ANALISIS DE PLANTAS.

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TEMA 18. ANLISIS DE PLANTAS 1. Introduccin. 2. Muestreo, transporte y conservacin del material vegetal 3. Preparacin de la muestra 4. Parmetros de Anlisis 5. Mtodos de Anlisis Qumico 6. Valoracin de los Resultados 7. Bibliografa

1. Introduccin El Anlisis Foliar, de Tejidos Vegetales o Anlisis de Plantas, consiste en la determinacin de la composicin qumica de alguna parte determinada de la planta. Actualmente se considera como una referencia indispensable para determinar tanto los requerimientos nutricionales de plantaciones como los estados carenciales de microelementos. Ello se debe a que el anlisis foliar da una indicacin precisa de la absorcin de los diferentes elementos por la planta, ya que las hojas son muy sensibles a los cambios de composicin del medio nutritivo. El anlisis de la planta como tcnica de diagnstico, tiene una historia considerable de aplicacin. Recientemente, se ha utilizado para determinar el estatus nutritivo del suelo y las plantas, como base para determinar las necesidades de cal, fertilizantes, etc. Entre los diversos objetivos que se han propuesto para analizar las plantas, el ms frecuente es la verificacin de sntomas de deficiencias o estatus nutritivo. As mismo, es una herramienta muy til para determinar absorcin de sustancias txicas por las plantas, residuos de plaguicidas, y las posibles consecuencias derivadas de procesos de contaminacin atmosfrica, de las aguas o de los suelos. Entre otras aplicaciones del anlisis de plantas, podemos destacar: Determinar el estado Nutricional de las Plantas. Elaborar un Diagnstico Nutricional. Complementar el Anlisis del Suelo. Estudios de Contaminacin Ambiental. Estudios de Geobotnica. Toxicologa Ambiental. En taxonoma vegetal, permite la identificacin qumica de especies y quimiotipos.

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2. Muestreo, transporte y conservacin del material vegetal. Muestreo: El objetivo de los procedimientos de muestreo es obtener una muestra representativa del total, para realizar el anlisis y determinar los niveles de los diversos componentes de la materia vegetal, como minerales, macro y micronutrientes, o residuos de plaguicidas remanentes en los vegetales. La correcta utilizacin de esta prctica requiere efectuar adecuadamente la toma de muestras, de modo que sea representativa del conjunto, e interpretar correctamente los anlisis. El contenido en nutrientes de las hojas depende de factores como la edad, tipo y posicin de la hoja que se muestrea, la disponibilidad de nutrientes del suelo, el estado fitosanitario, etc. La variabilidad de la muestra en campo hace que las consideraciones previas respecto al muestreo sean similares a aquellas descritas en captulos anteriores respecto a exactitud, precisin y nmero de muestras. As mismo han de registrarse algunos datos como densidad de vegetacin, altura, morfologa, especies asociadas, naturaleza del suelo, aspecto, drenaje y topografa local. Tambin vara mucho el contenido inorgnico en las distintas partes de la planta. Para la mayora de las plantas, los rganos ms ricos en estas sustancias son los pices, las hojas y los tallos si son fotosintticos. Los tejidos leosos generalmente acumulan menos elementos. As mismo, el contenido en nutrientes es mayor en los tejidos jvenes. Tambin se debe tener en cuenta la fluctuacin en el contenido en nutrientes que ocurre diurna, estacional, o anualmente. Para el muestreo se emplean los equipos usados normalmente en los trabajos forestales y agrcolas. Como norma general, no deben recogerse las plantas con el tiempo hmedo. Los instrumentos que se utilizan para la toma de muestras deben estar libres de contaminantes de plaguicidas. Se deben utilizar envases nuevos y en perfecto estado de limpieza. Las muestras deben de transportarse refrigeradas y mantenerse as hasta que se realice el anlisis. Mtodos de muestreo: a) Mtodo aleatorio que consiste en darle a cada uno de los elementos de la poblacin una probabilidad conocida de ser incluido en la muestra. Para este mtodo, se utiliza la tabla de nmeros aleatorios. b) Mtodo en X, que Consiste en dibujar una X imaginaria en el rea a muestrear y recolectar la muestra desde los extremos hasta el centro de la X hasta completar la cantidad necesaria. C) Mtodo en ZIG-ZAG que consiste en dibujar un ZIG-ZAG imaginario en el rea a muestrear y recolectar la muestra hasta completar la cantidad necesaria. Transporte y conservacin.: para el transporte y almacn, la muestra se mantendr en las condiciones ms parecidas a las de campo. Pueden ser refrigeradas, conservadas en bolsas de papel o de plstico, pero en stas el tiempo de permanencia ha de ser el mnimo posible, ya que las reacciones enzimticas pueden llevar a cambios en la estructura qumica.

