Agrobiotecnologa.

Curso 2011
Sistemas de transformacin vegetal
Sistemas de transferencia gentica en plantas
Transparencias 3-6
Antes de elegir un sistema de transformacin vegetal, es importante establecer un
protocolo de cultivo de tejidos y de regeneracin de las plantas. Este protocolo es
parte integral de la mayora de las estrategias de transformacin y es generalmente el
aspecto ms exigente de las mismas. La clave para integrar exitosamente las tcnicas
de cultivo de tejidos dentro en una estrategia de transformacin es la obtencin de un
sistema de regeneracin rpido y eficiente. No todos los protocolos de regeneracin
son compatibles con todas las tcnicas de transformacin. Mientras una gran variedad
de estrategias de regeneracin y transformacin son aplicables a muchos cultivos, se
requieren protocolos muy particulares y especficos para la modificacin de
determinadas especies. En trminos generales, algunos protocolos son claramente
ms eficientes que otros. Por ejemplo, la regeneracin de embriones maduros a partir
de embriones somticos es el mtodo ms adecuado para la regeneracin de
especies monocotiledneas. Por lo tanto, establecer una buena estrategia de
regeneracin y cultivo de tejidos es primordial antes de implementar una tcnica de
transformacin. La transparencia 4 muestra un diagrama de flujo orientativo para
establecer un protocolo de transformacin. Primero, hay que identificar el tejido o
clulas de las que se puede regenerar una planta, establecer los agentes de seleccin
apropiados, las hormonas requeridas, los medios de cultivos adecuados para
desarrollar una regeneracin eficiente de plantas enteras y frtiles (recuadro superior
de la transparencia 4). Una vez establecidos estos parmetros hay que realizar las
construcciones genticas, y recin entonces determinar el sistema de ms apropiado
para la introduccin del material gentico y establecer los principales parmetros del
procedimiento correspondiente (recuadro inferior).
La transformacin de plantas se refiere al evento de introducir e integrar ADN forneo
en clulas vegetales y regenerar plantas transgnicas. La transparencia 6 enumera las
diferentes tcnicas de transformacin de plantas que se han desarrollado con el objeto
de hacer ms fcil y eficiente esta metodologa. Los sistemas de trasferencia pueden
dividirse en dos grupos:
Sistemas basados en vectores biolgicos:
Transferencia mediada por Agrobacterium
Transferencia basada en virus vegetales.
Sistemas de transferencia directa de ADN, sistemas basados en transferencia fsica,
surgidos como alternativa para transformar especies monocotiledneas que no son
hospedantes naturales de Agrobacterium:
Transferencia por bombardeo de partculas o biobalstica.
Transferencia por cationes divalentes y/o electroporacin.
Transferencia con whiskers de carburo de silicio.
Transferencia por microinyeccin.
Los mtodos de transformacin desarrollados permiten la expresin transitoria o la
expresin estable del ADN introducido. La expresin transitoria ocurre durante un
perodo corto de tiempo (pocos das) o hasta culminar el ciclo de vida de la planta,

pero no es heredable por la progenie. La expresin estable permite la integracin del

ADN forneo al genoma vegetal y la consiguiente transmisin a las siguientes
generaciones.
Biologa de Agrobacterium tumefaciens
Transparencias 7-19
Pese al desarrollo de otros mtodos para la transferencia de genes, el mtodo ms
difundido es la transformacin mediada por Agrobacterium tumefaciens. A.
tumefaciens es una bacteria del suelo gram negativa que ataca a un amplio rango de
plantas dicotiledneas. Muchas especies agronmicamente importantes han sido
transformadas usando esta bacteria del suelo (micrografa de la transparencia 8) y la
lista de especies susceptibles a la transformacin por Agrobacterium se incrementa
continuamente. La fotografa del panel inferior de la transparencia 8 muestra un tumor
tpico causado por A. tumefaciens, comnmente denominado agalla del tallo. El
gnero Agrobacterium ataca a un amplio rango de huspedes, principalmente entre las
especies dicotiledneas. Con baja eficiencia puede infectar tambin a varias especies
monocotiledneas.
La transformacin mediada por Agrobacterium puede lograrse utilizando explantos de
tejido muy variados, los que deben seleccionarse de acuerdo con las caractersticas
de la especie vegetal o de la variedad con la que se trabaje. En algunos casos
(tabaco, papa), es posible utilizar tejidos muy diferentes con este fin. En otros casos, el
explanto de eleccin es sumamente especfico. La tabla de la transparencia 5 presenta
ejemplos de los explantos ms comnmente utilizados.
El gnero Agrobacterium incluye varias especies patognicas que presentan un amplio
rango de huspedes y de sintomatologas. La bacteria causa la formacin de tumores
en la zona cercana al sitio de infeccin. El desarrollo de estos tumores se debe a que
Agrobacterium ha desarrollado la capacidad de transferir parte de su propio material
gentico a la planta hospedante. La transparencia 9 muestra el ciclo de la enfermedad
de la agalla de corona causada por Agrobacterium tumefaciens. La formacin de
tumores ocurre generalmente en el tallo de la planta, inmediatamente sobre el nivel del
suelo. La formacin de estos tumores se debe a la transferencia de genes bacterianos
que intervienen en la sntesis de fitohormonas. La bacteria transfiere tambin genes
que participan de la sntesis de una serie de compuestos de conjugacin denominados
opinas, los que son secretados al medio y utilizados como fuente de carbono y
nitrgeno en forma exclusiva frente a otros microorganismos del suelo. Debido a que
su sistema de patogenia se basa en redirigir genticamente el metabolismo de la
planta para su propio beneficio, las distintas especies de Agrobacterium pueden
considerarse colonizadores genticos.
La transparencia 10 muestra los procesos celulares involucrados en las principales
etapas de interaccin entre Agrobacterium tumefaciens y una planta susceptible. Estos
procesos son:
A: Reconocimiento clula-clula. La colonizacin por Agrobacterium requiere la
existencia de heridas en las races de la planta. Agrobacterium se desplaza hacia el
tejido herido siguiendo un gradiente de concentracin de seales qumicas establecido
por exudados del tejido vegetal.
B, C y D: Corresponden a tres etapas consecutivas que involucran el procesamiento
del ADN, el empaquetamiento de la hebra T luego de su escisin, y el transporte del
complejo T desde la clula bacteriana hacia la clula vegetal. La transparencia

muestra una microscopa electrnica (C) del complejo T maduro, compuesto por el
ADN T de simple cadena y las protenas VirE y VirD. Este complejo es probablemente
transportado a la clula husped a travs del pilus (sealado por flechas en D).
E: Se muestra la importacin del complejo T maduro al interior del ncleo de la clula
vegetal. La foto muestra acumulacin de protena VirD fusionada a GFP en el ncleo,
la que se observa como fluorescencia verde.
F: Luego de la integracin y expresin del ADN bacteriano al genoma vegetal se
observa la formacin del tumor de agalla. El tejido indiferenciado prolifera desde el
sitio de la herida y secreta distintas opinas que son catabolizadas especficamente por
Agrobacterium.
La porcin de material gentico transferido desde la bacteria que se integra al genoma
de la planta corresponde a una regin de un plsmido residente en la bacteria
denominado plsmido Ti (transparencia 11). La regin que es transferida recibe el
nombre de ADN o hebra T (indicada en el esquema como regin T) y est flanqueada
por dos repeticiones directas denominadas borde derecho (BD) e izquierdo (BI). Los
plsmidos Ti tienen un tamao de entre 200 y 800 Kpb. La regin T corresponde a una
secuencia de ADN de entre 10 y 30 Kpb y comprende tanto los oncogenes (genes
responsables de la sntesis de auxinas y citoquininas) como los genes involucrados en
la sntesis y el transporte de opinas. La regin de virulencia (vir), comprende varios
operones bacterianos que participan en la escisin de la hebra T y en la formacin del
intermediario de transferencia (complejo T). La regin vir comprende unos 40 Kpb.
Otros elementos importantes localizados en los plsmidos Ti son los orgenes de
replicacin y de transferencia (oriT, implicado en el proceso de conjugacin
bacteriana) y las regiones que contienen genes responsables del catabolismo de las
opinas.
Todos los plsmidos Ti tienen una estructura similar. Las especies de Agrobacterium
sintetizan diferentes tipos de opinas y son referidas de acuerdo con ello. La
transparencia 12 muestra las regiones de homologa entre los plsmidos Ti de dos
cepas comunes de Agrobacterium, una de octopina (oct) y otra de nopalina (nop).
Dichas regiones abarcan principalmente la regin T y la regin vir. Una caracterstica
del plsmido Ti de octopina es que contiene tres regiones T cortas de 13, 1,5 y 7,8
Kpb, los cuales son transferidos independientemente unos de los otros, mientras que
el de nopalina lleva un nico plsmido Ti de 22 Kpb. Existen muchas otras opinas,
tales como manopina, agropina agrocitopina, etc. En los plsmidos representados en
esta transparencia se muestran cuatro regiones de homologa que contienen
respectivamente a los genes que codifican protenas involucradas en la sntesis de
auxinas y citoquininas (regin A), el origen de replicacin (regin B), los genes que
codifican protenas involucradas en el catabolismo de octopinas y nopalinas (regin C)
y los genes de virulencia (regin D).
La transparencia 13 muestra una representacin esquemtica de la regin T. La regin
T est definida por dos repeticiones directas de 25 pb altamente homlogas. Tanto el
borde derecho como izquierdo son importantes para el reconocimiento de las
endonucleasas VirD1/VirD2 que estaran involucradas en la liberacin de la hebra T.
Sin embargo, el proceso de escisin tendra caractersticas polares, como lo sugiere el
hecho de que la protena VirD2 se une preferentemente al borde derecho (extremo 5
de la hebra T). Tambin se han identificado secuencias prximas al borde derecho que
contribuiran a establecer la polaridad del proceso. En los plsmidos de octopina, una
de estas secuencias (overdrive) incrementa el transporte del ADN T a la clula vegetal.
La protena VirC se une a esta secuencia favoreciendo el clivaje del borde derecho por
la endonucleasa VirD1/D2. El borde derecho es requerido en forma absoluta para la
patogenicidad de Agrobacterium tumefaciens, mientras que el borde izquierdo es
prescindible.

