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UNIVERSIDAD AUTNOMA BENITO JUREZ DE OAXACA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS


LICENCIATURA EN QUMICO FARMACUTICO BILOGO

EXPRESIN DEL ANTGENO T Y GALECTINA 3 EN


CLULAS MCF-7 ESTIMULADAS CON
LIPOPOLISACRIDOS.

PROTOCOLO DE TESIS

ASESORA: DRA. EN C. ITANDEHUI BELEM


GALLEGOS VELASCO

PRESENTA:
APARICIO LPEZ EDEN

OAXACA DE JUREZ, OAXACA

MARZO 2015

NDICE
FUNDAMENTO TERICO................................................................................. 4

I.

LINEAS CELULARES DEL CANCER DE MAMA......................................................4


LINEA CELULAR MCF-7...................................................................................... 6
ANTGENO T...................................................................................................... 7
LECTINAS......................................................................................................... 9
GALECTINAS................................................................................................... 10
GALECTINA 3.................................................................................................. 10
PARTICIPACIN DE LA GALECTINA-3 EN EL DESARROLLO DEL CANCER DE
MAMA......................................................................................................... 12
LIPOPOLISACRIDOS....................................................................................... 13
II.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA................................................................15

III.

JUSTIFICACIN......................................................................................... 16

IV.

OBJETIVOS DE INVESTIGACIN.................................................................17
HIPTESIS.................................................................................................... 17

V.
VI.

METODOLOGA......................................................................................... 18

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS A UTILIZAR.............................................18


MUESTRA....................................................................................................... 18
PREPARACIN DE LAS CLULAS MCF-7............................................................18
PREPACIN DE PLACAS PARA CITOQUMICA.....................................................19
TIPO DE ESTUDIO............................................................................................ 19
VARIABLES..................................................................................................... 20
BIBLIOGRAFA................................................................................................... 21

I.

FUNDAMENTO TERICO

1.1 LINEAS CELULARES DEL CANCER DE MAMA


La primera lnea celular humana fue creada en un laboratorio de Baltimore, hace ms de 50
aos por George Gey (1). Esta lnea celular llamada HeLa deriva de una dama cuyo nombre
era Henrietta Lacks, que tena carcinoma cervical. La visin de Gey allan el camino para
el cultivo celular tal como la conocemos hoy en da, lo que permite su desarrollo
generalizado como una herramienta experimental importante en la investigacin del
cncer. Uno de los principales beneficios de usar lneas de clulas cultivadas en la
investigacin del cncer es que ofrecen un suministro infinito de una poblacin de clulas
relativamente homogneas que son capaces de autorreplicarse en un medio de cultivo
celular estndar.
La primera lnea celular de cncer de mama humano (BT-20) fue establecido por
Lasfargues y Ozzello en 1958 a partir del cultivo de un pedazo de explante de un tumor de
una mujer caucsica de 74 aos de edad (2). Estas clulas son receptor alfa de estrgeno
(ER) negativas, receptor de progesterona (PR) negativas, factor de necrosis tumoral alfa
(TNF-) positivas, y el receptor del factor de crecimiento epidrmico (EGFR) positivas (3).
BT-20 es la lnea celular de cncer de mama ms antiguamente establecida, sin embargo, no
es la lnea ms comnmente utilizada. Por el momento, la lnea celular de cncer de mama
ms ampliamente utilizado en todo el mundo es la lnea celular MCF-7 (4). Fue establecida
en 1973 por Soule y sus colegas de la Michigan Cancer Foundation, de donde se deriva su
nombre. Las clilas MCF-7 fueron aisladas de la efusin plural de una mujer de 69 aos de
edad con enfermedad metastsica (5). Desde su creacin, MCF7 se ha convertido en el
modelo de cncer de mama positivo para ER (6). El establecimiento de otras lneas
celulares ha seguido, incluyendo los de otros tipos de cncer de mama, como mutante
BRCA, triple negativo, que sobreexpresan HER2, y los derivados de las clulas epiteliales
mamarias normales como las clulas MCF-10A.
La evaluacin de las lneas celulares existentes indica que la mayora de las lneas celulares
de cncer de mama en uso se derivan de cncer metastsico y no de otros fenotipos de
cncer de mama (7). De hecho, la tasa global de xito del establecimiento de una lnea
celular es slo el 10%.

La mayora de las lneas celulares que existen en la actualidad se han derivado de derrame
pleural en lugar provenir de tumores primarios y son principalmente lneas-ER (revisado en

Lacroix y Laclercq, 2004). Esto es sorprendente, ya que cncer de mama ER negativo slo
se detectaron en el 20 - 30% de todos los tumores primarios, mientras que los tumores ER +
se detectan 55-60%.
LINEA
CELULAR

SIGNIFICADO

ORGANISMO

ORIGEN

MORFOLOGIA

MCF-7

Michigan Cancer
Foundation-7

Humano

Glandula
mamaria

Carcinoma
mamario ductal
invasivo

MDA-MB231

M.D. Andersonmetastatic breast

Humano

Mama

Cncer

T-47D

Ductal tumor

Humano

Glandula
mamaria

Epitelial

MDA-MB468

M.D. Andersonmetastatic breas

Humano

Mama

Cancer

MDA.MB435

M.D. Andersonmetastatic breast

Humano

Mama

Melanoma o
carcinoma
(disputado)

