Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Juan Bussi
La fase móvil puede ser alterada en el transcurso del análisis para
manipular las interacciones de los componentes de la muestra con
la fase estacionaria.
1
APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS Definiciones
Polaridad creciente
Insoluble en agua Soluble en agua Coeficiente de distribución K = cS/cM
No Polar Iónico
Tiempo de retención: tM
No Iónico Polar
inversa) normal)
3
10
1
104 v=ux
Exclusión por 1 + KVS/VM
tamaño
105
(Penetrabilidad (Filtración Factor de capacidad de una especie A:
sobre gel) sobre gel)
106 k’A = KA VS/VM
tR – tM
k’A =
Distintos métodos son complementarios. tM
Factor de selectividad para dos especies A y B Conceptos de Altura de Plato Teórico y factores que lo afectan
(tR)B – tM como en otras cromatografias.
α = KB/KA = k’B/k’A = H = A + B/u + (CS + CM) u
(tR)A – tM (ecuación de Van Deemter)
2
Efecto del tamaño de partícula del relleno
CS y CM ∝ dP2
Aumento de eficiencia con disminución del tamaño de partícula
(tamaño usuales entre 2 y 10 µm
Ensanchamiento extracolumna
Debido a diferencias de velocidad entre distintas capas del
líquido que se desplaza en tubos de inyección, de conexión y
detectores.
Gradientes no se compensa por difusión.
3
Instrumentación
Recipientes para una o más fases móviles Cámara de mezcla para disolventes
Ventajas de la elución con gradiente (relación variable de
De vidrio o acero de 0.2 a 1 L volúmenes de dos o más disolventes)
Sistemas de pretratamiento de fases móviles Mejora de resolución en tiempos de análisis más cortos.
4
Flujo libre de pulsaciones (minimización de errores de medición) Coeficientes de compresibilidad isotermos de algunos solventes
Variaciones menores a 1% son normales usados en HPLC.
Bombas recíprocas
Componentes resistentes a corrosión (juntas de acero inox o
teflón). Las más utilizadas
5
Pérdidas en válvulas
Bombas de desplazamiento
Funcionamiento normal:
Cámara con un émbolo impulsado por un motor
pérdidas pequeñas y constantes
Mayor incidencia a bajos caudales (µL/min). Ventajas: flujo libre de pulsos, independiente de viscosidad y
contrapresión
Fabricantes suministran diagnósticos para
detección de pérdidas
Desventajas: capacidad de bombeo limitada (0.25 L), poco
práctica para reposición y cambio de disolvente.
Test para pérdidas
Reemplazo de columna por una vacía de
V=1.5 mL
Llenado con disolvente y tapado.
Bombas neumáticas
Sistema de inyección de muestra
Ventajas: baratas
Volúmenes pequeños para evitar ensanchamiento de picos
Exentas de impulsos (décimas de µL a 500 µL).
Desventajas: Inyección manual.
Capacidad limitada y de presión de salida.
Sencilla
Caudal dependiente de la viscosidad del disolvente y de la
contrapresión. Evitar despresurización (microjeringas capaces de resistir 1500 psi).
No sirven para elución con gradiente. Inyecciones a flujo detenido
Presiones menores a 2000 psi. Reproducibilidad: dispersión 2%-3% o mayor
6
Columnas
Longitud entre 10 y 30 cm
Acoplables
Precolumnas Rellenos
7
Materiales más utilizados como soportes Detectores
sílice, alúmina, resinas de poliestireno. divinilbenceno o Propiedades de la fase móvil (Indice de Refracción, constante
carbohidratos. dieléctrica, densidad)
Parámetros físicos: porosidad, tamaño de poro, tamaño y rigidez Propiedades del soluto (absorbancia, fluorescencia, corriente límite).
de partícula, tamaño.
Detectores de absorbancia (71%)
Parámetros químicos. Polaridad, acidez-basicidad, estabilidad Volumen de 1 a 10 µL, longitud de 2 a 10 mm
frente a solventes y pH, reactividad superficial.