Entre los bordes izquierdo y derecho se encuentran los genes que codifican para la
sntesis de auxinas, citoquininas y opinas. En condiciones de alta concentracin de
auxinas y baja de citoquininas, el tejido vegetal se diferencia en races. Una situacin
inversa corresponde el desarrollo de tallos. La sntesis no regulada de auxinas y
citoquininas induce el crecimiento indiferenciado del tejido vegetal y conduce, en el
caso de una sntesis elevada de los dos tipos de hormonas, a la formacin de tejido
tumoral. Los oncogenes transferidos por Agrobacterium, si bien son controlados por
promotores de tipo eucariota, no responden a los mecanismos de regulacin
endgenos. Como consecuencia, la integracin del ADN T en el genoma de la planta,
induce la desdiferenciacin del tejido y el desarrollo de un tumor de agalla. El esquema
de la transparencia 14 indica tambin la ubicacin de la regin overdrive (enhancer de
la sntesis de la hebra T).
La colonizacin gentica por Agrobacterium requiere la presencia de dos regiones
localizadas en el plsmido Ti: 1) el ADN de la regin T, cuya secuencia ser
transferida al genoma de la planta y, 2) la regin de virulencia (vir), compuesta por
siete loci principales (virA, virB, virC, virD, virE, virG y virH), que codifican la mayor
parte de la maquinaria proteica involucrada en la transferencia del ADN T. Adems de
estas regiones, se requiere de un grupo de genes de virulencia localizado en el
cromosoma de la bacteria (genes chv) que participan en los estadios tempranos de
unin a las clulas de la planta. Las interacciones que tienen lugar durante la
transformacin gentica mediada por Agrobacterium conforman un proceso que puede
dividirse en ocho pasos distintivos, resumidos en la transparencia 15. 1)
Agrobacterium reconoce y se une a la clula husped. Esta unin es mediada por
protenas codificadas en el cromosoma de la bacteria y por receptores especficos de
la clula husped; 2) El sistema de traduccin de seales de Agrobacterium reconoce
seales qumicas especficas de la planta; 3) La protena virG media la transduccin
de seales y la activacin transcripcional de los genes vir; 4) La formacin de la copia
de ADN T y del complejo T inmaduro; 5) La formacin del complejo de transporte a
travs de las membranas de la bacteria y de la pared celular, compuesto
principalmente por las protenas de la familia VirB y la protena VirD4, lo que permite la
exportacin de la hebra T y de las protenas VirD2 y VirE1 al citoplasma de la clula
vegetal; 6) La formacin del complejo T maduro, formado por la hebra T y las
protenas VirD2 y VirE2; 7). La importacin del complejo T al ncleo, proceso que es
facilitado por protenas de la planta entre las que se ha identificado a AtKAPa y VIP1;
8) El transporte dentro del ncleo y la integracin del ADN T al genoma de la planta,
mediado por VirD2/VirE2 y por factores nucleares. Se ha reportado que VirD2 es
capaz de unirse a las ciclofilinas RocA, Roc4 y CypA, protenas que actan como
chaperonas y contribuira a mantener la conformacin de VirD2. Otra protena vegetal
que se une a VirD2 es una fosfatasa tipo 2C (PP2C) es requerida para la acumulacin
de VirD2 en el ncleo. Finalmente, VirD2 tambin interacciona con AtKApa. Esta
protena, participa en la importacin de protenas que contienen sitios NLS al ncleo. A
diferencia de VirD2, VirE2 no se une a AtKapa, pero si lo hace a otras dos protenas
VIP1 y VIP2. La protena VIP1 es capaz de importar la protena VirE1 al ncleo en un
sistema de levaduras. A su vez, VIP2 no slo se une a VirE2, sino tambin VIP1 en
ensayos de doble hbrido. Por lo tanto, VIP1, VIP2 y VirE2 pueden funcionar como un
complejo multiproteico facilitando y participando el transporte hacia el ncleo de la
protena VirE2 y contribuir as a la integracin del complejo T. Adems de AtKAPa y
VIP1, se ha descripto que el complejo RAN, con actividad GTPasa, es requerido para
la importacin al ncleo en otros sistemas, sugiriendo que tambin participara en la
importacin del complejo T al ncleo. Los anlogos de GTP no hidrolizables
bloquearan la importacin al ncleo de las protenas VirE2 y VirD2 por inhibicin de
RAN.

El reconocimiento y la unin de las clulas de Agrobacterium a la clula vegetal es

esencial para el proceso de infeccin. Luego de un primer paso de unin, la bacteria
sintetiza filamentos de celulosa que permiten el anclaje de sta a la pared celular de la
planta. Se han identificado varios genes cromosmicos (ChvA, chvB, pscA, att) que
participaran del proceso de unin a la pared de la clula vegetal. Sin embargo, este
proceso est poco caracterizado y la funcionalidad de estos genes en el proceso de
anclaje no ha sido completamente dilucidada. Agrobacterium ha desarrollado un
sistema regulatorio de dos componentes para reconocer la presencia de clulas
huspedes susceptibles, compuesto por una protena de membrana (VirA) y una
protena citoplasmtica (VirG). Estas protenas actan como un par
receptor/transductor frente a molculas provenientes de las heridas en la planta y
promueven la transcripcin de los genes vir (transparencia 16). El inductor mejor
estudiado es la acetosiringona, un compuesto fenlico. Algunos monosacridos, tales
como glucosa y galactosa tambin contribuyen a la expresin de los genes vir. La
sealizacin se inicia a travs de compuestos fenlicos secretados por la planta los
que se unen a la protena VirA. Dos protenas codificadas por genes cromosmicos de
Agrobacterium, p10 y p21, contribuyen en este reconocimiento. La primera se unira a
los compuestos fenlicos y mediara directa o indirectamente la unin a VirA. En
cambio, la induccin de los genes vir por azcares es mediada por otra protena de
origen cromosmico (ChvE) que une glucosa/galactosa e interacta con VirA. VirA
funciona como una proten quinasa y como fosfotransferasa. En el primer caso, ocurre
una autofosforilacin en un residuo de histidina situado dentro de su regin C-terminal,
la que tambin contiene el dominio quinasa. La protena VirA fosforilada se une a la
protena VirG que es a su vez fosforilada en un residuo aspartato. La forma fosforilada
de VirG es mucho ms estable y posiblemente permita maximizar los niveles de
induccin de los restantes genes vir. La induccin de los genes vir ocurre cuando VirG
fosforilado se une especficamente a los dominios vir, una secuencia conservada de
12 pb localizada en la regin promotora de los genes vir.
Una vez inducidos los genes vir, se produce la escisin de la hebra T libre. Este
evento se inicia en el borde derecho, contina en direccin 5-3, y termina en el borde
izquierdo de la hebra antisentido. Un complejo de protenas denominadas VirD1/D2,
que funcionan como endonucleasas especficas, se une a la forma supercoiled del
plsmido Ti, relajan el plsmido, hace un corte entre la tercera y cuarta base de los
bordes derecho e izquierdo en la hebra antisentido de la regin T y liberan dicha
hebra. La reaccin de corte comprende la unin covalente de la protena VirD2 al
extremo 5 del borde derecho. Luego, la maquinaria de sntesis de ADN repara la
brecha entre los bordes derecho e izquierdo de la hebra antisentido. La protena VirD2
permanece unida al ADN-T durante todo el trayecto hasta la clula husped. Las
protenas VirD2 y VirE2 (una protena de unin a ADN de simple cadena) junto con la
hebra T constituyen el complejo T maduro. La unin de VirE2 ocurre antes de que la
hebra T sea transportada a travs del canal de pasaje a travs de las membranas de
la bacteria. Otra protena recientemente identificada, la protena VirE1, se une a VirE2,
facilitando la unin de VirE2 al ADN, pero no interviene en la exportacin de la hebra T
a la clula de la planta.
Una vez formado el complejo T maduro, ste interacta con distintos complejos
proteicos involucrados en su exportacin al citoplasma de la clula vegetal. El
dispositivo de transporte del complejo T contiene alrededor de 12 protenas que
forman dos componentes funcionales: un complejo secretorio que transporta sustratos
a travs de la membrana celular y un pilus filamentoso. La transparencia 18 muestra
un modelo que da cuenta de la estructura de estos complejos, elaborado sobre la base
de evidencia indirecta. El complejo secretorio est compuesto por la protena
codificada por el gen virD4 y por un conjunto de protenas codificado por el opern
virB, el que contiene once marcos abiertos de lectura. El pilus est compuesto

mayoritariamente por la protena VirB2 y, en menor proporcin, por la protena VirB5.

El pilus censara el contacto con la clula vegetal y traducira la informacin al
complejo secretorio para iniciar la exportacin del complejo T. Se piensa que la
protena VirB1 tiene actividad transglucosilasa e interviene en la degradacin de los
peptidoglicanos bacterianos. Las protenas VirB3 y VirB4 promoveran el ensamblado
del pilus. Adems de VirD4, VirB4 y VirB11 poseen tambin actividad ATPasa. Se
asume que el transporte del complejo T implica la hidrlisis de ATP y que por lo tanto
se trata de un proceso de transporte activo. La protena VirB6 participara en la
formacin del poro del complejo secretorio de transporte. Se desconocen an las
funciones de las protenas VirB7, 8, 9 y 10.
Luego de pasar al citoplasma de la clula vegetal el complejo T es transportado al
ncleo de la misma. A diferencia de los elementos genticos transponibles, el ADN-T
no codifica protenas necesarias para su transporte e integracin. Por lo tanto, el ADNT no contiene secuencias especficas y cualquier fragmento de ADN insertado entre
los bordes de la regin T ser transferido e integrado al genoma vegetal. Las protenas
VirD2 y VirE2, que componen el complejo T, estn directamente implicadas en el
proceso de importacin al ncleo vegetal. VirD2 contiene dos seales de localizacin
nuclear (NLS) y VirE2 contiene una. VirD2 y VirE2 se uniran a protenas de la planta
involucradas con la importacin e integracin del ADN-T. Se ha reportado que VirD2
es capaz de unirse a las ciclofilinas RocA, Roc4 y CypA, protenas que actan como
chaperonas y contribuira a mantener la conformacin de VirD2. Otra protena vegetal
que se une a VirD2 es la ya mencionada fosfatasa tipo 2C (PP2C) es requerida para la
acumulacin de VirD2 en el ncleo. Finalmente, VirD2 tambin interacciona con
AtKApa. Esta protena, de la familia de carioferinas, participa en la importacin de
protenas que contienen sitios NLS al ncleo. A diferencia de VirD2, VirE2 no se une a
AtKapa, pero si lo hace a otras dos protenas VIP1 y VIP2. La protena VIP1, como ya
se dijo, es capaz de importar la protena VirE1 al ncleo en un sistema de levaduras, e
interactuar con VIP2. Por lo tanto, VIP1, VIP2 y VirE2 conformaran un complejo de
protenas que posibilita el transporte hacia el ncleo de VirE2 y contribuye as a la
integracin del complejo T.
Una vez en el ncleo, el complejo T participa de la integracin de la hebra T al genoma
de la planta. Se asume que tanto las protenas VirD2 y VirE2 como otros factores
nucleares proveen actividades que posibilitan este proceso. La transparencia 19 ilustra
un posible modelo del mecanismo involucrado. La protena VirD2 tiene actividad ligasa
in vitro, lo que sugiere que podra participar en la ligacin del extremo 5 del ADN T al
ADN de la planta. A este paso seguira un paso de sntesis reparativa de la hebra
complementaria en que intervendra la maquinaria nuclear de la planta. Sin embargo,
otros estudios sugieren que la doble cadena se sintetizara previamente a la
integracin al genoma vegetal. La protena VirD2 tiene en su extremo C-terminal
motivos presentes en la familia de las recombinasas. La protena VirE2 se requerira
para la integracin del extremo 3 del ADN T. Tambin se ha sugerido una
participacin de la histona H2A en el proceso de integracin.
En resumen, podemos dividir el proceso de transformacin mediada por
Agrobacterium en cuatro tipos de interacciones diferentes: a) interacciones
extracelulares, b) interacciones dentro de Agrobacterium, c) interacciones dentro de la
clula vegetal, y d) interacciones en el ncleo de la clula vegetal (ver Anexo,
transparencias 104-106).
Interacciones extracelulares (transparencia 104): Las protenas bacterianas ChvA,
ChvB, PscA y Att reconocen los receptores (protenas tipo vitronectina) de la pared
celular de la clula vegetal, resultando en la unin de las agrobacterias a la clula
husped. ChvE interacciona con azcares y transfiere la seal a VirA, o VirA

