Resumen

La biorremediación es un enfoque importante para la reducción de desechos que se basa en

procesos biológicos para descomponer una variedad de contaminantes. Esto es posible gracias a

la vasta diversidad metabólica del mundo microbiano. Para explorar esta diversidad para la

descomposición del plástico, realizamos una investigación donde se realizaron análisis de varias

docenas de hongos endofíticos por su capacidad para degradar el polímero sintético poliéster

poliuretano (PUR). Varios organismos demostraron la capacidad de degradar eficientemente el

PUR en suspensiones sólidas y líquidas. Se observó una actividad particularmente robusta entre

varios aislamientos en el género Pestalotiopsis, aunque no fue una característica universal de este

género. Dos aislamientos de microspora de Pestalotiopsis fueron capaces de crecer únicamente

en PUR como la única fuente de carbono en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. La

caracterización molecular de esta actividad sugiere que una serina hidrolasa es responsable de la

degradación de PUR. el caso sin precedentes de crecimiento anaeróbico que utiliza PUR como

única fuente de carbono sugiere que los endófitos son una fuente promisoria de biodiversidad

desde la cual se seleccionan las propiedades metabólicas útiles para la biorremediación.

Biodegradación de productos que contienen tolueno con microrganismos de las familias

fusarium y pseudomona.
 ABSTRACT

Bioremediation is an important approach to waste reduction that relies on biological processes

to break down a variety of pollutants. This is possible thanks to the vast metabolic diversity of

the microbial world. To explore this diversity for the decomposition of plastic, we conducted an

investigation where several dozens of endophytic fungi were analyzed for their ability to degrade

the synthetic polyester polyurethane (PUR) polymer. Several organisms demonstrated the ability

to efficiently degrade PUR in solid and liquid suspensions. A particularly robust activity was

observed among several isolates in the Pestalotiopsis genus, although it was not a universal

characteristic of this genus. Two Microspora isolates of Pestalotiopsis were able to grow only in

PUR as the sole carbon source under aerobic and anaerobic conditions. The molecular

characterization of this activity suggests that a serine hydrolase is responsible for the degradation

of PUR. The unprecedented case of anaerobic growth using PUR as the sole carbon source

suggests that endophytes are a promising source of biodiversity from which the metabolic

properties useful for bioremediation are selected.

Biodegradation of products containing toluene with microorganisms of the fusarium and

pseudomonas families.

Contenido
Introducción 1

Poliéster poliuretano PUR.......................................................................................................3

Polietileno de alta densidad PEAD.........................................................................................3

Tereftalato de polietileno PET................................................................................................4

Polietileno de baja densidad PEBD........................................................................................4

Fusarium Solani:.....................................................................................................................4

Enzima Cutinasa:....................................................................................................................5

Desarrollo....................................................................................................................................5

Muestreo de plantas................................................................................................................6

Aislamiento de endófitos........................................................................................................6

Secuenciación y análisis filogenético.....................................................................................6

Pantalla inicial de eliminación de PUR...................................................................................7

Ensayo de fuente de carbono única.......................................................................................10

La degradación anaeróbica de PUR......................................................................................11

Análisis IR de la degradación de PUR..................................................................................11

Caracterización enzimática de la poliuretanasa putativa......................................................12

Caracterización enzimática de la poliuretanasa putativa......................................................13

Resultados:................................................................................................................................15

Ensayo de fuente de carbono única...................................................................................21

Análisis IR de la degradación de PUR..............................................................................26

Discusión...................................................................................................................................29

Conclusión................................................................................................................................30

Agradecimientos.......................................................................................................................31
 1

Introducción

Los enormes incrementos en la fabricación y en los plásticos en las últimas décadas han

llevado a numerosas preocupaciones ecológicas y económicas. La persistencia de los polímeros

sintéticos introducidos en el medio ambiente por la industria humana representa una gran

amenaza para los sistemas ecológicos naturales. El bajo costo y la facilidad de fabricación han

aumentado la demanda global de plástico en más de 150 veces, con una producción de 1.5

millones de toneladas en 1950 y 245 millones de toneladas a partir de 2006. Al no reconocerse

los problemas de contaminación persistentes que plantea el plástico, la producción mundial sigue

aumentando, con los mayores aumentos esperados en los países en desarrollo.

Una de las mayores problemáticas en México y el mundo es la acumulación excesiva de

plásticos (El plástico es cualquier polímero orgánico sintético o semisintético.) dentro de su

composición incluyen carbono e hidrógeno. Los plásticos pueden estar hechos de casi cualquier

polímero orgánico, pero la mayoría está hecha de petroquímicos. El polímero utilizado para

hacer un plástico casi siempre se mezcla con aditivos, incluidos colorantes, plastificantes,

estabilizadores, rellenos y refuerzos. Estos aditivos también afectan la composición química, las

propiedades y las mecánicas, así como su costo.

Un elemento que juega un papel importante en la estructura de los platicos es el Tolueno. Es

el encargado de retrasar el proceso de descomposición, se utiliza como como un producto

intermedio en la producción de poliuretanos y poliésteres.

En México se generan cerca de 722 mil toneladas anuales de plástico. En promedio, cada

mexicano ingiere 163 litros de refresco y de agua embotellada al año en envases del poliéster

llamado PET (tereftalato de polietileno), y aunque el país recicla el 50.4 %, los esfuerzos son

insuficientes.
 2

El gran volumen de plásticos producidos cada año presenta un problema para los sistemas de

eliminación de residuos. Al comprender los mecanismos de degradación del polímero, se puede

lograr una técnica más eficiente para la biodegradación de los residuos plásticos. La mayoría de

estos compuestos se degrada de forma muy lenta y suponen una amenaza importante para el

medio ambiente, especialmente en los océanos. En las regiones costeras se genera una cantidad

de basura plástica de casi 100 millones de toneladas, de los cuales 32 millones no son

gestionados apropiadamente y una media de ocho millones de toneladas termina flotando cada

año en los océanos de todo el mundo.

Se estima que el proceso de degradación de plásticos es de 500 a 1000 años, diversos estudios

han demostrado que a partir de un tipo de enzimas llamada Poliuretanasas putativas, aceleraría el

proceso a 15 días.

Según pudieron comprobar, el PET se degradaba a una velocidad de 0,13 miligramos por cada

centímetro cuadrado y día a una temperatura de 30 grados, algo muy común en muchos lugares

de la Tierra. Pero, ¿esa velocidad era elevada o despreciable si se piensa en términos de su

aplicación para descontaminar una zona natural? La Producción y consumo excesivo de

productos formulados con tolueno, su tardía degradación y la falta de alternativas a su proceso de

descomposición son unas de las mayores problemáticas a enfrentar.

