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REVISION SOBRE LOS EFECTOS ANSIOLITICO, SEDANTE E HIPNTICO DEL TILO

Eduardo Gorry

INTRODUCCION:
El Tilo es un genero que pertenece a la familia Tilicea, la cual consta de un numero total de especies que oscila entre las 25 y las 80. Es oriundo de Europa, y lo podemos encontrar tanto en este continente como en Asia, Siberia Occidental y Amrica del Norte. Las diversas especies de Tilo se caracterizan por presentar alturas que varan entre los 30 y 40 metros y dimetros de alrededor de 1 metro. La madera es de color blanco y suave lo cual le proporciona la propiedad de ser fcilmente manipulable para trabajar, pero su gran contenido en protenas hace que, generalmente, estn contaminadas con larvas de insectos 2. Las flores son de color amarillo y blanco y se agrupan en inflorescencias sobre una brctea membranosa. Justamente son las inflorescencias las que contienen los principios activos utilizados como ansioltico; sedante; espasmoltico; demulcente respiratorio; diurtico suave; regulador hepatovesicular; anticoagulante; tratamiento de enterocolitis, gastroenteritis, clicos hepticos y renales. Dentro de los principios activos utilizados en el tratamiento de las patologas anteriormente mencionados encontramos: aceites esenciales, flavonoides, muclagos, cumarinas, taninos, cidos fenil-carboxlicos (ac.cafeico), polifenoles 1. De todos los usos mencionados, la actividad sedante y ansioltica es la ms popular dentro de la medicina tradicional. Se cree que la misma se debe a la actividad de un flavonoide denominado kaempferol al cual se le asocia actividad de tipo agonista sobre el receptor GABA similar las benzodiazepinas 10. Normalmente el tilo se administra mediante infusin de las inflorescencias y brcteas en concentracin del 0.5-1% (2-3 tazas/dia) cuando se desea obtener un efecto ansioltico o sedante. Tambin puede obtenerse el mismo efecto bajo administracin de cpsulas (250-300 mg 3 veces/dia) 4. Entre las precauciones que se deben tener en cuenta a la hora de la administracin de esta planta medicinal, debemos tener en cuenta la posibilidad latente de que los efectos sedantes se vean potenciados por administracin simultnea o conjunta con antihistamnicos, barbitricos, benzodiazepinas y alcohol. De esta manera, la persona debe informar al profesional de consulta sobre todo tipo de medicacin que utiliza de manera permanente o espordica para evitar efectos no deseados.

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ESTUDIOS PRECLINICOS:
En los estudios que se analizaran a continuacin se evala la actividad de los extractos mediante algunos de los siguientes ensayos:
HIPNOSIS INDUCIDA POR PENTOBARBITAL SDICO: El pentobarbital es

un barbitrico que acta provocando sueo al actuar sobre el SNC. Con esta prueba se evala la capacidad de las drogas de inters de potenciar los efectos hipnticos del barbitrico (disminuye el tiempo de induccin y aumenta el periodo de sueo) o antagonizarlos (aumenta el tiempo de induccin y disminuye el periodo de sueo); entendiendo por induccin de la hipnosis como la perdida del reflejo de postura y como periodo de sueo aquella porcin de tiempo que transcurre entre la perdida y la recuperacin de dicho reflejo 1. LABERINTO EN CRUZ ELEVADO: Este experimento consiste en colocar los ratones a evaluar en el centro de una estructura que tiene la forma de cruz, est elevada respecto del nivel del suelo, y presenta la particularidad que dos de sus ramas contienen paredes a sus costados que dan la sensacin de lugar cerrado y oscuro; mientras que las otras dos ramas se denominan abiertas porque no presentan dichas paredes a sus lados. Las ramas abiertas y cerradas se encuentran enfrentadas. La evaluacin consiste en colocar los ratones en el centro de la estructura y determinar la cantidad de veces que el ratn ingresa a cada tipo de rama y el tiempo que permanece en su interior en un periodo determinado (generalmente es de 5 minutos). Esta prueba se lleva a cabo para evaluar la actividad ansioltico de la droga en cuestin; y el fundamento radica en que los ratones son animales de hbito nocturno, por lo que se estima que permanecern, preferentemente, en la rama cerrada. De esta manera, un aumento en los tiempos de permanencia en la rama abierta implica un efecto ansioltico-desinhibitorio de la droga en cuestin 1.
HOLE-BOARD

