NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4458
2007-12-12

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOS PARA ANIMALES. MTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE COLIFORMES O Escherichia coli O AMBOS. TCNICA DE RECUENTO DE COLONIAS UTILIZANDO MEDIOS FLUOROGNICOS O CROMOGNICOS

E:

MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING STUFFS. HORIZONTAL METHOD FOR THE ENUMERATION OF COLIFORMS AND/OR ESCHERICHIA COLI. COLONY COUNT TECHNIQUE USING FLUOROGENIC OR CHROMOGENIC CULTURE MEDIA.

CORRESPONDENCIA:

DESCRIPTORES:

mtodo horizontal; mtodo de anlisis; microbiologa; anlisis microbiolgico; recuento; recuento en placa; escherichia coli; coliformes; alimentacin animal.

I.C.S.: 07.100.30
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC) Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435

Prohibida su reproduccin

Primera actualizacin Editada 2007-12-21

PRLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo caracterizado por la participacin del pblico en general. La NTC 4458 (Primera actualizacin) fue ratificada por el Consejo Directivo de 2007-12-12. Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a travs de su participacin en el Comit Tcnico 25 Microbiologa. ACEGRASAS S.A. ALIMENTOS POLAR COLOMBIA S.A. ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A. ANNAR DIAGNOSTICA IMPORT LTDA. ARCHIVO DE BOGOT ASBIOQUIM LTDA. ASEBIOL LABORATORIO LTDA. ASINAL LTDA. ASOCIACIN COLOMBIANA DE CIENCIA Y TECNOLOGA COSMTICA -ACCYTECASOCIACIN DE MICROBILOGOS JAVERIANOS AVESCO KOKORICO S.A. BIANALISIS BIOCONTROL LTDA. BIOMERIEUX COLOMBIA S.A. BIOQUILAB LTDA. CALIDAD INDUSTRIAL LTDA. CARULLA VIVERO S.A. COLOMBINA S.A. COMPAA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A. CREPES & WAFLES S.A. DON MAZ S.A. ENZIPN DE COLOMBIA LTDA. FRIGORFICOS COLOMBIANOS S.A. FRIGORFICOS GUADALUPE S.A. IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA. JHONSON DIVERSEY COLOMBIA LTDA. KOYOMAD S.A. LA CAMPIA S.A. LABCONTROL E.U. LABFARVE LABORATORIO DE FARMACOLOGA VEGETAL LABORATORIO DE GENTICA Y BIOLOGA MOLECULAR LABORATORIO EMICAL LTDA. LABORATORIOS GRAM LTDA. LABORATORIOS MICROLAB LTDA. LESNIAK E.U. MERCADEO DE ALIMENTOS DE COLOMBIA S.A. MERCK S.A. MICROBILOGOS ASOCIADOS LTDA. NULAB LTDA. PURIFICACIN Y ANLISIS DE FLUIDOS LTDA. QUIK LTDA. SOLUCIONES INTEGRALES MICROBIOLGICAS E.U. -SIMSUIZO S.A. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES UNIVERSIDAD MANUELA BELTRN UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

Adems de las anteriores, en Consulta Pblica el Proyecto se puso a consideracin de las siguientes empresas: 3M COLOMBIA S.A. ALGARRA S.A. AQUALAB ASOCIACIN COLOMBIANA DE MICROBIOLOGA BAVARIA S.A. BIOTRENDS LABORATORIOS CASA LUKER S.A. CENICAA CENTROAGUAS S.A. E.S.P. CERCAL LTDA. CERVECERA LEONA S.A. CONGELAGRO CONSULTORA BLANCA USECHE COOPERATIVA DE GANADEROS DE CARTAGENA LTDA. DU PONT QUALICON COLOMBIA S.A. EMPRESA DE ACUEDUCTO Y ALCANTARILLADO DE BOGOT FABRICA DE ESPECIAS Y CONDIMENTOS EL REY S.A. FRUGAL S.A. HOSPITAL DEPARTAMENTAL DE VILLAVICENCIO INGENIO PICHICHI S.A. INGENIO RIOPAILA INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO ICA INSTITUTO NACIONAL DE SALUD -INS INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS INVIMALA CONSTANCIA COLOMBIA S.A. LABORATORIO MICROBIOLGICO SIS LABORATOTORIO MICROBIOLGICO DE BARRANQUILLA LARKIN LTDA. LEVAPN S.A. LLOREDA GRASAS S.A. MEDIIMPLANTES LTDA. MICROLABY LTDA. MINISTERIO DE LA PROTECCIN SOCIAL. NESTL DE COLOMBIA S.A. PASIFLORA COLOMBIANA S.A. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA PRODUCTORA DE CONCENTRADOS Y JUGOS DE FRUTA QUALA S.A. QUIOS LTDA. REPRESENTACIONES BIOTECNOLGICAS LTDA. RICA RONDO, INDUSTRIA NACIONAL DE ALIMENTOS S.A. SCHERING COLOMBIANA S.A. SECRETARA DISTRITAL DE SALUD DE BOGOT TECNIMICRO LABORATORIO DE ANLISIS UNIVERSIDAD CATLICA INGECAL VIKINGOS S.A.

ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados. DIRECCIN DE NORMALIZACIN

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NTC 4458 (Primera actualizacin)

CONTENIDO

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1.

OBJETO .......................................................................................................................1

2.

REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................1

3.

TRMINOS Y DEFINICIONES .....................................................................................2

4. 4.1 4.2 4.3 4.4

PRINCIPIO....................................................................................................................2 BACTERIAS COLIFORMES FRENTE A UN MEDIO CROMOGNICO .....................2 Escherichia coli FRENTE A UN MEDIO FLUOROGNICO .....................................2 Escherichia coli FRENTE A UN MEDIO TRIPTONA BILIS X-GLUCORNIDO .......3 GENERALIDADES .......................................................................................................3

5. 5.1 5.2 5.3

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTE .......................................................................3 GENERALIDADES ......................................................................................................3 DILUYENTE..................................................................................................................3 MEDIO SELECTIVO SLIDO: AGAR - LACTOSA - BILIS - ROJO NEUTRO CRISTAL VIOLETA, VRBL - PARA COLIFORMES....................................................3 MEDIO SELECTIVO SLIDO: AGAR-LACTOSA-BILIS-ROJO NEUTRO-CRISTAL VIOLETA, + MUG PARA COLIFORMES Y E COLI.................4 MEDIO SELECTIVO SLIDO: AGAR CON TRIPTONA BILIS X GLUCORNIDO ...5

5.4

5.5

6. 6.1

EQUIPO Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO...6 APARATO PARA ESTERILIZACIN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIN EN HMEDO (AUTOCLAVE) ......................................................................................6 INCUBADORA..............................................................................................................6

6.2

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6.3 6.4 6.5 6.6 6.7

CAJAS DE PETRI .......................................................................................................6 PIPETAS DE SUMINISTRO TOTAL O MICROPIPETAS ............................................6 BAO DE MARA ........................................................................................................6 EQUIPO DE RECUENTO DE COLONIAS ...................................................................6 MEDIDOR DE pH .........................................................................................................6

7.

MUESTREO..................................................................................................................6

8.

PREPARACIN DE LA MUESTRA DE ENSAYO.......................................................6

9. 9.1 9.2 9.3

PROCEDIMIENTO........................................................................................................7 SUSPENSIN INICIAL Y DILUCIONES ......................................................................7 INOCULACIN E INCUBACIN .................................................................................7 RECUENTO DE LAS COLONIAS................................................................................7

10. 10.1 10.2 10.3

EXPRESIN DE LOS RESULTADOS ........................................................................8 Escherichia coli - MEDIO FLUOROGNICO .............................................................8 Escherichia coli MEDIO CROMOGNICO ..............................................................8 Escherichia coli MEDIO AGAR CON TRIPTONA BILIS X GLUCORNIDO 5-BROMO-4-CLORO-3-INDOLIL-D-GLUCURONIDO .................8

11. 11.1 11.2

MTODO DE CLCULO..............................................................................................8 CASO GENERAL .........................................................................................................8 CASO EN EL QUE CADA CAJA CONTIENE MENOS DE 15 COLONIAS CARACTERSTICAS....................................................................................................9 ESTIMACIN DE NMEROS PEQUEOS.9 COLONIAS NO CARACTERSTICAS .......................................................................10

11.3 11.4

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NTC 4458 (Primera actualizacin)

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12. 12.1

PRECISIN ................................................................................................................10 CAJAS QUE CONTENGAN ENTRE 15 Y 150 COLONIAS CARACTERSTICAS..................................................................................................10 CADA CAJA CONTIENE MENOS DE 15 COLONIAS CARACTERSTICAS ...........10

12.2

13.