SK-BR-3

Sloan-Kettering

Humano

Mama

Epitelial

MA-CLS-2

Cell line service

Humano

Glandula
mamaria

Epitelial

colo.824

Human breast
squamoust
carcinoma cells

Humano

mama

Epitelial

Tabla 1.- Lista de lneas celulares ms comunes de cncer de mama

1.2 LINEA CELULAR MCF-7


MCF-7 es una lnea celular de cncer de mama aislado en 1970 de una mujer Caucsica de
69 aos de edad con grupo sanguneo O Rh +. MCF-7 es el acrnimo de la Fundacin-7

Cncer de Michigan, en referencia al instituto en Detroit, donde se estableci la lnea


celular en 1973 por Herbert Soule y compaeros de trabajo (8).
La paciente, cuyo nombre era Frances Mallon, es desconocido para la gran mayora de los
investigadores del cncer, muri en 1970. Sus clulas son la fuente de gran parte de los
conocimientos actuales sobre el cncer de mama. En el momento del muestreo, era una
monja en el convento de la Inmaculada corazn de Mara en Monroe, Michigan, bajo el
nombre de Sor Catalina Frances (9).
Antes de la lnea MCF-7, no fue posible para los investigadores del cncer obtener una
lnea de clulas mamarias que fuera capaz de vivir ms de unos pocos meses (10).
Las caractersticas de las clulas MCF-7 son:
-

Tumor primario: carcinoma ductal de mama invasivo

Origen de las clulas: derrame pleural

La presencia de receptores de estrgeno, progesterona, andrgeno y glocorticoides.

Respuesta proliferativa a los estrgenos.

No presentea amplificacin del gen ErbB2 (HER2/neu con sobreexpresin de la


protena)

Si presenta tumorigenicidad en ratones, pero slo con la administracin de


suplementos de estrgenos

Fenotipo: epitelial luminal

Esta lnea celular retiene varias caractersticas del epitelio mamario diferenciado,
incluyendo la capacidad para procesar el estradiol a travs de los receptores de estrgeno
citoplasmticos y la capacidad de formacin de cpulas.
El cultivo de lneas celulares de cncer de mama humano exhiben vstago propiedades
funcionales similares a las clulas tales como la divisin simtrica y auto-renovacin y una
variedad de propiedades fenotpicas, tales como HER2, CD49f, protena fosfatasa y

homlogo de tensina - PTEN, EpCAM, mucina 1 ( MUC1), CD44 + / CD24-, y aldehdo


deshidrogenasa 1 - ALDH1, entre otros.
ANTGENO T
Los oligosacridos son cadenas cortas de monosacridos unidos entre s por medio de
enlaces glicosdicos, los cuales se encuentran formando parte de glicoprotenas y
glicolpidos, presentes en la parte externa de las membranas celulares, donde intervienen en
funciones como anclaje a la membrana basal, trfico de protenas, interacciones de ligandos
con sus receptores, relacin husped-parasito.
Las cadenas oligosacardicas estn constituidas por tres regiones principales:
a) el ncleo o core, es la regin en donde se encuentran los carbohidratos ms cercanos al
sitio de unin con la cadena polipeptdica, b) el esqueleto, que es la regin en donde se
determina la longitud del oligosacardo y c) la regin perifrica, donde se encuentran
antgenos de importancia biolgica, como por ejemplo los antigenos de los grupos
sanguneos.
Las glicoprotenas se clasifican de acuerdo a la unin entre el azcar y el aminocido, en Ny O-glicanos, si la unin es con el nitrgeno (N) del aminocido asparagina (Asn) o con el
oxgeno (O) de la serina (Ser) o de la treonina (Thr) respectivamente.
Los N-glicanos, que generalmente presentan un residuo de N-acetil-Dglucosamina
(GlcNAc) unida al nitrgeno de la Asn, se clasifican en tres grandes grupos: a) con un alto
contenido de manosa (Man) en su estructura, b) las estructuras del tipo lactosamnico, las
cuales tienen como caracterstica principal, la presencia de Gal(1-4)GlcNAc y c) las
estructuras hbridas, las cuales contienen una mezcla de las estructuras lactosamnicas y de
manosas. Sin embargo, hasta el momento no se han encontrados Nglicanos asociados al
desarrollo de cncer de mama.
Por otro lado, los Oglicanos poseen una N-acetil-Dgalactosamina (GalNAc) unida al
hidroxilo de la Ser o de la Thr de la cadena polipeptdica y presentan mayor variedad de
estructuras que los Nglicanos, ya que se han descrito ocho diferentes ncleos (core) de los
cuales se derivan el resto de estructuras oligosacardicas presentes en las glicoprotenas. Por
su gran complejidad y diversidad, los O-glicanos se encuentran participando en funciones
tan diversas como en la conformacin de la estructura secundaria, terciaria e inclusive de la

cuaternaria de algunas protenas, como en el caso de las mucinas y tambin participan


evitando la agregacin de las protenas (11).
Como consecuencia de la transformacin maligna (cncer) ocurren cambios muy
importantes en la glicosilacin, sobre todo en la etapa de elongacin de los O-glicanos. Esto
determina que algunos tipos de ncleos (cores), que en las clulas normales se encuentran
enmascarados por la adicin de otros azcares, queden expuestos en la superficie celular,
resultando en la formacin de nuevos antgenos asociados al cncer. Los antgenos mejor
caracterizados en el cncer de mama son los antgenos Tn,[GalNAc(1-O-)Ser/Thr], sialilTn[NeuA(2-6)GalNAc(1-O-)Ser/Thr], T o TF [Gal(1-3)GalNAc(1-O-)Ser/Thr] y
sialil-T [NeuA(2-6)Neu(2-3)

Gal(1-3)GalNAc(1-O-)Ser/Thr]

(12).

