UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA DE MICROORGANISMO
SIXTO DAVID ROJO

Caracterizacin taxonmica y fisiolgica de cepas de setas

(gnero Pleurotus) pertenecientes al cepario del Laboratorio de
Biotecnologa de microorganismos SIXTO DAVID ROJO ULA.

Por:
Br. Eduardo A. Chalbaud Mogolln

Trabajo presentado para optar

Al Ttulo de Licenciado en BIOLOGA de la
Ilustre Universidad de los Andes

Mrida 2015 - Venezuela

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AGRADECIMIENTOS

Quiero expresar mi ms sincero agradecimiento al MSc. Balmore Guerrero asesor de mi

trabajo especial de grado. As como a los profesores Dr. Julio Otoniel Rojas, Dr. Juan Gaviria y Dr.
Pablo Garca, por formar parte del comit de este trabajo, por sus valiosas sugerencias de inters, en
la revisin del presente trabajo.

A la Universidad de los Andes, Mrida Venezuela; especficamente a todo el personal del

Laboratorio de Biotecnologa de Microorganismos SIXTO DAVID ROJO, a los profesores Julio
Otoniel Rojas, Pablo Garca, Zarack Chacn, Balmore Guerrero; a la vigilancia, Gleydi Uzcategui; a
los tcnicos Jess Pacheco y Flormery Bracho; a los Investigadores, estudiantes de pregrado y
postgrado Yzoleth Torres, Osman Morillo, Racely Snchez, Datty Rosales, Alexis Sambrano y Ana
Daz por su amistad y apoyo durante la realizacin de esta investigacin.

Al investigador independiente el Dr. Jos David Rosales Rangel por su inters en la

realizacin de esta investigacin y su colaboracin en el uso de la herramientas de bioinformtica.
Al Laboratorio de Biodiversidad y Variabilidad Molecular adscrito al Instituto Jardn
botnico de Mrida a los Mgs. Arnaldo Moguera y Mgs. Romina Ruiz por proporcionarme todos las
bases fundamentales en las tcnicas de purificacin de productos de PCR.
Al Laboratorio De Gentica Y Qumica Celular (Gequimcel), a la Lic. Sophie Dulhoste y Lic.
Sonia Morales por proporcionarme todos las bases fundamentales en la biologa molecular y el apoyo
en la ejecucin de esta investigacin.

A todos y cada uno de mis compaeros en la Facultad de Ciencias, con especial

cario, respeto, agradecimiento y admiracin para Amelia Guerrero, Nayari Valero, Luis
Mora, Luz Amira, Astrid Davila y Jose Gregorio Contreras.

A mis 2 grandes preparadores Roberto Torrealba de Matemtica 20 y Juan Pablo

Bracho de Ingenieria Gentica, y a todos los profesores de la Facultad de Ciencias por el apoyo y
la formacin durante todo el tiempo de realizacin de mis estudios de pregrado.

DEDICATORIA

A m querida Mam:

Leticia del Carmen Mogolln Piango

Quien siempre ha luchado por darme lo mejor, y ha sido un ejemplo de rectitud, constancia,
respeto, educacin y superacin personal, adems por todo su cario con el que me ha formado. Y
porque siempre ha sido partcipe de mi desarrollo personal.

A mi hermano:

Esteban Ricardo Chalbaud Mogolln

Con quien he compartido gran parte de mi vida, a quien agradezco su gran paciencia, cario y
ejemplo de constancia, y por estar presente en los momentos ms difciles.

A la Prof. Carmen Chacn

A quien agradezco su gran paciencia y siempre creer en m.

Al Dr. Pedro Serena

Quien siempre me dio un ejemplo de fortaleza, principios, respeto, educacin y superacin

personal.

Gracias a su apoyo y confianza que fueron parte fundamental para la realizacin de esta meta en mi
vida.

vi

NDICE
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................................................. III
DEDICATORIA....................................................................................................................................................... VI
NDICE................................................................................................................................................................... VII
NDICE DE TABLAS ............................................................................................................................................ VIII
NDICE DE FIGURAS ............................................................................................................................................ IX
NDICE DE ANEXOS .............................................................................................................................................. X
RESUMEN ................................................................................................................................................................ 1
ABSTRACT .............................................................................................................................................................. 1
INTRODUCCIN ...................................................................................................................................................... 2
CAPITULO I ............................................................................................................................................................. 3
MARCO TEORICO ................................................................................................................................................... 3
I HONGOS............................................................................................................................................................... 3
I.1. TAXONOMA DE LOS HONGOS. ............................................................................................................................ 3
I.1.1 APLICACIN DE LA BIOLOGA MOLECULAR A LA TAXONOMA DE LOS HONGOS. ..................................................... 4
I.2 EL FILUM BASIDIOMYCOTA.................................................................................................................................. 7
I.2.1 Gnero Pleurotus ..................................................................................................................................... 8
CAPITULO II ..........................................................................................................................................................21
ANTECEDENTES ..................................................................................................................................................21
II.1 LOS HONGOS ..................................................................................................................................................21
II.1.1 LOS HONGOS COMESTIBLES .........................................................................................................................21
II.1.2 HISTORIA DEL CULTIVO DE LOS HONGOS COMESTIBLES..................................................................................22
II.1.3. TAXONOMA DEL GNERO PLEUROTUS .........................................................................................................22
II.1.3.1 EL CONTROL GENTICO Y MORFOLGICO DEL PROCESO DE FRUCTIFICACIN................................................25
II.1.3.2 ALGUNAS ESPECIES DEL GNERO PLEUROTUS EN LATINOAMRICA. .............................................................26
CAPITULO III .........................................................................................................................................................29
JUSTIFICACIN. ...................................................................................................................................................29
HIPOTESIS. ...........................................................................................................................................................29
OBJETIVO GENERAL ...........................................................................................................................................29
OBJETIVOS ESPECIFICOS..................................................................................................................................29
CAPITULO IV .........................................................................................................................................................30
MATERIALES Y METODOS..................................................................................................................................30
MATERIALES ........................................................................................................................................................30
MICROORGANISMOS..............................................................................................................................................30
MEDIOS DE CULTIVO..............................................................................................................................................30
METODOLOGAS ..................................................................................................................................................31
IV. DIAGRAMA GENERAL DE INVESTIGACIN............................................................................................................31
IV.1 DETERMINACIN DE LAS CARACTERSTICAS MORFO-ANATMICAS DE LAS CEPAS P3215, P132, POST, PCIT Y
PRAL PRESENTES EN EL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA DE MICROORGANISMOS...............................................31
IV.1.1 Cultivo de las cepas P3215, P132 y Post por fermentacin de estado slidos (FES) ........................32
IV.1.2 Caracterizacin macroscpicas y microscpicas de los pleurocarpos de las cepas P3215, P132 y
Post. ................................................................................................................................................................33
IV.2 IDENTIFICACIN TAXONMICA DE LAS CEPAS P3215, P132 Y POST BASADA EN LAS CARACTERSTICAS MORFOANATMICAS.........................................................................................................................................................34

vii

IV.3 CARACTERSTICAS DE LAS CEPAS P3215, P132, POST, PCIT, PRAL Y POST CRECIDAS EN MEDIOS
CONVENCIONALES Y NO CONVENCIONALES. ............................................................................................................34
IV.3.1 Caractersticas de las colonias fngicas en medios convencionales. .................................................34
IV.3.2 Determinacin del efecto de los medios de cultivo convencionales y la temperatura en el crecimiento
y produccin de biomasa de las cepas del gnero Pleurotus ........................................................................35
IV.4 IDENTIFICACIN MOLECULAR DE LAS CEPAS P3215, P132 Y POST. ..................................................................36
IV.4.1 Evaluacin de los mtodos de extraccin de los cidos nucleicos de las cepas P3215, P132 y Post.
........................................................................................................................................................................36
IV.4.2 Secuenciacin del ADN. ......................................................................................................................38
IV.4.3 Anlisis de secuencia de la regin ITS1, 5.8S ADNr e ITS2 ...............................................................39
CAPITULO V ..........................................................................................................................................................41
RESULTADOS Y DISCUSIN ..............................................................................................................................41
V.1.1 CARACTERSTICAS MORFO-ANATMICAS DE LAS CEPAS P3215, P132 Y POST PERTENECIENTES AL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA DE MICROORGANISMOS. ...................................................................................41
V.1.2 Caractersticas microscpicas de las cepas P3215, P132, Pcit, Post y PRAL. ...................................44
V.2 IDENTIFICACIN TAXONMICA DE LAS CEPAS LAS CEPAS P3215, P132 Y POST BASADA EN LAS CARACTERSTICAS
MORFOANATOMICAS. .............................................................................................................................................45
V.3 CARACTERSTICAS DE LAS CEPAS LAS CEPAS P3215, P132, POST Y PRAL CRECIDAS EN MEDIOS
CONVENCIONALES Y NO CONVENCIONALES. ............................................................................................................46
V.3.1 Caractersticas de las colonias fngicas en medios convencionales. ..................................................46
V.3.2 Efecto de la temperatura y el medio de cultivo en el crecimiento y la produccin de biomasa de las
cepas P132, P3215 y P.ost. ...........................................................................................................................46
V.3.3 Tasa de crecimiento de las cepas Post y P3215 en medios no convencionales .................................49
V. 3.3. Caractersticas morfolgicas de las cepas P3215 y Post en medios no convencionales. .................51
V.4 IDENTIFICACIN POR TCNICAS MOLECULARES DE LAS CEPAS P3215, P132, POST. ..........................................52
V.4.1 Extraccin del ADN ...............................................................................................................................52
V.4.1.1 La PCR de la regin ITS 1 a ITS 2 ....................................................................................................52
V.4.2 Anlisis de la secuencia de la regin ITS 1, gen 5.8 S ANDr y la regin ITS2 dentro de las cepas del
gnero Pleurotus ............................................................................................................................................54
CAPITULO VI .........................................................................................................................................................65
CONCLUSINES ...................................................................................................................................................65
RECOMENDACIONES ..........................................................................................................................................66
BIBLIOGRAFA ......................................................................................................................................................67
ANEXOS.................................................................................................................................................................75
GLOSARIO.............................................................................................................................................................80
SIGLAS Y ABREVIATURAS .................................................................................................................................81

NDICE DE TABLAS
TABLA I PRODUCCIN MUNDIAL DE HONGOS COMESTIBLES CULTIVA DOS EN 1986 HASTA EL 2010
PESO FRESCO. TOMADO DE MILES Y CHANG, 2004 MODIFICADO.RODRIGUEZ, 2007. ....................11
TABLA II COMPOSICIN PROXIMAL DE PROTENAS, VITAMINAS Y MINERALES DE ALGUNAS ESPECIES
DE HONGOS COMESTIBLES, LOS VALORES SE EXPRESAN COMO MG/100G DE PESO SECO.
TOMADO DE CHANG Y MILES, 2004; MILES Y CHANG, 1997. .................................................................12
TABLA III ESPECIES BIOLGICAS ESTABLECIDAS DENTRO DEL GNERO PLEUROTUS, SUS
SINNIMOS CORRESPONDIENTES Y/O TAXA DE NIVEL DE SUBESPECIES, Y GRUPOS
RESPECTIVOS DE NTERCOMPATIBILIDAD; Y SU DISTRIBUCIN MUNDIAL. TOMADO: VILGALYS
ET AL., 1996) Y KONG,. 2005. ......................................................................................................................24
TABLA IV MEZCLA DE REACCIN PARA EL SECUENCIA MIENTO DE LOS PRODUCTOS DE PCR.IVIC,
2014. ...............................................................................................................................................................39
TABLA V CARACTERISTICAS DE LA CEPA P132. .............................................................................................42
TABLA VI CARACTERISTICAS DE LA CEPA P3215. ..........................................................................................43

viii

TABLA VII CARACTERISTICAS DE LA CEPA DE POST.....................................................................................44

TABLA VIII CARACTERSTICAS MICROSCPICAS DE LAS CEPAS DEL GNERO PLEUROTUS ................45
TABLA IX CARACTERSTICAS MACROSCPICAS DE LAS COLONIAS DE LAS CEPAS LAS CEPAS P3215,
P132, PCIT, POST Y PRAL PRESENTES EN EL LABORATORIO BIOMI, EVALUADAS EN MEDIOS DE
CULTIVO PDA Y SA A 22C. .........................................................................................................................46
TABLA X TASA DE CRECIMIENTO MICELIAL (MM/DA) TRAS LA INCUBACIN POR 15 DA DE LAS CEPAS
P132, P3215, POST Y PRAL EN PDA (AGAR PAPA DEXTROSA) Y ASD (AGAR SABOURAUD
DEXTROSA). ..................................................................................................................................................48
TABLA XI TASA DE CRECIMIENTO MICELIAL (MM/DA) A LOS 15 DAS DE INCUBACIN DE LAS CEPAS
POST Y P3215 EN SUSTRATOS LIGNOCELULSICOS COMO TUZA DE MAZ, SEMILLA DE SORGO,
ARROZ Y SEMILLA DE PARCHITA. .............................................................................................................50
TABLA XII CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DE LAS CEPAS ESTUDIADAS EN EN MEDIOS NO
CONVENCIONALES COMO SEMILLA DE SORGO (SORGHUM SP.), TUZA DE MAZ (ZEA MAYS),
ARROZ (ORYZA SATIVA) Y SEMILLA DE PARCHITA (PASSIFLORA EDULIS) INCUBADAS POR 15
DAS A 25C ...................................................................................................................................................51
TABLA XIII COMPARACIN DE LAS CARACTERSTICAS DEL ADN OBTENIDO A PARTIR DE LAS CEPAS
DEL GNERO PLEUROTUS A PARTIR DE LOS MTODOS DE SAGHAI-MAROOF, ET AL. (1984) (S) Y
LEE (1990) (L). ...............................................................................................................................................53
TABLA XIV CONCENTRACIONES DE LOS PRODUCTOS DE PCR DE LA REGIN ITS1, 5.8S E ITS2 (PCR)
DE CADA CEPA ENVIADO A SECUENCIAR A LA A LA UNIDAD DE ESTUDIOS GENTICOS Y
FORENSES DEL IVIC. ...................................................................................................................................54
TABLA XV IDENTIDAD DE LOS PRODUCTOS DE PCR DE LA REGIN ITS1, 5.8S E ITS2 DE CADA CEPA
ENVIADA A SECUENCIAR A LA UNIDAD DE ESTUDIOS GENTICOS Y FORENSES DEL IVIC. ...........55
TABLA XVI PATRONES DE BANDAS RFLP ESPERADOS PARA LAS ESPECIES DEL GNERO
PLEUROTUS TRAS LA DIGESTIN TERICA CON LAS ENZIMAS DE RESTRICCIN QUE CORTAN
EN 3 SITIOS. NEGRO (LAS ENZIMAS DE RESTRICCIN QUE COMPARTEN TODOS), ROJO QUE
COMPARTEN LAS CEPAS P132, POST Y P3215. ......................................................................................57
TABLA XVII MATRIZ DE DISTANCIAS GENTICAS PAREADAS K2P PARA LA REGIN ITS1. .....................59
TABLA XVIII MATRIZ DE DISTANCIAS GENTICAS PAREADAS K2P PARA LA REGIN ITS2. ....................60
TABLA XIX MOTIVOS CONSERVADOS 5.8S Y 28S EN LA REGIN ITS2 DEL GNERO PLEUROTUS ........62
TABLA XX COINCIDENCIAS ENCONTRADAS POR COMPARACIN DE ESTRUCTURA SECUNDARIA ITS2
DE LA CEPA P3215 (PLEUROTUS OSTREATUS VAR. FLORIDA). ...........................................................64

NDICE DE FIGURAS
FIGURA I FILOGENIA Y CLASIFICACIN DEL REINO FUNG. SUB REINO DIKARYA Y HONGOS BASALES.
TOMADO DE HIBBETT ET AL., 2007. ............................................................................................................ 4
FIGURA II ESQUEMA DE LA ESTRUCTURA DE LOS GENES DEL ARN RIBOSOMAL. REGIONES NO
CODIFICANTES; IGS (ESPACIADORES INTERGNICOS), ITS (ESPACIADORES DE TRANSCRIPCIN
INTERNOS); REGIONES CODIFICANTES; 5.8S Y 5S [SSU (SUBUNIDAD PEQUEA)], Y LSU
(SUBUNIDAD GRANDE). TOMADO DE WHITE ET AL., 1990. ...................................................................... 5
FIGURA III REPRESENTACIN ESQUEMTICA DE LAS REGIONES ITS. TOMADO DE CIARDO ET AL.,
2010. ................................................................................................................................................................. 5
FIGURA IV ESQUEMA DE LA ESTRUCTURA DEL GEN DE LA -TUBULINA DE SCHIZOPHYLLUM
COMMUNE. REGIONES CODIFICANTES; (EXONES) SE INDICAN CON NMEROS. REGIONES NO
CODIFICANTES; (INTRONES) SON EN BARRAS NEGRAS. TOMADO DE RUSSO ET AL., 1992. ............ 6
FIGURA V ESQUEMA DE LA ESTRUCTURA DEL GEN DEL FACTOR 1 DE ELONGACIN DE LA
TRADUCCIN (TEF1) DE SCHIZOPHYLLUM COMUNA. LOS INTRONES SE INDICAN EN LAS BARRAS
NEGRAS. LOS EXONES ESTN INDICADOS CON LOS NMEROS. TOMADO DE WENDLAND Y
KOTHE, 1997. .................................................................................................................................................. 6
FIGURA VI ESQUEMA DE LA ESTRUCTURA DEL GEN RPB2. A) LOS INTRONES SE INDICAN EN LNEAS
GRUESAS NEGRAS Y EXONES ESTN CONTADOS. TOMADO DE MATHENY ET AL., 2006. B)
REPRESENTACIN DE LOS DOMINIOS CONSERVADOS DE LA PROTENA RPB2. LOS SEGMENTOS
NEGROS REPRESENTAN 12 MOTIVOS CONSERVADOS DE AMINOCIDOS (DOMINIOS
CONSERVADOS) ENTRE LOS EUCARIOTAS. TOMADO DE LIU ET AL., 1999.......................................... 7
FIGURA VII FILOGENIA Y CLASIFICACIN DEL FILUM BASIDIOMYCOTA. ...................................................... 7
FIGURA VIII CICLO DE VIDA DE LOS BASIDIOMYCOTA. TOMADO Y MODIFICADO DE JACKSON, 2010. .... 8
FIGURA IX LA SETA OSTRA P. OSTREATUS (JACQUIN: FRIES). TOMADO DE KUMMER, 1871. ................... 9

ix

FIGURA X CICLO DE VIDA DEL GNERO PLEUROTUS TOMADO DE: VALENCIA-DEL TORO, 2002............. 9
FIGURA XI CARACTERSTICAS ANATMICAS DEL GNERO PLEUROTUS. TOMADO DE LPEZ Y
GARCA, 2004. ...............................................................................................................................................13
FIGURA XII CRECIMIENTO DEL P. OSTREATUS ECS-0110 EN MEDIO LQUIDO. SE OBSERVAN LAS
DIFERENTES FASES DE DESARROLLO: L: LATENCIA; E: EXPONENCIAL; D: DECLINACIN; S:
ESTACIONARIA. CONDICIONES DE CULTIVO: CALDO DE GLUCOSA-EXTRACTO DE LEVADURA,
-1
AGITACIN 200 RPM, AIREACIN 1 VVM Y TEMPERATURA 26C. TASA DE CRECIMIENTO 0,036 H .
TOMADO DE MARQUEZ-ROCHA ET AL., 1999. .........................................................................................18
FIGURA XIII CULTIVO POR FERMENTACIN EN ESTADO SOLIDO (FES) DE HONGOS COMESTIBLES.
TOMADO DE STAMETS, 2000. .....................................................................................................................33
FIGURA XIV CARACTERIZACIN MACROSCPICA DE LA COLONIAL MICELIAL DE LOS HONGOS.
TOMADO DE PICCOLI ET AL., 2010). ..........................................................................................................34
FIGURA XIV CRECIMIENTO MICELIAL DE LAS CEPAS POST Y P3215 AL 6TO DA CULTIVADAS EN
MEDIOS NO CONVENCIONALES COMO SEMILLA DE SORGO (SORGHUM SP.), TUZA DE MAZ (ZEA
MAYS), ARROZ (ORYZA SATIVA) Y SEMILLA DE PARCHITA (PASSIFLORA EDULIS) INCUBADAS A
25C. ...............................................................................................................................................................50
FIGURA XV ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 0,8% DE 1G DEL ADN GENMICO EXTRADO
DE LAS CEPAS DEL GNERO PLEUROTUS P3215, P132, POST, PCIT Y PRAL UTILIZANDO EL
MTODO DE LEE (1990) (A) Y EL MTODO DE SAGHAI-MAROOF, ET. AL.(1984) (B). ..........................53
FIGURA XVI ANLISIS ELECTROFORTICO DE LOS PRODUCTOS DE PCR DE LA REGIN ITS1, 5.8S Y
ITS2 AMPLIFICADOS CON LOS PRIMERS ITS1 Y ITS4 A PARTIR DEL ADN GENMICOS DE LAS
CEPAS DEL GNERO PLEUROTUS COMO P3215, P132, POST, PRAL Y PCIT EXTRADOS POR EL
MTODO DE LEE ( 1990) DILUIDA A UN FD DE 1000 (A) Y EL MTODO DE SAGHAI-MAROOF, ET. AL.
(1984) A UN FD DE 100(B). (EPM) ESCALERA DE PESO MOLECULAR 1 KB PLUS DNA LADDER (+)
CONTROL POSITIVO Y (-) AL CONTROL NEGATIVO. ...............................................................................54
FIGURA XVII PATRONES RFLP DE LOS FRAGMENTO ITS1-5.8S-ITS2 ADNR DE LAS SECUENCIAS
EF514248 PLEUROTUS OSTREATUS, EF514244 P. CYSTIDIOS, AB115043 P. CITRINOPILIATUS,
EF514250 P. TUBERREGIUM, EF514243 P. PULMONARIUS, P132, P3215A, P3215B Y POSTA,
DIGERIDOS CON LA ENZIMA HAEIII A TRAVS DE LA HERRAMIENTA NEBCUTTER V2.0 (VINCZE ET
AL., 2003). MARCADOR DE PESO MOLECULAR 100PB. ..........................................................................56
FIGURA XVIII CLADOS DE LOS ARBOLES FILOGENTICOS DE LAS REGIONES ITS1 Y 5.8S (A) E ITS2 (B)
CONSTRUIDOS POR EL MTODO NJ-K2P- 1000 BOOTSTRAP. ..............................................................61
FIGURA XIX MOTIVOS CONSERVADOS 5.8S Y 28S EN LA REGIN ITS2 DEL GNERO PLEUROTUS ......63
FIGURA XXI ESTRUCTURA SECUNDARIA DE LA SECUENCIA ITS2 DE LA CEPA P3215 (PLEUROTUS
OSTREATUS VAR. FLORIDA). .....................................................................................................................64

NDICE DE ANEXOS

ANEXO 1 KEY TO IDENTIFY MUSHROOMS TO GENUS USING ONLY MACROSCOPIC FEATURES

(LARGENT, 1986). .........................................................................................................................................75
ANEXO 2 KEYS OF GNERO PLEUROTUS (PETERSEN ET AL., 2012). .........................................................76
ANEXO 3 ANALISIS ESTADSTICO DEL EFECTO DEL MEDIO DE CULTIVO Y LA TEMPERATURA EN LA
TASA DE CRECIMIENTO MICELIAL Y PRODUCCIN DE BIOMASA DE LAS CEPAS DEL GNERO
PLEUROTUS ..................................................................................................................................................77
ANEXO 4 BLAST RESULTADO DE LA BSQUEDA PARA LAS CEPAS P3215, P132 Y POST .......................78

RESUMEN

Algunas especies del gnero Pleurotus han sido una alternativa alimentara en muchos pases, por
sus propiedades nutricionales y medicinales. En Venezuela, el cultivo de este tipo de setas es
mnimo, as como la investigacin y las fuentes de informacin para llevar a cabo este tipo de cultivos.
En la presente investigacin se realiz la caracterizacin morfolgicas e identificacin molecular
utilizando la regin ITS1 e ITS2, de las cepas Post, P132, P3215, PRAL y Pcit que se sospechaba
pertenecan al gnero Pleurotus, tambin se evaluaron algunas caractersticas fisiolgicas siguiendo
su crecimiento en medios de cultivo a diferentes temperaturas. Se determin que las cepas P132 y
Post pertenecen a la especie P. ostreatus y la cepa P3215 a especie P. ostreatus var. florida, y que
existen diferencias significativas entre el comportamiento fisiolgico de estas cepas.
Palabras clave: cultivo de hongos comestibles, Hongo Orellana, Pleurotus, seguridad alimentara,
setas.

ABSTRACT

Some species genus Pleurotus have been a food alternative in many countries, for its nutritional and
medicinal properties. In Venezuela, the cultivation of this kind of mushroom is minimal, as well as
research and information sources to carry out this type of crop. In the present investigation was
performed the morphological characterization and molecular identification using the ITS1 and ITS2,
strains Post, P132, P3215, PRAL and PciT suspected of belonging to the genus Pleurotus, some
physiological characteristics were also evaluated according to their growth in culture media at different
temperatures. it was determined that the P132 and Post strains belong to the species P. ostreatus and
strain P3215 to P. ostreatus var. florida, and that there are significant differences between the
physiological behavior of these strains.
Keywords: cultivation of edible mushrooms, mushroom "Orellana", Pleurotus, food security,
mushrooms.

INTRODUCCIN

Los hongos son microorganismos descomponedores que forman parte fundamental en la

conservacin y preservacin de los ecosistemas forestales, ayudando con la formacin del suelo;
siendo a su vez una parte importante de la cultura agroalimentaria humana desde hace miles de
aos, como un rubro de alto valor nutricional y medicinal aprovechado por las civilizaciones ms
importantes de la historia. Dentro de este grupo tenemos especies comestibles como Agaricus
bisporus comnmente llamado champin u hongo de botn difundido en pases del occidente;
Lentinula sp. denominado el hongo negro de los bosques, hiang-gu para los chinos y shiitake
para los japoneses, producido en el oriente de Asia; Pleurotus ostreatus nombrado hongo oreja de
palo, hongo Orellana" u hongo ostra; Amanita sp. y Auricularia sp. Oreja de judas; caracterizados
por ser cultivables. En muchos pases estos hongos representan una alternativa de seguridad
alimentaria y agroecolgica basada en la fermentacin de estado slido (FES) para el
aprovechamiento de los desechos agroindustriales para la produccin de alimentos de un alto valor
nutricional y potencial medicinal. Dentro de estas setas comestibles se encuentra los hongos del
gnero Pleurotus, grupo comprendido por al menos 20 especies, distribuidas en todo el mundo (Kong,
2005). Estos hongos han sido de gran inters en las ltimas dcadas en produccin y estudio como
setas comestibles y medicinales por sus caractersticas organolpticos, facilidades de cultivo y
capacidad de degradar una gran diversidad de substratos lignocelulsicas en un amplio rango de
temperaturas (Ardon, 2007), y su resistencia contra plagas (Rajarathnam et al., 1987), adems ellos
se obtiene un alimento de alto valor nutricional por su alto contenido de protena cruda y bajos niveles
de carbohidratos y presencia de sustancias biolgicas activas con propiedades medicinales.

