Fisiologa de la hematopoyesis

M. Ramrez Orellana1, A.M. Cornejo Gutirrez2

1

Oncologa Peditrica. Hospital Nio Jess. 2Equipo de Atencin Primaria de Ocaa

Resumen

Palabras clave

El sistema hematopoytico est compuesto por diferentes tipos celulares que derivan de la diferenciacin y expansin de progenitores inmaduros. Su funcionamiento correcto asegura la produccin de las clulas responsables del transporte de oxgeno, la coagulacin sangunea y la inmunidad. Se organiza como una jerarqua en la que las relaciones entre los diferentes tipos celulares se basan en la capacidad de proliferacin y de diferenciacin celular. El funcionamiento normal de la hematopoyesis resulta de la interaccin entre mecanismos intracelulares y la influencia del microambiente donde se desarrollan las clulas hematopoyticas. Hematopoyesis; Fenotipo; Ensayos funcionales; Proliferacin; Diferenciacin.

Abstract

Key words

PHYSIOLOGY OF HEMATOPOIESIS Hematopoietic cells derive from the selfrenewal and differentiation of immature progenitors. The hematopoietic system provides the cells responsible for the oxigen exchange in the body tissues, blood clotting and immune defense. This system is organized as a hierarchy of different cells with different proliferative and differentiative capacities. Microenviroment cues as well as intracellular genetic programms govern the physiology of the hematopoietic system. Hematopoiesis; Phenotype; Functional assays; Proliferation; Differentiacion.

Pediatr Integral 2004;VIII(5):377-382.

INTRODUCCIN Diariamente miles de millones de clulas hemticas maduras, principalmente eritrocitos y granulocitos, mueren y son eliminadas de la circulacin. Un nmero equivalente de clulas jvenes alcanza la sangre perifrica (SP), de manera que se compensa la prdida ya sealada. La hematopoyesis hace referencia a este proceso continuo de produccin de clulas hemticas. En este artculo, vamos a comenzar describiendo las clulas que componen el sistema hematopoytico, seguidamente describiremos la organizacin de dicho sistema y, por ltimo, hablaremos del funcionamiento normal de la hematopoyesis. ANATOMA CELULAR DE LA HEMATOPOYESIS El sistema hematopoytico est compuesto por diferentes tipo celulares: c-

lulas madre, progenitores y clulas maduras. Su localizacin anatmica cambia a lo largo del desarrollo embrionario. El sistema hematopoytico est compuesto por diferentes tipo celulares organizados jerrquicamente (Fig. 1). Mientras su desarrollo y maduracin sucede en localizaciones anatmicas concretas, los elementos maduros y, en menor medida, los inmaduros circulan juntos por la SP. La hematopoyesis durante el desarrollo embrionario La localizacin anatmica del sistema hematopoytico cambia a lo largo del desarrollo embrionario y postnatal. Hoy da se piensa que este proceso se inicia durante la embriognesis, a partir de clulas mesodrmicas capaces de generar tanto hematopoyesis como clulas endoteliales: hemangioblastos. La primera localizacin es extraembrionaria, en los is-

lotes hemticos del saco vitelino. La hematopoyesis en este momento se caracteriza por restringirse a la produccin de clulas eritroides nucleadas, con hemoglobina embrionaria. Posteriormente, la hematopoyesis tendr una localizacin definitiva intraembrionaria, primero en la esplacnopleura paraartica y luego en la regin denominada AGM (Aortic-Gonadal-Mesonephros). Despus de desarrollarse la circulacin sangunea, es el hgado fetal el principal rgano hematopoytico, para trasladarse definitivamente a la mdula sea (MO) y tejidos linfticos perifricos. Clulas hematopoyticas En el sistema hematopoytico se reconocen diversos tipos celulares, que podemos agrupar en: clulas madre, clulas progenitoras y clulas maduras (Fig. 2). El inicio del proceso de diferenciacin hematopoytica se encuentra en