(TABLA AGJEREADA): Los ratones son colocados individualmente, despus de ser tratados, en el centro de una tabla que contiene 16 hoyos de 3 cm de dimetro cada uno y esos hoyos se encuentran en la parte superior de la tabla, de manera que la exploracin de los mismo se realiza hacia un espacio oscuro. La tabla est contenida en una caja de vidrio. El ratn es analizado durante un tiempo determinado (generalmente son 3 minutos) y se evala la cantidad de veces que explora los hoyos (movimiento denominado head-dips). Este test se utiliza para evaluar efectos ansiolticos debido a que la desinhibicin provocar en el roedor un aumento del nmero de exploraciones de tipo head-dips. Un efecto sedante provocar un descenso en las mismas ya que la movilidad se ve afectada durante el periodo de sedacion (1).

EXPLORACIONES VERTICALES: Esta prueba consiste en colocar los ratones

tratados de manera individual en un cilindro de 16 cm de alto y 11 cm de dimetro durante un tiempo predeterminado (generalmente 5 minutos) y contar la cantidad de veces que el roedor se eleva sobre sus patas traseras con el objetivo de explorar. La evaluacin sirve para determinar efectos ansiolticos de la droga ya que se considera

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que el aumento en las exploraciones es debido al efecto desinhibitorio mientras que un descenso respecto del control determina efectos sedantes 1.
PRUEBA DE ACTIVIDAD LOCOMOTORA: La misma radica en medir la

actividad locomotora total (de define como la suma de la actividad ambulatoria mas los movimientos estereotipados) de los animales tratados para medir cmo afecta la droga de inters en la misma. Para ello se utiliza una caja de dimensiones conocidas (la mas comn es de 36x15x20 cm) que contiene 2 barras laterales con sensores que detectan todos los movimientos del ratn durante un tiempo de 5 minutos. Un aumento en el nmero de tales movimientos refleja un estado desinhibido del animal tratado, mientras que un descenso abrupto de los mismos refleja un estado sedado 10. CAMPO ABIERTO: Es idntica a la anterior pero carece de sensores. Los mismos son reemplazados por una cuadrilla que se ubica en el piso de la caja y el operador cuenta el nmero de lneas que cada ratn cruza en un tiempo determinado (generalmente 2 minutos o 5 minutos). A mayor nmero de lneas cruzadas respecto del control negativo ms desinhibido est el ratn por efecto ansioltico de la droga en estudio; mientras una cada notoria en el nmero de lneas atravesadas refleja una falta de movimiento de locomocin caracterstica del efecto de sedacion 10.

ESTUDIO PRECLINICO N 1
En el trabajo de Aguirre-Hernndez E. y col.1 (Pharmalogycal evaluation of the anxiolytic and sedative effects of Tilia americana L. var. Mexicana in mice) se analizo el efecto sedante y ansioltico de los extractos metanlico y hexanlico obtenidos de las inflorescencias de Tilia americana variedad mexicana. Para realizar las pruebas se utilizaron grupos de ratones machos cuyo peso variaba entre 25-30 gr; y entre los ensayos realizados encontramos la hipnosis inducida por pentobarbital sdico, el laberinto en cruz elevado, el test de exploraciones verticales (conocido como exploratory rearings test), la prueba de la tabla agujereada (hole-board test) y la prueba de campo abierto. Entre las drogas que se utilizaron como referencia encontramos el pentobarbital sdico y el Diazepam. Los resultados arrojaron que ambos extractos presentaron efecto hipntico al prolongar el periodo de sueo inducido por el barbitrico de referencia, pero no modificaron los tiempos de latencia para inducir la sedacion y la hipnosis (ver tabla 1).

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Tabla 1. efecto de extractos de hexano y metanol (60 min. tras de adm.IP) en test de hipnosis inducida por

pentobarbital sdico (Aguirre-Hernndez E. y Col. 2006)1

Dosis (mg/kg) Vehculo

10 30 300 1000 10 30 300 11115 11519 7414 698 904 806 767 564

Latencia Sedacion Hipnosis

24823 26628 21928 18129 21011 21615 1398 14011

Duracin Hipnosis
73183 1560290 a 1155188 229191 a 2440120 a 1862250 2541245 b 7095211 b

Ext. Hexano

Ext. Metanol

Los datos obtenidos provienen del promedio de cinco o seis resultados a (F4.25 =17.90; P< 0.001). b (F3.16 = 4.98; P< 0.01).