La

expresin de estos antgenos es el resultado de una glicosilacin incompleta, lo que origina


que las cadenas de oligosacridos de las protenas se acorten, exponiendo carbohidratos que
normalmente se encuentran enmascarados por la adicin de otros azcares, quedando
expuestos en la superficie celular y originan nuevos antgenos. La expresin de estos
antgenos suele ser discontinua a lo largo de la cadena polipeptdica. El antgeno Tn es el
precursor del antgeno T o TF que se forma por la accin de una galactosil transferasa, la
cual puede estar bloqueada y provocar una sialilacin temprana del antgeno Tn, (13), que
normalmente se encuentra sustituido con galactosa (Gal) o N-acetilglucosamina (GlcNAc),
lo que permite la formacin del esqueleto del oligosacrido y finalmente su terminacin
con la adicin del cido silico (NeuA). La expresin del antgeno sialil-Tn se ha asociado
con diferentes carcinomas, como el adenocarcinoma gstrico difuso, los cnceres de
pulmn, cervico-uterino y de hgado (14). Al antgeno Tn tambin se le puede adicionar
Nacetilglucosamina (GlcNAc) formando los ncleos 3, 4 y 6 y Nacetilgalactosamina
(GalNAc) formando los ncleos 5, 7 y 8. La expresin de estos "cores", no se ha
relacionado con cncer de mama.
El antgeno Sialil Lewis es un pentasacrido, que se expresa en clulas del sistema inmune,
que participan en procesos inflamatorios, siendo su receptor en las clulas endoteliales la Eselectina. La expresin de antgenos del tipo Sialil-Lewis, se ha asociado con la capacidad
de las clulas transformadas para invadir otros tejidos y evadir al sistema inmune.
Estos O-glicanos algunas veces estn unidos a glicoprotenas que pueden ser expresadas en
las membranas celulares, lo que permitira la bsqueda de nuevos marcadores glicosilados

para la deteccin del cncer de mama desde sus fases iniciales, en donde los mtodos
histolgicos no logran diferenciar la morfologa celular.
LECTINAS
El trmino lectina se aplica a protenas o glicoprotenas de origen no inmune

que

reconocen de manera especfica carbohidratos de la superficie celular o en suspensin,


aglutinan clulas y precipitan glicoconjugados; las lectinas poseen por los menos dos sitios
de reconocimiento a carbohidrato, de ah su capacidad para aglutinar clulas, aunque en la
actualidad el trmino de lectina se ha aplicado a protenas con un solo sitio de
reconocimiento a carbohidrato como es el caso de las selectinas. Las lectinas no poseen
actividad enzimtica y no son producto de una respuesta inmune. Estas protenas se
encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza y han sido identificadas en diversos
organismos como virus, bacterias, hongos, plantas, as como en vertebrados superiores.
Debido a la capacidad de estas protenas para interactuar con clulas de la respuesta
inmune, algunas lectinas poseen efectos inmunosupresores, otras tambin son txicas,
inhiben el crecimiento de clulas tumorales y participan en la adhesin celular.
Todas las actividades biolgicas reportadas para las lectinas tienen en comn el
reconocimiento de un receptor oligosacardico (15).
Actualmente se han empleado lectinas para investigar el desarrollo de cncer, como por
ejemplo por medio de histoqumica, se ha demostrado que la lectina de Vicia villosa (VVA),
(16) y la lectina de Helix pomatia (HPA) (17), ambas con especificidad hacia GalNAc, han
sido utilizadas como factor pronstico en el cncer de mama. La lectina de Arachis
hypogeae (PNA), especfica para el antgeno TF, ha demostrado servir como marcador
pronsticos en el cncer de mama (18), la lectina de Amaranthus leucocarpus (ALL),
especfica para los antgenos Tn y TF, se ha empleado en el estudio del cncer
cervicouterino y en fibroadenoma (19, 20 ). En los tejidos animales, se han aislado lectinas
que son receptores potenciales de las estructuras oligosacaridicas, expresadas en las clulas
y que pueden tener participacin en diversos fenmenos biolgicos, un ejemplo de estas
lectinas, son las galectinas.

