Está en la página 1de 27

Virologa.

Ao 2011

GENERALIDADES DE LOS VIRUS - ESTRUCTURA PROPIEDADES - TAXONOMA LABORATORIO DE VIROLOGA CULTIVOS CELULARES - HUEVOS EMBRIONADOS

Objetivos: Que el alumno conozca: -Las caractersticas generales de los virus, su estructura, la relacin con las propiedades fsico-qumicas. -Los principales conceptos sobre taxonoma y clasificacin viral. -Los conceptos bsicos sobre la metodologa de estudio de los virus (multiplicacin viral) -La importancia de estos conceptos para su futuro desempeo profesional CARACTERSTICAS GENERALES DE LOS VIRUS Los virus pueden considerarse como un conjunto complejo de macromolculas orgnicas (cido nucleico y protenas), ordenadas tridimensionalmente, que no pueden replicarse fuera de clulas vivas. Las primeras caractersticas diferenciales de los virus con otros agentes fueron: el tamao estimado por su capacidad de atravesar filtros que retienen a las bacterias y su incapacidad para reproducirse en medios biolgicos inertes (como lo son los medios para cultivos de bacterias), requiriendo de clulas para su propagacin. Hoy en da se sabe que estas caractersticas no alcanzan para diferenciar a los virus de otros agentes biolgicos, ya que existen bacterias cuyo tamao puede ser similar al de los virus ms grandes y que otros agentes como Chlamydias y Ricketsias tambin son parsitos intracelulares obligatorios. La organizacin y composicin de las partculas virales ofrecen por s caractersticas diferenciales importantes con otros agentes:

Poseen un solo tipo de cido nucleico: ADN ARN, cuyo tamao es relativamente pequeo con respecto al de otros agentes biolgicos.

Tienen una estructura simple y esttica. Su tamao oscila entre 20 y 300 nm (1 nanmetro = 10-9 m) No tienen sistema metablico propio y para su replicacin dependiendo de la maquinaria de la clula husped (parsitos intracelulares estrictos).

Adems de su estructura tan simple y particular, el modo de reproduccin de los virus tal vez sea la caracterstica que justifica que tengan un lugar propio en la escala biolgica. A diferencia de los que sucede con las clulas, en el momento de su multiplicacin, los virus no aumentan de tamao para su posterior divisin binaria, por el contrario la partcula viral es desintegrada y luego se multiplica en cada uno de sus componentes (protenas y cido nucleico) para finalmente dar lugar a mltiples copias de partculas (progeie) similares a las originales, en el ltimo paso del proceso de replicacin denominado ensamblaje y maduracin. Los virus (del latn: veneno) estn ampliamente distribuidos en la naturaleza afectando
1

Virologa.

Ao 2011

a los organismos de los reinos animal y vegetal, protistas y hongos. Pueden infectar a clulas eucariotas (virus animales y vegetales) como as tambin a clulas procariotas (bacterifagos). ESTRUCTURA VIRAL El cido nucleico del genoma viral vara entre las diferentes familias virales. Puede ser ADN, ARN, de cadena simple o doble, lineal o circular y de sentido positivo (+) o negativo (-). El material gentico est rodeado por una capa proteica denominada cpside que est constituida por copias de un nmero determinado de protenas codificadas por el genoma viral que se ordenan en unidades denominadas capsmeros. El ordenamiento final de las protenas de la cpside define la pertenencia a alguna de las siguientes simetras: icosadrica, helicoidal compleja. Algunas protenas se asocian tan estrechamente al cido nucleico que se denominan nucleoprotenas constituyendo la nucleocpside. Algunos virus (ej: adenovirus) pueden tener proyecciones (fibras) en la cpside, generalmente en los vrtices del icosaedro. Rodeando a la cpside de algunos virus existe una membrana que proviene de la membrana celular modificada de la clula donde se replic el virus y que se denomina envoltura (envelope). Esta membrana, que se puede originar en la membrana plasmtica (ej.: virus de la influenza) nuclear (ej.: Herpesvirus), est formada por una bicapa lipdica y posee glicoprotenas (protenas + hidratos de carbono) con caractersticas antignicas propias del virus y en muchos casos forman parte de ciertas proyecciones denominadas espculas. Los virus envueltos, debido a la estructura lipo-glico-proteica son ms sensibles a las condiciones ambientales y pH extremos y a los solventes orgnicos. Estructura de un virus con envoltura

capside acido nucleico

envoltura glicoprotena

NOMENCLATURA y TAXONOMIA VIRAL El nombre de los virus obedece a diferentes consideraciones. En algunos casos ste se debe a la enfermedad que ellos producen (ej.: el poliovirus que se llama as porque produce la poliomielitis), a palabras compuestas (ej.: Papovavirus que corresponde a la contraccin de los nombres papiloma, polioma y vacuolizante), al nombre de los descubridores (virus de Epstein-Barr) o hacen referencia al tejido de donde fueron aislados (ej.: adenovirus aislado de adenoides humanas). Tambin puede deberse a las caractersticas estructurales (ej.: coronavirus pues parte de su estructura se asemeja a
2

Virologa.

Ao 2011

una corona), al tamao como el parvovirus (parvo: pequeo), o a una derivacin del lugar donde se detectaron por primera vez (ej.: virus Sendai o el Norwalk, Hantavirus -del Ro Hantann-). La Taxonoma viral se utiliza para la identificacin, clasificacin y agrupamiento sistemtico de los virus en categoras que revelan mutua vinculacin entre ellos mediante relaciones que a su vez indican el orden en que fueron apareciendo en la naturaleza. En 1973 se crea para ello el Comit Internacional de Taxonoma Viral (ICTV) que agrupa a los virus teniendo en cuenta los siguientes criterios: 1. La naturaleza del genoma viral (ADN, ARN) 2. Nmero de cadenas del genoma viral (una cadena o dos cadenas) 3. Propiedad de realizar transcripcin inversa 4. Polaridad del genoma viral (para los de una cadena que pueden ser positiva (+) o negativa (-) De esta forma se crean diferentes clases de virus, diversas familias y numerosos gneros El sistema utiliza una serie de taxones como se indica en negrita a continuacin: Orden (-virales) Familia (-viridae) Subfamilia (-virinae) Gnero (-virus) Especie Ejemplo: Orden: Herpesvirales Familia: Herpesviridae Subfamilia: Alphaherpesvirinae Genero: Simplexvirus Especie: Human herpesvirus 1

Otro tipo de clasificacin es la denominada CLASIFICACIN DE BALTIMORE basada en el modo de replicacin de los genes y su expresin. Nos referiremos a ella mas adelante.