En Venezuela, el cultivo del gnero Pleurotus de forma industrial tiene registro desde el ao
1976 hasta 1998 con una produccin estimada en peso fresco de 18 ton/ ao (Snchez y Royse,
2001); cosecha destinada a niveles socioeconmicos altos como un alimento gourmet, que debido a
su baja oferta, sus precios elevados, pocas personas con las herramientas y la formacin bsica para
su cultivo y el hecho de implementar aislados de cepas comerciales importadas de regiones
templadas, se ha dejando de producir; lo que hace necesario aumentar los esfuerzos cientficos y
tecnolgicos por recuperar aislados o cepas silvestres de estos hongos comestibles con potencial de
cultivo y desarrollar su comercializacin.

En el presente trabajo se realiz la caracterizacin morfo-anatmica, fisiolgica e identificacin

molecular a travs de la amplificacin y anlisis de la regin de los espaciadores transcritos internos
(ITS1 e IT2) intercalados por la unidad 5.8 S del ARN ribosomal, como tcnicas taxonmicas para la
identificacin de las cepas del gnero Pleurotus presentes en el Laboratorio de Biotecnologa de
Microorganismos SIXTO DAVID ROJO, y el desarrollo del cultivo por FES de estas setas para la
implementacin de metodologas fciles de desarrollar y reproducibles por productores venezolanos
que puedan cultivar su propio micelio a partir de su propia produccin y as, producir la semilla
fngica para el inicio de este tipo de cultivos. Llevando a un gran impulso en la produccin de estos
microorganismos, lo que permitira generar un desarrollo artesanal con potencial como alternativa de
seguridad alimentaria.

CAPITULO I
MARCO TEORICO

I Hongos.

La denominacin proviene del latn 'fungus': seta; griego: 'sphongos': esponja. Definido en el
sentido Botnico como cualquier vegetal hetertrofo que carecen de flagelos y clorofila, que parasitan
o viven sobre materia orgnica en descomposicin y producen esporas (Alexopoulos et al., 1996).
Los hongos son el segundo grupo eucarionte ms numerosos despus de los insectos, conforman
una parte intrnseca y transcendental para la existencia y restauracin de los ecosistemas forestales;
estn presentes en la naturaleza con una gran diversidad de especies descomponedores que
mantienen los ciclados trficos del carbono, nitrgeno y azufre, y el transporte de los nutrientes
indispensables para la existencia de los biosistemas (Palm y Chapela, 1997). Son microorganismo
que estn presentes en los ecosistemas como saprfitos, parsitos facultativos y obligados, y en
asociacin simbiticas conformando a los lquenes o las micorrizas (Guzmn, 1998). Se caracterizan
principalmente por la produccin de esporas, crecen formando filamentos septados ramificados
llamados hifas que conforman el micelio, poseen crecimiento apical en redes filamentosas de masas
algodonosas y radiales; que le permite mejor aprovechamiento de nutrimentos del medio ambiente
(Kato y Ferreira, 2003); tienen capacidad de almacenamiento de polisacridos (trehalosa y
glucgeno), con nutricin heterotrfica por absorcin debido a su pared celular (quitina) que no le
permite fagocitar, teniendo que absorber nutrientes simples y solubles mediante la degradacin va
extracelular de materia orgnica compleja principalmente celulosa, hemicelulosa y lignina, esto por la
accin de un complejo sistema de enzimas hidrolticas que liberan al ambiente (Moore-Landecker,
1996), tienen reproduccin sexual y/o asexual (Malloch et al., 1980; Guzmn et al., 1993).

I.1. Taxonoma de los hongos.

Estos microorganismos anteriormente incluidos dentro del reino vegetal, considerados como
plantas sin clorofila, constituyen un grupo muy variable y polimrfico clasificado con base en sus
caractersticas macroscpicas (Alexopoulos et al., 1996), luego segn estudios basados en la
caractersticas morfolgica macro y microscpicas segn Herrera, Ulloa, y Oronoz en (1998) fueron
ubicados dentro de un reino diferente al de las plantas, animales o protistas, denominado Reino Fung
o Myceteae, clasificado en dos divisiones naturales la divisin Myxomycota o hongos gelatinosos y
divisin Eumycota hongos verdaderos o superiores; comprendido por los grupos Phycomycota,
Ascomycota, Basidiomycota y Deuteromycota y una divisin artificial los lquenes, que incluye
organismos mixtos constituidos por algas y hongos asociados simbiticamente (Maldonado, 2007).

Durante mucho tiempo la taxonoma de los hongos estuvo basada en: estudios morfolgicos
de los rasgos macroscpicos, caractersticas ecolgicas, organolpticas (olor, sabor, consistencia y
aspecto) (Murakami y Takemaru. 1990). Rasgos microscpicos (las esporas, los elementos estriles
de las esporas, la conformacin del tejido por las hifas en el carpforo y de la estructura de la hifa),
propiedades bioqumicos y estructurales para as lograr la identificacin de las especies de este clado
(Buchanan, 1993). Pero ante la plasticidad fenotpica asociada a las condiciones ambientales de
crecimiento, se agregaron otros caracteres que permitieron identificar y clasificar de acuerdo a su
intercompatibilidad (Boidin, 1986), la tcnica consiste en el cruce de micelios monocariotico (haploide,

n) derivados a partir de una espora de una especie conocida, con micelios provenientes de una
espora de otra lnea pudindose obtener micelios dicaritico (n+n) en el caso de existir compatibilidad
(Petersen, 1992), permitiendo agrupar las distintas especies en grupos de incompatibilidad. Las
tcnicas antes mencionadas tienen desventajas con respecto al anlisis morfolgico influenciado por
el medio ambiente y condiciones experimentales in vitro; que afecta la interpretacin de los resultados
y no permite separar las homologas de las analogas.Sin embargo, no aclara la visin del Reino
Fung como un clado polifiletico; Este problema se resolvi con estudios masivos de biologa
molecular basados en el anlisis del genoma de todas las especies reportadas como miembros de
este grupo; que debido a su composicin gentica y su estructura se establecieron los diferentes
niveles taxonmicos segn su filogenias (Kauserud y Schumacher, 2003).

I.1.1 Aplicacin de la biologa molecular a la Taxonoma de los hongos.

Los primeros estudios masivos de la biologa molecular en la micologa fue la aplicacin de la

Reaccin en Cadena de Poimerasa (PCR), descrito por White et al. (1990) interesado en la
amplificacin y secuenciacin del ADN ribosomal (ADNr) para establecer la taxonoma y las
relaciones filogentica de los hongos, ya que estas molculas se encuentran en todas las clulas
fngicas vivas, por lo tanto, su evolucin podra reflejar la evolucin de todo el genoma. Estas
secuencias tambin contienen regiones variables y conservadas, lo que permite la comparacin y la
discriminacin de los microorganismos en diferentes niveles taxonmicos. En otras investigaciones
para establecer la filogenia, se ha realizado el aislamiento y el secuenciamiento de los genes
fundamentales en eucariotas: Los genes del ARN ribosmico (ADNr); genes que codifican protenas
como -tubulina, factor 1 de elongacin de la transcripcin (TEF1) y la ARN polimerasa Subunidad II
(RPB2), adems del estudio de las topologas de ciertas regiones del ADN ribosomal [ Espaciadores
de Transcripcin Internos (ITS), Subunidad Larga (LSU), Subunidad Pequea(SSU), Espaciadores
Intergnicos(IGS)]. Los resultados han permitiendo el anlisis filogenticos multilocus, con lo cual se
logr unificar el reino de los hongos como un clado monofiletico estructurado en un sub-reino Dikarya
que contempla a los antes llamados macromicetes la clases Basidiomycetes y Ascomycetes, hoy
conocidos como los fila Basidiomycota y Ascomycota; y 9 filums que contemplan a los denominados
micromycetes. Dicha clasificacin se resume en la Figura I (Hibbett et al., 2007).

Figura I Filogenia y clasificacin del Reino Fung. Sub Reino Dikarya y Hongos basales. Tomado de Hibbett et
al., 2007.

A continuacin se describen los aspectos ms resaltantes de estas tcnicas.

A. Genes del ARN ribosomal.

Los Genes del ARN ribosomal son los que codifican para el ADNr son los marcadores de la
historia filogentica de los eucariotas; presentes en varias copias de una familia multignica de genes
homlogos, dispuestos en tndem y separados por espaciadores no transcritos llamados IGS. Ellos
contienen la informacin de codificacin para los tres tipos de ARNr [18S (subunidad pequea ARNSSU), 5.8S y 28S (subunidad grande ARN-LSU)]; y de dos regiones variables de ITS1 y ITS 2 que
son no codificantes (Deacon, 2013). La figura II representa la estructura de los genes del ARN r de
los hongos.

Figura II Esquema de la estructura de los genes del ARN ribosomal. Regiones no codificantes; IGS
(espaciadores intergnicos), ITS (espaciadores de transcripcin internos); Regiones codificantes; 5.8S y 5S
[SSU (subunidad pequea)], y LSU (subunidad grande). Tomado de White et al., 1990.

A.1 Las Regin ITS1 e ITS2.

El ADNr es la regin ms conservada del genoma de los hongos con capacidad de
divergencia filogentica, albergando regiones con baja variabilidad intraespecifica, siendo estos
genes separados por dos secuencias espaciadoras internas que se transcriben junto a los genes del
ARNr, denominadas ITS1 e ITS2 (internal transcribed spacer). Las regiones ITSs son regiones
hipervariables, con una variabilidad intragnica especie-especfica, que permite alta discriminacin e
identificacin de especies; la extraccin y el anlisis individual de las regiones ITS1 e ITS2 ha sido
una tcnica utilizada en: la diferenciacin de especies de hongos, construccin de anlisis
filogenticos y trazar relaciones entre organismos a travs del modelado de sus estructuras
segundarias (Borrero, 2011). Estas regiones intergnicas pueden ser amplificadas por separado
utilizando los primers universales ITS1 - ITS2. Para la amplificacin especfica de la secuencia ITS1,
se utilizan los primers IST3 - ITS4 para la amplificacin de la secuencia ITS2 y de igual forma
amplificar las dos regiones ITS1 e ITS2 conjuntamente con la secuencia del gen 5.8S rRNA utilizando
la pareja de los primers ITS1-ITS4 como muestra la Figura III (White et al., 1990; Ciardo et al., 2010).

Figura III Representacin esquemtica de las regiones ITS. Tomado de Ciardo et al., 2010.

B. Gen de la tubulina.
Es el gen que est presente en todos los organismos y codifica la -tubulina. En el caso de los
hongos el polimorfismo de este gen sirve para identificar y diferenciar especies cripticas (sin
diferencias morfolgicas y fisiolgicas y diferencias de incompatibilidad reproductiva) (Russo et al.,
1992; Kim et al., 1997; Matsuo et al., 1999; Kim et al., 2001). La figura IV muestra la estructura del
gen de la -tubulina.

Figura IV Esquema de la estructura del gen de la -tubulina de Schizophyllum commune. Regiones

Codificantes; (exones) se indican con nmeros. Regiones no codificantes; (Intrones) son en barras negras.
Tomado de Russo et al., 1992.

C. Gen del factor 1 de elongacin de traduccin (tef1).

El gen tef1 codifica la protenaTEF1, enzima fundamental para la sntesis de protenas
ribosomales en eucariotas; presente en algunas especies en ms de una copia. Para la filogenia del
reino fung se utiliza el anlisis de secuencia parcial de este gen, en la diferenciacin entre
subespecies (Marongiu et al., 2005).La Figura V muestra la estructura del gen tef1.

Figura V Esquema de la estructura del gen del factor 1 de elongacin de la traduccin (TEF1) de Schizophyllum
comuna. Los intrones se indican en las barras negras. Los exones estn indicados con los nmeros. Tomado
de Wendland y Kothe, 1997.

D. Gen de la ARN polimerasa II (RPB2).

El gen rpb2 codifica la segunda subunidad mayor de la RNA polimerasa II, enzima que
transcribe en eucariotas el ARN inmaduro, para que luego pase por el splaysing y splaysing
alternativo (Liu et al., 1999; Matheny, 2005). En el reino Fung el polimorfismo del gen rpb2 y la
comparacin de las secuencias de aminocidos de los dominios altamente conservados en las
regiones variables entre 6 y 7 de la enzima RPB2, permiten sugerir taxonmicamente que especies
estn ms estrechamente relacionadas (Lutzoni et al., others, 2004). La Figura VI representa de
estructura del gen rpb2 y la disposicin de los dominios conservados de la protena RPB2.

Figura VI Esquema de la estructura del gen RPB2. a) Los intrones se indican en lneas gruesas negras y
exones estn contados. Tomado de Matheny et al., 2006. b) Representacin de los dominios conservados de la
protena RPB2. Los segmentos negros representan 12 motivos conservados de aminocidos (dominios
conservados) entre los eucariotas. Tomado de Liu et al., 1999.

I.2 El Filum Basidiomycota.

En el sub reino Dikarya, el filum Basidiomycota incluye alrededor de 30000 especies, en su

mayora hongos filamentosos caracterizados por producir meiosporas (basidiosporas) en el exterior
del esporangio en forma de bastn (basidio esporangio); El filum incluye tres sub fila como se
muestra en la figura VII; Pucciniomycotina en su mayora patgenos de las plantas;
Ustilaginomycotina que incluye de hongos filamentos y levaduras, de los cuales la mayora patgenos
de las angiospermas; y Agaricomycotina conforman los hongos superiores o setas y algunas formas
de levadura (Kirk et al., 2008; Lutzoni et al., 2004; Bauer et al., 2006).

Figura VII Filogenia y clasificacin del Filum Basidiomycota.

Los hongos del filum Basidiomycota se reproducen de forma sexual y asexual como se
muestra en la figura VIII, el ciclo de vida inicia con la germinacin de 2 esporas conformando las
lneas de hifas monocarioticas (n) (micelio primario), que permite la sobrevivencia y mayor invasin
de estos hongos hasta que estas 2 lneas celulares converjan y se produzca la fase de reproduccin
sexual. Esta fase sexual ocurre en 3 procesos: El primero es la plasmogamia, en el que despus del
contacto las 2 hifas monocarioticas compatibles se fusionan originando hifas dicaritica (n+n) (micelio
secundario), Este micelio crece e invade el sustrato hasta que condiciones apropiadas, disparan los
procesos de formacin del cuerpo fructfero en el cual ocurre la cariogamia , fenmeno en el que se
fusiona los ncleos haploides formando el zigoto, y por ltimo la meiosis proceso en que se da la
formacin de las esporas que luego se dispersaran y germinaran desarrollando nuevamente el
micelio primario. (Miles y Chang, 2004). Dentro de este clado destacan los gneros Agaricus
(Champin), Lentinula (Shiitake), Pleurotus (Hongo ostra), Amanita, entre otros que conforman la
mayor parte de los hongos comestibles.

Figura VIII Ciclo de vida de los Basidiomycota. Tomado y modificado de Jackson, 2010.

I.2.1 Gnero Pleurotus

El gnero Pleurotus fue descrito inicialmente por Kummer en 1871, comprende la familia
Pleurotaceae del orden Agaricales, definindolo como setas con un carpforo de estpite excntrico,
lateral o ausente; sin tejidos gelatinosos, lamelas decurrentes y conjuntas, que presentan esporas no
amiloideas de color blanco o lila plido, con una forma elptico-cilndrica, de un tamao de 4m de
longitud o ms; son hongos saprfitos en madera ssiles (Kummer, 1871). La Figura IX muestra la
representacin de estas setas establecidas en el ao 1871.

Figura IX La Seta ostra P. ostreatus (Jacquin: Fries). Tomado de Kummer, 1871.

El ciclo de vida del gnero Pleurotus se muestra en la figura X est basado en un sistema de
incompatibilidad de especies heterotlicas bifactoriales; en que la cariogamia no es inmediata a la
plasmogamia y genera una fase dicaritica o dicariofase (clula dicaritico, binucleada) con diferentes
factores de incompatibilidad conocidos como dicarin, el cual sigue creciendo de forma vegetativa
(Herrera et al., 1998). Despus ocurre la reproduccin sexual, el micelio en estado vegetativo forma
clulas especializadas, los basidios en los que se llevar a cabo la cariogamia comenzando la fase
diploide, que inmediatamente inicia el proceso de meiosis (Valencia del Toro, 2002).

Figura X Ciclo de vida del gnero Pleurotus Tomado de: Valencia-del Toro, 2002.

Dentro del gnero Pleurotus se incluye las setas con una gran diversidad de especies
distribuidas por todo el mundo; entre ellas: P. pulmonarius y P. cystidiosus localizadas en regiones
tropicales y subtropicales, P. eryngiien Europa, frica y parte de Asa, P. djamor, P. smithi, P. levis, P.
sajor-cajou, P. citrinopileatus y P. ostreatus en Latinoamrica (Kong, 2005).

I.2.1.1 Importancia del gnero Pleurotus

El gnero Pleurotus es uno de los grupos ms importantes de las setas comestibles y

medicinales del mundo despus de la especies Agaricus bisporus (Champin), Lentinula edodes
(Shiitake) y Auricularia sp. (Oreja de Judas), comprendiendo el 14% del mercado mundial de
consumo de hongos comestibles (Tabla I); debido a su facilidad de cultivo, alto rendimiento y
produccin de alimento de alto valor nutricional por su contenido de minerales, vitaminas y contenido
de protenas (Tabla II), por lo cual se le conoce tambin como "bistec vegetal" (Fennema, 2000).

El gnero Pleurotus resulta de suma importancia por sus aplicaciones en mltiples reas: En
la agricultura por su capacidad de degradar una gran diversidad de substratos en un amplio rango de
temperaturas (0C a 30C; Ardon,2007); permitiendo el aprovechamiento de diversos desechos
agroindustriales (Morillo et al., 2012), como un depsito de nutrientes vitales (vitaminas y minerales)
para potenciar las cosechas agrcolas, estos nutrientes quedan como subproducto de los cultivos de
estos hongos en lo que se conoce como compost agotado; para ser utilizado como fertilizantes
(Chang et al., 1981; Fasidi et al., 2008). En la biorremediacin: por la habilidad de estos hongos de
acumular metales pesados, degradacin de petrleo debido a su alta actividad enzimtica y variedad
de catalasas (Perna et al., 2012). En la medicina, la especie P. ostreatus son un agente
quimioteraputico por la acumulacin de pequeas concentraciones de cesio (agente activo en las
quimioterapias), presencia de sustancias antitumorales en el carpforo (Ajith y Janardhanan, 2007);
alto contenido de sustancias biolgicamente activas de alto valor nutricional y propiedades curativas,
de las que destacan antioxidantes (cido ascrbico, compuestos de -tocoferol, -caroteno y fenoles),
que actan de forma similar a la vitamina E (Murcia et al., 2002); sustancias reductoras (cistena,
metionina y lovastatina) que tienen el efecto de disminuir los niveles de colesterol en sangre y la
presin arterial. Son muy utilizados como alimento humano debido a su bajo contenido de grasa y
sodio, alto contenido de potasio y de protena; los hacen un alimento que controla padecimientos
cardiovasculares y estados de hipertensin y combate la obesidad (Kumari y Achal, 2008).As mismo
tienen potencial como alimento para animales en poca de apareamiento como estimulante sexual y
para prevenir enfermedades que se presentan en esta etapa de reproduccin (Potter y Hotchkiss,
1995).

10

Tabla I Produccin mundial de hongos comestibles cultiva dos en 1986 hasta el 2010 Peso fresco. Tomado de Miles y Chang, 2004
modificado.Rodriguez, 2007.

1970

1974

1984

1981

1986

1990

1994

1997

2002

2010

Nombre
ton

ton

ton

ton

ton

Agaricus bisporus

185

62

260

55

410

57

900

72

1220

56

1400 40,2 1850 37,6 2000 36,7 2240 35,4 2940

Lentinula edodes

94

31

148

31

191

27

180

14

320

15

400

11,3

830

16,8 1600 28,8 1160 18,2 1430

17,5

Pleurotus

22

40

2,8

170

7,8

900

25,4

800

16,2

900

16,1

930

14,6 1190

14,6

Auricularia sp.

10

0,8

120

5,5

400

11,3

420

8,6

500

8,9

600

9,47

840

10,3

Volvariella volvacea

200

4,3

180

8,2

210

5,8

300

6,1

200

3,3

350

5,59

450

5,57

Flammulina velutipes

11

42

63

100

4,8

100

4,6

140

230

4,7

300

5,2

290

4,53

360

4,46

Tremella fuciformis

40

1,8

40

1,1

160

3,2

230

3,69

290

3,52

Hypsizygus
marmoreus

60

1,1

110

1,78

130

1,62

Pholiota nameko

12

20

20

1,35

30

1,1

20

0,6

30

0,6

60

60

1,01

80

0,92

Tricholoma
matsutake

272

Grifola frondoSa

10

0,3

40

0,58

40

0,52

Otros

10

0,5

10

0,3

24

4,9

330

5,13

410

4,97

4834

100

5832

100

6340

100

8160

100

Total
Incremento (%)

36

34

513

300 100 470 100 714 100 1450

-

ton

120

100

2190 100 4033

100

51

73

62,9

11

ton

38,5

ton

10,8

ton

16,5

ton

%
36

28,7

Tabla II Composicin proximal de protenas, vitaminas y minerales de algunas especies de hongos comestibles, Los valores se expresan como mg/100g
de peso seco. Tomado de Chang y Miles, 2004; Miles y Chang, 1997.

Especie
Composicin

Agaricus bisporus

Flammulina velutipes

Lentinula edodes

P. ostreatus

V. volvacea

Humedad (%)

78,3 - 90,5

89,2

90,0 - 91,8

73,7 - 90,8

89,1

Protena cruda (N x 4.38)

23,9 - 34,8

17,6

13,4 - 17,5

10,5 - 30,4

25,9

Grasa cruda

1,7 - 8,0

1,9

4,9-8,0

1,6-2,2

2,4

Totales

51,3 - 62,5

73,1

67,5-78,0

57,6 - 81,1

Sin N

44,0 - 53,5

69,4

59,5-70,7

48,9 - 74,3

45,3

Fibra cruda

8,0 - 10,4

3,7

7,3-8,0

7,5 - 8,7

9,3

Ceniza

7,7 - 12,0

7,4

3,7-7,0

6,1 - 9,8

8,8

Valor energtico

328 - 368

378

387-392

345 - 367

276

Tiamina

1,1 - 8,9

6,1

7,8

4,8

0,3 - 1,2

Rivoflavina

3,7 - 5,0

5,2

4,9

4,7

1,6 - 3,3

Niacina

42,5 - 51,0

106,5

54,9

108,7

47,6 - 91,9

cido ascrbico

26,5 - 81,9

46,3

20,2

Ca

23 - 71

19

98

33

35 - 347

790 - 1425

278

476

1348

978 - 1337

2849 - 4762

2981

Nd

3793

2005 - 6144

Fe

0,2 - 19,0

11,1

8,5

15,2

6,0

Na

106 - 156

278

8,5

837

151 - 347

Carbohidratos

Vitaminas

Minerales

12

I.2.1.2 Caractersticas del gnero Pleurotus

Las especies del gnero Pleurotus se caracterizan por presentar carpforos blandos con un
olor y sabor caracterstico. Su tamao depende del medio donde crecen, siendo ms pequeo en
madera, que en substratos de desecho agroindustrial como de algodn y paja. Pueden ser de varios
colores, incluyendo el azul, blanco, crema a caf, amarillo y rosa, negro violceo, pardo, gris, segn
las especies; la intensidad del color se puede alterar de acuerdo a cambios en los factores
ambientales, como son la luz y la temperatura. En general, el color ser ms obscuro en condiciones
de luz intensa y clima fro, o ms claro en luz dbil y clima caliente. El estpite en este gnero se
dispone de forma excntrica, lateral o se encuentra ausente, inclusive algunas veces estos son
centrales, engrosados gradualmente hacia el lado del pleo, generalmente miden 2 cm de largo, 1 - 2
cm de grosor, y de coloracin blanquecina y contraste blanco, no presentan velo ni anillo, excepto en
algunas especies (Phillips, 1991). Como se observa en la figura XI el gnero Pleurotus presenta pleo
liso y convexo, raramente redondo, casi siempre en forma de ostra o concha, y en las etapas ms
viejas llegan a ser tipo embudo, pueden presentar escamas hacia el centro o en la base y de un
tamao de 5 - 30 cm de dimetro. El himenforo presenta laminillas con disposicin decurrente,
anastomosadas en la base, anchas, blancas, blanquecinas y a veces amarillas o grises, con un trama
himenoforal completamente irregular, conformada por hifas de pared delgada o gruesa, sus esporas
de color lila o crema en masa, en forma elipsoides de un tamao promedio de 9,5 x 3,5 m; los
basidios normales tetrapolares y cistidios como los queilocistidios usualmente presentes, un
subhimenio bien desarrollado y bien diferenciado y una trama del pleo inamiloide, con numerosas
fibulas (Singer, 1986; Largent y Stuntz, 1977; Largent et al., 1977).

Figura XI Caractersticas anatmicas del gnero Pleurotus. Tomado de Lpez y Garca, 2004.

