procesos biológicos para descomponer una variedad de contaminantes. Esto es posible gracias a
la vasta diversidad metabólica del mundo microbiano. Para explorar esta diversidad para la
descomposición del plástico, realizamos una investigación donde se realizaron análisis de varias
docenas de hongos endofíticos por su capacidad para degradar el polímero sintético poliéster
PUR en suspensiones sólidas y líquidas. Se observó una actividad particularmente robusta entre
varios aislamientos en el género Pestalotiopsis, aunque no fue una característica universal de este
caracterización molecular de esta actividad sugiere que una serina hidrolasa es responsable de la
degradación de PUR. el caso sin precedentes de crecimiento anaeróbico que utiliza PUR como
única fuente de carbono sugiere que los endófitos son una fuente promisoria de biodiversidad
fusarium y pseudomona.
ABSTRACT
to break down a variety of pollutants. This is possible thanks to the vast metabolic diversity of
the microbial world. To explore this diversity for the decomposition of plastic, we conducted an
investigation where several dozens of endophytic fungi were analyzed for their ability to degrade
the synthetic polyester polyurethane (PUR) polymer. Several organisms demonstrated the ability
to efficiently degrade PUR in solid and liquid suspensions. A particularly robust activity was
observed among several isolates in the Pestalotiopsis genus, although it was not a universal
characteristic of this genus. Two Microspora isolates of Pestalotiopsis were able to grow only in
PUR as the sole carbon source under aerobic and anaerobic conditions. The molecular
characterization of this activity suggests that a serine hydrolase is responsible for the degradation
of PUR. The unprecedented case of anaerobic growth using PUR as the sole carbon source
suggests that endophytes are a promising source of biodiversity from which the metabolic
pseudomonas families.
Contenido
Introducción 1
Fusarium Solani:.....................................................................................................................4
Enzima Cutinasa:....................................................................................................................5
Desarrollo....................................................................................................................................5
Muestreo de plantas................................................................................................................6
Aislamiento de endófitos........................................................................................................6
Resultados:................................................................................................................................15
Conclusión................................................................................................................................30
Agradecimientos.......................................................................................................................31
1
Introducción
Los enormes incrementos en la fabricación y en los plásticos en las últimas décadas han
sintéticos introducidos en el medio ambiente por la industria humana representa una gran
amenaza para los sistemas ecológicos naturales. El bajo costo y la facilidad de fabricación han
aumentado la demanda global de plástico en más de 150 veces, con una producción de 1.5
los problemas de contaminación persistentes que plantea el plástico, la producción mundial sigue
composición incluyen carbono e hidrógeno. Los plásticos pueden estar hechos de casi cualquier
polímero orgánico, pero la mayoría está hecha de petroquímicos. El polímero utilizado para
hacer un plástico casi siempre se mezcla con aditivos, incluidos colorantes, plastificantes,
estabilizadores, rellenos y refuerzos. Estos aditivos también afectan la composición química, las
En México se generan cerca de 722 mil toneladas anuales de plástico. En promedio, cada
mexicano ingiere 163 litros de refresco y de agua embotellada al año en envases del poliéster
llamado PET (tereftalato de polietileno), y aunque el país recicla el 50.4 %, los esfuerzos son
insuficientes.
2
El gran volumen de plásticos producidos cada año presenta un problema para los sistemas de
lograr una técnica más eficiente para la biodegradación de los residuos plásticos. La mayoría de
estos compuestos se degrada de forma muy lenta y suponen una amenaza importante para el
medio ambiente, especialmente en los océanos. En las regiones costeras se genera una cantidad
de basura plástica de casi 100 millones de toneladas, de los cuales 32 millones no son
gestionados apropiadamente y una media de ocho millones de toneladas termina flotando cada
Se estima que el proceso de degradación de plásticos es de 500 a 1000 años, diversos estudios
han demostrado que a partir de un tipo de enzimas llamada Poliuretanasas putativas, aceleraría el
proceso a 15 días.