GALECTINAS
Es una familia de protenas extremadamente conservadas a travs de la evolucin; que
participan en diversos eventos biolgicos. Son capaces de descifrar glicocdigos
especficos en macromolculas complejas situadas en las membranas celulares o en la
matriz extracelular 21, 22), a travs de un dominio de 130 aminocidos filogenticamente
conservado desde invertebrados inferiores a mamferos, denominado dominio de
reconocimiento de carbohidratos (DRC), con el cual reconocen -galactsidos. Su amplia
distribucin en la naturaleza y sus secuencias aminoacdicas conservadas a travs de la
evolucin, sugieren que estas protenas podran cumplir papeles fisiolgicos esenciales,
estas protenas han sido involucradas en fenmenos de inmunomodulacin, adhesin
celular, regulacin del crecimiento, metstasis (23) y proliferacin (24). Se ha observado
que estas protenas de unin a carbohidratos ejercen sus efectos biolgicos a travs del
reconocimiento de azcares especficos en ligandos intracelulares, receptores de membrana
y glicoprotenas extracelulares. La ejecucin de sus funciones vara en forma considerable
de acuerdo a su localizacin subcelular.
Las galectinas pueden tener efectos contrarios, as por ejemplo mientras que la galectina-1
inhibe la desgranulacin de mastocitos y la migracin de los leucocitos, la galectina-3
promueve la migracin de los mastocitos y migracin leucocitaria. La familia de las
galectinas, pueden ser clasificadas en tres grupos: aquellas que tienen un dominio de
reconocimiento de carbohidratos (DRC) y son las galectinas -1,-2, -5, -7, -10, -11, -13, -14
y -15, las que tienen dos DRC, uno encima de otro, y se unen por un fragmento peptdico
de 70 aminocidos y corresponden a las galectinas -4, -6, -8, -9 y -12 y las de tipo
quimrico que tienen un dominio proteico amino terminal con secuencias repetitivas de
glicina y prolina como la galectina-3.
GALECTINA 3
Hallada en el ncleo de los fibroblastos 3T3 de ratn en 1986, utilizando
inmunofluorescencia, descrita en un principio como PFC-35, posteriormente llamada
tambin CBP-35 protena ligante de carbohidratos 35, Mac-2, IgEBP protena ligante de Ig
E, CBP-30, RL-29, L-29, L-31. L-31, L-34 Y LBL.
La galectina-3 es una protena de 26 kDa, cuyo gen que la sintetiza se encuentra en el
cromosoma 14q21.3 (25). Funciona como un receptor para ligandos que contienen poli-

Nacetil-galactosamina. Normalmente se encuentra en el epitelio de diferentes rganos y en


clulas de respuesta inflamatoria como los macrfagos, clulas dendrticas y de Kupffer. La
galectina-3 tiene funciones tanto intracelulares como extracelulares.
En relacin con sus funciones intracelulares se le ha identificado como un componente de
ribocucleoprotenas heterogneas y como un factor en el empalme del RNA mensajero. As
mismo, participa en el control del ciclo celular y reduce la apoptosis de las clulas T
probablemente a travs de la interaccin con miembros de la familia del Bcl-2. La
galectina-3 se secreta por monocitos, macrfagos y clulas epiteliales. Como molcula
extracelular activa a monocitos, macrfagos, mastocitos, neutrfilos y linfocitos e
interviene en las interacciones entre clula y clula, as como entre clula y matriz
extracelular. Promueve el crecimiento de las neuritas, induce la diferenciacin y
angiognesis de las clulas endoteliales y funciona como una sustancia quimio atrayente de
los monocitos y clulas endoteliales. La galectina-3, se sintetiza en el citoplasma y
habitualmente se localizada en el ncleo, en el lquido extracelular y en la superficie
celular, donde la enriquecen y se acoplan a glicoconjugados de la membrana plasmtica y
de la matriz extracelular aunque tambin ejercen interacciones homo- y heterotipicas con
otras lectinas multivalentes (26). La localizacin intracelular de la galectina-3 juega un
papel importante en la proteccin contra apoptosis, la regulacin de la expresin gnica
ciclina D1 (27) y la regulacin del corte y empalme o splicing, siendo este un proceso de
eliminacin de los intrones del transcrito primario y la posterior unin de los exones en el
pre-RNA nuclear. Por otra parte, su localizacin en la superficie celular y en el medio
extracelular indica su participacin en la interaccin clula-clula, adhesin celular,
proliferacin, angiognesis, crecimiento celular.

PARTICIPACIN DE LA GALECTINA-3 EN EL DESARROLLO DEL CANCER


DE MAMA
El papel de la galectina-3 en el desarrollo de cncer se debe, a su participacin en varios
mecanismos, como por ejemplo: adhesin clula-clula, interaccin matriz extracelularclula, apoptosis y angiognesis (30). Existe evidencia que la expresin de la galectina-3 es

necesaria para el inicio de la transformacin celular, en el desarrollo del tumor (29). El


mecanismo por el cual la galectina-3 participa en la trasformacin celular, no ha sido
esclarecido con certeza, pero puede estar relacionado con su habilidad para interactuar con
K-RAS y facilitar la transduccin de la seal hacia RAF y fosfatidilinositol 3 cinasa. La
galectina-3 tambin puede estimular la produccin de ciclina D y c-MYC. Estudios en
lneas celulares de carcinoma mamario han demostrado que despus de inhibir la expresin
de la galectina-3, pierden su fenotipo caracterstico en el medio de cultivo celular (30)
La funcin ms estudiada de la galectina-3, se relaciona con la inhibicin de la apoptosis
(33). El mecanismo por el cual la galectina-3 lleva a cabo esta funcin, no ha sido
esclarecido, pero se cree que despus de un estmulo apopttico, la galectina-3 puede
traslocar del citosol o ncleo hacia la mitocondria, donde bloquea cambios en el potencial
de membrana de la mitocondria, previniendo la apoptosis, sin embargo, la galectina-3
presente en el ncleo debe ser fosforilada, para poder emigrar del ncleo, as mismo la
galectina-3, regula la va de la protena cinasa activada por nitrgeno (MAKP), implicada
en la regulacin de la apoptosis.
El papel de la galectina-3 en el desarrollo del cncer de mama no es muy claro, sin
embargo, en estudios in vitro (34) se determin que el bloqueo de la expresin de galectina3 en el ncleo y el citoplasma de la lnea celular cancergena de alta malignidad MDA-MB435 inyectada a ratones desnudos suprima el crecimiento de tumores, sugiriendo que la
expresin de galectina-3 es necesaria para la tumoregenidad en el cncer de mama MDAMB-435. Ms tarde, (33) se proporcion evidencia en la cual la galectina-3 promova el
potencial metastsico en las clulas de cncer de mama BT549 quedando sobre entendido
que la sobre expresin otorga esta propiedad. Mayoral et al., analizaron diferentes tejidos
glandulares de autopsias (34) sometidas a inmunohistoqumica con anticuerpos antigalectina-3, encontrando que no existe reaccin hacia galectina-3 en el tejido normal de
mama en contraste con la fuerte inmunorreactividad hacia galectina-3 en el cncer de mama
metastsico al cerebro. En estos tejidos se observ la inmunorreactividad ante la galectina-3
tanto intracelular como extracelular se reporta una baja reactivad hacia galectina-3 en el
cncer metastsico hacia el cerebro de origen mamario comparado con la reaccin en el
tejido de cncer de mama. Estudios preliminares demuestran que la expresin de antgeno
T, no vara segn el estadio del cncer de mama, mientras que la galectina-3 vara segn el