Virologa.

Ao 2011

MULTIPLICACION VIRAL Los virus son parsitos intracelulares obligados y pueden multiplicarse solamente en clulas vivas existiendo cierta especificidad para que un virus penetre a la clula husped y multiplique. Esta especificidad de unin depende tanto de las propiedades de la cubierta del virin como de receptores especficos en la superficie celular como as tambin de la existencia de factores celulares necesarios para la replicacin. Cuando se iniciaron los estudios experimentales y se desarrollaron los primeros mtodos de diagnstico de infecciones virales, debido a que no siempre era posible utilizar el husped natural (hombre, animales, etc.) se recurri a los animales de laboratorio (pequeos roedores) y huevos embrionados para multiplicar los virus. Tiempo despus aparecieron los cultivos celulares. La multiplicacin de un virus en un hospedador experimental suele presentar problemas de adaptacin por lo que se deben realizar una serie de pasajes sucesivos denominados "pasajes ciegos" hasta que se observen los signos o lesiones caractersticas o propiedades de los mismos. Cultivos celulares El desarrollo de cultivo de clulas es una de las tcnicas bsicas del Laboratorio de Virologa. Constituye el elemento fundamental para la multiplicacin viral in vitro ya que ofrece clulas vivas rodeadas de un medio inanimado que provee el mximo de condiciones favorables para lograr la infeccin y multiplicacin viral. La adaptacin de un sistema celular a un medio que permita su crecimiento y mantenimiento ofrece muchas ventajas para estudiar la interaccin virus-clula, como por ejemplo: 1- Acceso directo del virus a la clula husped
2- Comportamiento previsible para la infeccin con determinados virus lo que hace que

puedan mantenerse con relativa facilidad en el laboratorio. 3- Permiten el estudio de alteraciones metablicas o citopatognicas 4- Estn libres de interferencias tales como anticuerpos, hormonas, etc. Las condiciones ptimas de un cultivo varan con los diferentes tipos de clulas, lo cual exige el conocimiento del sistema para asegurar buenos resultados. Son muchas las variables a tener en cuenta y cada una de ellas merece particular atencin segn el tipo de cultivo que se realice y las clulas con que se trabaje: monocapa esttica, monocapa en sistema roller, cultivos en suspensin, cultivos de alta densidad (microcarriers). Los factores ms importantes son: 1) 2) 3) 4) Temperatura Composicin del medio de cultivo pH Concentracin de gases disueltos

5) Caractersticas del soporte inerte en el cual se propaga el

cultivo 6) Otros factores especficos.


4

Virologa.

Ao 2011

Cultivos celulares primarios: Es el primer cultivo de clulas a partir de un tejido (embrin de pollo, membrana corioalantoidea, dermis, rion, pulmn, tumores).

Constituye una poblacin mixta de clulas obtenida a partir de la dispersin del tejido original por accin digestora de una enzima (tripsina) asociada a una sustancia quelante (Acido Etilen Diamino Tetra-Actico-EDTA-). Cultivos celulares secundarios: Son los subcultivos de un cultivo primario. En la mayora de los casos solo son posibles un nmero limitado de subcultivos. deben subcultivarse con un conteo inicial relativamente alto. Lnea celular: Es una poblacin uniforme de clulas, con un ndice de Estas clulas

multiplicacin adecuado, derivadas de un cultivo celular primario que ha sido subcultivado durante un gran nmero de subpasajes (generalmente mas de 50 pasajes) y que a travs de seleccin espontnea a lo largo de los pasajes o por clonacin mltiple llegan a la unformidad. La American Type Culture Collection" (ATCC) es el Banco de clulas de los Estados Unidos, que describe en publicaciones varias las caractersticas de una amplia variedad de lneas celulares, su disponibilidad para diversos fines y donde son provistas como as tambin las instrucciones para la preparacin de los medios de culivo necesarios para su multiplicacin, almacenamiento y congelamiento de las mismas ("Catlogo de lneas celulares e hibridomas de ATCC") Actualmente la ATCC posee lneas celulares de referencia, ya caracterizadas, derivadas de una amplia gama de especies, hibridomas, lneas obtenidas por ingeniera gentica, etc. Todas estn conservadas en nitrgeno lquido. En Argentina existe, cumpliendo similares tareas, la Asociacin

Banco Argentino de Clulas (ABAC) que funciona en el "Instituto Viral de Enfermedades Humanas" (INEVH) de Pergamino y en el Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria (INTA) de Castelar. D re te tip s ife n s o d c lu s u a a e v lo a e la s d s n iro g A C ltiv p a d c lu s fib b s a d m m ro : u o rim rio e la ro l tic s e a fe . B L e c lu r d c lu s fib b s a . : n a e la e la ro l tic s C L e c lu r e ite id . : n a e la p lio e

Animales de experimentacin El uso de animales receptivos fue el primer mtodo utilizado para la multiplicacin de los virus. En algunos casos tambin pueden emplearse para el diagnstico si se induce y se considera una respuesta clnica positiva o negativa ante
5

Virologa.

