CARACTERSTICAS FSICAS Y QUMICAS DE LOS CARBOHIDRATOS

MONO Y DISACRIDOS SOLUBILIDAD: MUY SOLUBLES EN AGUA MENOS SOLUBLES EN ETANOL ALGO SOLUBLES EN ETANOL CON AGUA CALIENTE INSOLUBLES EN SOLVENTES ORGNICOS (EXCEPTO PIRIDINA)

IMPORTANCIA DE LA SOLUBILIDAD DE LOS CARBOHIDRATOS

INFLUYE EN LA HABILIDAD PARA REALIZAR DETERMINACIONES DE DENSIDAD. EXISTE RELACIN ENTRE SU DENSIDAD Y SU CONCENTRACIN

NDICE DE REFRACCIN DE LOS CARBOHIDRATOS

MUY TIL PARA DETERMINAR SU CONCENTRACIN. EXACTO SLO PARA SOLUCIONES DE PURA SACAROSA. AMPLIAMENTE USADO PARA APROXIMAR VALORES PARA OTRAS SOLUCIONES AZUCARADAS.

ROTACIN PTICA DE LOS CARBOHIDRATOS

FACILITA AL MTODO PARA MEDIR LA CONCENTRACIN DEL AZCAR EN SOLUCIN. MTODO BASADO EN MEDICIONES POLARIMTRICAS.

GENERALMENTE UTILIZADO CON SACAROSA Y ALMIDN.

PROPIEDADES REDUCTORAS DEL GRUPO CETO O ALDEHDO

EL GRUPO CETO O ALDEHDO REDUCIRN SOLUCIONES ALKALINAS DE SALES METLICAS AL METAL XIDO O LIBRE.

LA REACCIN ENTRE EL AZCAR Y EL SULFATO CPRICO NO ES ESTEQUIOMTRICA Y PROPORCIONA XIDO CUPROSO MUY DEPENDIENTE DE LAS CONDICIONES DE LA REACCIN.

REACCIONES DE CONDENSACIN DE LOS CARBOHIDRATOS

MONOSACRIDOS + CIDO FUERTE + CALOR SUBSTANCIAS QUE SE CONDENSAN CON REACTIVOS (E.G. FENOL) PARA PROPORCIONAR COMPLEJOS COLOREADOS.

PRDIDA DE AGUA Y FORMACIN DE DERIVATIVOS DEL FURFURAL. (SE DEBE CONTROLAR LA FUERZA DEL CIDO, EL TIEMPO Y LA VELOCIDAD DE CALENTAMIENTO)

REACCIONES DE SUSTITUCIN DE LOS CARBOHIDRATOS

FORMACIN DE TER (E.G. METIL TERES) ESTERIFICACIN (E.G. ACDETATOS DE ALDITOL) IMPORTANTES EN LA PREPARACIN DE DERIVADOS VOLTILES PARA LA CROMATOGRAFA GAS-LQUIDO.

PROPIEDADES DE LOS POLISACRIDOS

SOLUBILIDAD.- VARA ENORMEMENTE a) DEXTRINAS (ALMIDONES DE VARIAS COMPOSICIONES PARCIALMENTE HIDROLIZADOS) a) AMILOPECTINA Y GLUCGENO.SE DISPERSAN PARCIALMENTE EN AGUA CALIENTE.

SOLUBILIDAD DE LOS POLISACRIDOS

SUBSTANCIAS PCTICAS.SOLUBLES EN AGUA CALIENTE A MENOS QUE CONSTITUYAN UN COMPLEJO CON Ca.
GOMAS, MUCLAGOS, ARABINOXILANOS, -GLUCANOS.SOLUBLES EN AGUA

SOLUBILIDAD DE LOS POLISACRIDOS

CELULOSA, ALGUNOS MANANOS Y XILANOS, HEMICELULOSA.INSOLUBLES EN AGUA. EN GENERAL LOS POLISACRIDOS SON INSOLUBLES EN ALCOHOLES ACUOSOS CON FUERZAS POR ARRIBA DE 75 A 80% (v/v).

FORMACIN DE COMPLEJOS DE LOS POLISACRIDOS

EL ALMIDN FORMA UN COMPLEJO INSOLUBLE CON EL YODO EN SOLUCIN DE NaCl/KI. LOS POLISACRIDOS SULFATADOS DE LAS ALGAS DE TIPO CARRAGENO FORMAN COMPLEJOS CON LOS COMPUESTOS CUATERNARIOS DE AMONIO

HIDRLISIS DE LOS POLISACRIDOS

LA MAYORA DE LOS POLISACRIDOS SON SUJETOS A LA HIDRLISIS EN PRESENCIA DE CIDOS DILUIDOS.
LA MAYORA DE LOS COMPONENTES DE LA HIDRLISIS SON ESTABLES EN LOS CIDOS DILUIDOS (EXCEPTO LA FRUCTOSA Y TAL VEZ LA ARABINOSA)

SOLUBILIDAD DE LOS POLISACRIDOS

LA CELULOSA ES MUY ESTABLE A LA HIDRLISIS CIDA (SE NECESITAN 72% (p/p) DE H2SO4 PARA DEGRADARLA) LOS RESIDUOS DE CIDO URNICO DE UN POLISACRIDO CONFIEREN ESTABILIDAD EN EL ENLACE GLUCOSDICO ADYACENTE.

