Evaluacin de semen con el microscopio

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0606

Minitb Abfll- und Labortechnik GmbH & Co. KG

Premisas iniciales
Los requerimientos mnimos para microscopios para la evaluacin de semen son:
ptica binocular de contraste de fases
Platina temperada ajustable para temperaturas alrededor de +38C a +39C.
Ocular
fijado a 10x

escala de distancia interpupilar

Tubo
tornillo de fijacin de tubo
utilice llave Allen

Anillo ajuste
dioptras

dial simplificado de enfoque

Bastidor

Revolver Objetivos
Objetivo
bloqueo de movimiento
fijador de especmen
Interruptor principal

clavija de bloqueo

botn de intensidad
de luz

palanca de abertura de
iris de diafragma

tornillos de centrado de
condensador
Platina
Condensador
tornillo de enfoque
fino
soporte de filtro
coloque filtro de 45 mm
tornillo de enfoque grueso
anillo diafragma de campol
tornillo de eje X
tornillo de eje Y

Para la evaluacin del semen vivo, no olvide conectar la platina trmica de su microscopio,
con el tiempo suficiente para calentar sobre ella los porta- y cubreobjetos a +39C.
Asegrese de que la temperatura de su platina trmica est correctamente ajustada a +38C
hasta +39C. El proceso de calentamiento requiere de 10 20 minutos. Los porta- y
cubreobjetos insuficientemente temperados entregarn imgenes bajo el estndar.
Asegrese de utilizar slo porta- y cubreobjetos limpios. Algunos portaobjetos y
cubreobjetos, aun en empaque de fabricacin sellado, pueden requerir de limpieza adicional,
debido a impurezas o sustancias txicas en sus superficies, provenientes del proceso de
fabricacin. Los portaobjetos pueden limpiarse antes del uso mediante un pao libre de
peluzas humedecido con alcohol (utilice alcohol isoproplico 70-90%). Utilice portaobjetos de
0,9 a 1,4 mm de grosor. El uso de portaobjetos ms gruesos puede causar una imagen
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imprecisa de la muestra. Utilice cubreobjetos de mximo 0,17 mm de grosor para lograr el

rendimiento ptimo de los objetivos del microscopio.

Magnificacin del microscopio

El aumento o magnificacin total recomendado para la evaluacin de muestras de motilidad,
est entre 100x y 250x. La magnificacin total resulta de la combinacin de la magnificacin
del objetivo y del ocular.
Usted encontrar impreso el factor de magnificacin en los oculares (la mayora de ellos de
10x) y en los objetivos (10x, 20x, 25x, 40x, 100x oil). Multiplicando los factores de
magnificacin del ocular por objetivo, Usted obtendr la magnificacin total, con la cual
trabaja.

Magnificacin total = Magnificacin objetivo x magnificacin ocular

Las preparaciones debieran enfocarse primero con un bajo aumento para tener una
perspectiva general y enfocar el campo visual sobre la parte ms central de la preparacin.
Si Usted est evaluando muestras de semen, enfoque al centro del cubreobjeto
posicionando el objetivo exactamente sobre el, y ajuste la profundidad de foco moviendo la
platina lentamente hacia arriba o abajo hasta alcanzar una imagen ntida.
En seguida, utilice el aumento para la evaluacin de su muestra (tal como 200x con el
objetivo 20x), el que puede obtener rotando el objetivo deseado hasta enfocarlo sobre la
muestra. Con buenos microscopios obtendr, despus del cambio de magnificacin, una
imagen ntida, sin necesidad de enfoque adicional.
Si Usted no obtiene una imagen ntida, levante la platina lo ms posible, observando desde
un lado para evitar el contacto directo del objetivo con el cubreobjetos. Una vez que el
espacio entre objetivo y cubreobjetos sea mnimo, comience a bajar lentamente la platina,
mientras trata de reconocer la muestra a travs del ocular del microscopio. Mueva la platina
hasta obtener una imagen ntida.
El objetivo de inmersin 100x oil slo trabaja con aceite de inmersin, el cual debe colocarse
como una pequea gota entre un frotis sin cubreobjetos y el objetivo de inmersin. Este
mtodo de examen no es apropiado para muestras de semen cubiertas por un cubreobjetos,
sino slo para frotis fijados y teidos para evaluacin morfolgica. Mediante este mtodo, es
posible una magnificacin de 1.000x. La evaluacin de frotis teidos se hace en campo
claro, sin contraste de fase. Es decir, la posicin del condensador debe estar en 0 o campo
claro para este tipo de examen.