grado de diferenciacin del cncer ductal infiltrante. Estudios recientes han correlacionado
la presencia del antgeno TF y de la galectina-3 en la adhesion de las clulas transformadas
al endotelio, promoviendo su migracin los ganglios localizados en las axilas (35).
LIPOPOLISACRIDOS
Todas las clulas poseen una membrana citoplasmtica compuesta de una bicapa de
fosfolpidos que limitan el interior celular. Adicionalmente a esta frontera, un grupo de
bacterias denominadas Gram negativas, evolucionaron desarrollando una segunda
membrana exterior a la citoplasmtica. Esta membrana externa tiene una configuracin
asimtrica: la cara interna est compuesta de fosfolpidos, mientras que la externa est
compuesta mayoritariamente de unas molculas nicas en la naturaleza denominadas
lipopolisacridos (LPS).
Los LPS son glucolpidos anfipticos complejos. Estructuralmente pueden dividirse en tres
dominios: lpido A, oligosacrido ncleo (ON), y antgeno O. El lpido A est constituido
de un disacrido al que estn unidos cidos grasos, los cules anclan las molculas de LPS
a la membrana externa. Una cadena corta de monosacridos unida al lpido A constituye el
ON. El antgeno O es un polisacrido constituido por unidades de monosacridos u
oligosacridos repetidos muy variables, est unido al ON y es el dominio distal de la
molcula de LPS (36).
Los lipopolisacridos (LPS) estn localizados en la membrana externa de la envoltura
celular bacteriana y juegan un papel muy importante en la patognesis de las infecciones
bacterianas, as como en la interaccin con el hospedero y su sistema de defensa.

El LPS es a menudo llamado endotoxina. Este trmino fue introducido en el siglo XIX para
describir el componente bacteriano responsable de los fenmenos patofisiolgicos
asociados con las infecciones por Gramnegativos. El lpido A posee la actividad endotxica
del LPS, como ha sido demostrado usando lpido A obtenido sintticamente. Dentro de las
actividades biolgicas ms relevantes estn la potente activacin de macrfagos y la

produccin de gran cantidad de citoquinas y otros mediadores con mltiples efectos en


diferentes rganos (37).
El mecanismo de accin de las endotoxinas es complejo; en humanos, los LPS se unen a la
protena unificadora de los lpidos que se encuentran en el suero transfiriendo a la protena
al CD14 de la superficie de la membrana celular. Estos a su vez lo transfieren a la protena
MD2, la cual se asocia al Toll-like receptor-4 (TLT4), provocando que la cascada de
clulas macrfagas y endoteliales secreten citoquinas pro inflamatorias y xido ntrico lo
que produce el shock endotxico. Las protenas CD14 y TLR4 se encuentran presentes en
varias clulas del sistema inmunolgico incluyendo los macrfagos y clulas dendrticas.
En los monocitos y macrfagos ocurren tres eventos durante su interaccin con los LPS:
1.- Produccin de citoquinas incluyendo IL-1, IL-6, IL-8, factor de tumor necrtico (TNF,
por sus siglas en ingls) y el factor de activacin de plaquetas. Estos a su vez estimulan la
produccin de prostaglandinas y leucotrienos los cuales son poderosos mediadores de
inflamacin y shock sptico.
Los lipopolisacridos (LPS), activan los macrfagos para promover la fagocitosis y la
citotoxicidad. Los macrfagos son estimulados para producir y liberar enzimas lisosomales,
IL- 1 (pirgeno endgeno) y TNF, as como otras citoquinas y mediadores de inflamacin.
2. Activacin de la cascada de complemento en la que el C3a y C5a causan la liberacin de
histamina provocando la vasodilatacin y afectando la quimotaxis de los neutrfilos y su
acumulacin en el rgano afectado causando inflamacin.
3. Activacin de la cascada de coagulacin donde el factor Hageman o factor de
coagulacin XII puede activar varios sistemas humorales que resultan en:
a) Coagulacin, trombosis, coagulacin intravascular diseminada aguda (ADIC, por sus
siglas en ingls), disminucin de plaquetas y varios factores de coagulacin, lo que provoca
sangrado interno.
b) Activacin de la ruta alterna de complemento provocando inflamacin
c) Activacin de plasmina causando fibrinlisis y hemorragias
d) Activacin de quinina liberando pptidos vasoactivos que causan hipotensin
El efecto neto de este proceso es la induccin de inflamacin, coagulacin intravascular,
hemorragia y shock. Los LPS tambin pueden actuar como clulas B mitgenas,

estimulando la diferenciacin policlonal, la multiplicacin de las clulas B y la secrecin de


inmunoglobulinas, especficamente IgG e IgM (38).