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FIGURA 1. Clulas del sistema hematopoytico

Clulas madre mieloides CFU-GEMMM

Clulas madre

Clulas madre linfoides Pro-B Pro-T Pre-B

CFU-Meg BFU-E

CFU-GM

CFU-Eo CFU-Ba CFU-Mast Pre-T

CFU-E CFU-G CFU-M

B NK T

Plaquetas

Basfilos Neutrfilos Plasmticas Monocitos Mastocitos Eosinfilos Eritrocitos

La figura recoge las diferentes subpoblaciones hematopoyticas y las relaciones que mantienen entre ellas.

FIGURA 2. Representacin esquemtica del sistema hematopoytico

Sistema hematopoytico Clulas madre Progenitores comprometidos Clulas maduras + Maduracin Expansin

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el compartimento de clulas madre o clulas troncales hematopoyticas (stem cells). Este grupo de clulas es el responsable de la generacin continua y de por vida de todas las dems clulas hemticas. Son las clulas con la mxima capacidad de autorrenovacin y diferenciacin, caractersticas que se van perdiendo conforme las clulas hematopoyticas se diferencian en elementos ms maduros. Las clulas madre hematopoyticas son las nicas capaces de regenerar el sistema hematopoytico del receptor de un trasplante. Los estadios intermedios de desarrollo celular entre las clulas madre y las clulas hematopoyticas maduras estn constituidos por clulas que han sufrido restricciones en la capacidad de diferenciacin, pero todava no han adquirido los cambios morfolgicos tpicos de las clulas hemticas maduras; son los progenitores comprometidos. Las clulas ms maduras de los diferentes linajes mieloides (eritrocitos,

polimorfonucleares, monocitos y megacariocitos) se reconocen fcilmente gracias a sus caractersticas morfolgicas. Suponen el estadio final en el proceso de maduracin hematopoytica y constituyen la mayora de las clulas presentes en los sitios de hematopoyesis fisiolgica, por lo que son las clulas monitorizadas en los diferentes procesos fisiopatolgicos de la prctica mdica. Son, adems, las clulas diana de los diferentes mecanismos de control que afinan los cambios en su viabilidad, expansin y diferenciacin, as como de la liberacin final de las clulas maduras a la circulacin sangunea. Tanto las clulas madre como los progenitores y las clulas maduras se encuentran en la MO, en la SP y tambin en la sangre del cordn umbilical del recin nacido. El proceso de diferenciacin hematopoytica se describe como una jerarqua de clulas progenitoras, en la que cada estadio sucesivo se distingue del siguiente por un fenotipo caracterstico, as como por el nmero y tipo(s) de clulas hijas maduras que son capaces de generar. Esta organizacin no se puede visualizar in vivo directamente, en parte por la movilidad de los progenitores dentro de la MO y en parte porque muchos cambios tempranos e irreversibles en la expresin gnica suceden antes de que se expresen como cambios en la morfologa celular. Por este motivo, todas las clulas he-