Ao 2011

una infeccin experimental. Los animales de laboratorio ms utilizados son: ratones, hmsters, cobayos, conejos, hurones, monos y embriones de pollos. Pequeo roedores de laboratorio: Las vas de inoculacin a utilizarse dependen del virus estudiado y su posible histotropismo. La inoculacin puede realizarse por va subcutnea (SC), intramuscular (IM), endovenosa (EV), intracardaca (ICa), intraperitoneal (IP), intranasal (IN) e intracerebral (ICe). Se dan casos especiales de inoculacin intratesticular y por ej. escarificacin de la crnea del conejo para el caso de demostracin de virus varilico. Los animales deben estar perfectamente identificados. Los que mueren dentro de las primeras 24-48 horas pos-inoculacin son descartados debido a que se consideran muertes inespecficas producto de la inoculacin o de la va empleada. Los inoculados se observan diariamente para detectar la presencia de signos clnicos posibles; los que mueren deben ser necropsiados y al final de la experiencia los sobrevivientes deben ser sacrificados. En las necropsias se observar si existen lesiones, se recoger material, en caso de que sea necesario, y finalmente los cadveres se esterilizan en autoclave o se incineran en horno crematorio. Huevos embrionados: Los huevos utilizados para estudios virolgicos deben ser obtenidos de aves en buen estado, sanas, libres de infecciones bacterianas o virales. Las principales razones que llevan a utilizar huevos embrionados en estudios virolgicos son:

Se pueden adquirir con facilidad Son baratos Poseen tamao adecuado No se forman anticuerpos contra el virus inyectado porque carecen de respuesta
inmune El xito de una infeccin en huevos embrionados puede manifestarse como:

muerte del embrin. alteraciones macro y/o micropatolgicas. formacin de cuerpos de inclusin presencia de depsitos de urea hemorragias sobre las membranas retraso del crecimiento embrionario engrosamiento, edematizacin y fibrosis de las membranas

lesiones focales caractersticas (ej. virus de la viruela) En algunos casos pueden no producirse manifestaciones visibles y, en tal caso, el xito de la infeccin se manifiesta por la demostracin de antgenos especficos en los tejidos y en los lquidos. Algunos de los factores que influyen sobre la multiplicacin del virus en el embrin de pollo son: Edad del embrin Va de inoculacin Dilucin y volumen del inoculo
6

Virologa.

Ao 2011

Temperatura y humedad de incubacin Tiempo de incubacin Antes de ser inoculados, los huevos deben ser incubados durante el tiempo ptimo

para que el embrin, las cavidades extraembrionarias y sus membranas posean el tamao necesario segn la va de inoculacin a emplear. La va de inoculacin a seleccionar depender de la afinidad del virus por el tipo de clula constituyente del embrin y sus membranas (origen endodrmico, mesodrmico, ectodrmico) y de acuerdo a la va que se utilizar ser la edad de los embriones a utilizar. Vas de inoculacin Membrana coroalantoidea: se utilizan embriones de 10-12 das. Cavidad alantoidea: se emplean embriones de 9-12 das. Cavidad amnitica: se pueden utilizar embriones de 7-15 das. Saco Vitelino: se emplean embriones de 5-8 das de incubacin. Va intracerebral: puede practicarse en embriones de 8-14 das. Va endovenosa: de muy poca aplicacin en virologa. Se utilizan embriones de 10-15 das.

Cavidad amnica Casca ra

Membrana d la cascara areo Inoculacin amnitca Inoculacin en Inoculacin alantoidea

Cavid ad

Membrana eorioalantotctea

PATOGENIA DE LAS INFECCIONES VIRALES TOMA DE MUESTRA - AISLAMIENTO VIRAL Objetivos: Que el alumno conozca: - Los conceptos generales sobre patogenia viral - Los efectos de una infeccin viral sobre la clula husped - Los conceptos bsicos sobre la metodologa de estudio de los virus: toma de muestras a partir de casos clnicos para el diagnstico por aislamiento viral. GENERALIDADES SOBRE PATOGENIA DE LAS INFECCIONES VIRALES El trmino patogenia se refiere a los mecanismos de generacin del dao o enfermedad, en este caso, producidos por una infeccin viral. La patogenia puede estudiarse a distintos niveles segn se considere como husped a la clula, al individuo o a la poblacin. Los factores que intervienen en su desarrollo se pueden clasificar en tres grupos que interactan entre s: Factores dependientes del virus: Son los inherentes a la estructura viral. Se conoce que slo cierto tipo de virus pueden infectar clulas del aparato respiratorio y por lo tanto originar enfermedades como bronconeumona y otros el sistema nervioso central (SNC) y producir encefalitis. Incluso, dentro de ellos, algunas cepas resultan ms virulentas (Ej. adenovirus 3 y 7 causantes de enfermedades respiratorias). Factores dependientes del ambiente: Condiciones medioambientales como, temperatura, humedad, salinidad, pH, ventilacin, etc., pueden influir en la viabilidad del virus antes de llegar a la clula husped y afectar su capacidad de infectar. La presencia de envoltura lipoproteica le confiere mayor labilidad a la partcula viral, por lo tanto los virus desnudos resisten mejor las condiciones ambientales adversas. Factores dependientes del husped: Factores innatos como, raza, sexo, estado inmune, estado nutricional y otros, definen la resistencia o susceptibilidad ante los virus; a travs de receptores celulares especficos y la capacidad de montar una respuesta inmune. Patogenia a nivel celular Los virus producen diversas alteraciones al infectar las clulas. Estas se conocen con