13

A. Caracterizacin morfolgica del gnero Pleurotus

Los caracteres morfolgicas en los hongos del gnero Pleurotus son herramientas o una gua
para las descripcin e identificacin cientficas de las especies (Kohn, 1992).Para lo cual se han
generado una gran cantidad de trminos morfo-descriptivos que tratan de explicar de manera ms
precisa cada uno de los caracteres observados como forma del carpforo (pleo, himenio y estpite)
(Delgado-Fuentes et al., 2005). Los principales elementos utilizados para la caracterizacin de
especies del gnero Pleurotus son: setas con una forma plana a convexa, con colores grises, beige,
caf claros. El tamao en los carpforos va de 4.0 a 16.0 cm, con un margen ligeramente enrollado,
lminas delgadas, que se engrosa y densifica de colores crema a marfil, con insercin al pleo de
forma decurrente. El tamao del estpite varia de 0.4 a 4.0 cm, localizado de forma lateral a
excntrico, cilndrica y estriado slido, con colores crema a marfil, algunas veces flexible, frgil,
elstico. Las basidiosporas son subcilndricas a cilndricas de 6.5 13.5 X 3.0 5.0 m (Eger et al.,
1979), las colonias dicariticas tienen micelio denso y algodonoso, de crecimiento radial, algunas
veces marginal y colores que van del blanco al marfil.

La caracterizacin morfolgica tambin ha abordado el estudio del micelio en medio de cultivo

convencionales para su aislamiento y conservacin, los cuales son pasos iniciales para el cultivo de
estas setas de forma artesanal o industrial, de los que se ha reportado que en el medio Agar Papa
Dextrosa (PDA) a 25C especies como P. ostreatus tiene textura algodonosa, de color blanca,
crecimiento de la colonia de forma regular y crecimiento hifal abundante, con rangos de crecimiento
de 0.1 mm/h y 2.09 g/L/da de biomasa fresca; en otros medios como el medio Sabouraud presenta
textura polvorienta, de color beige, hifas abundantes y crecimiento de la colonia fngica de forma
regular, con rangos de crecimiento de 0.08 mm/h y 2.68 g/l/da de biomasa fresca (Sobal et al., 1989).

B. Caracterizacin fisiolgica del gnero Pleurotus

En el gnero Pleurotus los carpforos representan una estructura transitoria dentro de su ciclo de
vida. As el conocimiento ecolgico, taxonmico y fisiolgico de las especies dentro de dicho gnero
debe ser complementado con el estudio de las fases trficas de ste, analizando principalmente el
micelio vegetativo; punto donde se encuentra la mayora de la funciones de estos hongos en los
ecosistemas debido a las capacidades bioqumicas y fisiolgicas de estas estructuras. El estudio de
las capacidades bioqumicas del micelio de especies del gnero Pleurotus no slo provee de una
herramienta experimental para la descripcin de los aspectos ecolgicos y fisiolgicos de dichos
organismos; proporcionando tambin elementos para el desarrollo de procesos o productos
biotecnolgicos (capacidad del micelio vegetativo de degradar polifenoles aromticos y sustancias
carcinognicas y absorber metales txicos del ambiente) (Pointing, 2001; Baldrian y Gabriel, 2003).
Adicionalmente, diversos estudios han demostrado la capacidad de las especies del gnero Pleurotus
para producir lacasas extracelulares (Hammel, 1997), enzimas que participan en la degradacin de la
lignina que compone la madera y los sustratos en los cuales estas especies son fructificadas con
fines comerciales. Todo este potencial metablico permite que las especies del gnero Pleurotus
sean empleadas en la bioconversin de desechos de materia orgnica para la produccin de
composta y fertilizante de suelo (Croan, 2000). Hasta la fecha se han realizado diversos reportes y
estudios bioqumicos y fisiolgicos de distintas especies del gnero Pleurotus para caracterizar el
comportamiento in vitro del micelio vegetativo. No obstante, los estudios detallados en ese sentido
desarrollado en un nmero reducido de especies del total existente dentro del gnero. Siendo escaso
el estudio bioqumico, gentico y fisiolgico de cepas silvestres (Snchez y Royse, 2001).

14

a. Factores que afectan el crecimiento y la fructificacin de especies del

gnero Pleurotus
Los hongos del gnero Pleurotus; como otros microorganismos, se ven afectados por factores
abiticos y biticos, cada uno de estos factores, en un rango delimitado por un punto mnimo y un
punto mximo, bajo y sobre los cuales no ocurrir crecimiento; segn Snchez y Royse (2001) por:
Temperatura: La variacin de la temperatura, afecta el metabolismo de las clulas, incluyendo la
actividad enzimtica, y la fluidez de los lpidos de la membrana celular; variando entre especies y
adems en las diferentes etapas de su ciclo de vida. Teniendo una temperatura ptima de
germinacin de las esporas distinta a la temperatura ptima de crecimiento micelial o de la de
fructificacin. Algunas especies de este gnero pueden crecer en el rango de temperaturas desde los
0 C a 35 C, con temperaturas ptimas de 30C para la germinacin, 28 C para el crecimiento
micelial y 25C para la fructificacin.
pH: En el gnero Pleurotus el rango de pH para el crecimiento micelial oscila entre 4 y 7 con un
ptimo entre 5,5 y 6.
Sustrato: Estos hongos son saprfitos descomponedores de sustratos ricos en lignocelulosa,
reportndose su desarrollo sobre desechos agroindustriales, obteniendo un ptimo crecimiento y
fructificacin en bagazo de trigo, cebada, centeno, avena, maz, y arroz; tuza de maz, tallo de sorgo;
y sustratos con alto contenido de polmeros, azucares y lpidos.

Carbono: Las fuentes de carbono de estos microorganismos por lo general son polmeros de
naturaleza lignocelulsica ( la lignina, la celulosa y la hemicelulosa); adems azcares (la glucosa, la
manosa, la galactosa y la fructosa); y lpidos que se han reportado que la adicin de aceites vegetales
con un aumento del crecimiento micelial, los productos de la hidrlisis de estos (glicerol, cidos
grasos y saponinas) deprimen el crecimiento, pero la adicin de triglicridos y metil steres de cidos
grasos generalmente promueven su crecimiento.
Nitrgeno: Aunque a los hongos del gnero Pleurotus son capaces de degradar substratos con un
bajo contenido de nitrgeno, son capaces de emplear fuentes de nitrgeno inorgnico como Nitrato
de potasio o la urea; como tambin fuentes orgnicas.

Relacin C/N: En general estos hongos crecen en relaciones de C/N del 0,4 a 1,5; que en relaciones
de Carbono y Nitrgeno de 1-1,3 se da el crecimiento micelial ptimo, mientras que una relacin C/N
menos 0,6 se favorece la fructificacin de los carpforos.

Minerales y Vitaminas: No son capaces de crecer en ausencia de calcio, fsforo, potasio y

magnesio; y presentan una auxotrofia de tiamina, en una concentracin ptima de 100 mg/l.
La humedad en el substrato: La humedad en el sustrato influye directamente sobre el desarrollo del
hongo ya que afecta la disponibilidad de nutrientes; por lo cual este hongo a contenidos de humedad
inferiores al 50% y mayores al 80% tendr un efecto negativo en el crecimiento de P. ostreatus. El

15

contenido ptimo de humedad depende no solo de la especie de hongo que se cultiva, sino tambin
del tipo de substrato utilizado.

La humedad del aire: Factor fundamental para una ptima fructificacin, dado que el micelio
secundario est formado por un alto contenido de agua y su estructura no les permite retener la
humedad en condiciones adversas, un balance adecuado entre la humedad ambiental y el contenido
de humedad del hongo es necesario, por lo que para una correcto desarrollo la humedad debe estar
entre 85-90 %.

Tamao del sustrato: El tamao del sustrato afecta el crecimiento y la fructificacin, porque se
relaciona con la accesibilidad a los nutrientes, al agua y al aire por parte del micelio del hongo; en
relacin a esto el tamaos del sustrato para un ptimo de desarrollo es de 2-3 cm.

La aireacin: El oxgeno es un elemento de gran importancia para el crecimiento de los

basidiomicetos porque son organismos aerobios, que tienen requerimientos de oxgeno diferentes
segn el estado fisiolgico en que se encuentren, de lo cual concentraciones altas de CO 2 estimula la
germinacin de las esporas y el crecimiento micelial pero inhibe la fructificacin; obteniendo un
ptimo de crecimiento micelial a 28% de CO2 presente en el aire. Por otra parte en ausencia de CO 2
se ha encontrado prdida de materia orgnica y la deslignificacin del substrato a una mayor tasa.

b. Cintica del crecimiento micelial

El crecimiento del micelio en los hongos filamentosos como los del gnero Pleurotus se
efecta por la elongacin y ramificacin de las hifas que puede iniciarse a partir de una espora o de
una fraccin viable de tejido, dicho crecimiento se da en forma apical, por la elongacin y divisin de
la clula terminal produciendo un crecimiento tpico en forma de micelio (Cano et al., 1997; Parlad
Izquierdo et al., 2011). Segn el medio en el que se establecen los hongos filamentosos (lquido o
slido), procede la extensin y ramificacin de sus hifas (Matsuura, 2000), establecidas por el
desarrollo espacial determinstico y el ngulo que se forma al surgir sus nuevas hifas; considerndose
la presencia de dos diferentes tipos de hifas (madre y ramificada) caracterizadas por diferentes
velocidades de desarrollo y la disposicin de nutrientes en el medio de cultivo (Camacho, 2009).

i. Crecimiento micelial en medio slido

En la naturaleza los hongos del gnero Pleurotus suelen crecer en sustratos orgnicos
slidos, principalmente aquellos de naturaleza lignocelulosica que se encuentran hmedos y
aireados, lo cual los hace ideales para propagacin de inculos a ser utilizados en procesos de cultivo
en medios en estado slido, en los que se busca que el micelio invada lo ms extensamente posible
el sustrato, utilizando esta estrategia se han creado procesos para: produccin de biomasa destinada
a la alimentacin humana o animal (C. W. Hesseltine, 1972), composteo de desechos orgnicos para
la obtencin de abonos (A. Pandey, 1992), y de sustratos para el cultivo de otros hongos comestibles
(Derikx et al., 1990). Sin embargo, ha sido el estudio del crecimiento micelial de estos hongos
filamentos abordado a travs del cultivo en placas de agar para el estudio de los mecanismos de
crecimiento en ste sistema de cultivo; permitiendo la observacin de las condiciones de limitacin de
fuentes de carbono, la formacin de hifas y micelio de baja densidad o menor frecuencia de
ramificacin (Trinci, 1969, 1971, 1974); obteniendo como resultado que en medios solidos las
colonias fngicas se forman a partir de hifas que crecen apicalmente, ramificndose, las cuales se

16

superponen una con otra para el llenado de reas disponibles en el medio, formando complejas redes
radiales con bordes irregulares que le permiten al hongo desarrollarse y encontrar sus nutrientes
(Soddell et al., 1994; Lpez y Jensen, 2002; Matsuura, 2002), a una tasa que vara segn el estadio
del micelio y la disposicin de los nutrientes (Yang et al., 1992); condiciones en que el crecimiento de
las puntas y ramificaciones del micelial joven siguen una distribucin normal y las hifas madre
fngicas se extienden a una velocidad lineal constante cuando los nutrimentos del medio son
ilimitados y algunos otros factores ambientales permanecen estables.

El cultivo en medio slido (CMS) de micelio del hongo del gnero Pleurotus, es el mtodo
comn de propagacin del micelio para su posterior utilizacin en la produccin de inculos semilla
y consiste en el crecimiento de micelio en granos de cereales (trigo, sorgo, arroz, etc.), una vez
obtenido el inculo-grano se mantiene en condiciones ptimas para su conservacin, hasta su
utilizacin para inocular el sustrato que se emplear para la produccin de cuerpos fructferos
(Guilln-Navarro et al., 1998). Una alternativa para la obtencin de semilla es la utilizacin de
micelio crecido en medio lquido ya que permitir producir mayor cantidad de biomasa de mejor
calidad en menor tiempo, favorecer la adaptacin y dispersin del hongo en el trigo y facilitar su
manipulacin durante la siembra. La caracterizacin de la morfologa de crecimiento micelial es
importante en los estudios fisiolgicos y de ingeniera de los hongos filamentosos, como en el diseo
y operacin de fermentaciones fngicas. Los sistemas de CMS que se utilizan en el cultivo de los
hongos como Pleurotus, son mecanismos geomtricamente complejos con distribucin espacial
heterognea de los componentes del sistema. Por lo que el crecimiento est determinado por los
gradientes de concentracin que son difciles de medir, por lo que se hace nfasis en la produccin
de carpofros para hacer evidencia del efecto del sustrato en el desarrollo del hongo (Mitchell et al.,
1991).

ii. Crecimiento micelial en medio lquido

Dependiendo de la composicin del medio y de las condiciones de cultivo, en los medios
lquidos el desarrollo del micelio de los hongos filamentosos como los del gnero Pleurotus vara, as,
en condiciones de reposo provoca que el micelio de estos hongos crezca slo sobre la superficie del
lquido, o en condiciones de agitacin, en las que el micelio crece en todo el volumen pudiendo o no
formar pellets (pequeas esferas de micelio). En estos medios los hongos suelen presentar un
desarrollo tpico, similar al de otros organismos y que consta de las siguientes fases: de adaptacin o
Lag, estacionaria, declinacin y muerte. Este desarrollo se puede representar de manera grfica
mediante una curva del peso celular seco o biomasa en gramos por litro (mg/ml) versus tiempo de
incubacin (T). Cuando el crecimiento de un hongo se da en un medio slido en lugar de fase
exponencial se presenta una fase de crecimiento ms o menos lineal (Lilly y Barnett, 1951). En la
figura XII se muestra el comportamiento tpico del crecimiento de un hongo en medio lquido.

Fase de adaptacin o Lag: Es una etapa en la que no se observa un crecimiento vigoroso, ms bien
los organismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de
nutrimentos generalmente) para poder iniciar el crecimiento exponencial.
Fase exponencial o logartmica (log): Una vez que el hongo crece en el medio nutritivo, ocurre una
fase de crecimiento equilibrado, donde se duplica la poblacin de clulas a intervalos regulares, en
esta etapa se aprovechan al mximo los nutrimentos y son consumidos continuamente.

17

Fase estacionaria: En esta fase el crecimiento cesa, est equilibrado por la muerte celular, esta fase
se alcanza si disminuye algn nutrimento esencial u otro cambio en el medio fsico. Esta fase tiene
gran importancia porque probablemente represente el estado metablico real de los microorganismos
en muchos ambientes naturales. El hongo puede reiniciar su crecimiento si es resembrado en nuevo
medio propicio. En esta fase se producen diversos tipos de enzimas autolticas que conducen a la
muerte del hongo (Snchez y Royse, 2001).
Fase de declinacin y muerte micelial: Al acumularse desechos metablicos del hongo, pueden
alcanzar niveles que limiten su crecimiento, o si algn nutrimento se termina. Pueden aparecer
mutaciones celulares, esto explica por qu la resiembra continua de un organismo en un medio de
cultivo, sobre todo sinttico, puede conducir rpidamente al agotamiento de la cepa o a la prdida de
la misma (Snchez y Royse, 2001).

Figura XII Crecimiento del P. ostreatus ECS-0110 en medio lquido. Se observan las diferentes fases de
desarrollo: L: latencia; E: exponencial; D: declinacin; S: estacionaria. Condiciones de cultivo: caldo de glucosa-1
extracto de levadura, agitacin 200 rpm, aireacin 1 vvm y temperatura 26C. Tasa de crecimiento 0,036 h .
Tomado de Marquez-Rocha et al., 1999.

C. Caracterizacin molecular de especies del gnero Pleurotus

La taxonoma del gnero Pleurotus basada en diferencias morfolgicas por mucho tiempo fue
correcta, pero muchas veces ante la plasticidad de los caracteres morfolgicos debido a las
condiciones climticas en las que se desenvuelven, hicieron que fuera difcil la distincin entre
algunas especies, aislados y/o cepas de Pleurotus ampliamente conocidos. Por lo que otras
herramientas como la gentica molecular permitieron avanzar en la taxonoma de este gnero,
tcnicas fundamentadas en identificar y diferenciar las especies del gnero Pleurotus a travs de la
determinacin de las similitudes en las secuencias de genes y protenas muy conservados dentro del
grupo.

Las herramientas moleculares aplicadas a la taxonoma, han permitido determinar la

secuencia de nucletidos del ADN, y realizar la caracterizacin estructural de los genes, lo que
permiti analizar cualquier fragmento de ADN y detectar regiones regulatorias, genes estructurales e
intrones, la secuencia de aminocidos que codifican estos genes. A su vez la secuenciacin de
nucletidos y protenas estmulo al desarrollo de software para almacenamiento de datos y
comparacin de secuencias de ADN para la creacin de bancos de informacin de ADN de diferentes
seres vivos, donde pueden consultarse y compararse todas las secuencias de los genes y de los
genomas y proteomas que han sido publicadas (Bolvar, 2004).

18

I.2.1.3 Cultivo del gnero Pleurotus

El cultivo de Pleurotus de forma industrial, a pesar de ser relativamente reciente; ha tenido una
gran atencin como proceso biotecnolgico que permite la desgregacin de la variedad de substratos
lignocelulsicos en un amplio rango de temperaturas permitiendo as aprovechar diferentes desechos
agronmicos, fundamentado actualmente en el CMS y la FES, utilizada tanto en la transformacin de
residuos en alimentos para animales, como en la produccin de alimento de alto potencial nutricional
y biofertilizante. As mismo, en la fermentacin lquida sumergida para la produccin de biomasa,
complejos biolgicos activos y enzimas (Smith et al., 2002).

A. Fermentacin en estado slido con Pleurotus

La FES es un proceso de transformacin de material biolgico en el cual el sustrato slido carece

de agua libre permitiendo el desarrollo de microorganismos que crecen sobre la superficie o en el
interior de una matriz porosa, El trmino FES fue empleado por Hesseltine (1977) como un proceso
de fermentaciones en las que el sustrato empleado no es lquido, posteriormente se platea que esta
definicin debe ser usada para el crecimiento y desarrollo de microorganismos en materiales slidos
no sumergidos en una fase lquida. La FES es utilizada tanto en la produccin de ensilados, como en
el cultivo de hongos comestibles y en procesos biotecnolgicos industriales con la obtencin de
metablitos primarios y secundarios como enzimas, qumicos, alcohol y su aplicacin como cultivos
iniciadores (Roussos et al., 1997). El cultivo de hongos comestibles por fermentacin solida es visto
como la forma ms eficiente de conversin de residuos vegetales en alimento de alto valor nutricional
cuya importancia ecolgica de esta actividad econmica radica en la utilizacin y reciclaje de ms de
280.000 toneladas anuales de subproductos agrcolas y agroindustriales que pueden ser puros o
mezclados (Bermdez et al., 2003). El Cultivo de Pleurotus por FES ha implicado la utilizacin de
sustrato slido en matrices, medios agarizados, y desecho de naturaleza lignocelulsicos; para la
degradacin de la lignina, la produccin de alimento animal o la produccin de enzimas (Gregori et
al.,2007).

a. FES para la produccin de biomasa micelial y hongos.

La FES biomasa micelial se ha utilizado en el cultivo de Pleurotus a travs de medios
agarizados, medios como extracto de malta agar (MEA) y Agar Papa Dextrosa (PDA) que han
permitido la caracterizacin de estos microorganismo, determinando las tasas de crecimiento micelial,
las condiciones ptimas de crecimiento micelial del hongo, y evaluar los efectos fisiolgicos de la
temperatura, diferentes fuentes de carbono, nitrgeno y suplementos de sales inorgnicas sobre el
micelio (Guo et al., 2006); adems por medio del cultivo de estos hongos en sustratos no
convencionales como los desechos agroindustriales para la produccin de micelio y la produccin de
hongos; mtodo en que se ha podido estudiar los diferentes sustratos y las proporciones de estos
para el crecimiento optimo del micelio, la propagacin del micelio dentro del sustrato, la induccin de
la fructificacin y el rendimiento de produccin (Yildiz et al., 2006).

b. Uso de los desechos del cultivo de Pleurotus por FES.

La FES de desechos agroindustriales para el cultivo de Pleurotus, ha sido una tcnica que
permite la transformacin de desechos agroindustriales para la produccin de un alimento de alto

19

valor nutricional, dando origen a diferentes subproductos tras la colecta de la cosecha del cultivo,
denominados como compost agotado; producto con propiedades de inters en la agricultura por el
potencial de estos residuos y subproductos agrcolas, ya sea para la transformacin en alimentos
para animales o como sustratos primarios para la produccin de enzimas por otros microorganismos
o a partir de estos desechos.

B. Fermentacin lquida sumergida con Pleurotus

La tcnicas de la fermentacin liquida sumergida (FLS) se han desarrollado para una variedad de
hongos y la propagacin de micelio para la produccin de semilla lquida que luego es inoculo para la
fructificacin por FES; la produccin de biomasa para alimento animal, aplicaciones farmacuticas y
de suplementos dietticos, adems de la conversin de biomasa de residuos y la produccin de
enzimas; siendo as un mtodo que permite la posibilidad de alta produccin de biomasa en un
espacio compacto, menos tiempo y con menos posibilidades de contaminacin (Yang y Liau, 1998;
Friel y McLoughlin, 2000).

20

CAPITULO II
ANTECEDENTES

II.1 Los hongos

Se estima que existen 1,5 millones de especies de hongos y 140 mil corresponden a hongos
macroscpicos, de los que se conoce slo el 10%. Un amplio nmero de estas setas han mostrado
una gran cantidad de propiedades farmacolgicas y potencial con alimento de alto valor nutricional;
estimndose recientemente entre 270 a 700 las especies de hongos comestibles y medicinales
(Smith et al., 2002; Wasser, 2002).

La capacidad de los hongos de tener efectos benficos en la salud y en el tratamiento de

algunas enfermedades (Selegean et al., 2009), es debida seguramente a la biosntesis de metabolitos
secundarios biolgicamente activos. Hoy en da, estructuras de alrededor de 140 mil metabolitos
secundarios aislados de basidiomicetos se ha elucidado (Zaidman et al., 2005). Las aplicaciones de
los hongos, sus extractos y compuestos se incluyen en complementos medicinales o suplementos
dietticos, como agentes anticancergenos, antivirales, inmunopotenciadores, hipocolestermicos y
hepatoprotectores, formando una nueva clase de compuestos llamados nutracuticos (Chang, 2008).
Dentro de los hongos comestibles con propiedades medicinales est el gnero Pleurotus (Croan,
2000) que es ampliamente conocido como hongo medicinal en diferentes partes del mundo (Ajith y
Janardhanan, 2007).

II.1.1 Los Hongos comestibles

Los hongos comestibles en la actualidad comprenden cerca de 14000 gneros de hongos

superiores de los fila Basidiomycota y Ascomycota, como son Agaricus sp. comnmente llamado
hongo blanco, champin u hongo de botn difundido en pases del occidente; Lentinula sp.
denominado el hongo negro de los bosques, hiang-gu para los chinos y shiitake para los
japoneses, siendo uno de los hongos comestibles ms producido en el oriente de Asia ; Pleurotus,
nombradas tambin oreja, hongo orellana" u hongo ostra; Amanita sp. Y Auricularia sp. (Oreja de
judas), son importantes fuentes de protena que tienen un alto potencial para enriquecer la dieta
humana; caracterizados por poseer cuerpos fructferos que pueden ser cosechados fcilmente bajo
condiciones especficas de cultivo dependiendo de la especie que se desee cultivar; adems tienen
gran importancia etnomicolgica, ya que son muy estimados por diversos grupos tnicos, a nivel
mundial su produccin representa la mayor industria basada en FES (Miles y Chang, 2004;
Hernndez y Lpez, 2006). Estos microorganismos han sido parte de la dieta humana desde hace
varios siglos por la capacidad de producir variedad de metabolitos segundarios con potencial
nutricional y molculas biolgicas activas que favorecen la calidad de vida del hombre, como son los
antibiticos, agentes antitumorales, antiinflamatorios, anticolesterolmicos y antioxidantes (LpezRodrguez et al., 2008).

21

II.1.2 Historia del cultivo de los hongos comestibles

El cultivo de hongos comestibles es una actividad productiva basada en tecnologas limpias

para el ecosistema fcil de realizar, que se puede desarrollar en forma personal, grupal, familiar y
por comunidades; esta actividad se ha realizado desde la poca de la antigua Grecia (1200 A.C.)
que se llevaban de forma abierta, basada en recolectar numerosas especies de hongos que crecan
a la intemperie sobre los rboles, ms tarde en el ao 60 A.C. es cultivado por primera vez en China
el gnero Auricularia spp., desde entonces se han desarrollando diversos mtodos para su cultivo
,(S. Chang y Miles, 1989) luego los romanos y los celtas implementaron el cultivo ya no solo como
alimento sino por sus propiedades medicinales y txicas, sino tambin por las propiedades
alucingenas de algunas especies, siendo utilizados para rituales; despus en la Edad Media eran
un alimento de consumo slo a la realeza. En el siglo XVII se inicia en Francia el cultivo bajo
condiciones cerradas, en Espaa se logra industrializar explotando el cultivo de especies como
Agaricus sp. (Champin) y Lentinula sp. (Shiitake). En el siglo XXVIII comienza el cultivo de
Pleurotus de forma industrial con la FES abierta; abordando esta actividad una gran parte de Europa,
posteriormente en Francia, Hungra, Italia y Checoslovaquia se desarrolla su cultivo por FES cerrada.
Simultneamente en Amrica el cultivo de hongos comestibles se derrollaba por las etnias desde
varios siglos atrs con el cultivo de hongos alucingenos (Hernndez y Lpez, 2006).

Desde los aos 70 se desarrollo en varios pases de Latinoamerica (Mxico, Ecuador, Chile y
Per) el cultivo de hongos comestibles de forma industrial, basados en el cultivo de especies del
gnero Pleurotus por las facilidades de cultivo y propiedades, como sus pocas necesidades
nutricionales, fcilidad de adaptacin a los ambientes de cultivo, requiriendo de tcnicas simples y
econmicas; siendo los desechos agroindustriales una de las mejores fuentes de carbono, nitrgeno,
azufre y fsforo necesarias para el desarrollo adecuado de la biomasa fngica de estos hongos
(Cabrera et al., 1998; Madigan et al., 2008).

En Venezuela el cultivo de hongos comestibles ha sido una actividad que se ha venido

desarrollando desde 1968 con el cultivo del champin (Agaricus bisporus), extendindose a la
produccin del hongo Orellana (Pleurotus ostreatus) como un alimento gourmet; partiendo de
aislados importados de pases como Argentina, Mxico, EEUU y Espaa (Torres y Hurtado, 2003);
actualmente desarrollada en los estados Trujillo y Tchira, comercializndose de forma fresca o
enlatados. Sin embargo, por sus propiedades los hongos comestibles como los pertenecientes al
gnero Pleurotus ha sido de inters de estudio por los ltimos 60 aos en pas, como una alternativa
de produccin de extractos enzimticos tiles como fuentes de enzimas fibrolticas exgenas para el
alimento de rumiantes (Mrquez-Araque et al., 2007), para la degradacin de desechos
agroindustriales (Miro, 2004) y descripcin de la micodiversidad presentes en el pas (Dennis, 1970;
Iturriaga y Minter, 2006).