interacciona con compuestos fenlicos, en forma directa o va p10 y p21. Ambas vas
de sealizacin resultan en la autofosforilacin de VirA. La transferencia del grupo
fosfato de VirA a VirG transmite las seales de la planta a la clula bacteriana, donde
VirG activa la expresin de los genes vir.
Interacciones dentro de Agrobacterium (transparencia 105): Esta etapa comienza con
la activacin de los genes vir. Las protenas VirB1, VirB3, VirB4, VirB6, VirB7, VirB8,
VirB9, VirB10, VirB11 y VirD4 se ensamblan formando un complejo secretorio
transmembrana, que junto con el pilus formado por VirB2/VirB5, funcionan como un
canal que conecta la clula vegetal con la clula bacteriana. VirD1 y VirD2 forman un
complejo de endonucleasas que con la ayuda de VirC1, cortan la cadena antisentido
en los bordes del ADN T. Durante este proceso, VirD2 se une covalentemente al
extremo 5 de la hebra T generando un complejo T inmaduro. Este complejo T puede
madurar por dos mecanismos diferentes: a) el complejo T inmaduro y VirE2 unida a
VirE1 se exportaran a travs del canal de manera separada. En la clula husped,
VirE2 y VirE1 se desunen y VirE2 se une a la cadena T, formando el complejo T
maduro (ADN T, VirD2 y VirE2); b) VirE2 se une al ADN T en el citoplasma
bacteriano, y el complejo T maduro es luego exportado.
Interacciones dentro de la clula vegetal (transparencia 106, panel superior): Dentro
del citoplasma de la clula vegetal, VirD2 interacciona con las ciclofilinas RocA, Roc4 y
CypA para mantener su conformacin, con la protena AtKAPa para importar el
complejo T dentro del ncleo y, posiblemente, con PP2C para regular esta
importacin. VirE2 interacciona con VIP1 para favorecer su importacin al ncleo. Las
interacciones VirD2-AtKAPa y VirE2-VIP1 resultan en una eficiente importacin del
complejo T al ncleo.
Interacciones en el ncleo de la clula vegetal (transparencia 106, panel inferior): Una
vez en el ncleo, VIP1 y VIP2 podran participar en el transporte intranuclear del
complejo T, guindolo al sitio de integracin en el cromosoma de la planta. Finalmente,
factores nucleares actan en forma concertada con VirD2 y VirE2 para integrar la
cadena T en el ADN cromosmico, resultando en una transformacin gentica estable.
Vectores basados en plsmidos Ti
Transparencias 20-31
La capacidad natural de Agrobacterium de introducir ADN en el genoma nuclear de la
planta permiti desarrollar vectores basados en las secuencias del plsmido Ti de
Agrobacterium. Se constat que, si se remueven todos los genes comprendidos dentro
de la regin T (oncogenes y genes de sntesis de opinas), no se afecta la transferencia
e integracin del ADN T. Sobre esta base, se desarrollaron vectores de expresin que
permiten clonar genes de inters dentro de la regin T. Existen dos tipos diferentes de
vectores de transformacin. Las partes A y B de la transparencia 21 muestran los
fundamentos de un vector de tipo cointegrativo. El gen de inters es introducido dentro
de un plsmido Ti mediante un paso de recombinacin simple a partir del llamado
vector intermediario (un plsmido comn de trabajo para Escherichia coli). En este
plsmido Ti, las secuencias comprendidas entre los bordes de la regin T han sido
reemplazadas por secuencias que permiten la cointegracin del vector intermediario.
Este plsmido Ti conserva tambin todos los genes comprendidos en la regin vir. La
parte C de la transparencia ilustra un sistema basado en un vector binario. En ste, el
gen de inters y los genes vir residen en dos replicones separados capaces de
coexistir y replicarse autnomamente en Agrobacterium. El replicn que contiene el
gen de inters (en general de tamao pequeo) se denomina vector binario. El

replicn que contiene los genes vir se denomina plsmido Ti desarmado (obsrvese
que la regin T ha sido completamente eliminada de ste elemento). El desarrollo de
vectores binarios y la disponibilidad de un amplio rango de cepas de Agrobacterium
que contienen plsmidos Ti desarmados convirtieron a la transformacin basada en
esta bacteria en un mtodo preferencial de transformacin vegetal.
Inicialmente, el mtodo para introducir ADN forneo en un plsmido Ti cointegrado,
como el que se muestra en la transparencia 22, requera introducir un replicn de tipo
ColE1, como pBR322, dentro de la regin T del plsmido Ti. El ADN que se integrable
en la regin T se clonaba en un derivado de pBR322 que portaba un gen de
resistencia a un antibitico. Este plsmido se introduca en la cepa de Agrobacterium y
la cepa se seleccionada por resistencia a dicho antibitico. Como el ColE1 no puede
replicarse en Agrobacterium, el plsmido pBR322 deber cointegrarse al segmento
pBR322 homlogo de la regin T para acceder a una expresin estable. La desventaja
principal de esta tcnica es que resulta engorrosa y poco accesible para laboratorios
con poca experiencia en microbiologa. La ventaja principal es que este sistema
permite mantener al gen forneo en un bajo nmero de copias dentro de un plsmido
Ti de Agrobacterium. La transparencia muestra un ejemplo basado en un vector
cointegrativo tradicional.
Los vectores binarios surgen como una alternativa al uso de los vectores
cointegrativos debido a la fcil implementacin de su uso en todo tipo de laboratorios.
Estos vectores se basan en que la regin T y los genes vir se encuentran en dos
replicones separados. Cuando estos replicones son introducidos en Agrobacterium, los
productos de los genes vir pueden actuar en trans sobre la regin T procesando y
transfiriendo el ADN T a la clula vegetal. El plsmido que contiene la regin T es
denominado vector binario, mientras que el replicn que lleva los genes vir se
denomina plsmido helper o plsmido Ti desarmado. En general, el plsmido helper
contiene deleciones de la regin T y es incapaz de generar tumores. En la
transparencia 23 se muestran cuatro tipos de plsmidos binarios, todos los cuales
contienen genes con secuencias no homlogas que confieren resistencia a
kanamicina. Los plsmidos binarios son pequeos y fciles de manipular tanto en
Escherichia coli como en Agrobacterium. Generalmente, contienen sitios mltiples
para enzimas de restriccin dentro de la regin T donde puede clonarse fcilmente el
gen de inters. Muchos de los primeros plsmidos binarios tienen los genes de
seleccin para plantas cerca del borde derecho (por ejemplo, pBIN19). Ms
recientemente, los nuevos vectores binarios se desarrollaron con el gen marcador de
seleccin para plantas ms cerca del borde izquierdo, lo que asegura que el gen de
inters sea transferido antes que el gen selector (por ejemplo, pGreen0029). Debe
recordarse que el borde derecho precede borde izquierdo en la transferencia del ADNT.

Muchos vectores fueron diseados con propsitos especficos y contienen diferentes

genes selectores, promotores y seales de poliadenilacin. La tabla de la
transparencia 24 refleja la optimizacin gradual experimentada desde la introduccin
de los primeros vectores. Ello ha permitido incrementar la flexibilidad de los sistemas
de vectores para distintos usos en un amplio rango especies vegetales. Los genes
selectores ms comnmente usados en bacterias son los de resistencia a kanamicina,
gentamicina, tetraciclina y estreptomicina y/o espectinomicina. Tambin ha ocurrido
una progresiva reduccin del tamao de los plsmidos binarios. Los plsmidos pPZP
poseen un origen de replicacin pVS1 cuya secuencia es considerablemente ms
corta que las de otros orgenes de replicacin, como pRK2 o Ri. Por ello, los vectores
con orgenes de replicacin tipo pVS1 tienen un tamao menor comparado con los que
poseen los orgenes de replicacin pRK2 o Ri. El pGreen usa un locus de replicacin

pSa ms pequeo, subdividido en el origen de replicacin pSa ori y el gen de la

replicasa pSa (rep A). El gen de rep A proviene de un plsmido (psoup) de
Agrobacterium y permite la replicacin de pGreen en trans.
Los vectores binarios que hoy se utilizan proveen un amplio nmero de genes
selectores para plantas. Esta gama de genes permite as responder a requerimientos
de las tcnicas de cultivo de tejidos y expandir el rango de especies transformables.
De esta forma, se han desarrollado en muchos casos diversas versiones de un mismo
vector binario. El vector pGreen, por ejemplo, permite realizar distintas combinaciones
de genes selectores con el propsito de desarrollar protocolos de seleccin con uno o
ms marcadores. Este grado de flexibilidad permitir tambin la incorporacin de
nuevos genes selectores en el futuro. En la mayora de los casos, la seleccin se basa
en el agregado de una sustancia txica para el tejido no transformado al medio de
cultivo (seleccin negativa). Al expresarse en las clulas transformadas, el gen
selector permite su supervivencia y la regeneracin de plantas a partir de las mismas.
Los genes de resistencia a antibiticos han sido frecuentemente utilizados como
selectores. El ms utilizado de ellos es el gen nptII que confiere resistencia al
antibitico kanamicina. Otros genes ampliamente utilizados son los que confieren
resistencia a espectinomicina e higromicina y los que confieren resistencia a
herbicidas, como glufosinato y glifosato. El uso de un determinado selector est
vinculado con la susceptibilidad especfica de cada especie vegetal, por lo que la
transformacin de una especie nueva implica generalmente ensayos con distintos
selectores. Es conveniente disponer de ms de un gen selector si se prev la
necesidad de retransformar una especie con varios transgenes de inters. El debate
sobre el uso de genes de resistencia a antibiticos en plantas transgnicas
comerciales promovi la bsqueda de selectores ms aceptables para la percepcin
pblica que no poseen propiedades txicas para el tejido (seleccin positiva).
Asimismo, se han desarrollado diferentes estrategias para eliminar los genes
selectores en el cultivo transgnico.
Una opcin para evitar el uso de genes de resistencia a antibiticos u herbicidas es el
uso de genes de seleccin positiva, llamados as, porque permiten la proliferacin del
tejido transformado e inhiben la del tejido no transformado, el que sin embargo no
muere. Una de las estrategias ms interesantes de seleccin positiva se basa en la
utilizacin de las fuentes de carbono, para las cuales se han usado genes de origen
bacteriano que permiten la modificacin de manosa o xilosa (monosacridos que no
pueden ser directamente utilizados por las plantas) como genes de seleccin en la
transformacin de plantas. El ejemplo descrito en la transparencia 27 corresponde a la
seleccin mediada por el gen de la manosa-6P isomerasa (man A), el que interviene
en el pasaje de manosa-6P a fructosa 6P. Se compara la eficiencia de transformacin
de la remolacha utilizando el gen nptII y el gen man A. La parte A de la figura muestra
la eficiencia (en porcentaje) de brotes transformados usando mtodos de seleccin
positiva (manosa-6P isomerasa) o negativa (nptII). En la parte B se observa el
porcentaje de brotes capaces de enraizar usando uno y otro mtodo. Este mtodo de
seleccin positiva se ha utilizado en otros cultivos como cebada, tomate y girasol.
Para evitar la presencia de marcadores resistentes a antibiticos se han desarrollado
varios mtodos que permiten su remocin del tejido transgnico. La estrategia ms
sencilla es la co-transformacin de una misma clula con dos cepas de Agrobacterium
portando construcciones diferentes, una conteniendo el transgn de inters y otra el
gen selector. La base de esta estrategia consiste en que, de producirse la cotransformacin, ambos transgenes se insertarn en diferentes regiones del genoma en
forma no ligada, por lo cual ser factible su segregacin posterior en la progenie de la
planta transgnica. Como una alternativa a la co-transformacin, se han desarrollado
varios sistemas que utilizan elementos transponibles y/o sistemas de recombinacin

