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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA α-AMILASA


TERMÓFILA
INFORME
CAMILA ANDREA TORRES LÓPEZ- KAREN LORENA ZULETA HERNÁNDEZ
GRUPO 2.1

RESUMEN: En esta práctica fue posible verificar experimentalmente que tanto la


temperatura como el pH son algunos de los factores que afectan la actividad de la enzima
α-amilasa. Así mismo se determinó la actividad de esta enzima termófila. Se realizaron
varias pruebas, en las cuales la enzima fue sometida a cambios de temperatura que
oscilaban entre los 0 y 90 OC. Con cada una de estas temperaturas se tenía un tiempo de
reacción específico para así observar el comportamiento de la amilasa. El mismo
procedimiento fue realizado para la el efecto del pH, solo que esta vez se hizo reaccionar
la enzima con soluciones buffer a distintos valores de pH básico. Para los dos
procedimientos se utilizaron los reactivos de Lugol y Fehling, los cuales, en general
ayudaron en el monitoreo de la actividad de la α-amilasa. La mayoría de las veces la α-
amilasa no respondió con un cambio de coloración en el tiempo cero de ambas pruebas
para el reactivo de Lugol; sin embargo a medida que se realizaron las siguientes pruebas
se observó la variación en el color. Para el reactivo de Fehling el resultado fue positivo
tanto para el pH como para la temperatura.
PALABRAS CLAVE: α-amilasa, temperatura, pH, actividad enzimática, hidrólisis del
almidón.

ABSTRACT: In this practice it was possible to verify experimentally that both temperature
and pH are some of the factors that affect the activity of the α-amylase enzyme. Likewise,
the activity of this thermophilic enzyme was determined. Several tests were performed, in
which the enzyme was subjected to temperature changes ranging from 0 to 90 OC. At each
of these temperatures a specific reaction time was taken to observe the behavior of the
amylase. The same procedure was performed for the pH effect, only this time the enzyme
was reacted with buffer solutions at different basic pH values. Lugol and Fehling reagents
were used for both procedures, which generally assisted in the monitoring of α-amylase
activity. In most of the tests α-amylase did not respond with a change in coloration at time
zero of both trials for the Lugol reagent; however, as the following tests were performed,
color variation was observed. For the Fehling reagent the result was positive for both pH
and temperature.
KEY WORDS: α-amylase, temperature, pH, enzymatic activity, starch hydrolysis.
INTRODUCCION
Las enzimas son biomoléculas dedicadas a la catálisis de las reacciones químicas
que tienen lugar en la célula. Son muy eficaces como catalizadores ya que pueden
aumentar la velocidad de las reacciones químicas mucho más que cualquier
catalizador compuesto, además las enzimas son altamente específicas ya que cada
una trabaja en la trasformación de un solo tipo de sustancia y no de otras que se
puedan encontrar en la reacción. (Onã te Ocaña, 2010)
Catálisis química: las reacciones químicas ocurren de tal modo donde hay reactivos
y donde después promueven productos, estas reacciones tienen lugar cuando una
fracción de moléculas posee la energía suficiente para alcanzar un estado activado
que se denomina estado de transición, en este estado es muy fácil que se formen o
que se rompan los enlaces químicos que forman los productos. (Tortora, Funke, &
Case, 2007)
La velocidad de una reacción química es proporcional al número de moléculas por
unidad de tiempo con la energía requerida para alcanzar el estado de transición.
Existen algunos métodos mediante los cuales puede acelerarse la velocidad de una
reacción química.
Mecanismo de acción sustrato- enzima: en una reacción química interviene el
sustrato y la enzima lo que da como resultado el producto. Estas reacciones se
autorregulan mediante la cantidad proporcional del sustrato y producto que se
encuentra en la célula. Cuando la enzima se acopla al sustrato va transformándose
en producto mientras se gasta el sustrato, esta proporción afecta la velocidad de la
reacción. A este fenómeno se le denomina velocidad de reacción y se puede
representar de la siguiente manera. (Onã te Ocaña, 2010)

Figura 1. Velocidad de reacción. (Oñate Ocaña, 2010)