Según pudieron comprobar, el PET se degradaba a una velocidad de 0,13 miligramos por cada
centímetro cuadrado y día a una temperatura de 30 grados, algo muy común en muchos lugares
acelerar la degradación de los productos que contengan tolueno. Y con ello mitigar su presencia
Candida rugosas producen enzimas activas se han clasificado como esterasas, lipasas y proteasas
y ureasas, lo que sugiere una degradación del sustrato PUR por escisión del enlace éster.
espacios naturales.
Esto da como resultado un polímero de carbono de una serie de enlaces de uretano. Las
variaciones en el espaciado entre los enlaces de uretano, así como la naturaleza de las
sustituciones, pueden cambiar las propiedades del polímero resultante de lineal y rígido a
completamente opaco. Al igual que otros poliuretanos, este producto se sintetiza comercialmente
leche, yogures, botellas de detergente, etc. Otros usos incluyen la fabricación de baldes, tubos,
Es una resina termoplástica que se utiliza para fabricar diversos productos como botellas de
que incluyen bolsas para envasar, bolsas de pan, bolsas de supermercado, productos de aseo
Fusarium Solani:
Fusarium solani está implicado en la enfermedad vegetal, así como la enfermedad humana,
ADN es del 50%. micelio de F. solani es rico en el aminoácido alanina, así como una gama de
solani requiere potasio para el crecimiento, y desarrolla un patrón de plumas cuando los niveles
de potasio son inferiores a 3 mm. en la cultura se utilizan los siguientes disacáridos (de la
mayoría al menos preferencial): manosa, ramnosa y sorbosa. esta especie puede descomponer la
esteroides y la lignina, y reducir fe3 + a fe2 +. Fusarium solani produce micotoxinas como el ácido
Enzima Cutinasa:
Las cutinasas son uno de los miembros más pequeños de las serín hidrolasas. Su estructura
está compuesta por una lámina-β central de cinco cadenas paralelas cubierta por cuatro hélices-α.
las cutinasas reciben el número de clasificación EC 3.1.1.74, el cual las permite identificar
como hidrolasas que actúan sobre enlaces ésteres de ácidos carboxílicos del polímero cutina.
Las cutinasas son enzimas muy versátiles que pueden catalizar, además de la ruptura del
enlace éster de la cutina, reacciones de hidrólisis y síntesis in vitro de una amplia variedad de
sustratos.
Las cutinasas son enzimas hidrolíticas cuya producción se descubrió en hongos Fito
patógenos que crecían en medios conteniendo cutina como única fuente de carbono
Desarrollo
una bacteria desconocida hasta la fecha que es capaz de digerirlo y asimilarlo, es decir, que
encontró un trabajo donde se realizaron diferentes métodos para poder comprobar la eficacia de
Muestreo de plantas.
amazónica ecuatoriana. Algunas plantas fueron atacadas por sus supuestos usos etnobotánicos,
mientras que otras se tomaron muestras al azar. Se recogió una muestra de tallo de 10 cm y se
Aislamiento de endófitos.
Los tallos de las plantas se esterilizaron en superficie mediante inmersión en etanol durante
10s seguidos de una breve llama. Se retiraron capas externas de tejido de los tallos y se
sembraron tres secciones de los tejidos internos de cada muestra en agar de dextrosa de patata
(PDA) (Difco), una dilución 1:10 de medio de dextrosa de patata en agar de agua (WA),
Todas las placas se sellaron con Parafilm y se controlaron cada 2 a 3 días para determinar su
fúngicos transfiriendo una punta hifal a placas de PDA nuevas. Las placas se envolvieron de
cada organismo se hicieron cultivando los organismos en semillas de cebada con autoclave triple
y almacenándolos a -80 ° C.
kit de plantas Qiagen DNeasy. Se usaron aproximadamente 10 ng de ADN como plantilla para
7
amplificar la región espaciadora transcrita interna (ITS) del ADN ribosomal (ADNr) mediante
Biosystems 3730cL.
Las secuencias hacia adelante y hacia atrás para cada organismo se alinearon utilizando los
programas Pregap4 y Gap4. Las secuencias endófitas se alinearon con los organismos presentes
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/index .HTML).