INFORME DEL ENSAYO ...........................................................................................10

ANEXOS ANEXO A (Normativo) LMITES DE CONFIANZA PARA LA ESTIMACIN DE NMEROS PEQUEOS DE COLONIAS.......................................................................................................................11 ANEXO B (Informativo) BIBLIOGRAFA......................................................................................................................12

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NTC 4458 (Primera actualizacin)

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOS PARA ANIMALES. MTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE COLIFORMES O Escherichia coli O AMBOS. TCNICA DE RECUENTO DE COLONIAS UTILIZANDO MEDIOS FLUOROGNICOS O CROMOGNICOS

1.

OBJETO

Esta norma da directrices generales de un mtodo horizontal para el recuento de coliformes, Escherichia coli, o ambos, presentes en productos destinados al consumo humano o alimentacin de animales, por medio de la tcnica de recuento de colonias en un medio slido cromognico o fluorognico despus de su incubacin a 35 C 1 C.
NOTA Esta norma no aplica para la deteccin de E. coli H7 O157 (vase la NTC 4899).

2.

REFERENCIAS NORMATIVAS

Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicacin de este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica nicamente la edicin citada. Para referencias no fechadas, se aplica la ltima edicin del documento normativo referenciado (incluida cualquier correccin). NTC 4206, Microbiologa de alimentos y de alimentos para animales. Reglas Generales para los anlisis microbiolgicos (ISO 7218). NTC 4491-1, Microbiologa de alimentos y alimentos para animales. Preparacin de muestras para ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales para anlisis microbiolgico. Parte 1. Reglas generales para la preparacin de la suspensin inicial y de diluciones decimales. NTC 4491-2, Microbiologa de alimentos y alimentos para animales. Preparacin de muestras para ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales para anlisis microbiolgico. Parte 2. Reglas especficas para la preparacin de carne y productos crnicos. NTC 4491-3, Microbiologa de alimentos y alimentos para animales. Preparacin de muestras para ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales para anlisis microbiolgico. Parte 3. Reglas especficas para la preparacin de pescado y productos de la pesca. NTC 4491-4, Microbiologa de alimentos y alimentos para animales. Preparacin de muestras para ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales para anlisis microbiolgico. Parte 4. Reglas especficas para la preparacin de productos diferentes de leche, productos lcteos, carne, productos crnicos, pescados y productos de la pesca. 1 de 12

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3. TRMINOS Y DEFINICIONES

NTC 4458 (Primera actualizacin)

Para los propsitos de esta norma se aplican las siguientes definiciones: 3.1 Coliformes. Grupo de bacterias que presentan ciertas caractersticas bioqumicas en comn e importancia relevante como indicadores de contaminacin del agua y los alimentos. Se encuentran comnmente en las plantas, el suelo y los animales, incluyendo a los humanos. El grupo coliforme est conformado por los siguientes gneros tales como Escherichia, Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter.
NOTA Se define como coliformes fecales, aquellos microorganismos que fermentan la lactosa a 44,5 C - 45,5 C, anlisis que permite descartar a Enterobacter, puesto que sta no crece a esa temperatura. Si se aplica este criterio crecern en el medio de cultivo principalmente E. coli (90 %) y algunas bacterias de los gneros Klebsiella y Citrobacter. La prueba de coliformes fecales positiva indica un 90 % de probabilidad de que el coliforme aislado sea E. coli. Sirven como indicadores de contaminacin fecal.

3.2 Escherichia coli. Bacilo corto gram negativo que forma parte de la flora normal de intestino de animales de sangre caliente. Es aerobio facultativo, de metabolismo fermentativo, O-Nitrofenli--D- galactopiransido positivo y su crecimiento ptimo es a 37 C. Algunas cepas pueden producir enterotoxinas y tiene otros factores de virulencia de colonizacin e invasin por lo cual pueden causar enfermedades diarreicas, as como infecciones urinarias y nosocomiales.