sitio-especfico. Estos sistemas requieren la expresin simultnea de transposasas o

recombinasas que promueven la delecin especfica de la regin que debe ser
eliminada. La eliminacin del gen selector y de la transposasa/recombinasa se realiza
posteriormente por segregacin gentica. La transparencia 28 muestra el diseo de
los dos principales tipos de vectores utilizados con este propsito. Los de Tipo 1
contienen al gen de la transposasa y al gen selector en el mismo cassette de
expresin, mientras que, en los de Tipo 2, la transposasa es aportada en trans por un
vector helper. En los vectores de Tipo 1, las secuencias Ds, sobre las cuales acta la
transposasa, flanquean al gen de inters; en los de Tipo 2, las secuencias Ds
flanquean al marcador de seleccin. El gen de la transposasa se muestra como un
componente integrante de los vectores de Tipo 1, mientras que en el caso de los de
Tipo 2 debe ser introducido por cruzamiento a partir de plantas transformadas con una
construccin independiente. Una desventaja de estos sistemas es que la eliminacin y
seleccin posterior de las secuencias indeseables en la descendencia consumen
tiempos considerables. Estas estrategias no son viables en plantas de propagacin
vegetativa, para las cuales se han desarrollado mtodos alternativos.

Un sistema menos complicado, como el que se muestra en la transparencia 29,

implica la delecin de ADN mediante recombinacin de regiones intracromosmicas
(ICR) entre dos secuencias homlogas. Dado que la frecuencia de ICR es baja, esto
permite una eficiente aplicacin de este sistema. El vector de transformacin diseado
(OattO-ICR, contiene dos regiones de 352 pb de la secuencia de unin (attP) del
bacterifago l que rodean al gen de resistencia nptII, al gen GFP y al gen tms2. A la
izquierda del sitio attP, se encuentra la secuencia booster de transformacin (TBS),
que favorecera el apareamiento de las secuencias attP evitando la recombinacin
ilegtima; tambin se encuentra el gen efector que ser integrado al genoma por el
sistema attP (esquema superior). La recombinacin homloga entre las dos regiones
attP permite delecionar un fragmento de 5.9 Kpb y produce un transgn que contiene
el gen efector y la secuencia TBS (esquema inferior). El gen tms2 , usado como
selector, codifica una enzima que convierte NAM (naftaleno acetamida) a la auxina
ANA (cido naftalen actico). Las plantas que expresan el gen tms2 producen altos
niveles de auxina que evitan el desarrollo de races e inducen la produccin de callos.
Por lo tanto, cuando se elimina la regin entre las secuencias attP, se habilita el
desarrollo de races y se pueden identificar las plantas positivas. En la transparencia
30 se muestran resultados obtenidos utilizando el sistema descrito. Una construccin
similar a la detallada previamente se introdujo en de explantos de hojas de tabaco y se
seleccionaron callos resistentes a kanamicina. Despus de tres a cinco meses se
observ que varios brotes que se haban desarrollado mostraban una coloracin
blanca. Cuando se analizaron estos brotes por PCR se observ que haban perdido el
gen de resistencia a nptII y el gen tms2. Para seleccionar plantas de tabaco
transgnicas libres de marcador (panel A, se desarrollaron brotes verdes y blancos en
medio conteniendo kanamicina). En el tejido blanco, que potencialmente ha perdido el
marcador nptII, se ensay la actividad del gen tms2 (panel B). En medio conteniendo
NAM, las races con actividad tms2 produjeron abundantes callos en lugar de races
(izquierda), mientras que las races regeneradas a partir de tejido blanco que han
perdido el gen nptII, debido a que tambin perdieron el gen tms2, producen races
normales (derecha).
El sistema que se muestra en la transparencia 31 se basa en un sistema inducible por
estradiol, que permite la remocin de ADN en un sitio especfico en plantas
transgnicas de Arabidopsis, denominado CLX (por sistema de remocin de ADN
Cre/loxP). Este sistema es controlado por otro sistema denominado XVE. Comparado
con otros sistemas, el sistema CLX puede ser finamente controlado y es altamente
eficiente. Este sistema puede usarse en todo tipo de regeneracin de explantos, tanto

por organognesis como por embriognesis somtica. El sistema de expresin

inducible XVE se eligi para el sistema CLX. La recombinasa Cre del bacterifago P1,
que reconoce especficamente los sitios loxP, se ubic bajo el control del sistema XVE.
Dado que el promotor OlexA-46 tiene una expresin basal en clulas bacterianas, la
secuencia que codifica Cre se interrumpi con un intrn para evitar su expresin en las
mismas. El marcador de seleccin (gen nptII) se ubic entre las unidades de
transcripcin XVE y cre. En este ejemplo, el gen reportero GFP es utilizado como gen
de inters. Las tres unidades de transcripcin estn flanqueadas por los dos sitios
loxP, de tal forma que la recombinacin inducida por estradiol permite la remocin de
todos estos componentes y la activacin del gen GFP por el promotor G10-90.

Protocolos de transformacin mediante Agrobacterium tumefaciens

Transparencias 32-37
Los protocolos de transformacin por Agrobacterium tumefaciens son, en rasgos
generales, muy similares. La base de la tcnica radica en poner en contacto el
explanto que se va a utilizar para transformar con la cepa de Agrobacterium crecida en
condiciones apropiadas. De acuerdo con la cepa utilizada, el requerimiento de
antibiticos puede ser diferente. En general, las cepas de Agrobacterium se cultivan en
medio LB suplementado con MgSO4 en presencia de los antibiticos requeridos. El
Agrobacterium se cultiva toda la noche a 27-28 C. En el caso de la transformacin de
hojas de tabaco, se cortan discos de hoja (explantos) de aproximadamente 1 cm de
dimetro. El explanto se coloca en una caja de Petri que contiene medio MS lquido y
el cultivo de Agrobacterium. Se incuba unos minutos en presencia de la bacteria y
luego se pasa a un medio MS slido en presencia de las hormonas ANA y BAP para
inducir la formacin de brotes. Luego, los explantos se traspasan a un medio MS
slido suplementado con los antibiticos requeridos para seleccionar slo aquellos
brotes que hayan incorporado el ADN-T y cefotaxime, un bacteriosttico que inhibe el
crecimiento de Agrobacterium. Los explantos se repican cada 3 semanas durante 2
meses. Cuando se obtienen los brotes, estos se pasan a medio MS slido
suplementado con los agentes de seleccin, pero en ausencia de hormonas para
favorecer el desarrollo de races y tallos. Las plantas que enrazan en medio con
seleccin se pasan a tierra en invernadero. La transparencia 33 ilustra este proceso.
Panel A: control de seleccin: explantos que no fueron incubados con Agrobacterium
para confirmar que el agente selector est actuando. Panel B: control de regeneracin:
para confirmar que las hormonas estn actuando dado que en ausencia de agente
selector se observa regeneracin de brotes. Paneles C, D, E y F: transformantes en
medio suplementado con hormonas y agente selector. En el panel F se observa que el
brote es capaz de enraizar en medio suplementado con el agente selector.
La transparencia 34 ilustra la transformacin de soja a partir de cotiledones mediante
Agrobacterium y usando higromicina como agente selector. El uso de higromicina
como agente selector disminuy el nmero de escapes (plantas no transformadas). A:
explantos obtenidos a partir de plantas de soja de 5 das de edad. B: cotiledones
incubados en un medio conteniendo Agrobacterium. C: explantos incubados en medio
de induccin de tallos durante 28 das, los primeros 14 das en ausencia de
higromicina, y los segundos 14 das en presencia de higromicina. E, F, G: evolucin de
los explantos en medio selectivo conteniendo higromicina durante 4 meses. H: plantas
seleccionadas in vitro de una altura de 4 cm. I: plantas transferidas a tierra en
condiciones de invernculo.
El protocolo de transformacin de Arabidopsis thaliana por Agrobacterium es
extremadamente simple y la eficiencia de transformacin radica fundamentalmente en

el buen estado fisiolgico de las plantas durante el proceso de transformacin y

fecundacin. La transparencia 35 muestra pasos de este protocolo. Una vez que las
plantas florecen (panel A), se prepara la cepa de Agrobacterium tumefaciens que lleva
el gen de inters en un vector binario. El cultivo de Agrobacterium se resuspende en
una solucin de sacarosa al 5% y la planta se sumerge en la solucin de bacterias
dejando en contacto las flores durante unos segundos con agitacin suave (panel B).
Luego, las plantas se cultivan normalmente hasta la obtencin de semillas (panel C).
Una vez obtenidas, las semillas se recolectan, se secan y se esterilizan usando cido
clorhdrico. Las semillas transformadas se seleccionan durante 7 a 10 das en medio
MS slido en presencia del agente selector. El panel D muestra las plantas
potencialmente transformadas que crecieron en el medio selectivo.
La transparencia 36 resume los tiempos estimados para cada uno de los pasos de un
protocolo de una transformacin estndar mediado por Agrobacterium tumefaciens.
Estos tiempos son variables y dependen de la especie a ser transformada, la variedad
elegida, el explanto utilizado y el protocolo elegido para la seleccin.
Otro de los usos posibles de los sistemas basados en A. tumefaciens, es la
mutagnesis por insercin con ADN-T, insertndose ste tericamente al azar en
cualquier sitio de la eucromatina, y representando un marcador molecular de
secuencia conocida (tag) en el sitio de insercin. Pueden generarse as colecciones de
mutantes estables, para estudios de gentica inversa.
Protocolo de transformacin mediante Agrobacterium rhizogenes
Transparencias 38-42
Agrobacterium rhizogenes induce la formacin de races en forma de cabellera (hairy
roots, ver transparencia 39) en plantas dicotiledneas debido a la incorporacin del
ADN-T contenido en el plsmido Ri al genoma de la planta husped. Se muestra el
sobre crecimiento de races en discos de remolacha transformadas con el plsmido Ri
de A. rhizogenes.