Lo que buscamos es encontrar un equilibrio entre la excesiva producción-consumo de estos

productos a base de catalizadores enzimáticos (encontrar el microorganismo óptimo) para

acelerar la degradación de los productos que contengan tolueno. Y con ello mitigar su presencia

en los recolectores de desechos inorgánicos.

 3

Las bacterias Pseudomonas chlororaphis y Comamonas acidovorans, así como el hongo

Candida rugosas producen enzimas activas se han clasificado como esterasas, lipasas y proteasas

y ureasas, lo que sugiere una degradación del sustrato PUR por escisión del enlace éster.

Deseamos encontrar al microorganismo con la maquinaria enzimática más óptima para

degradar plásticos, y posteriormente usarlo como un método de biorremediación ambiental para

descontaminar ecosistemas colmados por envases mal gestionados y liberados en el mar o en

espacios naturales.

Poliéster poliuretano PUR

Es un plástico utilizado en la industria y la fabricación que ha demostrado ser susceptible de

biodegradación. El polímero se genera por la condensación de un poli isocianato y un poliol.

Esto da como resultado un polímero de carbono de una serie de enlaces de uretano. Las

variaciones en el espaciado entre los enlaces de uretano, así como la naturaleza de las

sustituciones, pueden cambiar las propiedades del polímero resultante de lineal y rígido a

ramificado y flexible. En una suspensión líquida aparece el PUR blanco lechoso y

completamente opaco. Al igual que otros poliuretanos, este producto se sintetiza comercialmente

para la fabricación de textiles y recubrimientos textiles.

Polietileno de alta densidad PEAD

Es un polímero termoplástico que se usa para la elaboración de envases plásticos rígidos de

leche, yogures, botellas de detergente, etc. Otros usos incluyen la fabricación de baldes, tubos,

cajas, tambores, bolsas de supermercado.

 4

Tereftalato de polietileno PET

Es una resina termoplástica que se utiliza para fabricar diversos productos como botellas de

agua y refrescos, jugos, etc. También se usa en la fabricación de textiles.

Polietileno de baja densidad PEBD

Pertenece al grupo de las poliolefinas y es utilizado en una amplia variedad de aplicaciones

que incluyen bolsas para envasar, bolsas de pan, bolsas de supermercado, productos de aseo

personal y película para forrar cuadernos entre otros.

Fusarium Solani:

Fusarium solani es un complejo de especies de al menos 26 hongos filamentosos

estrechamente relacionados en la división Ascomiceta, familia nectriaceae. es el anamorfo de

Nectria haematococca. es un hongo común del suelo y un colonizador de materiales vegetales.

Fusarium solani está implicado en la enfermedad vegetal, así como la enfermedad humana,

especialmente la infección de la córnea del ojo.

tiene 5-13 cromosomas, con un tamaño de genoma de unos 40 MB. el contenido de GC de su

ADN es del 50%. micelio de F. solani es rico en el aminoácido alanina, así como una gama de

ácidos grasos incluyendo δ-aminobutírico-, Palmitic-, oleico-, y ácidos linolénico. Fusarium

solani requiere potasio para el crecimiento, y desarrolla un patrón de plumas cuando los niveles

de potasio son inferiores a 3 mm. en la cultura se utilizan los siguientes disacáridos (de la

mayoría al menos preferencial): manosa, ramnosa y sorbosa. esta especie puede descomponer la

celulosa a un pH óptimo de 6,5 y temperatura de 30 ° c. también puede metabolizar los

esteroides y la lignina, y reducir fe3 + a fe2 +. Fusarium solani produce micotoxinas como el ácido

fusarico y contiene. otras toxinas también se han aislado de F. solani

 5

Enzima Cutinasa:

Las cutinasas son uno de los miembros más pequeños de las serín hidrolasas. Su estructura

está compuesta por una lámina-β central de cinco cadenas paralelas cubierta por cuatro hélices-α.

las cutinasas reciben el número de clasificación EC 3.1.1.74, el cual las permite identificar

como hidrolasas que actúan sobre enlaces ésteres de ácidos carboxílicos del polímero cutina.

Las cutinasas son enzimas muy versátiles que pueden catalizar, además de la ruptura del

enlace éster de la cutina, reacciones de hidrólisis y síntesis in vitro de una amplia variedad de

sustratos.

Las cutinasas son enzimas hidrolíticas cuya producción se descubrió en hongos Fito

patógenos que crecían en medios conteniendo cutina como única fuente de carbono

Desarrollo

Un equipo científico del Instituto de Tecnología de Kioto (Japón) descubrió recientemente

una bacteria desconocida hasta la fecha que es capaz de digerirlo y asimilarlo, es decir, que

puede vivir alimentándose de PET (Tereftalato de polietileno). La bacteria fue hallada en el

interior de una planta de reciclaje de botellas de plástico y es capaz de descomponer el tereftalato

de polietileno (PET) en sus componentes ácido tereftálico y etilenglicol.

Se realizó una investigación en un trabajo de la American Society For Microbiology donde se

encontró un trabajo donde se realizaron diferentes métodos para poder comprobar la eficacia de

los diferentes microorganismos en la biorremediación del PUR.

 6

Muestreo de plantas.

Se recolectaron plantas madereras de varias familias en el Bosque Nacional Yasuní en la selva

amazónica ecuatoriana. Algunas plantas fueron atacadas por sus supuestos usos etnobotánicos,

mientras que otras se tomaron muestras al azar. Se recogió una muestra de tallo de 10 cm y se

almacenó en una bolsa de polietileno hermética a 4 ° C. Las muestras de herbario fueron

preparadas y depositadas en el Herbario Peabody en la Universidad de Yale y en el Herbario

Nacional del Ecuador (QCNE).

Aislamiento de endófitos.

Los tallos de las plantas se esterilizaron en superficie mediante inmersión en etanol durante

10s seguidos de una breve llama. Se retiraron capas externas de tejido de los tallos y se

sembraron tres secciones de los tejidos internos de cada muestra en agar de dextrosa de patata

(PDA) (Difco), una dilución 1:10 de medio de dextrosa de patata en agar de agua (WA),

Dilución 1:10 de medio de glicerol arginina (GAM) en placas WA y WA.

Todas las placas se sellaron con Parafilm y se controlaron cada 2 a 3 días para determinar su

crecimiento. A medida que se detectaba el crecimiento de microbios, se aislaron organismos

fúngicos transfiriendo una punta hifal a placas de PDA nuevas. Las placas se envolvieron de

nuevo con Parafilm y se almacenaron en recipientes de plástico. Las reservas permanentes de

cada organismo se hicieron cultivando los organismos en semillas de cebada con autoclave triple

y almacenándolos a -80 ° C.

Secuenciación y análisis filogenético.

Los cultivos de endófitos se cultivaron en placas PDA durante 1 a 2 semanas a temperatura

ambiente. El ADN se extrajo de aproximadamente 100 mg de material fúngico utilizando el mini

kit de plantas Qiagen DNeasy. Se usaron aproximadamente 10 ng de ADN como plantilla para
 7

amplificar la región espaciadora transcrita interna (ITS) del ADN ribosomal (ADNr) mediante

PCR como se describió anteriormente.