matopoyticas inmaduras se clasifican morfolgicamente de manera indiscriminada como clulas blsticas: clulas de tamao pequeo, redondas, con ncleo grande y citoplasma escaso. Las relaciones entre progenitores y su progenie, que definen el inicio de la diferenciacin irreversible de dichos progenitores hacia un linaje hematopoytico concreto, no pueden ser estudiadas por criterios morfolgicos sino por otro tipo de anlisis, fundamentalmente por marcadores de la membrana plasmtica (inmunofenotipo) y por ensayos funcionales (cultivos in vitro, modelos animales): Inmunofenotipo: los elementos celulares diferentes del sistema hematopoytico presentan un perfil de expresin de marcadores de superficie que permite distinguirlos unos de otros mediante citometra de flujo (Fig. 3). Adems, basndose en dichas molculas de superficie se pueden purificar poblaciones de progenitores hematopoyticos para su uso en trasplantes hematopoyticos o para ensayos funcionales. Existen muchas molculas que determinan el inmunofenotipo de los progenitores, algunos de los cuales estn recogidos en la figura 3. As, las clulas madre hematopoyticas del ratn se definen como clulas que expresan la molcula Sca1, altos niveles del receptor c-kit, bajos niveles del antgeno Thy y no expresan antgenos de los diferentes linajes maduros. Son clulas Sca1+c-kithiThyloLin-. La expresin del receptor de interleuquina 7 (IL7R) y del receptor de trombopoyetina (TpoR) ayudan a identificar progenitores que exclusivamente generan clulas mieloides o clulas linfoides. De la misma manera, la expresin o no de otras molculas distingue a progenitores diferentes durante la maduracin y diferenciacin hematopoyticas (Fig. 3). Tambin, existen marcadores asociados clsicamente a clulas hemticas maduras: CD41 en plaquetas, glicoforina en eritrocitos, CD15 en granulocitos, CD14 en monocitos, CD19 en linfocitos B, CD3 en linfocitos T o CD56 en clulas NK. Ensayos funcionales: estudian las dos caractersticas principales que distin-

guen a los diversos tipos de progenitores hematopoyticos: el potencial proliferativo (nmero total de clulas hijas) y los linajes hematopoyticos diferentes (tipos distintos de clulas hijas) que puede generar un determinado tipo de progenitor (Fig. 4). Ms adelante, detallaremos los ensayos ms utilizados, tanto in vitro como in vivo. Un tipo especial de ensayo in vivo que no explicaremos aqu es la generacin de animales que bien sobreexpresan (animales transgnicos) o bien no expresan (animales knockout) un determinado cido ribonuclico mensajero (ARN-m) y, por tanto, su protena correspondiente. Estos animales sirven para estudiar la significacin fisiolgica de molculas implicadas en la hematopoyesis. El desarrollo de las clulas linfoides es diferente al de las clulas mieloides en muchos aspectos. Por ejemplo, los cambios morfolgicos no son tan pronunciados, al menos hasta el momento en el que alcanzan la capacidad de responder a estmulos antignicos. Adems, los primeros estadios de diferenciacin linfoide se acompaan de produccin y destruccin de una enorme cantidad de clulas. Hasta la fecha, no se han conseguido desarrollar condiciones de cultivo in vitro para progenitores linfoides, lo que ha impedido realizar estudios comparables a los desarrollados para los progenitores mieloides. ENSAYOS FUNCIONALES PARA PROGENITORES HEMATOPOYTICOS Las capacidades de proliferacin y maduracin de los diferentes tipos de clulas hematopoyticas slo se pueden estudiar mediante ensayos funcionales. Mucho de lo que hoy da conocemos sobre la hematopoyesis fisiolgica y sus mecanismos de regulacin proviene de estudios cuantitativos de poblaciones de clulas madre y progenitores comprometidos, definidos por su comportamiento en ensayos in vitro e in vivo. Los ensayos funcionales parten de una poblacin hematopoytica y detectan una actividad concreta en las clulas estudiadas al finalizar dicho ensayo. Requieren someter

Clulas madre mieloides

CD34+FCRlo EpoR+

Sca1+ckithiThyloLin-

Sca1lockit+ThyLin-IL7R-TpoR+

Clulas madre
Sca1lockitloThyLin-IL7R+TpoRCD34+FCRhi EpoR-

Clulas madre linfoides

FIGURA 3. Inmunofenotipo de las clulas hematopoyticas

CFU-GEMMM

CFU-GM BFU-E CFU-Meg CFU-E Plaquetas

CD41

CFU-G CFU-M

Pro-B

Pro-T

Eritrocitos
GlyA

Neutrfilos Monocitos CD15

CD14

Linfocitos B Linfocitos T Clula NK

CD19 CD3 CD56

Las diferentes subpoblaciones hematopoyticas se distinguen por el perfil de molculas que expresan en su membrana plasmtica. La figura recoge algunos de los inmunofenotipos mejor caracterizados, que aparecen encuadrados.