Inicialmente, se pens que la transformacin va Agrobacterium rhizogenes era un

mtodo de eleccin, dado la facilidad para rescatar plantas transformadas a partir de
races inoculadas con esta bacteria, en comparacin con las dificultades que implica el
rescate a partir de tumores de Agrobacterium tumefaciens. Sin embargo, una vez que
el plsmido Ti fue exitosamente desarmado y estuvieron disponibles vectores no
oncognicos, la transformacin con Agrobacterium tumefaciens pas a ser rutina y la
utilizacin de Agrobacterium rhizogenes se vio restringida a usos especficos. Las
plantas transformadas con Agrobacterium rhizogenes pueden rescatarse a partir de
pelos de explantos transformados (cada pelo representa un evento individual de
transformacin), mediante el uso de medios hormonales adecuados. Sin embargo, las
plantas transformadas y sus progenies son morfolgicamente anormales (panel inferior
de la transparencia 40) y presentan el denominado fenotipo Ri (entrenudos cortos,
hojas retorcidas, etc.). La transformacin de races por Agrobacterium rhizogenes ha
encontrado una importante aplicacin alternativa. Las races de las plantas en su
estado natural son capaces de sintetizar una extraordinaria diversidad de metabolitos
secundarios y las races transformadas tienen el potencial de capitalizar esta habilidad.
Debido a que las races son capaces de proliferar indefinidamente in vitro con altas
tasas de crecimiento, esta habilidad podra ser usada para la produccin de altos
niveles de metabolitos secundarios en cultivos en gran escala.

La transparencia 41 resume el procedimiento utilizado para la transformacin mediada

por Agrobacterium rhizogenes. Inicialmente, se clona el gen de inters en un vector
intermediario que contenga el ADN-T del plsmido Ri. Luego, se transforma
Agrobacterium rhizogenes con este vector intermediario, el que slo se va a poder
replicar como un cointegrado con el plsmido pRi. El cultivo de Agrobacterium
rhizogenes se co-cultiva con los explantos (en este caso, tallos decapitados) y stos
se transfieren a un medio donde se induce la formacin de races transformadas.
Luego las races se transfieren a un medio apropiado para inducir la formacin de
tallos a partir de los cuales se regeneran plantas enteras. Las plantas genticamente
transformadas se transfieren a invernadero.
Genes reporteros
Transparencias 43-52
Los genes reporteros son ampliamente usados en muchos vectores de expresin para
medir la actividad de distintas regiones reguladoras. Idealmente, un gen reportero
debe ser fcil de ensayar, si es posible en condiciones no destructivas del tejido. Se
requiere tambin que la actividad endgena asociada al gen reportero sea muy baja o
inexistente en las plantas a transformar. Actualmente, se cuenta con un pequeo
nmero de genes reporteros de uso frecuente, siendo los ms utilizados el de la glucuronidasa, la protena de fluorescencia verde, los de luciferasa y, en menor grado,
el de cloranfenicol acetiltransferasa. La transparencia 44 enumera los orgenes y tipos
de ensayos que se utilizan para detectar las actividades asociadas con estos genes.
Los genes reporteros han utilizados desde muy temprano como indicadores de que la
transformacin vegetal realmente ha ocurrido. En general, los genes reporteros son
codificados por enzimas que actan sobre sustratos que normalmente no estn
presentes en la clula husped. Uno de los genes reporteros ms comnmente
utilizado en plantas es el gen de la -glucuronidasa (uidA) de Escherichia coli. La
protena GUS es bastante estable y conserva su actividad an cuando est fusionada
a otras protenas. La actividad GUS puede detectarse a travs de una sencilla
reaccin histoqumica usando una variedad de sustratos que estn disponibles
comercialmente. Desafortunadamente, la mayora de los sustratos son caros y la
reaccin histoqumica es destructiva, por lo que este ensayo no puede realizarse en
tejido vivo. Sin embargo, la deteccin de la actividad GUS es muy sensible,
pudindose detectar a nivel de unas pocas clulas. La transparencia 45 muestra la
tincin de vulos, sacos embrionarios y lculos enteros de Arabidopsis thaliana
mediante la reaccin histoqumica de la enzima -glucuronidasa luego de la infiltracin
con Agrobacterium tumefaciens. En este caso, el gen uidA est regulado por un
promotor constitutivo y lo que se visualiza son los tejidos inicialmente transformados
por este mtodo. A: fotografa de una flor completa donde se observan varios vulos
teidos. B: Fotografa ampliada de un segmento floral donde se pueden ver vulos
completamente teidos y vulos no teidos. C: Tincin del embrin o saco
embrionario, en vez del vulo entero. D: Cavidad del lculo completamente teido.
Los genes reporteros son comnmente usados para explorar la localizacin espaciotemporal de la expresin gnica. Para ello, las regiones reguladoras de los genes que
se desea estudiar son ligadas al gen reportero y las construcciones as obtenidas son
transferidas al genoma de la planta. El panel de la parte superior de la transparencia
46 muestra la expresin del gen reportero uidA mediada por el promotor tejido
especfico AtpT2 en flores y frutos de Arabidopsis thaliana. 1) Expresin del gen uidA
en flores, 2) La expresin del gen uidA es confinada a la porcin entre la silicua y el
pecolo. 3 y 4). Cortes histolgicos del fruto donde se observa la expresin del gen

uidA en clulas del estrato superior (3) y en algunas clulas del tejido vacuolar (4). El
panel de la parte inferior de la transparencia muestra la expresin del gen reportero
uidA bajo la regulacin de un promotor tejido especfico AtpT2 en races de Nicotiana
tabacum. (5) y (6): Fotografas de las races completamente teidas debido a la
expresin del gen uidA. (7): Corte transversal de raz mostrando la expresin del gen
uidA.
Los genes reporteros se utilizan tambin para la puesta a punto y seguimiento de un
sistema de transformacin. La transparencia 47 muestra embriones cigticos
inmaduros de Zea mays co-cultivados con agrobacterias que portan una construccin
en que el gen uidA es dirigido por un promotor constitutivo. En el panel A se observa la
distribucin de puntos azules (expresin transitoria del gen uidA) en embriones
cigticos de maz. En el panel B se observa la expresin estable del gen uidA en callos
que emergieron de un nico embrin. El callo de la derecha no muestra actividad GUS
porque proviene de un embrin no transformado. El panel C muestra un segmento de
hoja aislada de una planta transgnica que expresa el gen uidA. La hoja de la derecha
proviene de una planta no transgnica (control negativo). El panel D muestra plantas
transgnicas de maz en invernadero expresando el gen uidA.
Aequorea victoria es una medusa con puntos luminiscentes en sus bordes
(transparencia 48, panel inferior izquierdo). La luz proviene de una masa de tejido
amarillo que contiene entre 6.000 a 7.000 clulas fotognicas. El citoplasma de estas
clulas contiene los componentes necesarios para generar bioluminiscencia. Estos
componentes son una fotoprotena que se activa por Ca2+ (aequorina) que emite luz
azul y verde, y una protena accesoria, la green fluorescent protein (GFP), que acepta
energa de la aequorina y re-emite esta energa como luz verde. La fluorescencia
intrnseca de la protena GFP se debe a una unin covalente a un cromforo que se
forma por modificaciones postranscripcionales de la protena y que involucran el
ciclado y la oxidacin de los residuos, 65-67 (Ser-Tyr-Gly). El ADNc de GFP fue
clonado y expresado en varios organismos procariotas y eucariotas, como bacterias,
levaduras, nematodos, Drosophila y mamferos. La protena GFP tiene las
caractersticas de un gen reportero deseable. Su expresin es autnoma e
independiente de la localizacin celular y se requiere solamente la presencia de luz UV
o azul y de oxgeno para la emisin de la fluorescencia verde. Adems, GFP
permanece activa cuando otras protenas se fusionan a su extremo C- y N- terminal,
sin afectar tampoco la distribucin o compartimentalizacin de la protena fusionada.
Sin embargo, la expresin de GFP en plantas presenta ciertos problemas que deben
ser tenidos en cuenta: a) la fluorescencia endgena que puede presentar las plantas
puede confundir la interpretacin de los resultados; b) la presencia de secuencias que
codifican intrones crpticos puede llevar a la sntesis de una protena inactiva; c) la
obtencin de radicales libres debido a la fuerte expresin de GFP puede resultar en
muerte celular. Para evitar estos problemas, se han realizado varias modificaciones a
la secuencia codificante de GFP: a) el uso de codones fue modificado para evitar el
reconocimiento de intrones crpticos por la maquinaria de splicing de la planta; b) la
serina 65 se reemplaz por una treonina para aumentar la luminiscencia de la protena
original y c) se adicionaron seales de transporte que permitieron la expresin de GFP
en organelas donde los efectos txicos pueden tolerarse mejor.
La transparencia 49 muestra la expresin de GFP bajo microscopio de
epifluorescencia usando excitacin de luz azul. En los paneles A y B se muestra la
expresin del gen de GFP utilizando un promotor especfico de polen (LAT59 de
tomate). El polen expresando GFP se desarroll como una herramienta para rastrear
el movimiento del polen transgnico en el ambiente. Las fotos muestran polen de
Nicotiana tabacum cv Xanthi que exhibe una segregacin mendeliana 1:1 (A; 400x de
aumento) y polen segregante transgnico y no transgnico sobre los pelos de la pata