Presiones < 600 psi (necesitan reductores de presión)
Dispositivos de doble haz (los más comunes)
Señal proporcional al Log I/Io
Filtros (longitudes de onda determinados)
Monocromadores (redes de difracción)(UV y Visible)
Cromatogramas a una λ fija o variable según el analito.
Barrido de λ para un analito con detención de flujo
Detectores de diodos permiten recoger el espectro completo
en 1 segundo (cromatografía tridimensional.
8
Detectores de absorbancia en el infrarrojo
Barrido de λ entre 2.5 y 15 µm
Cubetas con ventanas de NaCl o CaF2, long. 0,2 y 1,0 mm,
volumen 1,5 a 10 µL.
9
Detectores de índice de refracción
Detector universal
No dependen del caudal
Robustos
Sensible a cambios de temperatura
Menor sensibilidad que otros detectores.
Detectores electroquímicos
Elevada sensibilidad, sencillez, extensa aplicabilidad
Electrodo indicador de platino, oro, carbón vítreo o pasta de
carbono, electrodo de referencia y contraelectrodo se colocan más
adelante en el canal de flujo.
10
Detectores por espectrometría de masas
Sistemas para introducción de la fase móvil en cámara de vacío
Cromatografía de Reparto
Rellenos tipo siloxano para fase inversa:
La más utilizada
Grupo R: C8 (n-octilo), C18 (n-octadecilo)
Para compuestos polares, no iónicos, de baja a moderada masa
Mecanismos de retención de solutos (por disolución, molecular (<3000)
equivalente a una fase líquida no polar, por adsorción física
Más recientemente para compuestos iónicos derivatizados
(formación de pares iónicos).
Líquido-líquido: fase estacionaria unida por adsorcion física
Efecto de la longitud de cadena en eficacia de columnas de
siloxano en fase inversa (Figura 28.15 Skoog). Desventaja: pérdida de fase estacionaria por disolución en la fase
móvil
pH<7,5 para evitar hidrólisis del siloxano.
Fase unida químicamente: soporte más común es la sílice. diámetro
entre 3, 5 o 10 µm); porosidad (hasta 0.80)
Hi Hi Hi Hi
OH OH
OH OH
Ln km = ao,i - a1,i φ2 + (a2,i φ22)
Si Hi Hi
Si Si
φ2: fracción en volumen del componente orgánico OH OH
Agua unida a
grupos silanoles
Si Si
Grupo silanol Grupos silanoles
aislado vecinos
11
Cromatografía de fase normal
Sílice hidrolizada con HCl 0.1 M en caliente durante uno o dos días
µmol/m2 de grupos OH Relleno polar (agua o trietilenglicol soportado sobre sílice o
alúmina y fase móvil apolar.
Inmovilización química (90% de rendimiento) Competencia del disolvente y del analito por el relleno es
determinante de los factores de retención.
Si OH + X Si (CH2)n L Si O Si (CH2)n L
Solventes no polares (etiléter, cloroformo y n-hexano).
sílice organoclorosilano siloxano
Ecuación de Soczewinski: ln ki’ = ln ki(2) – Si lnx2
n = 8 o 18 X2: fracción molar del componente de más polaridad
12
Selectividad α
En fase inversa se ajusta con 3 disolventes: metanol, acetonitrilo
y tetrahidrofurano. Agua para ajustar k’.
En fase normal se ajusta con etiléter, cloruro de metileno y
cloroformo, nhexano para ajustar k’.
Formación de derivados
1) Reducción de polaridad que haga posible el uso de
cromatografía de reparto
2) aumento de respuesta del detector
3) aumento de selectividad de la respuesta
13
Cromatografía de Adsorción (Líquido-sólido) Cromatografía iónica
Equilibrio de intercambio entre iones de la fase móvil y iones del
Fases estacionarias: sílice y alúmina mismo signo en la superficie de la fase estacionaria (resinas de
Selección del disolvente intercambio).