Especificad y eficiencia de las enzimas: la especificad de las enzimas es posible
debido a la estructura de las mismas. Estas consisten en proteínas globulares de
gran tamaño y cuyo peso molecular esta alrededor de 10000. Cada enzima posee
una conformación tridimensional característica y una configuración superficial
especifica. Esta configuración permite localizar el sustrato apropiado.
Las enzimas además son altamente eficientes ya que en condiciones óptimas
pueden catalizar reacciones con una velocidad de 108 a 1010 veces mayor que la
de una reacción similar que no es catalizada por enzimas.(Tortora et al., 2007)
Componentes de las enzimas: algunas enzimas se componen exclusivamente por
proteínas, mientras que la mayoría consisten en una fracción proteica denominada
apoenzima y una fracción no proteica llamada cofactor. Si el cofactor es una
molécula orgánica se denomina coenzima. Las apoenzimas no poseen actividad
propia deben ser activadas por cofactores. La apoenzima y el cofactor forman una
holoenzima o una enzima completa y activa. (Tortora et al., 2007)
Las coenzimas pueden colaborar con la enzima mediante la aceptación de átomos
que provienen del sustrato o la donación de átomos que necesita el sustrato.
Algunas actúan como trasportadores de electrones; extraen electrones del sustrato
y los donan a moléculas en reacciones siguientes. (Tortora et al., 2007)
Factores que afectan la actividad enzimática: la actividad enzimática depende de
factores como
1. Concentración del sustrato
2. Concentración de la enzima
3. Temperatura
4. pH
5. Fuerza iónica
6. Presencia de inhibidores
(Grajales Muñiz, 2005)
Entre estos se destacan la temperatura y el pH. Con el primero la velocidad de la
mayoría de las reacciones aumenta a medida que aumenta la temperatura. Las
moléculas se desplazan más lentamente a bajas temperaturas, lo que implica que
la energía será insuficiente para provocar la reacción. Sin embargo, en el caso de
las reacciones químicas enzimáticas, todo aumento más de cierta temperatura (T
óptima) reduce la velocidad de la reacción. La temperatura óptima para la actividad
humana varía entre 35 y 40°C. (Tortora et al., 2007)
Mientras que existen enzimas termófilas que se activan a temperaturas entre 60 y
80 °C y enzimas extra termófilas con temperaturas muy elevadas.(Lozano José,
1997)
Con respecto al pH la mayoría de las enzimas existe a un pH óptimo que se asocia
con una actividad enzimática máxima. Por arriba o por debajo de ese pH la actividad
enzimática se ve disminuida y por ende la velocidad de reacción también disminuye.
La concentración de hidrogeniones del medio altera la estructura tridimensional de
la proteína, y los cambios extremos de pH pueden desnaturalizar la enzima. (Tortora
et al., 2007)
METODOLOGÍA
Efecto del pH en la reacción: En tres tubos de ensayo se adicionaron 10 mL de la solución
de almidón con 2 mL de buffer a distintos pH. Posteriormente se incubaron a 50oC por
cinco minutos. Luego la solución de amilasa en CaCl2 fue añadida. Se variaron los tiempos
de reacción y los resultados se observaron en la placa de vidrio con Lugol. En otro tubo se
mezclaron los reactivos de Fehling A y Fehling B. De esta manera se vió afectada la forma
y por lo tanto la tasa de reacción, debido a que cada enzima tiene un pH óptimo.

RESULTADOS

Figura 2. Efecto del pH con reactivo de Lugol.


Figura 3. Efecto del pH con el reactivo de Fehling.

Tabla1. Efecto del pH


TIEMPO DE EFECTO Del pH EN LA REACCIÓN
REACCIÓN

MINUTOS Buffer pH= 10 Buffer pH= 6,5 Buffer pH= 8


TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6

Lugol Fehling Lugol Fehling Lugol Fehling

0 + --- + --- + ---

1 + --- + --- + ---

2 ++ + +- + +- +

5 -- ++ -- ++ -- ++

10 --- +++ --- +++ --- +++


Figura 4. Efecto de la temperatura con el reactivo de Fehling.

Figura 5. Efecto de la temperatura con Lugol.