de una abeja (B; 100x de aumento). Los paneles C y D muestran expresin de GFP en
plantas transgnicas de Arabidopsis thaliana. El panel C muestra cuerpos fusiformes
dentro del retculo endoplsmico en clulas corticales del tallo. La protena GFP ha
sido dirigida al retculo por adicin de una secuencia de anclaje HDEL. El panel D
muestra clulas epidermales de hoja que exhiben fluorescencia en los tonoplastos y
sub-poblaciones de vacuolas dentro de una vacuola central. El panel E muestra un
cultivo de clulas en suspensin de la lnea BY2 de tabaco transformadas con el gen
GFP, en las que se observa acumulacin de la protena GFP dentro del retculo
endoplsmico.
La transparencia 50 muestra plantas de tabaco transgnicas que expresan el gen gfp
bajo el promotor AtSUC2 de la protena de transporte de sacarosa en clulas del
floema de Arabidopsis thaliana. Las plantas AtSUC2-GFP se examinaron usando un
microscopio confocal para localizar la expresin de GFP e identificar los patrones de
desarrollo del floema en diferentes estadios del desarrollo. La parte superior de la
transparencia muestra el desarrollo basiptalo del floema (desde la base hacia la
punta de la hoja) de la vena mayor en los cotiledones. GFP se expresa inicialmente en
la vena central (vena clase I; A y B) y luego se extiende hacia la punta de la hoja (vena
clase II; C). Finalmente, se expresa alrededor de la base de la hoja (D, E y F). La parte
inferior de la figura muestra el desarrollo acroptalo de la vena central en hojas
inmaduras. La descarga de GFP dentro de las hojas inmaduras en desarrollo ocurre
inicialmente desde la vena clase I (A y B), sigue por la parte basal de las venas clase II
(C y D) y finaliza en la parte apical de las venas clase II (E y F).
Los genes reporteros no destructivos pueden usarse para observar el desarrollo de
ciertos fenmenos biolgicos en tiempo real. La transparencia 51 muestra la expresin
de GFP en tabacos transgnicos de Nicotiana benthamiana. El gen gfp esta dirigido
por un promotor constitutivo que permite su expresin en todos los tejidos. El propsito
del ensayo es mostrar el desencadenamiento del fenmeno de silenciamiento gnico
postranscripcional en plantas transgnicas en las que este fenmeno ha sido inducido
artificialmente. La presencia de la protena GFP se revela por la aparicin de color
verde o amarillo bajo iluminacin ultravioleta. En ausencia de GFP, el tejido se observa
de color rojo debido a la fluorescencia de la clorofila. A: Hoja de una planta de
Nicotiana benthamiana no transgnica que emite fluorescencia roja debido a la
presencia de clorofila. B: Hoja de una planta transgnica de Nicotiana benthamiana
que emite una fuerte fluorescencia verde debido a la expresin del transgen gfp. C:
Planta transgnica para gfp infiltrada 18 d antes con Agrobacterium tumefaciens
portador del gen reportero gfp en que se puede observar la progresin del
silenciamiento de GFP en una hoja inferior (flecha).
Un gen reportero no destructivo menos utilizado (bsicamente por el costo de los
sustratos y por los tiempos implicados en el ensayo) es el de la luciferasa. La
transparencia 52 muestra una planta de Nicotiana tabacum expresando el gen Luc de
Photinus pyralis bajo el promotor constitutivo 35S de Cauliflower mosaic virus. La
deteccin de fluorescencia se realiz sobre una pelcula fotogrfica expuesta por
varios das a la emisin de la planta. El ensayo se basa en la medicin de los niveles
de luz producidas en una reaccin catalizada por la enzima luciferasa:
luciferasa

ATP + luciferina + O2

oxiluciferina + ampicilina + PPi + CO2 + luz

La intensidad de luz emitida es proporcional a la actividad de la enzima luciferasa, la

que a su vez es dependiente de la temperatura. La temperatura ptima para la
actividad de la luciferasa es de entre 20 y 25 C.

Sistemas de transferencia directa de ADN

Transparencias 53-99
Los diferentes mtodos desarrollados para la transformacin gentica de plantas
pueden agruparse en dos clases principales de acuerdo con el mecanismo utilizado
para la transferencia de ADN. Como muestra la transparencia 4, en una clase se
encuentran aquellos mtodos basados en la utilizacin de vectores biolgicos, como el
Agrobacterium o los virus vegetales, y en otra clase, aquellos que consisten en la
transferencia directa del ADN. El rango natural de hospedantes de Agrobacterium se
constituy en un importante factor limitante en los primeros intentos por transformar
monocotiledneas y algunas dicotiledneas que no eran susceptibles a la bacteria. En
consecuencia, se desarrollaron mtodos alternativos de transferencia de ADN basados
en procedimientos de naturaleza qumica, fisicoqumica, o mecnica. Estos nuevos
mtodos, conocidos como de transferencia directa, permiten transferir ADN desnudo
sin la mediacin de vectores biolgicos. Entre estos ltimos, se incluyen mtodos tales
como el bombardeo con micropartculas (biobalstica), la permeabilizacin de
membranas celulares inducida por corrientes elctricas (electroporacin) y/o por
tratamientos qumicos con policationes (PEG, PVP) o fusgenos lipdicos, la abrasin
con fibras de carburo de silicio y la microinyeccin. El bombardeo de micropartculas
es el ms ampliamente utilizado.
Los mtodos de transferencia directa presentan diversas ventajas y desventajas al ser
comparados con los mtodos mediados por vectores biolgicos. Entre las ventajas: a)
son considerados universales porque, al no incluir organismos vectores, pueden
aplicarse a cualquier especie, independientemente de su susceptibilidad a la infeccin
por parte de los mismos. Es decir, que su expresin no ser dependiente de la
interaccin vector-hospedador; b) no requieren la eliminacin de las clulas del
organismo vector de los tejidos o plantas transgnicas, como sucede en la
transformacin mediada por Agrobacterium; c) las construcciones son ms simples y
pequeas, ya que no son necesarias secuencias particulares, como las de la regin vir
o los bordes del plsmido Ti; d) es ms fcil la co-transformacin con dos o ms
genes; e) son tiles para estudiar funcin y regulacin gnica, como as tambin
actividad de promotores, ya que en este tipo de mtodos la expresin transitoria suele
ocurrir en forma muy temprana. El transgn puede ser transcripto en el ncleo y
traducido en el citoplasma independientemente de su integracin al genoma nuclear.
Entre sus desventajas: a) pueden conducir a una alta frecuencia de re-arreglos del
transgn; las clulas transformadas generalmente contienen secuencias fragmentadas
del transgn y del vector en varios sitios del genoma; b) la insercin de mltiples
copias del transgn es ms frecuente que en el caso de los sistemas basados en
vectores biolgicos. Estas dos cuestiones implican que en la transformacin directa
existe una mayor probabilidad de ocurrencia del silenciamiento gnico, tanto a nivel
transcripcional como post-transcripcional. Por regla general, con el fin de atenuar su
incidencia de este fenmeno, se recomienda tomar ciertas precauciones: a) reducir el
nmero de transgenes a transferir, b) evitar el uso de mltiples copias del mismo
promotor o terminador y c) evitar el uso de promotores y transgenes con un alto grado
de similitud a promotores o genes endgenos.

Transformacin por biobalstica o bombardeo de micropartculas

Transparencias 55-82
El trmino biobalstica deriva de la conjuncin de biolgico y balstica o dicho de
otro modo balstica biolgica. Es comn referirse a este mtodo como bombardeo de
partculas, bombardeo de micropartculas, aceleracin de partculas, mtodo del can
gnico, etc. La biobalstica fue ideada y refinada por John Sanford, Theodore Klein,
Edward Wolf y Nelson Allen en la Universidad de Cornell en los aos 80. Este
procedimiento consiste en la utilizacin de partculas microscpicas (microproyectiles)
cubiertas con molculas de ADN o de ARN que son acelerados a alta velocidad para
atravesar la pared y las membranas celulares. Una vez que las partculas son
atrapadas en las clulas, el ARN puede ser traducido directamente o el ADN puede
ser transcripto y traducido, lo que permite observar expresin transitoria entre 24 y 72
horas despus del bombardeo. Si las partculas bombardeadas son atrapadas en el
ncleo, el ADN puede integrarse de forma estable en los cromosomas mediante un
proceso de recombinacin al azar, lo que se considera como un evento de
transformacin estable. La transformacin estable ocurre a muy baja frecuencia, por lo
que es necesario utilizar un sistema de seleccin in vitro que permita distinguir clulas
transformadas y no transformadas. El primer can gnico era similar a una pistola de
calibre 22 en la que un percutor generaba una explosin de plvora impulsando una
bala de plstico (macroproyectil) con las partculas de metal (microproyectiles) y ADN
o ARN, hacia el tejido blanco.
En 1987, Klein et al. reportaron que era posible introducir ADN plasmdico en clulas
epidrmicas de Allium cepa mediante bombardeo con partculas de tungsteno, y que el
gen marcador cat de la enzima cloranfenicol acetiltransferasa era expresado en
niveles muy altos. Poco despus, numerosos investigadores pusieron a prueba este
mtodo en diferentes organismos obteniendo resultados positivos. Desde entonces, el
bombardeo de micropartculas se constituy en el segundo mtodo de transformacin
gentica de plantas ms empleado, luego del de Agrobacterium. El bombardeo de
micropartculas es considerado un mecanismo universal, ya que, por su naturaleza,
permite introducir ADN desnudo virtualmente en cualquier tipo de tejido o clula. Ha
sido utilizado para introducir y expresar material gentico no slo en el genoma de
plantas superiores sino tambin en bacterias, protozoarios, algas, hongos, clulas y
tejidos animales (insectos, peces, aves y mamferos) y an animales y plantas in vivo.
Hasta el presente, constituye el nico medio que permite transformar organelas
celulares, como mitocondrias y cloroplastos de modo reproducible.
Se han identificado varios parmetros fsicos, qumicos y biolgicos que interactan
entre s y que condicionan la eficiencia del bombardeo de micropartculas y la
integracin del material gentico transferido. En consecuencia, al establecer un
protocolo de transformacin, es necesario optimizar cada parmetro en forma
independiente, priorizndolos por la magnitud de sus efectos, y luego determinar sus
interacciones en una escala ms limitada. En la transparencia 58 se enumeran los
factores que influyen en la transferencia del ADN y los relacionados con las
construcciones genticas utilizadas. La transparencia 59 enumera los factores
biolgicos que condicionan la eficiencia de un ensayo biobalstico en relacin con el
tejido blanco a ser utilizado en la transformacin.
Desde la aparicin del primer dispositivo para bombardeo de micropartculas en los
aos 80, se han desarrollado diferentes caones gnicos con el objetivo de refinar la
tcnica, incrementando su seguridad, simplicidad y eficiencia. Adems, se procur
daar menos el tejido, aplicar una mayor aceleracin a las micropartculas y bajar los
costos de operacin. Los nuevos diseos incluyen en su mayora: a) el uso de una

fuerza impulsora reproducible y precisamente regulada; b) el uso de un macroproyectil