SOLUBILIDAD DE LOS POLISACRIDOS

LA MAYORA DE LOS RESIDUOS DE CIDO URNICO SE LIBERAN EN COMBINACIN CON OTRO RESIDUO, PRODUCIENDO UN DISACRIDO EXTREMADAMENTE RESISTENTE A LA HIDRLISIS CIDA.

DETERMINACIN DE AZCARES LIBRES

PREPARACIN DE LA MUESTRA CUANDO LOS AZCARES ESTN EN SOLUCIN GASES DISUELTOS.REMUVANSE DE LOS PRODUCTOS CARBONATADOS O FERMENTADOS MEDIANTE VACO

PREPARACIN DE LA MUESTRA
PIGMENTOS.- PUEDEN INTERFERIR CON LAS REACCIONES. EXISTEN MUCHAS MANERAS DE ELIMINARLOS (E.G. CARBN O SALES DE PLOMO) ACETATO DE PLOMO BSICO.INTERFERIR CON LOS MTODOS POLARIMTRICOS.

PREPARACIN DE LA MUESTRA

ACETATO DE PLOMO NEUTRO.FORMA PREFERENTE DE USO. SE UTILIZA COMO UNA SOLUCIN ACUOSA SATURADA. SE ELIMINA EL EXCESO AADIENDO YA SEA OXALATO DE SODIO O POTASIO.

PREPARACIN DE LA MUESTRA
DESPROTEINIZACIN LAS PROTENAS INTERFIEREN CON LAS DETERMINACIONES REDUCTORAS Y COLORIMTRICAS. EL USO DE TCA (CIDO TRICLOROACTICO) ES DEMASIADO FUERTE PARA DESPROTEINIZAR SI LA MUESTRA EN SOLUCIN CONTIENE DISACRIDOS O FRUCTOSA.

DESPROTEINIZACIN DE LA MUESTRA
MTODOS ACEPTABLES: a) ADASE ETANOL O ACETONA AL 70% (v/v). LA MAYORA DE LAS PROTENAS COAGULARN Y SE PODRN FILTRAR O CENTRIFUGAR.

DESPROTEINIZACIN DE LA MUESTRA
b) PRECIPITACIN CON METALES PESADOS BAJO CONDICIONES ALKALINAS. EJEMPLO: LA SOLUCIN CARREZ PRECIPITA PROTENAS, ABSORBE ALGUNOS COLORES, Y ROMPE EMULSIONES.

PROCEDIMIENTO
SE AADE A LA MUESTRA LQUIDA SOLUCIN CARREZ I (HEXACIANOFERRATO DE POTASIO, K4[Fe(CN)6]3H2O), SE AADE A LA MUESTRA SOLUCIN CARREZ II (SULFATO DE ZINC (ZnSO47 H2O), Y SOLUCIN DE NaOH. SE ENFRA, SE DILUYE A UN VOLUMEN DETERMINADO Y SE FILTRA.

PREPARACIN DE LA MUESTRA INCLUYENDO LA EXTRACCIN DE AZCAR

SE PUEDE REALIZAR MEDIANTE UN EXTRACTOR SOXHLET SE AADE LA MUESTRA AL ETANOL AL 80% (v/v, CONCENTRACIN FINAL) HIRVIENDO. LOS POLISACRIDOS SON INSOLUBLES Y EL CALOR INACTIVA A LAS ENZIMAS.

PREPARACIN DE LA MUESTRA INCLUYENDO LA EXTRACCIN DE AZCAR

PUEDE AADIRSE CARBONATO DE CALCIO PARA NEUTRALIZAR LOS CIDOS DEL ALIMENTO, YA QUE STOS PUEDEN OCASIONAR LA HIDRLISIS DE LOS POLISACRIDOS.
TAMBIN SE DEBE USAR EXTRACTANTE DE ALCOHOL EN BUFFER PARA EVITAR LA HIDRLISIS CIDA

PREPARACIN DE LA MUESTRA INCLUYENDO LA EXTRACCIN DE AZCAR

EN CASO DE QUE SE NECESITE ELIMINAR EL ETANOL DEL EXTRACTO PREVIO AL ANLISIS SE PUEDE REALIZAR ESTE PASO MEDIANTE VACO. TAMBIN SE PUEDE REALIZAR CALENTANDO LEVEMENTE EN BAO MARA BAJO CAMPANA DE EXTRACCIN O MEDIANTE UN ROTAVAPOR.

MTODOS DE ANLISIS DE CARBOHIDRATOS

MTODOS QUMICOS
MTODO FLUORIMTRICO MTODOS ENZIMTICOS CROMATOGRAFA DE GASES CROMATOGRAFA LQUIDA MTODOS FSICOS

MTODOS QUMICOS
REACCIONES DEL H2SO4 Y CARBOHIDRATOS CIDO FENOL SULFRICO FUNDAMENTO.- PROVIENE DE LOS PRODUCTOS DE REACCIN Y DEGRADACIN DEL CIDO Y EL AZCAR.

