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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS ASIGNATURA HEMATOLOGIA

Mtodos del laboratorio hematolgico


PRIMERA PARTE

Docentes

Dra. Nilda E. Fink Dra. Mara Elena hiesa Dra. Ma. Ale!andra Fern"nde# Alberti $io%. Fernando &entimiglia $io%. Mariana 'on#"le# $io%. (os )*is asali

)a Plata+ ,--.

ontenido
P"gina Instr*cti/o 0ara la obtencin de sangre 0eri1rica 0or 0*ncin /enosa Descri0cin de los anticoag*lantes *sados en hematologa Rec*ento de hemates 2ematocrito Determinacin de hemoglobina3 mtodo de la cianmetahemoglobina &elocidad de sedimentacin glob*lar Rec*ento de retic*locitos *anti1icacin de hierro srico Tincin histo%*mica de hierro3 coloracin de Perls 4e0aracin electro1ortica de hemoglobina Deteccin histo%*mica de hemoglobina 1etal3 reaccin de 5leiha*er6$etke 'r*0os sang*neos A$7 8 Rh3 0r*ebas de oombs Determinacin de antic*er0os inm*nes 9 : . ;, ;: ,; ,< ,= 9> >, >: >. :.

Instr*cti/o 0ara la obtencin de sangre 0eri1rica 0or 0*ncin /enosa


A? EN AD@)T74 ;. D*rante la toma de m*estra deben g*ardarse las m"s estrictas normas de higiene. ,. El material descartable a *sar se abrir" slo al momento de s* *tili#acin 8+ *na /e# mani0*lado+ no 0odr" g*ardarse n*e/amente aAn c*ando se lo considere n*e/o. 9. @na /e# reali#ada la toma de m*estra+ descartar inmediatamente los materiales *sados en reci0ientes 0ara ese 1in. >. )os reci0ientes %*e contienen algodn 8 los de desecho deben estar 0er1ectamente cerrados todo el tiem0o 8 se abrir"n solamente al momento de *sar. :. Al momento de hacer la eBtraccin colocarse los g*antes desechables+ los c*ales se mantendr"n 0*estos d*rante todo el 0rocedimiento. <. Antes de iniciar la toma de m*estra+ tener todo el material 0re0arado 0ero sin abrir. .. Elegir *na /ena bien /isible en el antebra#o+ locali#"ndola /is*almente 8 0or 0al0acin. olocar el la#o 8 /ol/er a 0al0ar la /ena+ indicarle al 0aciente %*e abra 8 cierre el 0*Co 0ara 1acilitar la eBtraccin. El la#o debe ser colocado de modo de 0rod*cir *na com0resin del mAsc*lo no ma8or a ; mm. D. @na /e# identi1icada la /ena+ lim0iar el "rea circ*ndante con algodn em0a0ado en alcohol. De!ar secar 0er1ectamente. =. En este momento se rom0er" el sello de garanta de la ag*!a+ se la colocar" en la !eringa sin tocar con los dedos+ controlando el correcto 1*ncionamiento del mbolo. ;-. )a ag*!a se insertar" en la /ena elegida con el bisel hacia arriba+ de!ando %*e la sangre 1l*8a en la !eringa as0irando s*a/emente con el mbolo. )a escala de la !eringa debe estar /isible Ehacia arriba?. ;;. Des0*s de la toma+ se le indica al 0aciente %*e abra la mano+ se retira el torni%*ete 8 l*ego la ag*!a+ 0resionando el l*gar de la 0*ncin con *n tro#o de algodn seco. ;,. )A A'@(A 4E DE4 ARTARF EN E) E4E FIN. 7NTENED7R DE4TINAD7 PARA

;9. )a sangre %*e est" en la !eringa se descargar" en los t*bos o 1rascos %*e contienen los anticoag*lantes corres0ondientes+ e/itando hacer es0*ma. ;>. Rot*lar los t*bos o 1rascos con los datos del 0aciente. ;:. En el sitio de la 0*ncin se 0ondr" *n a0sito des0*s de controlar %*e no ha8a m"s sangrado.

;<. )a 0ersona %*e hace la eBtraccin deber" %*itarse los g*antes al 1inali#ar la toma de m*estra 8 desecharlos inmediatamente. N7 RE@TI)IGAR)74 N@E&AMENTE. ;.. 4i ha8 algAn dato %*e ha8a inter1erido con el 0rocedimiento+ aclararlo en el registro de m*estras. $? EN NIH74 ;. En niCos ma8ores de < meses+ se recomienda hacer la eBtraccin del bra#o como en ad*ltos+ 0idindole a *n ad*lto %*e colabore en mantener inm/il al niCo+ en 0artic*lar el bra#o. ,. En el caso de niCos menores de < meses+ se 0roceder" a eBtraer la m*estra del taln con *na lanceta descartable. Antes de la eBtraccin con/iene calentar el taln 1rot"ndolo entre las manos 0ara 1a/orecer la irrigacin de la #ona. 9. Desin1ectar con *n tro#o de algodn embebido en alcohol+ de!ar e/a0orar 8 0*n#ar con la lanceta+ en la #ona del taln indicada en el dib*!o ad!*nto. >. )im0iar la 0rimera gota 8 de!ar gotear la sangre en el t*bo con anticoag*lante. 4ecar la #ona con *n tro#o de algodn seco 8 *na /e# %*e no ha8a sangrado+ colocar *na c*rita o a0sito.

)as 1lechas indican los l*gares de 0*ncin

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Descri0cin de los anticoag*lantes *sados en 2ematologa


)os anticoag*lantes se *tili#an 0ara obtener 0lasma o m*estras de sangre total 0ara est*diar las caractersticas mor1olgicas 8 reali#ar los rec*entos cel*lares. Deben intentar %*e las cl*las sang*neas a est*diar se enc*entren en el estado m"s 0arecido al 1isiolgico+ como c*ando se enc*entran circ*lando 0or el torrente sang*neo. Para ello los anticoag*lantes no deben alterar la mor1ologa de los le*cocitos+ el tamaCo eritrocitario+ no 0rod*cir hemlisis e im0edir la agregacin 0la%*etaria+ 0osibilitando al mismo tiem0o el m"Bimo 0erodo de conser/acin de la m*estra Egeneralmente no m"s de ,> horas incl*so re1rigerada a >I ?. )os anticoag*lantes m"s *tili#ados son3 EDTA E ;-2;<N,7D? o sal disdica+ di0ot"sica o tri0ot"sica del "cido etilendiaminotetraactico+ act*ando mediante *n e1ecto %*elante sobre el calcio E aJ J ?+ im0idiendo el 0roceso de la coag*lacin al 1i!arlo. Este anticoag*lante se *tili#a 1*ndamentalmente 0ara la reali#acin de rec*entos cel*lares+ sobretodo en los a*toanali#adores 8 0ermite adem"s la reali#acin del hematocrito 8 del 1rotis sang*neo hasta dos horas des0*s de la eBtraccin de la m*estra al mismo tiem0o %*e im0ide la agl*tinacin de las 0la%*etas. )as sales de 0otasio tienen la /enta!a con res0ecto a la de sodio+ 0or ser m"s 1"cilmente sol*bles en sangre c*ando las *samos a 0artir del 0rod*cto slido+ sin embargo + las tres sales a1ectan el tamaCo del eritrocito+ es0ecialmente des0*s del almacenamiento de la sangre anticoag*lada 0or es0acio de alg*nas horas. El International o*ncil 1or 4tandardi#ation in 2ematolog8 EI 42? recomienda la sal di0ot"sica como anticoag*lante 0ara recolectar m*estras sang*neas destinadas al rec*ento 8 caracteri#acin del tamaCo cel*lar 8 es0ecialmente c*ando los /alores del hematocrito se re%*ieren 0ara la calibracin de los contadores a*tom"ticos. El 5,EDTA .,2,7 0osee *n 0eso molec*lar relati/o de >->+;gK ;g %*ela ;-- mg de calcio inico 8 el 02 0ara *na sol*cin al ;L es de >.DJM6;+-. )a cantidad de EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de ;.:6,., mgMml. de sangre total. Esta cantidad es *n com0romiso entre la cantidad re%*erida 0ara e/itar la coag*lacin 8 la cantidad a la c*al se 0rod*cen las alteraciones cel*lares. 2EPARINA 4NDI A. 2EPARINA DE )ITI7+ es *n anticoag*lante 1isiolgico %*e actAa im0idiendo %*e la 0rotrombina se trans1orme en trombina. Estr*ct*ralmente es *n m*co0olisac"rido "cido. )os 1rotis reali#ados con m*estras sang*neas anticoag*ladas con he0arina 0rod*cen en las tinciones 0an0ticas *n color a#*lado 8 *na 0se*do/ac*oli#acin cel*lar 0or lo tanto no se lo recomienda 0ara tal 1in. )a 0ro0orcin adec*ada es de ;:6,- @I E-.;6-., mg? de he0arina 0or ml de sangre. ITRAT7 TRI4NDI 7+ <2:7.Na9+ actAa im0idiendo %*e el calcio se ionice+ e/itando as la coag*lacin. 4e *tili#a 0ara reali#ar las 0r*ebas de 2emostasia en *na 0ro0orcin sangre3 anticoag*lante =3;K as como 0ara la /elocidad de eritrosedimentacin en *na 0ro0orcin sangre3 anticoag*lante >3;. El citrato sdico se *tili#a a *na concentracin de -.;-< molMl E9;+9 gM) de <2:7.Na9.,2,7?. A D se em0lea 1*ndamentalmente en $ancos de 4angre 0ara conser/ar las *nidades de sangre 8 est*dios metablicos eritrocitarios 0or 0ermitir *na b*ena conser/acin de los hemates. 4e *tili#a en *na 0ro0orcin de *n /ol*men de A D 0or cada :

c*atro /olAmenes de sangre. )a 0ro0orcin de la me#cla del anticoag*lante es de3 Acido trico -.= g+ itrato disdico , g+ DeBtrosa , g+ 2,7 destilada ;,- ml.

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Rec*ento de hemates
A? RE @ENT7 MAN@A) onsiste en hacer el rec*ento en *na dil*cin de sangre entera anticoag*lada. Es *n mtodo 0oco *sado debido al ele/ado error %*e 0resenta. )%*ido dil*8ente3 sol*cin 1isiolgica o citrato de sodio 9+DL. )a dil*cin em0leada es de ;M,--+ 0ara lo c*al se mide eBactamente3 4ol*cin 1isiolgica o citratada3 9+=D ml 4angre Econ 0i0eta a*tom"tica?3 -+-, ml El rec*ento se reali#a en la c"mara de Ne*ba*er c*8o es%*ema es el sig*iente3

El rec*ento de hemates se reali#a en el c*adrado central+ se eligen : de los c*adrados %*e se enc*entran s*bdi/ididos en ;< c*adrados 0e%*eCos+ como se m*estra a contin*acin3

Rec*adro central3

)as lneas re1or#adas+ o tri0les+ sir/en Anicamente como lmites de cada c*adrado %*e contiene los ;< c*adrados 0e%*eCos. 4e deben contar : de estos c*adrados. )a s*0er1icie de este c*adrado es de ; mm, 8 la c"mara tiene *na 0ro1*ndidad de -+; mm. on la dil*cin indicada+ l*ego de agitar adec*adamente en *n agitador de rodillos+ se carga la c"mara 8 se c*entan los glb*los ro!os de los D- c*adrados 0e%*eCos E#ona sombreada?. )a c"mara 0*ede ser cargada con *n ca0ilar+ e/itando %*e %*eden b*rb*!as 8 %*e la misma %*ede cargada *ni1ormemente. onsiderando entonces+ %*e el retc*lo tiene >-- c*adrados 0e%*eCos en total+ el c"lc*lo %*e se debe hacer es el sig*iente3 N B D B F B 4T O nP de glb*los ro!osMmm9 T Donde3 N3 nAmero de eritrocitos contados. D3 Tt*lo de la dil*cin reali#ada E,--?. F 3 Factor de correccin de la 0ro1*ndidad+ 0ara lle/ar a ; mm9 E;-?. 4T3 Total de c*adrados 0e%*eCos en la s*0er1icie de ; mm, E>--?. T 3 Total de c*adrados 0e%*eCos contados. Causas de error en el recuento en cmara cuentaglbulos El rec*ento man*al de eritrocitos tiene *n error del ;-L+ el c*al 0*ede deberse a3 ;. Errores de eBtraccin3 dil*cin o hemoconcentracin. oag*lacin 0arcial. 2emlisis. ,. Mala homogenei#acin 0or agitacin ins*1iciente de la sangre. 9. @tili#acin de material mal calibrado+ s*cio o hAmedo. >. Falta de s*1iciente agitacin de la sangre dil*ida. :. "mara c*entaglb*los mal a!*stada+ s*cia o mo!ada. <. )lenado incom0leto de la c"mara c*entaglb*los. .. Em0leo de c*breob!etos de1ormable+ no rgido. D. l*las mal distrib*idas en el 1ondo de la c"mara. =. Errores del o0erador al reali#ar el rec*ento. ;-. Errores al e1ect*ar los c"lc*los.

$? RE @ENT7 A@T7MATIGAD7 )a a*tomati#acin ha contrib*ido de manera decisi/a al a*mento de la ra0ide# 8 la 1iabilidad del rec*ento de las cl*las sang*neas. EBisten distintos ti0os de instr*mentos3 los semia*tomati#ados %*e re%*ieren alg*nos 0asos 0re/ios+ como 0or e!em0lo dil*ciones de la m*estra antes de ser 0rocesada 8+ los a0aratos totalmente a*tomati#ados slo re%*ieren %*e se les s*ministre la m*estra obtenida en condiciones a0ro0iadas E0or e!em0lo3 con el anticoag*lante adec*ado?. )os sistemas de rec*ento cel*lar 0or estos medios se basan en la medida del tamaCo * otras 0ro0iedades 1sicas de las cl*las s*s0endidas en medio l%*ido de ac*erdo con *no de los dos 0rinci0ios sig*ientes3 ;. Im0edancia o resistencia elctrica. ,. Dis0ersin de l*# o cam0o osc*ro. B.1 Mtodo de la impedancia o de la resistencia elctrica Es el m"s em0leado en los a*toanali#adores hematolgicos. 4e basa en la 0ro0iedad de las cl*las sang*neas de no cond*cir la electricidad. )a sangre total es dil*ida en *na sol*cin de cond*cti/idad estable+ las cl*las sang*neas as dil*idas se hacen 0asar 0or *n ori1icio de a0ert*ra con *n "rea 0re1i!ada. Por dentro 8 1*era del ori1icio se dis0onen electrodos %*e establecen *na di1erencia de 0otencial. *ando *na cl*la 0asa a tra/s del ori1icio+ se genera *na resistencia entre ambos electrodos %*e se registra como *n im0*lso. El nAmero de im0*lsos se corres0onde directamente con el rec*ento cel*lar 8 como la am0lit*d del im0*lso es directamente 0ro0orcional al tamaCo de la cl*la+ es 0osible determinar tambin el /ol*men cel*lar. Este mtodo tiene alg*nas limitaciones. omo los im0*lsos elctricos %*e /an a determinar el /ol*men cel*lar se generan en el ori1icio de a0ert*ra del sistema+ 0ara cada 0oblacin cel*lar %*e se %*iera est*diar se deben seleccionar las condiciones 0ara %*e sean anali#adas sin error. )as condiciones m"s im0ortantes %*e deben tenerse en c*enta son3 ;. )a intensidad de corriente entre ambos electrodos3 debe ser lo s*1icientemente sensible 0ara detectar la resistencia %*e genera la 0artc*la c*ando atra/iesa el ori1icio. 4i es m*8 ele/ada 0*ede daCar las cl*las 8 0rod*cir inter1erencias originadas 0or r*ido electrotrmico. ,. El di"metro del ori1icio de a0ert*ra3 debe estar en relacin al tamaCo de las 0artc*las %*e se anali#an. Debe ser 0er1ectamente 0ermeable+ 0or lo general 0oseen *n monitor de /is*ali#acin %*e 0ermite obser/ar s* 0ermeabilidad d*rante el rec*ento. Es im0ortante reali#ar 0eridicamente *na lim0ie#a de este ori1icio. 9. )a concentracin de la s*s0ensin anali#ada3 debe ser la adec*ada 0ara e/itar el error de coincidencia+ es decir+ %*e /arias cl*las atra/iesen el ori1icio al mismo tiem0o.