el nombre de efecto citoptico o citopatognico (ECP) y ocurren tanto en las clulas de los organismos vivos como en las clulas de cultivos in vitro. A menudo este ECP es tan caracterstico que permite tener una idea aproximada del virus que lo produce; por lo tanto, esta propiedad es importante en el diagnstico de laboratorio. Las alteraciones que producen los virus en las clulas infectadas van desde aqullas que no conducen en forma inmediata a la muerte celular, a aquellas que destruyen la clula y que se denominan efectos citolticos o lisis. Principales efectos citopticos: 1.- Lisis celular. La destruccin celular se debe fundamentalmente a la detencin de la sntesis de macromolculas celulares, por algunas protenas virales. Con posterioridad, durante la fase tarda del ciclo replicativo de ciertos virus, (ej: adenovirus, virus polio) la acumulacin de grandes cantidades de protenas capsulares puede producir la inhibicin general de los procesos de biosntesis de macromolculas, tanto virales como celulares, ocasionando la lisis y liberacin de gran cantidad de viriones. 2.- Fusin celular. Ciertos virus codifican y poseen en su estructura, algunas protenas que tienen la propiedad de fusionar membranas celulares. La presencia de estas protenas en la superficie de las clulas infectadas o la presencia de partculas virales entre dos clulas vecinas permitir la fusin celular, dando origen a clulas multinucleadas que reciben el nombre de clulas gigantes, policariocitos o sincicios. Los virus como el del sarampin, el respiratorio sincicial, el herpes simplex y algunos retrovirus, poseen este tipo de protenas y son capaces de pasar de una clula a otra. 3.- Expresin de protenas y antgenos. Durante la infeccin viral, en la clula, aparecen y desaparecen protenas, tanto celulares como virales. En la infeccin por virus envueltos aparecen en la superficie de la clula infectada las protenas de la envoltura viral. Por ejemplo, en la infeccin por virus influenza aparecen en la superficie de la clula infectada las hemaglutininas virales que puede unir glbulos rojos produciendo un fenmeno de hemadsorcin. Tambin es posible detectar estas protenas mediante el uso de anticuerpos especficos, considerando que son antgenos virales. 4.- Cambios morfolgicos. Algunas protenas virales y otras celulares, inducidas durante la infeccin, pueden actuar sobre el sistema del citoesqueleto celular. Su alteracin origina que la clula se redondee, como ocurre con aqullas infectadas por los herpesvirus y los adenovirus. Las clulas que poseen cilios, como las del tracto respiratorio, pierden su funcionalidad ciliar durante la infeccin por virus respiratorios. 5.- Cuerpos de inclusin. Son estructuras que aparecen durante la infeccin por determinados virus. En algunos casos podran corresponder a sitios de agregacin de

protenas virales o viriones. Tambin poseen la propiedad de teirse con colorantes cidos o bsicos, presentan una localizacin intracitoplasmtica y/o nuclear. 6.- Proliferacin celular. Ciertos virus inducen la sntesis de ADN celular y determinan que las clulas infectadas proliferen antes de provocar su destruccin. Este hecho es fcilmente observable en las infecciones por virus papiloma, responsables de las verrugas. 7.- Alteraciones cromosmicas. Los virus pueden provocar cambios a nivel nuclear que conducen a la desintegracin de la cromatina de las clulas infectadas, como ocurre en las infecciones por virus herpes simplex. En otros casos las alteraciones nucleares pueden ser tan sutiles que no se detectan sino por metodologas moleculares. 8.- Transformacin celular. Ciertos virus DNA y los retrovirus pueden integrar el ADN viral sintetizado durante la replicacin en el genoma celular, generando clulas transformadas que se comportan in vitro en forma semejante a las clulas cancerosas. Mecanismos de lesin El dao en las clulas infectadas afecta a los tejidos y rganos y constituye uno de los elementos esenciales y determinantes en la patogenia. Este dao se puede producir directamente por la accin de los virus, o bien indirectamente, por accin de otros mecanismos, en especial los del sistema inmune. El reconocimiento de alteraciones celulares, como expresin de antgenos en la superficie celular, permite a las clulas del sistema inmune (especialmente linfocitos T citotxicos) y a los anticuerpos especficos, (actuando en conjunto con el complemento), destruir a las clulas infectadas por virus. Este mecanismo se ha denominado tambin de tipo inmunoalrgico. Otro mecanismo indirecto guarda relacin con la activacin de genes que controlan la llamada muerte celular programada o apoptosis. Patogenia a nivel del individuo Los factores que intervienen en la patogenia de las virosis a nivel del individuo son los que se describen a continuacin: Fuentes de contagio: El origen de las enfermedades virales que afectan al hombre y los animales son generalmente otros humanos o animales infectados. Mecanismos de transmisin: Se clasifican en directos o indirectos segn la forma de transmitirse desde la fuente de contagio al individuo susceptible de infectarse: A.- Directos: A1 con contacto fsico. A2 sin contacto fsico. A1 Aquellos que necesitan contacto fsico entre los individuos para propagarse se favorecen por la presencia de lesiones en las barreras mecnicas, representadas por

la piel y las mucosas. Estas actan como puerta de entrada y en general requieren de un contacto fsico relativamente estrecho. Ej: verrugas causadas por virus papiloma. A2 Las enfermedades virales que no requieren contacto fsico se contagian a travs de las secreciones eliminadas por los individuos infectados, cuyo ejemplo ms ilustrativo es el aerosol de partculas que se emiten al hablar, estornudar, etc. y que contienen virus. Este mecanismo es muy efectivo y es usado por la mayora de los virus exantemticos, respiratorios y otros para propagarse. B.- Indirectos: B1 a travs de un vehculo. B2 a travs de un vector: - mecnico. - biolgico. El mecanismo indirecto implica la accin intermediaria de un elemento inerte (vehculo) o vivo (vector) en el contagio. El rol del agua y los alimentos como vehculo de transmisin de infecciones virales entricas ser eficiente en aquellos virus que estructuralmente estn condicionados para permanecer viables en el medio ambiente, como sucede con los enterovirus, rotavirus y otros. Los vectores pueden ser mecnicos, si el virus es transmitido en forma pasiva (ej.: moscas en infecciones entricas, tbanidos en el virus de la anemia infecciosa equina), o biolgicos, si el virus se multiplica y desarrolla un ciclo reproductivo en ellos (ej: virus de la Encefalitis del Nilo). Puerta de entrada: Lugar por donde los virus pueden ingresar al organismo a travs de la infeccin de uno o varios tejidos. El hecho fundamental para que un rgano constituya una puerta de entrada de la infeccin es que las clulas de stos tengan receptores para permitir la adsorcin y penetracin de determinados virus. Las puertas de entrada tambin representan barreras defensivas contra las infecciones virales, por ejemplo la mucosa respiratoria tiene cilios, secreciones, inmunoglobulinas y enzimas que dificultan la adsorcin viral; el pH gstrico es una barrera para los virus que ingresan por va digestiva.Para actuar como sitio de ingreso del virus estas barreras tienen que estar alteradas por ejemplo la piel que habitualmente requiere de una solucin de continuidad para permitir el ingreso de un virus. Vas de diseminacin: Dependiendo del modelo de infeccin viral, el virus puede permanecer en la puerta de entrada (infeccin local) permaneciendo en este sitio o a clulas vecinas o bien diseminarse a rganos distantes (sistmica) por diferentes vas. Las principales formas de diseminacin son: a) Local. Ej. Bronconeumona por virus respiratorio sincicial, verruga por virus papiloma. b) Sistmica: - sangunea (a traves de clulas sanguneas). Ej. Virus de la viruela - neural (por las terminaciones nerviosas). Ej. Virus de la rabia.