II.1.3. Taxonoma del gnero Pleurotus

La taxonoma y caracterizacin de las especies del gnero Pleurotus han resultado difciles al
realizarse por los miclogos para identificar y diferenciar unos de otro debido al parentesco morfoanatmico del carpforo entre en cada especie y cepa como respuesta a las condiciones ambientales
en que se encuentre (Zervakis et al., 2001). Sin embargo, ante este sesgo se ha encontrado entre
estos organismos debido a las barreras de reproduccin no absolutas que implican incompatibilidad
parcial y un proceso de especiacin, siendo necesario otra herramienta para el taxnomo en la

22

descripcin y distincin de especies como la intercompatibilidad (Cailleux et al., 1981). La especiacin

dentro del Reino Fung se ha visto influenciada por el control gentico de dos importantes eventos en
sus ciclos de vida; como son el apareamiento y la fructificacin, puntos que conllevan a la variacin,
seleccin y el aislamiento de estos microorganismo; mecanismo que se ha podido observar en el
gnero Pleurotus, como es en los aislados de P. ostreatus que se originan en diversas partes del
mundo y que al cruzarlos crecen en diferentes substratos reflejan hasta un 100% de compatibilidad,
resultando hbridos viables y que desarrollan carpforos frtiles. Sin embargo, la compatibilidad se
reduce, cuando al intentar la hibridacin entre las especies con morfovariantes aloptricas como
aislados de P. abalonus y P. cystidiosus, o con diferentes ecotipos de P. eryngii; se presentan
barreras totales de reproduccin entre las especies de Pleurotus que a veces son morfolgicamente
indistinguibles (Bermdez et al., 2003). Se ha encontrado que la especiacin en este gnero
contempla un sistema de incompatibilidad heterotlico bifactorial, el cual consta de dos factores
ubicados en dos loci independientes entre s (A y B), denominados loci de incompatibilidad o genes
de apareamiento; conformados a su vez por uno o ms subloci fuertemente unidos y funcionalmente
equivalentes por la compatibiliad de un locus del tipo de apareamiento heterocigtico de uno de los
dos subloci; regiones genticas que constan de ms de 100 alelos del tipo de apareamiento por locus
de incompatibilidad (Raper, 1966). La diversidad de alelos es atribuida a todas las combinaciones
allicas posibles de dichos subloci a travs del proceso de recombinacin para originar una progenie
frtil (Larraya et al., 2001; James et al., 2004; Ramrez et al., 2010).

A pesar de todos los esfuerzos por aclarar el clado, la taxonoma de las especies de
Pleurotus, sigue siendo confusa; a pesar de que el estudio morfolgico y de intercompatibilidad
parcial de especies fueron herramientas que por largo tiempo soportaron la taxonmia para distinguir
y clasificar a estos microrganismos (Snchez y Roysee, 2001). Estas herramientas an tienen
algunas delimitacin entre la resolucin de los clados de especies a menudo difciles de resolver, que
viene a consecuencia de la definicin de especie biologica definida como grupo de organismos
iguales capaces de entrecruzarse y de producir descendencia frtil; pero para el caso de estos
hongos y otros, se maneja el concepto "complejo de especies" que se aplica ampliamente para definir
especies estrechamente relacionadas que son completamente o parcialmente intercompatibles
(cruces frtiles) y pertenecientes a un grupo interestril dado. Para el gnero Pleurotus se han
propuesto varios complejos de especies (Bao et al., 2004; Zervakis et al., 2001). Dada su amplia
diversidad y su complejidad estructural, fisiolgica y morfolgica, ha sido necesario clasificarlos segn
sus caractersticas ms intrnsecas como la interesterilidad o sistema de incompatibilidad sexual, con
la cual se permiti diferenciar y categorizar las diferentes especies, sinnimos y/o taxas de nivel de
subespecies en 11 grupos de complejos de especies (Tabla III), indicando adems la posibilidad de
compatibilidad entre ella, la posibilidad de crear nuevas especies dentro de este gnero; llevando a
las necesidad del uso de otras herramientas como la biologa molecular que ha conducido la mejor
comprensin de la identidad, variacin gentica y filogenia del gnero Pleurotus y otros
Basidiomycota; a travs del uso de marcadores moleculares de RFLP y secuenciacin de ADN de
diferentes regiones del genoma nuclear y extracromosmico (Vilgalys y Sun, 1994; Zervakis et al.,
1994; Gonzalez y Labarre, 2000; Zervakis el a., 2004).

23

Tabla III Especies biolgicas establecidas dentro del gnero Pleurotus, sus sinnimos correspondientes y/o taxa de nivel de subespecies , y grupos
respectivos de ntercompatibilidad; y su distribucin mundial. Tomado: Vilgalys et al., 1996) y Kong,. 2005.

Especie

Sinnimos y/o taxa de nivel de sub

especies

Grupos

Norte
Amrica

Europa

Asia

Pleurotus otreatus

P. combilunus; P. florida; P. Salignus;

P. spodoleucus

P. pulmonarius

P. sajor-caju; P. sapidus

II

III

*
*

P. populinus
P. cornopopiae
P. djamor
P. eryngii
P. cystidiosus

P. citrinopeliatus
P. flabellatus; P. otreatoroseus;
P. salmoneostramineus; P. euosmus
P. ferulae; P. nebrodensis; P.
hadamardii
P. abolanus

IV
V

VI
VII

P. caliptratus

VIII

P. levis

VIII

P. dryinus

IX

P. purpureo-olivaceus

P.turber-regiun

XI

P. agaves

XI

P. abieticola

XI

P. brazil

XI

P. australis

XI

24

Amrica
del Sur

frica

Australia

*
*
*

*
*
*

II.1.3.1 El control gentico y morfolgico del proceso de fructificacin

La morfognesis de los carpforos del gnero Pleurotus como de otros basidiomicetos, es un

campo ampliamente investigado en la actualidad, tanto a nivel fisiolgico como gentico; revelando la
existencia de una serie de genes expresados exclusivamente en alguna fase del desarrollo de estos
cuerpos fructferos (Lacourt et al., 2002; Lee et al., 2002; Sunagawa y Magae, 2005),entre los que se
encuentran los genes hidrofobnicos presentes en tanda, siendo genes marcadores de compatibilidad
que determinan el establecimiento del tipo de micelio frtil de estos hongos, como tambin diferenciar
entre micelio monocaritico y dicaritico (Koltin et al., 1972).Por otro lado, se ha comprobado que en
la morfognesis de los carpforos de las especies de Pleurotus, no solo influyen aspectos genticos,
sino tambin factores ambientales como la intensidad luminosa y temperatura (Eger, et al., 1974;
Marino et al., 2003). Estudios han determinado que la respuesta morfogentica en Pleurotus,
depende principalmente del intervalo de longitud de onda de la luz situado entre 200 - 400 nm,
correspondiente del ultravioleta al azul respectivamente (Tan, 1977). Tambin se observ que al
disminuir la intensidad de luz, el estpite se alarga y adelgaza, el pleo se reduce parcialmente, el
incremento en la duracin e intensidad luminosa disminuye el nmero de primordios; por otro lado, se
ha reportado que la luz verde retarda el crecimiento micelial, produce la formacin de primordios y su
elongacin aunque el desarrollo de carpforos solo se induce con luz blanca (Zadrazil, 1978; Danai et
al., 1998).

A. Mtodos utilizados para la obtencin de ADN genmico en hongos.

Para la identificacin del gnero Pleurotus, se pueden emplear algunas tcnicas moleculares
que faciliten descripcin y la seleccin de rasgos cuantitativos tales como la tasa de crecimiento,
rendimiento agronmico, acumulacin de metabolitos de inters, as como tambin de caractersticas
de resistencia a patgenos y formacin de esporas (Ramrez et al., 2010). Sin embargo, el anlisis
gentico de muchas especies del gnero Pleurotus como de otros hongos utilizando tcnicas de
biologa molecular, resultan ser procesos lentos debido, inicialmente, a los mtodos de extraccin de
ADN utilizados (Graham et al., 1994), siendo a travs del tiempo modificados las diferentes
metodologas para el proceso de obtencin de ADN genmico en plantas y hongos, arrojando que
dependiendo de la especie que se pretenda utilizar, se pueden aplicar procesos de rompimiento
mecnico de membranas para liberar ncleos, lisis celular y extraccin con amortiguadores
(compuestas de Sales, bromuro de hexadeciltrimetil amonio o Triton), seguidas de extracciones con
Fenol-Cloroformo, sucesivas centrifugaciones y precipitacin con alcoholes, principalmente etanol e
isopropanol y, con la finalidad de obtener ADN ms limpio y puro, se puede acoplar en la metodologa
el uso de enzimas tales como la ARNasa y proteinasa K, as como lavados con fenol equilibrado.
Actualmente existen reportes de diferentes metodologas para la extraccin de ADN genmico de
organismos vegetales como los protocolos de Murria y Thompson (1980), Dellaporta et al. (1983) y
Saghai-Maroof et al. (1984) y debido a la similitud estructural entre plantas y hongos (Zolan y Pukkila,
1986) y diferentes especies de gnero Pleurotus (Gonzalez y Labarre, 2000).

B. Aplicaciones de tcnicas de la biologa molecular del gnero Pleurotus

El RFLP en los aos 90, fue una de las primeras herramientas de biologa molecular para la
discriminacin de especies y la intercompatibilidad entre estas en el gnero Pleurotus, haciendo
discriminacin con base en a las diferencias hereditarias, en las longitudes de fragmentos de ADN
que se generan por la digestin con una endonucleasa de restriccin, reflejando relaciones estrechas
en los patrones de digestin entre especies como P. citrinopileatus y P. cornucopiae que por estudios

25

de intercompatibilidad se le asoci a P. citrinopileatus como una variedad de P. cornucopiae (Ohira,

1990), y tras este mtodo se revel tambin la estrecha relacin entre P. citrinopileatus y P.
cornucopiae como 2 especies que comparten el mismo grupo de intercompatibilidad.

La tcnicas RAPD, seguido de la RFLP; ha sido una metodologa que ha permitido el estudio
de la estructura de poblaciones del gnero Pleurotus que son difcil de caracterizar con otros
marcadores o para aclarar la sistemtica basado en criterios tradicionales (Assigbetse et al., 1994;
Holmes et al., 1994), como fue determinar la sistemtica y valorar la diversidad de taxones de
Pleurotus asociado con umbelferas, y determinar el proceso de especiacin en el complejo de
especies asociado a P. eryngii (Zervakis et al., 2001b). La tcnica SCAR en el gnero Pleurotus se ha
utilizado con el fin de estimar la diversidad de los tipos de apareamiento en especies como P. eryngii
de diferentes regiones, evaluando el emparejamientos entre monocariones derivadas de inter e intra
grupos, identificacin 16 alelos en los loci A y B, que son responsables de la fertilidad en el ciclo de
vida; reflejando secuencias consenso como la caja TATA y caja GC; influyendo en la eficiencia
biolgica de esta especie.

El RFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin), RAPDs (Amplificacin

aleatoria de ADN polimrfico), SCARs (caracterizacin de la secuencia de la regin amplificada), y
SSRs (microSatlites) han sido tecnicas que determinaron el cariotipo del gnero Pleurotus, el cual
posee 11 pares de cromosomas, con un tamao cromosmico de 35 mega pares de bases (Larraya
et al., 1999), que cuenta con un gran nmero de marcadores genticos funcionales y annimos. Para
ello se utiliza ADN mitocondrial y ADN ribosomal para cuantificar las relaciones entre poblaciones de
una misma especies distribuidas por todo el mundo y diferentes especies de este gnero,
demostrando que existen diferentes fenotipos, relacionados con la ubicacin geogrfica y divergen
genticamente. Segn (Bunyard et al. , 1996) demuestran que los anlisis filogenticos son tiles
para entender los patrones de la evolucin y especiacin de estas setas en un contexto
biogeogrfico.

II.1.3.2 Algunas especies del gnero Pleurotus en Latinoamrica.

A. P. ostreatus (Jacquim ex Fries) Kummer.

Esta especie se caracteriza por tener un pleo liso, a veces algo escamoso hacia el centro o
base; de 5 a 10 cm de ancho, grisceo con tonos metlicos, lminas decurrentes de color blanco o
amarillento al secarse, poco o nada unidas entre s en la base; ms o menos delgadas y con bordes
lisos, ssiles con estpite excntrico muy corto y mal definido, contorno color blanco, consistencia
carnosa-correosa con color y sabor agradables. Crecen sobre troncos podridos o rboles en zonas
tropicales, subtropicales o bosque de pino y encino (Griffin, 1972; Argueta, 1983; Snchez, 1994). El
Micelio presenta una coloracin blanca, su crecimiento es radial, tornndose algodonoso; y al
envejecer secreta a menudo gotas amarillentas o anaranjadas (Rolf Singer, 1986). Las esporas de
esta especie son subcilndricas de forma de rion, en promedio de 8-9 x 3-4 m; su esporada es
blanca o ligeramente lila o gris (Kummer, 1871).

26

B. P. levis (Berk y M.A Curtis).

Setas que presentan un carpforo de color rosa plido, rosa Salmn al madurar, secos son
amarillentos, correosos a duros; el pleo presenta hifas erectas de 2 mm dndole un aspecto
aterciopelado, con una forma convexa-plana a deprimida, con un dimetro en promedio de 15-21 cm.
Estpite subcilndrico, excntrico de ms de l0 cm de longitud y superficie pubescente, de color rosa
plido a blanco. Las lminas son decurrentes, gruesas, separadas entre s, de borde entero a
dentado-lacerado, de un color blanco a rosa plido y sobre el estpite forman un retculo rudimentario.
Su micelio es formado por hifas de pared relativamente gruesa y de pared delgada. Estos hongos
crecen en troncos podridos en bosques subtropicales (Singer, 1986; Arora, 1986; Guzmn, 1990;
Phillips, 1991; Chacn et al., 1995; Laso, 1996; A. Lpez y Garca, 2009). Las esporas de esta
especie son entre cilndricas a subcilndricas lisas, de pared delgada, hialinas, de 9-15 x 4-5 m
(Singer, 1951).

C. P. dryinus (Persoon) Kummer.

Especie con un pleo de un dimetro de 5 15 cm de dimetro, de color blanco o crema y
forma convexa, su cutcula tiene una textura agrietada, separable, de color blanco, cubierto con
fibrillas grisceas sobre un fondo blanco y un margen involuto. Las lminas son decurrentes, distantes
a subdistantes, algunas a veces con hendiduras que bajan hasta el estpite. El estpite es excntrico a
central, slido, blanquecino, y de 4 - 10 cm de longitud y 2 - 3 cm de ancho, el cual se estrecha hacia
la base; con un anillo de color blanco o crema de corta duracin. En esta especie su esporada es
color blanco (Phillips, 1991). Sea encontrado asociado sobre rboles planifolios, madera de robles,
lamos u olmos. Las esporas son lisas y elpticas, de 9 -14 x 3,5 - 4 m, hialinas y inamiloides;
adems de un color amarillento a caf (Kummer, 1871).

D. P. djamor (Fries) Boedijn.

Especie del gnero Pleurotus que presenta un color salmn rosa; el cual vara segn su edad
y la iluminacin que recibe. Este microorganismo crece sobre maderas duras, incluso sobre palmas,
el rbol de la goma e incluso en bamb; el carpforo tiene una cutcula escamosa, en forma de
repisas redondas, su pleo es de 3 a 8 cm de ancho, lobuladas de color blanquecino a cafamarillento claro; superficie lisa, lminas bien definidas decurrentes. El Estpite es corto sin presencia
de velo. Contextura blanquecina, con Sabor y olor semejante a harina fermentada (Snchez, 1994;
Chacn et al., 1995). Los primordios son rosa, formando a menudo colonias en racimo a lo largo de la
periferia en el interior de la caja de Petri y/o alrededor de la inoculacin. P. dejamor presenta esporas
de color rosa, las cuales cambian a beige al llegar la madurez (Stamets, 2000).

E. P. cornucopiae (Fr.) Gillet.

Hongo comestible con un Pleo blanco de consistencia subcarnosa a correosa, de un ancho
de 8 - 20 cm; liso a escamoso o aterciopelado, lminas unidas entre s en la base o sobre el pie,
formando un retculo, en la madurez, esta estructura sufre una depresin y toma una forma de
embudo. Las laminillas son decurrentes y de color blanco o crema, a veces con un tinte rosado.
Estpite lateral corto de hasta 5 cm de largo y 1 2,5 cm, aterciopelado o cubierto de pequeos pelos,
no presenta anillo. Su esporada es blanca o crema. Se han encontrado sobre diversas variedades de

27

troncos menos pinos y abetos (Arora, 1986; Guzmn, 1998). P. cornucopiae presentan cheilocistidios
y esporas cilndricas y lisas de 8 11 x 3,5 - 5 m (Moore-Landecker, 1996).

F. P. citrinopeliatus Singer.
Los carpforos de P. citrinopileatus crecen en racimos, el pleo es de color amarillo brillante,
de 2 6,5 cm de dimetro, con una cutcula de marrn a dorada, con una textura aterciopelada y
textura agrietada; Sus caractersticas organolpticas su una contextura suave, un Sabor suave y sin
olor fuerte. El estpite es cilndricos, de 2 - 5 cm de largo y 0,2 0,8 cm de dimetro, de color blanco,
y a menudo curvo. Las lminas son blancas, decurrentes y poco espaciadas. La esporada es amarilla
(Ohira, 1990). Las esporas de estas seta son cilndrica o elptica, y de 6 - 9 x 2 3,5 m (Parmasto,
1987).

G. P. pulmonarius (Fries) Quelet.

P. pulmonarius presenta un pleo convexo expandido, ondulado en forma de ostra,
eventualmente plano y muchas veces ondulado al envejecer, de 5-20 cm de dimetro, grisceo,
blanca a beige. El estpite es excntrico, con laminillas decurrentes, con velo ausente. Conocido
comnmente como hongo blanco, al igual que P. ostreatus, se diferencia de este por ser blanquecino.
Reportado en Norteamrica y Europa, se encuentran desde los 1200 hasta los 3000 msnm., son
comunes en primavera y verano. La esporada es blanquecina a amarillentas. Esporas cilndrica y a
largadas de 7,5-113-4 m (Gastn Guzmn et al., 1993).

28

CAPITULO III
JUSTIFICACIN.
En las ltimas dcadas el cultivo de los hongos del gnero Pleurotus ha tomado gran inters
como proceso biotecnolgico por su alta capacidad de degradar por FES una gran diversidad de
sustratos lignocelulsicos en un amplio rango de temperaturas, aprovechando as los desechos
agroindustriales para la produccin de un alimento con un alto valor nutricional y medicinal, debido a
su acumulacin de agentes quimioteraputicos y presencia de sustancias biolgicamente activas que
actan como antioxidantes, agentes reductores y antitumorales que disminuyen los niveles de
colesterol en sangre y la presin arterial lo que lo hace atractivo para la dieta humana; adems de
generar un sub producto con potencial como fuente de nutrientes vitales directos para las plantas;
propiedades que hacen del cultivo de los hongos del gnero Pleurotus una alternativa en las
estrategias de seguridad alimentaria de muchos pases de Latinoamrica. Este Proceso
biotecnolgico puede ser implementado en Venezuela, partiendo de la caracterizacin e identificacin
taxonmica de las especies de este gnero, para la formacin y equipamiento de los agroproductores
con los conocimientos bsicos para su produccin y mercado del cultivo de estos hongos en pro a
instalarlo como una alternativa alimentaria.

HIPOTESIS.
En el Laboratorio de Biotecnologa de Microorganismos SIXTO DAVID ROJO de la ULA
Existen varias cepas del gnero Pleurotus Luego de su caracterizacin taxonmica y fisiolgica se
espera la identificacin de las especies y establecer diferencias fisiolgicas entre ellas.

OBJETIVO GENERAL
Caracterizar las cepas gnero Pleurotus existentes en el Laboratorio de Biotecnologa de
Microorganismos.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Determinar las caractersticas morfo-anatmicas de las cepas del gnero Pleurotus presentes
en el Laboratorio de Biotecnologa de Microorganismos.

Identificacin taxonmica de las cepas del gnero Pleurotus basada en las caractersticas
morfo-anatmicas.

Caracterizacin de las cepas del gnero Pleurotus crecidas en medios convencionales y no

convencionales.

Identificar las cepas del gnero Pleurotus utilizando tcnicas moleculares.

29

CAPITULO IV
MATERIALES Y METODOS

La presente investigacin se llev a cabo en el Laboratorio de Biotecnologa de los

Microorganismos SIXTO DAVID ROJAS de la Facultad de Ciencias de la Universidad de los Andes
Estado Mrida.

MATERIALES

Microorganismos.

Las cepas de hongos comestibles P3215, P132, Post, PRAL y Pcit pertenecientes al cepario
de macrohongos SIXTO DAVIS ROJO del Laboratorio de Biotecnologa de Microorganismos SIXTO
DAVID ROJAS (BIOMI) del Departamento de Biologa de la Facultad de Ciencias de la Universidad
de los Andes, material biolgico donado por el ingeniero Osmar Morillo de la Fundacion Centro de
Investigaciones del Estado para la Produccin Experimental Agroindustrial (CIEPE). Se mantuvieron
en cuas de agar papa dextrosa (PDA) con repiques cada 15 das.

Medios de cultivo.

Se utilizaron dos medios de cultivo: PDA composicin: Papa 200,0 g, Agar-Agar 15,0 g,
Dextrosa 20,0 g, Levadura 2,0 g. Preparacin: pelar y poner a hervir 200 g de papa en 500 ml de
agua destilada durante 10 - 15 min, luego se filtra el extracto y se adiciona agua hasta ajustar a 1000
ml para reponer lo que se evapor, se agregaron los otros ingredientes y se calent con agitacin por
1 - 2 min hasta quedar homognea la preparacin de acuardo a lo indicado por (Gaitn, Salmones,
Merlo, y Mata, 2002).

El medio agar Sabaraud Dextrosa (ASD) (Odds, 1991)composicin: digerido enzimtico de

casena 5,0 g, Digerido de tejido animal 5,0 g, Dextrosa 40,0 g, Agar 15,0. Preparacin: Se toman 500
ml de agua destilada y se agregan todos los ingredientes, se calientan bajo agitacin hasta disolver
todos los ingredientes, se ajusta el pH a 5,6 y se lleva hasta 1000 ml.

Las semillas de sorgo (Sorghum bicolor) fueron adquiridas en el mercado local y mantenidas
en embaces hermticos hasta su uso, Los fardos de heno de pasto Bermuda (Cynodon dactylon)
fueron adquiridos en el mercado local y se procesaron en molino de martillo hasta un tamao de
particula de 1 cm.

Reactivos: A menos que se indique lo contrario los reactivos qumicos utilizados fueron de
grado analtico.

30

METODOLOGAS

Las experiencias que se detallan a continuacin se realizaron por triplicado a menos que se
indique lo contrario.

IV. Diagrama general de investigacin.

IV.1 Determinacin de las caractersticas morfo-anatmicas de las cepas P3215, P132,

Post, Pcit y PRAL presentes en el Laboratorio de Biotecnologa de Microorganismos.

La metodologa se centra en el anlisis de las caractersticas morfo-anatmicas del

pleurocarpo consideradas de importancia en la clasificacin de las especies dentro del gnero
Pleurotus Las caractersticas morfolgicas proveen la mayora de los caracteres usados para la
construccin de los sistemas taxonmicos. En el caso de las cepas del gnero Pleurotus, incluye la
descripcin macroscpica y microscpica del pleo, lminas y estpite.

31

IV.1.1 Cultivo de las cepas P3215, P132 y Post por fermentacin de estado slidos
(FES)

a. Preparacin de semilla fngica o inculo madre.

Se cultivaron las cepas P3215, P132, Pcit, Post y PRAL en medio PDA a 28 C en oscuridad
hasta que el micelio de cada cepa invadiera completamente las placas de pettri, a partir de estas
placas se cortaron trozos de un 1 cm2 del micelio, procedindose a inocular frascos de vidrio
conteniendo 300g de semilla de sorgo previamente hidratados y esterilizados, los cultivos fueron
incubdos a 28 C en oscuridad durante 25 das, periodo en que el micelio invade por completo los
frascos, obteniendo as la semilla fngica o inculo mayor.

b. Preparacin de los sustratos para la produccin de Pleurotus

i.

Preparacin de los sustratos para la produccin de semilla fngica o inoculo

madre.

Las semillas de sorgo (Sorghum bicolor) se lavaron con abundante agua y fueron sumergidas
en agua 12 h para su hidratacin, luego se cocinaron durante 15 min, se decantaron las semillas y se
empacaron en frascos de vidrio con tapa de rosca conteniendo 300g de semilla, y se esterilizaron
durante 40 min a 120 C, dejando enfriar durante 24 h para su posterior uso.

ii.

Preparacin del sustrato para el cultivo y fructificacin de Pleurotus

El heno de pasto Bermuda (Cynodon dactylon) fue cortado hasta tamao de partcula de 1 a 2
cm., se sumergi en agua durante 12 h, se decanto y empaco en bolsas plsticas transparentes a
razn de 1 kg del material hmedo/ bolsa. Las bolsas conteniendo el material fueron esterilizadas
durante 6h a 120 C, dejndose enfriar durante 24 h para luego utilizarse en los cultivos de las cepas
en estudio.

c. Cultivo y fructificacin de Pleurotus en sustrato slido.

Para cada una de las cepas, se tomaron 10 bolsas conteniendo sustrato estril preparadas
como se indic anteriormente, y se inocularon con 100g del inoculo madre. A las bolsas inoculadas y
cerradas se les practicaron agujeros con una aguja estril y se incubaron a 25 C en oscuridad,
durante 20 a 30 das tiempo en el que el micelio invadi totalmente el sustrato.. Para la induccin de
la fructificacin a cada bolsa se le realizaron 6 cortes de 2 cm. de largo y transfirieron a la cmara de
cultivos e incubadas a 28 C con iluminacin diurna de 10 h, humedad relativa del 70 a 85 % durante
un periodo de 30 a 45 das tiempo suficiente para la obtencin de los carpforos. Luego de
cosechados (figura XIII), los carpforos se utilizaron en la caracterizacin morfo-anatmica.

