INMUNOANALISIS

Servicio Medico Legal Santiago

Q. L. Ethel Guerrero R.
Q. F. L. Víctor Vidal P.
 Definición
 Técnicas que utilizan la reacción antígeno-
anticuerpo para el análisis cualitativo y
cuantitativo de diversas sustancias.

 En general se utiliza un anticuerpo como

reactivo para detectar o cuantificar lo que nos
interesa, el antígeno.

 Los anticuerpos pueden ser policlonales o

monoclonales
 Producción de Anticuerpos

 Requiere la inyección de varias dosis

del antígeno o hapteno unido a
molécula transportadora inmunógena
de Peso Molecular elevado, a un
animal (conejo, cabra, oveja, caballo) a
intervalos regulares, para
posteriormente sacrificar el animal y
obtener el antisuero.
Anticuerpos Policlonales

Purificación
de
anticuerpos

Separar
el suero
 Anticuerpos Monoclonales

 Se obtienen de manera similar, pero se

extrae el bazo o ganglios linfáticos para
obtener linfocitos B sensibilizados.

 Se incuban estos con células de mieloma

de ratón deficitarias de la enzima HGPRT
en presencia de PEG para producir la
fusión celular y obtener el hibridoma
 Cultivados en medio apropiado, por dos
semanas, solo crecen los hibridomas,
que producen diferentes tipos de Ac.
específicos contra el antígeno.

 Por dilución se aislan los diferentes

hibridomas, obteniéndose los clones
adecuados, los cuales se cultivan, para
producir el Ac. Monoclonal más
adecuado.
 Anticuerpos Monoclonales

Linfocitos Células de Mieloma

sensibilizados Fusión

Hibridomas
 Anticuerpos Monoclonales

Cultivo de células individuales en pequeño volumen

Producción de Ac - + - +
Crecimiento continuo
- + + -
Anticuerpos Monoclonales

Cultivo en grandes
volúmenes

Recuperar y purificar el
AcMo secretado
 Anticuerpos Monoclonales
 Ventajas con respecto  Desventajas:
a los policlonales:
– Mayor costo
– Alta especificidad,
reconocen un único
lugar antigénico.
– Se pueden obtener en
cantidades ilimitadas
con las mismas
características.
 Ejemplos

 Cualitativo o de identificación: Inmunoblot

 Cuantitativo: ELISA
 Inmunoanálisis con reactivos
marcados
 Dentro de estos inmunoanálisis tenemos:

– radioinmunoanálisis
– enzimoinmunoanálisis
– fluoroinmunoanálisis
– luminoinmunoanálisis
Inmunoanálisis con reactivos
marcados

– homogéneos y heterogéneos
– diseño competitivo o no competitivo
Según el diseño del ensayo

competitivos (de reactivo limitado)

no competitivos (de reactivo en

exceso)
 Competitivos
 Inmunoensayos en que se utiliza el
marcado de antígeno o anticuerpo.
 Una cantidad limitada de anticuerpos
que es insuficiente para unir todo el
antígeno.
 El antígeno marcado compite con el
antígeno sin marcar por los anticuerpos.
La cantidad de analito se determina a
partir de la regresión correspondiente.
 Competitivo- Captura de anticuerpos

E E
Ac marcado

+
E
Ag muestra Sustrato
Señal

Ag muestra
+
Ac marcado
Señal

[Ag]
 Competitivo- Captura de Antígeno

Señal

Antígeno marcado

[Ag]
Muestra
Señal

Lavado
 Métodos no competitivos o
inmunométricos

 El antígeno a cuantificar se une a un exceso de

anticuerpos.
 Por ejemplo, con el anticuerpo fijado a la fase
sólida, revelando con anticuerpo marcado.
 La concentración de antígeno se determina a
partir de la cantidad de anticuerpo marcado que
se une.
No competitivo- “sandwich” de anticuerpos