B.2 Mtodo de dispersin de luz 4e anali#a la dis0ersin de l*# 0rod*cida 0or las cl*las desde dos dimensiones gracias a sensores *bicados en "ng*los di1erentes. )as cl*las se hacen 0asar indi/id*almente a lo largo de *na c"mara de lect*ra sobre la %*e incide 0er0endic*larmente *n ha# de l*# %*e 0*ede ser halgena o l"ser. ada /e# %*e *na cl*la se inter0one en el ha# de l*# se 0rod*ce *na sombra %*e+ 0ro8ectada sobre *n cam0o osc*ro+ ser" anali#ada 0or los sensores. Estos sistemas 0ermiten medir la concentracin 8 el /ol*men cel*lares. 4i adem"s+ las cl*las se someten a tinciones cito%*micas se 0*eden detectar midiendo la intensidad de dicha reaccin los di1erentes ti0os de le*cocitos. Causas de error en el recuento automatizado on el em0leo de mtodos a*tomati#ados se 0*ede cometer grandes errores si se ol/ida el control 0eridico 8 el calibrado diario de los instr*mentos. En general+ el error debido al 0ro0io mtodo de rec*ento electrnico+ c*ando se reali#a en 0timas condiciones+ s*ele ser in1erior al ;L+ 0ero 0*ede incrementarse 0or3 ;. Errores de eBtraccin3 dil*cin o hemoconcentracin. oag*lacin 0arcial. 2emlisis. ,. Mala homogenei#acin 0or agitacin ins*1iciente de la sangre. 9. @so de *n dil*8ente incorrecto. >. Presencia de 0artc*las eBtraCas en el dil*8ente. :. De1ectos en el sistema electrnico de rec*ento3 a? )isis incom0leta de los eritrocitos en el ori1icio de le*cocitos. b? Presencia de agregados cel*lares a ni/el del ori1icio de rec*ento. c? 7bstr*ccin de los ca0ilares * ori1icios de rec*ento. d? Dil*cin incorrecta de la m*estra 0or el li%*ido dil*8ente. e? Presencia de microb*rb*!as+ %*e son contadas como cl*las. 1? ontaminacin 0or arrastre de *n es0ecimen con el sig*iente. g? Presencia de inter1erencias electrnicas 8 a/eras de los com0onentes electrnicos del instr*mento. . &A)7RE4 DE REFEREN IA Edad Recin nacidos NiCos E,6;, aCos? Ad*ltos !/enes E;,6;D aCos? Ad*ltos !/enes E;=6<- aCos? 4eBo ambos ambos m*!eres hombres m*!eres hombres Inter/alo de re1erencia >+.B;-;,M) 6 <+9B;-;,M) >+-B;-;,M) 6 :+9B;-;,M) >+;B;-;,M) 6 :+;B;-;,M) >+:B;-;,M) 6 :+9B;-;,M) >+;B;-;,M) 6 :+,B;-;,M) >+<B;-;,M) 6 :+=B;-;,M)

D? INTERPRETA I7N DE )74 RE4@)TAD74

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@n a*mento de la concentracin de eritrocitos con contenido hemoglobnico normal s*ele acom0aCarse de *n a*mento de la concentracin de hemoglobina 8 recibe el nombre de 0oliglob*lia. *ando el a*mento de la concentracin de eritrocitos /a acom0aCado de *na dismin*cin de la hemoglobina+ se habla de se*do0oliglob*lia+ la c*al 0*ede acom0aCarse de microcitosis como en la talasemia. El descenso en la concentracin de eritrocitos en la sangre se acom0aCa siem0re de *na dismin*cin en la concentracin de hemoglobina Eanemia? 8 0*ede deberse a di1erentes ca*sas como las hemorragias+ la hemlisis o 1allas en s* 1ormacin a ni/el de la med*la sea.

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2ematocrito
DEFINI I7N El hematocrito E2to? es la relacin eBistente entre el /ol*men de eritrocitos 8 el /ol*men total de sangre+ eB0resado como 0orcenta!e. Est" directamente relacionado con la concentracin de hemoglobina+ 0or lo %*e s* determinacin constit*8e el 0rocedimiento m"s sim0le 0ara el diagnstico de anemia. As+ *n descenso del 2to es indicati/o de anemia+ mientras %*e el a*mento lo es de 0oliglob*lia. El mtodo de re1erencia 0ara la determinacin del 2to es la centri1*gacin de sangre total en t*bo ca0ilar Emicromtodo?+ es *na tcnica sencilla+ barata 8 accesible a laboratorios de ba!a com0le!idad. A*n%*e tambin 0*ede em0learse *n t*bo de Qintrobe Emacromtodo?+ este 0rocedimiento no es tan recomendable debido a s* ma8or ineBactit*d e im0recisin. Ambos mtodos se basan en medir el em0a%*etamiento de la col*mna de eritrocitos c*ando la sangre total con anticoag*lante se somete a la accin de *na 1*er#a centr1*ga. Por ello+ entre s*s 1actores de error est" el 0lasma %*e %*eda atra0ado entre los eritrocitos em0a%*etados 8 el 0osible e1ecto de le*cocitos 8 0la%*etas en la lect*ra. En la act*alidad+ todos los a*toanali#adores hematolgicos s*ministran+ dentro del conteBto del hemograma a*tomati#ado+ *n /alor de 2to %*e res*lta de *n c"lc*lo electrnico a 0artir del &ol*men or0*sc*lar Medio Eobtenido 0or cond*cti/idad o cam0o osc*ro? 8 la concentracin de eritrocitos. 7b/iamente este /alor obtenido electrnicamente di1iere del obtenido 0or centri1*gacin en %*e no considera el e1ecto del 0lasma atra0ado entre los eritrocitos ni el e1ecto de las restantes cl*las sang*neas+ 0or lo %*e es siem0re algo in1erior E-+,6-+9 L?. Tanto el 2to. obtenido 0or microcentri1*gacin o 0or mtodos a*tomati#ados+ son *n b*en 0ar"metro del estado de la serie eritroide. El 2to re1le!a la concentracin 8 no la masa total de glb*los ro!os. Por e!.+ *n 0aciente en estado de shock acom0aCado de hemoconcentracin+ el 2to. 0*ede ser normal o alto+ aAn c*ando la masa eritrocitaria total dismin*8e 0or la 0rdida de sangre. Por lo tanto no es con1iable como indicador de anemia 0oco des0*s de *na hemorragia o *na trans1*sin. A? MET7D74 MAN@A)E4 A.1 Macromtodo (macrohematocrito) @tili#a -+< ml de sangre entera anticoag*lada con EDTA+ t*bo de Qintrobe con di"metro interno de 9mm . entri1*gamos d*rante 9- min*tos a ,.---69.--- r.0.m. )a lect*ra del res*ltado se reali#a eBtra8endo los t*bos de la centr1*ga 8 /alorando la alt*ra en milmetros de la col*mna eritrocitaria+ %*e corres0onde a *na 1raccin de la longit*d original de la col*mna sang*nea E;-- mm?. Debe eBcl*irse la col*mna de le*cocitos 8 0la%*etas.

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A.2 Micromtodo (microhematocrito) Es *na tcnica m*8 *tili#ada+ 0or necesitar m*8 0oca cantidad de sangre+ m*8 sencilla 8 0oderse reali#ar en gran nAmero de m*estras a la /e# 8 en m*8 0oco tiem0o. 4e *tili#an t*bos ca0ilares de /idrio de . a .+: cm. de longit*d 0or ;mm. de di"metro interno. 2e0arini#ados o no+ de0endiendo del ti0o de m*estra Esangre entera anticoag*lada o sangre ca0ilar?. 4i se *tili#a sangre ca0ilar+ se desechar" la 0rimera gota des0*s de la 0*ncin. 4e llena el t*bo ca0ilar hasta tres c*artas 0artes de s* ca0acidad con la sangre Ea0roBimadamente :- l?. El llenado de los t*bos se reali#a 0or ca0ilaridad+ 1a/oreciendo el 0roceso inclinando el ca0ilar hacia aba!o a medida %*e se /a llenando. )im0iar con 0a0el o gasa el ca0ilar 8 ta0ar el eBtremo lim0io con 0lastilina o sell"ndolo a la llama del mechero. @na /e# cerrados se colocan los ca0ilares en la centr1*ga con el eBtremo del ca0ilar cerrado hacia 1*era 8 de modo %*e %*ede 0er1ectamente e%*ilibrada. 4e centri1*gan d*rante cinco min*tos a ;,.--- r0m. Tan 0ronto se detiene la centr1*ga se eBtraen los ca0ilares 8 se 0rocede a s* lect*ra. Esta se 0*ede reali#ar con los lectores de hematocrito+ %*e nos dar"n el res*ltado directamente+ o con *na regla milimetrada+ a0licando la sig*iente regla de tres3 A6666666 ;-$6666666 B B 3 hematocrito en tanto 0or ciento A3 longit*d total $3 longit*d de la 0arte cor0*sc*lar

)a determinacin del 2to debe reali#arse 0or d*0licado 8 la di1erencia entre los dos /alores obtenidos no debe ser n*nca s*0erior a -+-;. Causas de error )as 1*gas de m*estra al no %*edar bien sellado los ca0ilares 0rod*cen *na dismin*cin en el /alor+ al 0erderse ma8or 0ro0orcin de cl*las %*e de 0lasma. El *so de anticoag*lantes l%*idos 0ro/oca *n error 0or dil*cin de la m*estra En m*estras ca0ilares no descartar la 0rimer gota+ 0rod*ce *na me#cla con los l%*idos tis*lares %*e 0ro/oca hemodil*cin. En m*estras de sangre /enosa+ el la#o colocado d*rante *n cierto tiem0o 0rod*ce hemoconcentracin. )a lect*ra no inmediata de los ca0ilares+ 0ro/oca %*e el sedimento de hemates /a8a tomando 1orma de bisel si el ca0ilar 0ermanece en 0osicin hori#ontal.

$. MET7D7 A@T7MATIGAD73 7NTAD7RE4 2EMAT7)7'I 74 El mtodo a*tom"tico de determinacin se basa en el c"lc*lo matem"tico a 0artir del &ol*men or0*sc*lar Medio E& M? 8 el nAmero de hemates. 2to O nI de hemates B & M

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&A)7RE4 DE REFEREN IA E x , DE? El /alor de 2to /ara con la edad 8 el seBo. Edad 8 seBo Recin Nacidos NiCos Ehasta ;- aCos? M*!eres E;D6:- aCos? Embara#adas 2ombres E;D6:- aCos? 2ematocrito L :> ;9D : >, : 9= : >: : Fraccin -+:> -+; -+9D -+-: -+>, -+-: -+9= -+-: -+>: -+-:

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Determinacin de hemoglobina3 mtodo de la cianmetahemoglobina


F@NDAMENT7 Este mtodo tiene como 1*ndamento la trans1ormacin 0re/ia de la hemoglobina en cianmetahemoglobina E2i N?+ %*e es m*8 estable 8 0osee *n color caracterstico c*8a absorbancia a :>- nm 0*ede ser c*anti1icada com0ar"ndola con la de /arias sol*ciones de concentraciones conocidas de hemoglobina 0re0aradas a 0artir del 0atrn de re1erencia Ec*r/a de calibracin?. )os distintos com0*estos de hemoglobina+ eBce0to la s*l1ohemoglobina %*e casi n*nca es signi1icati/a+ se trans1orman en 2i N segAn el sig*iente 0roceso3 2emoglobina J Ferrician*ro 0ot"sico metahemoglobina Metahemoglobina J ian*ro 0ot"sico cianmetahemoglobina MATERIA) 1. Es0ectro1otmetro o 1otocolormetro3 Estos instr*mentos deben ser calibrados 0eridicamente mediante la sol*cin 0atrn de 2i N+ 0re0arada de ac*erdo a las es0eci1icaciones del International ommittee 1or 4tandardi#ation in 2aematolog8 EI 42? 2. T*bos3 ;, B ;-- mm. . 4angre /enosa total3 anticoag*lada con EDTA65 9 E;+: mgMml? o con he0arina E;@IMml?. P*ede em0learse sangre ca0ilar. !. Pi0etas /ol*mtricas3 de /idrio 8 de : ml. ". Pi0etas a*tom"ticas3 de ,- l+ debidamente calibradas. #. Reacti/o de ianmetahemoglobina3 om0osicin E02 .6.+>? Ferrician*ro 0ot"sico R59 FeE N? <S ian*ro 0ot"sico R N5S Fos1ato mono0ot"sico R52,P7>S Detergente no inicoT Ag*a destilada hasta ,-- mg :- mg ;>- mg ; ml ;--- ml

Detergentes no inicos3 Tritn U6;--+ Nonic ,;D+ NonidetM>-+ V*olac Nic ,;D. El detergente no inico 1acilita la sol*bili#acin de 0rotenas insol*bles 8 acelera la trans1ormacin de la hemoglobina en 2i N+ de 1orma %*e a%*ella se com0leta en 9 min. Este reacti/o debe tener *n color amarillo 0"lido+ ser com0letamente trans0arente 8 tener *n 02 entre . 8 .+>. )a lect*ra de absorbancia a :>- nm *tili#ando ag*a destilada como blanco debe ser ig*al a cero. Para s* conser/acin *tili#ar botellas de /idrio de borosilicato o0acas 8 mantener a tem0erat*ra ambiente Eel 1ro modi1ica el color del reacti/o?. $. Patrn de re1erencia Esol*cin comercial?3 Es *na sol*cin de 2i N c*8a absorbancia corres0onde a *na determinada concentracin de hemoglobina. Todo

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0atrn de 2i N debe c*m0lir las es0eci1icaciones del llamado 0atrn 0rimario de 2i N. %. Patrn 0rimario de 2i N3 4e s*ministra a centros o 0ersonas relacionadas con 0rogramas o1iciales reconocidos 0ara la estandari#acin 8 el control de calidad. Este 0atrn+ es *na sol*cin m*8 estable de cianmetahemoglobina c*8as 0ro0iedades 8 caractersticas 1isico%*micas han sido de1inidas 0or el I 42 en base al 0eso molec*lar E<>+>:D? 8 el coe1iciente de eBtincin E>>+-? de la hemoglobina E 0or e!. la absorbancia de *na sol*cin %*e contenga > B ::+D mg de hierro hemoglobnico 0or litro a :>- nm?. El 0atrn 0rimario de 2i N se s*ministra en am0ollas cerradas al /aco %*e contienen ;- ml de *na sol*cin de 2i N corres0ondiente a *na concentracin de hemoglobina entre ::- 8 D:- mgMl. )a concentracin eBacta de hemoglobina de cada lote se indica siem0re en la am0olla.6 El /alor corres0ondiente en gramos de hemoglobina 0or litro se re1iere al %*e tendra *na m*estra de sangre dil*ida 8 0re0arada con/enientemente 0ara reali#ar la lect*ra 1otocolorimtrica. As+ si en el 1rasco se indica *na concentracin de :., mgMl+ signi1ica %*e dicha sol*cin 0atrn 0osee la misma absorbancia %*e la de *na sol*cin de hemoglobina de ;>9 gMl+ si la sangre total se ha dil*ido ,:- /eces+ o de ;;> gMl+ si la dil*cin ha sido de ,-- /eces. El 0atrn 0rimario 0osee *n es0ectro de absorcin caracterstico con *n 0ico de m"Bima absorbancia EA? a :>- nm 8 *na in1leBin a :-> nm. )a c*r/a de longit*d de onda /ers*s A desde O.:- nm a O><- nm se obser/a en la Fig.; + donde tambin se incl*8e la c*r/a del reacti/o. El /alor de la A a :>- nm /ara entre -+>-- 8 -+>->+ 8 a :-> nm entre -+,>D 8 -+,:;+ segAn el lote 8 el instr*mento de lect*ra *tili#ados. El cociente A :>-MA:-> oscila generalmente entre ;+<- 8 ;+<,. MET7D7 Por *n lado+ se e1ect*ar" el es0ectro de absorcin de la sol*cin de re1erencia internacional 8 del reacti/o de Drabkin en *n rango de >-- a .-- nm EFig.;?. Por otro lado se determinar" la concentracin de 2emoglobina de *na m*estra 0roblema sig*iendo los 0asos detallados a contin*acin3 ;. onectar el es0ectro1otmetro. ,. 2omogenei#ar bien la sangre mediante agitacin s*a/e con *n sistema a*tom"tico ErodillosMdisco giratorio? d*rante *n tiem0o mnimo de : min o man*almente 0or in/ersin del t*bo ,- /eces. 9. Pi0etear : ml de reacti/o de Drabkin en *n t*bo de ensa8o lim0io. >. Mediante la micro0i0eta aCadir ,- l de sangre homogenei#ada al t*bo %*e contiene : ml de reacti/o de Drabkin. Al reali#ar esta o0eracin+ es 1*ndamental eliminar el eBceso de sangre %*e 0*eda %*edar en las 0aredes eBternas del ca0ilar antes de introd*cirlo en el reacti/o 8 0roc*rar asimismo %*e no %*ede sangre adherida a las 0aredes internas de la 0i0eta. :. Agitar el t*bo mediante in/ersin E > o : /eces? con el 1in de conseg*ir homogenei#ar bien la me#cla sangre6reacti/o 8 es0erar *n mnimo de : min 0ara %*e se 0rod*#ca la hemlisis total 8 se com0lete la trans1ormacin de toda la hemoglobina en cianmetahemoglobina. <. )eer la A de la sol*cin a :>- nm+ *tili#ando ag*a destilada como blanco.