Los cebadores utilizados para la secuenciación de ITS fueron ITS1 (5'-

TCCGTAGGTGAACCTGCGGG-3 ') y ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'),

correspondientes a los cebadores directo e inverso. Los fragmentos amplificados se verificaron

para determinar su longitud utilizando electroforesis en gel de agarosa y se purificaron utilizando

un kit de purificación por PCR QIAquick (Qiagen). La secuenciación se realizó en la instalación

de W. M. Keck de la Universidad de Yale en las máquinas del analizador de ADN Applied

Biosystems 3730cL.

Las secuencias hacia adelante y hacia atrás para cada organismo se alinearon utilizando los

programas Pregap4 y Gap4. Las secuencias endófitas se alinearon con los organismos presentes

en la base de datos GenBank el 1 de agosto de 2008 utilizando la herramienta de búsqueda básica

de alineación local (BLAST) del Centro Nacional de Información Biotecnológica

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/index .HTML).

Pantalla inicial de eliminación de PUR.

Los endófitos se analizaron primero por su capacidad para degradar PUR haciéndolos crecer

en presencia de Impranil DLF y una dispersión de PUR acuosa alifática aniónica con 4% de N-

metilpirrolidona (NMP) (Bayer MaterialScience).

Se cultivaron 59 endófitos fúngicos en medio PUR sólido (PUR-A) que contenía NaH2PO4

19 mM, K2HPO4 33,5 mM, 7,6 mM (NH4) 2SO4, citrato de Na 2,5 mM, MgSO4 250 mM,

tiamina 19 mM, ácido casamino al 0,05%. 147 μM FeCl3 · 6H2O, 14 μM ZnCl2 · 4H2O, 12 μM

CoCl2 · 6H2O, 12 μM Na2MoO4 · 2H2O, 10 μM CaCl2 · 2H2O, 11 μM CuCl2, 12 μM HnCl2,

 8

12 μM H3BO3 y 1,8 mM HCl. A 1 litro de esta mezcla se agregaron 10 ml de Impranil DLF y

15 g de agar.

El polímero se añadió después de auto clavar el medio para evitar la deformación.

El ensayo de selección de medio sólido siguió el método general de Crabbe et al... El medio

sólido PUR-A se añadió a tubos de cultivo estériles en alícuotas de 10 ml. Se añadió un tapón de

0,5 cm3 de hongos cultivados en PDA a cada tubo de ensayo utilizando una técnica aséptica y se

dejó crecer sin alterar a 23 ° C.

La bacteria Pseudomonas chlororaphis (ATCC 55729, de Gary Howard) y el hongo

Aspergillus niger (de Gary Strobel, Universidad del Estado de Montana) se utilizaron como

controles positivos para la degradación del poliuretano. La degradación de PUR se evidenció por

un cambio en el aspecto del medio de opaco a translúcido. Después de 2 semanas de incubación,

se midió la profundidad del aclaramiento de poliuretano desde la parte superior del medio hasta

el punto más bajo del aclaramiento visible.

El ensayo de medio líquido siguió el método descrito por Gautam et al. (8). El medio líquido

PUR-L se preparó utilizando la misma receta que para el medio PUR-A sólido sin agar. Se

añadió medio PUR-L a tubos de cultivo estériles en alícuotas de 10 ml y se inoculó con un tapón

de hongo de 0,5 cm3 cultivado en PDA. Al final de las 2 semanas, los cultivos líquidos se

homogeneizaron mediante agitación vigorosa.

Una porción de 1,5 ml de cada cultivo se transfirió a un tubo Eppendorf y se centrifugó

durante 1 min a 4.200 × g en una centrífuga Eppendorf Mini Spin para sedimentar

selectivamente la materia fúngica. La absorbancia del líquido sobrenadante se midió en un

 9

espectrofotómetro Varían Cary 50 Bio UV-visible a una longitud de onda de 600 nm, con agua

estéril como blanco.

Las diluciones del medio PUR-L con agua estéril se midieron para construir una curva

estándar para convertir la absorbancia en porcentaje de eliminación. Las muestras se midieron

cada día durante 2 semanas para determinar la absorbancia óptica para determinar la velocidad

relativa de eliminación.

Se cultivaron 59 endófitos fúngicos en medio PUR sólido (PUR-A) que contenía NaH2PO4

19 mM, K2HPO4 33,5 mM, 7,6 mM (NH4) 2SO4, citrato de Na 2,5 mM, MgSO4 250 mM,

tiamina 19 mM, ácido casamino al 0,05%. 147 μM FeCl3 · 6H2O, 14 μM ZnCl2 · 4H2O, 12 μM

CoCl2 · 6H2O, 12 μM Na2MoO4 · 2H2O, 10 μM CaCl2 · 2H2O, 11 μM CuCl2, 12 μM HnCl2,

12 μM H3BO3 y 1,8 mM HCl. A 1 litro de esta mezcla se agregaron 10 ml de Impranil DLF y

15 g de agar.

El ensayo de medio líquido siguió el método descrito por Gautam et al. (8). El medio líquido

PUR-L se preparó utilizando la misma receta que para el medio PUR-A sólido sin agar. Se

añadió medio PUR-L a tubos de cultivo estériles en alícuotas de 10 ml y se inoculó con un tapón

de hongo de 0,5 cm3 cultivado en PDA. Al final de las 2 semanas, los cultivos líquidos se

homogeneizaron mediante agitación vigorosa. Una porción de 1,5 ml de cada cultivo se transfirió

a un tubo Eppendorf y se centrifugó durante 1 min a 4.200 × g en una centrífuga Eppendorf Mini

Spin para sedimentar selectivamente la materia fúngica.

La absorbancia del líquido sobrenadante se midió en un espectrofotómetro Varian Cary 50

Bio UV-visible a una longitud de onda de 600 nm, con agua estéril como blanco. Las diluciones

del medio PUR-L con agua estéril se midieron para construir una curva estándar para convertir la
 10

absorbancia en porcentaje de eliminación. Las muestras se midieron cada día durante 2 semanas

para determinar la absorbancia óptica para determinar la velocidad relativa de eliminación.

Ensayo de fuente de carbono única.

Los organismos identificados con actividad degradante de PUR se probaron para determinar

su capacidad para utilizar PUR como única fuente de carbono. Para estos estudios, el sustrato fue

Impranil DLN, que contiene PUR suspendido solo en agua (no hay N-metil pirrolidona

presente). Esto aísla al Impranil como la única fuente de carbono para el metabolismo y el

crecimiento.

