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21
Contra Hongos y Bacterias Patgenas en Alimentos
Mara del Rosario Razo Belmn, Jos Eleazar Barboza Corona, Rubn Salcedo Hernndez,
Manuel Vzquez Arista, Ma. Guadalupe L. Basurto Cadena.
Departamento de Alimentos, Instituto de Ciencias Agrcolas, Universidad de Guanajuato. Km
9 Carretera Irapuato-Silao, Exhacienda El Copal S/N Irapuato, Gto.
mbasurto@dulcinea.ugto.mx.
RESUMEN
En estudios previos se comprob la actividad antagnica, in Vitro y en invernadero, que
presenta una cepa mexicana de Bacillus subtilis No. 21, aislada de cultivos de fresa de la
regin de Irapuato contra los hongos fitopatgenos Fusarium verticillioides y Rhizoctonia
solani. Por tal motivo, se decidi evaluar algunos de los posibles mecanismos de accin de
esta bacteria. En este trabajo se detect la produccin de proteasas y bacteriocinas, las
cuales pudieran estar involucradas en el mecanismo antagnico de la bacteria B. subtilis No.
21.
ABSTRACT
Previous studies, in vitro and greenhouse, it was proved that the antagonistic activity of a
Mexican Bacillus subtilis strain 21, isolated from strawberry fields in Irapuato, against its
pathogenic fungi Fusarium verticillioides and Rhizoctonia Solani, Hence, it was decided
evaluate some possible action mechanisms of this bacteria. In this work proteases and
bacteriocinas production were detected, which could be involved in the antagonistic
mechanism of Bacillus subtilis strain 21.
INTRODUCCION
Uno de los aspectos que ms afectan la produccin de los cultivos a nivel mundial lo es sin
dudas la presencia cada vez ms creciente de enfermedades causadas por hongos,
bacterias y virus, esto trae como consecuencia la merma mundial de los cultivos. Este
aumento en las prdidas de cultivos y el nmero de enfermedades presentes en stos, hace
notable la disminucin de la efectividad de los productos qumicos, lo que con frecuencia da
lugar a problemas econmicos para los agricultores.
Actualmente se est desarrollando la base cientfica de la lucha biolgica y como principal
componente de esta se encuentra el control biolgico el cual abarca desde la represin o
control de insectos hasta las enfermedades causadas por hongos bacterias y virus. Para su
control se han utilizado microorganismos los cuales ejercen una actividad antagnica contra
dichas enfermedades, entre estos se encuentran hongos como Beauveria, Metarhizium y
Paecilomyces y bacterias como Bacillus thuringiensis y Bacillus subtilis. (Antela, 2004).
Uno de los principales problemas que limita la productividad de los cultivos es el uso
constante de fungicidas, los cuales son nocivos para la salud y el medio ambiente
(EPA,1999).
Estudios realizados en los ltimos aos sugieren que el mtodo para combatir plagas y
enfermedades en productos hortcola es el control biolgico, el cual puede ser incorporado a
un plan de manejo integral con el uso adecuado de rizobacterias antagonistas contra hongos
fitopatgenos (Fernndez, 1999), tal es el caso de la cepa de Bacillus subtilis No. 21, aislada
de cultivos de fresa de la regin de Irapuato, la cual demostr, a nivel de invernadero, ser
antagnica contra hongos de Fusarium verticillioides y Rhizoctonia solani (Torres - Basurto,
2000).
El objetivo de este trabajo fue estudiar dos de los posibles mecanismos por los cuales la
bacteria B. subtilis No.21 ejerce su antagonismo contra los microorganismos probados. Se
observo la presencia de altos niveles de proteasas y una posible actividad (baja) de
bacteriocina.
MATERIALES Y METODOS
Cultivo de Bacillus subtilis No 21. La cepa, conservada en el cepario del Instituto de
Ciencias Agrcolas se creci como colonias aisladas en Agar Nutitivo estandar (BD Bioxon).
Una colonia se pic en 3 mL de caldo nutrido (BD Bioxon) y se dej crecer toda la noche, de
este preinculo se transfirieron 0.5 mL en 100 mL de Caldo nutritivo y se cultiv en los
tiempos indicados (ver resultados). Las clulas se centrifugaron y el sobrenadante se utiliz
como medio condicionado.