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.. Para calc*lar la concentracin de hemoglobina es recomendable dis0oner de *na c*r/a de calibracin E/er m"s adelante?. D. )a concentracin de hemoglobina tambin 0*ede calc*larse a0licando la sig*iente 1rm*la3 2emoglobina EgMl?O A:>- Em*estra? A:>- E0atrn? B 2i N 0atrn EmgMl B F ;---

4iendo AO absorbancia FO 1actor de dil*cin de la sangre total en el reacti/o de &an 5am0en 8 G8lstra E,:;?. )a concentracin de hemoglobina en milimoles 0or litro de sangre EmmolMl? 0*ede calc*larse m*lti0licando el /alor en gMl 0or -+<,;. E)A$7RA I7N DE )A @R&A DE A)I$RA I7N )a gr"1ica de calibracin tiene como 1inalidad calibrar el es0ectro1otmetro 0ara *na lect*ra determinada calc*lando la correccin eBistente entre los /alores de A ledos en el a0arato 8 los corres0ondientes /alores de concentracin de hemoglobina. Para tra#ar este gr"1ico se 0re0aran : sol*ciones de concentracin de 2i N conocida 8 decreciente a 0artir del 0atrn de 2i N mediante dil*ciones s*cesi/as en reacti/o de cianmetahemoglobina E/ase tabla ;?. Reacti/o de Drabkin &ol*men Dil*cin 2b T*bo Emodi1icado? 1inal Eml? EgMl? EgMl?T Eml? ; 9+9 ;>: , ;+: ;+: 9 ;3, ., 9 ;+,+9 ;39 >D > -+: ,+: 9 ;3< ,> : 9+9 T El /alor de esta concentracin de0ender" del /alor indicado en la am0olla del 0atrn de 2i N %*e se em0lee en el Traba!o Pr"ctico. Patrn de re1erencia de 2i N Eml? )a concentracin de hemoglobina corres0ondiente a cada t*bo se determina a 0artir del grado de dil*cin 8 del /alor indicado en la am0olla del 0atrn de 2i N. @na /e# 0re0aradas las sol*ciones 0atrn+ se inicia la lect*ra a :>- nm del t*bo %*e contiene slo reacti/o Et*bo :? 8 se a!*sta la A E;--L de transmitancia?. )*ego+ 0artiendo de la sol*cin de 2i N m"s dil*ida Et*bo :? se leen las restantes sol*ciones 0atrn. Finalmente+ la relacin entre los /alores de A obtenidos 8 los corres0ondientes de concentracin de hemoglobina se re0resentan en *n gr"1ico con los /alores de A en las coordenadas 8 la concentracin de hemoglobina en las abscisas EFig. ,?.

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Causas de error en la determinacin de la concentracin de hemoglobina )a determinacin de hemoglobina est" sometida a 0osibles errores %*e deben ser tenidos en c*enta. Alg*nos de ellos obedecen a caractersticas 0ec*liares del es0cimen como la 0resencia de hi0erli0emia o le*citocitosis intensa E>:- B ;-=Ml?. No obstante+ la ma8ora de las /eces los errores se deben a de1ectos tcnicos en la mani0*lacin 8 el an"lisis del es0cimen. Errores en la obtencin del es0cimen de sangre3 ;. Errores de eBtraccin ,. Em0leo de anticoag*lantes no recomendados 9. oag*lacin 0arcial de la sangre Errores de la dil*cin3 ;. Em0leo de 0i0etas a*tom"ticas descalibradas * otras 0i0etas s*cias o hAmedas ,. No eliminacin del eBceso de sangre adherida a las 0aredes eBternas del ca0ilar antes de introd*cirlo en el reacti/o 9. Dil*cin incom0leta de la sangre en el reacti/o Errores de la trans1ormacin de la hemoglobina en 2i N3 ;. Em0leo de reacti/o de Drabkin mal 0re0arado o /encido ,. )ect*ra antes del tiem0o necesario 0ara la com0leta trans1ormacin de la 2b en 2i N Errores de la determinacin3 ;. Em0leo de instr*mentos no calibrados ,. *betas s*cias o deterioradas 9. 4ol*ciones t*rbias de 2i N Errores en la conser/acin del reacti/o3 ;. ongelacin del reacti/o+ lo %*e 0rod*ce trans1ormacin de 59 FeE N? < en 5> FeE N? < 8 *na oBidacin 0arcial de la 2b. ,. onser/acin del reacti/o en botellas de 0olietileno3 se 0ierden gr*0os N con 1ormacin eBcl*si/a de metahemoglobina+ en /e# de 2i N+ con lo %*e los /alores de concentracin de 2b obtenidos son in1eriores a los reales.

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Es0ectro de absorcin de la sol*cin de 2i N 8 del reacti/o *sado

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*r/a de calibracin elaborada a 0artir de *na sol*cin de cianmetahemoglobina de concentracin conocida.

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&elocidad de sedimentacin glob*lar


F@NDAMENT7 El test de /elocidad de sedimentacin glob*lar E&4'? mide la sedimentacin de eritrocitos en s* 0lasma nati/o. &4' es *n test no es0ec1ico %*e 0*ede ser *tili#ado 0ara detectar *n am0lio rango de en1ermedades 8 0ara monitorear el c*rso e/ol*ti/o de ciertas en1ermedades crnicas como los 0rocesos in1lamatorios crnicos Eartritis re*matoidea+ 0olimialgia re*m"tica 8 t*berc*losis? o la res0*esta a la tera0ia+ 0or e!em0lo con citost"ticos Een1ermedad de 2odgkin+ lin1omas 8 mieloma mAlti0le?. 4in embargo en ocasiones c*adros tan gra/es como neo0lasias 8 la cirrosis 0*eden 0resentar *na &4' normal. onstit*8e *no de los tests m"s *tili#ados como screening en el laboratorio clnico. 4e trata de *n mtodo sencillo 0ara reali#ar 8 %*e re%*iere e%*i0amiento sim0le. ME ANI4M7 El mecanismo 0or el c*al se 0rod*ce la eritrosedimentacin no est" com0letamente dil*cidado+ 0ero 0arece obedecer a interacciones electrost"ticas entre la s*0er1icie de los 'R 8 di/ersas 0rotenas del 0lasma %*e 1a/orecen E1ibringeno 8 glob*linas? o dismin*8en EalbAmina? la agregabilidad de estas cl*las. Desde el 0*nto de /ista 1sico+ este 1enmeno de0ende de los sig*ientes 1actores3 a. b. c. d. TamaCo de los ' Di1erencia de densidad entre los eritrocitos 8 el 0lasma+ &iscosidad del 0lasma. Tem0erat*ra.

Estos 1actores se hallan relacionados entre s a tra/s de la le8 de 4tokes si se considera al 'R como *na es1era s*s0endida en *n medio in1inito Erelacin entre la resistencia R %*e enc*entra *na 0artc*la es1rica de radio r al des0la#arse en el seno de *n 1l*ido de /iscosidad a *na /elocidad /3 R O </r )a sedimentacin oc*rre en 9 eta0as3 ;? *na eta0a en %*e se 0rod*ce la agl*tinacin de los 'R con 1ormacin de agregados en 1orma de W0ilas de monedasW+ ,? *n 0erodo d*rante el c*al los agregados de 'R sedimentan a /elocidad constante+ 8 9? *na eta0a 1inal donde la /elocidad de sedimentacin se enlentece al mismo tiem0o %*e los 'R se ac*m*lan en el 1ondo del reci0iente. )a eta0a m"s im0ortante es la 0rimera o de agl*tinacin+ 8a %*e de ella de0ender" la /elocidad de todo el 0roceso. As+ c*anto m"s 0e%*eCos sean los agregados+ m"s lentamente se 0rod*cir" la sedimentacin 8 /ice/ersa. Dado %*e+ como se mencion m"s arriba+ el test tambin est" in1l*enciado 0or la 1orma 8 el tamaCo de los 'R+ ste res*lta 0oco con1iable como *n ndice de en1ermedad en la anemia 1alci1orme o c*ando ha8 *na marcada 0oi%*ilocitosis.

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)a /elocidad de sedimentacin se incrementa 0or las altas concentraciones de 1ibringeno 8 otras 0rotenas de 1ase ag*da e inm*noglob*linas. )a albAmina retarda la &4'. El mecanismo 0or el c*al el 1ibringeno 8 las glob*linas 1acilitan la agl*tinacin de 'R no se conoce 1ehacientemente a*n%*e se cree %*e actAan dismin*8endo la 1*er#a de re0*lsin %*e normalmente eBiste entre 'R debido a s* carga s*0er1icial o 0otencial #eta. El 0otencial #eta es 0rod*cido 0or *na intensa carga negati/a a ni/el de la s*0er1icie de los 'R+ lo %*e eB0lica %*e estas cl*las se mantengan se0aradas. )a intensidad del 0otencial #eta de0ende en gran medida de la com0osicin 0roteica del 0lasma 8 es0ecialmente de la relacin entre las concentraciones de albAmina+ glob*linas 8 1ibringeno. As+ mientras la albAmina tiende a a*mentar el 0otencial #eta+ las glob*linas 8 sobre todo el 1ibringeno tienden a dismin*irlo. Ello obedece a %*e tanto el 1ibringeno como las glob*linas tienen *n ma8or 0eso molec*lar 8 *na con1ormacin menos es1rica %*e la albAmina+ lo %*e a*menta la constante dielctrica del 0lasma 8 red*ce el 0otencial #eta eritrocitario. )a dismin*cin del 0otencial #eta de los 'R tiene como consec*encia *na ma8or tendencia de stos a agregarse 8 1ormar las llamadas X0ilas de monedaY. De ac*erdo con este mecanismo+ el /alor normal de la &4' res*lta del e%*ilibrio entre las 0rinci0ales 0rotenas 0lasm"ticas. MET7D7)7'IA EBisten dos mtodos comAnmente *tili#ados 0ara medir la &4'3 el mtodo de Qestergren 8 el mtodo de Qintrobe. Ambos mtodos 0oseen limitaciones. El mtodo de Qestergren es menos sensible a 0e%*eCos a*mentos de los 1actores %*e ca*san la sedimentacin de los 'R 8 as 0*ede ser le/emente menos con1iable como *n 0rocedimiento de screening. El mtodo de Qintrobe+ 0or el otro lado+ 0*ede dar lect*ras ba!as incorrectas c*ando la &4' Qestergren es marcadamente ele/ada. Ambos mtodos son altamente sensiti/os a la relacin entre el 0lasma 8 los 'R en la m*estra+ 8 *n ba!o hematocrito ca*sa *n a*mento no es0ec1ico de la &4' 0robablemente acelerando la agregacin 8 red*ciendo las 1*er#as de 1riccin entre los agregados en sedimentacin. 4e trataron de a0licar 1actores de correccin 0ara anemias+ 0ero no res*ltaron con1iables. Tradicionalmente+ la &4' se ha determinado m"s 1rec*entemente 0or el mtodo de Qestergren %*e 1*e 0ro0*esto como mtodo de re1erencia 0or el International o*ncil 1or 4tandardi#ation in 2ematolog8 EI 42?. D*rante los Altimos aCos+ han a0arecido sistemas semia*tom"ticos 0ara medir la &4' %*e em0lean so0ortes es0eciales 8 0i0etas de material 0l"stico desechable. Estos sistemas+ a*n%*e re0rod*cen eBactamente el mtodo de Qestergren+ se di1erencian de ste 0or s* car"cter cerrado Erecogida de los es0ecmenes en t*bos al /aco %*e incor0oran *na cantidad 0recisa de anticoag*lante? 8 0or el em0leo de material com0lementario Ebombas as0irati/as? %*e a*mentan la ra0ide# 8 0recisin del llenado de las 0i0etas. MZT7D7 DE QE4TER'REN Es el mtodo de re1erencia 0ara medir la &4'. 4in embargo+ contin*a siendo *n mtodo 0oco re0rod*cible 8 sometido a di/ersas /ariables di1ciles de controlar+ como es la necesidad de 0redil*ir la sangre.

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A. MATERIA)E4. A.1 Anticoagulante itrato trisdico ;-= mM en sol*cin ac*osa. 4i *tili#a citrato trisdico dihidratado ENa9 <2:7..,2,7? 0re0are *na sol*cin ac*osa de 9,+-D gMl. A.2 &ubo de sedimentacin 4e *tili#an t*bos de /idrio es0ecialmente diseCados de *na longit*d de 9-- J ;.: mm 8 de *n di"metro de ,.:: J -.;: mm. El di"metro del t*bo debe ser *ni1orme EJ -.-: mm? todo a lo largo del t*bo 8 ste debe 0oseer *na escala grad*ada con eBactit*d en mm n*merada de ,-- mm en el 1ondo hasta - mm. )os t*bos estandari#ados %*e c*m0len las es0eci1icaciones de I 42 deben a0robados 0or omits de Estandari#acin en los di1erentes 0ases. )os t*bos deben ser c*idadosamente lim0iados en acetona6ag*a. No se recomienda el *so de detergentes o dicromatos 0ara la lim0ie#a. T*bos 0l"sticos descartables3 4e 1abrican t*bos 0l"sticos descartables segAn las es0eci1icaciones+ los c*ales son 0ro/istos lim0ios 8 secos 0or el 1abricante. Alg*nos 0l"sticos res*ltan inadec*ados 0*es *nen 'R siendo as m"s s*sce0tibles a los 0roblemas de ta0onamiento. 7tros t*bos 0l"sticos se man*1act*ran rec*biertos de agentes %*e eliminan hongos o contienen com0onentes %*e interact*an con la sangre. A. 'radillas )as gradillas o dis0ositi/os de sostn est"n diseCados 0ara sostener los t*bos en *na 0osicin /ertical inm/il. @n dis0ositi/o de b*rb*!a ni/eladora debe 1ormar 0arte integral de la gradilla 0ara aseg*rar %*e la 0osicin de los t*bos sea /ertical dentro de *n lmite de ;. )a misma debe estar constr*ida de modo tal %*e no eBistan 0rdidas de sangre c*ando el t*bo est" colocado en ella. $. TZ NI A $? )a sangre se obtiene 0or 0*ncin /enosa+ e/itando contaminacin con materiales *tili#ados 0ara la higiene de la 0iel. )a sangre se agrega en 0ro0orcin de > &ol de sangre a ; &ol de sol*cin de citrato de sodio+ 0or e!em0lo , ml de sangre en -+: ml de anticoag*lante. El test debe ser reali#ado dentro de las , hs si la sangre es mantenida a tem0erat*ra ambiente+ o dentro de las < hs. si es mantenida a > . ? 4i la sangre citratada se e%*ilibra a tem0erat*ra ambiente+ se me#cla 0or in/ersin re0etidas /eces+ 8 se s*merge *n t*bo de Qestergren en la m*estra de!ando %*e la sangre ascienda 0or ca0ilaridad. El ni/el de la sangre se a!*sta a cero. D? El t*bo es colocado en la gradilla en 0osicin estrictamente /ertical a tem0erat*ra ambiente E;D6,: ?+ sin eB0osicin a la l*# del sol directa+ libre de /ibraciones 8 corrientes de aire+ mantenindolo eBactamente <- min.

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E? @na /e# transc*rrido el tiem0o+ se lee la distancia entre la s*0er1icie del menisco de la col*mna eritrocitaria 8 la 0arte s*0erior de la col*mna de sangre sit*ada a ni/el de la marca cero de la escala grad*ada. El /alor de esta distancia+ eB0resado en mm+ corres0onde al de la &4' d*rante la 0rimera hora EmmMhora?. . &A)7RE4 DE REFEREN IA EDAD EaCos? NiCos ma8ores 8 !/enes 2ombres ad*ltos M*!eres ad*ltas -6;: ;.6::;6<<;6.;.6::;6<<;6.U J , DE : J ;>J9 <J9 <J> <J9 =J: ;- J : )mite s*0erior de la normalidad ;: ;;, ;> ;, ;= ,-

(actores tcnicos capaces de modi)icar la *+' a*sas de a*mento Des/iacin de /erticalidad de la 0i0eta Incremento de la longit*d 8 el di"metro de la 0i0eta Ele/acin de la tem0erat*ra ambiente Dil*cin de la sangre a*sas de dismin*cin3 Red*ccin del di"metro de la 0i0eta @tili#acin tarda de la sangre Ees0ecimen en/e!ecido? ambio de anticoag*lante

D. INTERPRETA I7N DE RE4@)TAD74 )os /alores de re1erencia de la &4' se eB0resan eBcl*si/amente en mmMh 8 /aran 1*ndamentalmente con el seBo 8 en cierto grado tambin con la edad E/er /alores de re1erencia?+ el ciclo menstr*al+ 8 las medicaciones Ecorticosteroides+ contraconce0ti/os orales+ etc.? )a &4' no 0arece estar in1l*enciada 0or las ingestas o 0or los ritmos circadianos. )as determinaciones de la &4' a la seg*nda hora o a las ,> hs+ m*8 *tili#adas anteriormente+ han demostrado ser 0oco 1iables 8 de escasa signi1icacin clnica+ 0or lo %*e no se recomienda s* em0leo. EBisten n*merosas 0atologas con alteraciones 0roteicas del 0lasma %*e c*rsan con modi1icaciones del /alor de &4'. 4e obser/an a*mentos de &4' en *n am0lio es0ectro de en1ermedades 0rinci0almente relacionadas a las 0rotenas de 1ase ag*da+ 8 tambin en el embara#o normal 8 el 0*er0erio. @n ;-L de los niCos normales tambin 0resentan &4' a*mentadas. ,>

)a &4' es es0ecialmente ba!a E-6; mm? en la 0olicitemia+ anormalidades de 'R Ehemoglobino0atas+ es1erocitosis hereditaria+ anemia 1alci1orme+ etc.?+ hi0o1ibrinogenemia+ de1ectos cardacos congesti/os+ 8 ocasionalmente sin ca*sa a0arente. Adem"s de estas condiciones %*e 0*eden tender a oc*ltar *na alta &4'+ es in*s*al obtener 1alsos negati/os+ 0or ende+ *n /alor normal de &4' generalmente aseg*ra %*e no eBiste en1ermedad org"nica.