Los cinco organismos principales de las pantallas de actividad inicial se cultivaron en

Impranil DLN sin otras fuentes de carbono (PUR-Lmin). Las muestras de hongos se lavaron

antes de la inoculación para eliminar todo el medio residual. Estas dos consideraciones, el lavado

y el sustrato DLN, aseguran que el polímero sea la única fuente de carbono para el metabolismo

y el crecimiento de los hongos.

PUR-Lmin se preparó de manera similar a la del medio PUR-L, pero en ausencia de citrato de

sodio, tiamina, ácidos Casamino o agar. El organismo Aspergillus niger se probó como base de

comparación.

Los cultivos fúngicos se cultivaron durante 1 semana en caldo de patata con dextrosa (PDB). Los

cultivos de reserva se homogeneizaron mediante agitación vigorosa, y se centrifugó 1 ml de cada

cultivo a 12.100 xg durante 1 minuto.

El sobrenadante se eliminó y el sedimento fúngico se Re suspendió en 1 ml del medio líquido

PUR-Lmin. Las muestras se centrifugaron y se Re suspendieron una segunda vez para asegurar

la eliminación de todos los PDB residuales. La muestra de 1 ml de material fúngico lavado se

 11

añadió a tubos de cultivo estériles hasta un volumen final de 10 ml de PUR-Lmin. Los cultivos

se monitorizaron para el aclaramiento visual del medio opaco.

Las muestras se midieron cada 2 días durante 2 semanas para determinar la absorbancia óptica

a 600 nm y determinar una tasa de eliminación aproximada. Se midió un aumento en la masa

fúngica que se correlaciona con la degradación de PUR mediante la liofilización de la masa

micelial de cultivos por triplicado que contienen medio mínimo con y sin PUR.

La degradación anaeróbica de PUR.

Los tubos de cultivo que contenían alícuotas de 9 ml de medio PUR-Lmin y 1 ml de inóculos

fúngicos lavados se incubaron en condiciones anaeróbicas. El ambiente anaeróbico se generó

utilizando una cámara anaeróbica BD GasPak.

Los cultivos líquidos de cada aislado se inocularon por duplicado. Se colocó un conjunto

dentro de la cámara anaeróbica, y el conjunto de control se colocó fuera de la cámara en un

entorno aeróbico. Ambos juegos se incubaron a 25 ° C durante la duración del estudio. Después

de 1 y 2 semanas, se retiraron las muestras y se determinó el aclaramiento por absorción a 600

nm.

Análisis IR de la degradación de PUR.

Los espectros de infrarrojos (IR) de las suspensiones líquidas de PUR-Lmin se recogieron

cada 48 h utilizando un espectrómetro de infrarrojos Nicolet 6700. Se retiró una porción de 50 μl

de cada muestra para cada medición y se centrifugó durante 60 segundos a 4.200 × g para separar

el material fúngico de las muestras sin una sedimentación significativa del polímero.
 12

Los espectros de muestra líquida se recogieron utilizando agua desionizada como espectro de

fondo. Las mediciones se realizaron hasta que se observó una degradación completa de PUR en

el cultivo de 10 ml dentro de las 2 semanas.

Caracterización enzimática de la poliuretanasa putativa.

Se preparó una fracción enzimática extracelular mediante el cultivo de un litro de cultivo

líquido del organismo más activo, Pestalotiopsis microspora E2712A, en medios PUR-Lmin y

PDB. Después de 10 días de incubación a 30 ° C, el cultivo se filtró a través de un filtro de 0,22

µm en un recipiente estéril.

El extracto extracelular crudo se almacenó a 4ºC. Para probar la actividad de una enzima

extracelular, se agregaron 4 ml de extracto a 6 ml de medio PUR-Lmin. Las muestras se

incubaron durante 2 h en una incubadora rotativa a 30 ° C.

Se utilizaron tres inhibidores basados en mecanismos para caracterizar la actividad

Se añadió fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), un inhibidor de la serina hidrolasa, a una

parte alícuota de extracto de enzima y se agregó a medio PUR-Lmin hasta una concentración

final de 1 mM. Se añadió yodoacetato, un inhibidor de la cisteína hidrolasa, a una concentración

final de 10 µM. Se utilizó EDTA a una concentración de 5 mM como inhibidor de la

metalohidrolasa. El extracto tratado térmicamente a 98 ° C durante 20 minutos sirvió como

control negativo.

Los cultivos líquidos de cada aislado se inocularon por duplicado. Se colocó un conjunto

dentro de la cámara anaeróbica, y el conjunto de control se colocó fuera de la cámara en un

entorno aeróbico. Ambos juegos se incubaron a 25 ° C durante la duración del estudio. Después
 13

de 1 y 2 semanas, se retiraron las muestras y se determinó el aclaramiento por absorción a 600

nm.

Análisis IR de la degradación de PUR. Los espectros de infrarrojos (IR) de las suspensiones

líquidas de PUR-Lmin se recogieron cada 48 h utilizando un espectrómetro de infrarrojos

Nicolet 6700. Se retiró una porción de 50 μl de cada muestra para cada medición y se centrifugó

durante 60 segundos a 4.200 × g para separar el material fúngico de las muestras sin una

sedimentación significativa del polímero.

Los espectros de muestra líquida se recogieron utilizando agua desionizada como espectro de

fondo. Las mediciones se realizaron hasta que se observó una degradación completa de PUR en

el cultivo de 10 ml dentro de las 2 semanas.

Caracterización enzimática de la poliuretanasa putativa.

Se preparó una fracción enzimática extracelular mediante el cultivo de un litro de cultivo

líquido del organismo más activo, Pestalotiopsis microspora E2712A, en medios PUR-Lmin y

PDB. Después de 10 días de incubación a 30 ° C, el cultivo se filtró a través de un filtro de 0,22

µm en un recipiente estéril.

El extracto extracelular crudo se almacenó a 4ºC. Para probar la actividad de una enzima

extracelular, se agregaron 4 ml de extracto a 6 ml de medio PUR-Lmin. Las muestras se

incubaron durante 2 h en una incubadora rotativa a 30 ° C.

Se utilizaron tres inhibidores basados en mecanismos para caracterizar la actividad.

Se añadió fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), un inhibidor de la serina hidrolasa, a una

parte alícuota de extracto de enzima y se agregó a medio PUR-Lmin hasta una concentración

final de 1 mM. Se añadió yodoacetato, un inhibidor de la cisteína hidrolasa, a una concentración

 14

final de 10 µM. Se utilizó EDTA a una concentración de 5 mM como inhibidor de la

metalohidrolasa. El extracto tratado térmicamente a 98 ° C durante 20 minutos sirvió como

control negativo.

Las muestras se incubaron en una incubadora rotatoria a 30 ° C, y se observó la eliminación

macroscópica después de 2 h.

Sobre la base de observaciones iniciales de que una serina hidrolasa estaba implicada en la

degradación de PUR, se usaron sondas basadas en la actividad para probar una proteína serina

hidrolasa en filtrados crudos libres de células.

