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Recuento de plaquetas

FUNDAMENTO DE LA TCNICA

La sangre se mezcla con un diluyente que hemoliza los glbulos rojos. El lquido diluido se coloca en un hemocitmetro y luego se cuentan las plaquetas en el microscopio, usando contraste de fases, si es posible.
MATERIALES/EQUIPAMIENTO

Cmara de recuento delgada, de fondo plano (hemocitmetro de contraste de fases con grillas de Neubauer). Microscopio de contraste de fases equipado con condensador de fases de larga distancia de trabajo; si no, un microscopio ptico corriente. Pipeta de 20 l. Pipeta graduada de 2 ml. Tubo de 12 75 mm. Mezcladora mecnica.
REACTIVO

Fluido diluyente: oxalato de amonio 1% en agua destilada. Conservar en el refrigerador y siempre filtrar inmediatamente antes de usar.
ESPCIMEN

Si la muestra se extrae por digitopuncin, la puncin debe ser limpia y la sangre debe uir libremente. Desechar la primera gota de sangre. Si la muestra de sangre se obtiene por venopuncin, se debe extraer con una jeringa seca de plstico (o de vidrio siliconado) con una aguja corta, mnimo calibre 21. La aguja se debe retirar antes de pasar la sangre a un recipiente de plstico con anticoagulante EDTA. La sangre y el anticoagulante se deben mezclar de inmediato y en forma suave para evitar que se forme espuma.
MTODO
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Pipetear 0,38 ml de uido diluyente en un tubo de ensayo. Llenar la pipeta de 20 l hasta la marca y limpiar la parte externa de la pipeta.

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DIAGNSTICO DE LA HEMOFILIA Y OTROS TRASTORNOS DE LA COAGULACIN

Volcar el contenido de la pipeta en el uido diluyente y enjuagar la pipeta extrayendo la sangre y volcndola dentro del tubo varias veces. Mezclar durante al menos 10 minutos a mano o, de ser posible, con mezcladora mecnica. Llenar el hemocitmetro, como se describe a continuacin. Cubrir la cmara con una placa de Petri de 10 a 20 minutos para permitir que las plaquetas se asienten. Dejar papel de filtro o algodn hmedo en la placa para evitar la evaporacin. Usando un microscopio, contar las plaquetas en los cuadrados grandes de 1 mm (= 0,1 l). Contar las plaquetas en todos los cuadrados que sean necesarios para llegar a contar al menos 100. Las plaquetas se ven redondas u ovaladas y debido a su estructura granular interna y su lustre prpura es posible distinguirlas de los residuos. En el fondo se ven restos de glbulos rojos que han sido descompuestos por el oxalato de amonio. Si no se dispone de contraste de fases, se puede utilizar un microscopio ptico corriente, siempre que se baje el condensador para disminuir la intensidad de la luz. Calcular la cantidad de plaquetas por litro de sangre de acuerdo con la frmula que aparece ms abajo.

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EL HEMOCITMETRO

La cmara de recuento del hemocitmetro, con grilla de Neubauer o de Neubauer mejorada, est construida de modo tal que la distancia entre la cara inferior del cubreobjetos y la superficie de la cmara sea de 0,1 mm. La superficie de la cmara contiene dos reas grilladas de dimensiones especficas tal como se ilustra en la figura 10.1. El rea central de 1 mm2 tiene lneas dobles o triples que marcan los bordes. En las reas centrales hay 25 cuadrados en la grilla de Neubauer mejorada y 16 cuadrados en la grilla de Neubauer. Cada cuadrado tiene un rea de 0,04 mm2 (0,2 0,2 mm). Estos cuadrados, a su vez, estn divididos en cuadrados ms pequeos, cada uno de 0,0025 mm2 (0,05 0,05 mm). Los cuadrantes externos del rea grillada son de 1 mm2 cada uno y estn divididos en 16 cuadrados.
CLCULOS

La frmula para efectuar el recuento plaquetario es la siguiente: Recuento (clulas/l) = N D/A 10 106 Donde cantidad total de clulas contadas dilucin rea total contada (en mm2) factor para calcular el volumen en l desde el rea (en mm2) y la profundidad de la cmara (0,1 mm) 106 = factor para convertir el recuento/l en recuento/l
RECUENTO DE PLAQUETAS