- vertical (de madre a hijo). Ej. Virus de la diarrea viral bovina En este ltimo caso puede ocurrir por varios mecanismos: 1) va sangunea transplacentaria. Ej: virus rubola; HIV, virus hepatitis B. 2) contigidad a travs del canal genital durante el parto. Ej. virus herpes simplex, HIV, virus papiloma. 3) Alimentacin con leche materna. Ej. citomegalovirus, HIV. rgano blanco. La infeccin viral debe alcanzar los rganos que tienen receptores para los virus infectantes, para poder replicar en sus clulas. As, se originan las manifestaciones propias de la enfermedad. Este tropismo de los virus por ciertos tejidos fue utilizado para clasificarlos en: virus neurotrpicos (Ej. virus de la poliomielitis), virus dermatotrpicos (Ej. virus del sarampin), virus respiratorios (Ej. adenovirus), virus entricos (Ej. Enterovirus), etc. Posteriormente se demostr que este tropismo no era exclusivo y que muchas veces el fenmeno ms interesante no corresponda a su clasificacin. As, por ejemplo, la muerte por sarampin se debe generalmente a bronconeumona; ya que el aparato respiratorio es uno de sus rganos blanco. La forma ms habitual de presentacin de una infeccin por virus polio es la asintomtica, en que el virus slo se replica en el aparato digestivo, sin alcanzar el SNC. Las infecciones por adenovirus pueden provocar muerte por compromiso generalizado de hgado, pulmn, encfalo; etc. Y los enterovirus ECHO y Coxsackie frecuentemente provocan exantemas o meningoencefalitis. MODELOS DE INFECCION VIRAL A nivel del individuo, el destino final del contacto de un virus con un individuo estar determinado por la interaccin de los factores antes mencionados, pudiendo evolucionar de distintas formas: Infeccin aguda: Infeccin limitada en el tiempo, donde el virus es eliminado del organismo y el husped se recupera. Esta puede presentarse con o sin sntomas. Ej: resfro comn por rinovirus, laringitis por virus parainfluenza, diarrea por rotavirus. A veces puede seguir una evolucin grave y producir la muerte. Infeccin persistente: Despus de la infeccin inicial sintomtica o no, el virus completo o su genoma se mantienen en el organismo por tiempo prolongado -meses, aos o de por vida (con o sin manifestaciones clnicas). Segn su condicin o estado replicativo, la infeccin persistente puede ser: a.- Latente. El virus permanece oculto en el organismo por tiempos variables posterior a la infeccin inicial, pudiendo reactivarse una o ms veces. Tanto la primoinfeccin como las reactivaciones pueden ser con o sin manifestaciones clnicas. Durante la latencia puede detectarse el cido nucleico viral, pero el virus infectivo no es

demostrable. b.- Crnica. El virus infecta en forma clnica o inaparente, y permanece en multiplicacin continua, con o sin integracin al genoma celular. Esta replicacin viral puede demorar aos en producir manifestaciones clnicas. Ej. Hepatitis crnica por virus hepatitis B, rubola congnita y HIV. c.- Lenta. La primoinfeccin generalmente es asintomtica y el virus no es detectable. Aos despus, se manifiesta como un cuadro severo, progresivo, que en meses lleva a la muerte. Los ejemplos se encuentran en infecciones virales convencionales, como la panencefalitis esclerosante subaguda por el virus del sarampin y en otros denominados no convencionales, porque todava no est bien determinada la naturaleza del agente (Ej. priones). Infeccin transformante: En este tipo de infeccin, el virus es capaz de infectar las clulas, pero no puede producir partculas virales en forma significativa que implique destruccin celular. Generalmente el genoma viral est presente en la clula (integrado) y slo parte de sus genes se traducen en protenas virales. Estas originan cambios en las propiedades celulares o transformacin celular, a travs de la interaccin con genes y protenas celulares, originando un tumor benigno o maligno. Ej: verruga por virus papiloma 2, carcinoma crvico uterino por virus papiloma 16-18.

MODELOS DE REPLICACIN VIRAL CUANTIFICACIN VIRAL Objetivos: Que el alumno conozca: - Las caractersticas generales y las diferentes etapas del mecanismo de replicacin viral - Los principales conceptos sobre la clasificacin de Baltimore - Los mtodos de cuantificacin viral REPLICACION VIRAL Los virus son parsitos intracelulares obligados por cuanto carecen de organelas que les permitan una vida auttrofa. La cintica de replicacin viral vara dependiendo del tipo de genoma que posea el virin. La replicacin viral requiere de una interaccin entre los distintos compartimentos celulares y las macromolculas virales. Las protenas virales son sintetizadas en los ribosomas libres en el citosol o asociados al retculo endoplsmico rugoso (RER) y son transportadas por sistemas de vesculas hacia los distintos componentes del aparato de Golgi como se observa en el siguiente esquema. La localizacin celular de las protenas virales est sujeta a informacin presente en las mismas en el conjunto de los primeros aminocidos sintetizados en el ribosoma y que constituye el cdigo de direccionamiento de la protena en un determinado espacio celular. Es por eso que algunos virus tienen replicacin estrictamente citoplsmica, mientras que otros alcanzan el ncleo celular, todo dependiendo de la adaptacin realizada entre los virus y las clulas que las hospedan.