Las moléculas de la sonda contienen un resto fluorofosfonato que reacciona específicamente

con las serinas del sitio activo de las enzimas de la familia de la serina hidrolasa y una etiqueta

de tetrametilrodamina (TMR). Las reacciones del extracto de proteína en bruto con la sonda se

llevaron a cabo como se describió anteriormente.

El gel resultante de SDS-poliacrilamida se visualizó utilizando un escáner de lecho

fluorescente Fujifilm FLA-5100 con excitación a 532 nm y un filtro de emisión de 570 nm. El

mismo gel se tiñó con plata para visualizar todas las proteínas en las muestras.

Proteína bruta del filtrado libre de células de Pestalotiopsis microspora E2712A cultivada en

cultivos de 1 litro de medio mínimo PUR-Lmin y medio rico en PDB se concentraron y

purificaron hasta una pureza de aproximadamente el 90% mediante cromatografía de filtración

en gel (datos no mostrados) utilizando una columna Superdex 200 (GE Healthcare) en un tampón

compuesto por MES 10 mM (ácido morfolineetanosulfónico) (pH 5,5) y NaCl 50 mM.

 15

Resultados:

Dentro de la investigación de la American Society For Microbiology realizaron las diferentes

metodologías ya antes mencionadas teniendo los siguientes resultados:

Pantalla de aprobación inicial de PUR. El imanil DLN, un poliéster poliuretano (PUR), es una

suspensión lechosa opaca que se vuelve transparente con la degradación. Los organismos

capaces de degradar este polímero muestran una zona de separación alrededor del cultivo en

crecimiento. Una colección de 59 organismos endófitos fúngicos aislados de muestras de plantas

en la Amazonía ecuatoriana se examinó por su capacidad para crecer y degradar el poliéster

poliuretano utilizando el ensayo de halo PUR como la pantalla inicial. De los organismos

analizados, 18 organismos produjeron un halo de aclaramiento como el que se muestra en la Fig.

1. Otros dos organismos, identificados mediante la secuenciación ITS como Guignardia

mangiferae (E2702C) y Zopfiella karachiensis (E2719A), podrían crecer pero no degradar el

PUR. Un medio de. Estos fueron utilizados como controles negativos en los estudios posteriores.

Las plantas huésped, los medios de aislamiento y las identidades de los 18 hongos activos y dos

hongos de control inactivos se enumeran en la Tabla 1.

 16

Figura

1.

Ejemplo de placas PUR-A utilizadas inicialmente para detectar la actividad degradante del poliuretano después de 2

semanas de crecimiento de hongos. (A) Control negativo. (B) Pleosporales sp. cepa E2705 Recuperado de:

https://aem.asm.org/content/77/17/6076

TABLA 1

P ROTEÍNABRUTA DEL FILTRADO LIBRE DE CÉLULAS DE P ESTALOTIOPSIS MICROSPORA E2712A

CULTIVADA EN CULTIVOS DE 1 LITRO DE MEDIO MÍNIMO PUR-L MIN Y MEDIO RICO EN PDB SE
CONCENTRARON Y PURIFICARON HASTA UNA PUREZA DE APROXIMADAMENTE EL 90% MEDIANTE
CROMATOGRAFÍA

E NDÓFITO ORGANISMO DE
a Medio
MAYOR HOMOLOGÍA
AISLAMIENTO DE de
(% MÁXIMO DE
LA PLANTA aislamiento
IDENTIDAD ) c
HOSPEDADORA b
E2524A Alternaria sp. Annonaceae,
PDA
(100) Annona muricata
E2914A Alternaria dauci Malvaceae, Malva 1:10
(100) alcea PDA
E2910B Gesneriaceae,
1:10
Bionectria sp. (99) Drymonia
PDA
semicordata
E2705G Plectosphaerella Piperaceae, Piper 1:10
sp. (94) arboretum PDA
E3432O Edenia Fabaceae, 1:10
gomezpompae (99) Erythrina smithiana GAM
E2702C Guignardia Melastomataceae, 1:10
 17

mangiferae (99) Axinaea sodiroi PDA

E2611A Moraceae,
Lasiodiplodia sp.
Naucleopsis WA
(100)
oblongifolia
E2711A Pestalotiopsis Monimiaceae, 1:10
microspora (100) Siparuna aspera PDA
E2712A Pestalotiopsis Myrtaceae, 1:10
microspora (100) Psidium guajava PDA
E2708A Mimosaeae,
Pestalotiopsis 1:10
Calliandra
microspora (100) PDA
angustifolia
E2911H Pestalotiopsis Commelinaceae,
PDA
microspora (100) Dicrorisandra ulei
E3317B Pestalotiopsis Annonaceae,
WA
microspora (100) Annona muricata
E3412F Fabaceae,
Pestalotiopsis 1:10
Lonchocarpus
microspora (99) PDA
glabrescens
E3314A Pestalotiopsis sp. Sterculiaceae, 1:10
(100) Guazuma ulmifolia PDA
E2520A Pestalotiopsis Myrtaceae,
PDA
microspora (99) Psidium acutangulum
E3432K Phaeosphaeria sp. Fabaceae,
PDA
(95) Erythrina smithiana
E2104E Onagraceae, 1:10
Nectria sp. (97)
Fuschia hybrida PDA
E2705B Pleosporales sp. Piperaceae, Piper 1:10
(99) arboretum GAM
E2812A Pleosporales sp. Sterculiaceae,
WA
(99) Theobroma kakau
E2719A Zopfiella Myrtaceae,
WA
karachiensis (99) Psidium guajava
a cada aislado de hongos se le dio un número de identificación único.

b La identidad de la secuencia de ADN para cada endófito se determinó mediante la secuenciación del ADNr de

ITS-5.8s y la comparación con las secuencias en la base de datos GenBank.

c PDA, agar de dextrosa de patata; 1:10 PDA, 1:10 dilución de medio de dextrosa de patata en agua agar; 1:10

GAM, 1:10 dilución de medio de glicerol arginina en agua agar; WA, Agar agua.

Recuperado de: https://aem.asm.org/content/77/17/6076

Varios organismos del género Pestalotiopsis fueron representados entre los organismos

activos en la primera pantalla de eliminación de PUR-A. Sobre la base de la actividad inicial

 18

observada en este género, todos los aislados de Pestalotiopsis en la colección se examinaron para

determinar su actividad. Algunos organismos dentro del género exhibieron alta actividad

(E2712A, E3317B y E2711A), algunos exhibieron actividad moderada (E3314A y E2708A), y

otros no mostraron actividad detectable (E4112A). Esta expresión variable se observó en

condiciones de crecimiento idénticas para cada organismo. Si bien es notable que algunas cepas

de Pporalotiopsis microspora demostraron algunos de los niveles más altos de actividad, el nivel

fue bastante variable entre los distintos aislamientos.