32

Figura XIII Cultivo por Fermentacin en Estado Solido (FES) de hongos comestibles. Tomado de Stamets,
2000.

IV.1.2 Caracterizacin macroscpicas y microscpicas de los pleurocarpos de las

cepas P3215, P132 y Post.

Para determinar las caractersticas macroscpicas, los pleurocarpos fueron examinados con
una lupa tomando en cuenta parmetros como: color, apariencia, consistencia y forma de los
carpforos. Las esporas se obtuvieron, partiendo de carpforos frescos maduros. A los que se les
corto estpite a nivel del pice, se colocaron sobre papel blanco y se cubrieron con un frasco de vidrio,
luego de 30 a 60 minutos se obtuvo la impronta de las esporas de cada cepa. Las esporas se
recolectaron en tubos de ensayo estriles y se guardaron en frio.

33

En la observacin de las caractersticas microscpicas se realizaron cortes al carpforo,

obtenindose pequeas porciones del pleo, estpite y lamela, se observ al microscopio la morfologa
de las hifas, el himenio, las esporas, los basidios y los cistidios de cada una de las cepas, por medio
de la tcnica de tincin con safranina y verde malaquita.

IV.2 Identificacin taxonmica de las cepas P3215, P132 y Post basada en las
caractersticas morfo-anatmicas.

Una vez descritas cada una de las cepas P3215, P132 y Post, se comparar y evalu todas
las caractersticas taxonmicas, frente a claves taxonmicas permitiendo la identificacin a nivel de
gnero (Largent y Stuntz, 1977; Largent et al., 1977) (Anexo 1), y especie (Petersen et al., 2006)
(Anexo 2).

IV.3 Caractersticas de las cepas P3215, P132, Post, Pcit, PRAL y Post crecidas en
medios convencionales y no convencionales.

IV.3.1 Caractersticas de las colonias fngicas en medios convencionales.

A partir de las cuas de las cepas P3215, P132, Post, Pcit, PRAL y Post se inocularon de
cajas de pettri con medio PDA y ASD, se incubaron en oscuridad durante 6 das a 22 C, partiendo de
estos cultivos se tomo un fragmento de 7 mm de dimetro y se colocaron en el centro de cajas de
pettri con el mismo medio, se incubaron a 22 C por 15 dias realizndose las observaciones diarias
de la forma, la elevacin, la textura, el aspecto, la superficie de la colonia micelial, el color, el margen
o borde y la pigmentacin de las colonias fngicas de cada cepa siguiendo las indicaciones
mostradas en la Figura XIV para el anlisis de las caractersticas macromorfolgicas.

Figura XIV Caracterizacin macroscpica de la colonial micelial de los hongos. Tomado de Piccoli et al., 2010).

34

IV.3.2 Determinacin del efecto de los medios de cultivo convencionales y la

temperatura en el crecimiento y produccin de biomasa de las cepas del gnero
Pleurotus

IV.3.2.1 Efecto de la temperatura sobre el crecimiento y produccin de biomasa de las

cepas P132, P3215, Post y PRAL cultivadas en placas de PDA y ASD.

Se procedi de acuerdo a (Mier et al., 2002)Las cajas con el medio (PDA, ASD) fueron
inoculadas en el centro con discos de micelio de 7mm dimetro obtenidos de cultivos en placas de los
mismos medios y que no superaban los 6 das de incubacin. La incubacin se realiz a 20 C, 25 C,
30 C y 35 C. Diariamente, las placas se colocaron en un escner y las imgenes obtenidas se
procesaron con el software ImageJ (Abrmoff et al., 2004) y se calcul la tasa radial de crecimiento
de los hongos (mm/da), al graficar la media del radio en mm contra el tiempo en das, la distancia o
radio de crecimiento se cacul a travs de la ecuacin del rea de un circulo figura geomtrica que se
asemeja al rea que cubren los hongos filamentosos tras su crecimiento. La cintica de crecimiento
radial de la colonia se ajust mediante el Software IBM SPS 20 (Field, 2013) a una serie de Fourier
de suma de senos y cosenos trigonomtricos; con los datos se estim la tasa de crecimiento (kr) en
dichos medios y en las formulaciones elaboradas en caja Petri, la cual se calcul con la funcin de
crecimiento lineal:

F(x) = k r (x) + c
Donde F(x) es la distancia y x es el tiempo, Kr expresada en milmetros por da (mm/da)
(Zervakis et al., 2001a).

La biomasa se cuantifico por determinacin del peso seco de los micelios presentes al final de
la incubacin en caja de Petri, el contenido de cada placa, se trasvaso a un vaso de precipitado
conteniendo 300 ml de H2O destilada hirviendo, una vez fundido el agar, la biomasa fngica se
recuper por filtracin en papel de filtros luego de varios lavados con agua caliente. La biomasa
obtenida se sec a 85 C hasta peso constante y se determin el peso seco gravimtricamente.
Realizando el anlisis estadstico de los datos mediante un ANOVA de dos vas y las diferencias
significativas proporcionado por la prueba de rangos mltiples de TUKEY a travs del IBM SPS 20
(Field, 2013).

IV.3.2.2 Caracterizacin de las cepas Post y P3215 sobre medios no convencionales.

La evaluacin se realiz comparando las tasas de crecimiento obtenidas en los sustratos

semilla de sorgo, parchita, arroz y tuza de maz procesados como se indica a continuacin:

35

Las semillas de sorgo se lavaron y dejaron hidratando por 24 h, posteriormente se retir el

exceso de agua, se trituraron hasta un tamao de partcula de 2 mm, se almacenaron en frascos de
vidrio con rosca y esterilizaron por 40 min a 120 C. Las semillas de parchita se sumergieron en agua
y se dejaron fermentar durante 4 a 8 das para eliminar los restos de pulpa, despus de lavados
sucesivos con abundante agua se elimin el exceso de agua por secado en estufa a 40 C por 48 h,
luego de triturarlas hasta un tamao de 2 mm, se almacenaron en frascos de vidrio con rosca y
esterilizaron a 120 C por 90 min. La tuza de maz, se lav por inmersin en agua durante 2 horas, se
dren el agua y se sec en estufa durante dos das a 40 C se tritur a un tamao de 2 mm, se
empaco en frascos de vidrios con rosca y se esterilizaron por 2 h a 120 C. El arroz comercial tipo A
marca Mary se hidrat por inmersin en agua durante 24h, se le retir el exceso de agua y trituro
hasta tamao de partcula de 2 mm, luego de empacarlo en frascos de vidrio con tapa de rosca se
esteriliz por 40 min a 120 C.

Los cultivos se realizaron en cajas de Petri previamente esterilizadas a las que se les agrego
una capa de 20 g del medio no convencional, compactados a un espesor de 8 mm, se esterilizaron
durante 1 h a 120 C, se dejaron en reposo 24h y se inocularon, colocando en el centro de la placa un
disco de 7 mm de dimetro obtenido de un cultivo de las cepas en PDA previamente incubado
durante 6 das (Hernndez et al., 2002). Las variables a medir fuero tasa de crecimiento micelial en
los diferentes medios no convencionales a travs del registro fotogrfico diario y el procesamiento de
las imgenes obtenidas con el software ImageJ (Abrmoff et al., 2004), calculando la tasa igual como
fue para los medios convencionales (Sihuanca, 2011); y forma del micelio presente por cepa.

IV.4 Identificacin molecular de las cepas P3215, P132 y Post.

IV.4.1 Evaluacin de los mtodos de extraccin de los cidos nucleicos de las cepas
P3215, P132 y Post.

La extraccin de los ADNs genmicos de las cepas P3215, P132 y Post se realiz mediante
los mtodos de Saghai-Maroof et al. (1984) y el mtodo de Lee (1990). Para determinar qu protocolo
tiene mayor eficiencia, se evalu la integridad, grado de pureza y concentracin de los ADNs
genmicos de las muestras fngicas obtenidos con cada uno de ellos y se comprob si a partir de
dichos ADNs era posible la amplificacin por PCR de la regin ITS1, 5.8S y ITS2.

Siguiendo el mtodo de Saghai-Maroof, et al. (1984), se parti del cultivo de las cepas en
medio liquido Sabaraud bajo agitacin a 28 C por 6 das. 300mg de micelio obtenido por filtracin se
transfirieron a un mortero estril y se les agrego nitrgeno lquido y se maceraron hasta pulverizar;
con ayuda de una esptula se transfiri el macerado a tubos eppendorf de 1,5 ml conteniendo 600 l
de tampn de lisis (100 mM tris- HCl, pH 8,25; 0,2% B-mercaptoetanol; 20 mM EDTA; NaCl 1,4 M;
2% CTAB) y se incubo a 75 C durante 15 min bajo inversiones cada 3 min. Despus se dej reposar
a temperatura ambiente durante 10 min y se le agregaron 1 volumen de una mezcla cloroformo
alcohol isoamilico (24:1), agitando los tubos hasta formar una emulsin, se centrifug por 15 min a
3000 g, punto en que se formaron las fases acuosas, interface y orgnica, de las cuales se colecto la
fase acuosa en tubos Eppendorf nuevos obteniendo as los cidos nucleicos.

36

El mtodo de extraccin de los cidos nucleicos de Lee (1990), se realiz partiendo de 100 mg
de micelio de cada una de las cepas obtenidas del raspado con un palillo del cultivo en cajas de pettri
en medio PDA incuvadas a 28 C; se coloc cada muestra en un tubo ependroff de 1,5 ml con 300 l
de tampn de lisis (tris- HCl 120 mM, pH 8,25; EDTA 25 mM; NaCl 25 mM; SDS 2 %). El tejido fue
macerado con un micro macerador de plstico, despus las muestras al estar homogenizadas se
hirvieron a 95 C por 10 min para luego pasarlas por 5 min a 4 C, se centrifugan a 3000 g durante 5
min, se colectan los sobrenadantes en nuevos tubos eppendorf. Los cidos nucleicos se extrajeron
aadiendo 250 l de acetato de potasio 3 M e incubndose a 4 C por 1 h, seguido se centrifugan a
10000 g durante 12 min a 4 C; de las fases que se forman, se colectan las fases acuosas en tubos
eppendorf. El ADN se precipit a -20 C en presencia de 2 volmenes de la solucin etanol absoluto y
250 l de acetato de potasio 3 M por toda la noche. Posteriormente, las mezclas se centrifugaron a
3000 g durante 10 min y los precipitados se lavaron con etanol al 70 %. Despus de dejarse secar a
temperatura ambiente las muestras, el ADN se re suspendi en 50 l de H2O destilada, desionizada y
libre de Dnasas y Rnasas (MQ).

Al obtener los cidos nucleicos de cada una de las cepas a travs de los diferentes mtodos
de extraccin se procedi con la purificacin del ADN genmico, cada uno de los ADN extrados se
incubo con 0,6 volmenes de iso-propanol absoluto durante toda la noche a 4 C y se centrifugaron a
12000 g durante 30 min, los precipitados se lavaron varias veces con etanol al 70%, despus se
colocaron cerca de un mechero hasta evaporar totalmente el etanol, los cidos nucleicos se
resuspendi en 100 l de H2O MQ. Una vez purificados los cidos nucleicos, se procedi con
obtencin del ADN genmico, paso en que se tomaron 50 l de los cidos nucleicos en tubos
Eppendorf de 1,5 ml y se le agreg 450 ul de H2O MQ y 5 l de RNAasa, incubndose por 1 h a 37
C, se aadi 1 volumen de la mezcla fenol-cloroformo-alcohol isoamilico (25:24:1) pH 8, agitando los
tubos hasta formar una emulsin, las mezclas se centrifugaron durante 15 min a 12000 g, se colecto
la fase acuosa en tubos eppendorf nuevos obteniendo as los cidos nucleicos, luego se agreg un
volumen de cloroformo-alcohol isoamilico (24:1), se centrifugaron durante 15 min a 12000 g y se
colecto la fase acuosa en tubos eppendorf nuevos obteniendo as los cidos nucleicos. Despus las
fases acuosas recolectadas se incubaron con 0,6 volmenes de iso-propanol absoluto durante toda la
noche a 4 C, se centrifugaron a 12000 g por 30 min y se descartaron los sobrenadantes con ayuda
de una pipeta, los precipitados se lavaron con etanol al 70%.

Despus cada muestra se coloc cerca de un mechero hasta evaporar totalmente el etanol,
los cidos nucleicos se resuspendieron en 100 l de H2O MQ. Una vez purificados los ADN
genmicos se evalu la integridad de estos mediante electroforesis en gel de agarosa D-1
(Pronadisa) 0,8 %, en 1 % de buffer TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) al que se incorpor 0,5
g/mL de bromuro de etidio, a 70 voltios durante 45 min, cargando 5 ul de cada muestra. La pureza
del ADN se determino por espectrofotometra, realizando lecturas de absorbancia de las muestras a
230 nm, a 260 nm y 280 nm, relacionando la contaminacin con sales al valor de coeficiente A
230nm/A 260nm, comprendido entre 0,3 y 0,7 para un estndar del contenido en sales en la muestra,
y la contaminacin con protenas y fenol al valor del coeficiente A 260nm/A 280nm, comprendido
entre 1,8 - 2,0 a bajas concentraciones de protenas y fenol (Maniatis et al., 1982). La concentracin
del ADN genmico de las muestra se valor realizando lecturas de absorbancia de una dilucin de la
muestra a 260 nm. Teniendo en cuenta que una unidad de absorbancia a 260 nm corresponde a 50
g/mL de ADN bicentenario (Sambrook et al., 1989).

37

IV.4.1.1 Amplificacin a travs de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) de la

regn ITS 1 a ITS 2.
Se amplific la regin ITS 1 a TS 2 a travs de la PCR utilizando los primers universales para
hongos; ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') y ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3')
(White et al,. 1990), siguiendo la metodologa modificada propuesta por (A. Rodriguez, 2008),22 l
mezcla mixta PCR (Taq ADN polimerasa (1 unidad/ml), dNTPs 200 M, MgCl2 1,5 mM), primers 2 l
(10 M c/u), 5 l tampn de la TaqADN polimerasa, 11,3 l agua y 3,0 l ADN (40 ng/l) en un
volumen de 25 l de reaccin. Realizando el ciclo de PCR en un PTC-100 de control trmico
programable (MJ Research); 95 C/1 min, 35 ciclos de 94 C/30 s, 55C/90 s, 72 C/90 s y 72 C/5
min. Visualizando los productos de PCR a travs de electroforesis en geles de agarosa al 2 % teidos
con bromuro de etidio (0,16 l/ ml); cargando 5 l de cada producto de PCR a 100 V durante 30 min.

IV.4.1.2 Precipitacin de productos de PCR empleando sales.

Los amplificados de la regin ITS 1 a ITS 2 tras la PCR, fueron diluidos a un volumen final de
100 l con agua MQ, se agreg un volumen de acetato de amonio 10 M y 2,5 vol de etanol 100% con
respecto a 200 l; se homogeneizo la mezcla e incub a 20 C durante 12 horas, se centrifugo a
14000 g durante 30 min. Se decant el sobrenadante y lavaron los productos de PCR con un volumen
de etanol 70%, de nuevo se centrifugo la solucin a 14000 g por 30 min. Se descart el sobrenadante
y agrego 1 volumen de etanol 70 %, la preparacin se centrifug a 14000 g por 15 min. Se decant el
sobrenadante y dejo evaporar el etanol a temperatura ambiente por 1 h. Se resuspendi el ADN en
11 l de agua MQ y se procedi a verificar el ADN amplificado a travs de la electroforesis en gel de
agarosa al 2 %. Los volmenes restantes de producto de PCR se utilizaron en las reacciones de
secuenciamiento.

IV.4.1.3 Cuantificacin semi-cuantitativa de los productos de PCR.

La cuantificacin de la concentracin de los productos de PCR de la regin ITS1, 5.8S e ITS2,

se realiz mediante electroforesis en geles de agarosa al 1 %. Esto se consigui comparando la
intensidad de las bandas correspondientes a cada producto de PCR con las bandas patrn de
diferentes concentraciones conocida de ADN del fago , obteniendo as resultados aproximados de la
concentracin de los productos de PCR (Maniatis et al., 1982).

IV.4.2 Secuenciacin del ADN.

Una vez obtenidos los 75 ng/l de la regin ITS1 a ITS2 de cada muestra fngica para la
secuenciacin, se procedi con la preparacin de la mezcla reaccin de secuencia en un tubo de
0,2uL como se muestra en la tabla IV; para luego llevarse a un termociclador a 40 ciclos de 96 C/10
seg, 58 C/ 5 seg y 60 C/ 4 min. El producto de la reaccin se precipit con isopropanol y lavado con
etanol, la secienciacin se realiz en el secuenciador ABI 3130, proceso basado en 3 pasos. 1) La

38

preparacin de las muestras (desnaturalizacin del ADN y montaje en la placa de corrida), 2) la

preparacin del archivo con las condiciones de corrida y 3) el montaje de las muestras en el equipo.

Tabla IV Mezcla de reaccin para el secuencia miento de los productos de PCR.IVIC, 2014.

Reactivo
Terminator ready reaction mix
(Big Dye)

Concentracin
inicial

Buffer del kit

5X

Primer F o R

10uM

Producto de PCR

5 - 20 ng/L

Concentracin
en la reaccin

Cantidad para una

reaccin (L)

0,5

1X

2
0,2

Agua

Completar

IV.4.3 Anlisis de secuencia de la regin ITS1, 5.8S ADNr e ITS2

El anlisis de secuencia se comenz con la visualizacin y exportacin de las secuencias a

travs del software de bioinformtica Chromas LITE v2.01, para luego comparar las secuencias de las
cepas P3215, Post y P132 frente a las secuencias reportadas en las bases de datos internacionales
de secuencias de nucletidos (INSD: GenBank, EMBL, DDBJ), por medio de la herramienta BLAST
(Johnson et al., 2008) y el servidor Expasy (Gasteiger et al., 2003); esto junto con los datos de
secuencia de la regin ITS1, 5.8S ADNr y ITS2 de las especies P. eryngii, P. tuberregium, P.
citrinopileatus, P. cystidiosus, P. ostreatus, P. pulmonarius y P. djamor presentes en el GenBanck
(nmeros de acceso EU233990, EF514250, AB115043, EF514244, EF514248, EF514243,
AY265821, respectivamente), obteniendo las 20 secuencias con mayor identidad; esto mismo
proceso se repiti para el anlisis bioinformatico por separado de las regiones ITS1 y ITS2 de las
secuencias problemas a travs de las herramientas bioinformticas ITS2 Database (Schultz et al.,
2006), ITS1 Database (Nilsson et al., 2010) y DNAclub.

IV.4.3.1 Anlisis Filogentico

La reconstruccin del rbol filogentico del gnero Pleurotus se realiz por separado con las
secuencias problema de las regiones ITS1 a 5.8S e ITS2, comparando con las secuencias
recopiladas de mayor coincidencia encontradas tras el anlisis de secuencias y bioinformticos
anteriormente mencionado. Una vez obtenidas las secuencias se realizaron los diferentes
alineamientos a travs del algoritmo del software MUSCLE del EMBI (Edgar, 2004), utilizando el
programa MEGA 6.1 (Kumar et al., 2008) se realiz la reconstruccin de los arboles filogenticos por
el mtodo de vecinos ms cercanos (neighbor-joining), adicionalmente se utiliz el modelo de
sustitucin Kimura 2 parmetros (K2P con un valor de rplicas de 1000 bootstrap). Los arboles fueron
observados y editados en el mismo programa MEGA 6.1 (Kumar et al., 2008).

39

IV.4.3.2 RFLP por digestiones virtual

En el anlisis del Polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin (RFLP) de las

secuencias de la regin ITS de las cepas P3215, P132 y Post, se emplearon las herramientas de
bioinformtica NEBcutter V2.0 (Vincze et al., 2003) y Webcutter 2.0 (Maarek et al., 1997). Se realiz
la digestin virtual de estas secuencias, junto con varias secuencias del GenBank correspondientes a
diferentes cepas de las especies P. eryngii, P. tuberregium, P. citrinopileatus, P. cystidiosus, P.
ostreatus, P. pulmonarius y P. djamor; las digestiones se ajustaron para visualizar los productos en
geles de agarosa al 2%; implementando aquellas enzimas de restriccin que corten las secuencias en
2 a 5 sitios.

IV.4.3.3 Anlisis de estructuras secundarias del ADNr

Para la ejecucin de este proceso se utilizaron las herramientas bioinformticas disponibles en

el servidor web ITS2 Data base desarrollado por Schultz et al. (2006) accedida a travs
http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg (Selig et al., 2008; Koetschan et al., 2010).Inicialmente
se realiz la extraccin de la secuencia ITS2 de las secuencias de las muestras utilizando HMMs
(Hidden Markov Models) seguida por la prediccin de la estructura secundaria bajo el mtodo
comparativo de secuencias y estructuras homlogas, evaluando el grado de transferencia de hlices
y la homologa de la molcula frente a las reportadas y anotadas en la base de datos ITS2.
Adicionalmente se corri un anlisis de cambios de bases compensatorias (Compensatory base per
changes CBC) para la diferenciacin de especies. Esto fue realizado con el programa 4SALE
(Koetschan et al, 2010; Selig et al, 2008; Schultz et al, 2006; Schultz et al, 2009).

40

CAPITULO V
RESULTADOS Y DISCUSIN

V.1.1 Caractersticas morfo-anatmicas de las cepas P3215,

pertenecientes al Laboratorio de Biotecnologa de Microorganismos.

P132

Post

A continuacin se presentan las caractersticas macroscpicas observadas en el estudio de

los carpforos de las cepas P3215, P132 y Post; en base a los caracteres macroscpicos obteniendo
un catlogo (Tabla V VII).

a. Cepa P132

Descripcin: la cepa P132 se cultiv en heno de pasto bermuda (Cynodon dactylon) por FES
cerrada, observndose que solo se desarrollaron los carpforos de esta cepa y de forma individual.
Los carpforos de P132, presentaron forma Pleurocarpica con disposicin de las lamelas con forma
de hoja en posicin decurrente, sin volva presente, estpite excntrico. El pleo de estos carpforos se
desarrollo hasta los 6 cm de dimetro, en el plano anterior el pleo mostro una forma plana convexa
y en el plano lateral con una vista apical petaloide y cncavo, con un disco ligeramente deprimido,
margen arqueada y bordes desgarrados, con un grado de humedad seca; estas presentaron
tonalidades de blanco - mate, con una textura glabra, consistencia carnosa porosa. En cuanto al
estpite es de color blanco de 1,4 cm de largo y 9 mm de dimetro, con unin lateral al pleo y de
forma cilndrica ventricosa, una consistencia carnosa porosa y slida. El himenio es de color blanco a
claro, con patrones de ramificacin dicotmica, generalmente las lminas son atenuadas a
redondeadas, estrechas y poco separadas (Tabla V).

b. Cepa P3215.
Descripcin: la cepa 3215 se cultiv en heno de pasto bermuda (Cynodon dactylon ) por FES
cerrada, encontrando un desarrollo en conjunto de 8 a 12 primordios para dar origen a los carpforos,
estos caracterizados por presentar un pleo ssil de un color entre caf variando a mate de 7,5 cm de
dimetro, con una forma Pleurocrpica de lamelas decurrentes, en una vista lateral el pleo con una
forma plana convexa y en vista apical un forma lenguada, petaloide y cncavo, con un margen
arqueado; bordes de tipo crenulado, ondulados, enteros y desgarrados, con humedad seca, con
textura glabra y consistencia carnosa quebradiza y fibrosa; su esporada color blanco, sin presencia
de volva. En cuanto al estpite pose unin al pleo de forma lateral excntrica, con forma cilndrica y
compacta sinuosa, as como ventricosa, consistencia correosa, de cuerpo slido y colores desde el
blanco a crema, midiendo 1,5 cm de largo y 1,1 cm de dimetro. El himenio es de color blanco a
crema claro, no poseen patrones de ramificacin, las lminas son atenuadas o redondeadas,
generalmente estn muy juntas, son anchas como se ve en la tabla VI.

41

Tabla V Caracteristicas de la cepa P132.

Carpforo (Anterior)

Carpforo (Posterior)

PLEO
Forma
Vista lateral: Plano convexo
Vista Apical: Petaloide y cncavo.
Disco: Obtuso.
Margen: Arqueado.
Borde: Ondulado.
Viscosidad: Seca.
Higroscopicidad: -

Color: Crema claro.

Brillo: Mate.
Textura: Lisa.
Consistencia: Carnoso-fibroso.
Dimetro: 7,5 cm.
Grosor: 1,5 cm.

ESTIPITE
Unin: Lateral.
Forma: Comprimido
sinuosa.
Consistencia: Correosa.
Contextura: Dura.
Color: Crema claro.
Dimetro: 8,5 cm.
Largo: 3,5 cm.

HIMENIO
Frecuencia: Separados
Unin: Decurrentes.
Ancho: Anchas.
Lamelas: Atenuadas.
Ramificacin: Si.
Color: Blanco.
Grosor: 0,3 cm.

c. Cepa Post.
Descripcin: La cepa Post se cultiv en heno de pasto bermuda (Cynodon dactylon) por FES
cerrada, reflejando un desarrollo en conjunto de 6 a 10 primordios para dar origen a los carpforos.
Las setas obtenidas presentaron un pleo con una forma Pleurocarpica habitual a los hongos del
gnero Pleurotus sp, en su vista lateral son planos - convexos y en la vista apical tienen forma desde
el lenguado, petaloide y concado; con un disco desde el de tipo deprimido, umbilicado hasta el
obtuso; margen arqueada; bordes de tipo crenulado, ondulados, enteros, con un grado de humedad
seco y colores mate, pasando por los cremas claros y obscuros, con una textura glabra y consistencia
carnosa quebradiza y fibrosa. En cuanto al estpite poseen uniones al pleo de forma lateral y
excntrica, con formas cilndricas y comprimidas sinuosas, as como ventricosas, contexto slido y
colores desde el blanco a crema. El himenio es de color blanco a crema claro, no poseen patrones de
ramificacin, las lminas son atenuadas o redondeadas, muy juntas, anchas y de forma decurrente
(Tabla VII).

42

Tabla VI Caracteristicas de la cepa P3215.