Figura 1.- Representacin esquemtica molecular de la estructura del lipopolisacrido.

II.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Qu cambios habr en la expresin del antgeno T y galectina 3 en clulas MCF-7


estimuladas con lipopolisacridos (LPS) a 1, 3 y 5 horas, con respecto a las clulas no
estimuladas?

III.

JUSTIFICACIN

El cncer de mama es la neoplasia ms frecuente en las mujeres a nivel mundial, aunque


puede presentarse en hombres, la proporcin es de 1 caso por 150 mujeres.
La lnea celular MCF-7 se utiliza en esta investigacin debido a que presenta varios
receptores, entre ellos los de progesterona y estrgeno, que permiten realizar diversos
experimentos con esta poblacin celular. Cabe resaltar que las pruebas en pacientes no se
realizan por cuestiones ticas.
Este trabajo nos permitir conocer el efecto que tendr una infeccin sobre una persona que
desarrolle cncer de mama o el efecto de una infeccin bacteriana durante un tratamiento
quimioteraputico en un paciente con esta neoplasia, mediante el estudio de la expresin
del antgeno-t y galectina-3.
Los lipopolisacridos (LPS), principales componentes de la pared de bacterias Gramnegativas, producen la liberacin de diversas citoquinas proinflamatorias en algunas clulas
del sistema inmune del husped, Estas citoquinas actan como mediadores ante diversas
agresiones llevando a desrdenes inmunopatolgicos cuando son secretados en exceso. El
LPS representa uno de los ms potentes inductores de TNF, y en altas concentraciones
causa lesin tisular, coagulacin vascular diseminada y shock sptico, llevando incluso a la
muerte. Es por ello que se utilizarn el LPS para la estimulacin de clulas MCF-7 y con
esto aportar nuevos conocimientos de la accin de esta potente endotoxina sobre las clulas
y adems contribuir al conocimiento de los posibles mecanismos moleculares que
desencadenan el cncer de mama.
Adems, ste trabajo contribuye a la ampliacin de los conocimientos en el apartado de la
glicobiologa tumoral.

IV.

OBJETIVOS DE INVESTIGACIN

GENERAL

Analizar la expresin de galectina-3 y antgeno T en clulas MCF-7 estimuladas con


lipopolisacridos, para comparar su expresin con otro tipo de estmulo.

ESPECFICOS

Identificar el patrn de expresin de galectina-3 y antgeno T en clulas MCF-7


estimuladas con LPS y no estimuladas, mediante el empleo de las lectinas:
Artocarpus intergrifolia, Amarantus leucocarpus, Penaut aglutinin,

Conocer la expresin de galectina 3 y antgeno T mediante el empleo de las tcnicas


de Inmunofluorescencia y citometra de flujo.

V.

HIPTESIS

HIPTESIS ALTERNATIVA
Hay cambios en la cantidad de la expresin del antgeno T y galectina 3 en las clulas
MCF-7 cuando son estimuladas con lipopolisacridos, con respecto a las clulas no
estimuladas.
HIPTESIS NULA
No hay cambios en la cantidad de la expresin del antgeno T y galectina 3 en las clulas
MCF-7 cuando son estimuladas con lipopolisacridos, con respecto a las clulas no
estimuladas.

VI.

METODOLOGA

Materiales, reactivos y equipos a utilizar


-

Campana de flujo laminar

Incubadora con suministro de CO2

Cronmetro

Pipetas

Puntas para pipetas

Botellas con clulas MCF-7

Placas de 16 pozos

Medio DMEN con Suero Fetal Bovino

Medio DMEN sin Suero Fetal Bovino

Lipopolisacridos [20ng/ml]

Verseno

Tripsina

MUESTRA
Las clulas MCF-7 que se utilizaron se obtuvieron del Centro de Investigacin Facultad de
Medicina UNAM-UABJO, las cuales se encuentran sembradas en botellas de 75 cm 3 en el
medio DMEN adicionado con glutamina y Suero Fetal Bovino al 10%.
PREPARACIN DE LAS CLULAS MCF-7
Se realiza el proceso de rasurado de las clulas MCF-7 (siempre y cuando las clulas
presenten confluencia), las cuales se encuentran dentro de las botellas de cultivo;
primeramente se saca el medio, posteriormente se le aade a la botella verseno 2 veces
dejndolo actuar por un momento y despus se le aade tripsina, se mezcla suavemente
para lograr el desprendimiento de las clulas, posteriormente se incuba por 10 minutos.
Despus del proceso de incubacin se recupera el contenido de la botella donde se
encuentran las clulas MCF-7, pasndolo a un tubo Corning: en seguida se le aade medio
con suero fetal bovino a la botella y se guarda en la incubadora con suministro de CO2.

