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Cromatografa en capa fina de lpidos

Isaac Tnez Fiana, Mara del Carmen Muoz
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de Crdoba, Avda. Menndez Pidal s/n, 14004-Crdoba.

RESUMEN

La palabra cromatografa significa literalmente escribir en colores, ya que cuando fue desarrollada, los componentes separados eran colorantes. Se trata de una tcnica o mtodo fsico de separacin de dos o ms solutos presentes en una mezcla basada en la velocidad de desplazamiento de los mismos. En ella participan dos fases, una mvil (lquida o gaseosa) y otra estacionaria (slida o lquida). La presente prctica estar dirigida a la comprensin y asimilacin de los fundamentos bsico-tericos de este procedimiento fsico, as como de su metodologa, tipos y uso en la bioqumica clnica, especialmente en la separacin de lpidos. Para tal efecto, se realizar una cromatografa en capa fina para la separacin de lpidos neutros y fosfolpidos. Palabras clave: gel, placas, HPLC, slice, vidrio Abreviaturas. HPLC: High-Pressure Liquid Chromatography

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS A principios del siglo XX el botnico-qumico ruso Michael Tswett, verti extracto de hojas vegetales en un tubo de ensayo que contena carbonato clcico pulverizado. Al aadir posteriormente disolvente, pudo comprobar que los pigmentos coloreados se separaban, de ah el nombre cromatos (del griego, color) para una serie de tcnicas que se engloban bajo la denominacin genrica de cromatografa y que poseen caractersticas generales similares. Conviene aclarar, ya desde el principio, que la mayora de separaciones no son coloreadas, teniendo que revelar mediante reactivos adecuados las distintas bandas de separacin. El objetivo fundamental de cualquier tipo de cromatografa es la separacin de los componentes de mezclas en base a la diferencia de propiedades fsicas de aqullos. Son tcnicas analticas de separacin de materiales que utilizan la distribucin de las sustancias entre dos fases, una mvil y otra estacionaria. La primera, tambin conocida como eluyente, de naturaleza lquida o gaseosa tiene como misin arrastrar las sustancias a travs de la fase fija. En la estacionaria o fija se verifica la separacin de la mezcla. Segn la naturaleza de las dos fases se puede hablar de diversos tipos de cromatografa: cromatografa en papel, en capa fina, lquido-lquido, gaseosa, de filtracin en gel, lquida de alta presin o HPLC (High-Pressure Liquid Chromatography), de intercambio inico, de afinidad, etc.
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Cuando una especie qumica se distribuye entre dos fases, a este fenmeno se le denomina reparto. Cuando la muestra est formada por multicomponentes y el reparto es muy diferente entre las dos fases consideradas, se habla de extraccin, si est ms equilibrado se denomina fraccionamiento. Dependiendo de la interaccin de las sustancias a separar con la fase estacionaria se puede hacer la siguiente clasificacin de tcnicas cromatogrficas: De adsorcin. De reparto. De intercambio inico. De permeabilidad. De afinidad.

De acuerdo con el sistema utilizado como soporte, la cromatografa puede efectuarse en columna, en papel o en capa fina. El presente captulo tiene como objetivo principal el aprendizaje de las tcnicas cromatogrficas, incluyendo su definicin, tipos y conceptos tericos sobre los que se asientan. Ello permitir el conocimiento de sus fundamentos, metodologa y aplicaciones, resaltando su importancia en la Bioqumica Clnica. 1.1. Cromatografa de adsorcin Se realiza generalmente en columna (tambin es posible en capa fina), que se rellena de un adsorbente adecuado. El sistema es baado por un solvente que fluye a travs de la columna para comprobar el funcionamiento de la misma. Por la parte superior se introduce la sustancia a separar disuelta adecuadamente. Se deja fluir por la columna. Antes de que sta quede totalmente seca se incorporan los disolventes de acuerdo con la solubilidad de las sustancias, sufriendo durante su arrastre interacciones de polaridad con el slido adsorbente. Los eluatos son recogidos para su determinacin posterior, normalmente por un mtodo espectroscpico (espectrofotometra, espectrofluorimetra). Las separaciones se basan en las diferencias de distribucin de los solutos entre el adsorbente (fase estacionaria) y el disolvente (fase mvil) de acuerdo con sus respectivas isotermas de adsorcin. Los adsorbentes ms utilizados, ordenados de mayor a menor actividad son: Almina Slice Carbonato clcico