4. 4.1

PRINCIPIO BACTERIAS COLIFORMES FRENTE A UN MEDIO CROMOGNICO

Cuando se utiliza la tcnica enzimtica, el grupo coliforme se define como toda bacteria que posea la enzima -D galactosidasa; la cual tiene la propiedad de actuar sobre el substrato cromognico, formado en la liberacin del cromgeno. 4.2 Escherichia coli FRENTE A UN MEDIO FLUOROGNICO

Cuando se utiliza la tcnica enzimtica, la Escherichia coli es definida, como toda bacteria que da respuesta positiva al grupo coliforme y posee adems la enzima B-Glucoronidasa, la cual tiene la propiedad de abrir el substrato fluorognico, resultando en la liberacin del fluorgeno. Un substrato fluorognico tal como 4-metil-umbeliferil--D-glucornido (MUG) es utilizado para detectar la enzima B-glucoronidasa la cual es producida por E. coli. La enzima B-glucoronidasa hidroliza el substrato y da un producto fluorescente cuando es revelado bajo luz ultravioleta de onda larga (366 nm). La presencia de fluorescencia indica una prueba positiva para E.coli. El medio de cultivo utilizado se basa en la tecnologa del substrato definido, el cual emplea nutrientes - indicadores que producen color, fluorescencia, o ambos, al ser metabolizados por los microorganismos coliformes y E. coli; los cuales son detectados simultneamente. El reactivo proporciona dos nutrientes-indicadores especficos: ONPG (O- nitrofenil --dgalactopiransido) y MUG (4-metil-umbeliferil-- d- glucornido). Durante la metabolizacin de stos nutrientes por la enzima Coliforme -D galactosidasa y - glucoronidasa de E. coli, se produce un color amarillo (del ONPG) y fluorescencia (del MUG). Con lo cual queda confirmada la presencia de coliformes y de E. coli respectivamente. 2

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NOTA

NTC 4458 (Primera actualizacin)

Definiciones tomadas de la NTC 4772 coliformes en agua SM 9221F.

4.3

Escherichia coli FRENTE A UN MEDIO TRIPTONA BILIS X-GLUCORNIDO

La presencia de la enzima -D-glocoronidasa diferencia la E. coli de los otros coliformes. E. coli absorbe el sustrato cromognico 5-bromo-4-cloro-3-indol--D-glocornido (X--D-glocornido). La enzima -glucoronidasa rompe los enlaces entre el 5-bromo-4-cloro-3-indolil cromforo y el -D-glocornido. Las colonias de E. coli se tornan de color verde azuloso. La flora acompaante de microorganismos gram positivos, es inhibida por el uso de sales biliares y la incubacin a una temperatura de 44 C. 4.4 GENERALIDADES

4.4.1 Se realizan siembras utilizando un medio de cultivo selectivo y empleando una cantidad especificada de la muestra de ensayo si el producto inicial es lquido, o una cantidad especificada de una suspensin inicial en el caso de otros productos. Se realizan otras siembras en las mismas condiciones, usando diluciones decimales de la muestra de ensayo o de la suspensin inicial. 4.4.2
NOTA

Se incuban las placas a 35 C 1 C durante 24 h.

Para productos lcteos la incubacin de los coliformes debe hacerse a 32 1 C durante 24 2 h.

4.4.3 Se calcula el nmero de coliformes y E. coli por mililitro o por gramo de muestra a partir del nmero de colonias obtenido en las cajas seleccionadas (vase el numeral 10).