CIDO FENOL SULFRICO

EL AZCAR SE TORNA PRINCIPALMENTE HIDROXIMETILFURFURAL (HMF) O FURFURAL (F) LOS CUALES SON REALMENTE DETERMINADOS LEYENDO LA ABSORBANCIA A 490nm
H2SO4 CONC.

FENOL + CARBOHIDRATO AMARILLO NARANJA CALOR

CIDO FENOL SULFRICO

H+ H+ POLISACRIDOS MONOSACRIDOS F + HMF

VENTAJAS DEL MTODO

ES SENCILLO ES RPIDO SENSIBLE A MUY BAJOS NIVELES DE AZCAR (E.G. 5g) ESPECFICO PARA CARBOHIDRATOS. NO EXISTE INTERFERENCIA CON PROTENAS

VENTAJAS DEL MTODO

A MENUDO NO ES NECESARIA LA CLARIFICACIN DE LA MUESTRA LOS REACTIVOS SON BARATOS Y ESTABLES COLOR ESTABLE RESULTADOS REPRODUCIBLES RESULTADOS CONFIABLES

DESVENTAJAS DEL MTODO

LOS CARBOHIDRATOS QUE NO PROPORCIONAN HMF Y F EN LA DESCOMPOSICIN CIDA RESULTAN EN UNA AMPLIA GAMA DE COLORES. POR TANTO EL MTODO NO MIDE TODOS LOS CARBOHIDRATOS

DESVENTAJAS DEL MTODO

MIDE LA MAYORA DE LOS CARBOHIDRATOS PERO LA INTENSIDAD DEL COLOR VARA AMPLIAMENTE ENTRE LOS CARBOHIDRATOS, POR LO QUE SE DEBE SELECCIONAR UNO DE ELLOS COMO REFERENCIA

DESVENTAJAS DEL MTODO

LA PROPORCIN DE H2SO4 ES MUY IMPORTANTE YA QUE SE ADICIONA H2SO4 COMO FUENTE DE CALOR A LA MUESTRA ACUOSA.

SE DEBE EVITAR LA CONTAMINACIN PROVENIENTE DEL PAPEL FILTRO O POLVO DE CELULOSA

ANTRONA CIDO SULFRICO (9,10 DIHIDRO-9OXOANTRACENO)

FUNDAMENTO EL MTODO ES BSICAMENTE IGUAL AL DEL FENOL PERO EL COLOR QUE SE OBTIENE ES AZL VERDE Y SE LEE A UNA ABSORBANCIA DE 620nm. TIENE LAS MISMAS VENTAJAS Y DESVENTAJAS QUE EL MTODO ANTERIOR.

DETERMINACIONES DE AZCARES REDUCTORES

AZCAR + LKALI FRAGMENTOS DE AZCAR REDUCTOR + Cu(OH)2 COMPLEJO DE COBRE DE TARTRATO Y CITRATO OH H2O + Cu2O ---- CuOH ---- Cu+ + MEZCLA DE CIDOS DE AZCAR

SOLUCIN DE FEHLING
FUNDAMENTO DOS SOLUCIONES : SOLUCIN A: SULFATO DE COBRE CRISTALINO SOLUCIN B: TARTRATO DE SODIO Y POTASIO (O CITRATO DE SODIO) + HIDRXIDO DE SODIO (O HIDRXIDO DE POTASIO O CARBONATO DE SODIO)

SOLUCIN DE FEHLING
FUNDAMENTO

EL CITRATO O TARTRATO EVITA LA PRECIPITACIN DEL HIDRXIDO CPRICO

EL LKALI ENOLIZA A LOS AZCARES Y PROVOCA SU ROMPIMIENTO EN FRAGMENTOS REACTIVOS QUE PUEDEN OXIDARSE INMEDIATAMENTE: Cu++ (CPRICO) ES REDUCIDO A Cu+ (EL IN CUPROSO)

SOLUCIN DE FEHLING
FUNDAMENTO A MEDIDA QUE LOS IONES Cu++ SE REDUCEN POR LOS FRAGMENTOS DE AZCAR, LOS IONES Cu+ SE COMBINAN CON LOS IONES HIDROXILO PARA FORMAR HIDRXIDO DE COBRE (DE COLOR AMARILLO, Cu+).

SOLUCIN DE FEHLING
FUNDAMENTO EL CuOH REDUCIDO PIERDE H2O EN PRESENCIA DE CALOR PARA DAR COMO RESULTADO XIDO CUPROSO INSOLUBLE (Cu2O)

SOLUCIN DE FEHLING
FUNDAMENTO LA DETERMINACIN DEL COBRE REDUCIDO SE PUEDE LLEVAR A CABO POR GRAVIMETRA, VOLUMETRA, O POR MTODOS ELECTROLTICOS. EL PESO DEL Cu2O SLO ES APLICABLE A MUESTRAS RELATIVAMENTE PURAS.