Los endófitos se analizaron primero por su capacidad para degradar PUR haciéndolos crecer
en presencia de Impranil DLF y una dispersión de PUR acuosa alifática aniónica con 4% de N-
Se cultivaron 59 endófitos fúngicos en medio PUR sólido (PUR-A) que contenía NaH2PO4
19 mM, K2HPO4 33,5 mM, 7,6 mM (NH4) 2SO4, citrato de Na 2,5 mM, MgSO4 250 mM,
tiamina 19 mM, ácido casamino al 0,05%. 147 μM FeCl3 · 6H2O, 14 μM ZnCl2 · 4H2O, 12 μM
15 g de agar.
El ensayo de selección de medio sólido siguió el método general de Crabbe et al... El medio
sólido PUR-A se añadió a tubos de cultivo estériles en alícuotas de 10 ml. Se añadió un tapón de
0,5 cm3 de hongos cultivados en PDA a cada tubo de ensayo utilizando una técnica aséptica y se
Aspergillus niger (de Gary Strobel, Universidad del Estado de Montana) se utilizaron como
controles positivos para la degradación del poliuretano. La degradación de PUR se evidenció por
se midió la profundidad del aclaramiento de poliuretano desde la parte superior del medio hasta
El ensayo de medio líquido siguió el método descrito por Gautam et al. (8). El medio líquido
PUR-L se preparó utilizando la misma receta que para el medio PUR-A sólido sin agar. Se
añadió medio PUR-L a tubos de cultivo estériles en alícuotas de 10 ml y se inoculó con un tapón
de hongo de 0,5 cm3 cultivado en PDA. Al final de las 2 semanas, los cultivos líquidos se
durante 1 min a 4.200 × g en una centrífuga Eppendorf Mini Spin para sedimentar
espectrofotómetro Varían Cary 50 Bio UV-visible a una longitud de onda de 600 nm, con agua
Las diluciones del medio PUR-L con agua estéril se midieron para construir una curva
cada día durante 2 semanas para determinar la absorbancia óptica para determinar la velocidad
relativa de eliminación.
Se cultivaron 59 endófitos fúngicos en medio PUR sólido (PUR-A) que contenía NaH2PO4
19 mM, K2HPO4 33,5 mM, 7,6 mM (NH4) 2SO4, citrato de Na 2,5 mM, MgSO4 250 mM,
tiamina 19 mM, ácido casamino al 0,05%. 147 μM FeCl3 · 6H2O, 14 μM ZnCl2 · 4H2O, 12 μM
15 g de agar.
El ensayo de medio líquido siguió el método descrito por Gautam et al. (8). El medio líquido
PUR-L se preparó utilizando la misma receta que para el medio PUR-A sólido sin agar. Se
añadió medio PUR-L a tubos de cultivo estériles en alícuotas de 10 ml y se inoculó con un tapón
de hongo de 0,5 cm3 cultivado en PDA. Al final de las 2 semanas, los cultivos líquidos se
homogeneizaron mediante agitación vigorosa. Una porción de 1,5 ml de cada cultivo se transfirió
a un tubo Eppendorf y se centrifugó durante 1 min a 4.200 × g en una centrífuga Eppendorf Mini
Bio UV-visible a una longitud de onda de 600 nm, con agua estéril como blanco. Las diluciones
del medio PUR-L con agua estéril se midieron para construir una curva estándar para convertir la
10
absorbancia en porcentaje de eliminación. Las muestras se midieron cada día durante 2 semanas
Los organismos identificados con actividad degradante de PUR se probaron para determinar
su capacidad para utilizar PUR como única fuente de carbono. Para estos estudios, el sustrato fue
Impranil DLN, que contiene PUR suspendido solo en agua (no hay N-metil pirrolidona
presente). Esto aísla al Impranil como la única fuente de carbono para el metabolismo y el
crecimiento.