5. 5.1

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTE GENERALIDADES

Para los procedimientos de laboratorio corrientes, vase la NTC 4206 (ISO 7218). 5.2 DILUYENTE

Vanse las normas NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3, NTC 4491-4 y la norma especfica relacionada con el producto sometido a anlisis. 5.3 MEDIO SELECTIVO SLIDO: AGAR - LACTOSA - BILIS - ROJO NEUTRO CRISTAL VIOLETA, VRBL - PARA COLIFORMES

NOTA Se utiliza el medio VRBL o cualquier otro similar preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

5.3.1

Composicin del medio VRBL 7,0 g 3,0 g 10,0 g 5,0 g 3

Peptona Extracto de levadura Lactosa Cloruro de sodio

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Sales biliares Rojo neutro Cristal violeta Agar Agua destilada o desionizada 5.3.2 Preparacin

NTC 4458 (Primera actualizacin)

1,5 g 0,03 g 0,002 g 12 g a 18 g 1 1 000 ml

Se procede como se indica a continuacin, para conservar la capacidad selectiva y especificidad del medio. Se mezclan muy bien en agua, los componentes o el medio completo deshidratado, y se dejan reposar durante varios minutos. Se verifica el pH despus del calentamiento, este debe ser 7,4 0,2 a 25 C. Se permite que ebulla hasta su disolucin y se enfra inmediatamente el medio en un bao de mara (vase el numeral 6.5) a 45 C 1 C. Verificar la preparacin segn las instrucciones del fabricante. En consecuencia, no se debe esterilizar en autoclave y se debe verificar la esterilidad del medio en el momento de su uso (vase el numeral 9.2.2). El medio se debe usar dentro de un lapso mximo de 3 h desde el momento de su preparacin. Verificar si hay evidencia que despus de las tres horas se ven afectados los recuentos. 5.4 MEDIO SELECTIVO SLIDO: AGAR-LACTOSA-BILIS-ROJO NEUTRO-CRISTAL VIOLETA, + MUG PARA COLIFORMES Y E. coli Composicin del medio VRBL + MUG 7,0 g 3,0 g 10,0 g 5,0 g 1,5 g 0,03 g 0,002 g 0,1 g

5.4.1

Peptona Extracto de levadura Lactosa Cloruro de sodio Sales biliares Rojo neutro Cristal violeta 4 metilumbeliferil -D glucornido MUG

De acuerdo con la resistencia del gel del agar.

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Agar Agua destilada o desionizada 5.4.2 Preparacin

NTC 4458 (Primera actualizacin)

12 g a 18 g 2 1 000 ml

Se procede como se indica a continuacin, para conservar la capacidad selectiva y especificidad del medio. Se mezclan muy bien en agua, los componentes o el medio completo deshidratado, y se dejan reposar durante varios minutos. Se verifica el pH despus del calentamiento, este debe ser de 7,4 0.2 a 25 C. Se permite que ebulla hasta su disolucin y se enfra inmediatamente el medio en un bao de mara (vase el numeral 6.5) a 45 C 1 C. Se debe evitar el calentamiento excesivo del medio. En consecuencia, no se debe esterilizar en autoclave y se debe verificar la esterilidad del medio en el momento de su uso (vase el numeral 9.2.2). El medio se debe usar dentro de un lapso mximo de 3 h desde el momento de su preparacin. 5.5 MEDIO SELECTIVO SLIDO: AGAR CON TRIPTONA BILIS X GLUCORNIDO

5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-glucuronido 5.5.1 Composicin del medio 20,0 g 1,5 g 0,075 g 15,0 g 1 000 ml

Peptona Sales biliares X B-D glucornido Agar Agua destilada o desionizada 5.5.2 Preparacin

Se mezclan muy bien en agua, los componentes o el medio completo deshidratado, y se dejan reposar durante varios minutos. Se verifica el pH despus del calentamiento, este debe ser 7,4 0,2 a 25 C. Se permite que ebulla hasta su disolucin y se enfra inmediatamente el medio en un bao de mara (vase el numeral 6.5) a 45 C 2 C. Autoclavar a 121 C por 15 min o segn las directrices de la casa comercial.
NOTA La determinacin de coliformes, E. coli o ambos puede realizarse tambin por los siguientes mtodos: siembra en membranas hidrofbicas con MUG, PCR inmunoprecipitacin (VIP), enzimoinmunoensayos (EIA).

De acuerdo con la resistencia del gel del agar.

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6.

NTC 4458 (Primera actualizacin)

EQUIPO Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO

NOTA El equipo y material desechable es una alternativa aceptable frente al material de vidrio reutilizable si cumple con las especificaciones adecuadas.