DESVENTAJAS DEL MTODO DE FEHLING

LA REDUCCIN DEL COBRE Y LA OXIDACIN DE LOS AZCARES NO ES ESTQUIOMTRICA .
LA PRODUCCIN DE XIDO CUPROSO VARA, DEPENDIENDO DEL REACTIVO LKALI, LA VELOCIDAD Y TIEMPO DE CALENTAMIENTO Y LA CONCENTRACIN DE AZCARES EN LA MUESTRA

DESVENTAJAS DEL MTODO DE FEHLING

LOS AZCARES DIFIEREN EN SU HABILIDAD PARA REDUCIR LA SOLUCIN CPRICA, POR TANTO, LA TITULACIN (O PESO O ABSORBANCIA) DEBEN SER CONVERTIDOS EN (mg DE COBRE) Y POSTERIORMENTE SE RECURRIR A TABLAS PARA DETERMINAR LA CONCENTRACIN DE AZCAR PRESENTE EN LA MUESTRA

MTODO DE MUNSON WALKER

FUNDAMENTO
NaOH + Cu++ + AZCAR REDUCTOR CU+ + AZCAR (Cu2O) OXIDADO

LA DETERMINACIN DEL Cu2O PUEDE SER GRAVIMTRICA, PERO ES GENERALMENTE MEJOR TITULAR EL XIDO CUPROSO. ESTO SE PUEDE REALIZAR MEDIANTE UNO DE LOS SIGUIENTES MTODOS (SE LLEVAN MUCHO TIEMPO):

TITULACIN DEL PERMANGANATO DE POTASIO

EL Cu2O REACCIONA CON EL IN FRRICO (Cu+++) EL CUAL ES REDUCIDO AL IN FERROSO (Cu++). POSTERIORMENTE EL IN FERROSO ES TITULADO (+2 +3) CON PERMANGANATO (+3, ROSA +2, INCOLORO)
1) Cu2O + Fe2(SO4)3 2FeSO4 + CuSO4 + CuO

TITULACIN DEL PERMANGANATO DE POTASIO

2) 10 FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 5Fe2(SO4)3 + K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O

TITULACIN DEL TIOSULFATO DE SODIO

SE OXIDA EL Cu+ A Cu++ CON CIDO NTRICO. POSTERIORMENTE SE HIERVE LA MUESTRA PARA ELIMINAR EL EXCESO DE HNO3

Cu2O Cu(NO3)2

HNO3

TITULACIN DEL TIOSULFATO DE SODIO

SE AADE UNA CANTIDAD CONOCIDA DE SOLUCIN DE KI 2I- + 2Cu++ 2Cu+ + I2

TITULACIN DEL TIOSULFATO DE SODIO

SE TITULA EL I2 LIBERADO CON UNA SOLUCIN ESTNDAR DE TIOSULFATO DE SODIO (Na2S2O3) I2 + I- I3- S4O6-2 + 3 I(TRIIODURO)

S2O3-2

SE USA ALMIDN COMO INDICADOR: AZL INCOLORO

DESVENTAJAS DEL MTODO

NO SE PUEDE DISTINGUIR ENTRE LOS DIFERENTES AZCARES REDUCTORES.

SE REQUIEREN MUESTRAS RELATIVAMENTE GRANDES (100 A 200mg DE GLUCOSA POR DETERMINACIN.

MTODO SOMOGY I-NELSON

AZCAR REDUCTOR + Cu++ Cu+ + AZCAR REDUCTOR

MTODO SOMOGY I-NELSON

PROCEDIMIENTO:
Muestra (Azcar reductor +) Reactivo de Somogyi Cu+2

Calor

Azcar Oxidante + CU+ (Cu2O) CU+1(red) CU+1(oxi) AsMo (ox) AsMo (red) Es de un fuerte color azul

Se le la absorbancia a 500 nm. Se cuantifica con la curva estndar

Reactivos para el Mtodo de Somogy i y Nelson para azcares reductores Reactivo de Somogy i
NaCO3 - Carbonato de sodio NaHCO3 Bicarbonato de Sodio KaNaC4H4O6 Tartrato de Sodio Potasio CuSO45H2O Sulfato de Cobre

Reactivo de Nelson
(NH4)6Mo7O24 - Molibdato de amonio Na2HAsO7H2O Arsenato de Sodio H2SO4 cido Sulfrico

MTODO FLUORIMTRICO
FUNDAMENTO ESTE MTODO ES POSIBLE CUANDO LOS COMPUESTOS ABSORBEN RADIACIN A LONGITUD DE ONDA CORTA Y LUEGO EMITEN RADIACIN A UNA LONGITUD DE ONDA MS LARGA.