Impranil DLN sin otras fuentes de carbono (PUR-Lmin). Las muestras de hongos se lavaron
antes de la inoculación para eliminar todo el medio residual. Estas dos consideraciones, el lavado
y el sustrato DLN, aseguran que el polímero sea la única fuente de carbono para el metabolismo
PUR-Lmin se preparó de manera similar a la del medio PUR-L, pero en ausencia de citrato de
sodio, tiamina, ácidos Casamino o agar. El organismo Aspergillus niger se probó como base de
comparación.
Los cultivos fúngicos se cultivaron durante 1 semana en caldo de patata con dextrosa (PDB). Los
PUR-Lmin. Las muestras se centrifugaron y se Re suspendieron una segunda vez para asegurar
añadió a tubos de cultivo estériles hasta un volumen final de 10 ml de PUR-Lmin. Los cultivos
Las muestras se midieron cada 2 días durante 2 semanas para determinar la absorbancia óptica
micelial de cultivos por triplicado que contienen medio mínimo con y sin PUR.
Los cultivos líquidos de cada aislado se inocularon por duplicado. Se colocó un conjunto
entorno aeróbico. Ambos juegos se incubaron a 25 ° C durante la duración del estudio. Después
nm.
de cada muestra para cada medición y se centrifugó durante 60 segundos a 4.200 × g para separar
el material fúngico de las muestras sin una sedimentación significativa del polímero.
12
Los espectros de muestra líquida se recogieron utilizando agua desionizada como espectro de
fondo. Las mediciones se realizaron hasta que se observó una degradación completa de PUR en
líquido del organismo más activo, Pestalotiopsis microspora E2712A, en medios PUR-Lmin y
µm en un recipiente estéril.
El extracto extracelular crudo se almacenó a 4ºC. Para probar la actividad de una enzima
parte alícuota de extracto de enzima y se agregó a medio PUR-Lmin hasta una concentración
control negativo.
Los cultivos líquidos de cada aislado se inocularon por duplicado. Se colocó un conjunto
entorno aeróbico. Ambos juegos se incubaron a 25 ° C durante la duración del estudio. Después
13
nm.
Nicolet 6700. Se retiró una porción de 50 μl de cada muestra para cada medición y se centrifugó
durante 60 segundos a 4.200 × g para separar el material fúngico de las muestras sin una
Los espectros de muestra líquida se recogieron utilizando agua desionizada como espectro de
fondo. Las mediciones se realizaron hasta que se observó una degradación completa de PUR en
líquido del organismo más activo, Pestalotiopsis microspora E2712A, en medios PUR-Lmin y
µm en un recipiente estéril.
El extracto extracelular crudo se almacenó a 4ºC. Para probar la actividad de una enzima
parte alícuota de extracto de enzima y se agregó a medio PUR-Lmin hasta una concentración
control negativo.
macroscópica después de 2 h.
Sobre la base de observaciones iniciales de que una serina hidrolasa estaba implicada en la
degradación de PUR, se usaron sondas basadas en la actividad para probar una proteína serina
con las serinas del sitio activo de las enzimas de la familia de la serina hidrolasa y una etiqueta
de tetrametilrodamina (TMR). Las reacciones del extracto de proteína en bruto con la sonda se
fluorescente Fujifilm FLA-5100 con excitación a 532 nm y un filtro de emisión de 570 nm. El
mismo gel se tiñó con plata para visualizar todas las proteínas en las muestras.
Proteína bruta del filtrado libre de células de Pestalotiopsis microspora E2712A cultivada en
en gel (datos no mostrados) utilizando una columna Superdex 200 (GE Healthcare) en un tampón
Resultados:
Pantalla de aprobación inicial de PUR. El imanil DLN, un poliéster poliuretano (PUR), es una
suspensión lechosa opaca que se vuelve transparente con la degradación. Los organismos
capaces de degradar este polímero muestran una zona de separación alrededor del cultivo en
poliuretano utilizando el ensayo de halo PUR como la pantalla inicial. De los organismos
PUR. Un medio de. Estos fueron utilizados como controles negativos en los estudios posteriores.