Se utiliza el equipo y material usual de laboratorio microbiolgico y, en especial, lo siguiente. 6.1 APARATO PARA ESTERILIZACIN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIN EN HMEDO (AUTOCLAVE)

Vase la NTC 4206 (ISO 7218). 6.2 INCUBADORA

Con capacidad de operar a 35 C 1 C. 6.3 CAJAS DE PETRI

De vidrio o plstico, con dimetro de 90 mm a 100 mm. 6.4 PIPETAS DE SUMINISTRO TOTAL O MICROPIPETAS

Con capacidad nominal de 1 ml. 6.5 BAO DE MARA

O equipo similar, con capacidad de operar a 45 C 2 C (para mantener los medios de cultivo antes de la siembra). 6.6 EQUIPO DE RECUENTO DE COLONIAS

Consistente en una base iluminada y un contador digital mecnico o electrnico. 6.7 MEDIDOR DE pH

Con aproximacin a 0,1 unidad de pH a 25 C.

7.

MUESTREO

El muestreo se debe haber efectuado de acuerdo con la norma especfica apropiada para el producto que se estudia de acuerdo con la AOAC (Oficial Methods of Anlisis of AOAC International). Si no existe una norma especfica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.

8.

PREPARACIN DE LA MUESTRA DE ENSAYO

La muestra de ensayo se debe preparar de acuerdo con las normas de la coleccin NTC 4491 para muestras microbiolgicas o normas que traten acerca del producto que interese. Si no existe norma especfica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este punto.

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9. 9.1 PROCEDIMIENTO

NTC 4458 (Primera actualizacin)

SUSPENSIN INICIAL Y DILUCIONES

Vanse las normas NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3, NTC 4491-4 y la norma especfica apropiada para el producto que interese. 9.2 INOCULACIN E INCUBACIN

9.2.1 Se toman dos cajas de Petri estriles (vase el numeral 6.3). Usando una pipeta estril (vase el numeral 6.4), se transfiere a cada caja 1 ml de la muestra de ensayo, si el producto es lquido o 1 ml de la suspensin inicial en el caso de otros productos (vase el numeral 9.1). Se toman otras dos cajas de Petri estriles. Usando otra pipeta estril, se transfiere a cada caja 1 ml de la primera dilucin decimal (10-1) de la muestra de ensayo, si el producto es lquido o 1 ml de la primera dilucin decimal (10-2) de la suspensin inicial en el caso de otros productos. Se repite el procedimiento descrito con las diluciones adicionales, usando una pipeta estril para cada dilucin decimal. 9.2.2 Se vierten aproximadamente entre 10 ml a 15 ml del medio (vase el numeral 5.3), a 45 C 2 C, en cada caja de Petri. El tiempo transcurrido entre el final de la preparacin de la suspensin inicial (o de la dilucin 10-1 si el producto es lquido) y el momento en que el medio (vase el numeral 5.3) se vierte en las cajas no debe ser mayor de 20 min. Cuidadosamente se mezcla el inculo con el medio y se deja solidificar la mezcla, estando las cajas de Petri sobre una superficie horizontal fra. 9.2.3 Despus de que se complete la solidificacin, se vierten aproximadamente 4 ml de medio de cultivo que cubra la superficie (vase el numeral 5.3, 5.4, 5,5) a 45 C 2 C, sobre la superficie del medio inoculado. Se deja solidificar como se describi anteriormente. Se pretende dejar una doble capa para visualizar mejor las colonias. 9.2.4 Se invierten las cajas preparadas y se incuban a 35 C 1 C durante 24 h 2 h.

9.2.5 Si el objeto del anlisis es solo la determinacin de E. coli, para una mejor recuperacin de bacterias injuriadas, incubar a 35 C 1 C (si son productos lcteos incubar a 30 C 1 C) las primeras 4 horas y despus incubar a 44 C 1 C por 18 h a 20 h. 9.3 RECUENTO DE LAS COLONIAS

Despus del perodo especificado de incubacin (vase el numeral 9.2.4), se cuentan las colonias coliformes caractersticas en cada caja que contenga no ms de 150 colonias3, ya sean caractersticas o no, usando el equipo para el recuento de colonias. Mediante la utilizacin de una lmpara de fluorescencia de 360 nm a 366 nm hacer la lectura de las bacterias E. coli fluorescencia positiva.
NOTA Despus de la incubacin durante 24 h, las colonias caractersticas son de color rojo prpura con un dimetro de 0,5 mm o mayor, y algunas veces estn rodeadas de una zona rojiza de bilis precipitada.