El tubo Corning se centrifuga a 2,000 r.p.m. por 2 minutos, luego se decanta el tubo y se
recuperan el sedimento (clulas MCF-7), al cual se le agrega medio con SFB.
PREPACIN DE PLACAS PARA CITOQUMICA
Las clulas MCF-7 se siembran en placas de 12 pozos de fondo plano con la ayuda de una
pipeta, encontrndose aproximadamente 200,000 clulas/pozo, en seguida se aade 1 ml del
medio DMEN AL 10% a cada pozo. Se incuba la placa por 24 horas para que las clulas se
peguen.
Deprivado celular. Cumplido ese lapso de tiempo, se le quita el medio con SFB que
contienen los pozos, en seguida se lavan con PBS y se les agrega medio DMEN sin SFB,
finalmente se guarda la placa. Este procedimiento se realiza de igual manera por 24 horas.
Estimulacin, Una vez trascurridas las 24 horas, se le quita el medio DMEN sin SFB y se
aade el estmulo que es lipopolisacrido a una concentracin de 20 ng/ml, este proceso se
realiza a 1, 3 y 5 horas por cada fila, adems se deja una fila sin estimulacin que son los
pozos basales.
Despus se fijan con p-formaldehdo y se marcan con las lectinas y posteriormente se
observan en el microscopio de fluorescencia.

TIPO DE ESTUDIO
Experimental y trasversal

VARIABLES

Id Variable

Definicion operacional Escala

Codificacin

Tipo

TIEMPO

Tiempo de
Discretas
estimulacin de
las ciulas MCF-7

Valor entero
positivo

Explicativa

EXPRESIN

Expresin del antgeno -Cualitativas PresenciaRespuesta


con respecto al
ordinales
ausencia
tiempo de
Valor entero
estimulacin (IF y-Numericas
positivo
citometra de
Discretas
flujo)

ANTGENO T

EXPRESIN
Expresin de la
GALECT
galectina con
INA 3
respecto al
tiempo (IF y
citometra de
flujo)

-Cualitativas PresenciaRespuesta
ordinales
ausencia
-Numericas
Discretas

Valor entero
positivo

BIBLIOGRAFA
1. Gey GO, Coffman WD, Kubicek MT.(1952) Tissue culture studies of the
proliferative capacity of cervical carcinoma and normal epithelium. Cancer
Research.12, 264265.
2. Lasfargues, E., and Ozzello, L. (1958). Cultivation of human breast cancer
carcinomas. J Natl Cancer Inst 21, 1131-1147.
3. Borras, M., Lacroix, M., Legros, N., and Leclercq, G. (1997). Estrogen
receptornegative/ progesterone receptor-positive Evsa-T mammary tumor cells: a
model for assessing the biological property of this peculiar phenotype of breast
cancers. Cancer Lett 120, 23-30.
4. Burdall, S., Hanby, A., Lansdown, M., and Speirs, V. (2003). Breast cancer cell
lines: friend or foe? Breast Cancer Research 5, 89-95.
5. Soule, H., Vazguez, J., Long, A., Albert, S., and M, B. (1973). A human cell line
from a pleural effusion derived from a breast carcinoma. J Natl Cancer Inst 51,
1409-1410.
6. Lacroix, M., and Laclercq, G. (2004). Relevance of breast cancer cell lines as
models for breast tumours: an update. Breast Cancer Research and Treatment 83,
249.
7. Borras, M., Lacroix, M., Legros, N., and Leclercq, G. (1997). Estrogen
receptornegative/ progesterone receptor-positive Evsa-T mammary tumor cells: a
model for assessing the biological property of this peculiar phenotype of breast
cancers. Cancer Lett 120, 23-30.
8. Soule HD., Vazquez J., Long A., Albert S., Brennan M.. (1973). A human cell line
from a pleural effusion derived from a breast carcinoma. Journal of the National
Cancer Institute 51 (5), 14091416.
9. Glodek, Cass, Ph.D., (1990) A History of the Michigan Cancer Foundation, the
Beginnings & Growth of Detroit's Anticancer Movement. Michigan Cancer
Foundation, Detroit, 68.
10. Morrison BJ,, Hastie ML., Grewal YS., Bruce ZC., Schmidt C., et al. (2012)
Proteomic Comparison of MCF-7 Tumoursphere and Monolayer Cultures. PLoS
ONE 7(12), 1-3.
11. Gallegos B., Cuevas B., Prez E., Coutio R., & Hernandez P. (2012). El papel de la
galectina-3 en el desarrollo del cncer de mama. Revista de Educacin Bioqumica,
32(1), 4-6.
12. Brockhausen I. (2006). Mucin-type O-glycans in human colon and breast cncer:
glycodynamics and functions. EMBO Rep 7, 599-600.
13. Zhuang D., Yousefi S., & Dennis JW. (1991). Tn antigen and UDP-Gal:GalNAc
alpha-R beta1-3Galactosyltransferase expression in human breast carcinoma.
Cancer Biochem Biophys. 12, 185-198.