Las protenas que se dirigen al aparto de Golgi son modificadas mediante un proceso de maduracin que requieren del sistema enzimtico presente en los diferentes compartimientos del aparto de Golgi y la protena as madura poseer las funciones de protena estructural o no estructural. Las glicoprotenas virales requieren de este sistema de transporte para garantizar su localizacin en la membrana celular, mientras que otras protenas que constituyen las cpsides virales pueden realizar su proceso de sntesis y transporte en el sistema de citosol y dirigidos por el citoesqueleto celular.

La produccin de partculas virales requiere que la clula sintetice ARNm y de esta manera se utiliza la maquinaria biosinttica celular para la sntesis de protenas virales. La clula eucariota slo posee a nivel nuclear las enzimas necesarias para la produccin de ARNm a partir de ADN de doble cadena, por esta razn en caso que el virus posea un genoma diferente al ADN de doble cadena debe aportar a la clula las enzimas necesarias para la sntesis de ARNm. Por convencin se denominan cadenas genmicas (+) aquellas que se escriben en direccin 5-3 o en el caso de los ARN aquellos que se reconocen como ARNmensajeros. Las familias virales se organizan entonces y de acuerdo a la composicin genmica en 7 grupos arbitrarios que se reconoce como la Clasificacin de Baltimore que consiste en clasificar a los virus teniendo en cuenta el modo de replicacin de los genes y su expresin. En ella el ARNm juega un papel central, de modo que los virus que constituyen un grupo siguen el mismo camino para la sntesis del ARNm. Todos los virus independientemente de cul sea su genoma confluyen por diferentes mecanismos de transcripcin en la produccin a nivel intracelular con la

formacin de ARNm para la sntesis final de protenas virales. El tipo viral segn la clasificacin de Baltimore se asigna en nmeros romanos: Grupo I: virus con genoma de tipo ADN de doble cadena (Adenoviridae, Herpesviridae, Papovaviridae, Poxviridae). Las familias Adenoviridae y Herpesviridae replican en el ncleo celular. La familia Poxviridae se replica en el citoplasma y posee sus propias enzimas para la replicacin genmica. Grupo II: virus con genoma de tipo ADN de cadena nica (Parvoviridae). La replicacin de esta familia viral se realiza en el ncleo. Se sintetiza la cadena (-) de ADN que a su vez sirve de molde para la sntesis de genomas virales y para la sntesis de cadenas de ARNm. Grupo III: virus con genoma de tipo ARN de doble cadena (Reoviridae). El genoma de los miembros de esta familia viral es segmentado. Cada segmento se transcribe en forma independiente para producir un ARNm. Grupo IV: virus con genoma de tipo ARN de cadena nica y sentido positivo (+) (Astroviridae, Caliciviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Picornaviridae, Togaviridae). Grupo V: virus con genoma de tipo ARN de cadena nica y sentido negativo (-) (Arenaviridae, Bunyaviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae). Estos virus requieren de una ARN polimerasa ARN dependiente. Grupo VI: virus con genoma de tipo ARN de doble cadena, sentido (+) y ADN intermediario en su ciclo (Retroviridae). Son los nicos virus diploides en los que el ARN no codifica sino que sirve de molde para la transcripcin inversa. Grupo VII: virus con genoma de tipo ADN con ARN intermediario (Hepadnaviridae). Como los retrovirus tambin hacen retrotranscripcin pero a diferencia de ellos se lleva a cabo durante el proceso de maduracin viral. Para una observacin global y grfica de este tipo de clasificacin y, a modo de representacin esquemtica y como material complementario, se presentan en esta gua las siguientes figuras que representan a cada uno de los grupos:

Para poder comprender

entonces la patogenia de la infeccin viral es

importante conocer cual es la secuencia de acontecimientos observados en el interior de la clula husped. Si bien los pasos que se enumeran a continuacin no son un esquema rgido y nico en el interior de la clula infectada, sirven como organigrama para comprender como funcionan los virus y los mecanismos patognicos. A pesar de las diferencias que existen en las estrategias de replicacin, los

diferentes esquemas contienen los siguientes pasos bsicos: 1. UNION, ANCLAJE o ADSORCIN: depende de la interaccin fsica entre el virin y la superficie de la clula husped. Esta interaccin determina especificidad de especie. De un lado el virus aporta las protenas de unin y por otro lado las clulas aportan los receptores de membrana. Este paso involucra el concepto de afinidad entre virin y clula, lo que nos explica porque los virus pueden ser selectivos de rgano o tejido (tropismo) y el porque hay agentes que causan infecciones localizadas generalizadas. 2- PENETRACIN: se refiere a la introduccin de la partcula viral dentro de la clula, la internalizacin de la nucleocpside por endocitosis o por fusin de la envoltura viral con la membrana plasmtica. 3- DECAPSIDACIN O DESNUDAMIENTO: el cido nucleico se libera de la nucleocpside. En general participan enzimas de la clula husped y es un prerrequisito para la expresin del genoma viral. 4. TRANSCRIPCION: se define transcripcin como el proceso por el cual se transfiere la informacin gentica de una secuencia de nucletidos de una molcula de cido nucleico a otra. Este paso requiere la formacin de un ARNm a partir de una molcula de ADN o la formacin de una cadena de ARN complementario en caso de virus con genoma en forma de ARN monocatenario de polaridad negativa. En los virus que poseen ARN (+) el genoma se comporta como un ARNm por lo tanto puede ser usado directamente para la sntesis de protenas. En los virus con ARN (-) el material gentico posee la secuencia de nucletidos necesaria para la sntesis del ARN complementario el cual funcionar como mensajero. Este ARN (-) requiere de una ARN polimerasa ARN dependiente (transcriptasa) que es codificada por el virus. Para la produccin de ARN mensajero o para la replicacin genmica los virus poseen unas enzimas que se denominan ARN polimerasas ARN dependientes. Estas enzimas cumplen con funciones de replicacin cuando la funcin es la de copiar el ARN viral para formar nuevos genomas. Cuando las enzimas producen ARNm se designa que tienen una funcin de transcripcin. La mayora de los virus ADN se multiplican en el ncleo y dependen de ARN polimerasas celulares ADN dependientes. 5- TRADUCCIN: El ARNm, tanto de virus ARN como ADN, es traducido y se sintetizan las protenas. Se lleva a cabo en el citoplasma por los ribosomas celulares, dando lugar a la biosntesis de protenas virales. 7- REPLICACION : durante esta fase tiene lugar la sntesis de ARN o ADN viral que sigue el esquema de Watson y Crick de bases complementarias. En el caso de virus o