Carpforo (Anterior)

Carpforo (Posterior)

PLEO
Forma
Vista Laterial: Plano convexo
Vista Apical: Petaloide.
Disco: Obtuso.
Margen: Arqueado.
Borde: Degradado.
Viscosidad: Seca.
Higroscopicidad: ESTIPITE

Color: Crema claro.

Brillo: Mate.
Textura: Lisa.
Consistencia: Carnoso-fibroso.
Dimetro: 7,5 cm.
Grosor: 1,5 cm.
HIMENIO

Unin: Lateral.
Forma: Comprimido sinuosa.
Consistencia: Correosa.
Contextura: Dura.
Color: Crema claro.
Dimetro: 8,5 cm.
Largo: 3,5 cm.

Frecuencia: Separados
Unin: Decurrentes.
Ancho: Anchas.
Lamelas: Atenuadas.
Ramificacin: Si.
Color: Blanco.
Grosor: 0,3 cm.

43

Tabla VII Caracteristicas de la cepa de Post.

Carpforo (Anterior)

Carpforo (Posterior)

PLEO
Forma
Vista Laterial: Plano convexo
Vista Apical: Petaloide.
Disco: Obtuso.
Margen: Arqueado.
Borde: Liso.
Viscosidad: Seca.
Higroscopicidad: ESTIPITE

Color: Crema.
Brillo: Mate.
Textura: Glabro.
Consistencia: Carnosa-quebradiza.
Dimetro: 11,5 cm.
Grosor: 4 cm.
HIMENIO

Unin: Lateral:
Forma: Compacta.
Consistencia: Correosa.
Contextura: Dura.
Color: Crema claro.
Dimetro: 0,8 cm.
Largo: 4,2 cm.

Frecuencia: Juntas.
Unin: Decurrentes.
Ancho: Anchas.
Lamelas: Redondeadas.
Ramificacin: No.
Color: Crema.
Grosor: 0,56 cm.

V.1.2 Caractersticas microscpicas de las cepas P3215, P132, Pcit, Post y PRAL.

En cuanto a las caractersticas microscpicas de las cepas del gnero Pleurotus evaluados se
pudo observar que las cepas P3215 y Post presentaron hifas de paredes delgadas y entrelazadas
junto a la presencia de perillas con pednculos, las cepas P132, Post, Pcit y PRAL presentaron hifas

44

de paredes gruesas con fbulas PRAL presentaron hifas de perillas con pednculo como se observa
en la tabla VIII.

Tabla VIII Caractersticas microscpicas de las cepas del gnero Pleurotus

Cepa

Presencia fbulas

Caractersticas de las hifas

P3215

Hifas de paredes delgadas y entrelazadas, presencia de perillas con pednculo

P132

Hifas de paredes gruesas

Pcit

Hifas de paredes gruesas

Post

Hifas de paredes delgadas y entrelazadas, presencia de perillas con pednculo

PRAL

Hifas de paredes gruesas

V.2 Identificacin taxonmica de las cepas las cepas P3215, P132 y Post basada en las
caractersticas morfoanatomicas.

Las cepas evaluadas se identificaron contrastando nuestros resultados con los caracteres
macroscpicos propuestos por Delgado et al., 2005 y Largent, 1977, que definen a un hongo del
gnero Pleurotus Encontrando que las cepas P132, P3215 y Post pertenecen al gnero Pleurotus por
presentar:

A. Donde se desarrollaron los carpforos de cada cepa no crecan otros hongos.

B. El pleo es de color blanquecino, con un himenio formando lminas llamadas lamelas.
C. Las lamelas se disponen en posicin decurrente, con un borde liso.
D. El carpforo sin presencia de volva.
E. El estpite se dispone en el pleo de forma excntrica o lateral, mide entre 2 a 4 cm, son de
contexto slido y de un color crema.
F. El pleo es ssil, con una forma de embudo o de esptula (hbito pleurotoide), consistencia de
la pulpa suave, flexible y de cuero, y las lamelas no son duras, ni correosas.
G. La esporada es de un color entre blanquecino a amarillo plido.
H. Las lamelas no se dividen a lo largo de sus bordes, estas son estrechas; el espesor del pleo
vara, siendo las lamelas suficientemente delgadas para ser membranosas, suaves y
carnosas.

A travs de los caracteres macroscpicos propuestos por Petersen et al., 2006, tambin se
pudieron identificar las diferentes cepas a nivel de especie, encontrando que las cepas P132, P3215 y
Post presentan las caractersticas fundamentales al gnero Pleurotus con pleo de color blanco de
forma Pleurocarpica y la disposicin de las lamelas en posicin decurrente y borde liso, sin presencia
de volva, y un estpite excntrico de 2 a 4 cm, de contexto slido y color crema.

45

V.3 Caractersticas de las cepas las cepas P3215, P132, Post y PRAL crecidas en
medios convencionales y no convencionales.

V.3.1 Caractersticas de las colonias fngicas en medios convencionales.

Como puede observarse en la tabla IX los caracteres estudiados varan de acuerdo a cada
cepa y al medio de cultivo empleado; encontrando que la cepa Pcit difiere a las dems por presentar
textura polvorienta, no presentar micelio areo, su forma es filamentosa en PDA y circular en SA,
elevacin convexa umbilicada, de margen liso y superficie sectorizada, mientras que las dems cepas
mostraron tener textura algodonosa, micelio areo, formas filamentosas, convexa umbilicada, de
margen desflecado y superficie cerebriforme. En todos los casos la densidad fue mayor en el medio
PDA.

Tabla IX Caractersticas macroscpicas de las colonias de las cepas las cepas P3215, P132, Pcit, Post y PRAL
presentes en el Laboratorio BIOMI, evaluadas en medios de cultivo PDA y SA a 22C.

Cepa

Medios de
Cultivo

Caractersticas
Color

Textura

Blanco

Algodonosa

PDA
P3215

Algodonosa

SA

Media

PDA

Alta
Blanco

Polvorienta

SA

Si

Filamentoso

Elevada y
limitada

Desflecado

Sectorizada

Si

Filamentoso

Elevada y
limitada

Desflecado

Convexa
umbilicada

Liso

Elevada y
limitada

Desflecado

Elevada y
limitada

Desflecado

Filamentoso
No
Circular

Alta
Blanco

Algodonosa
Media

PDA

Alta

Blanco

Algodonosa

Filamentoso
Si

SA
SA

Superficie

Media

PDA

PRAL

Margen

Alta
Blanco

Post

Elevacin

Media

PDA

Pcit

Forma

Alta

SA
P132

Densidad

Micelio
areo

Media

Circular
Si

Filamentoso

Sectorizada
Cerebriforme
Sectorizada
Cerebriforme
Sectorizada
Cerebriforme

V.3.2 Efecto de la temperatura y el medio de cultivo en el crecimiento y la produccin

de biomasa de las cepas P132, P3215 y P.ost.

Los resultados mostrados en la tabla X y la figua XV indican que existen diferencias

significativas (p < 0,05) entre los medios de cultivo y la temperatura de incubacin sobre la tasa de
crecimiento micelial y la produccin de biomasa. La cepa P132 mostro mejor desempeo tanto en la
tasa de crecimiento como en la produccin de biomasa (5,22 mm/d y 558,97 mg respectivamente)
cuando fue crecida en el medio PDA a 20C, los valores ms bajos en la tasa de crecimiento micelial
en el medio PDA, se obtuvieron cuando la cepa se incubo a 35 C (4,23 mm/d) en el caso de la
produccin de biomasa el valor ms bajo fue (158,7 mg) a 25 C. Los cultivos de esta cepa en el
medio SA arrojaron en todos los caso valores menores, que los encontrados en el medio PDA a la
misma temperatura. Estos resultados son similares a los reportados por Zervakis et al., (2001a) con
las cepas de P. ostreatus, P. pulmonarius y L. edodes utilizando un medio suplementado con celulosa

46

a 30 C, quienes obtuvieron la mayor tasa de crecimiento de 4.7 mm/d en P. pulmonarius que en

medio ASD o MEA.

Si se compara la tasa de crecimiento micelial con la produccin de biomasa se puede

observar que en el caso de la tasa de crecimiento, el mayor valor 5,22mm/d a 20C es 1,23 veces
mayor que el menor valor 4,23 mm/d a 35C, siendo esta diferencia menor a la observada en el caso
de la biomasa cuyo valor mximo 558,97mg a 20 C es 3,53 veces mayor que el obtenido a 25 C.
Estos resultados indican que en el caso de esta cepa, el efecto de la temperatura es mayor sobre la
produccin de biomasa corroborada por las observaciones en las placas en las que se observa
micelio menos denso a temperatura superior a 25C.

Para la cepa 3215, la tasa de crecimiento micelial mxima se obtuvo a 25 C en el medio PDA
5,45 mm/d y 3,72 mm/d en el medio SA a 30C. Sin embargo, los valores ms altos de produccin de
biomasa se obtuvieron a 30C en el medio PDA y SA (742,33 y 233,97 mg respectivamente). La cepa
Post presento mayor tasa de crecimiento micelial a 30C tanto en el medio PDA 5,75 mm/d como en
el medio SA 3,68 mm/d, en ambos casos el peor desempeo se registr a 35C. En cuanto a la
produccin de biomasa el valor mximo 146,33 mg se obtuvo a 20C en el medio PDA y en el medio
SA 106,65mg a 25 C, esta cepa no presento crecimiento a 35C en ambos medios. La cepa PRAL
presento el mximo de crecimiento micelial en el medio PDA a 25C (5,59 mm/d) y en el medio SA a
20C (3,41 mm/d) los valores ms bajos se obtuvieron a 35C (3,23mm/d) en el medio PDA y en el
medio SA a 30C (2,87mm/d). Los valores mximos de produccin de biomasa se lograron a 25C
(136 mg) en el medio PDA y a 30 C en el medio SA.

En general se puede indicar que la temperatura de incubacin en el rango de 20 a 35 C tiene

poco efecto sobre la tasa de crecimiento de las cepas P132, P3215 y PRAL. No obstante, afecta de
forma significativa la produccin de biomasa dependiendo del medio de cultivo y de las caractersticas
de cada cepa. La cepa Post es afectada negativamente por temperaturas superiores a 30C.
Presentando su mejor desempeo a 20C. Las diferencias observadas entre las cepas crecidas en el
mismo medio y en similares condiciones de incubacin, indican que existen diferencias fisiolgicas
entre las mismas, atribuibles a diferencias genticas. En cuanto al crecimiento en los dos medios
estudiados, es conocido, que estos hongos crecen naturalmente en sustratos vegetales ricos en
lignocelulosa y almidn, pero con bajos contenidos de protena, es de esperar que su capacidad
amilolitica sea mayor que la proteoltica, esto explicara el mayor crecimiento en el medio PDA.

47

Tabla X Tasa de crecimiento micelial (mm/da) tras la incubacin por 9 da de las cepas P132, P3215, Post y PRAL en
PDA (Agar Papa Dextrosa) y ASD (Agar Sabouraud Dextrosa).

Tasa de crecimiento micelial (mm/d)

Cepa
PDA

P132e

P3215f

Postg

PRALh

ASD

Produccin de biomasa (mg)

PDA

ASD

Temperatura
(C) i

5,22

2,42

558,97 *

230,40

20,00

5,07

3,25

158,17

269,67 *

25,00

4,51

3,24

166,80**

248,90

30,00

4,23**

3,17**

187,40

72,17**

35,00

5,33

2,60**

193,00

192,63

20,00

5,45*

3,37

106,67**

224,43

25,00

3,52

3,72*

742,33*

233,97*

30,00

3,45**

2,76

145,67

149,70**

35,00

3,36

2,13

146,33

59,23

20,00

3,99

2,31

107,00

106,65

25,00

5,75 *

3,68 *

117,67

99,33

30,00

0,30 **

0,30 **

0,00 **

0,30 **

35,00

4,78

3,41*

110,33

46,53

20,00

5,59*

3,01

136,00*

26,55

25,00

4,93

2,87**

58,33

63,60*

30,00

3,23**

3,01

34,33**

32,00**

35,00

Nota: a, b, c, d, e, f, g, h y i diferencia significativa en la tasa de crecimiento micelial, la produccin de biomasas

con respecto a la temperatura y los medios de cultivo con P < 0,05.
* Valores mximos
** Valores minimos

48

Nota: a, b, c, d, e, f, g, h,i y j, diferencia significativa en la tasa de crecimiento micelial con respecto a la

temperatura y los medios de cultivo con P < 0,05.
Figura XV Efecto de la temperatura sobre el crecimiento micelial (mm) de las cepas P132, P3215,
Post y PRAL crecidas en PDA (Agar Papa Dextrosa) y ASD (Agar Sabouraud Dextrosa).

V.3.3 Tasa de crecimiento de las cepas Post y P3215 en medios no convencionales

En los resultados mostrados en la fig. XVI a los 6 das de incubacin se aprecia que la cepa
3215 se desarrolla ms rpido en el medio arroz seguida por tuza de maz y sorgo, observndose
poco desarrollo sobre las semillas de parchita. Comportamiento similar se observ en el caso de la
cepa Post, solo que en este caso el crecimiento en tuza fue ligeramente mayor al observado en
sorgo. Sin embargo, a los 15 das de la incubacin (tabla XI) se obtuvo que la cepa 3215 logr la
mayor tasa de crecimiento 4,9 y 4,6 mm/d en los medios, tuza de maz y arroz respectivamente, con
escaso desarrollo en la semilla de parchita. La cepa Post mostro un comportamiento similar con tasas
de crecimiento en tuza de maz y en arroz de 4,1 y 3,9 mm/d respectivamente. Estos resultados
indican que la tuza de maz podra ser un buen sustrato para la produccin de inculos (semilla) y
para el proceso de produccin de carpforos. Estos resultados nos permiten concluir que las cepas
estudiadas presentan diferencias significativas entre ellas, ya que tienen comportamientos diferentes

49

frente a la composicin del medio y la temperatura de incubacin, desde el punto de vista

biotecnolgico, esto resulta de gran importancia ya que se cuenta con cepas que pueden crecer a
diferentes temperaturas y sustratos. En el caso de las cepas P132 P3215 y PRAL podran cultivarse
en zonas con temperaturas cercanas a los 25C. Mientras la cepa Post se adapto mejor a
temperaturas cercanas a los 30C.

Tabla XI Tasa de crecimiento micelial (mm/da) a los 15 das de incubacin de las cepas Post y P3215 en
sustratos lignocelulsicos como tuza de maz, semilla de sorgo, arroz y semilla de parchita.

Sustratos

Tasa de crecimiento (mm/d)

P3215
4,9 0,3

Post

Tuza a

4,1 0 0,1

Sorgo

2,1 0,1

3,2 0,1

3,9 0,2

4,6 0,2

1,49 0,09

1,6 0,1

Arroz

Parchita

Nota: a, b y c diferencia significativa en la tasa de crecimiento micelial con P< 0,05.

Figura XVI Crecimiento micelial de las cepas Post y P3215 al 6to da cultivadas en medios no convencionales
como semilla de sorgo (Sorghum sp.), Tuza de maz (Zea mays), Arroz (Oryza sativa) y semilla de parchita
(Passiflora edulis) incubadas a 25C.

Estos resultados fueron parecidos a los obtenidos por (Grodznskaya et al., 2002), donde la
colonizacin total sepresent a los 14 das en las mezclas de medio no convencional; caa de azcar
y tusa de maz, y aserrn y caa de azcar con cepas de P. ostreatus, aunque no presentan tasa de
crecimiento micelial. Este crecimiento rpido, puede deberse al material lignocelulosico presente en
estos sustratos y a la actividad del paquete enzimtico presente en estas cepas, variando entre las
cepas, siendo as reflejo de diferencias genticas entre ellas.

50

V. 3.3. Caractersticas morfolgicas de las cepas P3215 y Post en medios no

convencionales.

Las caractersticas miceliales de las cepas Post y P3215 crecidas en los medios no
convencionales como semilla de sorgo (Sorghum sp.), Tuza de maz (Zea mays), Arroz (Oryza sativa)
y semilla de parchita (Passiflora edulis), se presentan en la Tabla XII. En la cepa P3215 se pudo
observar una densidad micelial de forma regular (tuza de maz (Zea mays) y semilla de sorgo
(Sorghum sp.)), abundante (arroz (Oryza sativa)) y escaso (semilla de parchita (Passiflora edulis)), el
micelio en cada medio se desarrollo de un color blanco y de forma aria, no present aglomeraciones
en los medios de cultivo. En los medios de cultivo semilla de sorgo (Sorghum sp.) y parchita
(Passiflora edulis) tuvo menor invasin manteniendo la coloracin de estos en donde no invadi el
micelio, mientras que en los medios como Tuza de maz (Zea mays) y Arroz (Oryza sativa), las
regiones sin invasin sufrieron decoloracin tornndose mas claros y mostrando estar secos.

En la cepa Post se pudo observar una densidad micelial de forma abundante (arroz (Oryza
sativa)), regular (tuza de maz (Zea mays) y semilla de sorgo (Sorghum sp.)) y escaso (semilla de
parchita (Passiflora edulis)). El micelio se desarrollo de color blanco en cada uno de los medios, no
hay presencia de micelio ario en los medios Tuza de maz (Zea mays) y Arroz (Oryza sativa), no
present aglomeraciones en los medios de cultivo. En los medios de cultivo semilla de sorgo
(Sorghum sp.) y parchita (Passiflora edulis) tuvo menor invasin manteniendo la coloracin estos en
donde no invadi el micelio, mientras que en los medios como Tuza de maz y Arroz, las regiones sin
invasin sufrieron decoloracin tornndose ms claros.

Tabla XII Caractersticas morfolgicas de las cepas estudiadas en en medios no convencionales como semilla
de sorgo (Sorghum sp.), Tuza de maz (Zea mays), Arroz (Oryza sativa) y semilla de parchita (Passiflora edulis)
incubadas por 15 das a 25C

Micelio
Cepa

Sustrato
Color
Sin micelio
Con micelio

Medios de
Cultivo

Densidad

Micelio
aerio

Color

Tuza de maz

Regular

Si

Blanco

Marron claro

Marron claro

S. Sorgo

Regular

Si

Blanco

Marron oscuro

Marron claro

Arroz

Abundante

Si

Blanco

Beige

Beige claro

S. Parchita

Escaso

Si

Blanco

Marron oscuro o negro

Marron oscuro

Tuza de maz

Regular

Si

Blanco

Marron

Marron claro

S. Sorgo

Regular

No

Blanco

Marron oscuro

Marron claro

Arroz

Abundante

No

Blanco

Beige

Beige claro

S. Parchita

Escaso

Si

Blanco

Marron oscuro o negro

Marron oscuro

P3215

Post

51

V.4 Identificacin por tcnicas moleculares de las cepas P3215, P132, Post.

Para llevar a cabo la identificacin gentica de las cepas del gnero Pleurotus, se
desarrollaron las siguientes actividades: 1) Puesta a punto de un mtodo de extraccin de ADN a
partir del micelial de cada cepa. 2) Amplificacin por PCR de las regiones ITS 1 e ITS2. A
continuacin se describen los resultados obtenidos con relacin a los objetivos planteados en este
trabajo.

V.4.1 Extraccin del ADN

La integridad de los ADN obtenidos en cada uno de estos mtodos de extraccin se evalu a
travs de una electroforesis en gel de agarosa al 0,8%; mostraron que la metodologa de SaghaiMaroof, et al. (1984) conservo la integridad del ADN y se obtuvo mayor concentracin de ADN. El
ADN obtenido por el mtodo de Lee, 1990 resulto parcialmente degradado y en menor concentracin
como se muestra en la figura XV. La concentracin de los ADNs genmicos obtenidas por el mtodo
de Saghai-Maroof, et. al.1984 variaron entre los 1.000 - 4.000 ng/L, permitiendo la amplificacin de
la regin ITS1, 5.8S y ITS2 por PCR a un factos de dilucin (FD) de 100 logrando amplificar todos las
muestras. El ADN extrado por el mtodo de Lee (1990) mostro degradacin y concentracin entre
450 - 680 ng/L, solo se pudo amplificar la regin ITS1, 5.8S e ITS2 por PCR tras un FD de 1000. En
el caso de la cepa Pcit, no se produjo amplificacin figura XVII.

V.4.1.1 La PCR de la regin ITS 1 a ITS 2

La amplificacin de la regin ITS1-5.8S-ITS2 del ADNr con los primers ITS1 - ITS4. Arrojo
fragmentos con tamao de alrededor de 500-670 pb para las cepas P3215, PRAL, POST, Pcit y P132,
visualizando en geles de agarosa al 2% como muestra la figura XVIII.

La evaluacin de los mtodos Saghai-Maroof et al. (1984) y Lee (1990) para la extraccin del
ADN genmico de las cepas de estudio, permiti determinar que el protocolo con mayor eficiencia fue
el de Saghai-Maroof et al. (1984); ya que permiti conservar la integridad, el grado de pureza, altas
concentraciones de los ADNs genmicos y amplificar por PCR la regin ITS1, 5.8S e ITS2. Esto
debido a que este mtodo de extraccin una vez pulverizado el material fngico con nitrgeno
lquido, el CTAB como surfactante catinico es ms eficiente en la eliminacin de compuestos
secundarios que atrapan el ADN en una matriz gelatinosa (Guillemaut & Marchal-Drouard, 1992) y
de protenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN genmico (Do & Adams, 1991; Demeke &
Adams, 1992) los cuales inhiben la reaccin de amplificacin de ADN (Pandey et al., 1996), mientras
que el mtodo de Lee (1990); parte de la ruptura celular por accin mecnica, causando que la
actividad ltica se dispare y se termine por degradar el ADN, tambin la purificacin del ADN
genmico con un surfactante como el SDS es menos eficientes en la eliminacin de compuestos
segundarios que atrapan el ADN.

52

Tabla XIII Comparacin de las caractersticas del ADN obtenido a partir de las cepas del gnero Pleurotus a
partir de los mtodos de Saghai-Maroof, et al. (1984) (S) y Lee (1990) (L).

Minerales

Pureza

Concentracin (ng/ul)

Integridad

PCR (Dilucin)

Muestra
S

P3215

1,8

1,03

1,3

1,62

18,73

1,25

Integro

Degradado

100

1000

POST

0,72

3,39

1,7

1,75

6,92

0,28

Integro

Degradado

100

1000

PCIT

4,33

2,59

1,01

1,42

0,21

0,43

Degradado

Degradado

100

1000

PRAL

1,42

0,91

1,23

1,42

5,57

1,52

Integro

Degradado

100

1000

P132

0,73

3,05

1,7

1,08

11,03

0,17

Integro

Degradado

100

1000

Figura XVII Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de 1g del ADN genmico extrado de las cepas del
gnero Pleurotus P3215, P132, Post, Pcit y PRAL utilizando el mtodo de Lee (1990) (a) y el mtodo de
Saghai-Maroof, et. al.(1984) (b).

53

Figura XVIII Anlisis electrofortico de los productos de PCR de la regin ITS1, 5.8S y ITS2 amplificados con
los primers ITS1 y ITS4 a partir del ADN genmicos de las cepas del gnero Pleurotus como P3215, P132,
Post, PRAL y PCIT extrados por el mtodo de Lee (1990) diluida a un FD de 1000 (a) y el mtodo de SaghaiMaroof, et. al. (1984) a un FD de 100(b). (EPM) Escalera de peso molecular 1 Kb plus DNA ladder (+) Control
positivo y (-) al control negativo.

V.4.2 Anlisis de la secuencia de la regin ITS 1, gen 5.8 S ANDr y la regin ITS2 dentro
de las cepas del gnero Pleurotus

Una vez obtenidos los productos de PCR de la regin ITS1, 5.8S e ITS2, se determinaron las
concentraciones de AND a travs de la cuantificacin semicualitativa comparando con ADN de
lambda; obteniendo as entre 25 a 200 ng/l y se enviaron a secuenciar a la Unidad de Estudios
Genticos y Forenses (UEGF) del IVIC segn como se muestra en la tabla XIV.

Tabla XIV Concentraciones de los productos de PCR de la regin ITS1, 5.8S e ITS2 (PCR) de cada cepa
enviado a secuenciar a la a la Unidad de Estudios Genticos y Forenses del IVIC.

Muestras
P3215
Post
Pcit
PRAL
P132

Tipo de
ADN
templado
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR

Mtodo de
Purificacin
Mtodo Alcalino
Mtodo Alcalino
Mtodo Alcalino
Mtodo Alcalino
Mtodo Alcalino

Tamao del
ADN
templado
560
710
690
720
730

54

Primer
ITS1 (FW)
ITS1 (FW)
ITS1 (FW)
ITS1 (FW)
ITS1 (FW)

Temperatura
Concentracin
de Annealing
de ADN (ng/l)
(C)
55C
100
55C
100
55C
50
55C
25
55C
200

De las 5 muestras enviadas a secuenciamiento, se obtuvieron 3 secuencias, de las cuales al

comenzar el anlisis bioinformtico se encontraron segn la herramienta Blast del NCBI (Johnson et
al., 2008) que las muestras P132, Post y P3215 comparten una identidad del 98% con cepas
identificadas en el NCBI a la especie Pleurotus ostreatus como lo muestra la tabla XV.

Tabla XV Identidad de los productos de PCR de la regin ITS1, 5.8S e ITS2 de cada cepa enviada a secuenciar
a la Unidad de Estudios Genticos y Forenses del IVIC.