Las plantas huésped, los medios de aislamiento y las identidades de los 18 hongos activos y dos
Figura
1.
Ejemplo de placas PUR-A utilizadas inicialmente para detectar la actividad degradante del poliuretano después de 2
semanas de crecimiento de hongos. (A) Control negativo. (B) Pleosporales sp. cepa E2705 Recuperado de:
https://aem.asm.org/content/77/17/6076
TABLA 1
E NDÓFITO ORGANISMO DE
a Medio
MAYOR HOMOLOGÍA
AISLAMIENTO DE de
(% MÁXIMO DE
LA PLANTA aislamiento
IDENTIDAD ) c
HOSPEDADORA b
E2524A Alternaria sp. Annonaceae,
PDA
(100) Annona muricata
E2914A Alternaria dauci Malvaceae, Malva 1:10
(100) alcea PDA
E2910B Gesneriaceae,
1:10
Bionectria sp. (99) Drymonia
PDA
semicordata
E2705G Plectosphaerella Piperaceae, Piper 1:10
sp. (94) arboretum PDA
E3432O Edenia Fabaceae, 1:10
gomezpompae (99) Erythrina smithiana GAM
E2702C Guignardia Melastomataceae, 1:10
17
b La identidad de la secuencia de ADN para cada endófito se determinó mediante la secuenciación del ADNr de
c PDA, agar de dextrosa de patata; 1:10 PDA, 1:10 dilución de medio de dextrosa de patata en agua agar; 1:10
GAM, 1:10 dilución de medio de glicerol arginina en agua agar; WA, Agar agua.
Varios organismos del género Pestalotiopsis fueron representados entre los organismos
observada en este género, todos los aislados de Pestalotiopsis en la colección se examinaron para
determinar su actividad. Algunos organismos dentro del género exhibieron alta actividad
condiciones de crecimiento idénticas para cada organismo. Si bien es notable que algunas cepas
de Pporalotiopsis microspora demostraron algunos de los niveles más altos de actividad, el nivel
Los organismos activos del ensayo de depuración de placa se analizaron en dos ensayos
medio líquido. En el ensayo de depuración de PUR-A sólido, se usaron tapones de hongos para
semanas de crecimiento (Fig. 2). Los 18 hongos activos eliminaron visiblemente el medio PUR-
A. Dieciséis de estos hongos demostraron una actividad que era al menos el doble que la del
secuenciación ITS como un Lasiodiplodia sp. (cepa E2611A). Cuatro de los seis organismos más
activos pertenecían al género Pestalotiopsis, con una alta relación a nivel de especie con la
microspora Pestalotiopsis. Estos seis organismos principales eliminaron el PUR más eficazmente
que el hongo de control positivo Aspergillus niger. Los dos organismos de control negativo,
Figura2.
(A) Ejemplos de cultivos de agar sólido PUR-A 2 semanas después de la inoculación, incluido Pseudomonas
chlororaphis como control positivo. (B) Los cultivos de hongos se cultivaron por triplicado en medio PUR-A sólido
crecimiento. Los organismos de prueba de control positivo, Pseudomonas chlororaphis y Aspergillus niger, están
representados a la izquierda. Los cinco organismos resaltados (Lasiodiplodia sp. Cepa E2611A, Pestalotiopsis
microspora E2712A, Pestalotiopsis microspora E3317B, Pleosporales sp. Cepa E2812A y Bionectria sp. Cepa
E2910B) se seleccionaron para una selección adicional. Las barras de error representan la desviación estándar para
absorbancia óptica a 600 nm, debido a la dispersión del polímero suspendido, se midió como una
indicación del grado de eliminación por el hongo. Los cultivos líquidos se limpiaron hasta el
punto de transparencia visual en la superficie del cultivo líquido, que se extendió a lo largo de la
longitud del tubo a medida que avanzaba el tiempo (Fig. 3A). El orden relativo del ensayo de
depuración líquida fue diferente del observado para el ensayo de depuración de sólidos (Fig.