con genoma de tipo ADN estos pueden utilizar durante esta fase las ADN polimerasas de la clula presente en el ncleo celular o poseer su propia ADN polimerasa. En el caso de virus cuyo genoma se encuentra en forma de ARN se utilizan replicasas que tienen como funcin la formacin de ARN a partir de cadenas complementarias o intermediarios replicativos que sirven de molde o templado. 8- ENSAMBLAJE : durante esta fase hay organizacin de las macromolculas virales (protenas y cidos nucleicos) tendientes a la formacin de viriones maduros. En el caso de partculas virales con envoltura, la nucleocpside se organiza y ensambla por debajo de la unidad de membrana celular, donde se han localizado la glicoproteinas virales. En el caso de virus desnudos la cpside se ensambla alrededor del genoma viral.

9- LIBERACION: Durante esta fase ocurre la salida de los viriones infectantes. Hay dos procesos que pueden tener lugar, de un lado la citlisis y de otra parte los virus pueden ser liberados por un proceso de gemacin; este ltimo es un proceso de endocitosis inversa (exocitosis) que si no produce dao a la membrana celular puede conllevar a infecciones latentes. Debe recordarse adems que en la fase inicial ocurre lo que se conoce como periodo de eclipse, el cual estara dado in vitro como el lapso transcurrido entre la desaparicin de los viriones en el medio circundante, la denudacin, la liberacin del genoma viral a nivel intracelular y la aparicin de nuevos viriones. Otros definen lo que se conoce como periodo de latencia el cual estara comprendido entre la captacin de viriones infectantes hasta la aparicin del primer nuevo virin en el medio circundante.

Los periodos de eclipse y latencia pueden hacerse iguales en el caso de los virus cubiertos que maduran tomando parte de la membrana celular.

La replicacin viral es entonces un proceso complejo y variado que depende fundamentalmente del tipo de cido nucleico y de la organizacin gentica de cada virus en particular.

CUANTIFICACIN VIRAL

Para la identidad, actividad y/o potencia de una preparacin viral deben utilizarse mtodos de cuantificacin adecuados y perfectamente estandarizados. Es importante que el profesional posea los conocimientos bsicos sobre este tema ya que en su actividad se encontrara frecuentemente con inmungenos contra enfermedades virales en los que se detalla cmo estn elaborados y la cantidad de partculas virales que poseen, si las mismas estn activas o inactivadas, etc. Las partculas virales pueden ser cuantificadas desde dos puntos de vista: a- constitucin fsico-qumica b- actividad biolgica En el primer caso solo contabilizamos partculas sin determinar si son o no infecciosas. En el segundo caso cuantificamos infectividad. a) Cuantificacin por propiedades fsico-qumicas Teniendo en cuenta su constitucin fsico-qumica podramos utilizar por ej.: * Microscopa electrnica. * Propiedades hemaglutinantes (HA) * Presencia de enzimas especficas * Propiedades antignicas (Fijacin del complemento, precipitacin) Microscopa electrnica La ME permite cuantificar las partculas virales presentes en una muestra. Se puede determinar el nmero de partculas virales por campo y conociendo el volumen en la grilla de muestra se puede calcular el ttulo del virus en partculas virales por ml. Sin embargo se debe tener en cuenta que en este mtodo solo contamos partculas virales sin poder determinar si las mismas son infecciosas o no.

Imagen de herpesvirus al Microscopio electrnico Hemoaglutinacin Se denomina Hemoaglutinacin (HA) a la capacidad que presentan ciertos virus de aglutinar los glbulos rojos de distintas especies animales La capacidad de hemoaglutinacin refleja el hecho de que algunos eritrocitos poseen receptores para ciertos componentes de la superficie de las partculas virales que funcionan como protenas de adherencia a las clulas. En el caso de los Ortho y Paramixovirus estos componentes de la superficie de las partculas virales llamados hemoaglutininas son espculas glicoproteicas. Los Orthomixovirus poseen dos tipos de espculas, unas con actividad de hemaglutinina (HA) y otras con actividad de enzima neuraminidasa (NA). Los Paramixovirus poseen las dos actividades en una sola espcula. Los virus que poseen propiedades hemoaglutinantes son heterogneos en cuanto a tamao, afinidad de receptores, condiciones en que se produce la hemaglutinacin y caractersticas del antgeno hemoaglutinante, pero el fenmeno de la HA es bsicamente similar en todos los casos. Una hemoaglutinina se une simultneamente a dos glbulos rojos establecindose un puente entre ellos. Si el nmero de clulas excede al nmero de partculas virales, se forma un nmero pequeo de dmeros celulares que por lo general no es detectable, pero si la concentracin vrica es bastante elevada se forman puentes mltiples que dan lugar a un enrejado de clulas aglutinadas que se depositan de una forma muy caracterstica, perfectamente diferenciable del patrn de sedimentacin que presentan las clulas noaglutinadas. La prueba de HA es una reaccin fsico-qumica y se utiliza para la titulacin adecuada de una suspensin viral que aglutinar un nmero estandarizado de eritrocitos. La prueba de HA no es muy sensitiva ya que son necesarias