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Limpieza y descontaminacin: la descontaminacin es necesaria para eliminar sustancias no nativas si se determina que el tejido foliar est cubierto de polvo o de materiales de fumigacin. Existen muchas fuentes de contaminacin en el campo que incluyen: Arrastre de fertilizantes por el viento. Excrementos de animales (dan lugar a contenidos muy elevados en N y P) Contaminacin de metales por estructuras cercanas, tipo vallado, cables, etc. Herramientas y contenedores metlicos oxidados.

Se deben enjuagar las muestras suavemente para quitar las partculas de la superficie de las hojas. No deben lavarse demasiado, pues algunos nutrientes solubles podran perderse. Las muestras han de secarse suavemente con un trapo o papel.

3.- Preparacin de la muestra para el anlisis qumico Secado y Conservacin: El secado y la reduccin de tamao de muestra (molienda) preparan la muestra para el anlisis del laboratorio. El material tiene que estar perfectamente seco antes de guardarlo en un recipiente hermtico y opaco o en bolsas de papel, vigilando el desarrollo hongos. Las bolsas se etiquetan con nombre de la planta, fecha y lugar de recoleccin. Se guardan en lugar fresco y ventilado, a la sombra, protegido de la luz. Determinacin de humedad: se entiende por humedad el agua libre que contiene el material vegetal. Para una buena conservacin, el contenido ha de ser inferior al 10%. En el material vegetal seleccionado (planta entera, hojas, raz, etc.) se determina la humedad siguiendo el mtodo elegido. Existen dos mtodos principalmente: El mtodo gravimtrico, o prdida de peso en estufa a 105 C hasta peso constante. Este es un mtodo orientativo, ya que en la calefaccin pueden perderse compuestos voltiles distintos del agua. Humedad (%) = [peso perdido (g)/peso inicial (g)] 100 El mtodo volumtrico, por arrastre del agua con un disolvente no miscible, como xileno o tolueno (figura 18.1). Contenido en cenizas: el trmino cenizas totales se refiere a el residuo que deja la combustin de la muestra y es una medida de el contenido mineral total. Se obtienen por calcinacin en mufla a 400 C durante 24h. Una vez enfriado se pesa. Adems, en las cenizas obtenidas se evaluar el contenido en elementos minerales disolvindolas en HCl (1:1). Cenizas (%) = [peso cenizas (g)/peso seco (g)] 100

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Figura 18.1 Determinacin de humedad en plantas Preparacin de la disolucin: para el anlisis de elementos es til la preparacin de una disolucin. Para ello es necesario destruir la materia orgnica mediante un proceso de oxidacin previa al anlisis, que consiste en la disolucin de las cenizas en cido (HCl) o su digestin cida (Kjeldhal). Tambin se puede realizar una digestin de la muestra en horno microondas.

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4. Parmetros de Anlisis Los parmetros de anlisis suelen ser aquellos de inters en cuanto a requerimientos nutricionales de las plantas, como son los macro y micronutrientes, y sustancias contaminantes como residuos de fumigacin, pesticidas o metales. Macronutrientes: Na, K, Mg, Ca, P, N Micronutrientes: Zn, Cu, Fe, Mn, B, Al. Extractos (fraccin no voltil): flavonoides, cidos fenlicos. Esencias (fraccin voltil) Contaminantes: metales, pesticidas.

5.- Mtodos de Anlisis Qumico En la Tabla 18.1 se muestra un resumen de los mtodos analticos aplicados al anlisis de material vegetal. Tabla 18.1 Mtodos analticos para materia vegetal PARMETRO MTODOS Humedad Gravimetra o volumetra Cenizas totales Combustin, calcinacin Preparacin de la disolucin Digestin cida o disolucin cenizas en HCl(1:1) Nitrgeno Total (N) Digestin Kjeldhal + Espectrofotometra UV - Vis Azufre (S) Digestin cida + Espectrofotometra UV - Vis Boro (B), Fsforo (P) Espectrofotometra UV - Vis Molibdeno (Mo) Absorcin Atmica con Cmara de Grafito Potasio (K), Sodio (Na) Espectrofotometra de Emisin de Llama Hg y Selenio Espectrofotometra de Absorcin Atmica Vapor Fro Cu, Zn, Fe, Mn Espectrofotometra de Absorcin Atmica Cl-, NO3 Electrodos especficos o Cromatografa Inica Aceites esenciales Destilacin + CGL Extractos (Flavonoides) Extraccin + HPLC Extractos (cidos fenlicos) Extraccin + HPLC Anlisis de elementos; Tras la combustin o digestin cida, se analiza cada uno de los micro o macronutrientes u otros elementos de inters. La calibracin se lleva a cabo mediante patrones a partir de disoluciones estndar. Se determinan macronutrientes (Na, K, Ca, Mg y Mn) y micronutrientes (Fe, Cu, Zn) analizndolos por Espectrofotometra de Absorcin Atmica. De esta forma, se conoce la cantidad de cada uno de ellos que la planta extrae del suelo en cada uno de sus estados fenolgicos. En la figura18.2, se muestra un ejemplo de lo que sera un esquema de anlisis foliar para elementos, desde la preparacin de la muestra hasta su anlisis.