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Rec*ento de retic*locitos
)os retic*locitos+ eritrocitos inmad*ros+ eBisten en la sangre en *na 0ro0orcin de cinco a die# 0or mil hemates. 4* tamaCo es el de los dem"s hemates 8 se caracteri#a 0or contener *na 0e%*eCa cantidad de ARN Eribosomas? 1ormando *n retc*lo gran*lo1ilamentoso obser/able al ser teCido con colorantes llamados /itales como son el a#*l brillante de cresilo o el a#*l de metileno n*e/o. )a cantidad de ARN es tanto menor c*anto m"s mad*ra es la cl*la. El rec*ento de retic*locitos es la tcnica m"s sim0le act*almente dis0onible 0ara /alorar la acti/idad eritro0o8tica de la md*la sea. *ando *na anemia se acom0aCa de *n ele/ado nAmero de retic*locitos circ*lantes Eretic*locitosis? se considera regenerati/a+ mientras %*e c*ando el nAmero es normal o dismin*ido se denomina arregenerati/a. En condiciones normales+ los retic*locitos 0ermanecen en la md*la d*rante ,69 das 8 terminan s* mad*racin en ,> horas+ a0roBimadamente+ *na /e# 8a en la sangre 0eri1rica. El rec*ento de retic*locitos debe reali#arse a 0artir de sangre total con anticoag*lante EEDTA?8 a ser 0osible+ dentro de las ,> 0rimeras horas de la eBtraccin c*ando la sangre se conser/a a tem0erat*ra ambiente. 4i se mantiene a >P + el rec*ento 0*ede reali#arse hasta >D horas des0*s de la eBtraccin. El rec*ento 0*ede e1ect*arse 0or dos 0rocedimientos3 ;. Tincin /ital 8 microsco0io 0tico. ,. itometra de 1l*!o. El mtodo man*al adolece de m*8 escasa 1iabilidad Ecoe1icientes de /ariacin [,-L?+ lo %*e limita s* em0leo 0ara /alorar la ca0acidad de res0*esta med*lar 1rente a tera0*ticas agresi/as+ 0ero sobretodo a los errores de ndole s*b!eti/a debidos al di1erente criterio %*e cada obser/ador tiene de lo %*e es *n retic*locito. MZT7D7 DE )A TIN INN &ITA) EMZT7D7 DE REFEREN IA? Este mtodo *sa como colorante el a#*l de metileno n*e/o3 ; g cada ;-- ml de sol*cin citratada E; /ol de citrato de sodio 9- gM) 8 > /ol de lNa = gM)?. Mediante *na 0i0eta Paste*r se aCaden a *n t*bo de hemlisis tres gotas de sol*cin colorante 8 tres gotas de sangre total bien homogenei#ada. En caso de /alores m*8 ba!os de hematocrito debe colocarse doble cantidad de sangre total %*e de sol*cin colorante. )a s*s0ensin sangreMcolorante se agita s*a/emente 8 se de!a a tem0erat*ra ambiente d*rante cinco min*tos. Transc*rrido este tiem0o+ se toma *na 0e%*eCa gota de la s*s0ensin 8 se eBtiende sobre *n 0ortaob!etos.+ *na /e# seca se 0*ede obser/ar al microsco0io con ob!eti/o de inmersin EB;---?. Es necesario reali#ar el rec*ento sobre *n mnimo de ;--- eritrocitos. El rec*ento se e1ectAa contando en donde los eritrocitos estn distrib*idos homogneamente. 4e c*entan tantos cam0os como sean necesarios 0ara alcan#ar la ci1ra de eritrocitos ,<

re%*erida+ siendo ;--6;,: el nAmero 0timo de hemates 0or cam0o de los c*ales disting*imos c*ales son retic*locitos 0ara l*ego eB0resar el res*ltado como 0orcenta!e+ siendo el cien 0orciento el nAmero total de hemates contado. Este /alor ser" /alido si se trata de *na concentracin normal de eritrocitos en sangre total. Por ello+ c*ando dismin*8e el nAmero de eritrocitos como s*ele s*ceder en la anemia+ el /alor 0orcent*al debe corregirse segAn el hematocrito em0leando la sig*iente 1rm*la3
Retic*locitos corregidos EL? O retic*locitos obser/ados EL? B 2to del 0aciente 2to normal

EEl hematocrito normal es el %*e le corres0onde segAn edad 8 seBo?. En caso de anemia intensa+ el nAmero de retic*locitos circ*lantes s*ele ser s*0erior al %*e corres0onde al grado de regeneracin eritrobl"stica. Ello obedece a %*e la anemia se acom0aCa siem0re de *n estm*lo eritro0o8tico com0ensador+ %*e 1acilita *na salida 0reco# de retic*locitos desde la md*la a la sangre 0eri1rica+ 8 *n acortamiento de s* 0erodo de mad*racin intramed*lar+ lo %*e s*0one *n a*mento del 0erodo de mad*racin 0eri1rica. Este 1enmeno se caracteri#a 0or la a0aricin en el eBamen mor1olgico de la eBtensin de sangre de eritrocitos grandes Emacrocitos? 8 tonalidad a#*lada E0olicromasia? EBiste *na relacin in/ersa+ a0roBimadamente lineal+ entre el hematocrito 8 el 0erodo de mad*racin 0eri1rica de los retic*locitos. De esta 1orma 0*ede calc*larse otra magnit*d de inters clnico denominada ndice de 0rod*ccin retic*locitaria EIPR? a0licando la 1rm*la sig*iente3 IPR O Retic*locitos del 0aciente B 2to del 0aciente Perodo de mad*racin en das B 2to normal

@n IPR [9 indica a*mento de acti/idad eritro0o8tica med*lar Eanemia regenerati/a?+ mientras %*e *n IPR \, indica escasa acti/idad eritro0o8tica Eanemia arregenerati/a? Relacin entre la res0*esta retic*locitaria 8 el grado de anemia 2ematocrito -+>: -+>- -+9: -+9- -+,: -+,- -+;: Ni/eles de 2emoglobina EgM)? ;:- ;99 ;;. ;;- D9 << :Rec*ento de retic*locitos EL? ; , : ;- ;: ,- 9Rec*ento de retic*locitos ; ;+D > . D+9 = ;corregido EL? Tiem0o de mad*racin estimado 9 ; da , da das ]ndice de retic*locitos ; , : : .+: ;- ;7TRA TE NI A @tili#a como colorante A#*l $rillante de resilo en ig*ales 0ro0orciones a las indicadas en el mtodo de re1erencia. )a me#cla sangreMcolorante se inc*bar" d*rante ;: min*tos a 9.P . )*ego de este tiem0o se reali#ar" el eBtendido 8 se reali#a el rec*ento como se indic antes.

,.

RE @ENT7 A@T7MATIGAD7 Estos e%*i0os reali#an *n rec*ento m*8 1iable de retic*locitos a 0artir de sangre total. En los e%*i0os semia*tom"ticos la sangre es 0re/iamente inc*bada con el 1l*orocromo+ mientras %*e en los totalmente a*tomati#ados no es necesaria esta inc*bacin 0re/ia 8 el an"lisis se reali#a directamente. El 1*ndamento de estos a*toanali#adores es la s*stit*cin del criterio mor1olgico inherente al mtodo /is*al 0or el an"lisis c*antitati/o del contenido eritrocitario en ARN mediante citometra de 1l*!o 8 l*# l"ser. Para la tincin del ARN se em0lean 1l*orocromos %*e 0*eden ser de dos ti0os3 naran!a de tia#ol o A*ramina. &A)7RE4 DE REFEREN IA &alor relati/o EL? 9+,6<+- E>6;= aCos? -+,6,+, -+,6 ,+: -+:6,+D &alor absol*to EB;-= M)? ;;-699-? ,:6D= ,:6D< 9,6=.

Recin nacido Esangre de cordn? NiCos 8 ad*ltos !/enes de > a ;= aCos Ad*ltos E,-6:- aCos? M*!eres 2ombres

*ariaciones patolgicas Dismin*cin de la ci1ra de retic*locitos Eretic*locito0enia? A0lasia med*lar Anemias carenciales intensas Emegalobl"stica 8 1erro0nica? Anemias in1lamatorias A*mento de la ci1ra de retic*locitos Eretic*locitosis? Perodo neonatal Anemias hemolticas Anemias 0osthemorr"gicas Anemias carenciales en 1ase de tratamiento Mielo0tisis Ein1iltracin neo0l"sica en la md*la sea? Mielo1ibrosis idio0"tica

,D

*anti1icacin de hierro srico

Fer-color Transferrina
Mtodo colorimtrico para la determinacin de la Capacidad Total de Fijacin de Hierro (Transferrina) del suero SIGNIFICACION CLINICA En el organismo humano, el hierro circula como Fe (III) unido a una protena transportadora especfica: la transferrina o siderofilina. Su funcin es captar el hierro de los sitios de absorcin (mucosa intestinal) o depsito (sistema retculo endotelial) y llevarlo a los rganos hematopoyticos donde es utilizado. En el individuo normal slo la tercera parte de la transferan se satura con hierro, estando el resto libre para unir y vehiculizar cualquier eventual aporte. La actividad fisiolgica de la transferrina se puede determinar eficazmente midiendo la capacidad total de fijacin de hierro (TIBC). La TIBC se encuentra aumentada en anemias post-hemorrgicas, y ferropnicas en general, en insuficiencias hepticas y fisiolgicamente en los ltimos meses del embarazo. Disminuye en cambio en la hemocromatosis, en ciertas anemias con disproteinemia (infecciosas, neoplsicas, nefropticas, etc.) en las hepatopatas crnicas, y en las grandes prdidas proteicas del sndrome nefrtico. FUNDAMENTOS DEL METODO La transferrina o protena transportadora especfica del hierro, se determina por su actividad fisiolgica de captar Fe (III) a pH mayor que 7,2 donde la transferrina se satura en presencia de Fe (III) en exceso. El remanente de Fe (III) no ligado se elimina totalmente por coprecipitacin con carbonato de magnesio. El hierro unido a la transferrina se libera y determina colorimtricamente segn la tcnica de Fer-color o Fer-color AA. La cantidad de Transferrina se expresa como los microgramos de Fe (III) con que est saturada. REACTIVOS PROVISTOS Solucin sa uran e! solucin estabilizada de Fe (III). A"sor#en e! carbonato de magnesio granulado. REACTIVOS NO PROVISTOS - Fer-color o Fer-color AA provistos separadamente por Wiener lab. - Agua destilada. INSTRUCCIONES PARA SU USO Solucin sa uran e! lista para usar. A"sor#en e! listo para usar. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". ESTA$ILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. A"sor#en e! el frasco debe volver a taparse inmediatamente despus de retirar las porciones necesarias para el momento. INDICIOS DE INESTA$ILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. MUESTRA Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. MATERIAL RE%UERIDO (no provisto) - Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. - Tubos de Kahn. CONDICIONES DE REACCION Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. PROCEDIMIENTO a& Sa uracin "e la rans'errina! en un tubo de Kahn colocar 500 ul de suero y 500 ul de Solucin saturante. Mezclar y dejar 5 minutos a 37oC. Con el dosificador provisto agregar el contenido de una medida al ras de Adsorbente. Tapar y agitar 5 minutos a temperatura ambiente. La agitacin deber ser vigorosa y en sentido longitudinal.

,=

Centrifugar 10-15 minutos a 3.000-4.000 r.p.m. hasta obtener sobrenadante lmpido o con la opalescencia propia del suero. #& Colori(e r)a! seguir el procedimiento indicado en el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA. ESTA$ILIDAD DE LA ME*CLA DE REACCION FINAL Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fercolor AA de Wiener lab. CALCULO DE LOS RESULTADOS Corregir las lecturas y efectuar los clculos de la misma manera que en la determinacin de hierro srico, multiplicando por dos el resultado final, por la dilucin del suero. Habitualmente se realiza la determinacin de hierro srico juntamente con la de transferrina. En ese caso se informan tres valores: Hierro Srico, Transferrina y Porcentaje de Saturacin de la Transferrina, que se calcula de la siguiente manera: Saturacin % = Hierro srico (ug/dl) Transferan (ug/dl) x 100

Si se desea efectuar simultneamente la determinacin de hierro srico para el clculo del Porcentaje de Saturacin, comenzar con la Saturacin de la Transferrina 30 minutos antes. VALORES DE REFERENCIA La literatura registra los siguientes rangos de valores para Transferrina y Saturacin de la Transferrina en personas normales: Transferrina (TIBC): 250-400 ug/dl. Saturacin de la Transferrina: 20-55%. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. La agitacin insuficiente producir valores falsamente aumentados de Transferrina. La concentracin de Fe (III) de la Solucin saturante es 10 veces mayor que la del Standard. Por lo tanto, no debe medirse este reactivo con la misma micropipeta que se utilice para el Standard y los Desconocidos. Caso contrario se introducen fuertes contaminaciones que invalidan los resultados. Adems, como la medida exacta de esta solucin no es crtica, puede usarse para tal fin una pipeta de 1 ml. PERFORMANCE Re+ro"uci#ili"a"! procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da se obtuvieron los siguientes datos: Nivel 280 ug/dl 560 ug/dl D.S. +2 !2 ug/dl +28!" ug/dl C.V. 8!2"# 5!$6#

PRESENTACION Reactivos auxiliares para 25 determinaciones de la Capacidad Total de Fijacin de Hierro (Transferrina) (Cd. 1492002). $I$LIOGRAFIA - Dixon, K. - Ann. Clin. Biochem. 10/5:127 (1973). - I.C.S.H. - Am. J. Clin. Path. 56/4:543 (1971). - Zak, B.; Baginski, E.S.; Epstein, E. y Wiener, L.M.- Clin. Toxicol. 4/4:621 (1971). - Rojkn, M.; Olgun de Mariani, M.; Drappo, G. y Albarracn, A. - III Congreso Argentino de Bioqumica - Buenos Aires (1975). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

,iener la#2000 Rosario - Argentina


Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Inscripto M.S. Disp. N: 1287/77 - 220/00

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Fer-color
Mtodo colorimtrico para la determinacin de hierro srico sin desproteinizacin SIGNIFICACI.N CLINICA El hierro se encuentra en el organismo localizado en su mayor parte en el interior celular y particularmente en los eritrocitos, formando parte de la hemoglobina. La mioglobina, pigmento ms importante de las clulas musculares, contiene hierro en su grupo hemo, y una notable cantidad de este elemento se encuentra depositado en las clulas del sistema reticuloendotelial de hgado, bazo, mdula sea y parnquima heptico. Los niveles de hierro circulantes son relativamente bajos y dependen de numerosas variables (fluctuaciones diurnas, edad, sexo, hbitos alimenticios y actividad eritropoytica). La anemia por prdida de hierro representa uno de los trastornos orgnicos ms frecuentemente encontrados en la clnica mdica. Ocurre con frecuencia en mujeres, particularmente durante el embarazo debido a los requerimientos del feto. La otra causa ms comn de anemia ferropnica, es la prdida de sangre a travs del tracto gastrointestinal, a veces imperceptible, debida a hernia de hiato, lceras gstricas o duodenales, y carcinomas de estmago y colon. Por el contrario existen situaciones que conducen a hiperferremia. A veces se asocian a terapia transfusional, y otras veces a desrdenes caracterizados por una sntesis defectuosa de hemoglobina o fenmenos hemolticos. FUNDAMENTOS DEL METODO El hierro srico se libera de su unin con su protena transportadora especfica, la transferrina, en buffer succinato de pH 3,7 y en presencia de un reductor, el cido mercaptoactico. Posteriormente reacciona con el reactivo de color, piridil bis-fenil triazina sulfonato (PBTS) dando un complejo color magenta, que se mide a 560 nm. REACTIVOS PROVISTOS Reac i/o P$TS! solucin estabilizada de piridil bis-fenil triazina sulfonato 50 mmol/l. S an"ar"! solucin de iones Fe (III) equivalente a 100 ug/dl. $u''er succina o! solucin de succinato 0,25 mol/l para pH 3,7. Re"uc or! ampolla autorrompible conteniendo cido mercaptoactico al 70 %. REACTIVOS NO PROVISTOS Agua destilada. INSTRUCCIONES PARA SU USO Reac i/o P$TS! listo para usar. S an"ar"! listo para usar. $u''er0Re"uc or! transferir el contenido de la ampolla del Reductor al Buffer succinato, vertindolo directamente en el frasco de Buffer y mezclando por inversin. Anotar en el rtulo la fecha de preparacin. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". ESTA$ILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reac i/os Pro/is os! son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. $u''er0Re"uc or! en refrigerador (2-10oC) es estable durante un ao a partir de la fecha de su preparacin. Antes de usar llevar a 18-30oC. INDICIOS DE INESTA$ILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Variaciones en las lecturas de Blancos de Reactivos y/o Standard, indican contaminaciones ocasionales (agua, material de vidrio, etc.). Un aumento en el valor de los Blancos indicar una contaminacin con hierro. MUESTRA Suero a& Recoleccin! debe usarse nicamente suero ya que los anticoagulantes interfieren en la reaccin. El paciente debe estar en ayunas y las extracciones deben practicarse siempre a la misma hora (preferentemente de maana) ya que las fluctuaciones fisiolgicas son significativas durante el da. #& A"i i/os! no se requieren. c& Sus ancias in er'eren es conoci"as! no se observa interferencia por hemoglobina hasta 70 mg/dl, hiperlipemia, iones Cu hasta 200 ug/dl y bilirrubina hasta 400 mg/dl. Si bien hemlisis ligeras no interfieren con este mtodo, el International Committee for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda el uso de suero libre de hemlisis. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. "& Es a#ili"a" e ins rucciones "e al(acena(ien o! el suero puede conservarse hasta una semana en refrigerador (2-10oC). MATERIAL RE%UERIDO (no provisto)