Los organismos activos del ensayo de depuración de placa se analizaron en dos ensayos

adicionales de depuración PUR, uno utilizando un medio sólido y el segundo utilizando un

medio líquido. En el ensayo de depuración de PUR-A sólido, se usaron tapones de hongos para

inocular tubos de ensayo de medio PUR-A y la depuración vertical se midió después de 2

semanas de crecimiento (Fig. 2). Los 18 hongos activos eliminaron visiblemente el medio PUR-

A. Dieciséis de estos hongos demostraron una actividad que era al menos el doble que la del

organismo Pseudomonas chlororaphis, un control positivo para la degradación de PUR. El

organismo de limpieza superior en este ensayo de medio sólido se identificó mediante la

secuenciación ITS como un Lasiodiplodia sp. (cepa E2611A). Cuatro de los seis organismos más

activos pertenecían al género Pestalotiopsis, con una alta relación a nivel de especie con la

microspora Pestalotiopsis. Estos seis organismos principales eliminaron el PUR más eficazmente

que el hongo de control positivo Aspergillus niger. Los dos organismos de control negativo,

Guignardia mangiferae (E2702C) y Zopfiella karachiensis (E2719A), no demostraron un

aclaramiento visible del sustrato de Impranil.

 19

Figura2.

(A) Ejemplos de cultivos de agar sólido PUR-A 2 semanas después de la inoculación, incluido Pseudomonas

chlororaphis como control positivo. (B) Los cultivos de hongos se cultivaron por triplicado en medio PUR-A sólido

durante 2 semanas. Las mediciones de la profundidad de la depuración se realizaron después de 2 semanas de

crecimiento. Los organismos de prueba de control positivo, Pseudomonas chlororaphis y Aspergillus niger, están

representados a la izquierda. Los cinco organismos resaltados (Lasiodiplodia sp. Cepa E2611A, Pestalotiopsis

microspora E2712A, Pestalotiopsis microspora E3317B, Pleosporales sp. Cepa E2812A y Bionectria sp. Cepa

E2910B) se seleccionaron para una selección adicional. Las barras de error representan la desviación estándar para

cada conjunto de datos. Recuperado de: https://aem.asm.org/content/77/17/6076

La tasa relativa de eliminación de PUR también se midió en un ensayo de cultivo líquido. La

absorbancia óptica a 600 nm, debido a la dispersión del polímero suspendido, se midió como una

indicación del grado de eliminación por el hongo. Los cultivos líquidos se limpiaron hasta el

punto de transparencia visual en la superficie del cultivo líquido, que se extendió a lo largo de la

longitud del tubo a medida que avanzaba el tiempo (Fig. 3A). El orden relativo del ensayo de

depuración líquida fue diferente del observado para el ensayo de depuración de sólidos (Fig.

2A). A Lasiodiplodia sp. (la cepa E2611A) fue el organismo más activo en la pantalla de

eliminación de medio líquido, junto con un Pleosporales sp. (cepa E2812A) y una Bionectria sp.

(cepa E2910B), seguida de Pestalotiopsis microspora (E2712A) y Pestalotiopsis microspora

 20

(E3317B). Todos estos organismos se eliminaron tan bien o mejor que el Aspergillus niger, un

control positivo de hongos, después de 2 semanas de crecimiento. Casi todos los organismos

activos probados mostraron más actividad que el control bacteriano positivo Pseudomonas

chlororaphis. Los dos organismos de control negativo no produjeron un aclaramiento detectable

del medio líquido PUR-L.

Fig.3.

(A) Ejemplos de cultivos líquidos de PUR-L a las 2 semanas de la inoculación. (B) Los cultivos de hongos se

cultivaron por triplicado en medio líquido PUR-L que contenía Impranil DLF durante 2 semanas. El porcentaje de

aclaramiento se determinó por una disminución en la dispersión de la luz a 600 nm, medida por espectrofotometría

UV-visible. Las medidas de porcentaje de aclaramiento se tomaron después de 2 semanas de crecimiento. Todos los

datos se normalizaron al control negativo. Los organismos de prueba de control positivo, Pseudomonas chlororaphis

y Aspergillus niger, están representados a la izquierda. Los 5 organismos resaltados (Lasiodiplodia sp. Cepa

E2611A, Pestalotiopsis microspora E2712A, Pestalotiopsis microspora E3317B, Pleosporales sp. Cepa E2812A y

Bionectria sp. Cepa E2910B) se seleccionaron para una selección adicional. Las barras de error representan la

desviación estándar para cada conjunto de datos. Recuperado de: https://aem.asm.org/content/77/17/6076

Ensayo de fuente de carbono única. Se evaluó la capacidad de los cinco organismos más

activos para degradar PUR en cultivo líquido utilizando PUR como única fuente de carbono
 21

(PUR-Lmin). Para estos estudios, utilizamos Impranil DLN, que es equivalente al Impranil DLF

(una dispersión de PUR alifática aniónica en agua) utilizada para los estudios anteriores, pero no

contiene N-metilpirrolidona. Si un organismo crece en Impranil DLN, puede usar PUR como la

única fuente de carbono para el metabolismo y el crecimiento. Todos los inóculos de hongos se

lavaron con medio mínimo para eliminar el carbono residual y las enzimas del cultivo de reserva.

Los cinco organismos principales de los dos ensayos de cribado se analizaron para esta actividad,

y los cinco fueron capaces de realizar una actividad de degradación de PUR en esta condición de

medio mínimo. Cada hongo mostró un crecimiento micelial significativo según lo monitoreado

por inspección visual. Para Pestalotiopsis microspora E2712A, los cultivos cultivados con PUR

mostraron un crecimiento aumentado de 0,110 g ± 0,031 g de material fúngico sobre el de un

cultivo de control cultivado en condiciones idénticas sin adición de PUR. Además, el hongo de

control positivo Aspergillus niger pudo degradar lentamente el PUR como única fuente de

carbono, como se informó anteriormente. Con el fin de comparar las tasas a las que se degradó el

PUR en esta condición, los cinco organismos principales en los análisis de detección de sólidos y

líquidos se cultivaron por duplicado y se rastrearon durante 16 días (Fig. 4A). Dos organismos,

Pestalotiopsis microspora E2712A y E3317B, demostraron la tasa más alta de eliminación de

PUR. El tiempo medio aproximado para la eliminación de estos dos organismos fue de 5 días.

Los cultivos fueron transparentes visualmente al final del período de 16 días, consistente con la

degradación completa del Impranil DLN (Fig. 4B). El único material no translúcido que quedó

en el matraz consistió en el crecimiento de hongos. En comparación con otros estándares, el

medio tiempo para la eliminación por parte del organismo de control Aspergillus niger fue de 15

días, y la bacteria Pseudomonas chlororaphis no alcanzó un estado de media limpieza dentro del

plazo de 16 días. Los experimentos realizados con Impranil DLF como sustrato mostraron que la
 22

presencia de N-metil pirrolidona no afectó la tasa de crecimiento de los organismos analizados.

