saponificacin adecuada en base al contenido de vitamina A, diluyendo previamente la muestra en respectivo volumen de metanol.

Someter la solucin saponificada a bao Mara entre rango de 15 min a 45 min con temperatura de 85 C a 100 C, agitando vigorosamente; o tambin, puede dejarse en ausencia de oxigeno (o bajo atmsfera nitrogenada) con agitacin durante 16 horas en oscuridad. En muestras slidas es necesario utilizar centrifugacin donde previamente se debe aforar con agua bidestilada la solucin saponificada hasta un volumen conocido y luego someter a centrifugacin a 2500 r. p.m., de 5 minutos para muestras de harinas y 10 minutos para galletas; posteriormente se toma una alicuota de esta solucin (10 mL) para su anlisis, o bien filtrar dicha solucin en un embudo con placa fija de porosidad 50 um agregando un poco de alcohol al final sobre el filtro para arrastrar lo residual. Pero en situacin de obtener un volumen de saponificacin menor, se procede a someter todo para la extraccin. Si despus de la saponificacin se observa la presencia de fase aceitosa o grasa, adicionar solucin de (OH)K en etanol y extender el tiempo de saponificacin. 4.6.2 Extraccin 4.6.2.1 Liquido-Liquido (con nhexano) En un embudo que contiene previamente etanol y n-hexano, en proporcin de 0.5 mL n-hexano y 0.2 mL de etanol por mililitro de muestra a extraer, es decir que para 10 mL de solucin saponificada se debe utilizar 2 mL de etanol y 5 mL de n-hexano; y para evitar formacin de emulsificado se puede utilizar Cloruro de sodio al 1% agregando entre 1-2 mL sobre la solucin saponificada. Luego agitar fuertemente y esperar que se separen las fases, la fase inferior acuosa se drena para un segundo embudo de separacin que contendr igual proporcin que en el primer embudo de etanol y n-hexano, y nuevamente se repite la agitacin. Pudiendo aplicar una tercera extraccin sobre la fase acuosa del segundo embudo de separacin si el analista lo ve conveniente. Juntar las fases superiores u orgnicas de cada embudo y lavar cuidadosamente con agua y un poco de alcohol, varias veces hasta

que no exista presencia de lcali, para ello se utiliza gotas del indicador de Fenolftaleina al 1% sobre el agua procedente del lavado que debe ser incolora de no existir lcali. La extraccin lquido-lquido es aplicable en muestras que contienen vitamina A dosificadas y un mximo de 10 % de materia grasa. De lo contrario para mejorar la extraccin se debe aplicar seguido a esto el proceso slido-liquido para eliminar interferencias. 4.6.2.2 SlidoLiquido (Cromatografa de columna abierta con almina) 5 UNIVERSIDAD AUTONOMA GABRIEL RENE MORENO CENTRO DE INVESTIGACION Y DESARROLLO DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS Pgina 6 de 8 Este paso es aplicado para eliminar las interferencias, haciendo pasar la muestra a travs de una columna (1 cm d.i.X 15 cm) rellenada con 7 cm de Oxido de Aluminio (almina). La muestra a utilizar es la que procede de la extraccin liquido-liquido y debe estar concentrada previamente en un rotavapor hasta un considerable volumen (no-sequedad, aprox. 10 mL). Una vez empaquetada la columna con el adsorbente es embebida con ter de petrleo con flujo a razn de 1mL/min y cuidando de no dejar que se seque la columna, se agrega inmediatamente la muestra con ayuda de una pipeta pasteur, donde el retinol quedara retenido en la superficie del adsorbente; enseguida se hace circular 20 mL de Eter de petrleo y se lo colecta en un baln para rotavapor, continuando de no dejar secar la columna se aade 30 mL de 5 % ter Etlico/ter de petrleo para arrastrar las interferencias fuera de la columna (se descarta) y finalmente se agrega 40 mL de 10% ter etlico/Eter de Petrleo cuyo aumento de polaridad provocara captar al retinol de la columna y eluirlo por la misma libre de interferencias para juntarlo en el baln donde estaba la primera fraccin de Retinol en ter de petrleo. Este extracto, se somete a concentracin (4.6.3) nuevamente en rotavapor hasta sequedad a 35C, para diluirlo en 25