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Figura 18.2 Anlisis de elementos en plantas Componentes voltiles (Aceites esenciales): Los aceites esenciales constituyen la fraccin voltil de estudio en plantas aromticas y medicinales, compuesta por terpenos y derivados, derivados del benceno y otros. Se determinan por cromatografa de gases (CGL) y espectrometra de masas si es necesario, tras su obtencin por destilacin de arrastre de vapor a presin atmosfrica. Los aceites esenciales estn formados en su mayora por terpenos, fenilpropanos y compuestos alifticos de bajo peso molecular. La caracterstica fundamental de los terpenos es que estn constitudos por unidades de isopreno (2 metil butadieno). Tienen un nmero de tomos de carbono mltiplo de 5. Los terpenos presentes en los aceites esenciales son monoterpenos (C10, 2 unidades de isopreno) y sesquiterpenos (C15, 3 unidades de isopreno). En la mayora de los terpenos la unin de las unidades de isopreno es, en general, de tipo cabezacola 1-4: el carbono 1 de una molcula est unido al carbono 4 de otra: esto constituye la denominada regla isoprnica.

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C C C-C-C-C-C-C-C-C cabeza cola cabeza cola La obtencin se realiza por hidrodestilacin en Clavenger (figura 18.3), mtodo recomendado en la Farmacopea para muestras pequeas, inferiores a 20 g o bien por arrastre de vapor (figura 18.4). Los aceites esenciales obtenidos se deshidratan con Na2SO4 y en ellos se determinan las caractersticas organolpticas (color, olor y sabor) y su composicin qumica. La identificacin de los componentes mayoritarios de los aceites esenciales se realiza por Cromatografa de Gases (CGL), por comparacin de los tiempos de retencin de los picos eludos con los de patrones puros y con datos bibliogrficos, y, si es necesario, se recurre a la identificacin por Espectrofotometra de Masas. En la Tabla 18.2 se muestra a modo de ejemplo los componentes encontrados en el aceite esencial del organo verde cultivado en la provincia de Guadalajara, el rango de valores hallados en las distintas submuestras y el valor medio para cada uno de ellos. El contenido se expresa en %.

Tabla18. 2. Componentes mayoritarios encontrados en Origanum vulgare L. ssp viride (%) Rango Valor medio Rango Valor medio t 0,8 0,5 linalol 0,1 14,2 5,3 pineno p cimeno t 7,0 1,9 limoneno t 0,8 0,2 9,9 borneol t 2,2 0,5 felandreno 1,2 36,9 1-8 cineol 2,7 25,5 16,8 terpinen-4-ol 0,6 2,9 1,6 t 7,8 3,0 acetato bornilo 2,7 14,0 7,3 terpineno Carvacrol 0,3 31,8 10,4 1,0 2,3 1,4 cariofileno

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Figura 18.3 Aparato Clevenger

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Figura 18.4 Destilacin por arrastre de vapor (laboratorio) Para muestras inferiores a 5 Kg, se realizar por arrastre de vapor de agua en caldera de acero inoxidable a presin atmosfrica, y para muestras de ms de 5 Kg, por arrastre de vapor de agua y con presin (figura 18.5).

Figura 18.5 Arrastre de vapor en caldera (nivel industrial)

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Componentes no voltiles (Extractos): Para la determinacin de compuestos no voltiles se lleva a cabo una extraccin slido - lquido con disolventes orgnicos, que penetran en la materia vegetal y disuelven las sustancias, que son evaporadas y concentradas a baja temperatura. Despus, se elimina el disolvente, obteniendo la fraccin deseada. La seleccin del disolvente debe cumplir los siguientes requisitos: Ser capaz de disolver rpidamente todos los principios activos. Disolver la menor cantidad de materia inerte. Tener un punto de ebullicin bajo y uniforme que permita eliminarlo rpidamente, pero evitando prdidas por evaporacin. Qumicamente inerte, para no reaccionar con los componentes a analizar. No inflamable y barato.

Este disolvente ideal no existe, y los ms empleados son el ter de petrleo, benceno y alcohol. Los componentes mayoritarios de los extractos son: cidos Fenlicos: Glico, 2,4,6 TOHB, protocatquico, gentsico, clorognico, vainlico, rutsido, isovainllico, OHcinmico, sirngico, sinpico, ferlico, 4 metoxifenilactico. Flavonoides: rutsido, naringina, luteolina, quercetina, apigenina, crysoeriol.