a las clulas a unas condiciones en las que se puedan determinar tanto el potencial de diferenciacin (nmero de linajes hematopoyticos representados entre las clulas hijas), como el potencial de proliferacin (nmero total de clulas hijas producidas). Los ensayos que cumplen estos criterios y que permiten la evaluacin de la actividad de clulas hematopoyticas individuales, facilitan la cuantificacin de la frecuencia de progenitores en una poblacin determinada. De esta forma, se pueden estudiar tambin cambios cualitativos y cuantitativos en los progenitores. El estudio de la hematopoyesis humana se ha beneficiado de los modelos y ensayos aplicados a la hematopoyesis murina. Aunque no todos los ensayos funcionales en ratones son aplicables a la hematopoyesis humana, comentaremos los ms importantes por ser los que se encuentran ms frecuentemente en la literatura. Clulas madre CFU-S El primer ensayo desarrollado para cuantificar la capacidad de proliferacin y de diferenciacin de clulas hematopoyticas fue denominado unidad formadora de colonias esplnicas (CFU-S, colony forming unit-spleen). Este ensayo detecta una subpoblacin de progenitores que, 11-12 das despus de ser trasplantadas

Sistema hematopoytico clulas progenitoras Clulas CRUs madre CFU-S LTC-ICs Progenitores CFU-GEMM comprometidos CFU-GM, BFU-E CFU-G, CFU-M, CFU-E, CFU-Meg Clulas maduras
La figura representa la localizacin de los diferentes progenitores en el sistema hematopoytico. Cada progenitor se identifica por un ensayo funcional (ver texto).

FIGURA 4. Ensayos funcionales hematopoyticos

a ratones irradiados letalmente, son capaces de originar colonias de clulas hematopoyticas en el bazo de los receptores. Las colonias esplnicas son visibles macroscpicamente y dan lugar a clulas hematopoyticas de diferentes linajes. Ms an, si se aslan y se trasplantan a ratones, algunas son capaces de generar nuevas colonias esplnicas en los receptores secundarios. Por lo tanto, las CFUS definen a una clula capaz de autorrenovarse y de diferenciarse en distintos linajes hematopoyticos, caractersticas ambas de una clula pluripotente. Estudios posteriores han descubierto que las CFU-S nos son una poblacin homognea, sino que engloban a progenitores con propiedades fenotpicas y biolgicas distintas.

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CRU La unidad de repoblacin competitiva (CRU, competitive repopulation unit) se refiere a una clula que produce un nmero estable y continuado (por ms de 4 meses) de clulas mieloides y linfoides, tras ser trasplantada a un ratn receptor. Este ensayo requiere unas condiciones especiales y complejas. De un lado, el trasplante se hace a dilucin lmite, para que exista la posibilidad de examinar la actividad de clulas individuales. De otro lado, la CRU compite con otras clulas hematopoyticas en el proceso de regeneracin postrasplante. Esto hace imprescindible que dicha CRU y su progenie sean distinguibles, normalmente por marcadores de membrana. Por ltimo, la duracin del ensayo es larga, ms de 4 meses. Sin embargo, las caractersticas tan exigentes del ensayo han servido para caracterizar muchos aspectos biolgicos de las clulas troncales hematopoyticas. El ensayo de CRU se desarroll primero en estudios de hematopoyesis murina. Recientemente, han aparecido animales inmunodeficientes en los que se ha conseguido trasplantar y desarrollar hematopoyesis humana. Esto ha hecho que se haya intentado desarrollar ensayos para caracterizar cualitativa y cuantitativamente las clulas madre hematopoyticas humanas. Aunque han resultado de utilidad, hay que tener presente que estos ensayos de hematopoyesis humana en animales inmunodeficientes no deben ser considerados como ensayos funcionales de las clulas madre humanas. El nico ensayo de este tipo sera el trasplante alognico en humanos. LTC-IC Este ensayo es defendido por algunos como un ensayo para clulas madre, aunque no existe acuerdo al respecto. Identifica una clula capaz de generar progenitores mieloides al cabo de 5 semanas de cultivo sobre un estroma de MO. Sus siglas corresponden a una clula iniciadora de cultivo a largo plazo (long term cultureinitiating cell). Experimentos con retrovirus han demostrado que las LTC-ICs no son capaces de generar hematopoyesis humana en ratones inmunodeficientes, lo que pone en cuestin su validez como ensayo para clulas madre hematopoytica.