Fuerza del disolvente ε0 (energía de adsorción por unidad de
superficie). xRSO3-H+ + Mx+ ↔ (RSO3-)x + xH+
ε0 varía no linealmente con la relación de volúmenes de dos sólido disolución sólido disolución
disolventes.
Rellenos
[RSO3-B+]s [RSO3-H+]s
= KII Partículas esféricas porosas copolímeros de estireno y
[B+]ac [H+] ac divinilbenceno (8%) emulsionados (estables entre pH 0 y 14).
Activación por grupos ácidos (sulfónico) o básicos (aminas
[H+]ac y [RSO3-H+]s >> [B+] cuaternarias).
Nuevos desarrollos: partículas esféricas (30 a 40 µm), no porosa,
de vidrio o polímero, recubierta con resina de intercambio iónico
[RSO3-B+]s CS
(menor difusión)
= KII =
[B+]ac CM
Fase móvil
Kex alta → tiempo de retención elevado Disoluciones acuosas con metanol u otros disolventes orgánicos
y especies iónicas para formar un buffer.
Tl+ >Ag+>Cs+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+
Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+>Cu2+>Cp2+>Zn2+>Mg2+>UO22+ Cromatografía iónica con columnas supresoras
SO42->C2O42->I->NO3->Br->Cl->HCO2->CH3CO2->OH->F- Electrolito eluyente enmascara la respuesta del Detector de
conductividad a los iones del analito.
14
NaBr, NaCl, NaF, NaOH (diluyente)
Columna supresora convierte iones de la fase móvil en especies
Bomba
poco ionizadas
Inyector
Ejemplo:
H+(ac) + Cl-(ac) + Resina+OH-(s) →
NaBr
Resina+Cl-(s) + H2O Eluyente
NaOH NaOH Columna separadora
NaCl + -
Resina OH (s)
Na+(ac) + HCO3-(ac) + Resina-H+(s) → Resina-Na+(s) + H2CO3 (ac) Sistema para
NaF
separación de
analitos aniónicos
usando columna HBr
supresora H2O
Columna supresora
HCl - +
HF Resina H (s)
Conductancia
Detector
Tiempo
Residuos
15
Cromatografía de exclusión por tamaño Propiedades de los rellenos comerciales típicos para la cromatografía
de exclusión por tamaño
Tiempo de residencia depende del tamaño efectivo de las Poliestireno- 10 102 700
moléculas. divinilbenceno 103 (0.1 a 20) x 104
104 (1 a 20) x 104
Moléculas más grandes no se retenidas y eluyen primero. 105 (0.1 a 20) x 105
Separación por tamaño, no implica interacciones química o física 106 (5 a >10) x 106
con el relleno. Sílice 10 125 (0.2 a 5) x 104
300 (0.03 a 1) x 105
Rellenos de sílice: retienen por adsorción y catalizan
500 (0.05 a 5) x 105
descomposiciones. Se modifican por sustituyentes orgánicos
1000 (5 a 20) x 105
(sililación).
Rellenos de copolímeros estireno-divinilbenceno: hidrofóbicos.
Teoría Aplicaciones
Vt = Vg + V i + Vo Filtración sobre gel
Vt: volumen total de la columna Disolventes acuosos y relleno hidrofílicos
Vg: volumen ocupado por matriz sólida del gel Penetrabilidad sobre gel: disolventes orgánicos no polares y
Vi: volumen del disolvente retenido rellenos hidrofóbicos.
Vo: volumen libre exterior Separación de productos naturales de alto peso molecular.
Separación de homólogos y oligómeros
Límite de exclusión: peso molecular por encima del que no existe Tiempo de separación cortos y bien definidos (entre Vo y Vo+Vi)
retención. Bandas estrechas
Límite de penetración: peso molecular por debajo del cual las No hay pérdida de muestra
moléculas pueden penetrar completamente en los poros.
No hay desactivación de la columna
16
Desventajas
Número limitado de bandas
No diferencia compuestos de tamaño semejante (isómeros)
17