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- Espectrofotmetro o fotocolormetro. - Micropipetas y pipetas para medir los volmenes indicados. - Tubos de fotocolormetro. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO - Valores de Blanco aceptables: la determinacin de oligoelementos implica prevenir celosamente las posibles contaminaciones del agua y los reactivos. El Blanco de Reactivos, ejecutado de acuerdo al Manual de Instrucciones, no debe ser superior a 0,150 D.O. debiendo ser adems, despreciable la contribucin del agua en dicho Blanco. Para controlar esto ltimo, se recomienda leer un Blanco de Reactivos (2 ml de Buffer/Reductor + 0,5 ml de agua + 1 gota de PBTS) contra un Blanco de Buffer (2,5 ml de Buffer/Reductor + 1 gota de PBTS): la lectura del Blanco de Reactivos debe ser menor o igual que la del Blanco de Buffer. Caso contrario, reemplazar el agua destilada en uso por una de calidad comprobada (conductividad menor de 0,02 uOhms). Por otra parte, si la lectura del Blanco de Buffer es superior a 0,150 D.O. es indicio de contaminacin grosera de los reactivos, los cuales debern desecharse. Efectuar este control peridicamente. - Mezclado: los tubos pueden ser mezclados con la varilla o por agitacin suave. No invertir para evitar contaminaciones. - Limpieza del material: todo el material de laboratorio empleado debe estar libre de hierro, para lo cual debe ser sumergido durante 6 horas en HCl p.a. 10-15%, eliminando la acidez con numerosos lavados con agua libre de hierro. Secar el material preferentemente a no ms de 80C en cestillas de acero inoxidable o revestidos con plsticos. Todo el material debe ser empleado exclusivamente para la determinacin de hierro. PERFORMANCE a& Re+ro"uci#ili"a"! procesando la misma muestra en 10 das diferentes, se obtuvo un coeficiente de variacin del 4,2%, para un nivel de Fe srico de 129 ug/dl. #& Recu+eracin! agregando cantidades conocidas de Fe (II) a alcuotas de un mismo suero, se recuper entre 90 y 103%. c& Lineali"a"! la reaccin es lineal hasta 500 ug/dl. PRESENTACION Equipo para 100 determinaciones (Cd. 1492001). $I$LIOGRAFIA - Dixon, K. - Ann. Clin. Biochem. 10/5:127 (1973). - I.C.S.H. - Am. J. Clin. Path. 56/4:543 (1971). - Zak, B.; Baginski, E.S.; Epstein, E. y Wiener, L.M.- Clin. Toxicol. 4/4:621 (1971). - Rojkn, M. L.; Olgun de Mariani, M. C.; Drappo, G. A. Y Albarracn, A. - III Congreso Argentino de Bioqumica Buenos Aires (1975). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990. CONDICIONES DE REACCION - Longitud de onda: 560 nm en espectrofotmetro o 540-560 nm en fotocolormetro con filtro verde. - Temperatura de reaccin: temperatura ambiente - Tiempo de reaccin: 10 minutos - Volumen de muestra: 500 ul - Volumen total de reaccin: 2,5 ml PROCEDIMIENTO En tres tubos de fotocolormetro marcados B (Blanco de Reactivos), S (Standard) y D (Desconocido) colocar: B Agua bidestilada Standard Suero Bfer/reductor 500 ul 2 ml S 500 ul 2 ml D 500 ul 2m

Mezclar. Leer la absorbancia del tubo D (Blanco de Suero BS) en espectrofotmetro a 560 nm o en fotocolormetro con filtro verde (540-560 nm) llevando a cero el aparato con agua. Agregar, manteniendo el frasco gotero en posicin vertical, 1 gota de Reactivo PBTS a cada tubo. Mezclar inmediatamente cada tubo y leer todos los tubos a 560 nm entre 6 y 20 minutos, llevando el aparato a cero con agua. ESTA$ILIDAD DE LA ME*CLA DE REACCION FINAL Los tubos deben ser ledos entre 6 y 20 minutos luego de completados los pasos del procedimiento. CALCULO DE LOS RESULTADOS Corregir las lecturas de S y D, restndoles los Blancos correspondientes: S - B = S corregida D - (B + BS) = D corregida Fe (ug/dl) = D corregida x f

9,

Donde: f = METODO DE CO T!O" DE C#"$D#D Standatrol S-E 2 niveles.

100 ug/dl S o!!eg"d#

VALORES DE REFERENCIA En un grupo de 20 mujeres y 20 varones sanos, con edades oscilando entre los 18 y 51 aos, se hall un rango de 60 a 160 ug/dl con los siguiente promedios: Varones: 114,6 ug/dl Mujeres: 103,3 ug/dl Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

,iener la#2000 Rosario - Argentina


Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Inscripto M.S. Disp. N: 1287/77 - 198/00

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Tincin histo%*mica de hierro3 coloracin de Perls


)a coloracin de Perls 0one de mani1iesto la 0resencia de hemosiderina en el cito0lasma ti0o de cl*la 0*diendo ser a0licada a las cl*las 0resentes en *n 1rotis o eBtensin de sangre o md*la sea. )a hemosiderina es *n deri/ado insol*ble de la 1erritina+ %*e se considera el res*ltado de la 0reci0itacin de /arias molc*las desnat*rali#adas de a0o1erritina. Normalmente+ constit*8e el hierro no hemnico de los eritroblastos 8 0*ede hallarse ab*ndantemente en las cl*las del sistema monon*clear 1agoctico. MATERIA) ;. Frotis de la md*la sea bien eBtendidos en 0ortaob!etos totalmente libres de hierro. ,. 4ol*cin clorhdrica de 1errician*ro 0ot"sico. Debe 0re0ararse eBtem0or"neamente me#clando dos /olAmenes ig*ales de *na sol*cin ac*osa de 1errician*ro 0ot"sico al ,L en ag*a destilada E,-gM)? 8 otra en 2 l -., N d*rante ;- min*tos a tem0erat*ra ambienteE,>P ?. 9. 4ol*cin de contraste eosina E; gM) de 2,7? o sa1raninaE; gM) de 2,7. >. Microsco0io 0tico. MET7D7 ;. 1i!ar los 1rotis en /a0ores de 1ormol d*rante 9- min*tos Ealgodn em0a0ado de 1ormol en el 1ondo de *n /aso de o0lin?. ,. Introd*cir los 1rotis 1i!ados en la sol*cin clorhdrica d*rante ; hora a tem0erat*ra ambiente. 9. )a/ar los 1rotis coloc"ndolos en la sol*cin de contraste d*rante 9- min*tos. INTERPRETA I7N ^ E&A)@A INN DE RE4@)TAD74 )a hemosiderina teCida mediante la tincin de Perls a0arece ba!o la 1orma de gr"n*los de intenso color a#*l+ %*e se obser/an normalmente a ni/el de las #onas de ab*ndantes macr1agos. )a tincin de Perls 0ermite /alorar tambin el hierro no hemnico 0resente en el cito0lasma de los eritroblastos 8 determinar el nAmero de los %*e 0resenten *no o m"s gr"n*los de hemosiderina Esideroblastos?. 4e han establecido scores 0ara la semic*anti1icacin de la reaccin. MEDI INN DE )A FRA'I)IDAD 74MNTI A )a )ragilidad osmtica mide el grado de resistencia de los glb*los ro!os a la lisis en 1*ncin de la dismin*cin de la concentracin de lNa en el medio. Re1le!a la habilidad de la eritrocitos 0ara ca0tar ag*a sin lisar. Este test ha sido m*8 *sado eB0erimentalmente como medida de la /iabilidad del glb*lo ro!o 8 clnicamente con 1ines diagnsticos. )a 1ragilidad osmtica se /e a*mentada en anemias hemolticas+ como la es1erocitosis hereditaria+ l*ego del tratamiento con drogas+ como la indometacinaK mientras %*e se /e dismin*ida en la anemia con cl*las 4 Esickle cells?+ anemias 0or de1iciencia de hierro 8 talasemias.

9>

En este test se mide la ca0acidad de de1ormacin o elasticidad de la membrana del glb*lo ro!o+ la c*al es im0rescindible 0ara %*e el eritrocito 0*eda circ*lar libremente+ 1*ndamentalmente a tra/s de los ca0ilares es0lnicos. 4i 0or alg*na alteracin del citoes%*eleto+ la membrana del glb*lo ro!o 0ierde s* ca0acidad de de1ormacin + el mismo es %*itado de circ*lacin. 4i se 0rod*ce *n desbalance en el e%*ilibrio entre la 0rod*ccin de eritrocitos 0or la md*la sea 8 s* eliminacin es0lnica+ nos encontraremos ante la 0resencia de *na anemia hemoltica debida+ 0osiblemente+ a alg*na alteracin de las 0rotenas del citoes%*eleto de la membrana eritrocitaria. Este test es 0or lo tanto+ indicador del estado de la membrana eritrocitaria. )a 1ragilidad osmtica+ mide el grado de resistencia de los glb*los ro!os a la lisis en 1*ncin de la dismin*cin de la concentracin de lNa en el medio. El grado de hemlisis es determinado midiendo la hemoglobina liberada a 0artir de las cl*las. )as /ariaciones en la 1ragilidad osmtica son de1inidas como cambios en las c*r/as de hemlisis 8 son establecidos 0or determinacin de la R lNaS %*e 0rod*ce el :-L de hemlisis. )a 1orma de la c*r/a %*e m*estra el grado de hemlisis en 1*ncin de la R lNaS s*giere %*e sta 0*ede ser el res*ltado de la distrib*cin de las 0oblaciones de 'R+ di1erenciadas de ac*erdo a la resistencia de s* membrana. Para reali#ar la medicin+ se deben me#clar :- l de sangre con : ml de sol*ciones con di1erentes concentraciones de lNa 3 ;-+-K =+-K D+-K .+-K <+-K :+-K >+:K >+-K 9+-K ,+- 8 ;+gM). )as dil*ciones se reali#an 0or d*0licado. 4e centri1*gan+ l*ego de me#clar 0or in/ersin+ a ,:-- r0m 0or ;: min*tos 8 se reali#an lect*ras de los sobrenadantes a :>nm. )a sol*cin de ;-+- gM) es *sada como blanco. Para 0re0arar las sol*ciones de dil*ciones de la misma. lNa se 0arte de *na sol*cin ;- gM) 8 se reali#an

)a concentracin de lNa %*e 0rod*ce el :- L de hemlisis 0*ede ser determinada calc*lando el L de hemlisis segAn la sig*iente ec*acin3 L de hemlisis O ED7s 6D7bl? B ;--M D7o donde3 D7sO densidad 0tica del sobrenadante D7blO densidad 0tica del blanco D7oO densidad 0tica de la sol*cin de ; gM) de lNa. )*ego se gra1ican las c*r/as de L de hemlisis /s. R lNaS 8 de las mismas se eBtrae el /alor de R lNaS %*e 0rod*ce el :-L de hemlisis.

9:

%D&-'
AA
Mtodo %& optimizado ('F(C) para la determinacin de lactato deshidro)enasa ("DH) en suero o plasma SIGNIFICACION CLINICA La determinacin de la actividad de lactato deshidrogenada (LDH) en suero, tiene una gran variedad de aplicaciones clnicas. En el caso del infarto agudo de miocardio (IAM), la actividad de LDH total (junto con las de CK y GOT) constituye un elemento importante de diagnstico. La misma comienza a aumentar de 12 a 24 horas despus de producido el infarto; alcanza un pico entre las 48 - 72 horas y permanece elevada hasta el sptimo o dcimo da. Por otra parte, tambin se registra un aumento de la actividad de LDH total en pacientes con necrosis heptica (producida por agentes txicos o por infecciones agudas como la hepatitis viral) e incluso acompaando a necrosis tubular renal, pielonefritis. FUNDAMENTOS DEL METODO Basado en el siguiente esquema de reaccin: %D& Piiruvato + NADH + H+ L-lactato + NAD+

Las concentraciones del ensayo estn optimizadas de acuerdo a la Sociedad Francesa de Biologa Clnica (SFBC). REACTIVOS PROVISTOS $u''er! solucin de buffer Tris, pH 7,2 conteniendo piruvato y cloruro de sodio. Sus ra o! viales conteniendo NADH. Concen raciones 'inales (segn SFBC) Tris ............................................................... 80 mM, pH 7,2 Piruvato ............................................................... 1,6 mmol/l NADH .................................................................. 0,2 mmol/l ClNa .................................................................... 200 mmol/l INSTRUCCIONES PARA SU USO $u''er! listo para usar. Sus ra o! agregar el volumen de Buffer indicado en el rtulo a un vial de Sustrato. Tapar y agitar suavemente por inversin hasta disolucin completa. Fechar. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". ESTA$ILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reac i/os Pro/is os! son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Sus ra o recons i ui"o! estable 21 das en refrigerador (2-10 oC) o 3 das a temperatura ambiente a partir del momento de su reconstitucin. INDICIOS DE INESTA$ILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Cuando el espectrofotmetro ha sido llevado a cero con agua destilada, lecturas de absorbancia del Sustrato reconstituido inferiores a 0,800 D.O. o superiores a 1,800 D.O. (a 340 nm) son indicio de deterioro del mismo. MUESTRA Suero o plasma a& Recoleccin! se debe obtener suero de la manera usual y separar del cogulo dentro de las dos horas de su obtencin. Tambin puede usarse plasma. #& A"i i/os! en caso de que la muestra a emplear sea plasma, debe usarse heparina como anticoagulante. c& Sus ancias in er'eren es conoci"as! las muestras con hemlisis visible o intensa pueden producir valores falsamente aumentados por lo que no deben ser usadas. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. "& Es a#ili"a" e ins rucciones "e al(acena(ien o! la muestra debe ser preferentemente fresca. La LDH es estable hasta 24 horas en refrigerador. No congelar. MATERIAL RE%UERIDO (no provisto) - Espectrofotmetro. - Micropipetas y pipetas para medir los volmenes indicados. - Material volumtrico adecuado. - Bao de agua a la temperatura indicada en el procedimiento a seguir. - Cronmetro. CONDICIONES DE REACCION (Disminucin de absorbancia)

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- Longitud de onda: 340 nm (Hg 334 366) - Temperatura de reaccin: 25, 30 37oC. Ver los VALORES DE REFERENCIA correspondientes a cada temperatura. - Tiempo de reaccin: 3 minutos y 30 segundos. - Los volmenes de muestra y reactivo se pueden reducir proporcionalmente sin que varen los factores de clculo. PROCEDIMIENTO A& 12oC En una cubeta mantenida a la temperatura de trabajo, colocar: Sus ra o recons i ui"o 3 ml Preincubar unos minutos, luego agregar: Mues ra 100 ul Mezclar inmediatamente y disparar simultneamente el cronmetro. Esperar 30 segundos. Leer la absorbancia inicial (ver LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO) y luego a los 1, 2 y 3 minutos de la primera lectura. Determinar la diferencia promedio de absorbancia/min ( A/min), restando cada lectura de la anterior y promediando los valores. Utilizar este promedio para los clculos. $& 34-35oC I- MACROTECNICA Emplear 50 ul de Muestra, siguiendo el procedimiento indicado en A). II- MICROTECNICA Emplear 20 ul de muestra y 1,0 ml de Sustrato reconstituido siguiendo el procedimiento indicado en A). CALCULO DE LOS RESULTADOS LDH (U/l) = A/min x factor En cada caso deber emplearse el factor de clculo correspondiente de acuerdo a la temperatura de reaccin seleccionada (30-37oC o 25oC) y a la tcnica empleada (micro o macrotcnica) como se indica en la siguiente tabla de factores: Long"$ud de ond# +/0 n% ++/ n% +00 n% VALORES DE REFERENCIA Temperatura 25C 30C* Valores (U/I) 120-240 160-320 (*) Calculados Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. 37C* 230-460 Te%&e!#$u!# I *+0,+-)C. 2103+ 213-1 1-12/1