2A). A Lasiodiplodia sp. (la cepa E2611A) fue el organismo más activo en la pantalla de
eliminación de medio líquido, junto con un Pleosporales sp. (cepa E2812A) y una Bionectria sp.
(E3317B). Todos estos organismos se eliminaron tan bien o mejor que el Aspergillus niger, un
control positivo de hongos, después de 2 semanas de crecimiento. Casi todos los organismos
activos probados mostraron más actividad que el control bacteriano positivo Pseudomonas
Fig.3.
(A) Ejemplos de cultivos líquidos de PUR-L a las 2 semanas de la inoculación. (B) Los cultivos de hongos se
cultivaron por triplicado en medio líquido PUR-L que contenía Impranil DLF durante 2 semanas. El porcentaje de
aclaramiento se determinó por una disminución en la dispersión de la luz a 600 nm, medida por espectrofotometría
UV-visible. Las medidas de porcentaje de aclaramiento se tomaron después de 2 semanas de crecimiento. Todos los
datos se normalizaron al control negativo. Los organismos de prueba de control positivo, Pseudomonas chlororaphis
y Aspergillus niger, están representados a la izquierda. Los 5 organismos resaltados (Lasiodiplodia sp. Cepa
E2611A, Pestalotiopsis microspora E2712A, Pestalotiopsis microspora E3317B, Pleosporales sp. Cepa E2812A y
Bionectria sp. Cepa E2910B) se seleccionaron para una selección adicional. Las barras de error representan la
Ensayo de fuente de carbono única. Se evaluó la capacidad de los cinco organismos más
activos para degradar PUR en cultivo líquido utilizando PUR como única fuente de carbono
21
(PUR-Lmin). Para estos estudios, utilizamos Impranil DLN, que es equivalente al Impranil DLF
(una dispersión de PUR alifática aniónica en agua) utilizada para los estudios anteriores, pero no
contiene N-metilpirrolidona. Si un organismo crece en Impranil DLN, puede usar PUR como la
única fuente de carbono para el metabolismo y el crecimiento. Todos los inóculos de hongos se
lavaron con medio mínimo para eliminar el carbono residual y las enzimas del cultivo de reserva.
Los cinco organismos principales de los dos ensayos de cribado se analizaron para esta actividad,
y los cinco fueron capaces de realizar una actividad de degradación de PUR en esta condición de
medio mínimo. Cada hongo mostró un crecimiento micelial significativo según lo monitoreado
por inspección visual. Para Pestalotiopsis microspora E2712A, los cultivos cultivados con PUR
cultivo de control cultivado en condiciones idénticas sin adición de PUR. Además, el hongo de
control positivo Aspergillus niger pudo degradar lentamente el PUR como única fuente de
carbono, como se informó anteriormente. Con el fin de comparar las tasas a las que se degradó el
PUR en esta condición, los cinco organismos principales en los análisis de detección de sólidos y
líquidos se cultivaron por duplicado y se rastrearon durante 16 días (Fig. 4A). Dos organismos,
PUR. El tiempo medio aproximado para la eliminación de estos dos organismos fue de 5 días.
Los cultivos fueron transparentes visualmente al final del período de 16 días, consistente con la
degradación completa del Impranil DLN (Fig. 4B). El único material no translúcido que quedó
medio tiempo para la eliminación por parte del organismo de control Aspergillus niger fue de 15
días, y la bacteria Pseudomonas chlororaphis no alcanzó un estado de media limpieza dentro del
plazo de 16 días. Los experimentos realizados con Impranil DLF como sustrato mostraron que la
22
Esto estableció que el PUR solo es suficiente para el crecimiento de hongos para estos
organismos. Como resultado, se utilizó Impranil DLN para estudios posteriores para caracterizar
ig.4.