Este tipo de cromatografa se utiliza en el laboratorio clnico para la separacin de 17-cetoteroides, 17-hidroxicorticoides, catecolaminas y otras sustancias urinarias. 1.2. Cromatografa de reparto Produce la separacin de sustancias en base a la diferente distribucin de stas entre una fase orgnica y una fase acuosa, de acuerdo con las respectivas
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solubilidades (coeficiente de reparto). Puede realizarse en capa fina, papel o columna. 1.2.1. Cromatografa en capa fina (TLC) Aunque la incluyamos en este apartado, la TLC puede ser, de acuerdo con la composicin de la capa cromatogrfica y de su forma de preparacin, bien de reparto o de adsorcin. As, si la capa de adsorbente se deposita como una suspensin acuosa que se deja secar a temperatura ambiente (caso ms frecuente), ser la pelcula de agua depositada sobre las partculas de adsorbente quien actuar de fase estacionaria, por lo que con solventes orgnicos la particin supondr, al menos mayoritariamente, equilibrios de reparto lquido-lquido (cromatografa de reparto). Por el contrario, si la capa de adsorbente se seca por calentamiento en estufa, la particin supondr equilibrios de adsorcin slidolquido (cromatografa de adsorcin). En este mtodo se utilizan como soporte placas de vidrio, plstico, aluminio, etc. en las que se deposita una fina capa de adsorbente (gel de slice, almidn, polvo de celulosa, etc.) cuyo espesor puede ajustarse a conveniencia. En el mercado se encuentran disponibles ya fabricadas placas comerciales. A la altura de 1,5 cm (aproximadamente) de una de las bases se marca dbilmente con un lpiz fino una lnea teniendo cuidado de no romper la capa adsorbente. Esta lnea servir de base para situar las muestras a analizar. Con una micropipeta de vaciado automtico se depositan 5 l sobre un punto o varios en la lnea de base (lnea de aplicacin) teniendo siempre cuidado de no tocar la placa con la punta de la pipeta para no daarla. Tras aplicacin de la muestra, se deja secar a temperatura ambiente o con ayuda de un pequeo secador. A continuacin la placa se introduce en una cubeta que contiene el disolvente de desarrollo adecuado en cada caso, cuyo nivel no debe nunca llegar a la lnea de siembra. Su ascenso por capilaridad produce el efecto cromatogrfico. Si se realizan dos desarrollos consecutivos con eluyentes apropiados en cada caso, se habla de cromatografa bidimensional. Las sustancias se visualizan en la placa una vez desarrollada mediante su color, absorcin ultravioleta o revelado especfico que produce una reaccin coloreada. Para su cuantificacin, se raspa la parte donde se ubique el componente que se quiere medir, se extrae con los disolventes adecuados y se analiza segn el mtodo empleado. La diversidad de adsorbentes (ver anteriormente) y eluyentes disponibles, permiten que esta tcnica sea de utilidad para separar e identificar un amplio repertorio de biomolculas: aminocidos, hidratos de carbono, lpidos, protenas, etc. Una vez revelada la placa se puede establecer un coeficiente de relacin entre la distancia alcanzada por el frente y la distancia alcanzada por una sustancia especfica, a esta relacin se conoce con el nombre de Rf (Rf = distancia de la sustancia/frente de la fase mvil). 1.2.2. Cromatografa en papel
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Puede ser ascendente o descendente, segn la fase mvil ascienda por capilaridad o descienda por gravedad a lo largo del soporte. Una vez desarrollada la cromatografa, las sustancias separadas se localizan por su color, si son coloreadas, o se revelan pulverizando sobre el papel un reactivo especfico a cada sustancia, que origine la aparicin de un producto coloreado. En qumica clnica se utiliza este procedimiento para la separacin de aminocidos, azcares y otras sustancias de bajo peso molecular. Su empleo es reducido en la actualidad debido a sus largos periodos de tiempo de desarrollo. 1.3. Cromatografa de intercambio inico Esta cromatografa est basada en las interacciones electrostticas que se producen entre los grupos ionizables de los productos a separar y los grupos cargados unidos a un soporte inerte (fase estacionaria). Existen dos clases principales de soportes (cambiadores), segn el tipo de grupos enlazados que posea: Catinicos: con grupos cargados negativamente y que intercambian iones del medio con carga positiva. Aninicos: con grupos positivos y que intercambian iones negativos.