'()C /12'1 (1010 21113

II *+0,+-)C. 3102( 31'(+ 1(100

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. - Absorbancia inicial baja: cuando una vez agregado el suero, la primera lectura (tiempo 0) es inferior a 0,800 D.O. estando el sustrato en condiciones, indica una muestra con muy alta actividad de LDH (que consume NADH an antes de esta lectura). En este caso, repetir la determinacin con muestra diluida 1/10 con solucin fisiolgica y multiplicar el resultado por la dilucin efectuada. - La humectacin es causa de deterioro del Sustrato. PERFORMANCE a& Re+ro"uci#ili"a"! procesando simultneamente replicados de una misma muestra, se obtienen los siguientes valores:

,i-el
/+3 U/l 03+ U/l

D1S1 5(61/ U/l 5-622 U/l

C141 161-7 161-7

#& L)(i e "e "e eccin! depende del espectrofotmetro empleado y de la longitud de onda. De acuerdo con la sensibilidad requerida, en espectrofotmetro a 340 nm (Hg 334 366), con cubetas de caras paralelas de 1 cm de espesor, reproducibilidad 2 nm, luz espuria 0,5% y semiancho de banda 8 nm, para un A/min de 0,001, el mnimo cambio de actividad detectable ser de 5 U/l (a 340 nm y a 25oC). c& Ran6o "in7(ico! el rango til de lectura se extiende hasta 0,200 D.O. A/min (a 340 nm y 25oC). Si la A/min es superior a 0,200 D.O. (340-334 nm y 25 oC) o 0,100 D.O. (366 nm y 25 oC), repetir la determinacin con muestra diluida 1/5 1/10 con solucin fisiolgica, corrigiendo consecuentemente los resultados. PARAMETROS PARA ANALI*ADORES AUTOMATICOS Longitud de onda primaria ...................................... 340 nm Longitud de onda secundaria (bicromtica) .......... 380 nm Tipo de reaccin ..................................................... cintica

9.

Direccin de la reaccin .................................... disminuye Temperatura de reaccin ............................................ 37oC Relacin muestra/reactivo .......................................... 1:50 Tiempo de equilibrio ......................................... 3 segundos Tiempo de retardo ......................................... 40 segundos Tiempo de lectura .......................................... 60 segundos Absorbancia de blanco .................................. > 0,700 D.O. Lmite de absorbancia ....................................... 2,000 D.O. Valor normal inferior ................................................ 230 U/l Valor normal superior .............................................. 460 U/l Linealidad ............................................................... 1000 U/l Factor (paso de luz 1 cm) ......................................... 8.095 Coef. extincin molar (340) ................ 6,3 [l x mmol-1 x cm-1] Para las instrucciones de programacin consulte el manual del usuario del analizador en uso. PRESENTACION - 3 x 20 ml (Cd. 1521303). $I$LIOGRAFIA - Societ Franaise de Biologie Clinique (SFBC) - Ann. Biol. Clin. 40:160, 1982. - Sociedad Espaola de Qumica Clnica - Comit Cientfico, Comisin de Enzimas - Quim. Clin. 57-61, 1989. - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

,iener la#2000 Rosario - Argentina


Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Inscripto M.S. Disp. N: 3330/97 Cert. N: 2114/97

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(ilirru)ina
Mtodo colorimtrico para la determinacin de *ilirru*ina directa + total en suero + otros l,-uidos *iol)icos SIGNIFICACION CLINICA La bilirrubina, compuesto de degradacin de la hemoglobina, es captada por el hgado para su conjugacin y excrecin en la bilis. Las alteraciones hepatocelulares u obstrucciones biliares pueden provocar hiperbilirrubinemias. La eritroblastosis fetal o anemia hemoltica del recin nacido es una patologa provocada por incompatibilidad maternofetal en la que se produce una destruccin excesiva de glbulos rojos. Esto resulta en un severo aumento de la bilirrubina srica con el consecuente riesgo de difusin del pigmento al sistema nervioso central, por lo que la determinacin de la bilirrubina en estos nios recin nacidos resulta sumamente importante. FUNDAMENTOS DEL METODO La bilirrubina reacciona especficamente con el cido sulfanlico diazotado produciendo un pigmento color rojo-violceo (azobilirrubina) que se mide fotocolorimtricamente a 530 nm. Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo, la bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso que posibilite su reaccin. De forma tal que, para que reaccione la bilirrubina total (conjugada y no conjugada) presente en la muestra, debe agregarse benzoato de cafena al medio de reaccin. REACTIVOS PROVISTOS Desarrolla"or! solucin acuosa de benzoato de cafena 0,13 mol/l, tamponada y estabilizada. Ni ri o "e So"io! solucin de nitrito de sodio 0,07 mol/l. Reac i/o Sul'an)lico! solucin de cido sulfanlico 29 mmol/l y cido clorhdrico 0,17 mol/l. REACTIVOS NO PROVISTOS - Agua destilada. - $ilirru#ina S an"ar" provisto separadamente por Wiener lab. para efectuar la calibracin peridica del equipo. INSTRUCCIONES PARA SU USO Desarrolla"or! listo para usar. Reac i/o Sul'an)lico! listo para usar. Dia8orreac i/o! de acuerdo al volumen de trabajo, mezclar 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo Sulfanlico. Rotular y fechar. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". ESTA$ILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reac i/os Pro/is os! son estables a temperatura ambiente (< 25 oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Dia8orreac i/o! en refrigerador (2-10oC) y en frasco de vidrio color caramelo es estable 3 meses a partir de la fecha de su preparacin. INDICIOS DE INESTA$ILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS La presencia de sedimento y/o cambio de coloracin de los reactivos, pueden ser indicio de deterioro de los mismos. MUESTRA Suero, plasma o lquido amnitico a& Recoleccin! obtener suero o plasma de la manera usual. Proteger de la luz natural o artificial, envolviendo el tubo con papel negro. Tambin es posible realizar la determinacin en lquido amnitico. #& A"i i/os! en caso de que la muestra a emplear sea plasma, debe usarse heparina para su obtencin. c& Sus ancias in er'eren es conoci"as! hemlisis moderada o intensa inhiben la reaccin directa, obtenindose valores de bilirrubina total falsamente aumentados. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. "& Es a#ili"a" e ins rucciones "e al(acena(ien o! la muestra debe ser preferentemente fresca. En caso de no efectuarse el ensayo en el momento, el suero debe conservarse hasta 48 horas en el refrigerador (2-10 oC) y la sangre entera no ms de 24 horas en refrigerador o 12 horas a temperatura ambiente. El lquido amnitico es conveniente mantenerlo congelado hasta el momento de efectuar el ensayo. La accin de la luz es capaz de destruir en una hora hasta un 50% de la bilirrubina presente en la muestra. Es por tal motivo que debe protegerse cuidadosamente. MATERIAL RE%UERIDO (no provisto) - Espectrofotmetro o fotocolormetro. - Micropipetas y pipetas capaces de medir los volmenes indicados.

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- Frasco de vidrio color caramelo. - Tubos de fotocolormetro. - Reloj o timer. CONDICIONES DE REACCION - Longitud de onda: 530 nm en espectrofotmetro o 520-550 nm en fotocolormetro con filtro verde. - Temperatura de reaccin: temperatura ambiente - Tiempo de reaccin: 5 minutos - Volumen de muestra: 200 ul - Volumen final de reaccin: 2,9 ml PROCEDIMIENTO I- TECNICA PARA SUERO En tres tubos de fotocolormetro marcados B (Blanco), D (Directa) y T (Total) colocar: B Muestra (suero) Agua destilada Desarrollador Reactivo sulfanlico Diazorreactivo 200 ml 2,5 ml 200 ul D 200 ml 2,5 ml 200 ul T 200 ml 2,5 ml 200 ul

Mezclar de inmediato cada tubo por inversin. Luego de 5 minutos, leer en espectrofotmetro a 530 nm o en fotocolormetro con filtro verde (520-550 nm), llevando el aparato a cero con agua destilada. Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos, excepto para la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos. Si se lee antes, habr subvaloracin de los resultados por reaccin incompleta. Si se lee despus, habr sobrevaloracin porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre. Sueros ic 9ricos! debe emplearse la tcnica descripta pero con menores cantidades de muestra, de acuerdo a la severidad de la ictericia. De tal forma, en caso de ictericia moderada se usarn 50 ul de suero mientras que frente a una ictericia intensa se requieren slo 20 ul. Multiplicar los resultados obtenidos por 3,79 y 9,38 respectivamente. II- TECNICA PARA LIQUIDO AMNIOTICO Se determina bilirrubina total. En dos tubos de fotocolormetro marcados B (Blanco) y T (Total) colocar: B 1 ml 1,5 ml 0,2 ml T 1 ml 1,5 ml 0,2 ml

Muestra (lquido amnitico) Agua destilada Desarrollador Reactivo sulfanlico Diazorreactivo

Proceder de la misma manera que en la tcnica I. Dividir el resultado final por 5,37.

CALCULO DE LOS RESULTADOS Bilirrubina total (mg/l) = (T - B) x f Bilirrubina directa (mg/l) = (D - B) x f Bilirrubina libre (indirecta) = BRB total - BRB directa El factor colorimtrico (f) debe calcularse con el Standard de Bilirrubina de Wiener lab. METODO DE CONTROL DE CALIDAD Standatrol S-E 2 niveles. VALORES DE REFERENCIA $ilirru#ina en suero o +las(a - Adultos: Directa: hasta 2 mg/l Total: hasta 10 mg/l - Recin nacidos: Nacidos a trmino 25 mg/l 60 mg/l 75 mg/l 120 mg/l Prematuros 80 mg/l 120 mg/l 240 mg/l

Sangre de cordn Hasta las 24 hs Hasta las 48 hs Del 3 al 5 da

>-

Los valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del adulto al mes del nacimiento. En los prematuros, los niveles de bilirrubina tardan ms en alcanzar la normalidad, dependiendo del grado de inmadurez heptica. $ilirru#ina en l):ui"o a(ni ico Valores menores de 1 mg/l son considerados normales, mientras que entre 1 y 2,7 mg/l sugieren la posibilidad de un feto afectado. Los niveles por encima de 2,7 mg/l slo se encuentran en presencia de eritroblastosis fetal. Si la cantidad de bilirrubina es superior a 4,7 mg/l el feto ya se encuentra afectado y tiene probablemente algn tipo de falla circulatoria. Si la cantidad de bilirrubina sobrepasa los 9,5 mg/l la muerte fetal es inminente. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

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LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. La accin de la luz, tanto sobre los sueros como sobre las soluciones standard, es capaz de destruir en una hora hasta el 50% de la bilirrubina presente. PERFORMANCE a& Re+ro"uci#ili"a"! procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da, se obtuvo lo siguiente: (ilirru*ina directa (ilirru*ina total Nivel 2!$ *g/l 26!0 *g/l "!8 *g/l $2,!, *g/l D.S. +0!$8 *g/l +0!62 *g/l +0!+, *g/l +$!+5 *g/l C.V. 8!5# 2!+# +!,# $!$#

#& Lineali"a": la reaccin es lineal hasta 150 mg/l. c& Recu+eracin: agregando cantidades conocidas de bilirrubina a distintos sueros, se obtuvo una recuperacin entre 100 y 106%. PRESENTACION Equipo para 200 determinaciones (Cd. 1120001). $I$LIOGRAFIA - Botwell, J. H. - Clin. Chem. 10/3:197 (1964). - Watson, D. - Clin. Chem. 7/6:603 (1961). - Ichida, T.; Nobuoka, M. - Clin. Chim. Acta 19/2:249 (1968). - Zaroda, R. - Am. J. Clin. Path. 45/1:70 (1966). - OBrien, D. et al - Laboratory manual of pediatric microbiochemical techniques, Harper & Row Pub - 4a Ed. (1968). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

,iener la#2000 Rosario - Argentina


Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Inscripto M.S. Disp. N: 252/75 - 5347/98

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4e0aracin electro1ortica de hemoglobina


47P7RTE Acetato de cel*losa gelatini#ado+ en medio alcalino E02O D+<?. )as tiras deben conser/arse en 0osicin /ertical 8 en *n reci0iente ta0ado conteniendo metanol al >-L. )as tiras secas 0ierden las dimensiones 8 las caractersticas del gel. )a s*0er1icie de las tiras %*e es 0enetrable a las 0rotenas se reconoce 0or%*e es m"s o0aca l*ego de secarse entre dos tiras de 0a0el de 1iltro. F@NDAMENT7 )as di1erentes hemoglobinas se se0aran 0or migrar a di1erentes /elocidades. En este medio la 2bA migra hacia el "nodo+ mientras %*e la 2bF E%*e en condiciones normales se enc*entra en 0e%*eCas cantidades?+ %*eda en la 2bA migrando !*ntas. )a 2bA , tiene *na /elocidad menor %*e la A. REA TI&74 ;? 4ol*cin b*11er3 Tris........................ ;>+; g 'licina .................. ,,+< g 2,7 destilada......... ;--- ml ,? 4ol*cin colorante3 Poncea* 43 -+: g en ;-- ml de "cido tricloroactico :L Edosis 0ara ,- tiras? 9? 4ol*cin decolorante3 Fcido actico :L. >? 4ol*cin deshidratante3 Metanol 0*ro. :? 4ol*cin de trans0arenti#acin3 Metanol ......................... D: ml Fcido actico ................ ;> ml 'licerol ........................... ; ml <? 4ol*cin disol/ente3 Fcido actico D-L Tcnica3 ;. 4*mergir las tiras en el b*11er 0or lo menos ;- min*tos ,. Eliminar el eBceso de l%*ido secando entre , 0a0eles de 1iltro. 9. EBtender las tiras sobre el 0*ente de la c"mara electro1ortica. )a s*0er1icie 0enetrable tiene %*e ir dirigida hacia arriba. )a tira debe estar bien tiesa 8 0lana. 70erar r"0idamente 0ara e/itar e/a0oraciones. >. 4embrar las m*estras con el hemoli#ado obtenido E/er m"s adelante?. :. onectar la 1*ente de 0oder+ reali#ar la corrida a *n /olta!e constante de ,-/olts+ d*rante =- min*tos. <. Desconectar la corriente 8 retirar las tiras. .. olorear d*rante : min*tos. D. Decolorar con 96> baCos de sol*cin decolorante+ hasta /er el 1ondo blanco de la tira. =. Determinacin c*antitati/a3 ortar las 1racciones coloreadas e introd*cirlas en t*bos de ensa8o conteniendo la sol*cin disol/ente 8 agitar. )eer a :,nm si se *s colorante Poncea* 4. Trans0arenti#acin3 )*ego de decolorar las tiras se s*mergen en metanol 0*ro anhidro d*rante 9- seg*ndos+ a contin*acin se las coloca en la >9

sol*cin trans0arentadora d*rante ; min*to como mnimo. 4e colocan l*ego en *na 0laca de /idrio+ eliminando c*idadosamente las b*rb*!as de aire 8 se calienta a la llama de *n mechero d*rante *nos min*tos+ hasta la trans0arencia com0leta. As se conser/a 0ara leer en densitometra. El sig*iente c*adro m*estra los res*ltados obtenidos en di1erentes 2emoglobino0atas3 TIP7 Normal Polo negati/o Anhidrasas arbnicas Recin nacido Anhidrasas arbnicas Dre0anocitosis homocigota Anhidrasas 2bA, 2b 4 arbnicas Dre0anocitosis heterocigota Anhidrasas 2bA, 2b 4 arbnicas 2emoglobino0ata homocigota Anhidrasas carbnicas 2emoglobino0ata heterocigota Anhidrasas arbnicas 6talasemia heterocigota 6talasemia homocigota Doble 2eterocigota 4M 2b 2bA 2b 2bA 2bF 2bA 2bA, Polo 0ositi/o A )ARA I7NE4 2bA =DL 2bA 2bA, ,L 2bF =-L 2bA ;-L 2bA, ,L 2b4 =DL 2bA \ :-L 2b4 [ :-L 2bA, ,L 2b =DL 2bA, ,L 2b [ :-L 2bA \ :-L 2bA, entre >6DL Anhidrasas 2bA, arbnicas Anhidrasas 2bA, arbnicas Anhidrasas 2b arbnicas 2b4 2bA 2bA, normal L de 2bF 8 2bA+ /ariable segAn ti0o de Th homocigota 2b4 :-L 2b :-L

2bF 2bA

>>

./0.A/AC12, 304 50M6417A36 Tcnica ;. 7btener : ml de sangre 0or 0*ncin /enosa+ *sando c*al%*ier anticoag*lante+ a*n%*e se recomienda la he0arina. ,. 4e la/a tres /eces con sol*cin 1isiolgica+ desechando los sobrenadantes. 9. se agrega *n /ol*men de ag*a destilada ig*al al del 0a%*ete glob*lar 8 -+D ml de tol*eno Erom0e los glb*los blancos?+ agitar /igorosamente d*rante ; min*to. >. olocar en heladera E1a/orece la hemlisis?+ de!ar ,> horas. :. entri1*gar d*rante ;- min*tos a 9--- r0m+ recoger con 0i0eta Paste*r el in1ranadante 8 1iltrar. <. 4e determina la concentracin de hemoglobina en el bemoli#ado obtenido+ mediante el mtodo de la cianmetahemoglobina+ se lle/a la concentracin hasta los /alores .6 D gMdl de hemoglobina con ag*a destilada.