Tabla2. Efecto de la temperatura

TIEMPO DE EFECTO DE LA TEMPERATURA DE LA REACCIÓN


REACCIÓN

MINUTOS BAÑO DE HIELO (0OC) 50OC 90OC


TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3
Lugol Fehling Lugol Fehling Lugol Fehling

0 +++ --- +++ --- +++ ---

1 +++ --- +++ -- ++ ---

2 ++ + + + +- ---

5 --- ++ -- ++ ++ +

10 --- +++ --- +++ +++ ++

ANÁLISIS DE RESULTADOS
La amilasa, es una enzima que se encarga de hidrolizar el almidón, se encuentra
en animales, plantas y en microorganismos. La amilasa puede ser de origen
fúngico (Aspergillus oryzae), bacteriano (Bacillus stearothermophilus, Bacillus
subtilis, Bacillus amyloliquefaciens) céreo y pancreático. La amilasa hidroliza los
enlaces 1,4 del almidón (en cada uno de sus componentes), del glucógeno y de
las ciclodextrinas, además mantienen la configuración del carbono anomérico.
Para que su acción catalítica sobre el almidón sea favorable, esta enzima requiere
un activador como el cloruro de calcio y un pH óptimo, el cual oscila entre 5 y 7.
(Beltrán, 2010). Para la enzima amilasa bacteriana es de 6.5, ya que fue en el
que mejor se observó la variación del color según la figura 1, lo que indica una mayor
actividad de la enzima en este pH.

La amilasa es una enzima altamente sensible a una acidez elevada y se inactiva


a pH ≤ 3.3. Así mismo, interviene sobre el almidón en su estado nativo o crudo e
incluso sobre preparaciones donde el almidón ya está gelatinizado. (Beltrán, 2010)
Los valores de pH extremos ocasionaron la desnaturalización de la alfa amilasa, ya
que su estructura fue modificada con estos cambios. Así mismo, las interacciones
iónicas intervinieron en la estabilidad de la enzima en su estado nativo. Esto se
corrobora con la coloración café oscura que se obtuvo con los reactivos de Fehling
A y B ilustrados en la figura 2, confirmando así la presencia de azúcares reductores
tales como la maltosa y la maltotriosa.
La alfa- amilasa se encarga de digerir el glucógeno y el almidón para formar
azucares simples. Esta enzima trabaja a una temperatura elevada o cálida que
oscila entre 67- 73°C. La temperatura a la cual alcanza la máxima actividad, es decir
la temperatura optima de reacción es 70°C, cuando se sobrepasa este valor, la
actividad enzimática disminuye rápidamente ya que la enzima se va
desnaturalizando, mientras que la alfa amilasa salival trabaja a una temperatura
optima de 37°C que es la misma del cuerpo humano (Espinoza, 2016)
A 90°C la enzima aun daba positivo con Lugol, mientras que con Fehling se observó
solo un pequeño precipitado rojo, lo cual indica que la enzima se fue
desnaturalizando debido al tiempo en que duro a esa temperatura, contrario a esto
las temperaturas menores dieron negativo para un tiempo mayor con Lugol,
mientras que con Fehling a mayor tiempo las pruebas dieron positivas.

GENERALIDADES DE LA ALFA-AMILASA
Sustrato: almidón.
Cofactor: ión Ca+2
Producto: dextrinas de diferentes largos de cadena, y oligosacáridos.
Nombres comunes: sacarógeno amilasa; glicogenasa; glucoamilasa; amiloglucosidasa;
alfa-glucosidasa lisosómica, maltasa ácida; alfa-glucosidasa; maltasa, glucoinvertasa;
glucosidosacarasa, maltasa-glucoamilasa, alfa-glucopiranosidasa, glucosidoinvertasa; alfa-
glucósido hidrolasa; isoamilasa; enzima desramificante; alfa-amilasa maltogénica; amilasa
III; endoamilasa; taka - amilasa A. (DBGET Search- Enzyme)