Esto estableció que el PUR solo es suficiente para el crecimiento de hongos para estos

organismos. Como resultado, se utilizó Impranil DLN para estudios posteriores para caracterizar

el crecimiento anaeróbico y la naturaleza de la reacción de degradación.

ig.4.

(A) La degradación de PUR como única fuente de carbono por parte de los cinco organismos más activos se

monitorizó durante un período de 16 días. Los cultivos que contenían medio PUR-Lmin con Impranil DLN como
 23

única fuente de carbono se inocularon con inóculos de hongos lavados. El ensayo se realizó por duplicado y los

valores mostrados representan los promedios de los dos cultivos en cada punto de tiempo. Aspergillus niger (verde)

y Pseudomonas chlororaphis (rojo) sirvieron como controles positivos. (B) Pestalotiopsis microspora E2712A

(izquierda) que degrada el PUR Impranil DLN como única fuente de carbono después de un período de 16 días. El

material restante en el matraz es el resultado del crecimiento de hongos. Recuperado de:

https://aem.asm.org/content/77/17/6076

Degradación anaerobia de PUR. Se observó que algunos de los organismos analizados durante

los ensayos de cultivo líquido, incluidos Pestalotiopsis microspora E2712A y Pestalotiopsis

microspora E3317B, crecían desde la parte inferior del tubo de cultivo en lugar de hacerlo desde

la parte superior. Esto sugirió que estos hongos son capaces de degradar anaeróbicamente el

poliuretano. Para probar esta posibilidad, se repitió el ensayo utilizando medio PUR-Lmin con

sustrato Impranil DLN en condiciones anaeróbicas. Los cinco organismos principales del ensayo

anterior se inocularon por triplicado y se cultivaron durante 1 y 2 semanas en una cámara

anaeróbica BD GasPak. Se cultivó un conjunto correspondiente de cultivos fuera de la cámara y

se compararon las extensiones de eliminación en las dos condiciones (Fig. 5). El aislado fúngico

de Pestalotiopsis microspora E2712A utilizado en este ensayo mostró tasas equivalentes de

degradación tanto en condiciones anaeróbicas como aeróbicas (Fig. 5B). Lasiodiplodia sp. cepa

E2611A y Pleosporales sp. la cepa E2812A mostró tasas disminuidas de eliminación, mientras

que Bionectria sp. la cepa E2910B y el control Aspergillus niger mostraron una degradación de

sustrato insignificante en condiciones anaeróbicas. Todos los organismos mostraron un

crecimiento micelial en condiciones anaeróbicas como lo demuestra la inspección visual.

 24

fig 5

(A) Mediciones de degradación PUR de cultivos de hongos cultivados en condiciones aeróbicas y anaeróbicas.

Se cultivaron conjuntos por triplicado de cultivos de hongos en medio PUR-Lmin que contenía Impranil DLN como

el único medio de carbono en condiciones aeróbicas o anaeróbicas. Al final de las 2 semanas de crecimiento, se

retiraron las muestras de la cámara sellada y se midió el porcentaje de aclaramiento de PUR en solución para cada

conjunto de cultivos mediante una disminución de la dispersión de la luz a una longitud de onda de 600 nm

utilizando espectrofotometría UV visible. Los controles Pseudomonas chlororaphis y Aspergillus niger se muestran

a la izquierda. Dos cepas de Pestalotiopsis microspora (E2712A y E3317B) mantuvieron la actividad de la

poliuretanasa cuando crecieron en condiciones anaeróbicas, mientras que Pseudomonas chlororaphis, Aspergillus

niger, Lasiodiplodia sp. cepa E2611A, Pleosporales sp. cepa E2812A, y Bionectria sp. la cepa E2910B mostró

reducciones significativas en la magnitud de la actividad de degradación de PUR. Las barras de error representan la

desviación estándar para cada conjunto de datos. (B) Las tasas de degradación se compararon mediante la medición

por triplicado de cultivos de Aspergillus niger y Pestalotiopsis microspora E2712A después de 1 semana y 2

semanas de crecimiento. Pestalotiopsis microspora E2712A muestra tasas equivalentes de actividad de degradación

en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Las barras de error representan la desviación estándar para cada conjunto de

datos. Recuperado de: https://aem.asm.org/content/77/17/6076

 25

Análisis IR de la degradación de PUR. El mecanismo de la degradación de PUR se

investigó inicialmente mediante espectroscopia de infrarrojos . Las muestras PUR de Impranil

DLN muestran un gran pico de absorción a 1.735 cm − 1 correspondiente al enlace C (O) -O

éster en el polímero de poliuretano (Fig. 6A). Se añadió material fúngico al sustrato PUR y se

recogieron los espectros a lo largo del curso del experimento de degradación. Se observó una

reducción progresiva en la intensidad relativa del pico a 1,735 cm − 1 y se acompañó de cambios

más sutiles en otras ondas. En el momento en que el cultivo se había vuelto visualmente

transparente, había una pérdida completa del pico de absorbancia en 1,735 cm-1 (Fig. 6B). La

pérdida de este pico es consistente con la hidrólisis del enlace éster en el enlace uretano.

Fig. 6.

(A) Estructura química general de la molécula de poliuretano. R1 y R2 conectan monómeros de uretano

subsiguientes dentro de la molécula polimérica. (B) Espectros infrarrojos del medio líquido PUR que contiene

Impranil DLN tomado después de 6 días de incubación con el hongo Pestalotiopsis microspora. El espectro de

muestra (arriba) y el espectro de control (abajo) se muestran junto con una escala común. El pico fuerte denotado

por un asterisco a 1,735 cm-1 en el control corresponde al estiramiento éster C = O en el carbamato de etilo del

motivo uretano. Este pico desaparece después de la degradación del enlace éster por la enzima poliuretanasa.

Recuperado de: https://aem.asm.org/content/77/17/6076

 26

Caracterización enzimática de la poliuretanasa putativa. Las zonas de limpieza tanto en el

medio sólido como en el líquido ocurrieron a una distancia significativa del sitio de crecimiento

fúngico, lo que sugiere una actividad enzimática que se excreta extracelularmente. Para probar

explícitamente esta posibilidad, se probó el aclaramiento del sustrato Impranil DLN utilizando

un filtrado sin células de Pestalotiopsis microspora E2712A. El filtrado se preparó a partir de un

cultivo fúngico desarrollado en medio PUR-Lmin durante 10 días. El filtrado crudo del cultivo

PUR pudo eliminar completamente el Impranil DLN en 1 hora o menos (datos no mostrados). La

proteína activa parece ser inducida bajo condiciones de crecimiento PUR-Lmin, ya que el

filtrado libre de células preparado a partir de cultivos líquidos equivalentes de PDB no exhibió

ninguna actividad de eliminación (datos no mostrados). Esto sugiere que la actividad se excreta,

es difusible e inducida por la exposición celular al sustrato de poliuretano.