Cada grupo se extrae y analiza por separado pero en ambos casos mediante Cromatografa Lquida de Alta Eficacia (HPLC) utilizando detector UV/VIS a 280 nm (cidos fenlicos) 254 nm (flavonoides). La identificacin se lleva a cabo comparando sus tiempos de retencin con los patrones puros, y con sus espectros UV cuando fuera necesario. Se identifican nicamente los componentes mayoritarios. La cuantificacin se realiza por el mtodo de patrn interno. Ensayos de control de calidad y pureza: Estos ensayos estn encaminados tanto a confirmar la identidad de materias primas vegetales como a valorar su calidad y pureza, con vistas a su normalizacin. La calidad y pureza requeridas para una sustancia o materia prima vegetal viene determinada por los patrones o estndares (valores numricos) dados en las farmacopeas y normas de calidad. Cuando las materias primas no renen los requisitos deben ser rechazadas. Para este tipo de control se emplean ensayos fsico qumicos cuantitativos de tipo general (humedad, cenizas, residuos de productos fitosanitarios) o de tipo especfico, tiles para cuantificar o valorar determinados principios activos relacionados con la actividad biolgica que han sido aislados previamente (alcaloides, taninos, hetersidos). En la Tabla 18.3 se muestran los procedimientos analticos a llevar a cabo para estos casos, segn la Sociedad Espaola de Farmacologa de la Industria.

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Tabla 18.3. Procedimientos de Anlisis para el Control de Calidad de Materia Vegetal Caracteres organolpticos Control Droga entera Caracteres microscpicos botnico Droga pulverizada Cortes histolgicos Estudio de elementos y contenidos celulares Reacciones de Alcaloides, Saponinas, Flavonoides, Taninos identificacin de Hetersidos cianognicos y antraquinnicos principios activos Ensayos Cromatografa de adsorcin fsicoCromatografa de particin qumicos Cromatografa en capa fina o en papel Anlisis cualitativos Cromatografa de gases cromatogrfico Cromatografa lquida de alta resolucin Electroforesis Humedad Residuos de productos fitosanitarios Contaminacin microbiolgica Control de Ensayos fsico - Contaminacin radiactiva Naturaleza y tasa de elementos extrados < 2% calidad y qumicos pureza de las cuantitativos de Cenizas tipo general drogas Metales pesados Pb, Cd, Hg ndice de hinchamiento Aceites esenciales ndice de refraccin Poder rotatorio Ensayos especficos segn especie y finalidad del producto (extractos, esencia, etc.)

6.- Valoracin de resultados La interpretacin del anlisis foliar se realiza comparando los resultados obtenidos con los valores estndar previamente establecidos para cada elemento. Para la interpretacin de los resultados de los anlisis de tejidos vegetales se utilizar el criterio de suficiencia. Este criterio pretende que los valores foliares no sean inferiores a un nivel crtico, es decir, que se ubiquen dentro de un rango de suficiencia. Anlisis que detectan valores en los rangos desde bajo a suficiente pueden estar asociados a sntomas visibles de deficiencias o rendimientos reducidos. Por el contrario, anlisis foliares en rango alto en exceso, se asocian a derroches en la utilizacin de fertilizacin y potenciales a bajos rendimientos.

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Los niveles considerados como deficientes indican que el elemento en cuestin no alcanza en el tejido la concentracin suficiente para el normal desarrollo de las funciones fisiolgicas o procesos metablicos en el que ste est implicado. Estas disfunciones producen sintomatologas caractersticas en diversos rganos (hojas, races, tallos) que, con limitaciones, permiten diagnosticar visualmente el estado carencial. La consecuencia final de todas estas alteraciones suele ser una disminucin significativa del vigor de la planta. Existen adems una serie de procedimientos estandarizados para el control de calidad de muestras vegetales destinadas al consumo humano, como ocurre con las plantas aromtica, medicinales y condimentarias. La finalidad del anlisis qumico de este tipo de materia vegetal es, entre otros, determinar: Rendimiento y composicin qumica de la esencia y extractos obtenidos. Evolucin del contenido en principios activos en el ciclo fenolgico. Estandarizacin y garanta de calidad de los productos. Supervisin del cumplimiento de la normativa vigente al respecto.

7.- Bibliografa Allen, S. (1989). Chemical Analysis of Ecological Materials. Blackwell Scientific Publications. London. Kalra, Y.P. (Ed.) (1998). Handbook of reference methods for plant analysis. Soil and Plant Analysis Council, Inc. CRC Press, USA: 300p. Lachica, M., Aguilar, A. y Ynez, J. 1973. Anlisis foliar. Mtodos utilizados en la Estacin Experimental Zaidn. Anales de Edafologa y Agrobiologa 32, 1033-1047.