En cuanto a la actividad ambulatoria se vio un efecto de tipo ansioltico o desinhibitorio con las dosis mas bajas de ambos extractos y un efecto sedante a medida que la dosis era aumentada, aunque dicho efecto siempre se encontr por debajo de los mismos provocados por la Benzodiazepina de referencia. Estas conclusiones parten de analizar los resultados arrojados por el laberinto en cruz, la prueba de campo abierto, la prueba del cilindro de exploraciones verticales y la prueba de la tabla agujereada. Como conclusin de este trabajo los autores mencionan que ambos extractos presentan los efectos esperados en cuanto a su actividad sobre el SNC; pero lo que todava no se ha podido dilucidar son aquellas estructuras responsables de dicho efecto ni el mecanismo mediante el cual acta, aunque se cree que el sistema inhibitoria GABA estara involucrado en los hechos observados. En cuanto a la comparacin entre los dos extractos los autores observaron actividad en ambos, aunque el metanlico fue superior en las actividades analizadas as como tambin el anlisis de toxicidad reflejo, mediante los valores de DL50, que la misma es 8 veces inferior en el extracto metanlico respecto del hexanlico.

ESTUDIO PRECLINICO N 2
El objetivo del trabajo realizado por Prez-Ortega G. y col.8 (Sedative and anxiolytic efficacy of Tilia americana var. Mexicana inflorescenses used traditionally by communities of State of Michoacn, Mxico) fue evaluar la actividad sedante-ansioltico de la especie Tilia variedad mexicana, la cual se distribuye a lo largo te todo Mxico; y comparar determinar si dicho efecto es diferente en la materia prima recolectada de manera directa respecto de aquella adquirida en diversos mercados. Los experimentos que se realizaron fueron la induccin de la hipnosis con pentobarbital sdico y la evaluacin del efecto que tiene el extracto acuoso de las inflorescencias de Tilo variedad mexicana sobre la misma; la evaluacin en campo abierto, la prueba Hole-board (tabla agujereada) y el laberinto en cruz. Para dichos experimentos se utilizaron ratones machos albinos cuyo peso oscilo entre

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los 25-30 gr, estando los grupos de estudio formados por 6 ratones cada uno. Como droga de referencia se utiliz Diazepam, una Benzodiazepina cuyo efecto ansioltico y sedante es conocido. Entre los resultados que obtuvieron, los autores mencionan que no se han encontrado diferencias significativas entre el Tilo recolectado de manera directa y aquel obtenido de mercados locales. En cuanto a los efectos en s, se observ que los tiempos de latencia inducidos por pentobarbital sdico no sufrieron modificacin ante la administracin del extracto, pero s hubo un aumento del tiempo que permanecieron dormidos los roedores. La actividad ambulatoria se vio modificada levemente por la administracin del extracto acuoso (mucho menos que ante la administracin de Diazepam); aunque s se vio un efecto de tipo sedante en la prueba Hole-board (tabla agujereada) ya que disminuyeron las exploraciones. Por su parte el laberinto en cruz arroj una respuesta de tipo ansioltica al aumentar el tiempo de residencia en las ramas abiertas, aunque no tan pronunciado como el observado ante la administracin de Diazepam. En conclusin, los autores estn en condiciones de afirmar que Tilo mexicana presenta efectos de tipo ansioltico y sedante. Las respuestas no fueron atribuidas a un principio activo especfico ya que el Tilo tiene una variada composicin que incluye steres, cidos alifticos, terpenoides, polifenoles, flavonoides, etc. De todos estos componentes solo algunos estn presentes en el extracto acuoso analizado (los ms polares), siendo los flavonoides aquellos estudiados en ms detalle. Mediante un perfil de composicin de flavonoides realizado por la tcnica HPLC se obtuvo la siguiente tabla .
Tabla 2

Presencia de flavonoides en extracto acuoso de inflorescencias de Tilia americana variedad mexicana (Prez-Ortega G. y col. 2007).8