Exceso de anticuerpo marcado

eliminado por lavado
bloqueante +
E
Ag
E
Sustra- Señal
to

Señal Curva standard

[Ag]
Según el diseño del ensayo

homogéneos

heterogéneos
 Heterogéneos:  Homogéneos
 Los más utilizados.  Mas utilizados en drogas
 Diversos formatos : de abuso y monitoreo de
– micro placas, fármacos
– partículas magnéticas,  Sin pasos de separación,
– Membranas de no se requiere la
nitrocelulosa, separación del antígeno
 Implican un paso de unido del no unido.
separación del antígeno  Ejemplos
unido del no unido. Por – Emit
ejemplo ELISA, los – Cedia
pasos de lavado son
etapas de separación.
 Heterogéneos Homogéneos
 Ventajas  Ventajas
– Menos interferencias, más – Más precisos
específicos y sensibles – Al ser en general
– Instrumentación menos automatizados se llevan a
costosa cabo sin entrenamiento
– Admiten mayor tamaño especial
de muestra, así disminuye
el límite de detección.  Desventajas
– Más versátiles en cuanto a – Son más costosos en
tipo de analito reactivos
 Desventajas – En general sólo sirven para
– Más difíciles de fármacos
automatizar
– Mayor tiempo de análisis
 Heterogéneos

 Algunos métodos de separación:

– Precipitación fraccionada con sulfato de amonio, etanol

en frío o PEG.
– Unión de la forma unida a una fase sólida (EIA,
partículas magnéticas)
– Centrifugación
 Homogéneos Características

 La cuantificación de la reacción Ag-Ac en los

EIA homogéneos se realiza por cambios en la
señal proveniente de la marca sin hacer
separación física de las formas libre y unida.
 El cambio de señal depende de la inhibición ,
activación o cambios conformacionales en la
enzima.
 Monitoreo terapéutico de fármacos (digoxina)
detección de drogas de abuso.
 Homogéneos

Ac

Ag Ag
Enzima

Sustrato
Ag
 Homogéneos

S
Ag

Enzima activa Enzima inactiva

Detección y Cuantificación:
Las medidas se pueden hacer con:
- un simple espectrofotómetro o con
- un analizador automático de química clínica.
 Inmunoanálisis con reactivos
marcados

Con compuestos radiactivos:

– RIA inmunoanálisis heterogéneo y competitivo

– IRMA inmunoanálisis heterogéneo no competitivo

 Inmunoanálisis con reactivos
marcados
ENZIMOINMUNOANALISIS:
 Las más utilizadas son:
– peroxidasa
– fosfatasa alcalina
– Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa
– B- galactosidasa
 Ventajas
– disponibles comercialmente
– se pueden conjugar por técnicas simples
– tienen varios sustratos
 ENZIMOINMUNOANALISIS

 Enzimoinmunoanálisis homogéneos:

- EMIT
- CEDIA

- Enzimoinmunoanálisis heterogéneos:
- ELISA
 FLUOROINMUNOANALISIS

 Fluoroinmunoanálisis homogéneos:
- FPIA (de polarización de fluorescencia)
- SLFIA (sustrato marcado)
- FETI (transferencia de la energía de
fluorescencia)
- Fluoroinmunoanálisis heterogéneos:
- DELFIA (disociación aumentada por
lantánidos)
 Inmunoensayos de Fluorescencia
Fluoróforos
HO O O

O
C
OH

R2
Fluoresceína
R1
 Quimioluminiscencia
 Es el fenómeno que ocurre en las luciérnagas y consiste
en:

– una reacción química con un muy alto rendimiento energético

produce una molécula potencialmente fluorescente.

– (No hay excitación luminosa como en la fluorescencia)

– Usualmente son reacciones redox catalizadas por enzimas que

involucran O2 o H2O2 y un sustrato orgánico oxidable. La energía se
libera como luz visible.

 Se utiliza para detectar concentraciones muy bajas de

moléculas, menor límite de detección que en los métodos
isotópicos y en otros enzimáticos.
 Técnica analítica Quimioluminiscente

 Para inmunoensayos se marcan Ag o Ac con

sustancias que participan en la reacción
quimioluminiscente (luminol, peroxidasa), y la
quimioluminiscencia es el paso final en la
detección.

 Se hacen en fase sólida, o en técnicas

homogéneas