La evaluacin de la motilidad del semen al microscopio

La motilidad se evala colocando una pequea gota de semen (aprox. 5 l) sobre un
portaobjetos, tapndola cuidadosamente con un cubreobjetos. Muchas personas tienden a
utilizar una gota demasiado grande para una buena evaluacin. La capa de semen entre
porta- y cubreobjetos debe ser lo ms delgada posible y la gota se semen fluir fcilmente
bajo el cubreobjetos, hasta alcanzar sus bordes. Si la gota no se extiende por s misma,
generalmente se debe a la presencia de polvo y material grasoso sobre el vidrio. La muestra
debe evaluarse inmediatamente despus de su preparacin. En cada campo microscpico
se deben poder visualizar los espermios individuales, y la cantidad de clulas debe permitir
que se muevan relativamente libres. Si el nmero de espermios es demasiado alto, se debe
diluir la muestra de semen para aseguar una evaluacin correcta.

Seleccione para la evaluacin campos que muestren buena motilidad y no estn ubicados
en los bordes del cubreobjeto. Debieran evaluarse al menos 5 campos diferentes. El
porcentaje de espermios motiles de un eyaculado debe evaluarse dentro de un rango de 0%
(ningn espermio mvil) hasta 100% (todos los espermios en movimiento). En cada uno de
los campos, debiera estimarse el porcentaje de clulas con movimiento, asignando
preferentemente cada uno de ellos a 1 de las 3 categoras, inmvil, movimiento local, o
movimiento progresivo.
Durante la evaluacin de motilidad, est atento tambin a alteraciones morfolgicas visibles,
tales como gotas citoplasmticas o colas torcidas. Las clulas espermticas no debieran
presentar ms de 20% de formas alteradas. En caso de dudas, utilice un procedimiento de
tincin especial, como la tincin de Farelly, que es fcil de utilizar.
Eyaculados con una baja motilidad (por ejemplo bajo 70%), con ms de 20% de alteraciones
morfolgicas, y un monto alto de clulas espermticas aglutinadas, no debieran diluirse, sino
descartarse por esa razn. Los valores umbrales dependen de la especie y difieren
bastante.
Las aglutinaciones se producen particularmente en presencia de contaminacin bacteriana,
o por enfermedad febril del macho. Si Usted observa aglutinacin en un alto porcentaje de
las muestras, revise las condiciones higinicas y aspectos de salud, manejo y tcnica de
coleccin en los reproductores.
La evaluacin de motilidad de semen fresco o de semen descongelado requiere de un cierto
entrenamiento y prctica. Como primer paso, recomendamos comparar la proporcin de
espermios mviles de la de inmviles, y decidir cul predomina (ms de 50%). Si
predominan las clulas motiles, intente entonces estimar cunto ms de 50% son: 60%
70% 80%? Repita esta estimacin en por lo menos 4 campos adicionales. Recuerde de
concluir la evaluacin dentro de pocos minutos debido a que la calidad del semen deteriora
debajo del microscopio con el tiempo.
En algunos casos, particularmente con semen diluido con diluyentes de larga duracin,
como Androhep para semen porcino, las clulas espermticas necesitan ajustarse a aprox.
+37C en un pequeo tubito, por un mnimo de 20 minutos, antes de mostrar su completa
motilidad. Despus de completar su tiempo de incubacin, las muestras pueden extenderse
sobre un portaobjeto.

Cmo utilizar el objetivo de inmersin (100x Oil)

Asegrese de utilizar nicamente aceite de inmersin para microscopa. Otros tipos de
aceite pueden daar la superficie de los lentes expuestos.
1. Enfoque la muestra girando el revolver de los objetivos de menor a mayor aumento.
2. Antes de rotar el objetivo de inmersin a su direccin de foco, coloque una gota de
aceite de inmersin, suministrado con el objetivo de 100x, sobre el area de la
muestra a observar.
3. Gire el revolver para ubicar el objetivo de inmersin sobre la muestra y corrija el foco
con el botn de ajuste fino. Asegrese de que el aceite est libre de burbujas de aire,
debido a que afectar la calidad de la imagen. Para remover las burbujas de aire,
gire el revolver con el objetivo de inmersin, alejndolo y volvindolo a la muestra por
varias veces. .
4. Despus del uso, remueva el aceite del lente del objetivo, con una gasa humedecida
con una mezcla de ter (70%) y alcohol (30%).