Determinacin de proteasas. Se aadieron 100 L de medio condicionado en pozos
horadados en un medio caseoltico, se dejaron 24 h en refrigeracin para la difusin de las
proteasas en el medio y se incubaron a 28 C por otras 24 h. Posteriormente se midi el rea
de hidrlisis en las diferentes muestras usando el halo transparente delimitado por un crculo
blanquecino formado alrededor de los pozos. Una unidad de proteasa (U) fue definida como
2
la
absorbencia
280
nm
una
unidad
fue
definida
como
RESULTADOS
Determinacin de proteasas. Los resultados obtenidos mostraron la presencia de
proteasas. En la Tabla 1, se muestran los resultados del dimetro que presentaron los halos
de hidrlisis al colocar la cepa de Bacillus subtilis No. 21, en dos diferentes medios. Las
Figuras 2 y 3 muestran el ensayo de proteasas a 24, 48 y 72 h en medio de caldo nutritivo.
Las Figuras 4 y 5 muestran el ensayo de proteasas a las 24, 48 y 72 h en medio de quitina
coloidal. En estas figuras se puede observar que las muestras colocadas en caldo nutritivo
tuvieron mayor actividad de proteasas que las muestras colocadas en quitina coloidal.
Medio de Cultivo
Tiempo
Caldo
Quitina
Nutritivo
Coloidal
24
1.3823
0.3534
48
2.8589
0.7461
72
2.7568
1.1545
24
48
72
24
72
48
500
UP/mL/min.
400
300
200
100
0
10
20
30
40
50
60
tiempo (h)
70
80
Medio de Cultivo
Nombre
Caldo Nutritivo
Quitina Coloidal
Streptococcus pyogenes
25.13
19.44
275.68
35.34
25.13
25.13
275.68
21.99
Escherichia coli
Listeria inocua
Salmonella sp.
Shigella flexneri
Streptococcus pneumoniae
Bacteria
180
160
fluorescencia (UR)
140
120
100
80
60
40
20
0
10
20
30
40
50
60
70
80
tiempo (h)
DISCUSIN
Los resultados obtenidos sugieren que la cepa mexicana de Bacillus subtilis No. 21
analizada en este trabajo puede ejercer una actividad antagnica contra diversas cepas de
hongos fitopatgenos como son Fusarium verticillioides y Rhizoctonia solani mediante la
liberacin de proteasas donde su mayor produccin se present entre las 18 y 24 h, de
acuerdo a la Figura 5. Adems de producir proteasas, B. subtilis No. 21 produce tambin
bacteriocinas, las cuales segn los resultados obtenidos pueden inhibir el crecimiento de
algunas bacterias patgenas para el ser humano y las cuales pueden ser encontradas en los
alimentos. Dichas bacteriocinas alcanza su mayor actividad a despus 60 h de cultivo, la
cual es de 160 UR. En posteriores trabajos se realizar estudios adicionales para la
determinacin cuantitativa de proteasas mediante zimogramas, adems de realizar pruebas
para determinar que otros compuestos pueden ser producidos por dicha cepa bacteriana. El
ensayo de fluorescencia est diseado especficamente para la deteccin rpida de
bacteriocinas (Fuente Salcido, et. al., 2007), en nuestro caso pudimos detectar actividad con
dicho ensayo, sin embargo nos falta una prueba adicional para demostrar que la actividad
medida efectivamente es una bacteriocina: la prueba de que la actividad mostrada es debida
a una molcula de naturaleza protica, actualmente estamos trabajando en ese tema.
BIBLIOGRAFIA
Antela- Arrasta., O., 2004. Control biolgico como estrategia en el manejo integrado de
plagas.
EPA., 1999 Environmental Protection Agency and pesticides.
Fernndez, G.J., 1999. Agroecologa Americana. En Enciclopedia Prctica de la Agricultura y
Ganadera: 11-18. Grupo Editorial Ocano. Barcelona, Espaa.
Fuente Salcido N., Salcedo Hernandez R., Alans Guzmn M., K. Bideshi D., Barboza
Corona J., 2007. A new rapid fluorogenic method for measuring bacteriocin actiity.,
Journal of Microbiological Methods.
Torres G.L.I., Basurto C.M.G. 2000. Control Biolgico De Hongos Fitopatgenos De La Raz
y Corona De Fresa Con Cepas Antagnicas De Bacillus subtilis. Tesis de Licenciatura.
ICA. U. de Guanajuato. Irapuato, Gto. Mxico.
Rojas I. 1994. Produccin de proteasas por Bacillus thuringensis crecido en medios a base
de materiales protein-quitinosos. Posible uso de estas enzimas en la obtencin de
hidrolizados de carne y harinas de pescado. Tesis de Maestra. Instituto Tecnolgico
de Veracruz. Veracruz, Veracruz, Mxico.