(A) La degradación de PUR como única fuente de carbono por parte de los cinco organismos más activos se
monitorizó durante un período de 16 días. Los cultivos que contenían medio PUR-Lmin con Impranil DLN como
23
única fuente de carbono se inocularon con inóculos de hongos lavados. El ensayo se realizó por duplicado y los
valores mostrados representan los promedios de los dos cultivos en cada punto de tiempo. Aspergillus niger (verde)
y Pseudomonas chlororaphis (rojo) sirvieron como controles positivos. (B) Pestalotiopsis microspora E2712A
(izquierda) que degrada el PUR Impranil DLN como única fuente de carbono después de un período de 16 días. El
https://aem.asm.org/content/77/17/6076
Degradación anaerobia de PUR. Se observó que algunos de los organismos analizados durante
microspora E3317B, crecían desde la parte inferior del tubo de cultivo en lugar de hacerlo desde
la parte superior. Esto sugirió que estos hongos son capaces de degradar anaeróbicamente el
poliuretano. Para probar esta posibilidad, se repitió el ensayo utilizando medio PUR-Lmin con
sustrato Impranil DLN en condiciones anaeróbicas. Los cinco organismos principales del ensayo
se compararon las extensiones de eliminación en las dos condiciones (Fig. 5). El aislado fúngico
degradación tanto en condiciones anaeróbicas como aeróbicas (Fig. 5B). Lasiodiplodia sp. cepa
E2611A y Pleosporales sp. la cepa E2812A mostró tasas disminuidas de eliminación, mientras
que Bionectria sp. la cepa E2910B y el control Aspergillus niger mostraron una degradación de
fig 5
(A) Mediciones de degradación PUR de cultivos de hongos cultivados en condiciones aeróbicas y anaeróbicas.
Se cultivaron conjuntos por triplicado de cultivos de hongos en medio PUR-Lmin que contenía Impranil DLN como
el único medio de carbono en condiciones aeróbicas o anaeróbicas. Al final de las 2 semanas de crecimiento, se
retiraron las muestras de la cámara sellada y se midió el porcentaje de aclaramiento de PUR en solución para cada
conjunto de cultivos mediante una disminución de la dispersión de la luz a una longitud de onda de 600 nm
utilizando espectrofotometría UV visible. Los controles Pseudomonas chlororaphis y Aspergillus niger se muestran
poliuretanasa cuando crecieron en condiciones anaeróbicas, mientras que Pseudomonas chlororaphis, Aspergillus
niger, Lasiodiplodia sp. cepa E2611A, Pleosporales sp. cepa E2812A, y Bionectria sp. la cepa E2910B mostró
reducciones significativas en la magnitud de la actividad de degradación de PUR. Las barras de error representan la
desviación estándar para cada conjunto de datos. (B) Las tasas de degradación se compararon mediante la medición
por triplicado de cultivos de Aspergillus niger y Pestalotiopsis microspora E2712A después de 1 semana y 2
semanas de crecimiento. Pestalotiopsis microspora E2712A muestra tasas equivalentes de actividad de degradación
en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Las barras de error representan la desviación estándar para cada conjunto de
éster en el polímero de poliuretano (Fig. 6A). Se añadió material fúngico al sustrato PUR y se
recogieron los espectros a lo largo del curso del experimento de degradación. Se observó una
más sutiles en otras ondas. En el momento en que el cultivo se había vuelto visualmente
transparente, había una pérdida completa del pico de absorbancia en 1,735 cm-1 (Fig. 6B). La
pérdida de este pico es consistente con la hidrólisis del enlace éster en el enlace uretano.
Fig. 6.
subsiguientes dentro de la molécula polimérica. (B) Espectros infrarrojos del medio líquido PUR que contiene
Impranil DLN tomado después de 6 días de incubación con el hongo Pestalotiopsis microspora. El espectro de
muestra (arriba) y el espectro de control (abajo) se muestran junto con una escala común. El pico fuerte denotado
por un asterisco a 1,735 cm-1 en el control corresponde al estiramiento éster C = O en el carbamato de etilo del
motivo uretano. Este pico desaparece después de la degradación del enlace éster por la enzima poliuretanasa.