Los grupos cargados de la matriz insoluble determinan el tipo y la fuerza del cambiador. La fase cargada inmvil est inicialmente neutralizada por cationes o aniones (contraiones), dependiendo de su naturaleza. Cuando la mezcla inica a separar se pone en contracto con la fase inmvil, en condiciones oportunas de fuerza inica y pH, se produce el intercambio inico formndose sales y asociaciones inicas entre la fase estacionaria y la mvil: Los grupos fenlico, carboxilo y sulfnico se utilizan como cambiadores catinicos. Los grupos amino, aliftico y aromtico, se utilizan como cambiadores aninicos.

Este tipo de cromatografa se usa para la separacin de aminocidos, pptidos, protenas, nucletidos y, en general, para los compuestos que tengan naturaleza inica. En clnica, se utilizan para la separacin de hemoglobinas, isoenzimas, esteroides, etc. 1.4. Cromatografa de filtracin en gel o de exclusin molecular La fase inmvil es un gel, polmero anhidro muy hidrfilo, que al sumergirlo en la fase mvil (agua o cualquier solucin electroltica) se hincha formndose una matriz de poros semiuniformes que actan como un tamiz molecular, til para separar macromolculas (ejemplo protenas). Las sustancias que se van a separar se aplican sobre el lecho de gel, previamente dispuesto como relleno de una columna, y posteriormente se eluyen con un disolvente apropiado. En la elucin, al pasar la muestra a travs del gel, las molculas mayores que el dimetro mximo de los poros de ste, pasan por los espacios que dejan entre s las partculas del gel, siendo eluidas en primer lugar. Por el contrario, cuanto menores sean las molculas, ms se incluirn dentro de las partculas del gel y retrasarn su salida.
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La elucin, por tanto, se produce en orden decreciente al tamao de las molculas. Esta tcnica permite, usando patrones adecuados, calcular los pesos moleculares de las sustancias que se separan. 1.5. Cromatografa de afinidad Se basa en la fijacin por enlace covalente de un ligando sobre un soporte inerte, bien de manera directa o a travs de un brazo espaciador. El ligando debe interaccionar especficamente con la sustancia que se desea separar, con lo que la mezcla sobrante puede eliminarse. Son frecuentes en este tipo de cromatografa interacciones especficas como las existentes entre un antgeno y su anticuerpo, entre una hormona y su receptor, entre una enzima y su sustrato, etc. 1.6. Cromatografa en fase reversa Constituye una forma de particin lquido-lquido en la que el carcter polar de las fases se invierte respecto al de la cromatografa en papel. La fase fija la forma un lquido no polar inmovilizado sobre un slido relativamente inerte y la fase mvil es un lquido ms polar. 1.7. HPLC En este tipo de cromatografa, la fase mvil, bombeada a presin, fluye a travs de la columna estrechamente empaquetada, lo que ocasiona tiempos de anlisis muy reducidos. Los eluatos se identifican cuando abandonan la columna por mtodos como absorcin UV, ndice de refraccin medidas de fluorescencia. 1.7.1. Ventajas de HPLC Su elevada resolucin permite la purificacin de rutina de mezclas cuya separacin no se consigue por otras tcnicas. Su velocidad permite que la mayor parte de las separaciones se consigan significativamente en tiempos menores a 1 hora. Su elevada sensibilidad permite la valoracin cuantitativa de cantidades de material menores del picomol. Su capacidad de automatizacin. 1.7.2. Desventajas de HPLC Pequea capacidad, no pudindose hacer purificaciones a gran escala. Gasto elevado de la instrumentacin.

1.8. Cromatografa de gas-lquido La fase estacionaria es un slido inerte como ladrillo refractario pulverizado, impregnado con un lquido de volatilidad baja (polietilenglicol, aceite de silicona,
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etc.). El slido se empaqueta en una columna larga y estrecha, mantenindose a temperatura elevada (200 C). La fase mvil es una corriente de gas inerte (Ar, He, N2) en la que se evapora instantneamente la mezcla que se va a analizar. Las sustancias sometidas a anlisis por este procedimiento deben ser voltiles y estables a temperaturas altas. Tambin cabe la posibilidad de aplicar la tcnica a compuestos poco voltiles, tras formacin de derivados suyos ms voltiles.