DETERMINACIN DE GLUCOSA POR EL MTODO FLUORIMTRICO

EXTRACCIN CON ISO-BUTIL METIL CETONA. REACCIN CON HIDRACIDA DE CIDO p-HIDROXIBENZOICO ADICIN DE REACTIVO Y LECTURA A UNA EMSIN DE 470nm EXCITACIN A 454nm

MTODOS ENZIMTICOS
INFORMACIN GENERAL REQUIEREN DE UN EXTRACTO NEUTRO O CIDO LIBRE DE ALCOHOLES Y METALES PESADOS (NO SE PUEDEN USAR SALES DE PLOMO PARA CLARIFICAR LOS EXTRACTOS)

APLICACIN DE LOS MTODOS ENZIMTICOS

SON POSIBLES PARA UN GRAN NMERO DE CARBOHIDRATOS O COMPUESTOS RELACIONADOS: MONOSACRIDOS DISACRIDOS POLISACRIDOS ALOCHOLES Y POLIOLES CIDOS

FUNDAMENTO
GLUCOSA EXISTEN KITS QUE CONTIENEN LOS SIGUIENTES REACTIVOS PARA LA DETERMINACIN DE GLUCOSA: BUFFER, o DIANISIDINA 2HCl (CROMGENO REDUCIDO) CATALASA GLUCOSA OXIDASA

REACCIONES
GLUCOSA OXIDASA

H2O + O2 + GLUCOSA LACTONA DE CIDO D-GLUCNICO + H2O

CATALASA

H2O2 H2O + O2 O2 + CROMGENO INCOLORO, REDUCIDO CROMGENO AZL OXIDADO

DETERMINACIN ENZIMTICA DE SACAROSA/GLUCOSA

LA CONCENTRACIN DE GLUCOSA ES DETERMINADA ANTES Y DESPUS DE LA HIDRLISIS ENZIMTICA

DETERMINACIN DE LA GLUCOSA ANTES DE LA INVERSIN

A UN pH DE 7.6 LA ENZIMA HEXOQUINASA (HK) CATALIZA LA FOSFORILACIN DE GLUCOSA MEDIANTE EL ADENOSIN TRIFOSFATO. EN PRESENCIA DE GLUCOSA 6FOSFATO DESHIDROGENASA (G6P-DH) LA GLUCOSA-FOSFATO PRODUCIDA ES ESPECFICAMENTE OXIDADA POR EL NADP A GLUCONATO-FOSFATO CON LA FORMACIN DE NADP REDUCIDO.

REACCIONES
GLUCOSA + ATP G6P + ADP
G6P + NADP+ GLUCONATO-FOSFATO + NADPH + H+
G6P-DH

HK

EL NADPH FORMADO EN ESTA REACCIN ES ESTEQUIOMTRICO CON LA CANTIDAD DE GLUCOSA Y SE MIDE MEDIANTE EL AUMJENTO EN ABOSROBANCIA A 334, 340 365 nm.

INVERSIN ENZIMTICA.
A pH DE 4.6 LA SACAROSA ES HIDROLIZADA POR LA ENZIMA FRUCTOSIDASA (INVERTASA) A GLUCOSA Y FRUCTOSA:
SACAROSA + H2O GLUCOSA + FRUCTOSA
-FRUCTOSIDASA

EL CONTENIDO DE GLUCOSA ES CALCULADO DE LA DIFERENCIA DE CONCENTRACIONES DE GLUCOSA ANTES Y DESPUS DE LA INVERSIN ENZIMTICA

CROMATOGRAFA DE GASES
FUNDAMENTO LOS AZCARES SON COMPUESTOS POLIHIDROXI UNIDOS FUERTEMENTE POR HIDRGENO YA SEA A AGUA O A ELLOS MISMOS EN CRISTALES. POR TANTO, TIENEN PUNTOS DE FUSIN MUY ALTOS (200-300C)

CROMATOGRAFA DE GASES FUNDAMENTO

LOS AZCARES SE PUEDEN CONVERTIR EN DERIVADOS VOLTILES POR MTODOS DE UN PASO ANTES DE SER SUJETOS A ANLISIS POR CG. LOS MS CONVENIENTES PARECEN SER: ACETATOS DE ALDITOL, METIL TERES, Y TRIMETISILIL TERES.

CROMATOGRAFA DE GASES FUNDAMENTO

LA ALTA TEMPERATURA PUEDE OCASIONAR LA DEGRADACIN TRMICA DE LOS AZCARES, PARTICULARMENTE LA PRDIDA DE AGUA PARA FORMAR DERIVADOS ANHIDRO.
LOS TRIMEISILIL TERES TIENEN LA VENTAJA DE LA COMBINACIN DE ESTABILIDAD Y VOLATILIDAD QUE PERMITEN LA DETERMINACIN POR CG DE OLIGOSACRIDOS DE HASTA 7 CARBONOS

CROMATOGRAFA DE GASES PROCEDIMIENTO

SE PREPARAN DERIVADOS VOLTILES DE CARBOHIDRATOS SE INYECTAN EN LA COLUMNA CALIENTE DEL CG LOS DERIVADOS VOLTILES PSAN A DIFERENTES VELOCIDADES A TRAVS DE LA COLUMNA CON UNA CORRIENTE LEVE DE GAS ACARREADOR

CROMATOGRAFA DE GASES PROCEDIMIENTO

LOS COMPONENTES SEPARADOS ALCANZAN EL FINAL DE LA COLUMNA Y EL DETECTOR. LA SEAL GENERADA POR EL DETECTOR CONDUCE A LA PLUMILLA DE LA CARTA REGISTRADORA A OBTENER UN PICO PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIN DE LA SUBSTANCIA.