% de densidad analizado por HPLC

Simple Recolectadas S1 S2 Mercados M1 M2 M3 M4 1 3.66 3.86 9.11 6.56 8.85 5.63 2 13.78 10.99 18.00 8.52 26.27 13.18 3 4.22 3.64 10.22 16.10 17.72 12.41 4 24.01 12.36 10.51 28.91 13.45 17.00 5 7.89 15.89 6.73 4.61 3.09 3.28 6 14.36 6.87 2.12 6.39 8.10 16.54 7 13.76 11.89 7.38 7.36 8.88 5.27 8 4.40 7.11 24.57 9 6.63 8.14 11.35 2.30 10 3.25 7.53 3.77 4.86 5.15 12.37 11 4.34 12 4.30 5.66 6.71 12.01 13 2.18 1.57 14 1.77 15 1.72 5.41 3.77 -

De la misma vemos que los compuestos 1-7 son los que estn presentes en todos los extractos analizados y por lo tanto podran ser responsable/s de la actividad a nivel central. Los nicos flavonoides que se pudieron identificar fueron kaempferol y quercetina debido a que se tenan patrones de los mismos; pero los autores no evaluaron si son los responsables de la actividad.

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ESTUDIO PRECLINICO N 3
Los autores de este trabajo Viola H. y col.10 (Isolation of pharmalogically active benzodiazepine receptor ligando from Tilia tomentosa (Tiliaceae)) se fijaron como objetivo aislar y caracterizar aquellas sustancias que estn presentes en las inflorescencias de Tilia tomentosa y que se caracterizan por tener algn tipo de interaccin con los receptores de Benzodiazepinas de manera de producir un efecto teraputico de tipo ansioltico y sedante. Para ello los autores siguieron un protocolo especfico de purificacin que permite obtener el tipo de sustancias buscadas. Las inflorescencias provenan de mercados locales ubicados en Buenos Aires. En el experimento se utilizaron ratones machos cuyo peso oscilaba entre 28-35 gr, y los grupos de evaluacin estaban constituidos de 10 ratones cada uno. Entre las pruebas realizadas podemos mencionar el laberinto en cruz elevado, la prueba Hole-board (tabla agujereada) y la prueba de la actividad locomotora. En funcin de los resultados obtenidos, los responsables de este trabajo pudieron afirmar la presencia de efectos ansiolticos y sedantes en el extracto que se obtuvo siguiendo el protocolo de purificacin; el problema es que con dicho protocolo se obtuvo una cantidad importante de sustancias, de las cuales, slo el kaempferol pudo ser identificado usando espectroscopia de masa a travs de la tcnica de superposicin de espectros y HPLC en fase reversa utilizando un testigo de dicho compuesto como referencia En este grafico, los autores, analizaron el efecto de tres dosis distintas de kaempferol en la prueba de laberinto en cruz elevado y la contrastaron frente al vehculo utilizado a lo largo de todo este trabajo, obteniendo como resultado la ausencia de diferencias significativas entre el flavonoide y el vehculo, por lo que el kaempferol no produce efectos ansiolticos, probablemente debido a su baja afinidad por el receptor de Benzodiazepina. De esta forma, los autores retomaron el extracto crudo inicial

Fig. 2. Performance de ratones tras ensayo durante 5 min. en Test laberinto en cruz elevado tras haber sido administrados 15 minutos previo con VEH o kaempferol en dosis de 1,3 o 10 mg/kg (K1, K3 y K10, respectivamente). Los resultados se expresan como desviacin del nmero total de entradas a la rama abierta (barra rayada), porcentaje de entrada en rama abierta (barra sin relleno) y como porcentaje de tiempo permanecido en las ramas abiertas (barra oscura). La cantidad de ratones utilizados se aclara entre parntesis. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos analizados. F (3.73; 0.05)= 2.44; F (3.73; 0.05)= 2.16; F (3.73, 0.05)=1.83 para cada parmetro descrito anteriormente (Viola H. y Col, 1994).10

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y remodelaron el protocolo de manera de modificar la composicin de lo obtenido en bsqueda de resultados que justifiquen la actividad ansioltica y sedante del Tilo. Los nuevos extractos s mostraron los efectos esperados. Este hecho explica que el efecto sobre SNC no es aportado por el kaempferol sino que tendra que deberse a otros flavonoides. Estudios posteriores que se publicaron en el mismo trabajo demostraron que algunos compuestos provenientes de otras especies cuya actividad de tipo agonista sobre los receptores de benzodiazepinas es conocida fueron identificados mediante espectroscopia UV y probados en los experimentos de laberinto en cruz. Estos compuestos eran de naturaleza flavonoide y solo tres de ellos demostraron efectos ansiolticos (ver tabla 3 adjunta) pero hacen falta mas pruebas para identificar cules estan presentes en las inflorescencias de Tilo y quienes son los responsables de la actividad observada ya que se desconoce la composicin de las partes usadas.
Tabla 3 Efecto de diversos flavonoides y Diazepam sobre la unin al Receptor de BZD en la prueba del

laberinto en cruz (Viola H. y Col. 1994).10

Compuesto Amentoflavone Apigenin Chalcone Chrysin Fisetin Flavone Isoquercitrin Faempferol Luteolin Morin Quercetin Rutine Diazepam