Nombres sistemáticos: 1,4-alfa-D-glucano maltohidrolasa; glucano 1,4 - alfa -


glucosidasa; 1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa; alfa-D-glucosidasa, alfa-1,4-glucosidasa;
glucógeno alfa-1,6-glucanohidrolasa; glucano 1,4 - alfa - maltohidrolasa; 1,4-alfa-D-glucano
alfa-maltohidrolasa; oligosacárido 4-alfa-D-glucosiltransferasa; 1,4-alfa-glucano:4-alfa-
glucosiltransferasa; 1,4-alfa-D-glucano: 1,4-alfa-D-glucano 4-alfa-D-glucosiltransferasa;
alfa-1,4-transglucosilasa; 1,4-alfa-D-glucano glucanohidrolasa. (DBGET Search- Enzyme)

Clase: hidrolasas, glicosidasas; transferasas, glicosiltransferasas;hexosiltransferasas.

Clasificación completa:
KEGG Orthology (KO) - todas las categorías [BR: ko00000]
09100 Metabolismo
09101 Metabolismo de los carbohidratos
00500 Almidón y metabolismo de la sacarosa [CAMINO: ko00500]
K01176 AMY, amyA, malS; alfa-amilasa
K07405 E3.2.1.1A; alfa-amilasa
K05343 treS; maltosa alfa-D-glucosiltransferasa / alfa-amilasa
K05992 amyM; alfa-amilasa maltogénica
K01208 cd, ma, nplT; ciclomaltodextrinasa / alfa-amilasa maligna / neopullulanasa
09150 Sistemas Organismales
09154 Sistema digestivo
04973 Digestión y absorción de carbohidratos [CAMINO: ko04973]
K01176 AMY, amyA, malS; alfa-amilasa

KEGG Orthology (KO) [BR: ko00001]


Metabolismo
Metabolismo de los carbohidratos
00500 Almidón y metabolismo de la sacarosa [CAMINO: ko00500]
K01176 AMY, amyA, malS; alfa-amilasa [EC: 3.2.1.1]
K07405 E3.2.1.1A; alfa-amilasa [EC: 3.2.1.1]
K05343 treS; maltosa alfa-D-glucosiltransferasa / alfa-amilasa [CE: 5.4.99.16 3.2.1]
K05992 amyM; alfa-amilasa maltogénica [EC: 3.2.1.133]
K01208 cd, ma, nplT; ciclomaltodextrinasa / alfa-amilasa / neopullulanasa
maltogénicas [CE: 3.2.1.54 3.2.1.133 3.2.1.135]
Sistemas Organismaticos
Sistema digestivo
04973 Digestión y absorción de carbohidratos [CAMINO: ko04973]
K01176 AMY, amyA, malS; alfa-amilasa [EC: 3.2.1.1]
Enzimas [BR: ko01000]
3. Hidrolasas
3.2 Glicosidasas
3.2.1 Glicosidasas, es decir, enzimas que hidrolizan compuestos de O- y S-glicosilo
3.2.1.1 alfa-amilasa
K01176 AMY, amyA, malS; alfa-amilasa [EC: 3.2.1.1]
K05343 treS; maltosa alfa-D-glucosiltransferasa / alfa-amilasa [CE: 5.4.99.16
3.2.1.1]
K07405 E3.2.1.1A; alfa-amilasa [EC: 3.2.1.1]
3.2.1.54 cyclomaltodextrinase
K01208 cd, ma, nplT; ciclomaltodextrinasa / alfa-amilasa / neopullulanasa
maltogénicas [CE: 3.2.1.54 3.2.1.133 3.2.1.135]
3.2.1.133 glucano 1,4-alfa-maltohidrolasa
K01208 cd, ma, nplT; ciclomaltodextrinasa / alfa-amilasa / neopullulanasa
maltogénicas [CE: 3.2.1.54 3.2.1.133 3.2.1.135]
K05992 amyM; alfa-amilasa maltogénica [EC: 3.2.1.133]
3.2.1.135 neopullulanasa
K01208 cd, ma, nplT; ciclomaltodextrinasa / alfa-amilasa / neopullulanasa
maltogénicas [CE: 3.2.1.54 3.2.1.133 3.2.1.135]
5. Isomerasas
5.4 Transferasas intramoleculares
5.4.99 Transferencia de otros grupos
5.4.99.16 maltosa alfa-D-glucosiltransferasa
K05343 treS; maltosa alfa-D-glucosiltransferasa / alfa-amilasa [CE: 5.4.99.16
3.2.1.1]

