DETERMINACIN DE PROTENAS POR EL MTODO DE BRADFORD

(no sacar esta hoja)

Blanco: Este tubo no contiene protena, se reemplaza la muestra por agua y se le agrega el
correspondiente volumen de reactivo. Se realiza para determinar la absorbancia del reactivo, este valor
se descuenta de la absorbancia del resto de los tubos.
Curva de calibracin: Para su realizacin se utilizar la solucin testigo de concentracin conocida.
Con la medida de absorbancia de cada tubo y conociendo la cantidad de protenas que contiene cada
uno de los tubos, es posible realizar una curva de calibracin (grfico A 595 vs g de protena). Es
necesario realizarla cada vez que se procesen las muestras. La concentracin del TESTIGO es 100
g/ml.
Muestra incgnita: se procesa en simultneo y en las mismas condiciones que la curva de
calibracin. El tubo contiene la muestra y la misma cantidad de reactivos que los anteriores. Para
conocer la cantidad de protenas de la muestra (g), se determina la absorbancia de la misma y se
interpola en la curva de calibracin. Cada grupo procesa una sola Muestra incgnita (A o B).
Protocolo:
Tubo

H2O
(l)

Blanco

600

450

150

----------

300

300

----------

--------

600

----------

-------

600

Muestra -------AoB

Testigo Muestra Reactivo de Protena Absorbancia

AoB
Bradford
a 595 nm
(l)
(g)
(ml)
(l)
-------- ---------2

Procedimiento:
Pipetear en el orden de la tabla:
- Primero el AGUA con la pipeta de 1 ml (rotulada H2O).
- El TESTIGO con otra pipeta de 1 ml (rotulada T) respetando el orden de los tubos: 1,2 y 3.
- Luego con otra pipeta de 1 ml (rotulada A o B segn corresponda) la MUESTRA INCGNITA en su
tubo correspondiente.
-Por ltimo, el reactivo de Bradford con la pipeta de 5 ml (rotulada R).
- Mezclar el contenido de los tubos.
- Incubar 5 minutos a temperatura ambiente.
Observar el color de la curva de calibracin y comparar con el color de la muestra incgnita con la
curva. De esta manera estimar los valores de protenas de la muestra incgnita. Luego leer en el
fotocolormetro tanto la curva y como la muestra incgnita. Completar la tabla con los valores de
absorbancia y realizar el grfico A595 vs g de protena.
Interpolar en el grfico el valor de absorbancia de las muestras incgnita en dicha curva y determinar
g de protena de las muestras y en luego determinar su concentracin g/ml. Analizar si existe
concordancia con el valor estimado visualmente.
Al finalizar el trabajo prctico es IMPORTANTE que todo el material quede limpio y en su lugar.
Se enjuagarn las pipetas con agua. Para limpiar los tubos de Bradford los alumnos contarn con una
pizeta con etanol. Primero se descartar el contenido de los tubos en las piletas. Luego se enjuagarn
los tubos con un poco de etanol y por ltimo con abundante agua.