El filtrado se probó a continuación para determinar la inhibición de la actividad enzimática

responsable de la actividad de degradación utilizando tratamientos de calor y de moléculas

pequeñas. El calentamiento de los filtrados a 60 ° C y 80 ° C durante 15 minutos no tuvo ningún

efecto detectable sobre la actividad de degradación del sustrato. Se requirió tratamiento a 98 ° C

durante 20 minutos para inactivar la enzima. La demostración de la actividad de biodegradación

de PUR sensible al calor a partir de un extracto extracelular filtrado de 0.22 μm indica que una

proteína extracelular soluble y secretada es responsable de la actividad enzimática.

La enzima responsable de la biodegradación PUR se caracterizó aún más mediante el uso de

inhibidores basados en mecanismos. El fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) inactiva

específicamente la serina del sitio activo en hidrolasas de serina por modificación covalente. El

yodoacetato inactiva la cisteína del sitio activo en hidrolasas de cisteína por un mecanismo

similar. El EDTA secuestra metales e inhibe específicamente la actividad de las

 27

metalohidrolasas. Se usaron PMSF, yodoacetato y EDTA a concentraciones inhibitorias en el

filtrado sin células de Pestalotiopsis microspora E2712A para monitorear los cambios en la

actividad resultante del aclaramiento PUR. El extracto tratado térmicamente se utilizó como

control negativo. La adición de PMSF, un inhibidor de la serina hidrolasa, dio como resultado la

inactivación de la actividad de biodegradación. La adición de iodoacetato y EDTA no tuvo

efecto en la velocidad o el alcance de la actividad (datos no mostrados).

La reacción del filtrado crudo libre de células de Pestalotiopsis microspora E2712A con sondas

inhibidoras de serina hidrolasa marcó de manera eficiente una proteína en la fracción cultivada

en medio PUR-Lmin. El marcado de proteínas específicas estuvo ausente en el filtrado libre de

células del cultivo líquido de PDB, la condición en la que no se observó actividad de

degradación de PUR (Fig. 7B). Estos resultados sugieren que una enzima similar a la serina

hidrolasa de aproximadamente 21 kDa es responsable de la degradación de PUR. Además, el

crecimiento en PUR-Lmin indujo la secreción de esta enzima (Fig. 7A). La proteína de 21 kDa

se purificó a partir del filtrado bruto hasta una pureza de aproximadamente el 90%, y mantuvo la

capacidad de degradar el PUR (datos no mostrados).

 28

Fig.7.

Detección de hidrolasas de serina en proteína cruda a partir de filtrado sin células. Se muestra el análisis de SDS-

PAGE de proteínas de un filtrado bruto sin células de Pestalotiopsis microspora E2712A cultivado en medio PUR-

Lmin y medio rico en PDB. Los filtrados libres de células se incubaron con sondas basadas en la actividad de la

serina hidrolasa antes de la carga. (A) Las bandas de proteína se visualizaron mediante tinción con plata. (B) Las

bandas de proteínas marcadas se visualizaron utilizando un escáner de fluorescencia. Este análisis muestra que una

proteína de aproximadamente 21 kDa expresada exclusivamente bajo la condición de crecimiento inducida por

PUR-Lmin se marca de manera eficiente mediante la sonda basada en la actividad de la serina hidrolasa.

Recuperado de: https://aem.asm.org/content/77/17/6076

Discusión

De los nueve aislamientos probados, tres fueron altamente activos (E2712A, E3317B y

E2711A), cinco fueron moderadamente activos (E3314A, E2520A, E2911H, E3412F y

E2708A), y uno fue inactivo (E4112A). Esta variabilidad en la actividad entre distintos

aislamientos de microspora de Pestalotiopsis sugiere que existen diferencias genéticas entre los

organismos.
 29

La enzima producida por Pestalotiopsis microspora que es responsable de la degradación de

PUR parece ser un miembro de la familia de la serina hidrolasa.

Conclusión

Al término de la recopilación concluimos que el microorganismo que cumple con las

características que buscamos fue Pestalotiopsis microspora, ya que ésta, tuvo una gran eficiencia

para degradación del PUR (15 días); se desarrolla en condiciones convencionales e inusuales

(aerobias y anaerobias), Además de utilizar el PUR como única fuente de carbono, es decir, para

desarrollar su actividad vital, o lo que es lo mismo para alimentarse y crecer.

Referencias

ECOCE, A. C. (2019), Polietileno de alta densidad [página web] http://ecoce.mx/materiales-

pead.php

Filip Z.. 1979. Polyurethane as the sole nutrient source for Aspergillus niger and

Cladosporium herbarum. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 7:277–280 CrossRef

Juan Jose Montiel e Irene Palma (2018), Parabenos: ¿qué son? ¿cómo evitarlos?, Conasi

06/07/2018. https://www.conasi.eu/blog/consejos-de-salud/cosmetica-ecologica/parabenos-que-

son-como-evitarlos/

Marta Villén (2012), Disruptores hormonales[en linea ] CONASI recuperado 18/06/2012

https://www.conasi.eu/blog/consejos-de-salud/disruptores-hormonales-2/

MIGUEL G. CORRAL(2016), La bacteria que come plástico, [en linea],

Madrid;recuperado10/03/2016 20:05, de:

https://www.elmundo.es/ciencia/2016/03/10/56e1c141e2704e7a6a8b4629.html
 30

PlasticsEurope. 1 2008. The compelling facts about plastics, an analysis of plastics

production, demand and recovery for 2006 in Europe. PlasticsEurope, Brussels,

Belgium. http://www.plasticsrecyclers.eu/docs/press

%20release/080123CfaPpdfVersion.pdf.

Sociedad Americana de Microbiología,( 2011), Biodegradation of Polyester Polyurethane by

Endophytic Fungi [en linea](15 July 2011) https://aem.asm.org/content/77/17/6076

Agradecimientos.

Gracias a mi querido CECyT 6, gracias por haberme permitido fórmame y en ella, gracias a

todas las personas que fueron participes de este proceso, ya sea de manera directa o indirecta,

gracias a todos ustedes, fueron ustedes los responsables de realizar su pequeño aporte, que el día

de hoy se vería reflejado en la culminación de mi paso por la preparatoria. Gracias a mis padres,

que fueron mis mayores promotores durante este proceso, mi principal apoyo y motivador para

cada día continuar sin tirar la toalla.

Este es un momento muy especial que espero, perduré en el tiempo, no solo en la mente de las

personas a quienes agradecí, sino también a quienes invirtieron su tiempo para echarle una

mirada a mi proyecto de tesina; a ellos asimismo les agradezco con todo mi ser.