medio sólido como en el líquido ocurrieron a una distancia significativa del sitio de crecimiento
fúngico, lo que sugiere una actividad enzimática que se excreta extracelularmente. Para probar
explícitamente esta posibilidad, se probó el aclaramiento del sustrato Impranil DLN utilizando
cultivo fúngico desarrollado en medio PUR-Lmin durante 10 días. El filtrado crudo del cultivo
PUR pudo eliminar completamente el Impranil DLN en 1 hora o menos (datos no mostrados). La
proteína activa parece ser inducida bajo condiciones de crecimiento PUR-Lmin, ya que el
filtrado libre de células preparado a partir de cultivos líquidos equivalentes de PDB no exhibió
ninguna actividad de eliminación (datos no mostrados). Esto sugiere que la actividad se excreta,
de PUR sensible al calor a partir de un extracto extracelular filtrado de 0.22 μm indica que una
específicamente la serina del sitio activo en hidrolasas de serina por modificación covalente. El
yodoacetato inactiva la cisteína del sitio activo en hidrolasas de cisteína por un mecanismo
filtrado sin células de Pestalotiopsis microspora E2712A para monitorear los cambios en la
actividad resultante del aclaramiento PUR. El extracto tratado térmicamente se utilizó como
control negativo. La adición de PMSF, un inhibidor de la serina hidrolasa, dio como resultado la
La reacción del filtrado crudo libre de células de Pestalotiopsis microspora E2712A con sondas
inhibidoras de serina hidrolasa marcó de manera eficiente una proteína en la fracción cultivada
degradación de PUR (Fig. 7B). Estos resultados sugieren que una enzima similar a la serina
crecimiento en PUR-Lmin indujo la secreción de esta enzima (Fig. 7A). La proteína de 21 kDa
se purificó a partir del filtrado bruto hasta una pureza de aproximadamente el 90%, y mantuvo la
Fig.7.
Detección de hidrolasas de serina en proteína cruda a partir de filtrado sin células. Se muestra el análisis de SDS-
PAGE de proteínas de un filtrado bruto sin células de Pestalotiopsis microspora E2712A cultivado en medio PUR-
Lmin y medio rico en PDB. Los filtrados libres de células se incubaron con sondas basadas en la actividad de la
serina hidrolasa antes de la carga. (A) Las bandas de proteína se visualizaron mediante tinción con plata. (B) Las
bandas de proteínas marcadas se visualizaron utilizando un escáner de fluorescencia. Este análisis muestra que una
proteína de aproximadamente 21 kDa expresada exclusivamente bajo la condición de crecimiento inducida por
PUR-Lmin se marca de manera eficiente mediante la sonda basada en la actividad de la serina hidrolasa.
Discusión
De los nueve aislamientos probados, tres fueron altamente activos (E2712A, E3317B y
E2708A), y uno fue inactivo (E4112A). Esta variabilidad en la actividad entre distintos
aislamientos de microspora de Pestalotiopsis sugiere que existen diferencias genéticas entre los
organismos.
29
Conclusión
características que buscamos fue Pestalotiopsis microspora, ya que ésta, tuvo una gran eficiencia
para degradación del PUR (15 días); se desarrolla en condiciones convencionales e inusuales
(aerobias y anaerobias), Además de utilizar el PUR como única fuente de carbono, es decir, para
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Belgium. http://www.plasticsrecyclers.eu/docs/press
%20release/080123CfaPpdfVersion.pdf.
Agradecimientos.
Gracias a mi querido CECyT 6, gracias por haberme permitido fórmame y en ella, gracias a
todas las personas que fueron participes de este proceso, ya sea de manera directa o indirecta,
gracias a todos ustedes, fueron ustedes los responsables de realizar su pequeño aporte, que el día
de hoy se vería reflejado en la culminación de mi paso por la preparatoria. Gracias a mis padres,
que fueron mis mayores promotores durante este proceso, mi principal apoyo y motivador para
Este es un momento muy especial que espero, perduré en el tiempo, no solo en la mente de las
personas a quienes agradecí, sino también a quienes invirtieron su tiempo para echarle una
mirada a mi proyecto de tesina; a ellos asimismo les agradezco con todo mi ser.