Cmo ajustar el contraste de fases

La imagen de un objeto en contraste de fases puede ajustarse cambiando el retardo del foco
luminoso principal. Dependiendo del retardo elegido, los objetos pueden aparecer mas
brillantes (contraste de fases negativo) o ms oscuros (contraste de fases positivo) que su
alrededor o su fondo. El contraste de fases positivo es el mtodo estndar para la
evaluacin de semen. El contraste de fases negativo debe utilizarse para el sistema CASA
(computer assisted semen analysis) SpermVisionTM. Aqu el objeto ser brillante y el fondo
ser oscuro.
La motilidad de semen debiera evaluarse siempre utilizando contraste de fases. El contraste
de fases requiere de objetivos especiales, que vienen rotulados como Ph1, Ph2, o Ph3. El
condensador para contraste de fases requiere de 1, 2, o 3 posiciones de anillos de fase,
dependiendo del objetivo correspondiente elegido. La fase debe centrarse de tal manera,
que el anillo de fase al interior del objetivo se superponga exactamente a la posicin del
anillo de fase del condensador, dentro del paso del haz luminoso. Por esto es necesario que
en la primera instalacin de un microscopio, se centre el contraste de fase para cada
objetivo. Este ajuste debe controlarse regularmente.

Condensador de contraste de fases

Ajustando el condensador
no
centrado

correctamente
centrado

El ajuste se efecta normalmente con dos pequeos tornillos de centrado en el

condensador. El condensador debe estar posicionado cerca de la platina, en posicin de
enfoque de una muestra. Objetivo y anillo de fase del condensador deben corresponder uno
al otro. Utilice un telescopio de centrado para posicionar correctamente los anillos de fase.
Este accesorio se parece a un ocular y puede insertarse en uno de los tubos de
observacin, en lugar de un ocular. Al enfocarlo a la pupila del objetivo, se pueden controlar
la abertura del diafragma y centrar los anillos de fase. El enfoque con el telescopio se
efecta normalmente subiendo o bajando el ocular de ajuste.
Cada tipo de microscopio requiere de procedimientos de ajuste algo diferentes. Srvase
consultar el manual de su microscopio para mayores detalles.
Uso del diafragma de abertura
El diafragma de abertura es parte del condensador. Es utilizado para limitar la imagen de un
haz de luz. Con el diafragma se pueden regular la resolucin, el contraste y la profundidad
de campo. Sin embargo, nunca debe utilizarse para regular la luminosidad.

Problemas ms frecuentes
1. Si la iluminacin no es satisfactoria, controle el centrado y el ajuste vertical del
condensador, y si la parte superior del condensador est desviada, en relacin al
objetivo utilizado.
2. La suciedad de los lentes del objetivo y la de los oculares son, frecuentemente, la
causa de imgenes pobres o falta de contraste. El polvo debiera removerse con una
brocha suave, no slo de los lentes frontales, sino de todas las superficies externas o
lentes de objetivos. La suciedad rebelde debiera removerse con agua destilada, una
mezcla de alcohol y ter o bencina. Los lentes de los oculares debieran limpiarse
ocasionalmente. Estas se encuentran frecuentemente cubiertas por una fina pelcula
depositada por las pestaas.
3. Al cambiar los objetivos, frecuentemente se olvida el ajuste de la abertura del
diafragma. De esto resultan imgines de bajo contraste. La abertura y los diafragmas
de campo deben ser siempre correctamente fijadas. No ajuste nunca la intensidad de
luz con la abertura del diafragma.
4. Si la muestra solo puede ser enfocada pobremente, o simplemente no puede ser
enfocada, puede que el portaobjetos haya sido colocado invertido sobre la platina,
con la muestra dirigida hacia abajo. Esto puede suceder fcilmente, cuando la
superficie que contiene el frotis de la muestra no se encuentra marcada.