MTODOS FSICOS DENSIMETRA

FUNDAMENTO
LA GRAVEDAD ESPECFICA DE UNA SOLUCIN DE AZCAR ES UNA FUNCIN DE LA CONCENTRACIN DE SOLUTO A UNA TEMPERATURA DEFINIDA. LA PRESENCIA DE OTROS MATERIALES SOLUBLES AFECTA LA GRAVEDAD ESPECFICA DE LA SOLUCIN, PERO ESTE MTODO PROPORCIONA UNA APROXIMACIN A LA CANTIDA DE AZCAR PRESENTE EN SOLUCIONES DE AZCAR RELATIVAMENTE PURA

DETERMINACIN POR DENSITOMETRA

EL INSTRUMENTO DE MEDICIN ES UN HIGRMETRO (TAMBIN UTILIZADO PARA MEDIR SLIDOS SOLUBLES TOTALES). SE HA DISEADO UN HIGRMETRO ESPECIAL PARA LEER EL % DE AZCAR DIRECTAMENTE A 20C (GRADOS BRIX).

NDICE DE REFRACCIN FUNDAMENTO

EL NDICE DE REFRACCIN DE UNA SOLUCIN DE AZCAR ES UNA MEDIDA DE SU CONCENTRACIN. LAS SOLUCIONES DE DIFERENTES AZCARES DE IGUAL CONCENTRACIN TIENEN APROXIMADAMENTE EL MISMO NDICE DE REFRACCIN

NDICE DE REFRACCIN PROCEDIMIENTO

SE DETERMINA EL NDICE DE REFRACCIN DE LA SOLUCIN AZUCARADA A 20C MEDIANTE UN REFRACTMETRO ABB O UN REFRACTMETRO MANUAL.
SE OBTIENE POR LECTURA DIRECTA EL % DE SLIDOS SOLUBLES TOTALES (COMO SACAROSA) DE UNA TABLA DE NDICES DE REFRACCIN A % DE SACAROSA COMO FACTORES DE CORRECCIN.

POLARIMETRA FUNDAMENTO
LA RADIACIN SE COMPORTA COMO SI TUVIERA UN COMPONENTE ELCTRICO Y UNO MAGNTICO. ACTAN COMO SI ESTUVIERAN DISPUESTOS EN NGULOS RECTOS UNO CON RESPECTO AL OTRO. HAY MILLONES DE RAYOS QUE PROVIENEN DE LA FUENTE LUMINOSA. LA DIRECCIN DE LOS COMPONENTES ELCTRICOS Y MAGNTICOS ES PURAMENTE ALEATORIA, AS QUE SE TIENE RADIACIN NO POLARIZADA.

POLARIMETRA FUNDAMENTO
SI SE PUEDE HACER QUE TODOS LOS RAYOS TENGAN ORIENTADOS SUS COMPONENTES ELCTRICOS Y MAGNTICOS EN LA MISMA DIRECCIN, LA RADIACIN SER POLARIZADA EN PLANO. ESTO SE PUEDE LOGRAR MEDIANTE EL USO DE UN FILTRO POLARIZADOR.

POLARIMETRA FUNDAMENTO
CUANDO LA LUZ POLARIZADA BRILLA EN UNA MOLCULA ASIMTRICA (UN COMPUESTO QUE NO PUEDE PRODUCIR UNA IMAGEN AL ESPEJO). LA LUZ ES ROTADA. ESTO ES LLAMADO COMPUESTO PTICAMENTE ACTIVO (e.g. GLUCOSA).

SI UN COMPUESTO TIENE SIMETRA LA LUZ POLARIZADA NO SER AFECTADA.

POLARIMETRA FUNDAMENTO
EL SEGUNDO FILTRO ES ROTADO MANUALMENTE PARA COMPAGINAR VISUALMENTE LAS SOMBRAS DE UN COLOR. ESTO ROTA AL RAYO DE LUZ POLARIZADA DE REGRESO A SU POSICIN ORIGINAL. SE MIDE EL GRADO DE ROTACIN REQUERIDO.

MAGNITUD DE LA ROTACIN
DEPENDIENTE DE:
LA LONGITUD DE ONDA DE LA LUZ UTILIZADA. LONGITUD DE LA CELDA NATURALEZA DE LA SUBSTANCIA ACTIVA Y SU CONCENTRACIN TEMPERATURA

POLARMETROS vs SACARMETROS
POLARMETRO: USA LUZ MONOCROMTICA Y LEE EN GRADOS ANGULARES (SE DEBE RELACIONAR CON LA CONCENTRACIN DE AZCAR). SACARMETRO: USA LUZ BLANCA Y LEE LA CONCENTRACIN DE AZCAR DIRECTA.

SEPARACIN DE PROTENAS MTODOS

SE UTILIZAN ESTOS MTODOS PARA LA PRODUCCIN DE ALIMENTOS O INGREDIENTES DE LOS MISMOS. PARA PURIFICAR UNA PROTENA DE UN ALIMENTO PARA POSTERIOR ESTUDIO EN EL LABORATORIO.