Cepa
P132
Post

P3215

Identidad

ADN

490/49(98.2%)
490/49(98.2%)
490/49(98.2%)
492/49(98.8%)
492/49(98.8%)
492/49(98.8%)
626/64(97.81%)
626/64(97.81%)
625/64(97.66%)

Regin ITS1, 5.8S e ITS2

Regin ITS1, 5.8S e ITS2
Regin ITS1, 5.8S e ITS2
Regin ITS1, 5.8S e ITS2
Regin ITS1, 5.8S e ITS2
Regin ITS1, 5.8S e ITS2
Regin ITS1, 5.8S e ITS2
Regin ITS1, 5.8S e ITS2
Regin ITS1, 5.8S e ITS2

cdigo de
acceso
KJ020935
KF681359
KF309193
JX429940
KC686866
KC686865
KF309193
EU424300
KF681359

Especie
Pleurotus ostreatus
P. ostreatus
P. ostreatus
P. sapidus
P. ostreatus
P. ostreatus
P. ostreatus
P. ostreatus
P. ostreatus

V.4.2.1 Anlisis bioinformtico de las secuencia de la regin ITS 1, 5.8S e ITS2 de las
cepas del gnero Pleurotus

Una vez identificadas las secuencias de la regin ITS 1, gen 5.8 S ANDr a ITS2 de las
cepas del gnero Pleurotus a travs de la herramienta bioinformtica Blast del NCBI como Pleurotus,
se procedi con el anlisis del RFLP de las secuencias de P132, Post y P3215, junto a las con varias
secuencias del GenBank correspondientes a diferentes cepas de las especies P. eryngii, P.
tuberregium, P. citrinopileatus, P. cystidiosus, P. ostreatus, P. pulmonarius y P. djamor; empleando
las herramientas de bioinformtica NEBcutter V2.0 (Vincze et al., 2003) y Webcutter 2.0 (Maarek et
al., 1997); encontrando que comparten los sitios de reconocimiento de las enzimas de restriccin
ApoI, AciI, HaeIII, HinfI, Hpy166II, HpyCH4V, CviAII y MnLI, y cortan el ADN en 4 fragmento como se
muestra en la tabla XVI, en relacin a esto y con el anlisis de Martin et al. (2004) se hizo el anlisis
de RFLP virtual con base en la enzima Haelll, a cada una de las secuencia encontrando variaciones
en el patrn de digestin de la regin ITS1 a ITS2 entre las especies evaluadas (Figura XVII, carriles
EF514248, AB115043, AY265821, EF514243, EF514244 y EF514250), y cierta similitud del patrn de
digestin entre las cepas y la especie P. ostreatus (Figura XIX, carriles P3215a, Posta, P132, Postb,
P3215b y EF514248).

Los resultados por la tcnica RFLP permitieron diferenciar e identificar correctamente las
especies del gnero Pleurotus utilizadas en este estudio, obteniendo los patrones tericos de bandas
esperados. Adicionalmente, el patrn terico de bandas de la cepa P3215, P132 y Post permiti
ubicarla en la especie P. ostreatus, obteniendo una identificacin consistente con respecto a los
resultados obtenidos por mtodos convencionales. Aun as, esta metodologa presenta una baja
especificidad para la diferenciacin de especies estrechamente relacionadas como las subespecies
de especies en este clado. El anlisis electrofortico, anlisis de secuencias de dominios de la regin
28S y recientes comparaciones de las regiones ITS1-5.8s-ITS2 del ADNr han permitido distinguir
nuevas especies reubicadas como P. cystidius y P. abalonus (Zervakis et al., 2004).La similitud de

55

secuencias explica la alta probabilidad de obtener un perfil electrofortico RFLP similar que no
permite distinguir entre especies estrechamente relacionadas.

Figura XIX Patrones RFLP de los fragmento ITS1-5.8S-ITS2 ADNr de las secuencias EF514248 Pleurotus
ostreatus, EF514244 P. cystidios, AB115043 P. citrinopiliatus, EF514250 P. tuberregium, EF514243 P.
pulmonarius, P132, P3215a, P3215b y Posta, digeridos con la enzima HaeIII a travs de la herramienta
NEBcutter v2.0 (Vincze et al., 2003). Marcador de peso molecular 100pb.

56

Tabla XVI Patrones de bandas RFLP esperados para las especies del gnero Pleurotus tras la digestin terica con las enzimas de restriccin que cortan en 3
sitios. Negro (Las enzimas de restriccin que comparten todos), Rojo que comparten las cepas P132, Post y P3215.
Nombre de la Secuencia

Enzimas de Restriccin que cortan en 3 sitios del ADN

EF514248 P.ostreatus

AciI (C^CG_C)

APoI (R^AATT_Y)

HaeIII (GG|CC)

Hindi (G^ANT_C)

HPy166II (GTN|NAC)

HPyCH4V (TG|CA)

Cortes

*7/9, *591/593,
*637/639

24/28, 331/335,
411/415

48/48, 230/230,
472/472

340/343, *348/351, 571/574

*64/64, 94/94,
*210/210

64/64, 328/328, 499/499

EF514244 P. cystidios

APoI (R^AATT_Y)

Cortes

8/12, 327/331,
407/411

AB115043 P. citrinopiliatus

AciI (C^CG_C)

HPy166II (GTN|NAC)

APoI (R^AATT_Y)

Cortes

*473/475, *593/595,
*614/616

*50/50, 83/83,
*171/171

9/13, 294/298,
374/378

EF514250 P. tuberregium

APoI (R^AATT_Y)

Cortes

10/14, 323/327,
403/407

EF514243 P. pulmonarius

APoI (R^AATT_Y)

HinfI (G^ANT_C)

HPy166II (GTN|NAC)

HP.yCH4V (TG|CA)

Cortes

8/12, 315/319,
395/399

324/327, *332/335,
546/549

*48/48, 78/78,
*194/194

48/48, 312/312, 474/474

AY265821 P. djamor

CviAII (C^AT_G)

Cortes

225/227, 383/385,
551/553

EU233990 P.eryngii

Cortes

P.132

AP.oI (R^AATT_Y)

HaeIII (GG|CC)

HP.y166II (GTN|NAC)

MnlI (CCTCNNNNNN_N^)

Cortes

6/10, 312/316,
392/396

29/29, 211/211,
455/455

*45/45, 75/75,
*191/191

40/39, 358/357, 482/481

P.3215a

APoI (R^AATT_Y)

CviAII (C^AT_G)

FatI (^CATG_)

MnlI (CCTCNNNNNN_N^)

NlaIII (_CATG^)

Cortes

18/22, 211/215,
291/295

59/63, 93/97, 233/237

95/94, 127/126, 250/249

63/59, 97/93,
237/233

60/62, 94/96, 234/236

P.3215b

AciI (C^CG_C)

HaeIII (GG|CC)

HinfI (G^ANT_C)

HPy166II (GTN|NAC)

HPyCH4V (TG|CA)

Cortes

*572/574, *619/621,
*643/645

26/26, 207/207,
451/451

317/320, 552/555,
612/615

*42/42, 71/71, 187/187

42/42, 305/305,
479/479

P.osta

AgsI (TT_S^AA)

HaeIII (GG|CC)

HPy166II (GTN|NAC)

MnlI (CCTCNNNNNN_N^)

Cortes

64/63, 240/239,
335/334

29/29, 209/209,
454/454

*45/45, 75/75,
*189/189

40/39, 356/355, 481/480

P.ostb

AgsI (TT_S^AA)

CviAII (C^AT_G)

FatI (^CATG_)

HPy166II (GTN|NAC)

MluCI (^AATT_)

NlaIII (_CATG^)

Cortes

65/64, 241/240,
336/335

41/43, 369/371,
541/543

40/44, 368/372,
540/544

*46/46, 76/76, *190/190

303/307, 311/315,
390/394

44/40, 372/368, 544/540

57

V.4.2.2 Anlisis Filogentico de las cepas del gnero Pleurotus

El anlisis filogentico de las regiones ITS1 e ITS2 arrojaron resultados con topologa
diferentes entre las regiones evaluadas, encontrando en la regin ITS1 valores bootstrap altos (60 99) para la resolucin de los clados correspondientes a las especies Pleurotus ostreatus, P. djamor,
P. citropileatus y P. eryngii, indicando una construccin filogentica solida (Figura XX a), y en ITS2 se
observ ser una regin ms variable en el gnero Pleurotus con valores de bootstrap altos (50 - 99)
para la resolucin de los clados correspondientes a las especies P. cystidios, P. citronopeliaus, P.
pulmonaris y P. ostreatus indicando una construccin filogentica solida exceptuando para las
especies P. ostreatus y P. eryngii (Figura XX b).

En un intento de aproximar a la identificacin de las cepas P3215, P132 y Post se analizaron

los valores observados en la matriz de distancia gentica pareada de K2P. La matriz K2P
correspondiente a la regin ITS2 present valores iguales de nmero de sustituciones de bases por
sitio (0.00) entre las especies estrechamente relacionadas del clado P. ostreatus, P. sapidus y P.
erryngii lo cual no permiti establecer diferencias entre las especies. Por otro lado, la matriz K2P de la
regin ITS1 permiti excluir las especies P. djamor, P. citrinopileatus, P. cystidios, P. eriingy y P.
drynius, reduciendo la identificacin de estas cepas estudio a las especies P. ostreatus, P. floridanus,
P. florida y P. sapidus (Tabla XVII y Tabla XVIII).

El anlisis filogentico fue realizado nicamente con las cepas P3215, P132 y Post, la
inferencia del rbol filogentico de las regin ITS1 y ITS2 no obtuvo una slida construccin dentro de
los clados de especies estrechamente relacionadas como son P. ostreatus, P. sapidus y P. florida al
obtener valores bajos de bootstrap (61 y 35).

Al evaluar las diferencias de los resultados del agrupamiento de los rboles filogenticos y el
nmero de sustituciones de bases por sitio de las regiones ITS1 e ITS2, se obtiene que estas
regiones no presentan igual conservacin evolutiva. Al comparar el valor total (overall) de nmero de
sustituciones de bases por sitio (K2P) se obtiene una mayor divergencia nucleotdica para la regin
ITS2 con respecto a la regin ITS1. Aun as, estos estudios revelan que esta divergencia y la
diversidad de estas secuencias difieren dependiendo del grupo taxonmico. Para este estudio la
regin ITS2 no permiti reducir la identificacin dentro del gnero Pleurotus, mientras que la regin
ITS1 permiti excluir las especies las especies Pleurotus eriingy y Pleurotus cornucopiea, reduciendo
la identificacin de las cepa P3215, P132 y Post de estudio a las especies P. ostreatus y P.
floridanus. Aun as, el anlisis pudo verse sesgado por la falta de un nmero representativo de
secuencias de cepas de referencia pertenecientes a dichas especies; siendo as las regiones ITS
ADNr insuficientes para la identificacin certera de las cepas evaluadas.

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Tabla XVII Matriz de distancias genticas pareadas K2P para la regin ITS1.
Distancia
1,00000 AB115036ITS1P_cystidiosus
2,00000 AB115037ITS1P_cornucopiae
3,00000 AB115038ITS1P_pulmonarius
4,00000 AB115042ITS1P_eryngii
5,00000 AB115049ITS1P_javanicus
6,00000 AB115053ITS1P_djamor
7,00000 AB272091ITS1P_nebrodensis
8,00000 AB286152ITS1P_eryngii
9,00000 AB286153ITS1P_eryngii
10,00000 AB733142ITS1P_ostreatus
11,00000 AB733143ITS1P_ostreatus
12,00000 AY450345ITS1P_ostreatus
13,00000 AY540318ITS1P_citrinopileatus
14,00000 AY540319ITS1P_citrinopileatus
15,00000 AY540326ITS1P_sapidus
16,00000 AY540327ITS1P_sapidus
17,00000 AY540332ITS1P_ostreatus
18,00000 EF514243ITS1P_pulmonarius
19,00000 EF514244ITS1P_cystidiosus
20,00000 EF514248ITS1P_ostreatus
21,00000 EU424287ITS1P_djamor
22,00000 EU424288ITS1P_djamor
23,00000 EU424293ITS1P_dryinus
24,00000 EU424294ITS1P_dryinus
25,00000 EU424300IST1P_ostreatus
26,00000 EU424316ITS1P_sapidus
27,00000 FJ687276ITS1Pleurotus_sp
28,00000 FJ810181ITS1P_sapidus
29,00000 FN391585ITS1P_ostreatus
30,00000 GU721058ITS1P_floridanus
31,00000 HM561980ITS1P_sapidus
32,00000 JF758887ITS1P_ostreatus
33,00000 JF908604ITS1P_pulmonarius
34,00000 JF908619ITS1P_ostreatus
35,00000 JN234845ITS1P_sapidus
36,00000 JX403720ITS1Pleurotus_sp
37,00000 JX429940ITS1P_sapidus
38,00000 KC686865IST1P_ostreatus
39,00000 KC686866IST1P_ostreatus
40,00000 KF681359ITS1P_ostreatus
41,00000 P132
42,00000 P3215a
43,00000 P3215b
44,00000 Posta
45,00000 Postb

1,00000 2,00000 3,00000 4,00000 5,00000 6,00000 7,00000 8,00000 9,00000 10,00000 11,00000 12,00000 13,00000 14,00000 15,00000 16,00000 17,00000 18,00000 19,00000 20,00000 21,00000 22,00000 23,00000 24,00000 25,00000 26,00000 27,00000 28,00000 29,00000 30,00000 31,00000 32,00000 33,00000 34,00000 35,00000 36,00000 37,00000 38,00000 39,00000 40,00000 41,00000 42,00000 43,00000 44,00000 45,00000
0,06875 0,07796 0,09906 0,08383 0,10478 0,07987 0,09016 0,09906 0,07796 0,07796 0,07796 0,07782 0,07782 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,02251 0,07796 0,08758 0,10478 0,06259 0,06259 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,08572 0,07796 0,07796
0,17159
0,07091 0,09054 0,08684 0,09687 0,07105 0,08147 0,09054 0,07091 0,07091 0,07091 0,02260 0,02260 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,06333 0,07091 0,07986 0,09687 0,06866 0,06866 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07924 0,07091 0,07091
0,20101 0,17388
0,04063 0,07485 0,10201 0,03387 0,04786 0,04063 0,00000 0,00000 0,00000 0,06197 0,06197 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,28929 0,25861 0,06866
0,10153 0,11044 0,04786 0,02260 0,00000 0,04063 0,04063 0,04063 0,08147 0,08147 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,09228 0,04063 0,09256 0,11044 0,10441 0,10441 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04611 0,04063 0,04063
0,22735 0,25702 0,19813 0,29018
0,09081 0,07853 0,09723 0,10153 0,07485 0,07485 0,07485 0,09459 0,09459 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07743 0,07485 0,07562 0,09081 0,08283 0,08283 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,08204 0,07485 0,07485
0,32144 0,28831 0,32058 0,35478 0,25800
0,10454 0,10456 0,11044 0,10201 0,10201 0,10201 0,10426 0,10426 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,09727 0,10201 0,04030 0,00000 0,09965 0,09965 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201
0,20101 0,17388 0,04549 0,09248 0,19813 0,32058
0,04063 0,04786 0,03387 0,03387 0,03387 0,08060 0,08060 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,07324 0,03387 0,08851 0,10454 0,08144 0,08144 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,04230 0,03387 0,03387
0,25702 0,22735 0,09248 0,02223 0,26076 0,32144 0,06866
0,02260 0,04786 0,04786 0,04786 0,09054 0,09054 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,08333 0,04786 0,08705 0,10456 0,09634 0,09634 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,05369 0,04786 0,04786
0,28929 0,25861 0,06866 0,00000 0,29018 0,35478 0,09248 0,02223
0,04063 0,04063 0,04063 0,08147 0,08147 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,09228 0,04063 0,09256 0,11044 0,10441 0,10441 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04611 0,04063 0,04063
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866
0,00000 0,00000 0,06197 0,06197 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000
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0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000
0,06197 0,06197 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
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0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
0,02135 0,00000 0,00000
0,23227 0,20420 0,02223 0,09248 0,22671 0,32058 0,06988 0,11748 0,09248 0,02223 0,02223 0,02223 0,17388 0,17388 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,20420 0,02223 0,28929 0,32058 0,25861 0,25861 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223
0,02135 0,02135
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02223
0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02223 0,00000

59

Tabla XVIII Matriz de distancias genticas pareadas K2P para la regin ITS2.
Distancia
1 AB115043ITS2P_citrinopileatus
2 AB286152ITS2P_eryngii_var_ferula
3 AB286153ITS2P_eryngii_var_ferula
4 AY265832ITS2P_floridanus
5 AY265851ITS2P_smithii
6 AY265852ITS2P_citrinopileatus
7 AY368665ITS2P_ostreatus
8 AY450345ITS2P_ostreatus
9 AY540327ITS2P_sapidus
10 AY540332ITS2P_ostreatus
11 DQ882570ITS2P_abalonus
12 DQ882571ITS2P_abalonus
13 DQ978222ITS2P_cystidiosus
14 EF514243ITS2P_pulmonarius
15 EF514244ITS2P_cystidiosus
16 EF514248ITS2P_ostreatus
17 EF514250ITS2P_tuberregium
18 EU424286ITS2P_ostreatus
19 EU424287ITS2P_djamor
20 EU424289ITS2P_djamor
21 EU424291ITS2P_dryinus
22 EU424300ITS2P_ostreatus
23 EU424316ITS2P_sapidus
24 EU622250ITS2P_ostreatus
25 EU622254ITS2P_ostreatus
26 FJ379271ITS2P_cornucopiae
27 FJ608594ITS2P_Florida
28 FJ810181ITS2P_sapidus
29 FN391585ITS2P_ostreatus
30 GU721058ITS2P_floridanus
31 GU7222811ITS2P_ostreatus
32 HM561980ITS2P_sapidus
33 HM590444ITS2P_ostreatus
34 P132
35 P3215a
36 P3215b
37 Posta
38 Postb

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
0,05687 0,05522 0,05378 0,04476 0,00000 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,04499 0,04415 0,04415 0,04761 0,04600 0,05378 0,06481 0,05378 0,03272 0,03272 0,04386 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,06128 0,05378 0,05598 0,06145 0,06497
0,20353
0,01528 0,01095 0,06812 0,05687 0,01095 0,01095 0,01095 0,01095 0,05443 0,05275 0,05275 0,02850 0,06789 0,01095 0,06260 0,01095 0,04747 0,04747 0,05686 0,01095 0,01095 0,01476 0,01476 0,01095 0,01476 0,01095 0,01095 0,01476 0,01095 0,01476 0,01476 0,02992 0,01095 0,01657 0,03023 0,03809
0,20159 0,02183
0,01027 0,06476 0,05522 0,01027 0,01027 0,01027 0,01027 0,05200 0,04766 0,04766 0,02777 0,06202 0,01027 0,05701 0,01027 0,04636 0,04636 0,05350 0,01027 0,01027 0,01460 0,01460 0,01027 0,01460 0,01027 0,01027 0,01460 0,01027 0,01460 0,01460 0,02919 0,01027 0,01550 0,02980 0,03679
0,18815 0,01087 0,01084
0,06382 0,05378 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,05054 0,04865 0,04865 0,02599 0,06325 0,00000 0,05889 0,00000 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,14595 0,25275 0,25002 0,23580
0,04476 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,03824 0,03550 0,03550 0,05460 0,04053 0,06382 0,06061 0,06382 0,04718 0,04718 0,04342 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,07207 0,06382 0,06708 0,07647 0,07427
0,00000 0,20353 0,20159 0,18815 0,14595
0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,04499 0,04415 0,04415 0,04761 0,04600 0,05378 0,06481 0,05378 0,03272 0,03272 0,04386 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,06128 0,05378 0,05598 0,06145 0,06497
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815
0,00000 0,00000 0,00000 0,05054 0,04865 0,04865 0,02599 0,06325 0,00000 0,05889 0,00000 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000
0,00000 0,00000 0,05054 0,04865 0,04865 0,02599 0,06325 0,00000 0,05889 0,00000 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000
0,00000 0,05054 0,04865 0,04865 0,02599 0,06325 0,00000 0,05889 0,00000 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000
0,05054 0,04865 0,04865 0,02599 0,06325 0,00000 0,05889 0,00000 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,14595 0,17691 0,17494 0,16198 0,10539 0,14595 0,16198 0,16198 0,16198 0,16198
0,02248 0,02248 0,04945 0,04463 0,05054 0,04957 0,05054 0,05053 0,05053 0,04389 0,05054 0,05054 0,05426 0,05426 0,05054 0,05426 0,05054 0,05054 0,05426 0,05054 0,05426 0,05426 0,06160 0,05054 0,05322 0,06225 0,05889
0,14595 0,17691 0,16024 0,16198 0,10539 0,14595 0,16198 0,16198 0,16198 0,16198 0,04497
0,00000 0,05200 0,04184 0,04865 0,05789 0,04865 0,04407 0,04407 0,04045 0,04865 0,04865 0,05192 0,05192 0,04865 0,05192 0,04865 0,04865 0,05192 0,04865 0,05192 0,05192 0,05377 0,04865 0,05171 0,06059 0,05808
0,14595 0,17691 0,16024 0,16198 0,10539 0,14595 0,16198 0,16198 0,16198 0,16198 0,04497 0,00000
0,05200 0,04184 0,04865 0,05789 0,04865 0,04407 0,04407 0,04045 0,04865 0,04865 0,05192 0,05192 0,04865 0,05192 0,04865 0,04865 0,05192 0,04865 0,05192 0,05192 0,05377 0,04865 0,05171 0,06059 0,05808
0,15872 0,06787 0,06756 0,05596 0,18815 0,15872 0,05596 0,05596 0,05596 0,05596 0,15872 0,17322 0,17322
0,05839 0,02599 0,05755 0,02599 0,03872 0,03872 0,05458 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,03975 0,02599 0,02815 0,04126 0,04616
0,15745 0,25906 0,22753 0,24151 0,13004 0,15745 0,24151 0,24151 0,24151 0,24151 0,14595 0,13206 0,13206 0,21941
0,06325 0,05532 0,06325 0,04180 0,04180 0,04677 0,06325 0,06325 0,06750 0,06750 0,06325 0,06750 0,06325 0,06325 0,06750 0,06325 0,06750 0,06750 0,07272 0,06325 0,06713 0,07716 0,07637
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151
0,05889 0,00000 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,24757 0,24540 0,21530 0,22927 0,25992 0,24757 0,22927 0,22927 0,22927 0,22927 0,18499 0,23117 0,23117 0,22630 0,21530 0,22927
0,05889 0,06382 0,06382 0,04771 0,05889 0,05889 0,06220 0,06220 0,05889 0,06220 0,05889 0,05889 0,06220 0,05889 0,06220 0,06220 0,07171 0,05889 0,06317 0,06484 0,06728
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927
0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,09257 0,15872 0,15745 0,14464 0,16024 0,09257 0,14464 0,14464 0,14464 0,14464 0,17494 0,14595 0,14595 0,11761 0,14356 0,14464 0,25992 0,14464
0,00000 0,04501 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,05372 0,04487 0,04692 0,05366 0,06618
0,09257 0,15872 0,15745 0,14464 0,16024 0,09257 0,14464 0,14464 0,14464 0,14464 0,17494 0,14595 0,14595 0,11761 0,14356 0,14464 0,25992 0,14464 0,00000
0,04501 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,05372 0,04487 0,04692 0,05366 0,06618
0,14356 0,19229 0,19010 0,17691 0,15745 0,14356 0,17691 0,17691 0,17691 0,17691 0,14595 0,13206 0,13206 0,18815 0,16024 0,17691 0,18284 0,17691 0,15745 0,15745
0,05247 0,05247 0,05576 0,05576 0,05247 0,05576 0,05247 0,05247 0,05576 0,05247 0,05576 0,05576 0,05987 0,05247 0,05578 0,05392 0,05787
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691
0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691 0,00000
0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,18815 0,02198 0,02183 0,01087 0,23580 0,18815 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,05596 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,14464 0,14464 0,19229 0,01087 0,01087
0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,02897 0,01031 0,01508 0,02970 0,03755
0,18815 0,02198 0,02183 0,01087 0,23580 0,18815 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,05596 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,14464 0,14464 0,19229 0,01087 0,01087 0,00000
0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,02897 0,01031 0,01508 0,02970 0,03755
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691 0,00000 0,00000 0,01087 0,01087
0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,18815 0,02198 0,02183 0,01087 0,23580 0,18815 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,05596 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,14464 0,14464 0,19229 0,01087 0,01087 0,00000 0,00000 0,01087
0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,02897 0,01031 0,01508 0,02970 0,03755
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691 0,00000 0,00000 0,01087 0,01087 0,00000 0,01087
0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691 0,00000 0,00000 0,01087 0,01087 0,00000 0,01087 0,00000
0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,18815 0,02198 0,02183 0,01087 0,23580 0,18815 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,05596 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,14464 0,14464 0,19229 0,01087 0,01087 0,00000 0,00000 0,01087 0,00000 0,01087 0,01087
0,01031 0,00000 0,00000 0,02897 0,01031 0,01508 0,02970 0,03755
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691 0,00000 0,00000 0,01087 0,01087 0,00000 0,01087 0,00000 0,00000 0,01087
0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,18815 0,02198 0,02183 0,01087 0,23580 0,18815 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,05596 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,14464 0,14464 0,19229 0,01087 0,01087 0,00000 0,00000 0,01087 0,00000 0,01087 0,01087 0,00000 0,01087
0,00000 0,02897 0,01031 0,01508 0,02970 0,03755
0,18815 0,02198 0,02183 0,01087 0,23580 0,18815 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,05596 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,14464 0,14464 0,19229 0,01087 0,01087 0,00000 0,00000 0,01087 0,00000 0,01087 0,01087 0,00000 0,01087 0,00000
0,02897 0,01031 0,01508 0,02970 0,03755
0,24352 0,07937 0,07933 0,06746 0,29441 0,24352 0,06746 0,06746 0,06746 0,06746 0,23117 0,19991 0,19991 0,12893 0,30025 0,06746 0,32317 0,06746 0,19733 0,19733 0,23117 0,06746 0,06746 0,07937 0,07937 0,06746 0,07937 0,06746 0,06746 0,07937 0,06746 0,07937 0,07937
0,02686 0,02933 0,03309 0,04756
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691 0,00000 0,00000 0,01087 0,01087 0,00000 0,01087 0,00000 0,00000 0,01087 0,00000 0,01087 0,01087 0,06746
0,01140 0,02734 0,03529
0,20353 0,02198 0,02183 0,01087 0,25275 0,20353 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,06787 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,15872 0,15872 0,19229 0,01087 0,01087 0,02198 0,02198 0,01087 0,02198 0,01087 0,01087 0,02198 0,01087 0,02198 0,02198 0,07937 0,01087
0,03051 0,03809
0,24352 0,07937 0,07933 0,06746 0,31260 0,24352 0,06746 0,06746 0,06746 0,06746 0,23117 0,23117 0,23117 0,12893 0,31912 0,06746 0,27140 0,06746 0,19733 0,19733 0,19991 0,06746 0,06746 0,07937 0,07937 0,06746 0,07937 0,06746 0,06746 0,07937 0,06746 0,07937 0,07937 0,09156 0,06746 0,07937
0,04343
0,25992 0,11688 0,11639 0,10406 0,31260 0,25992 0,10406 0,10406 0,10406 0,10406 0,23117 0,23117 0,23117 0,16950 0,31912 0,10406 0,29197 0,10406 0,27687 0,27687 0,21530 0,10406 0,10406 0,11688 0,11688 0,10406 0,11688 0,10406 0,10406 0,11688 0,10406 0,11688 0,11688 0,18216 0,10406 0,11688 0,15475

60

(a)

(b)

Figura XX Clados de los arboles filogenticos de las regiones ITS1 y 5.8S (a) e ITS2 (b) construidos por el mtodo NJ-K2P- 1000 Bootstrap.