aproximadamente

106 partculas

virales

para la visualizacin

de 1 unidad

hemoaglutinante. Por ello, cuando dicha suspensin viral es titulada, la misma es diluida solo en base 2 (1:2, 1:4, etc.) Los anticuerpos producidos en respuesta a la infeccin por cierto tipo de virus que, como anteriormente se mencion, presentan en su envoltura hemoaglutininas, las que actan como potentes antgenos (Orthomixo, Paramixo y Togavirus) son inhibidores de la hemaglutinacin y esta tcnica se utiliza entonces para evaluar la capacidad de los anticuerpos para bloquear una infeccin viral especfica. La reaccin de HI es una verdadera reaccin inmunolgica

b) Cuantificacin por propiedades biolgicas Desde el punto de vista de su actividad biolgica (infectividad), la titulacin de un virus es un ensayo cuantitativo en el que se utilizan diluciones sucesivas de la suspensin viral (de un factor constante determinado) y se contabilizan el nmero de respuestas positivas sobre el nmero total de respuestas posibles producidas en un sistema hospedador determinado. La actividad biolgica de un virus puede manifestarse por su accin sobre una sola clula o bien sobre varias clulas. Todos los mtodos de cuantificacin viral en los que se emplea infectividad como factor determinante son de 105 - 107 veces ms sensibles que los mtodos que se basan en las propiedades fsico-qumicas.

Existen dos sistemas fundamentales de determinacin viral por medio de su actividad biolgica o infectividad: Mtodo de placa, pocks o tumor: Es un mtodo enumerativo y se basa fundamentalmente en que se considera que una partcula viral infecciosa es capaz de producir un efecto observable, por lo tanto un efecto observable = una partcula viral. Se utilizan monocapas celulares mantenidas bajo una capa de medio semislido para impedir el pasaje de la progenie viral al sobrenadante lo que posibilitara la aparicin de nuevos focos (alejados del sitio inicial de infeccin) con el consiguiente error de los resultados. Pueden utilizarse otros sustratos celulares como el embrin de pollo (membrana corioalantoidea) donde es posible observar la presencia de pocks. Para el caso de virus tumorales se contabilizan los focos neoplsicos producidos en animales o en monocapas celulares. La actividad biolgica del virus sobre la clula puede registrarse de varias formas como por ejemplo: A- Efecto citopatognico (ECP) como la lisis celular: se detecta por colorantes especficos (azul tripn que tie clulas muertas o rojo neutro que tie clulas vivas) B- ECP como la formacin de clulas multinucleadas (Tincin H-E) Si el nmero de efectos observables es elevado, se hace confluente y dificulta la observacin, se deben realizar diluciones hasta lograr un N adecuado que permita el conteo. Si el nmero de efectos observables en los sustratos infectados con diferentes diluciones de la misma mezcla viral son proporcionales a la concentracin del virus, tendremos entre ambas (concentracin de virus versus nmero de efectos) una relacin lineal

Mtodo de punto final 50%: Este tipo de anlisis cuantitativo se basa en la estimacin del nmero de respuestas positivas sobre el total de respuestas posibles, utilizando un clculo estadstico que determina la cantidad de dosis infectantes contenidas en el inculo. Las diluciones menores de virus contendrn ms Dosis infectantes que las mayores y entre ellas habr un gradiente de actividad. Se ha establecido determinar el 50 % de actividad y tomarla como Dosis infectante 50 %. El mtodo mas comnmente utilizado para la interpolacin del Punto Final 50% es el Mtodo de Reed y Muench. Se basa en la respuesta todo o nada es decir positiva o negativa sin que haya calificaciones intermedias. La respuesta o reaccin producida en el hospedador debe ser tpica de la infeccin producida por el virus de tal modo que permita su interpretacin sin dificultad. El virus a estudiar se inocula en diluciones a su respectivo hospedador: ratas, ratones, embrin de pollo, cultivo celulares, etc. Entre los criterios a utilizar para la lectura tomamos por ej: * Muerte o alteraciones del animal embrin * Efecto citoptico sobre cultivos celulares Los resultados deben expresarse de acuerdo al mtodo utilizado y solo podrn ser reproducibles siempre que se use el mismo mtodo y el mismo sistema, el que deber ser referido en el resultado. Ej: Dosis letal ratn 50%; Dosis infecciosa pollo 50%, Dosis paralizante ratn 50%, Dosis letal embrin de pollo 50%, Dosis infectante cultivo de tejido 50%, etc.

RESUMEN: El punto final 50% en la titulacin de una suspensin viral, es la dilucin de virus que produce el 50% de efectos positivos. El ttulo es la inversa de aquella dilucin a la cual reaccionan, estadsticamente, la mitad de los sujetos infectados o unidades reveladoras. Figura 1: Modelo de titulacin en microplaca. Lectura de presencia de ECP en celulas infectadas con 0, 1 ml de diluciones en base 10. Mtodo de Reed y Muench A B C D E F G H -1 + + + + + + -2 + + + + + + -3 + + + + + + -4 + + + + + + -5 + + + -6 -7 -8 9 10 11 12

Vemos que el punto final 50% del virus est en la dilucin de 10 -5 (tres de seis reacciones positivas). La inversa de este valor = 105 DICT50 es el ttulo de la suspensin vrica original que es equivalente a 100.000 partculas virales. En el caso de que el 50% de los efectos observables se encuentre entre una u otra dilucin debe realizarse un clculo estadstico conocido como Mtodo de Reed y Muench .