Categoría terapéutica de fármacos en Japón [BR: br08301]


2 Agentes que afectan órganos individuales
23 Agentes de órganos digestivos
233 Estómicas y digestivos
2339 Otros
D08708 Licase (alfa Amilasa) - hidróxido de aluminio, secado - carbonato de
magnesio - bicarbonato de sodio - mezcla de carbonato de calcio precipitado

Categoría de riesgo de medicamentos OTC japoneses [BR: br08312]


Medicamentos OTC de tercera clase
Productos químicos inorgánicos y orgánicos
Amilasa
D02831 Alfa Amilasa (USAN)
Diásmina
D02831 Alfa Amilasa (USAN)

Clasificación de fármacos basada en objetivos [BR: br08310]


Enzimas
Hidrolasas
alfa - amilasa [HSA: 279 280] [KO: K01176]
(KEGG BRITE Database)
Reacciones que cataliza (IUBMB):

Transfiere el residuo de alfa-D-glucosa terminal no reductor de un (1-> 4) -alpha-D-glucano


a la posición 4 de una glucosa libre o de un residuo glucosilo en el extremo no reductor de
un (1 -> 4) -alfa-D-glucano, lo que provoca el reordenamiento de los oligosacáridos
Endohidrólisis de enlaces (1-> 4) -alfa-D-glucosídicos en polisacáridos que contienen tres
o más unidades de D-glucosa unidas a (1-> 4) -alfa. (Sorensen,1982)
Cicla parte de una cadena de (1-> 4) -alfa-D-glucano mediante la formación de un enlace
(1-> 4) -alfa- (Manners,1984)
Hidrólisis de enlaces (1-> 4) -alfa-D-glucosídicos en polisacáridos con el fin de eliminar
unidades de maltosa sucesivas de los extremos no reductores de las cadenas D-glucosídico
La hidrólisis de residuos de alfa-D-glucosa terminales, no reductores (1-> 4), con liberación
de D-glucosa
Actúa sobre almidón y polisacáridos y oligosacáridos relacionados. El producto es alfa-
maltosa. (Outtrup,1984)
Reacciones que cataliza (KEGG):

Maltosa + H 2 O <=> 2 D – Glucosa:

Figura 4. Reacción de maltosa con agua

Almidón <=> Dextrina + Maltosa

Figura 5. Reacción de almidón.


Maltodextrina + H 2 O <=> Maltosa

Figura 6. Reacción de maltodextrina con agua.

Almidón <=> Ciclo Maltodextrina

Figura 7. Reacción de almidón que produce ciclomaltodextrina.