Por encima de este nmero existe el riesgo de que las colonias coliformes tengan una apariencia atpica.

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10.

NTC 4458 (Primera actualizacin)

EXPRESIN DE LOS RESULTADOS

Despus del periodo especificado de incubacin (vanse los numerales 9.2.4 para coliformes y 9.2.5 para E.coli), realizar el conteo de coliformes, incluyendo la E. coli y expresar independiente el conteo de bacterias coliformes del conteo de bacterias E. coli glucoronidasa positivas, utilizando el equipo para el recuento de colonias (vase el numeral 6.6). 10.1 Escherichia coli - medio fluorognico

Examinar las cajas de petri usando una lmpara de luz ultravioleta (preferiblemente de 6 watios, de onda larga (366 nm)). La presencia de fluorescencia es una prueba positiva para E. coli. Si la fluorescencia es cuestionable incubar por un periodo adicional de 4 h para la prueba con ONPG y hasta por un periodo adicional de 20 h para verificar la fluorescencia intensificada como prueba de resultado positivo. 10.2 Escherichia coli medio cromognico

Examinar las cajas de petri que presentan colonias de color azul verdosas (T,B,X, D glucornido). Se presume que la prueba es positiva para la presencia de E. coli. 10.3 Escherichia coli medio agar con triptona bilis x glucornido 5-bromo-4-cloro-3indolil-D-glucuronido

Examinar las cajas de petri que presentan colonias de color verde azuladas (D-glucornido). Se presume que la prueba es positiva para la presencia de E. coli.

11. 11.1

MTODO DE CLCULO CASO GENERAL

Cajas que contengan entre 15 colonias y 150 colonias caractersticas. Se seleccionan las cajas que contengan no ms de 150 colonias caractersticas en dos diluciones consecutivas. Es necesario que una de estas cajas contenga al menos 15 colonias caractersticas. Se calcula el nmero N de colonias por mililitro o por gramo de producto, dependiendo del caso, usando la siguiente ecuacin:
N= C (n1 + 0,1 n2 )d

en donde

C
n1 n2 d

= = = =

es la suma de colonias contadas en todos los cajas retenidos; es el nmero de cajas retenidos en la primera dilucin; es el nmero de cajas retenidos en la segunda dilucin; es el factor de dilucin correspondiente a la primera dilucin.

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NTC 4458 (Primera actualizacin)

Se redondea el resultado calculado con dos cifras significativas. Se toma como resultado el nmero de unidades formadoras de colonias, UFC/ml o UFC/g de producto, expresado como un nmero entre 1,0 y 9,9 multiplicado por 10x donde x es la potencia apropiada de 10.
EJEMPLO Un recuento de coliformes dio los siguientes resultados: -2 en la primera dilucin seleccionada (10 ): 83 y 97 colonias -3 en la segunda dilucin seleccionada (10 ): 13 y 8 colonias

N=

83 + 97 +13 + 8 201 C = = = 9136 (n1 + 0,1 n2) d (2 + 0,1 x 2 ) x 10 2 0,022

Al redondear el resultado como se indic antes, se obtiene 9 100 9,1 x 103 UFC/ml o UFC/g de producto. 11.2 CASO EN EL QUE CADA CAJA CONTIENE MENOS DE 15 COLONIAS CARACTERSTICAS

Si cada una de las cajas seleccionadas, contiene menos de 15 de colonias caractersticas, se calcula el nmero estimado NE de coliformes usando la ecuacin presentada en el numeral 11.1.
EJEMPLO Un recuento de colonias de coliformes dio los siguientes resultados: En una dilucin de 10-4 : 140 y 145 colonias, de las cuales 5 y 3 respectivamente fueron caractersticas. En una dilucin de 10 caractersticas.
NE =
-5