2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO 2.1. Equipamiento Bao termostatizado. Placas de vidrio recubiertas con gel de slice activado (20 x 20 cm). Cmaras de cromatografa. Cmaras secadoras. Cmara de revelado con vapor de yodo. Estufa de desecacin (40 200 C). 2.2. Material Pipetas de 1 5 ml. Micropipetas o pipetas de pistn. Vasos de precipitado. Lpiz. 2.3. Reactivos Agua destilada. Solventes orgnicos. Suero sanguneo.

3. PROTOCOLO A REALIZAR 3.1. Extraccin de los lpidos de la muestra biolgica 3.1.1. Se toma 1 ml de suero. 3.1.2. Se agregan 2 ml de una mezcla cloroformo-metanol (2:1) 3.1.3. Se pone la muestra en un bao termostatizado a 50C durante 30 min. 3.1.4. Se enfra y dejan separar las fases.

3.1.5. Se centrifuga a 3000 rpm durante 10 min y se separa la fase clorofrmica, pasndola a un tubo de vidrio hasta su total desecacin en un bao o corriente de aire.
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3.2. Aplicacin y desarrollo cromatogrfico 3.2.1. Se reextrae el extracto seco con 0.5 ml de cloroformo. 3.2.2. Se indica en la placa de vidrio con gel de slice la lnea de aplicacin u origen, siempre por encima de la mezcla del eluyente presente en la cmara separadora. 3.2.3. Se aplican las muestras en volmenes de 5, 10 y 20 L y se colocan controles en igual cantidad. 3.2.4. Se introduce la placa en la cmara separadora conteniendo el solvente adecuado. 3.2.5. Se deja desarrollar la placa hasta que la lnea de frente del solvente haya recorrido 1315 cm desde la lnea de aplicacin. 3.2. Revelado cromatogrfico 3.2.1. Se introduce la placa, una vez finalizado el desarrollo de la muestra, en una cmara saturada de vapores de yodo. 3.2.2. Se compara el desarrollo de las muestras con el de los controles y tablas.

4. RESULTADOS Tras pocos minutos de exposicin al sublimado de yodo, aparecen una serie de fracciones o manchas cuya intensidad y superficie vara con la cantidad de muestra aplicada. El raspado de estas manchas y su correspondiente extraccin con solventes apropiados permitir la medicin cuantitativa de las diferentes fracciones, menester que puede conseguirse mediante procedimientos espectrofotomtricos o con sistemas tales como la cromatografa gaseosa y HPLC. El desarrollo cromatogrfico de estas muestras proporcionar las fracciones que se muestran esquemticamente en las figuras A (lpidos neutros) y B (fosfolpidos).

5. DISCUSIN Y COMENTARIOS

6. BIBLIOGRAFA RECOMENDADA Gonzlez de Buitrago JM (1985): Cromatografa. En Gonzlez de Buitrago JM (eds): Tcnicas de Laboratorio Clnico, 1 Ed. Editorial Alambra (Madrid, Espaa), pp. 128 141. Gonzlez de Buitrago JM (1998): Osmometra. Cromatografa. Electroforesis. Tcnicas electroqumicas. En Gonzlez de Buitrago JM, Arilla E, RodrguezSegade M, Snchez A (eds): Bioqumica Clnica, 1 Ed. Editorial McGraw-Hill Interamericana (Madrid, Espaa), pp. 17 27. Lozano J (1988): Cromatografa. En: Lozano JA, Tudelo J (eds): Prcticas de Bioqumica. Experimentacin y Simulacin, 1 ed. Editorial Sntesis (Madrid, Espaa), pp. 25 35.

ANEXO 1: SOLUCIONES Los solventes orgnicos (eluyentes) utilizados segn el tipo de lpidos a separar estarn constituidos por: Lpidos neutros: ter de petrleo, ter etlico y cido actico (85/15/2) Fosfolpidos: cloroformo, metano y agua (65/25/4)