IC50 sobre receptor de BZD 6-10 nM 3 uM >100 uM 3 uM >100 uM 2-3 uM >100 uM 93 uM >100 uM >100 uM >100 uM >100 uM 8 nM

Efectos ansiolticos + ND + ND + ND ND ND ND ND +

ND No determinado - No presenta diferencias significativas con el vehculo + Aumento significativo en lo valores de entradas en la rama abierta y el tiempo de permanencia en las mismas durante el ensayo de laberinto en cruz

Lo que es claro es que el uso tradicional etnofarmacolgico que presenta el Tilo se corrobora con estos estudios pero hasta el momento no ha sido posible atribuir dicho efecto a un compuesto en particular.

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CONCLUSIONES
Tras la recoleccin de las pruebas experimentales detalladas anteriormente y su anlisis, podemos concluir que el Tilo es una planta medicinal cuyos efectos farmacolgicos se manifiestan de manera fehaciente y el uso popular como ansioltico, sedante e hipntico tiene un sustento cientfico y demostrable mediante la realizacin de un protocolo de obtencin de principios activos y su posterior evaluacin en las pruebas preclnicas correspondientes. Con respecto a los componentes, todava no se ha encontrado aquel que sea el responsable total de la respuesta observada, y si bien, se le atribuyen los efectos manifestados a los flavonoides, se sabe que el kaempferol (principal flavonoide contenido en el extracto) no interviene de manera directa en la respuesta biolgica. Tampoco podra descartarse un rol secundario de ste que permita que otras sustancias sean las responsables de la actividad a nivel central. Las sustancias que intervienen presentan un grado importante de polaridad en lo que respecta a sus propiedades, ya que se ha corroborado que los extractos acuosos y metanolicos (solventes de tipo polar) son mas efectivos que los extractos obtenidos utilizando hexano (solvente no polar). De igual manera, as como podemos encontrar flavonoides en los extractos acuosos y metanolicos, existen otras sustancias que presenta afinidad por estos solventes y que tambin son extradas al utilizarlos; por lo tanto no podramos afirmar que el efecto observado es exclusivo de los flavonoides. Independientemente de que dicho efecto sea producto de la interaccin entre los flavonoides o de stos con otras sustancias, es claro que los efectos observados son de tipo dosis-dependiente, y siempre inferiores a los observados con las benzodiazepinas en las dosis teraputicas recetadas. Por ltimo, en lo que respecta al mecanismo de accin, se cree que los componentes del Tilo actan de manera similar a las benzodiazepinas, es decir, a travs de la modulacin de la sinapsis GABAergica a nivel del Sistema Nervioso Central. Aunque esto ltimo no ha sido claramente corroborado, hay indicios del mismo y se est abordando conjuntamente con la identificacin de los flavonoides presentes en los extractos de inflorescencias y de aquellas otras sustancias que puedan verse relacionadas con los efectos descriptos.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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7. Mandrile E.L. (2006). Farmacognosia de Plantas Medicinales que se dispensan en Argentina, La Plata, Prov. De Bs.As, Argentina, DASA Calidad Grafica, 2006. 8. Prez-Ortega G., Guevara-Fefer P., Chvez M., Herrera J., Martnez A., Martnez A.L., Gonzlez-Trujano M.E., Sedative and anxiolytic efficacy of Tilia americana var.mexicana inflorescences used tradicionally by communities of State of Michoacn, Mexico, Journal of Ethnopharmacology (2008), 1-8. 9. Sorar, S.B. y Bandoni, A.L. (1978). Plantas de la medicina Popular Argentina, Buenos Aires, Argentina, Editorial Albatros, 1978. 10. Viola H., Wolfman C., Levi de Stein M., Wasowski C., Pea C., Medina J.H., Paladn A.C., Isolation of pharmacologically active benzodiazepine receptor ligando from Tilia tomentosa (Tiliaceae), Journal of Ethnopharmacology (1994) 44, 47-53.