: 11 y 8 colonias, de las cuales 0 y 1 respectivamente fueron

(2 + 0,1 x 2) x 10 4

5 + 3 + 0+1

9 2,2 x 10 4

= 40 000

Al redondear el resultado como se especific en el numeral 10.1.1, da 4,0 x 10-4 UFC/ml o UFC/g del producto. 11.3 ESTIMACIN DE NMEROS PEQUEOS

Si las dos cajas, correspondientes a la muestra de ensayo (productos lquidos) o a la suspensin inicial (otros productos) contienen menos de 15 colonias caractersticas, los resultados se reportan as: < 15 UFC/ml (productos lquidos); < 15 x 1/d UFC/g (otros productos), en donde d es el factor de dilucin de la suspensin inicial.

NORMA TCNICA COLOMBIANA

11.4

NTC 4458 (Primera actualizacin)

COLONIAS NO CARACTERSTICAS

Si las dos cajas correspondientes a la muestra de ensayo (productos lquidos) o a la suspensin inicial (otros productos) no contienen colonias caractersticas, se informa el resultado como sigue: <1 UFC/ml (productos lquidos); <1 x 1/d UFC/g (otros productos), donde d es el factor de dilucin de la suspensin inicial.

12. 12.1

PRECISIN CAJAS QUE CONTENGAN ENTRE 15 Y 150 COLONIAS CARACTERSTICAS (vase el numeral 11.1)

Solamente por razones estadsticas, en el 95 % de los casos los lmites de confianza de este mtodo varan desde 16 % hasta 52 % (Cowell y Morisetti, J. Sci. Fd. Agric., 1969, Vol. 20, p. 573). En la prctica, se puede encontrar variacin an mayor especialmente entre resultados obtenidos por diferentes microbilogos. 12.2 CADA CAJA CONTIENE MENOS DE 15 COLONIAS CARACTERSTICAS (vase el numeral 11.2)

Consltese la Tabla A.1. Para obtener los lmites de confianza, se multiplican los lmites superior e inferior dados por 1/d, en donde d es el factor de dilucin.

13.

INFORME DEL ENSAYO

El informe de ensayo debe especificar: toda la informacin necesaria para la completa identificacin de la muestra; el mtodo de muestreo utilizado, si se conoce; el mtodo de ensayo utilizado, con referencia a esta parte de la norma; todos los detalles operativos no especificados en esta parte de la norma, o considerado como opcional, cualquier incidente detallado que pueda haber influenciado los resultados del ensayo; el resultado obtenido.

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NTC 4458 (Primera actualizacin)

ANEXO A (Normativo)

LMITES DE CONFIANZA PARA LA ESTIMACIN DE NMEROS PEQUEOS DE COLONIAS En la Tabla A.1 se dan los lmites de confianza al nivel del 95 % para la estimacin de nmeros pequeos, cuando el nmero de colonias en las cajas seleccionadas es menor de 15.
Tabla A.1 Lmites de confianza al nivel del 95 % Nmero de coliformes Inferior 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 <1 <1 <1 1 2 2 2 3 4 4 5 6 7 7 8 Superior 2 4 5 6 9 10 12 13 14 16 18 19 20 21 23

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NTC 4458 (Primera actualizacin)

ANEXO B (Informativo) BIBLIOGRAFA

[1]

The Scientific Association Dedicated to Analytical Excellence, Official Methods of Analysis of AOAC International. Method 996.02. Colifrms and E. coli in food, plate count technique. Chapter 17. 18th Edition, 2005. INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology. General Guidance for the Enumeration of Coliforms. Colony Count Technique. Geneva: ISO, 12 pp. (ISO 4832:2006). GTC 125, Gua de referencias de mtodos horizontales de anlisis microbiolgicos para bebidas, alimentos y alimentos para animales. Tabla No. 8. 2006. Fluorocult LMX Broth modified acc_ to MANAFI and OSSMER.htm. 2006-11-12. http://www.epa.gov/nerlcwww/online.htm. 2006-11-12. http://www.bergeys.org/. 2006-11-12. William B. Whitman. Bergey's Manual Trust. Department of Microbiology. 527 Biological Sciences Building. University of Georgia. Athens, GA 30602-2605. USA.

[2]

[3] [4] [5] [6] [7]

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