61

V.4.2.3 Anlisis de la estructura segundaria de la regin ITS2

Al realizar el anlisis de estructuras secundarias bajo el mtodo comparativo de secuencias y

estructuras homologas de la regin ITS2 de las secuencias de las cepas P3215, P132 y Post, junto
con varias secuencias del GenBank correspondientes a diferentes cepas de las especies P. eryngii,
P. tuberregium, P. citrinopileatus, P. cystidiosus, P. ostreatus, P. pulmonarius y P. djamor (EF514248,
AB115043, AY265821, EF514243, EF514244, EF514250 y EF514248), se encontr que estas
comparten el mismo motivo 5.8S que para el gnero Pleurotus representa la secuencia
5GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA3; variando segn la especie en el motivo 28S, como se ve
en la Figuras XXI y tabla XIX.

Una vez realizado el anlisis global de las estructuras secundarias para todas las secuencias,
se procedi bajo este mtodo comparativo de secuencias y estructuras homologas a inferir la
estructura segundaria completa de la regin ITS2 de la cepa P3215 obteniendo una estructura de
cuatro proyecciones o brazos (doble hlices auto complementarias), como muestra la figura XXII.

El anlisis de la cepa P3215 arroj coincidencias con un valor de e-value de 2,64 e-99 de las
cuales una perteneciente a la especie P. nebrodensis presentando una identidad de un 88,24 % y
85,71 % de las primeras 2 hlices, y 75,57% y 77,78% para la tercera y cuarta hlice respectivamente
(88,235 / 85,714 / 75,571 / 77,778). Las diez coincidencias restantes correspondieron a 5 P. ostreatus
con un e-value de 5,716 e-96, con porcentajes de 100 / 100 / 100 / 100 identidad como muestra la
tabla XX, corroborando la identidad de la cepa con respecto al anlisis filogentico de la regin ITS1.

Tabla XIX Motivos conservados 5.8S y 28S en la regin ITS2 del gnero Pleurotus

Especie

ID

Motivo 5.8S

Motivo 28S

P3215

GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA

TGACCTCAAATCGGGTAGGACTCCC

Post

GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA

P132

GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA

P. ostreatus

EF514248

GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA

TGACCTCAAATCAGGTAGGACTACC

P. djamor

AY265821

GAAGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA

TGACCTCAAATCAGGTAGGACTACC

P. pulmonarius

EF514243

GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA

TGACCTCAAATCAGGTAGGACTA

P. cystidiosus

EF514244

GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA

TGACCTCAAATCAGGTAGGA

P. citrinopileatus

AB115043

GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA

TGACCGCAAATCAGGTAGGACTACC

P. tuberregium

EF514250

GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA

TGACCTCAAATCAGGTAGGACTAC

P. eryngii

EU233990

GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA

El anlisis de estructuras secundarias del ITS2 ADNr se vio afectado debido a el posible
encuentro de secuencias mal anotadas, lo cual queda reflejado en la presencia de especies como P.
spodoleucus que pertenece actualmente al gnero Agaricus sp., pero la coincidencia con P. ostreatus
corrobor el estudio al patrn RFLP terico en que se le encontr relacin a esta cepa de estudio con
la especie P. ostreatus.

62

Figura XXI Motivos conservados 5.8S y 28S en la regin ITS2 del gnero Pleurotus

63

Tabla XX Coincidencias encontradas por comparacin de estructura secundaria ITS2 de la cepa P3215
(Pleurotus ostreatus var. florida).

ID

Especie

E-value

Modelo

EF470252

P. nebrodensis

1,203x 10-112

88,235 / 85,714 / 75,571 / 77,778

AY368663

P. floridanus

2,640x10-99

100 / 100 / 100 / 100

GU722281

P. ostreatus

3,416x10-98

100 / 100 / 100 / 100

AY265848

P. spodoleucus

1,228x10-97

100 / 100 / 100 / 100

EU424310

P. ostreatus

1,228x10-97

100 / 100 / 100 / 100

EU622256

P. ostreatus

5,716x10-96

100 / 100 / 100 / 100

FN391585

P. ostreatus

5,716x10-96

100 / 100 / 100 / 100

DQ077881.

Pleurotus

5,716x10-96

100 / 100 / 100 / 100

HM561980

P. sapidus

5,716x10-96

100 / 100 / 100 / 100

AY854077

P. ostreatus

2,056x10-95

100 / 100 / 100 / 100

Figura XXII Estructura secundaria de la secuencia ITS2 de la cepa P3215 (Pleurotus ostreatus var. florida).

64

CAPITULO VI
CONCLUSINES

Las caractersticas morfo-anatomicas permitieron clasificar a las cepas Post, P3215 y P132 en
el gnero Pleurotus.
En los medios PDA y ASD la temperatura de incubacin en el rango de 20 35 C, tiene poco
efecto sobre las tasas de crecimiento micelial de las cepas P3215, P132, Post y PRAL; no obstante,
afecto la produccin de biomasa dependiendo del medio de cultivo y de cada cepa.

El compartamiento de las cepas inoculadas a diferentes temperaturas en medios

convencionales, indican que las cepas P132, P3215 y PRAL podran cultivarse en temperaturas
cercanas a los 25 C, mientras que la cepa Post se cultiva mejor a temperaturas cercanas a los 30
C.

Las diferencias en cuanto a las tasa de crecimiento y produccin de biomasa, cuando las
cepas fueron cultivadas en las mismas condiciones, indican que existe diferencias fisiologicas y
genticas entre ellas.

La tuza de maz resulto el mejor sustrato no convencional para el cultivo de las cepas Post y
P3215, siendo as una alternativa al sorgo para la produccin de semilla fngica o inoculo mayor.

Mediante las tcnicas moleculares se determino por anlisis filogentico de las regiones ITS1
e ITS2 del ADNr que las cepas Post, P3215 y P132 pertenecen a la especie P. ostreatus.

La tcnica de RFLP tericos a travs de la digestin virtual de las secuencias del regin ITS1,
5.8S a ITS2, corrobor el anlisis filogentico; logrando diferenciar e identificar correctamente las
especies del gnero Pleurotus utilizadas en este estudio, obteniendo los patrones de bandas
esperados. Adicionalmente, el patrn de bandas de la cepa Post de estudio permiti ubicarla en la
especie P.ostreatus. Por otro lado, los anlisis de la secuencia primaria y secundaria de la regin
ITS1 e ITS2 ubicaron las cepa P3215, P132 y Post de estudio dentro del clado de especies
estrechamente relacionadas P. ostreatus y P. floridanuss.

El estudio molecular de las cepas corrobor su descripcin morfolgica.

65

RECOMENDACIONES
Se requiere la constitucin de un mico-cepario de hongos comestibles del gneo Pleurotus spp., que
incluya cepas importadas y aislados autctonos; dicho material debe ser caracterizacin desde el punto de vista
morfologco y anatomico del micelio vegetativo y los cuerpos reproductivo, fisiologco evaluando su desarrollo
en diferentes medios de cultivo, a temperaturas, pH, luz y humedad; y identificacin molecular por medio de
diferentes marcadores moleculares a parte de la regin ITS 1, 5.8S e ITS2; buscando as la aplicabilidad
biotecnologca del cepario.

El anlisis filogentico de la regin ITS1 a ITS2 de las cepas del gnero Pleurotus presentes
en el Laboratorio de Biotecnologa de Microorganismos SIXTO DAVID ROJO, revelo una
incertidumbre para identificacin de especie, por lo cual se recomienda ampliar la recoleccin de
estos recursos genticos y repetir este tipo de anlisis junto a otros marcadores moleculares como el
gen del factor de elongacin de la traduccin 1 (EF1), los tres tipos de ARNr [18S (subunidad
pequea ARN-SSU), 5.8S y 28S (subunidad grande ARN-LSU)]; el de la ARN polimerasa II (RPB2)
para lograr una identificacin definitiva de las cepas de estudio, tal como lo sugieren varios autores
(Lutzoni et al.,2004; Marongiu et al., 2005; White et al.,1990), adems de evaluar el conocimiento
tradicional de estos en las comunidades y llevar a cabo pruebas de compatibilidad gentica con el
resto a los 15 grupos interestriles hasta ahora descritos para el gnero Pleurotus (Vilgalys et al.,
1996), lo cual confirmar la identidad del material aislado y evaluar la posibilidad de especies
genticamente aisladas e interestriles con el resto de los miembros de esta taxa, a partir del
concepto biolgico de especie.
El uso de las regiones ITSs ADNr no fueron suficientes para una identificacin definitiva entre
especies estrechamente relacionadas, por lo cual se concluye que es necesario la realizacin de
estudios adicionales de mtodos convencionales y diferentes marcadores moleculares para llegar a
una identificacin certera. Por ltimo, se recomienda la revisin de las especies estrechamente
relacionadas para lograr una correcta anotacin tanto de las secuencias como de las estructuras
secundarias que permitan una diferenciacin correcta entre estas especies, estableciendo lmites
claros entre ellas.

66

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74

ANEXOS

Anexo 1 Key to identify Mushrooms to genus using only macroscopic features (Largent, 1986).

In this key, only characteristics of mushrooms that can be seen with the unaided eye or with a hand
lens are used. Since this key is based only on macroscopic features, you many not be able to identify
correctly all genera of mushrooms you study ( Langent, 1986).
1. Sporocarp not growing on other mushrooms6
6. Undersurface of pileus with normal, blade-like gills...10
10. Pileus with definite stipe that may be central, eccentric, or (rarely) even lateral21
10. Pileus sessile; laterally attached and sheving, or attached by a short lateral tubercle or
"pseudostipe", or basally attached and funnel-shaped or spatulate (pleurotoid habit)11
11. Spores not as above.13
13. Spores white to pale yellowish or cream-colored, or (rarely) pale dingy lilac15
15. Gills not split along their edges and rolled back laterally16
16. Gills narrow or broad, but not strongly crisped or sinuos; pileal thickness varies, but if thin enoufgh
to be membranous it is also soft and fleshy17
17. Pileus varying in consistency from soft and pulpy to pliable and leathery, but not corky; gills not
tough and leathery...19
19. Edges of gills entire20
20. Pileus soft and pulpy or fleshy Pleurotus
21. Gills not deliquescent23
23. Stipe when broken or split lengthwise showing evidence of fibrous context25
25. Volva not present..31
31.Annulus absent; however, a cortina may be present51
51. Gills attached.58
58. Flesh of mature pilei soft and pulpy to soft-fibrous, or very fragile (not reviving when moidtened
after having been dried); spores white, parle yellowish, or some other color61
61 stipe central, or nearly so65
61. Stipe definitely and consistenly escentric, sometimes almost lateral62
62. Spores white to pale yeloowish or cream-colored, or pallid lilacPleurotus
65. Gills variously attached, but neither adnate-subdecurrent not decurrent.77
77. Stipe stouter than the above, usually 5 mm or more thick, fleshyfibrous and soft, or pulpy, or with a
firm cartilaginou " rind" and soft interior; pileal fleh ordinarily at least 3-5 mm thick at the center , rarely
thin enough to be called membranous................91
91.Spores white to pale cream-colored (rarely cream-colored with a faint pinkish tinge) to pale pink, or
salomon-pink, dingy salmon, to brownish-salmon..92
92. Gills thin, usually close or crowded, rarely subdistant, and not waxy-appearing96
96. Spore wite to cream-colored to pale pink, al times cream-colored with a faint pinkish tinge; mature
gills not pink from the spores.97
97. Not as above..98
98. Carpophore growing out of cones or growing oud of decaying wood (i.e.lignicolous)...99
99.Carpophore on cones or on decaying wood; gills not completely sterile (some especies of
Pleurotus)

75

Anexo 2 Keys of gnero Pleurotus (Petersen et al., 2012).

Keys abound for limited groups (Vilgalys et al., 1993, for the P. ostreatus complex) or of limited
accuracy (Pilt, 1935; Khner and Romagnesi, 1953; Hilber, 1982, 1993, 1997).
To devise a key to this group is fraught with problems, for basidiome colors, hosts, and stature often
intergrade, and geographical distribution is often wide and therefore creates overlaps. Especially
vexing is the separation of Pleurotus pulmonarius from its sister monomitic, pleurotoid species, P.
ostreatus and P. populinus. With these problems in mind, the following key to biological species is
offered.
1. Anamorphic spores produced on basidiomata or associated vegetative mycelium................ 2
1. Anamorphic spores, if formed, not associated with basidiomata ........... 4
2. Anamorphic state a lawn of simple conidiophores producing black arthrospores, dry initially but later
slimy; Australa, New Zeald.............................................................. P. australis
2. Anamorph coremioid, with black, slimy heads of arthrospores............ 3
3. Pileus pale tan to brown; distribution roughly pantropical....... P. cystidiosus
3. Pileus deep olive, olive-black, occasionally with purplish tints; New Zealand,
Australia..... P. purpureo-olivaceus
4. Stipe central to weakly eccentric ................. 5
4. Stipe strongly eccentric or lateral ......................... 11
5. Pileus tan, brown, rufous brown, usually concave ......6
5. Pileus pearl gray, white, or banana yellow ......................................... 8
6. Basidiomata arising from a sclerotium ............................................... P. tuber-regium
6. Basidiomata without sclerotium ..................................... 7
7. Root parasite; pileus tan to brown; Europe ....... P. eryngii
7. On rotting wood; pileus tan, brown, usually with ruddy tints............ P. cornucopiae
8. Pileus and stipe white to pearl gray .................... 9
8. Pileus banana yellow; stipe white (citrinopileatus form) ..................... P. cornucopiae
9. Stipe nearly lateral; on Agave, Opuntia; northern Africa, Mexico ........................... P. opuntiae
9. Stipe central; all basidiome parts white .. 10
10. Pileus surface velutinous to plushy; warm climates; anamorph unknown .......................... P. levis
10. Pileus surface strigose to wooly; cool, wet climates; anamorph of tan to Brown arthrospores in
culture ................................................................................ P. dryinus
11. Stipe tissue dimitic....................................... 12
11. Stipe tissue monomitic.................................... 14
12. Partial veil present over young lamellae....... P. calyptratus
12. Partial veil absent .................................................. 13
13. Basidiomata usually everted; pileus surface ruddy tan to ruddy brown.. P. cornucopiae
13. Basidiomata pleurotoid; pileus surface white, yellow-olive, brown, olive-brown, pink or gray
....................................................................................................... P. djamor
14. On coniferous wood; northern China, far eastern Russia ........... P. abieticola

76

14. On deciduous wood (chiefly) .......................... 15

15. Pileus and lamellae buffy tan to pastel tan; lamellae subdistant; spore print pallid buff; spores 9-12
X 3-5 m m; North America; usually on Populus wood................... P. populinus
15. Pileus various shades of off-white, tan, brown, deep gray, bluish olive to olive-black; spore print
avellaneous; spores 7-10 m m long; worldwide; usually on deciduous wood...... 16
16. Fruiting predominately in winter; pileus tan, brown, gray-brown, olive-black; North Temperate Zone
..................................................................... .P. ostreatus
16. Fruiting predominately in late summer (Europe, Asia, eastern North America) or spring (western
North America); pileus white, tan, gray-brown; North Temperate Zone. P. pulmonarius.

ANEXO 3 Analisis estadstico del efecto del medio de cultivo y la temperatura en la tasa de
crecimiento micelial y produccin de biomasa de las cepas del gnero Pleurotus

Factores inter-sujetos
1,00
2,00
3,00
4,00
20,00
25,00
30,00
35,00

Cepa

Temperatura

N
6
8
12
10
10
10
9
7

Pruebas de los efectos inter-sujetos

Suma de
cuadrados
tipo III

Origen

Modelo
corregido

Sig.

Suma de
cuadrados
tipo III

Origen

83,239 a

14,00

5,95

68,02

32,753 b

14,00

2,34

107,32

14,00

118114,24

29,69

255295,762 d

14,00

18235,41

6,93

0,00

mgSA

478,48

1,00

478,48

5474,21

0,00

PDA

mgPDA

SA

1653599,307

0,00

201,90

1,00

201,90

9261,40

0,00

777234,89

1,00

777234,89

195,38

0,00

mgSA

388772,29

1,00

388772,29

147,76

10,96

3,00

3,65

41,78

SA

PDA

0,00 Cepa *
SA
0,00 Temperatura mgPDA

mgPDA

PDA

SA

33,28

0,00

1,50

68,69

0,00

877443,34

8,00

109680,42

27,57

0,00

45162,50

8,00

5645,31

2,15

0,08

1,84

21,00

0,09
0,02
3978,10

0,00

mgSA

55254,59

21,00

2631,17

0,00

PDA

724,41

36,00

2,36

108,37

0,00

130438,51

32,79

0,00

mgSA

114720,65

3,00

38240,22

14,53

0,00

mgSA

27,09

3,00

9,03

103,29

0,00

8,07

3,00

2,69

123,44

334083,15

3,00

111361,05

27,99

13831,52

3,00

4610,51

1,75

mgSA

2,91

8,00

21,00

3,00

mgPDA

8,00

21,00

3,00

300,26

36,00

2591962,84

36,00

787973,77

36,00

PDA

85,08

35,00

0,00 Total
0,00 corregida

SA

33,21

35,00

1737139,32

35,00

0,19

mgSA

310550,35

35,00

Total

a. R cuadrado = ,978 (R cuadrado corregida = ,964)

b. R cuadrado = ,986 (R cuadrado corregida = ,977)

77

SA
mgPDA

mgPDA

Sig.

11,98

0,46

7,09

23,27

83540,01

391315,54

SA

Media
cuadrtica

gl

mgPDA

Error

mgPDA
PDA

Temperatura

SA

PDA

Cepa

gl

PDA

mgSA

Interseccin

Media
cuadrtica

Anexo 4 Secuencias de la regin ITS 1 a ITS2 de las cepas del gnero Pleurotus P3215, P132 y Post

Regin ITS1 a 5.8S de las cepas P3215, P132 y Post del gnero Pleurotusp.

>P132ITS1
AAAAAGAATTCCTATGGAGTTGTTGCTGGCCTCTAGGGGCATGTGCACGCTTCACTAGTCTTTCA
ACCACCTGTGAACTTTTGATAGATCTGTGAAGTCGTCTTTCAAGTCGTCAGACTTGGTTTGCTGG
GATTTAAACGTCTCGGTGTGACAACACAGTCTATTTACTTAACACACCCCAAATGTATGTCTACGA
ATGTCATTTAATGGGCCTTGTGCCTATAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTC
TCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAAAATTCAGTGAATCAT
CGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA

>P3215aITS1
CATTATTCCTATGGAGTTGTTGCTGGCCTCTAGGGGCATGTGCACGCTTCACTAGTCTTTCACCA
CCTGTGAACTTTTGATAGATCTGTGAAGTCGTCTTTCAAGTCGTCAGACTTGGTTTGCTGGGATTT
AAACGTCTCGGTGTGACAACACAGTCTATTTACTTAACACACCCCAAATGTATGTCTACAAATGTC
ATTTAATGGGCCTTGTGCCTATAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCA
TCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAAAATTCAGTGAATCATCAAATC
TTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA

>P3215bITS1
CTGGGATTTAAACGTCTCGGTGTGACAACACAGTCTATTTACTTAACACACCCCAAATGTATGTCT
ACGAATGTCATTTAATGGGCCTTGTGCCTATAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTG
GCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAA
TCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTC
A

>POstaITS1
CATAATTATTCCTATGGAGTTGTTGCTGGCCTCTAGGGGCATGTGCACGCTTCACTAGTCTTTCAA
CCACCTGTGAACTTTTGATAGATCTGTGAAGTCGTCTCTCAAGTCGTCAGACTTGGTTGCTGGGA
TTTAAACGTCTCGGTGTGACTACGCAGTCTATTTACTTACACACCCCAAATGTATGTCTACGAATG
TCATTTAATGGGCCTTGTGCCTTTAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCG
CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGA
ATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA

>PostbITS1
GAATATTGATTCCTATGGAGTTGTTGCTGGCCTCTAGGGGCATGTGCACGCTTCACTAGTCTTTC
AACCACCTGTGAACTTTTGATAGATCTGTGAAGTCGTCTCTCAAGTCGTCAGACTTGGTTGCTGG
GATTTAAACGTCTCGGTGTGACTACGCAGTCTATTTACTTACACACCCCAAATGTATGTCTACGAA
TGTTATTTAATGGGCCTTGTGCCTTTAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCT
CGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC
GAATCTTTGAACGCCCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA

78

Region ITS2 de las cepas P3215, P132 y Post del gnero Pleurotusp.

>P132_ITS2
TTAAATTCTCAAACTCACTTTGGTTTTTTTTCCAATTGTGATGTTTGGATTGTGGGGGGCTGCTGG
CCTTGACAGGTGGGCTCCTCCTAAAAGCTTTAGCGGGACTTCTCATTG

>P3215a_ITS2
TTAAATTCTCAAACTCACTTTGGTTTTTTTCCAATTGTGATGTTTGGATTGTTGGGGGCTGCTGGC
CTTGACAGGTCGGCTCCTCTTAAATGCATTAGCAGGACTTCTCATTGCCTCTGCGCATGATGTGA
TAATTATCACTCATCAATAGCACGCATGAATAGATGTCCAGCTCTCCAATCGTCCGCAAGTGACG
AATTTGACAATTGACCTCAAAT

>P3215b_ITS2
TTAAATTCTCAAACTCACTTTGGTTTTTTTCCAATTGTGATGTTTGGATTGTTGGGGGGCTGCTGG
CCTTGACAGGTCGGCTCCCTCTTAAATGCATTAGCAGGATTTCTCATTGCCTCTGCGCATGATGT
GATAATTATCACTCATCAATAGCACGCATGAATAAGAGTCCAGCTCTCCAATCGTCCGCAGGGAC
AATTTGACAATTTGACCTCAAATCGGGTAGGACTCCCCCGCTGAACTTAAGCTTTCAATAAGCGG
AAAAAAA

>Postb_IT2
TTAAATTCTCAACTCACTTTGGTTTCTTTCCATTGTGATGTTTGGATTGTTGGGGCTGCTGGCCTT
GACAGGCCGGCTCCTCTTTAATGGATTAGGAGGACTTTCCATTGCCCTCTGCGCTGATGGGAAAA
ATATCACTCCTCAATAGCCCCGCATGAATAGAGTCCC

>Posta_ITS2
TTAAATTCTCAAACTCACTTTGGTTTCTTTCCAAATTGTGATGTTTGGGATTGTGGGGGGCTGCTG
GCCTTGACAGGTCGGCTCCTCTTAAATGCTTTAGCAGGGACTTCTCATTTGCCTCT

lxxix

GLOSARIO
C.
Cariogamia: Paso final en el proceso de fusin de dos clulas eucariontes haploides, en el cual se
fusionan los dos ncleos celulares dando origen al zigoto.
Carpforo: Cuerpo fructfero.
Cepa: En microbiologa, una variante fenotpica de una especie o incluso de un taxn inferior,
propagada clonalmente, debido al inters en la conservacin de sus cualidades definitorias.
Champin: hongo de botn: Agaricus bisporus
D.
Dicaritica: La carga gentica es n+n.
Diploide: La carga gentica es 2n.
H.
Haploides: la carga gentica es n.
Hiang-gu: Shiitake: Lentinula sp.
Hongo: fungus: seta.
Hongo Orellana: hongo ostra: hongo oreja de palo: Setas ostra: Pleurotus ostreatus.
L.
Lquenes: Asociacin simbiticas conformando por hongo y bacteria. o las micorrizas (hongo con
plantas superiores)
M.
Meiosis: Divisin celular que permite la reproduccin sexual, comprendido por 2 divisiones
sucesivas; una primera divisin meitica, en la cual una clula diploide se obtienen dos clulas hijas
haploides (n); y una segunda divisin meitica (divisin mittica), divisin en que las clulas hijas
tienen el mismo nmero de cromosomas que la clula madre. As, dos clulas haploides de la primera
divisin meitica se obtiene cuatro clulas haploides.
Micorrizas: Asociacin simbiticas conformando por hongo y plantas superiores.
O.
Oreja de judas: Auricularia sp.
P.
Parsitos facultativos y obligados: Alimentarse lentamente de otros seres vivos.
Plasmogamia: Es la unin ntima entre los citoplasmas de los gametos o clulas que se funcionen
como tales en los procesos de reproduccin sexual.
Pleurocarpo: Etimologa; del latn cientfico pleurocarpus, acuado como nombre del taxn
Pleurocarpi por Bridel en (1822) , a partir del neolatn pleuro-, del griego antiguo -, de
(pleur), "costado", o (pleurn), "costilla"; y el neolatn -carpus, del griego antiguo -
(karpos), forma combinatoria de (karps), "fruto".
S.
Saprfitos: alimentarse de material vegetal en descomposicin.

80

SIGLAS Y ABREVIATURAS

#.
C: Grados centrigrados.
5.8S: Unidad 5.8S del ARN ribosomal.
A.
A.C.: Antes de Cristo.
ADN: cido dexoribonucleico.
ADNr: ADN ribosomal.
ASD: Agar Sabarouad Dextrosa.
ARN: cido ribonucleico.
ARNr: ARN ribosomal.
C.
cm: Centmetro.
CMS: Cultivo en Medios Solido.
F.
FES: Fermentacin de estado slido.
G.
g: gramo
H.
h: Horas
I.
IGS: Espaciadores Intergnicos.
ITS: Espaciadores transcritos Internos.
L.
LSU: Subunidad Larga.
M.
mg: miligramos.
ml: mili litros.
mm: milmetros.
min: Minutos
P.
PCR: Reaccin en cadena de la polimerasa.

81

PDA: Agar Papa Dextrosa.

R.
RAPDs: Amplificacin aleatoria de ADN polimrfico.
RFLP: Polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin.
RPB2: Sub unidad II de la ARN polimerasa Subunidad.
S.
SCARs: Caracterizacin de la secuencia de la regin amplificada.
sp.: Se emplea para designar una especie concreta cuyo epteto especfico es desconocido.
SSRs: microSatlites.
SSU: Subunidad pequea.
T.
TEF1: Factor 1 de elongacin de la transcripcin.
Ton: Tonelada.
.
m: micrmetro.

82