SEPARACIN DE PROTENAS FUNDAMENTO GENERAL

LOS MTODOS DE SEPARACIN DE PROTENAS EXPLOTAN LAS DIFERENCIAS BIOQUMICAS EN LA SOLUBILIDAD DE LAS MISMAS, SU TAMAO, CARGA, CARACTERSTICAS DE ADSORCIN, AFINIDAD BIOLGICA POR OTRAS MOLCULAS. LAS TCNICAS SE UTILIZAN PARA PURIFICAR PROTENAS INDIVIDUALES A PARTIR DE MEZCLAS COMPLEJAS.

CONSIDERACIONES GENERALES
ANTES DE EMPEZAR UNA SECUENCIA DE SEPARACIN DE PROTENAS PARA SU PURIFICACIN SE DEBE CONOCER: SU PESO MOLECULAR, SU PUNTO ISOELCTRICO, SUS PROPIEDADES DE SOLUBILIDAD, SU TEMPERATURA DE DESNATURALIZACIN, ALGUNA CARACTERSTICA QUE LA DISTINGA DE LAS DEMS PROTENAS.

MTODOS DE PURIFICACIN DE PROTENAS

LOS MS COMNES SON: PRECIPITACIN CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO CROMATOGRAFA DE AFINIDAD CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN DE TAMAO

SEPARACIN POR CARACTERSTICAS DE SOLUBILIDAD DIFERENCIAL

FUNDAMENTO LA SEPARACIN POR PRECIPITACIN EXPLOTA LAS DIVERSAS DIFERENCIAS EN SOLUBILIDAD DE LAS PROTENAS EN SOLUCIN.

LAS PROTENAS SON POLIELECTROLITOS Y SUS CARACTERSTICAS DE SOLUBILIDAD ESTN DETERMINADAS POR EL TIPO Y CARGA DE AMINO CIDOS EN LA MOLCULA.

PRECIPITACIN DIFERENCIAL DE LAS PROTENAS

CAMBIANDO EL pH DEL BUFFER FUERZA INICA CONSTANTE DIELCTRICA TEMPERATURA

PROCEDIMIENTOS
SALADO (SALTING OUT) LAS PROTENAS TIENEN PERFILES DE SOLUBILIDAD NICOS EN SOLUCIONES DE SAL NEUTRAS. LAS BAJAS CONCENTRACIONES DE SALES NEUTRAS AUMENTAN LA SOLUBILIDAD DE LAS PROTENAS.

SALADO (SALTING OUT) FUNDAMENTO

SI SE AUMENTA LA FUERZA INICA DE LA SOLUCIN LAS PROTENAS SE PRECIPITAN. ESTE ES UNO DE LOS PRIMEROS PASOS DE SEPARACIN DE PROTENAS. STAS SE PUEDEN SEPARAR DE UNA MEZCLA MUY COMPLEJA CON ESTE MTODO.

SALADO (SALTING OUT) REACTIVOS

SULFATO DE AMONIO [(NH4)2SO4]. SE USA COMNMENTE DEBIDO A QUE ES ALTAMENTE SOLUBLE. TAMBIN SE PUEDEN USAR: NaCl, O KCl.

PRECIPITACIN ISOELCTRICA FUNDAMENTO

PUNTO ISOELCTRICO (pI). DEFINIDO COMO EL pH AL QUE UNA PROTENA NO TIENE CRGA NETA EN SOLUCIN.
LAS PROTENAS SE AGREGAN Y PRECIPITAN EN SU pI DEBIDO A QUE NO EXISTE REPULSIN ELECTROSTTICA ENTRE MOLCULAS.

PRECIPITACIN ISOELCTRICA FUNDAMENTO

LAS PROTENAS TIENEN DIFERENTES pIS, POR TANTO, PUEDEN SER SEPARADAS AJUSTANDO EL pH DE LA SOLUCIN.

CUANDO SE AJUSTA EL pH DE UNA SOLUCIN AL pI DE UNA PROTENA STA PRECIPITA. SI LAS DEMS PROTENAS TIENEN OTROS pIS STAS PERMANECERN EN SOLUCIN

PRECIPITACIN DE PROTENAS POR TAMAO

FUNDAMENTO LOS PESOS MOLECULARES DE LAS PROTENAS SON DE 10 000 A MS DE 1 000 000. POR TANTO, EL TAMAO ES UN PARMETRO A EXPLOTAR PARA SU SEPARACIN. LA SEPARACIN REAL OCURRE BASADA EN EL LLAMADO RADIO DE STOKES, EL CUAL ES EL RADIO PROMEDIO DE LA PROTENA EN SOLUCIN Y ES DETERMINADO POR LA CONFORMACIN DE LA PROTENA.

PROCEDIMIENTOS DILISIS
FUNDAMENTO SE UTILIZA PARA SEPARAR MOLCULAS EN SOLUCIN MEDIANTE EL USO DE MEMBRANAS SEMIPERMEABLES QUE PERMITEN EL PASO DE PEQUEAS MOLCULAS PERO NO DE LAS GRANDES.