>:

Deteccin histo%*mica de hemoglobina 1etal3 reaccin de 5leiha*er6$etke


F@NDAMENT7 )a hemoglobina 1etal E2bF o ,,? es "cido 8 alcalirresistente. Por consig*iente+ sometido *n 0re0arado 1resco de sangre a *na el*cin "cida ser" arrastrada la hemoglobina A 8 retenida la 1etal dentro de los eritrocitos+ lo c*al se reconoce 0or la coloracin de estos Altimos. REA TI&74 ;. Alcohol etlico al D-L ,. $*11er de "cido ctrico+ 02 9+> 4ol*cin A3 Fcido ctrico............................ >+, g Ag*a destilada......................... ;-- ml 4ol*cin $3 itrato de sodio........................ :+= g Ag*a destilada......................... ;-- ml 4ol*cin $*11er 02 9+>3 4ol*cin A ................ D> ml 4ol*cin $................. ;< ml 9. Eritrosina o eosina al -+; L en ag*a. DE4ARR7))7 ;. EBtendidos de sangre secos de no m"s de *na hora de obtencin+ se 1i!an d*rante : min*tos en el alcohol etlico al D-L ,. )a/ado r"0ido con ag*a 8 secado. 9. Inmersin en *na c"0s*la de Petri %*e contenga el b*11er de citrato. )le/arlos a est*1a a 9. *n mnimo de : min*tos+ agitando cada dos min*tos. )a/ar r"0idamente en ag*a comAn 8 secar en 0osicin /ertical. >. olorear en 9 a : min*tos con la sol*cin de eritrosina o eosina. )a/ar con ag*a 8 secar. RE4@)TAD74 )os hemates con hemoglobina 1etal se colorean 0or la eritrosina o eosina. )os %*e contienen hemoglobina A han sido red*cidos a s*s membranas /acas 8 a0arecen como sombras. El an"lisis c*antitati/o 0*ede hacerse estableciendo el 0orcenta!e de hemates coloreados e incoloros.

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DETERMINA INN DE 2EM7')7$INA FETA)3 MET7D7 DE 4IN'ER F@NDAMENT7 Debido a la m*8 seme!ante mo/ilidad de la hemoglobina normal E2bA? 8 la hemoglobina 1etal E2bF?+ c*ando *samos los mtodos electro1orticos de r*tina 0ara el est*dio de hemoglobinas+ es necesario /alerse de la 0ro0iedad de la 2bF E8 la 2b $artE de ser resistentes a la desnat*rali#acin en medio alcalino. REA TI&74 ;. 4ol*cin de hemoglobina E/ase obtencin de bemoli#ado? ,. 72Na ;M;, N Erecin 0re0arado? 9. Reacti/o 0reci0itante 47>EN2>?, .............................. 9D g l2 ;N ..................................... ,+: ml 2,7 destilada ........................... ;-- ml TZ NI A 4e 0re0aran tres t*bos3 T*bo ;3 $lanco3 9+, ml de 72Na ;M;, N+ agregar <+D ml de reacti/o 0reci0itante 8 1iltrar. T*bo ,3 2b ;--3 : ml de ag*a destilada+ agregar -+-, ml de la sol*cin de hemoglobina T*bo 93 2b "lcali6resistente3 9+, ml de o2Na ;M;, N+ agregar -+, ml de sol*cin de hemoglobina 8 dis0arar en el momento *n crnometro+ a los <- seg*ndos agregar <+D ml de reacti/o 0reci0itente+ in/ertir /arias /eces 8 1iltrar. )eer en *n es0ectro1otmetro a :>- nm+ lle/ar a cero con el t*bo blanco ET*bo ;?. F) @)7 L de 2b "lcali6resistente O &A)7R N7RMA) Menos de ,L. D7 t*bo 9 B ,D7 t*bo ,

>.

'r*0os sang*neos A$7 8 Rh3 0r*ebas de oombs


A. TIPIFI A I7N DE ANTI'EN74 A$7 EN 2EMATIE43 MET7D7 EN T@$7 P7R 4EDIMENTA I7N a? Pre0arar *na s*s0ensin de hemates de gr*0o sang*neo desconocido+ al , L en salina 1resca E/ase m"s aba!o el a0artado C. Preparacin de la suspensin globular al 2%?. b? Agregar *na gota de la s*s0ensin glob*lar+ a ig*al /ol*men de s*ero anti6A+ anti6 $+ anti6A$ 8 0lasma A$ normal E0oli o monoclonales? en t*bos de 5ahn. c? 4im*lt"neamente controlar cada antis*ero contra hemates A;+ $ 8 7 al ,L d? Inc*bar ; hora a tem0erat*ra ambiente o centri1*gar ; min*to a ;--- r0m. e? )eer 0rimero los controles 8 l*ego los 0roblemas microsc0icamente en /isor 8 microsc0icamente. 1? 4cores de lect*ra3 JJJ *n gran agl*tinato JJ /arios agl*tinatos grandes JJ m*chos agl*tinatos 0e%*eCos J 0e%*eCos agl*tinatos+ m*8 escasos+ /isibles a o!o desn*do J agl*tinatos /isibles 0ero solo microsc0icamente agl*tinatos conteniendo m*8 0ocas cl*las tr tra#as 6 negati/o $. TIPIFI A I7N DE ANTI @ERP74 A$7 EN 4@ER7 a? Tomar *na m*estra de s*ero libre de hemates. b? En t*bos de 5ahn+ agregar *na gota de s*ero a ig*al /ol*men de s*s0ensin al ,L+ de los sig*ientes hemates3 ;? hemates A conocidos ,? hemates $ conocidos 9? hemates del 0ro0io indi/id*o >? hemates 7 conocidos c? Inc*bar ; hora a ta o centri1*gar ; min*to a ;--- r0m. d? )eer 0rimero los controles 8 l*ego los 0roblemas + microsc0icamente en /isor 8 microsc0icamente. . PREPARA INN DE )A 4@4PEN4INN ')7$@)AR A) ,L a? 4e0arar los hemates del 0lasma 8 tras/asar *na 0orcin de los mismos a *n t*bo de 5ahn. b? )lenar el t*bo con sol*cin 1isiolgica al -.D:L 8 centri1*gar a ;--- r0m d*rante ; min*to. c? Eliminar el sobrenadante 8 re0etir los la/ados dos /eces m"s+ teniendo la 0reca*cin de res*s0ender 0er1ectamente el c*lot glob*lar antes de com0letar el agregado de sol*cin 1isiolgica. d? Tomar *na gota de c*lot E:- l? 8 agregarle -+: ml de sol*cin 1isiolgica. 4e tendr" as la s*s0ensin al ,L.

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D. 4@$A'R@PA I7N DE) 'R@P7 A3 MET7D7 EN P)A A a? olocar *na cantidad de sangre total ig*al a _ de gota. b? Agregar *na gota de anti6A absorbido; 8 me#clar bien con *na /arilla de 0*nta 1ina. c? Al terminar de me#clar+ dis0arar el cronmetro. d? Rotar la 0laca en 1orma circ*lar 8 obser/ar la a0aricin de agl*tinacin dentro del min*to. )os sig*ientes c*adros res*men los 0osibles res*ltados3 'lb*los ro!os 0roblema Anti A J 6 6 J 'R A 6 J J 6 Anti $ 6 J 6 J 'R $ J 6 J 6 Anti A$ J J 6 J 'R A$ J J J 6 'r*0o A$7 A $ 7 A$ 'r*0o A$7 A $ 7 A$

4*ero 0roblema

E. TIPIFI A I7N DE) FA T7R D DE) 4I4TEMA Rh a? olo%*e , gotas de s*ero anti6D en *n t*bo de 5ahn. b? Adicione *na gota 0e%*eCa de s*s0ensin de glb*los o en s* de1ecto de sangre entera de la m*estra. c? Agite 0ara me#clar los reacti/os 8 centri1*g*e d*rante ; min*to a ;:-- r0m. d? Des0renda s*a/emente el c*lot glob*lar 8 lea. )a lect*ra se har" microsc0icamente con *n /isor 8 microsc0icamente. e? Proceda de la misma manera con los t*bos controles. 0.1 Controles a? Pr*eba sobre la bondad del s*ero3 sangre D 0ositi/a J anti6D b? Pr*eba sobre la ines0eci1icidad res0ecto de anti6D3 sangre D negati/a J anti6D c? ontrol de se*doagl*tinacin3 m*estras de sangre J 0lasma de 0ersona A$. 0.2 /eacciones Positi/a3 los hemates DERho? 0ositi/os 0ermanecer"n agl*tinados al %*erer des0render el c*lot glob*lar. Negati/a3 los hemates ERh6rh? se s*s0ender"n n*e/amente sin e/idenciar agl*tinacin.

F. PR@E$A PARA DETE TAR D*

Tambin se 0*ede *tili#ar *n monoclonal anti6A;

>=

N*nca 0*ede ser diagnosticada como negati/a la sangre de *n dador 0or o1recer reacciones negati/as 1rente a s*eros anti `D. 4iem0re debe descartarse la 0osibilidad de estar en 0resencia de *n indi/id*o D*. Para ello es necesario a0licar la 0r*eba de oombs. ;? olo%*e dos gotas de s*ero anti `DERho? en *n t*bo de 5ahn,. ,? Agreg*e ; gota de *na s*s0ensin sang*nea al ,L en salina . 9? Agite 0ara me#clar los reacti/os e inc*be d*rante 9- min*tos a 9.I . >? )a/e los hemates 9 /eces con ab*ndante cantidad de 4F Eoc*0ando casi todo el /ol*men del t*bo?. entri1*g*e 8 elimine el sobrenadante. :? Agreg*e , gotas del s*ero antiglob*lina h*mana. <? Agite 0ara me#clar los reacti/os 8 centri1*g*e inmediatamente d*rante ; min*to a ;:-- r0m+ des0renda s*a/emente el c*lot glob*lar 8 lea. )a lect*ra se har" macro 8 microsc0icamente. (.1 /eacciones Positi/a3 los hemates D* ERho*? 0ositi/os 0ermanecer"n agl*tinados l*ego de intentar des0render el c*lot glob*lar. Negati/a3 los hemates Rh6Erh? 8 D* ERho*? negati/os se res*s0ender"n 8 no agl*tinar"n.

(.2 Controles utilizados 4e *tili#an tres controles 0ara ;. Probar la bondad del s*ero ,. om0robar s* es0eci1icidad 9. Para se*doagl*tinacin Para el 0rimer control 0ositi/o deben em0learse hemates Rh 0ositi/os de dador conocido 7R;r E deMcde?. Es aconse!able *sar esos hemates 8 e/itar em0lear eritrocitos DERho? 0ositi/os con el antgeno EErhY? 0resente +dado %*e+ en tales hemates el 1actor DERho? es mas reacti/o. El control negati/o consiste en eliminar la 0osibilidad de estar *tili#ando *n s*ero %*e contenga agl*tininas ines0ec1icas 0ara el antgeno en c*estin E0or e!em0lo3 anti6A 8Mo anti6$ no absorbidos d*rante la 0re0aracin del s*ero?. Estos dos 0rimeros controles sir/en 0ara demostrar %*e el s*ero a em0lear es es0ec1ico 8 no 0osee ningAn contaminante %*e 0*eda 1alsear los res*ltados. El tercer control+ es de se*doagl*tinacin 8 0ara ello se reem0la#a el s*ero anti `D 0or s*ero de 0ersona de gr*0o sang*neo A$+ se lo en1renta con los hemates %*e est"n siendo ti0i1icados.

'. 7MPR7$A INN DE )A PRE4EN IA DE ANTI @ERP74 INM@NE4 MEDIANTE )A PR@E$A DE 77M$4.
,

)a deteccin de D* tambin se 0*ede hacer con antic*er0o monoclonal anti6D*.

:-

'.1 .rueba de Coombs indirecta ;? olocar en *n t*bo de 5ahn , gotas de s*ero 0roblema 8 , gotas de s*s0ensin de hemates de gr*0o 7 RhJ al ,L. Agitar s*a/emente , o 9 /eces d*rante el 0erodo de inc*bacin de ; hora a 9. I . Proceder de la misma manera con *n t*bo control %*e contiene , gotas de sol*cin 1isiolgica 8 , gotas de s*s0ensin de hemates 7 RhJ al ,L. entri1*gar+ %*itar el sobrenadante 8 la/ar 9 /eces con sol*cin 1isiolgica+ eliminando com0letamente el sobrenadante en el Altimo la/ado.

,?

9? Pre0arar otros controles sig*iendo las indicaciones del a0artado F., >? )eer al microsco0io antes del agregado del s*ero antiglob*lina h*mana. :? Agregar *na gota de s*ero antiglob*lina h*mana. entri1*gar ; min*to a ;:-- r0m. )eer microsc0icamente con /isor 8 microsc0icamente. '.2 .rueba de Coombs directa <? olocar en *n t*bo de 5ahn , gotas de s*s0ensin al ,L de hemates 0roblema. Pre0arar *n t*bo control %*e contenga , gotas de s*s0ensin de hemates 7 RhJ sensibili#ados al ,L.

.? Pre0arar otros controles sig*iendo las indicaciones del a0artado F., D? )eer al microsco0io antes del agregado del s*ero antiglob*lina h*mana. =? Agregar *na gota de s*ero antiglob*lina h*mana. entri1*gar ; min*to a ;:-- r0m. )eer microsc0icamente con /isor 8 microsc0icamente.

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-n.i--! -n.i-( o -n.i -!(


Monoclonal
!eacti.os para la determinacin de )rupos san)u,neos #(O SIGNIFICACION CLINICA En el ao 1900 Landsteiner descubri que los glbulos rojos humanos podan ser clasificados en A, B, AB u O de acuerdo a la presencia (grupos A, B, o AB) o ausencia (grupo O) de antgenos altamente reactivos en su superficie. Tambin demostr que existen anticuerpos (aglutininas) para los anfgenos A y B y que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el antgeno presente en sus propios glbulos rojos pero s contra los que no posee. Actualmente se han identificado subgrupos de los grupos A y B con distinta especificidad. Todas estas observaciones revelaron la importancia de la compatibilidad ABO en la prctica transfusional. Por este motivo, la tipificacin de los grupos sanguneos ABO es la prueba fundamental sobre la que se basan los dems ensayos pretransfusionales. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glbulos rojos del paciente se ponen en contacto con Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal. Si existen en la superficie de los eritrocitos los antgenos correspondientes, se producir una aglutinacin visible macroscpicamente. La ausencia de aglutinacin en todos los casos, implica grupo O. REACTIVOS PROVISTOS An i-A; An i-$ o An i-A;$ (onoclonal! reactivos preparados a partir de anticuerpos monoclonales secretados por lneas celulares de hibridomas de ratn. REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la tcnica que se emplee pueden requerirse adicionalmente: - Solucin fisiolgica - Solucin fisiolgica tamponada con buffer fosfatos (PBS) - Solucin fisiolgica de baja fuerza inica (LISS) - Al#<(ina $o/ina 34= de Wiener lab. INSTRUCCIONES PARA SU USO Los Reactivos se proveen listos para usar. ESTA$ILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. INDICIOS DE INESTA$ILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminacin del mismo. MUESTRA Glbulos rojos o sangre entera a& Recoleccin! la sangre debe ser obtenida aspticamente, con o sin anticoagulante. #& A"i i/os! pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (cido ctrico, citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. c& Es a#ili"a" e ins rucciones "e al(acena(ien o! las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de los 7 das de obtenida la muestra. MATERIAL RE%UERIDO (no provisto) - Centrfuga - Tubos de hemlisis - Placas - Palillos mezcladores descartables PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". PROCEDIMIENTO En las siguientes tcnicas la suspensin de glbulos rojos a ensayar debe ser preparada con solucin fisiolgica, PBS o LISS. /- T0CN/C- 0N '%-C're1arar una sus1ensi2n de gl2)ulos ro3os al $0#. Co*o al.erna.iva 1uede e*1learse una sus1ensi2n al 5-+5# en 1las*a del *is*o 1acien.e o sangre en.era.0 $4 - una go.a de 5eac.ivo -n.i--! -n.i-( o -n.i--!( *onoclonal colocada en una 1laca li*1ia! agregar $ go.a de sus1ensi2n de gl2)ulos ro3os.