Progenitores comprometidos CFU Las unidades formadoras de colonias hematopoyticas (colony forming units) identifican a progenitores hematopoyticos comprometidos con algn linaje mieloide conocido. En estos ensayos se cultiva una poblacin de clulas hematopoyticas en un medio semislido (metilcelulosa normalmente) que contiene diferentes factores de crecimiento hematopoyticos. La actividad hematopoytica de los progenitores se identifica por el crecimiento de colonias de clulas tras 2 semanas en cultivo. El tipo de colonia identifica al tipo de progenitor. As, se identifican progenitores granuloctico-macrofgicos (CFU-GM), granulocticos (CFU-G), eritrocticos (BFU-E ms inmaduro, y CFU-E ms maduro), megacariocticos (CFU-Meg), y mixtos (CFUGEMM). Los ensayos de colonias han servido para estudiar los tipos y concentraciones de factores de crecimiento que mantienen, estimulan, aumentan o bloquean la proliferacin y diferenciacin de los diferentes progenitores hematopoyticos. FUNCIONAMIENTO DE LA HEMATOPOYESIS El funcionamiento normal de la hematopoyesis resulta de la interaccin entre mecanismos intracelulares y la influencia del microambiente donde se desarrollan las clulas hematopoyticas. Mecanismos intrnsecos versus extrnsecos Los mecanismos intrnsecos se refieren a los cambios que acontecen en la clula hematopoytica y dirigen su comportamiento. Se han distinguido siempre cambios reversibles (aquellos que tienen que ver con la proliferacin celular) de los irreversibles (los que se asocian a diferenciacin o a muerte celular). Los mecanismos moleculares que regulan la viabilidad y la progresin en el ciclo celular estn conservados a lo largo de la evolucin. No son diferentes en las clulas hematopoyticas en comparacin con otras clulas del organismo. Estudios en este sentido han explorado sobre todo el papel de factores extrnsecos en la activacin de estos fenmenos biolgicos, adems de las vas de sealizacin de la seal extracelular hacia el ncleo.

Los procesos moleculares que regulan los cambios progresivos e irreversibles en la expresin gnica que resulta en la diferenciacin de las clulas hematopoyticas, se asocian a mediadores intracelulares especficos y tambin genricos. Entre los genes ms caractersticos de estos procesos se hallan los factores de transcripcin expresados slo en clulas hematopoyticas, e incluso a veces slo en algn linaje hematopoytico: SCL/TAL-1, GATA-1, GATA-2, PU-1. Otros genes codifican molculas que no son especficas del sistema hematopoytico, pero que son especficos en un estadio de desarrollo concreto. Un ejemplo lo constituyen la familia de los genes HOX. Adems, se han descrito cambios en la expresin de genes de las molculas de superficie, de molculas de adhesin y de mediadores intracitoplasmticos, durante los cambios asociados a la diferenciacin hematopoytica. Los estudios de sobreexpresin o de inhibicin de genes han descubierto tanto un papel esencial en algunos genes como un papel redundante de otros, adems de funciones no hematopoyticas en diferentes estadios del desarrollo embrionario. Mecanismos locales versus sistmicos Aunque los ensayos in vitro han permitido estudiar la respuesta de las clulas hematopoyticas a factores de crecimiento definidos, la viabilidad, proliferacin, diferenciacin y apoptosis in vivo debe estar regulada por cambios en el ambiente local que rodea a las clulas progenitoras. Dichos cambios incluyen el contacto directo de los progenitores y las clulas del estroma, y cambios en factores de crecimiento hematopoyticos solubles y unidos a la matriz extracelular. Existen numerosos ejemplos del papel regulador de tales contactos. Por ejemplo, la interaccin de las CFUs con las clulas del estroma se hace por medio del factor de clulas madre (SCF, stem cell factor), expresado como molcula unida a la membrana de clulas estromales. Menos conocido es el papel que puedan jugar molculas que se internalizan en la clula. Los cultivos de MO a largo plazo reproducen algunas de las caractersticas locales de la hematopoyesis. El estroma ce-