mL de etanol absoluto e injectarlo en el sistema HPLC. 4.6.3 Concentracin de la extraccin La solucin obtenida de la extraccin lquido-lquido que contiene Retinol, se pasa a travs de un filtro con placa fija de 50 um conteniendo sulfato de sodio anhidro para un baln de rotavapor, con cuidado y con ayuda de vaco; lavando dos veces el embudo con n-hexano o Eter de Petrleo para no perder muestra. La solucin procedente de la extraccin slido-lquido, se coloca directamente en el baln de rotavapor En ambos casos, se procede a concentrar la solucin hasta sequedad en un rotavapor a 35 C y luego se diluye en 25 mL de Etanol absoluto para su anlisis en HPLC. 4.6.4 Cromatografa Cierto volumen de la muestra diluida en etanol absoluto se filtra por una membrana de 0.22 um y se coloca en un vial de 5 mL, de donde ser colectada inmediatamente para ser analizada en el HPLC. Del mismo modo las soluciones de estndar deben ser filtradas por membranas de 0.22 um antes de inyectar en el HPLC. Las condiciones del HPLC son las siguientes Columna ODS de Fase Reversa C18. Pre-columna ODS. Detector UV con sensibilidad de 0.005 ua/mV Fase mvil: 8 % H 2 O/Metanol Flujo: 1 mL/min Longitud de onda: 325 nm Volumen de inyeccin 20 uL. 6 UNIVERSIDAD AUTONOMA GABRIEL RENE MORENO CENTRO DE INVESTIGACION Y DESARROLLO DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS Pgina 7 de 8 Temperatura: 30 C Se recomienda realizar un buen acondicionamiento del sistema basndose en la estabilidad de la lnea base, pues durante el anlisis es garanta para la estabilidad de la presin. Al finalizar el anlisis, dejar funcionar mnimo 30 minutos el equipo con 100 % Metanol a razn de 0.5 mL/min. 4.7 Expresin de resultados Es necesario elaborar la curva calibracin y as obtener la ecuacin lineal cuyo factor de correlacin debe ser mayor o igual a 0.9996. para su segura aplicacin en la evaluacin del contenido de vitamina A en

la muestra. X (Estndar) Concentracion de REtinol ug /mL de etanol Y Area en HPLC N1 A f(N1) N2 A f(N2) N3 A f(N3) AREA ..................................... Concentracin Retinol ug/mL...... Y= a + b X

X= (Y-a)/b Ecuacin de la curva calibracion del

estndar . Para l clculo de la concentracin de Retinol en la muestra, existen dos formas: a) Aplicando la siguiente expresin matemtica. Se debe tener registrado todos los datos desde el comienzo del anlisis, desde el peso inicial, volumen inicial, alicuota tomada para la extraccin y el volumen de dilusion de la muestra para inyectar al HPLC. Retinol (ug/100g) = C HPLC x V r x V i x 100 V a x P Donde: C HPLC : Concentracin de

Retinol ug/mL calculado para la muestra en funcin de su rea en la ecuacin de la curva calibracin del estndar V r : Volumen de etanol en el que s disolvi la muestra para injectar al sistema (25mL) V a : Volumen de alicuota para extraer (10 mL) V i : Volumen inicial de la muestra (100 mL) P: Peso de la muestra 7 UNIVERSIDAD AUTONOMA GABRIEL RENE MORENO CENTRO DE INVESTIGACION Y DESARROLLO DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS Pgina 8 de 8 b) Aplicando calculo de Fraccin directa. Se realiza la fraccin de la concentracin para el rea de la muestra (ug de Retinol/mL de etanol) obtenida por la ecuacin de la curva calibracin del estndar; entre la concentracin de la muestra que s inject al sistema HPLC (gramos de aceite/ ml de etanol), y este resultado se multiplica por 100 para si obtener nuestro resultado en trminos de ug Retinol / 100 g de muestra. curva calibracin X 100 Retinol (ug/100g)= Conc. f(rea muestra) Conc muestra inyeccin en HPLC. 4.8

Equivalencia Como la expresin de los alimentos fortificados que contienen vitamina A suele estar expresado en termino de Unidades Internacionales de Vitamina A contenido, se presenta la siguiente equivalencia. 1 U.I. de Vitamina A = 0.3 ug de Retinol All Trans 5

Bibliografa - Japan Foods Analysis Center, TABLE OF FOODS COMPONENTS IN JAPAN. "Vitamin A determination by HPLC". First Edition (2000). - EN 12823-1:2000. " Vitamin A by HPLC". Norma Europea

HPLC in Food Analysis, Second Edition.

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