DILISIS PROCEDIMIENTO
LA SOLUCI PROTICA ES COLOCADA EN UN TUBO O BOLSA DE DILISIS QUE SE AMARRA O SUJETA POR UN EXTREMO. EL OTRO EXTREMO SE SELLA O AMARRA UNA VEZ QUE SE HA COLOCADO LA MUESTRA Y SE COLOCA EL TUBO O BOLSA EN UN GRAN VOLUMEN DE AGUA O BUFFER (GENERALMENTE 500 A 1000 VECES MS GRANDE QUE LA CANTIDAD DE MUESTRA EN EL TUBO O BOLSA DE DILISIS.

DILISIS FUNDAMENTO
LOS SOLUTOS DE BAJO PESO MOLECULAR DIFUNDEN FUERA DEL TUBO DE DILISIS. EL BUFFER O AGUA DIFUNDE HACIA ADENTRO DEL TUBO.

LA SOLUCIN PROTICA DE ADENTRO DEL TUBO A MENUDO ES DILUIDA DURANTE LA DILISIS DEBIDO A DIFERENCIAS EN FUERZA OSMTICA ENTRE LA SOLUCIN Y EL AGUA O BUFFER DE LA DILISIS

APLICACIONES DEL MTODO DE DILISIS

SE PUEDE UTILIZAR ESTE MTODO PARA CONCENTRAR PROTENA ENVOLVIENDO LA BOLSA DE DILISIS CON POLIETILENGLICOL, EL CUAL ABSORBE AGUA Y CONCENTRA LA SOLUCIN DENTRO DE LA BOLSA DE DILISIS. EL EQUILIBRIO DE LA DILISIS SE PUEDE USAR PARA DETERMINAR LA ESTEQUIOMETRA DE LA UNIN PROTENA-LIGANDO.

GELIFICACIN DE LAS PROTENAS

CASO DE LA CASENA DE LA LECHE
FUNDAMENTO EL QUESO ES LA CUAJADA DE LA LECHE, BSICAMENTE UN GEL DE CASENA .

FORMACIN DE LA CUAJADA
SE BASA EN LA ACIDIFICACIN DE LA LECHE MEDIANTE ENZIMAS PROTEOLTICAS. LAS ENZIMAS ACTAN EN UN RANGO PTIMO DE 36-39C. SE SUELEN UTILIZAR UNA MEZCLA DE QUIMOSINA Y PEPSINA DE CERDO CON UNA ENZIMA COAGULADORA OBTENIDA DE UN HONGO.

FORMACIN DE LA CUAJADA
LA ENZIMA INICIA EL PRIMER PASO EN LA CONVERSIN DE LAS MICELAS DE FOSFOCASEINATO DE CALCIO DISPERSAS EN FORMA COLOIDAL EN EL QUESO. LAS MICELAS DE CASENA EN LA LECHE PUEDEN DESESTABILIZARSE POR LA ENZIMA QUIMOSINA. STA ES EL INGREDIENTE ACTIVO EN LAS GOTAS O TABLETAS DE CUAJO.

EFECTOS DE LA QUIMOSINA EN LA FORMACIN DEL QUESO

LA QUIMOSINA ES RESPONSABLE DE LA PRIMERA ETAPA EN LA COAGULACIN DE LA LECHE. CAUSA LA DIVISIN DE UN ENLACE ESPECFICO, EL ENLACE PEPTDICO DE FENIL-ALANINA-METIONINA. ROMPE LA PORCIN CIDA RICA EN CARBOHIDRATOS DE LA MOLCULA DEL RESTO HIDROFBICO PRIMARIO O para-kCASENA.

EFECTOS DE LA QUIMOSINA EN LA FORMACIN DEL QUESO

CON LA PRDIDA DE LA PORCIN CIDA DE LA MOLCULA, EL RESTO DE LA k-CASENA YA NO ESTABILIZA LAS MICELAS. STAS SE APROXIMAN UNAS A OTRAS Y SE UNEN, PROBABLEMENTE POR ENLACES HIDROFBICOS Y FORMAN UNA RED TRIDIMENSIONAL QUE ATRAPA LA FASE ACUOSA DE LA LECHE.

EFECTOS DE LA QUIMOSINA EN LA FORMACIN DEL QUESO

LA QUIMOSINA NO DESPLAZA AL CALCIO DE LA MICELA. EL COAGULO DE LA LECHE FORMADO POR LA ACCIN DEL CUAJO ES EL FOSOFOCASEINATO DE CALCIO.
EL GEL FORMADO POR EL CUAJO ES FIRME, ELSTICO.

TEMPERATURA PTIMA DE FORMACIN DE LA CUAJADA

39-40C
LA LECHE NO DEBE SOBRECALENTARSE ANTES DE AADIR EL CUAJO DEBIDO A QUE SI SE FORMA GEL STE SER DBIL DEBIDO, EN PARTE, A UN COMPLEJO INDUCIDO POR EL CALOR ENTRE LA -LACTOGLOBULINA Y LA k-CASENA. STA LTIMA SE HACE RESISTENTE AL EFECTO DE LA QUIMOSINA.