que permite acelerar a las micropartculas depositadas sobre su superficie. Adems,
en general, estos dispositivos incorporaron una cmara de vaco en la que se realiza el
disparo, lo que permite disminuir la desaceleracin de las micropartculas por el
rozamiento con el aire. La transparencia 60 enumera distintos sistemas de impulsin
basados en: a) explosin qumica de plvora seca; b) descarga de helio a alta presin;
c) descarga de aire, CO2 o N2 comprimido; d) descarga elctrica de alto voltaje y baja
capacitancia o de bajo voltaje y alta capacitancia; e) flujo de partculas o flujo de helio
a baja presin por aspersin; f) flujo de helio con can de precisin. La eleccin del
sistema de impulsin influye considerablemente en el nmero de partculas que
impacta por unidad de rea bombardeada. La figura de la transparencia 60 muestra el
can gnico original ideado por Sandford y colaboradores.
El can gnico desarrollado inicialmente en la Universidad de Cornell (transparencia
56) operaba de forma similar a una pistola, en la que un macroproyectil acelerado por
explosin de plvora liberaba una salva de microproyectiles metlicos revestidos de
ADN en el interior de las clulas blanco. Los primeros bombardeos se efectuaron con
microproyectiles de tungsteno de 4 m de dimetro suspendidos en H2O, depositados
sobre un macroproyectil de Tefln. El macroproyectil era acelerado por explosin de
plvora a una velocidad de unos 800 m/seg hacia las clulas blanco situadas a 10-15
cm de la salida del can. Como se muestra en el esquema, luego del impacto, el
macroproyectil quedaba retenido en una placa de retencin ubicada en la extremidad
del tubo de aceleracin. Los microproyectiles eran impulsados hacia el tejido blanco a
travs de un orificio existente en la placa. Aunque el modelo de plvora permiti la
transferencia de ADN a diferentes especies, las dificultades para controlar la potencia
del disparo en forma reproducible y el dao fsico provocado a las clulas limit el
nmero de transformaciones estables.
Entre las modificaciones ms notables introducidas al diseo de los caones gnicos
figura el reemplazo de la carga de plvora por presin de gas para generar el impulso
de las micropartculas. El primer dispositivo que utiliz esta forma de impulsin fue el
can PDS-1000 de Dupont, basado en una descarga de helio o nitrgeno
comprimido. El modelo ms utilizado en la actualidad es el can de alta presin de
helio PDS-1000/He, el que fue patentado por Dupont y es comercializado por la
compaa BioRad (transparencias 61 y 62). El mismo consta de los componentes
necesarios para la transferencia de alta presin de helio (regulador del helio, vlvula
solenoide, tubos conectores, membrana de ruptura), de un componente portador del
macroproyectil y de una cmara principal en donde se bombardea el tejido blanco en
condiciones de vaco parcial. Al accionar el sistema, se establece vaco dentro de la
cmara de disparo y el helio es liberado hacia la misma luego que la membrana de
ruptura se rompe por exceso de presin. El movimiento del helio a alta velocidad
impulsa el macroproyectil que porta las micropartculas recubiertas de ADN, las que
son as aceleradas hacia el tejido blanco. Este dispositivo asegura una aceleracin
reproducible de las micropartculas y los tejidos resultan menos daados que en el
caso de los caones impulsados por plvora.
Las transparencias 63-64 ilustran los distintos pasos del procedimiento de bombardeo.
El primer paso involucra la preparacin de las micropartculas, la precipitacin del ADN
sobre las mismas y el ensamblaje de las distintas partes del can que comprenden el
sistema de impulsin de los microproyectiles. Para ello, se desenrosca el soporte de la
membrana de ruptura, se escoge una membrana de ruptura del espesor apropiado y
se la coloca en el soporte correspondiente. A continuacin, se ajusta el soporte al
extremo del tubo de salid de gas. El espesor de la membrana de ruptura vara segn la
presin de helio con la que se quiera trabajar (existen membranas que van de los 300
psi hasta los 2.200 psi). La presin de ruptura determina el poder de la onda de

choque que impacta en la cmara. Si se incrementa la presin de helio, se incrementa

la aceleracin de las micropartculas y, en consecuencia, su penetracin en el tejido
blanco.
La transparencia 64 ilustra los pasos siguientes en la preparacin del can para el
bombardeo. Una vez que se ha colocado el macroproyectil sobre su respectivo retn,
se toma una alcuota de las micropartculas recubiertas de ADN y suspendidas en H2O
o etanol y se la deposita sobre el mismo. Cuando la alcuota se seca, el retn es
invertido (de manera tal que los microproyectiles queden enfrentados con las clulas
blanco) y colocado en el lanzador. En el mismo dispositivo, se agrega una malla de
retencin que frenar al macroproyectil luego de completar su desplazamiento. En
principio, cualquier material puede ser empleado como micropartcula transportadora
de ADN, siempre que sea de alta densidad, qumicamente inerte y de tamao y
formato adecuados. Las micropartculas metlicas de oro o tungsteno son las ms
utilizadas. Las de tungsteno son de formato irregular, de tamao de 0,2 a 3 m. Su
costo es bastante reducido, por lo que son comnmente elegidas. Sin embargo, son
potencialmente txicas para algunos tipos de clulas y estn sujetas a oxidacin
rpida, con la consecuente degradacin del ADN. Las micropartculas de oro son
biolgicamente inertes, de formato redondeado y de tamao ms uniforme de entre
0,6 a 3 m. Su principal desventaja es su alto costo. Las caractersticas mencionadas
deben ser evaluadas en distintos tipos de clulas blanco de modo de optimizar el
proceso de bombardeo.
La transparencia 66 muestra un esquema de los parmetros que pueden variarse en el
dispositivo de un can gnico y de las relaciones existentes entre las principales
variables y la velocidad de los microproyectiles. En cada bombardeo realizado con el
can PDS1000/He, la velocidad que alcanzan los microproyectiles es condicionada
por: a) la presin de helio elegida; b) la presin negativa alcanzada en la cmara de
disparo; c) la distancia (A) entre la membrana de ruptura y el macroproyectil; d) la
distancia (B) de desplazamiento del macroproyectil desde su posicin original hasta el
impacto contra la malla de retencin; e) la distancia (C) de desplazamiento de los
microproyectiles desde la malla de retencin hasta el tejido. Variando la presin y las
distancias (A, B y C), se puede modificar la velocidad de los microproyectiles, lo que
permite optimizar los protocolos segn el objetivo de transformacin y tejido blanco.
Existen modelos alternativos al can PDS 1000/He que permiten regular la presin
del gas a la cual se desea producir el bombardeo. La regulacin se efecta por medio
de una vlvula elctrica, dentro de un rango de presiones de 200 a 1500 psi. Al
accionar un control elctrico, la fuerza electromagntica generada por un solenoide
produce el desplazamiento de una aguja que perfora las membranas de ruptura
permitiendo la salida del helio (en contraste con el can PDS1000/He en que la
membrana de ruptura se rompe pasivamente por exceso de presin). El dispositivo
que se muestra en la transparencia 67 fue desarrollado en EMBRAPA-CENARGEN
(Brasil) y ha sido utilizado exitosamente en la transformacin de Glycine max,
Phaseolus vulgaris, Gossypium hirsutum, entre otros.
El Genebooster (transparencia 68) es otro tipo de can gnico, producido por ELAK
(Budapest) y desarrollado por el Centro de Biotecnologa Agrcola del Instituto de
Ciencias Vegetales de Hungra. Mediante este dispositivo, las partculas son
impulsadas hacia el tejido blanco por liberacin de nitrgeno comprimido a alta
presin. En este caso, los controles de presin y vaco se encuentran en una unidad
separada de la cmara de disparo. El proceso de disparo es controlado por un sistema
electrnico automtico. La energa del disparo es ajustada segn el espesor de la
pared celular del tejido blanco. Los ajustes de los parmetros de cada disparo pueden
ser archivados por una computadora conectada al dispositivo. Este can ha sido

usado con xito en la transformacin de Oryza sativa y tambin para obtener

expresin transitoria en estudios de promotores especficos para diferentes tejidos
(hoja, hipoctilo, embrin, escutelo, callo, cotiledn) de varias especies vegetales.
Entre sus ventajas, pueden mencionarse: a) control automtico de los disparos; b)
registro computarizado de los ajustes de cada disparo; c) control continuo de la
energa de disparo; d) alta penetracin a travs de paredes celulares; e) alta
frecuencia de transformacin en especies recalcitrantes; f) bajo costo (gas barato,
placas de retencin reciclables).
En 1996 hizo su aparicin la pistola gnica de mano como una alternativa al can
PDS 1000/He. En contraste con los caones gnicos convencionales, en que el
tamao del tejido blanco est limitado por el tamao de la cmara y el explanto es
sujeto a vaco durante el bombardeo, este nuevo diseo no requiere vaco, permite
trabajar con virtualmente cualquier tipo de clulas o tejido blanco y provee una
herramienta para transformar organismos in vitro o in vivo. El instrumento que se
muestra en la transparencia 69 es comercializado por la compaa BioRad. La pistola
trabaja con microproyectiles de oro recubiertos de ADN o ARN que son precipitados
en la pared interna de un cartucho de plstico y acelerados por un flujo de helio a
presin. Es posible preparar 50 cartuchos a la vez conteniendo cantidades conocidas
de microproyectiles, los cuales pueden conservarse hasta dos meses previos a su
utilizacin. Los cartuchos se colocan en un soporte (figura C), el cual se ensambla en
la pistola y se dispara. El sistema es rpido, verstil y permite la co-transformacin con
ms de un transgn. En la prctica los dos sistemas de helio, el can PDS1000/He y
la pistola Helios, se complementan, dado que en el primero el vaco provee
condiciones ambientales ms controladas en su cmara de disparo, mientras que el
ltimo permite trabajar con una amplia variedad de tejidos o clulas blanco, incluidos
organismos vivos. La transparencia muestra la pistola gnica (figura A), el porta
cartuchos (figura C), y un dispositivo (figura B) utilizado para preparar hasta 50
cartuchos por vez. El esquema inferior muestra el diseo interno de la pistola gnica.
La pistola gnica constituye una valiosa herramienta para transferir ADN o ARN en
organismos vivos sin utilizar cmara de vaco. Debido a que la pistola puede ser
dispuesta muy cerca del tejido a ser bombardeado, la trayectoria de las partculas es
reducida y la desaceleracin por friccin es muy baja. Estos cambios reducen el
trauma en tejidos frgiles y facilitan las manipulaciones. Sin embargo, los parmetros
de bombardeo deben ser ajustados de acuerdo con el tipo de tejido blanco. Algunos
reportes mencionan que una desventaja del sistema es la poca reproducibilidad entre
experimentos. Sin embargo, este problema es frecuente en todos los sistemas de
bombardeo de partculas. Algunos autores recomiendan tomar recaudos especiales
para controlar mejor este problema, tales como trabajar con material vegetal crecido
en las mismas condiciones o utilizar explantos de misma edad fisiolgica.
La expresin transitoria temprana de genes reporteros es extremadamente til en el
monitoreo de la eficiencia de transferencia gnica y en el ajuste de los parmetros de
bombardeo. Asimismo, la expresin transitoria es sumamente utilizada para estudios
de regulacin y funcin gnica, especificidad de promotores, etc. Las figuras de la
parte superior de la transparencia 71 muestran la expresin transitoria del gen uid A en
embriones inmaduros de centeno. Las diferencias en la expresin del gen se
relacionan con el uso de diferentes cantidades de microproyectiles para el bombardeo:
(figura A) 200 g; (figura B) 100 g; (figura C) 30 g. Las figuras de la parte inferior
muestran la diferencia de expresin transitoria del gen uid A observada en hojas de
Arabidopsis thaliana bombardeadas con una pistola gnica Helios (presin de disparo,
75 psi) usando 125 g de micropartculas de oro y 1 g de ADN por disparo; con o sin
malla difusora de micropartculas (A y B respectivamente).