:,

24

6e7clar el 5eac.ivo 8 los gl2)ulos con un 1alillo descar.a)le cu)riendo un 9rea circular de 2 c* de di9*e.ro 8 )alancear la 1laca con.inua*en.e duran.e 2 *inu.os. :)servar aglu.inaci2n visi)le *icrosc21ica*en.e ;as.a los 2 *inu.os. No de)e e*1learse *icrosco1io.

//- T0CN/C- 0N T<(: =1or cen.rifugaci2n4 $4 - una go.a de 5eac.ivo -n.i--! -n.i-( o -n.i--!( *onoclonal colocada en un .u)o de ;e*2lisis! agregar $ go.a de sus1ensi2n de gl2)ulos ro3os al -5#. ///- T0CN/C- 0N T<(: =1or sedi*en.aci2n4 $4 - una go.a de 5eac.ivo -n.i--! -n.i-( o -n.i--!( *onoclonal colocada en un .u)o de ;e*2lisis! agregar $ go.a de sus1ensi2n de gl2)ulos ro3os al -5#. 24 6e7clar e incu)ar duran.e 60 *inu.os a .e*1era.ura a*)ien.e. 4 -gi.ar el .u)o 1ara des1egar las c>lulas 8 e?a*inar *acrosc21ica*en.e la aglu.inaci2n. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas utilizadas) indica una reaccin positiva. Grupo sanguneo A B 0 AB Variants dbiles del grupo A como Ax Antisuero Anti-B + + -

Anti-A + + +/-

Anti-A,B + + + +

METODO DE CONTROL DE CALIDAD El control de calidad puede efectuarse ensayando glbulos rojos tipificados. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones dbiles pueden observarse en las siguientes situaciones: - Neonatos: los antgenos A y B no se encuentran totalmente expresados en el recin nacido. Por esta razn deben extremarse los cuidados, sobre todo en los prematuros. - Leucemias u otros desrdenes malignos. - Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sustanciales de sangre de grupo no idntico. - Reacciones falsas positivas: se han observado problemas ocasionados en la tipificacin de los grupos sanguneos ABO debido a anticuerpos que reaccionan con drogas, colorantes, compuestos qumicos o con partculas de slica coloidal liberadas de vidrios de mala calidad. - Aglutininas fras: en presencia de aglutininas fras, el lavado de los glbulos rojos 4-6 veces con solucin fisiolgica, resulta generalmente suficiente para obtener clulas aptas para la tipificacin. En muy raras ocasiones se requiere un calentamiento a 37oC durante 10 minutos antes de los lavados mencionados. Como control, se coloca una gota de estas clulas con 2 gotas de solucin fisiolgica. No debe producirse aglutinacin. PRESENTACION Anti-A: frasco x 10 ml (Cd. 1443152). Anti-B: frasco x 10 ml (Cd. 1443154). Anti-AB: frasco x 10 ml (Cd. 1443153). $I$LIOGRAFIA - Moore, S. et al. Int. Symp. on Monoclonal Antibodies: Standardization of their Characterization and use. Pars, France, 1983. Develop. Biol. Standard 57:49-59. - Widman, F.K. Technical Manual. 9 th Edition, Washington, D.C. American Association of Blood Banks 1985. Chapter 8. 2) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm. 3) Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin.

,iener la#2000 Rosario - Argentina


Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Inscripto M.S. Disp. N: 1076/89 (Anti-A) Disp. N: 1073/89 (Anti-B) Disp. N: 1071/89 (Anti-A,B)

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-n.i-D =5;o4
monoclonal
!eacti.o para la deteccin de ant,)eno D (!ho) SIGNIFICACION CLINICA Las observaciones de Levine y Stetson en 1939 y de Landsteiner y Wiener en 1940 establecieron las bases para el conocimiento actual de la importancia clnica de la deteccin en el laboratorio de los anticuerpos anti-D. Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca y el 8% de los individuos de raza negra carecen del antgeno D y son fcilmente estimulados cuando reciben este antgeno, ya sea por transfusin o durante el parto, produciendo anti-D. Este anticuerpo es responsable de severas reacciones postransfusionales y de la enfermedad hemoltica del recin nacido. Existen muchos otros antgenos identificados dentro del sistema Rh. Sin embargo, es el antgeno D el que posee mayor importancia en la clnica despus del sistema ABO. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glbulos rojos del paciente se ponen en contacto con suero anti-D (anti-Rho). Si existe en la superficie del eritrocito el antgeno correspondiente, se producir una aglutinacin visible macroscpicamente. REACTIVO PROVISTO An i-D >R?o&! solucin de anticuerpos monoclonales humanos. REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la tcnica empleada puede requerirse adicionalmente: - Solucin fisiolgica. - Suero An i-?u(ano >+olies+ec)'ico& provisto separadamente por Wiener lab. INSTRUCCIONES PARA SU USO An i-D >R?o&! listo para usar. PRECAUCIONES El reactivo es para uso diagnstico "in vitro". ESTA$ILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. INDICIOS DE INESTA$ILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminacin del mismo. MUESTRA Glbulos rojos o sangre entera a& Recoleccin! obtener la sangre en forma asptica con o sin anticoagulantes. #& A"i i/os! pueden emplearse como anticoagulantes: heparina, EDTA, ACD (cido ctrico, citrato, dextrosa), CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). c& Sus ancias in er'eren es conoci"as! los glbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas o fracciones del complemento pueden dar reacciones falsamente positivas. Cuando se sospecha esta situacin deber realizarse una Prueba de Antiglobulina Directa. "& Es a#ili"a" e ins rucciones "e al(acena(ien o! las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de los 7 das de obtenida la muestra. MATERIAL RE%UERIDO (no provisto) Dependiendo de la tcnica que se emplee, podrn ser necesarios: - Centrfuga - Tubos de hemlisis - Placa de vidrio - Palillos mezcladores descartables PROCEDIMIENTO I- TECNICA EN PLACA Preparar una suspensin de glbulos rojos al 40-50% en plasma o suero autlogos, o solucin fisiolgica. Tambin puede emplearse sangre entera. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa de vidrio limpia. 2) Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar.

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3)

Mezclar el antisuero y los glbulos rojos con un palillo descartable en un rea de 2 cm de dimetro y balancear constantemente la placa durante 2 minutos. Observar macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin.

II- TECNICA EN TUBO Preparar una suspensin de glbulos rojos al 3-5% en plasma o suero autlogos, o en solucin fisiolgica. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemlisis. 2) Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar. 3) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm. 4) Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin. Las reacciones aparentemente negativas deben incubarse a 37 oC durante 15-30 minutos, luego centrifugar y volver a leer como se describi en 4). Las muestras que an en estas condiciones resulten negativas deben ser investigadas respecto al antgeno Du. III- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA PARA Du Preparar una suspensin al 3-5% de glbulos rojos en plasma o suero autlogos, o solucin fisiolgica. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemlisis. 2) Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar.

3)
4) :? 6)

Mezclar e incubar a 37oC durante 15-30 minutos. Lavar las clulas 3-4 veces con solucin fisiolgica, descartando perfectamente el sobrenadante y resuspender las clulas luego de cada lavado. Agregar 2 gotas de Suero An i-?u(ano >+olies+ec)'ico& , mezclar, centrifugar 20 segundos a 3500 rpm. Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas empleadas) indica una reaccin positiva. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. La prueba para tipificacin de antgeno D (Rho) de glbulos rojos sensibilizados debe realizarse solamente en medio salino. La determinacin del Du no puede efectuarse sobre glbulos rojos sensibilizados. Pueden obtenerse resultados ms rpidos y mejor visualizacin precalentando la placa a 45-50 oC. PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cd. 1443155). $I$LIOGRAFIA - Landsteiner, K.; Wiener, A.S. - Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 43: 223, 1940. - Wiener, A.S.; Unger, L.J. - JAMA 169:696, 1959. - Widman, F.K. - Technical Manual - 9 th. Ed. Washington D.C., American Association of Blood Banks, Chapter 9, 1985. - Race , R.R. and Sanger, R. - Blood Groups in Man - 6 th Ed. Oxford Blackwell Scientific Publications, pg. 178, 1975.

,iener la#2000 Rosario - Argentina


Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Inscripto M.S. Disp. N: 1074/89

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Suero -n.i-;u*ano
(poliespecfico)
/ara realizar /rue*as #nti)lo*ulina (Coom*s) Directa o $ndirecta SIGNIFICACION CLINICA Las experiencias descriptas por Coombs, Mourant y Race en 1945 establecieron que las Pruebas Antiglobulina Humana resultaban los mejores mtodos para detectar anticuerpos sensibilizantes pero no directamente aglutinantes. El ejemplo descripto originalmente haca referencia a antgenos del sistema Rh. Experiencias posteriores probaron el valor de estas pruebas en la deteccin de anticuerpos en casi todos los grupos sanguneos de importancia clnica, siendo empleadas actualmente en los siguientes casos: Prue#a An i6lo#ulina In"irec a - Screening de suero de donantes y pacientes para anticuerpos. - Pruebas de compatibilidad previas a la transfusin. - Fenotipo de glbulos rojos. - Identificacin y titulacin de anticuerpos encontrados en suero o eluatos. Prue#a An i6lo#ulina Direc a - Diagnstico de laboratorio de anemia hemoltica y enfermedad hemoltica del recin nacido. - Investigacin de reacciones dudosas en una transfusin. - Investigacin de enfermedades autoinmunes que involucran la unin de inmunoglobulinas y/o fracciones del complemento a los glbulos rojos. FUNDAMENTOS DEL METODO El agregado de Suero Anti-humano (poliespecfico) a glbulos rojos que estn cubiertos de inmunoglobulinas y/o Fragmentos de complemento (C3b, C3bi, C3dg o C3d), produce una aglutinacin de los glbulos rojos visible macroscpicamente. REACTIVO PROVISTO Suero An i-?u(ano >+olies+ec)'ico&! suero obtenido de conejos inmunizados con inmunoglobulina G purificada y C3. REACTIVOS NO PROVISTOS - Reactivos para la determinacin de grupos sanguneos. De acuerdo a la tcnica a emplear puede requerirse adicionalmente: - Solucin fisiolgica. - Solucin fisiolgica tamponada con buffer fosfato (PBS). - Solucin fisiolgica de baja fuerza inica (LISS). INSTRUCCIONES PARA SU USO Suero An i-?u(ano >+olies+ec)'ico&! listo para usar. PRECAUCIONES El Reactivo Provisto es para uso diagnstico "in vitro". ESTA$ILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. INDICIOS DE INESTA$ILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo si se observa contaminacin del mismo. MUESTRA Glbulos rojos a& Recoleccin! la sangre debe ser obtenida aspticamente, con o sin anticoagulante. #& A"i i/os! pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (cido ctrico, citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. c& Es a#ili"a" e ins rucciones "e al(acena(ien o! las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de los 7 das de obtenida la muestra. Cuando se efectan pruebas antiglobulina directas, la sangre debe ser preferentemente fresca (menos de 24 horas de la extraccin).

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Si los glbulos provienen de cogulos, no deben ser refrigerados antes de las pruebas directas. MATERIAL RE%UERIDO (no provisto) - Centrfuga - Bao de agua a 37oC - Tubos de hemlisis PROCEDIMIENTO I- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solucin salina de fuerza inica normal). 1) En un tubo de hemlisis colocar 2 gotas del suero a probar. 2) Agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos a probar al 3% lavados 3 veces y resuspendidos en PBS.

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Mezclar e incubar a 37oC durante 30-60 minutos. Lavar los glbulos 3 veces con PBS teniendo la precaucin de descartar completamente el sobrenadante y resuspender el precipitado luego de cada lavado. Descartar completamente el sobrenadante luego del ltimo lavado. Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecfico) al botn de clulas. Mezclar perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 3.500 rpm. Resuspender las clulas por agitacin y observar macroscpicamente. Tener en cuenta que agitaciones demasiado vigorosas pueden desligar aglutinaciones dbiles. Los resultados negativos deben confirmarse por adicin de glbulos rojos sensibilizados con IgG dbiles.

II- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solucin fisiolgica de baja fuerza inica). El empleo de esta solucin permite reducir el tiempo de incubacin a 15 minutos. Los glbulos rojos deben lavarse 2 veces con PBS y una vez con LISS. Finalmente preparar con esta solucin una suspensin de glbulos rojos al 3%. 1) Colocar en un tubo de hemlisis 1 gota de suero a probar. 2) Agregar 1 gota de glbulos rojos a probar al 3% en LISS. 3) Mezclar e incubar a 37C durante 15 minutos en bao de agua. Continuar como se indica en los pasos 4) a 7) de la tcnica I). III- PRUEBA ANTIGLOBULINA DIRECTA Se e*1lea 1ara de*os.rar la a)sorci2n @in vivoA de /gB 8/o fracciones del co*1le*en.o en la su1erficie de los gl2)ulos ro3os. 1) Preparar una suspensin de glbulos rojos a probar en PBS al 3%. 2) En un tubo de hemlisis colocar 1 gota de esta suspensin y continuar con los pasos 4) a 7) de la tcnica I). INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas empleadas) indica una reaccin positiva. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ocurrir por las siguientes causas: - Contaminacin qumica o bacteriana de la muestra u otros materiales empleados para la prueba. - Lavado inadecuado de las clulas. - Tiempo o temperatura de incubacin inadecuados. - Tiempo o velocidad de centrifugacin inadecuados. - Concentracin inadecuada de glbulos rojos. - Agitacin excesiva para despegar los glbulos rojos aglutinados. Recordar que los reactivos han sido estandarizados para detectar inmunoglobulinas humanas y fragmentos C3 unidos a los glbulos rojos. No son aptos para detectar anticuerpos de otro origen. PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cd. 1443156). $I$LIOGRAFIA - Coombs, R.R.A.; Mourant., A.E. and Race, R.R. - Lancet, ii:15, 1945. - Coombs, R.R.A.; Mourant, A.E. and Race, R.R. - Brit. J. Exp. Path. 26:225, 1945. - Widman, F.K. - Technical Manual. 9th ed. Washington D.C. American Association of Blood Banks, pg. 376, 1985.

,iener la#2000 Rosario - Argentina


Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Inscripto M.S. Disp. N: 2503/91

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Determinacin de antic*er0os inm*nes


A. TIT@)A INN DE ANTI @ERP74 A.1 &cnica bsica de titulacin A.;.;. Pre0aracin de dil*ciones madres. a? olocar en *na gradilla ;- t*bos de 5ahn n*merados del ; al ;- Eel nAmero de t*bos 0*ede a*mentarse o dismin*irse si 1*era necesario?. b? En los t*bos , al ;-+ colocar -+;-- ml de sol*cin 1isiolgica E4F?. olocar -+9-ml de s*ero a tit*lar en el t*bo NI;. c? Tomar -+;-- ml de s*ero del t*bo ; 8 trans/asarlo al t*bo NI,. d? 2omogenei#ar la me#cla de s*ero 8 4F con la misma 0i0eta. )*ego se toman -+;-ml de la misma 8 se tras/asan al t*bo de 5ahn NI9. 2omogenei#ar 8 re0etir la o0eracin hasta com0letar las dil*ciones. A.;., Tit*lacin a? 4e toman ;- t*bos de 5ahn+ n*merados del ; al ;- 8 se dis0onen en *na gradilla. on *na 0i0eta Paste*r 0ara cada dil*cin+ colocar , gotas de las mismas en los corres0ondientes t*bos. b? Adicionar con 0i0eta Paste*r , gotas de s*s0ensin de hemates al ,L. Agitar la me#cla. c? Inc*bar a la tem0erat*ra a0ro0iada + el tiem0o re%*erido. d? 4im*lt"neamente se lle/an a cabo controles de a*toagl*tinacin 8 de es0eci1icidad del s*ero. e? )eer los res*ltados macro 8 microsc0icamente comen#ando 0or los controles 8 l*ego 0or el t*bo de ma8or dil*cin. El grado de agl*tinacin se considerar" segAn los scores anteriormente indicados. El tt*lo es la rec0roca de la dil*cin m"s alta donde se obser/a agl*tinacin . 4i en la Altima dil*cin+ con agl*tinacin+ el ti0o de agl*tinato es tr+ el tt*lo se determinar" 0romediando dicha dil*cin con la 0recedente. Por e!em0lo+ si en el t*bo NI : c*8a dil*cin es ;M;<+ el ti0o de agl*tinato es tr+ el tt*lo ser" E;<JD?M,O;,. a? ontrol de a*toagl*tinacin3 consiste en en1rentar dos gotas de s*s0ensin de hemates a *sarse con dos gotas del s*ero del dador de hemates. b? ontrol de es0eci1icidad del s*ero3 consiste en en1rentar dos gotas de hemates 7 con dos gotas del s*ero a tit*lar.

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