N D A 10

= = = =

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Figura 10.1. Cmara de recuento del hemocitmetro (a) Neubauer y (b) Neubauer mejorado
(a)

1 mm

3 mm

1 mm

(b)

1 mm

3 mm

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DIAGNSTICO DE LA HEMOFILIA Y OTROS TRASTORNOS DE LA COAGULACIN

FUENTES DE ERROR EN EL RECUENTO DE CLULAS

Cuando se utiliza sangre capilar, se debe obtener una gota que uya libremente. Cuando se utiliza sangre anticoagulada, se debe mezclar el espcimen cuidadosamente invirtiendo el tubo de sangre al menos 20 veces antes de tomar la muestra. No sacudir el tubo, porque al sacudirlo se produce espuma, que impedir usar la pipeta con exactitud. Inclinar el tubo bien mezclado a un ngulo de 45 o apenas ms, y con la pipeta tomar la muestra desde el borde del tubo, siguiendo los mismos procedimientos que para la sangre capilar. Las pipetas para la toma de muestras de sangre deben estar limpias y secas. Llenar la pipeta aspirando la sangre rpidamente y con exactitud, mediante un mecanismo de succin que se sujeta a la pipeta, hasta alcanzar la lnea deseada. Si se sobrepasa levemente la lnea, la sangre en exceso se puede eliminar apoyando el borde de la pipeta sobre papel de filtro o papel tis suave. Si se sobrepasa mucho la lnea, usar una pipeta limpia. No debe haber burbujas de aire en la columna de sangre. Se debe limpiar la parte externa de la pipeta para que no quede sangre (con cuidado de que no caiga sangre del borde) antes de introducirla en el uido diluyente. Una vez que se ha descargado el contenido de la pipeta en el diluyente, se debe succionar la mezcla a la pipeta varias veces, con succin pareja, para asegurarse de que se ha descargado toda la sangre en el uido. Sacudir ligeramente el tubo con la sangre diluida durante al menos dos minutos a mano o, de ser posible, en un agitador mecnico. Una vez que se ha agitado el tubo, se proceder de inmediato a llenar la cmara mediante una pipeta Pasteur o un tubo capilar. La cmara se llena por accin capilar, regulando el paso del uido desde la pipeta o tubo capilar de modo de lograr un llenado rpido y suave. Debe llenarse por completo, pero sin que el uido rebase y caiga en los fosos. Dejar asentar las clulas en el rea de recuento de 10 a 20 minutos, y luego proceder a contarlas. La cmara del hemocitmetro y el portaobjetos deben estar limpios y secos antes de usarlos. Las marcas de huellas digitales o una pelcula grasosa pueden causar errores importantes. Se debe contar una cantidad suficiente de clulas para reducir el margen de error que puede producir una distribucin de clulas aleatoria. En la prctica, se deben contar al menos 100 clulas. Al verificar otra vez la correcta distribucin de las clulas en la cmara, la cantidad de clulas que se cuenta en cada rea (es decir, en los cuadrados grandes) no debera diferir en ms del 10%.

RECUENTO DE PLAQUETAS

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CONTROLES

Se deben realizar dos diluciones y tomar la media de los dos recuentos; los dos recuentos deben coincidir dentro del 10%.
FUENTES DE ERROR EN EL RECUENTO DE PLAQUETAS

Es preferible usar sangre obtenida mediante venopuncin que sangre capilar, porque las plaquetas se adhieren a la herida y no siempre es posible reproducir las sucesivas diluciones de sangre obtenida por digitopuncin. Hasta aqu se describieron los errores generales en el uso de la pipeta y en hemocitometra. Tambin se debe prestar especial atencin a la cmara de recuento y asegurarse de que est completamente limpia, ya que la suciedad y los residuos se podran contar como plaquetas. Lavar la cmara con agua jabonosa, enjuagar con agua destilada, dejar que desage completamente y secar con papel tis que no deje pelusa. Asegurarse de que el portaobjetos est limpio antes de usarlo. La presencia de cmulos de plaquetas impide que el recuento sea confiable. Si la muestra contiene cmulos, se debe tomar una nueva muestra. El oxalato de amonio que se usa como diluyente se debe mantener refrigerado y desechar si hay evidencia de contaminacin bacteriolgica. El espcimen se debe contar dentro de las tres horas de la extraccin.

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DIAGNSTICO DE LA HEMOFILIA Y OTROS TRASTORNOS DE LA COAGULACIN