Comentarios:
Las ciclomaltodextrinas (dextrinas Schardinger) de diversos tamaños (6,7,8, etc., unidades
de glucosa) se forman reversiblemente a partir de almidón y sustratos similares. También
se producirán desproporcionadas maltodextrinas lineales sin ciclos
La enzima actúa sobre amilosa, amilopectina, glicógeno y maltooligosacáridos. No se forma
glucosa libre detectable, indicando que la enzima no actúa como una hidrolasa. La enzima
de la bacteria Cellvibrio japonicus tiene la mayor actividad con la maltotriosa como donante,
y también acepta maltosa, mientras que la enzima de la ameba no acepta maltosa.
Oligosacáridos con 1-> 6 enlaces no pueden funcionar como donantes, pero pueden actuar
como aceptores. La 4-alfa-glucanotransferasa, puede transferir solo un residuo de glucosilo.
(Manners,1962)
Actúa sobre el almidón, el glucógeno y los polisacáridos y oligosacáridos relacionados de
manera aleatoria; los grupos reductores se liberan en la configuración alfa. El término alfa
se refiere a la configuración anomérica inicial del grupo de azúcar libre liberado y no a la
configuración del enlace hidrolizado.
Actúa sobre el almidón, el glucógeno y los polisacáridos y oligosacáridos relacionados que
producen beta-maltosa mediante una inversión. El término beta se refiere a la configuración
anomérica inicial del grupo de azúcar libre liberado y no a la configuración del enlace
hidrolizado. (Outtrup,1984)
La mayoría de las formas de la enzima pueden hidrolizar rápidamente enlaces 1,6-alfa-D-
glucosídicos cuando el siguiente enlace en la secuencia es 1,4, y algunas preparaciones
de esta enzima hidrolizan 1,6- y 1,3-alfa-D- glucosídicos en otros polisacáridos. Esta
entrada cubre todas estas enzimas que actúan sobre los polisacáridos más rápidamente
que sobre los oligosacáridos. La alfa-glucosidasa, procedente de intestino de mamífero,
puede catalizar reacciones similares. (Outtrup,1984)
Esta única entrada cubre un grupo de enzimas cuya especificidad está dirigida
principalmente hacia la exohidrólisis de enlaces (1-> 4) -alpha- glucosídicos, y que
hidrolizan oligosacáridos rápidamente, con respecto al polisacárido, que se hidrolizan
relativamente lentamente o no lo hacen en absoluto. La enzima intestinal también hidroliza
polisacáridos, catalizando las reacciones de glucano 1,4-alfa-glucosidasa y, más
lentamente, hidrólisis (1-> 6) -alfa-D-glucosa.
También hidroliza fácilmente la amilopectina. Posee incapacidad para hidrolizar el pululano
y por acción limitada sobre las dextrinas alfa-limitadas. La maltosa es el azúcar más
pequeño que puede liberar de un enlace alfa- (1-> 6) .
(Sorensen,1982)
Estructura Primaria:

Figura 8. Estructura primaria de la alfa amilasa.


Estructura Secundaria:

Figura 9. Estructura secundaria de la alfa amilasa.

Estructura Terciaria:

Figura 10. Estructura terciaria de la alfa amilasa.


Cuenta con alfa hélices, bucles y hojas plegadas beta. La alfa-amilasa está compuesta por
una cadena polipeptídica plegada en tres dominios: A, B y C. El A es el dominio catalítico
(β/α)8 barril, y los dominios B y C se encuentran aproximadamente a los lados opuestos de
este TIM-barril. (Peña,2009)
Estructura cuaternaria

Figura 11. Estructura cuaternaria de la alfa amilasa.

El mecanismo catalítico establecido para la familia α-amilasa incluye dos tipos de


reacciones SN2; los aminoácidos que intervienen en la catálisis son Glu 230 que actúa como
donador de protón seguido de un ataque nucleofílico por el Asp 206. (Beltrán, 2010)
Al observar la estructura 3D de la enzima se conoce que el ión Ca+2 se ubica en la interfase
formando puente iónico entre los dominios A y B lo que estabiliza la hendidura del sitio
activo. (Peña,2009)

Aplicaciones industriales:
Las enzimas en el campo de los alimentos son utilizadas, debido a su cuentan con un
amplio potencial, además que son bastante diversas. Teniendo impacto sobre aspectos
económicos y tecnológicos. Para el caso de la alfa- amilasa, es útil para una rápida
reducción de la viscosidad del almidón gelatinizado. (Beltrán, 2010)
Las enzimas hidrolasa aceleran y facilita la digestión del almidón, de grasas y proteínas.
También es utilizado en la industria de la medicina, la alfa amilasa es el principio activo de
varios medicamentos que ayuda a digerir los carbohidratos. (Beltrán, 2010)
CONCLUSIONES
La alfa-amilasa requiere de la presencia de un cofactor para mejorar su actividad catalítica
sobre el sustrato.
El pH óptimo de la alfa amilasa es 6,5.
A 90 OC con el reactivo de Fehling la reacción se dio en una muy mínima proporción, lo que
significa que hay presencia de maltosa y dextrinas mas no de glucosa.
La temperatura óptima de la alfa amilasa es 70°C.
Para una temperatura de 50°C a un mayor tiempo la alfa amilasa ya había digerido todo el
almidón, por ende la prueba dio negativa para Lugol.

BIBLIOGRAFÍA

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