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lular que se genera contiene diversos tipos celulares: macrfagos, adipocitos, fibroblastos, clulas endoteliales y reticulares. Adems, contiene matriz extracelular, formada por fibronectina, hemonectina, trombospodina, colgeno, laminina y glicosaminoglicanos. La interaccin entre los progenitores y el estroma es un proceso muy complejo. Estas interacciones adhesivas, junto con la accin de las citoquinas presentes en el microambiente medular promoviendo o inhibiendo el crecimiento de los elementos celulares, inducen la quiescencia o la proliferacin y diferenciacin de los progenitores hematopoyticos primitivos y resultan en la progresin ordenada del sistema hematopoytico. Pero no toda la regulacin in vivo es local. La eritropoietina es una molcula circulante prototipo de un mecanismo de control por retroalimentacin. Cambios mensurables en los niveles circulantes de otros

factores hematopoyticos pueden ser detectados en una gran variedad de enfermedades y alteraciones del sistema hematopoytico. Asimismo, la administracin de dosis farmacolgicas de algunos factores de crecimiento produce efectos importantes en el nmero de clulas hemticas circulantes y la salida desde la MO a la SP de progenitores muy inmaduros (movilizacin de progenitores a la SP). Este proceso resulta clnicamente til porque permite recoger dichos progenitores mediante leucoafresis, lo que ha permitido la realizacin de trasplantes hematopoyticos en humanos sin necesidad de realizar la recogida de MO. BIBLIOGRAFA
Los asteriscos reflejan el inters del artculo a juicio del autor. 1.** Baron MH. Embryonic origins of mammalian hematopoiesis. Exp Hematol 2003; 31: 1160-9.

Es un resumen actualizado de los conocimientos existentes sobre las primeras fases del desarrollo del sistema hematopoytico. 2.*** Akashi K, Traver D, Miyamoto T, Weissman IL. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature 2000; 404: 193-7.

3.***

Kondo M, Weissman IL, Akashi K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell 1997; 91: 661-72. Estos dos trabajos son muy buenos ejemplos del uso de tcnicas de citometra y ensayos funcionales que han permitido la identificacin fenotpica y funcional de poblaciones de progenitores exclusivamente mieloides y linfoides. 4.** Ramrez M, Civin CI. Fisiologa de la hematopoyesis. En: Madero L, Muoz A, editores. Hematologa y Oncologa Peditricas. Madrid: Ergon S.A.; 1997. p. 1-19. Este captulo ampla la informacin reflejada en el presente artculo, sobre todo en lo referente a factores de crecimiento hematopoyticos y subpoblaciones celulares.

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ALGORITMO: FISIOLOGA DE LA HEMATOPOYESIS

Anatoma celular

FISIOLOGA DE LA HEMATOPOYESIS

Ensayos funcionales

Funcionamiento

Hematopoyesis embrionaria

Clulas madre

Mecanismos intrnsecos versus extrnsecos

CRU Clulas hematopoyticas

CFU-S

Mecanismos locales versus sistmicos

Inmunofenotipo

LTC-IC

Ensayos funcionales

Progenitores

CFU

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