14. Cao Y., Karsten U,, Otto G., & Bannasch P. (1999). Expression of MUC1,
Thomsen-Friedenreich antigen, Tn, sialosyl-Tn, and alpha2,6-linked sialic acid in
hepatocellular carcinomas and preneoplastic hepatocellular lesions. Virchows Arch
434, 503-509.
15. Van den Steen P., Rudd MP., Dwek AR., & Opdenaker G (1998) Concepts and
Principles of O-glycosylation. Crit Rev Biochem Mol Biol 33, 151-208.
16. Kawaguchi T., Takazawa H., Imai S., Morimoto J., Watanabe T., Kanno M., &
Igarashi S. (2006). Expression of Vicia villosa agglutinin (VVA)- binding
glycoprotein in primary breast cncer cells in relation to lymphatic metastasis: is
atypical MUC1 bearing Tn antigen a receptor of VVA? Breast Cancer Res Treat 98,
31-40.
17. Brooks S A., Hall D M., & Buley I. (2001). GalNAc glycoprotein expression by
breast cell lines, primary breast cancer and normal breast epithelial membrane. Br J
Cancer 28, 1014-1022.
18. Stanley M W., Kiang D T., & Sibley RK. (1986). Peanut lectin binding in breast
carcinoma. Lack of correlation with estrogen receptor content. Cancer Nov 1; 58(9),
2046-2051.
19. Santaella A., Gallegos B., Perez E., Zenteno E., & Hernndez P. (2007). Use of
Amaranthus leucocarpus Lectin to Differentiate Cervical Dysplasia (CIN). Prep
Biochem Biotechnol 37, 219-228.
20. Gallegos B., Prez-Campos E., Martinez R., Leyva P., Martinez M., Hernndez R.,
Pina S., Hernndez C., Zenteno E., & Hernndez P. (2010). O-glycosilation
expression in fibroadenoma. Prep Biochem Biotechnol 40, 1-12.
21. Rabinovich GA. (1999). Galectins: an evolutionarily conserved family of animal
lectins with multifunctional properties; a trip from the gene to clinical therapy. Cell
Death Differ 6, 711-722.
22. Kasai K., & Hirabayashi J. (1996). Galectins: a family of animal lectins that
decipher glycocodes. J Biochem 119, 1-8.
23. Yoshimasa I (2000) Oxidized galectin-1 promotes axonal regeneration in peripheral
nerves but does not possess lectin properties. Eur J Biochem 267, 2955-2964.
24. Dagher SF, Wang JL., & Patterson RJ (1995) Identification of galectin-3 as a factor
in pre-mRNA splicing. Proc Natl Acad Sci USA 92, 1213-1217.
25. Gillenwater A, Xu XC, Estrov Y, Sacks PG, Lotan D., & Lotan R (1998)
Modulation of galectin-1 content in human head and neck squamous carcinoma
cells by sodium butyrate. Int J Cancer 75, 217-224.
26. Leffler H. (1997). Introduction to galectins. Trends Glycosci. Glycotechnol 9, 919.
27. Moutsatsos IK, Davis JM, Wang J (1986) L. Endogenous lectins from cultured cells:
subcellular localization of carbohydratebinding protein 35 in 3T3 fibroblasts.
Journal of Cell Biology 102, 477483.
28. Krzeslak A, Lipinska A (2004) Galectin-3 as a multifunctional protein. Cell Mol
Biol Lett 9, 305-328.

29. Brewer CF (1997) Cross-linking activities of galectins and other multivalent lectins.
Trends Glycotech 9, 155-165.
30. Lin HM, Pestell RG, Raz A, Kim HRC (2002) Galectin-3 enhances cyclin D(1)
promoter activity through SP1 and Camp-responsive element in human breast
epithelial cells. Oncogen 21, 8001-8010
31. Yang R, Hsu D, Liu T. (1996). Expression of galectin-3 modulates T-cell growth
and apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA 93, 67376742.
32. Roland J Pieters. (2006). Inhibition and Detection of Galectins. ChemBioChem 7,
721728.
33. Lu-Gang Yu, Nigel Andrews, Qicheng Zhao, Daniel McKean, Jennifer F. Williams,
Lucy J. Connor, Oleg V. Gerasimenko, John Hilkens Jun Hirabayashi, Kenichi
Kasai, Jonathan M. Rhodes (2007) Galectin-3 Interaction with ThomsenFriedenreich Disaccharide on Cancer-associated MUC1 Causes Increased Cancer
Cell Endothelial Adhesion. Journal of Biological Chemistry 282, 773-781.
34. Honjo Y, Nangia-Makker P, Inohara H, Ra A (2001) Downregulation of galectin-3
suppresses tumorigenicity of human breast carcinoma cells. Clin Cancer Res 7,
661668.
35. Liu FT, Rabinovich GA. (2005). Galectins as modulators of tumour progression.
Nat Rev Cancer 5, 29-41.
36. Ormeo E. (2005). Lipopolisacridos de Rhizobiaceae: estructura y biosntesis.
Revista Latinoamericana de Microbiologa, 47(3,4), 165-175.
37. Rojas N. El lipopolisacridos bacteriano: Una potente endotoxinas con multiples
actividades biolgicas. Facultad de Mocrobiologa, Universidad de Costa Rica, 7172.
38. Bolte G., Bischof W., Borte M., Lehmann I., Wichmann HE., & Heinrich J. (2003).
Early endotoxin exposure and atopy development in infants: results of a birth cohort
study. Clin Exp Allergy; 33, 770776.
La glicosilacin en el cncer sufre cambios, sobre todo en los glicanos. Por lo que
no hay todava una justificacin

algunos ncleos se encuentran enmascarados con la adicin de otros azucares y


una vez expuestos a la superficie, se forman nuevos antgenos que se asocian al
cncer como es el caso del cncer de mama.
Por lo cual en este tema nos permitir conocer cmo interactan las clulas del
cncer de mama en relacin a una persona que tiene sta enfermedad y que
adems presenta una infeccin de tipo bacteriana, como tambin qu relacin hay
en cuanto a la expresin del cido silico.