El Geneboy es una pistola de mano ELAK (Budapest) y desarrollado por el Centro de

Biotecnologa Agrcola del Instituto de Ciencias Vegetales de Hungra. Mediante este
dispositivo las micropartculas son impulsadas hacia el tejido blanco por liberacin de
CO2 a presin. Pueden utilizarse contenedores manuales de gas de diferente
capacidad para mltiples disparos. Esta pistola se ha utilizado con xito en la
produccin de plantas transgnicas de maz. Este sistema permiti la transferencia de
ADN in vivo en tejidos meristemticos de especies leosas como durazno, manzana,
etc. Entre sus ventajas ms importantes, caben mencionar: a) bajo costo; b) no
requiere uso de cmara de vaco; c) alta eficiencia de penetracin a travs de paredes
celulares; d) alta frecuencia de transformacin en especies recalcitrantes; e) fcil
manejo en condiciones de campo.
Otro sistema biobalstico alternativo se basa en la tecnologa ACCELL, desarrollada
por la compaa Agracetus para permitir el mximo de flexibilidad de ajuste, blanco y
penetracin celular. Esta tecnologa involucra el uso de una descarga elctrica a alto
voltaje para evaporar una gota de H2O. Los microproyectiles recubiertos de ADN son
dispuestos sobre un disco de metal (macroproyectil) y posicionados en una cmara de
vaco (transparencia 72). Una expansin explosiva generada por la descarga elctrica
(aproximadamente 14 kV desde un capacitor de 2 F) en una gota de agua acelera el
complejo macroproyectil-microproyectiles hacia las clulas blanco. La penetracin del
tejido blanco puede ser finamente regulada variando la intensidad de la descarga
elctrica. Mediante este procedimiento, las partculas pueden ser dirigidas a una capa
especfica del tejido. Esta capacidad es un atributo importante del sistema, an cuando
explantos idnticos de diferentes genotipos de la misma especie pueden requerir
diferentes condiciones de aceleracin para una ptima penetracin de las partculas.
La aceleracin provocada por la descarga elctrica reduce el impacto provocado en
las clulas blanco, en comparacin con los sistemas basados en propulsin por gases.
Sin embargo, a pesar de haber sido usado con xito en la transformacin de
numerosas especies y de las ventajas operativas del sistema, este sistema no ha sido
adoptado en forma generalizada para la transformacin de plantas.
Un dispositivo de bajo costo, que puede usarse como alternativa a los instrumentos
ms sofisticados, es el can de chorro de partculas (PIG; Particle Inflow Gun). El
mismo puede ser fcilmente construido en el laboratorio con medios relativamente
econmicos. Este can hace uso de una vlvula elctrica para generar un chorro de
helio a baja presin, el cual acelera las micropartculas dentro de una cmara de vaco
(28-30 pulgadas de Hg) y las proyecta hacia las clulas blanco. La micropartculas
recubiertas de ADN son dispuestas en una jeringa con filtro que se acopla a un
adaptador conectado a la vlvula solenoide. Este instrumento ha sido exitosamente
usado para transformar Glycine max, Zea mays, Manihot esculenta y Musa spp. Existe
una versin del PIG en el cual se ha eliminado la cmara de vaco y que se ha usado
para transformar Oryza sativa. A pesar del bajo costo del sistema, su uso no ha sido
tan difundido como el de los caones mencionados anteriormente.
Sautter et al. desarrollaron un diseo alternativo de can gnico que combina
caractersticas del mtodo de microinyeccin con la biobalstica. Fue ideado para el
bombardeo de meristemas apicales y permite apuntar el disparo en reas de 100 a
200 m de dimetro. El tejido blanco es montado sobre una capa de agarosa en una
gota de alginato. No utiliza macroproyectiles y el ADN no es precipitado con los
microproyectiles sino mezclado con los mismos y transferido en conjunto con los
mismos en una pequea gota de lquido desde un tubo capilar conectado a un tubo
Pitot. Para romper la gota, se usa un flujo de CO2 o de N2 a alta presin que forma un
aerosol y fuerza a las partculas a travs de una pequea apertura (aspersin de gotas
microscpicas). A partir de all, las partculas son aceleradas a travs de un capilar a

una cmara con vaco parcial en que se encuentra el tejido blanco. La longitud de este
ltimo capilar determina la velocidad de las partculas y su dimetro determina el rea
de impacto en determinadas condiciones de vaco, presin y distancia de trabajo. Los
parmetros de disparo pueden adaptarse dentro de un amplio rango. Un dispositivo de
enfoque permite dirigir las partculas a un meristema individual. Como se muestra en el
esquema de la derecha, el rea del blanco es determinada con una mira. En el mismo,
se observa el meristema apical de una plntula de cereal luego del bombardeo y la
distribucin de las partculas bajo la mira utilizada para apuntar el can. El rea
apuntada tiene un dimetro de 150 m. La segunda capa celular, que dar origen a las
clulas germinativas, se seala con el dibujo de los ncleos. Este sistema ha sido
utilizado en diferentes plantas como Triticum aestivum, Sorghum bicolor y otras
gramneas, aunque los resultados obtenidos no satisficieron las expectativas para lo
cual fue diseado.
La transparencia 73 muestra ejemplos de especies de monocotiledneas
transformadas por biobalstica, junto con el tipo de tejido blanco, genes reporteros y
genes marcadores de seleccin usados.
uid A: gen de la enzima -glucuronidasa de Escherichia coli.
cat: gen de la enzima cloranfenicol acetiltransferasa de Escherichia coli
luc: gen de la enzima luciferasa de Photinus pyralis
bar: gen de la enzima fosfinotricina acetiltransferasa de Streptomyces hygroscopicus
csr-1/als: gen de una forma alterada de la enzima sintasa del cido acetohidroxil, tambin
conocida como acetolactasa sintasa, de mutantes de Arabidopsis thaliana.
hpt: gen de la enzima higromicina fosfotransferasa de Escherichia coli.
npt II: gen de la enzima neomicina fosfotransferasa II de Escherichia coli.

A diferencia de la transformacin va Agrobacterium, los procedimientos de

transformacin por biobalstica no requieren el uso de vectores especiales. Como
fuente de ADN para el bombardeo, es posible utilizar los plsmidos comnmente
usados en las manipulaciones de ingeniera gentica conteniendo las construcciones
genticas de inters. En algunos casos, se ha obtenido mayor eficiencia de
transformacin cuando los plsmidos son linealizados. El promotor ms ampliamente
utilizado para inducir la expresin de genes en plantas es el promotor constitutivo 35S
del virus del Mosaico de Coliflor (CaMV; Cauliflower mosaic virus). Generalmente, este
promotor brinda altos niveles de expresin en dicotiledneas. Sin embargo, no ocurre
lo mismo en monocotiledneas, en las que se utilizan en forma alternativa promotores
como el del gen ubi1 (ubiquitina) de maz y el del gen act1 (actina) de arroz. La tabla
de la transparencia 74 muestra ejemplos de promotores utilizados en la transformacin
de cereales y de sus actividades relativas.
Emu: Promotor modificado de alcohol deshidrogenasa de maz
Act1-Act1 intrn1: Promotor e intrn de actina de arroz
Ubi1-Ubi1 intrn: Promotor e intrn de ubiquitina de maz
35S: Promotor de 35S de CaMV
35S-Adh1 intron 1: Promotor de 35S de CaMV e intrn de alcohol deshidrogenasa de maz

La transparencia 75 muestra ejemplos de especies de dicotiledneas transformadas

por biobalstica junto con los tejidos blanco, genes reporteros y genes marcadores de
seleccin que demostraron ser eficientes.
uid A: gen de la enzima -glucuronidasa de Escherichia coli
gfp: gen de la protena de fluorescencia verde de Aequorea victoria
bar: gen de la enzima fosfinotricina acetiltransferasa de Streptomyces hygroscopicus
hpt: gen de la enzima higromicina fosfotransferasa de Escherichia coli
npt II: gen de la enzima neomicina fosfotransferasa II de Escherichia coli.

csr-1: gen de una forma alterada de la enzima sintasa del cido acetohidroxil, tambin conocida
como acetolactasa sintasa, de mutantes de Arabidopsis thaliana.

Al elegir un tejido blanco para la transformacin por biobalstica, nuevamente debe

tenerse en cuenta la capacidad de la especie de inters para regenerar in vitro. Entre
los explantos vegetales utilizados con mayor xito, se encuentran las suspensiones
celulares, meristemas, embriones en desarrollo, embriones maduros, embriones
somticos, primordios foliares, cotiledones y callos. En la transparencia 76 se
muestran algunos explantos comnmente usados en protocolos de biobalstica. Una
de las estrategias ampliamente utilizadas para favorecer la recuperacin de los tejidos
luego del bombardeo es la aplicacin de baos en antioxidantes para prevenir la
oxidacin de los explantos. Para facilitar el ingreso de los microproyectiles en el ncleo
celular, los explantos suelen ser cultivados en medios conteniendo sustancias
osmticas (como manitol) que provocan plasmlisis reversible de las clulas. As, la
menor turgencia de las clulas, hace que las mismas resulten menos daadas por el
impacto de los microproyectiles. Por otro lado, el pasaje de los explantos a medio
fresco previo al bombardeo aumenta la tasa mittica, favoreciendo as la integracin
del ADN forneo al genoma vegetal.
El bombardeo de micropartculas ofrece una alternativa altamente eficiente e
independiente del genotipo para la transformacin de Oryza sativa. A la fecha, han
sido transformadas ms de 40 variedades de arroz por esta tcnica. Los explantos
ms utilizados son embriones inmaduros y callos derivados de semillas. El antibitico
preferentemente usado como selector es higromicina. El procedimiento se basa en el
bombardeo de embriones inmaduros a partir de los cuales se obtienen callos en medio
selectivo. Estos callos puede dar lugar a la regeneracin de plantas transgnicas en
medios conteniendo los reguladores de crecimiento adecuados.
La transparencia 77 muestra resultados de transformacin de Oryza sativa utilizando
el sistema de bombardeo con micropartculas. En este caso, los explantos
bombardeados son callos embriognicos de 6 variedades de lite que expresaron
actividad GUS positiva 24 hs despus del bombardeo. Se les transfiri
simultneamente el gen bar y el gen hpt. Se obtuvieron plantas completas a partir de
callos cultivados en seleccin con higromicina y glufosinato de amonio. En las figuras,
se observan los callos embriognicos transformados, la expresin transitoria del gen
uid A en los mismos, y la regeneracin de brotes a partir de los callos en seleccin con
glufosinato de amonio.
La transformacin por biobalstica puede implementarse eficientemente no slo en el
caso del arroz, sino tambin en otras especies de monocotiledneas como Festuca
arundinacea. La transparencia 78 ilustra el procedimiento de transformacin de esta
especie basado en la induccin de callos embriognicos y en el establecimiento
posterior de suspensiones celulares embriognicas. Estas suspensiones celulares son
utilizadas como tejido blanco para la transformacin por biobalstica. Luego del
bombardeo, stas son puestas en seleccin con higromicina. En la transparencia se
diferencian las suspensiones celulares transgnicas (resistentes a la seleccin y de
color amarillento) de las suspensiones susceptibles a higromicina, de color marrn.
La biobalstica es una de las tcnicas ms ampliamente utilizadas en la transformacin
gentica de Glycine max (soja). Desde hace ms de 10 aos, se han documentado
numerosos eventos de transformacin por bombardeo de micropartculas que incluyen
el uso de distintos dispositivos de aceleracin como los caones PDS 1000/He, PIG, o
Accell, mencionados anteriormente. Las variedades transgnicas comerciales
tolerantes al herbicida glifosato han sido obtenidas por biobalstica. Los tejidos o
suspensiones embriognicas de soja, as como tambin los meristemas apicales son

los explantos ms utilizados en esta especie. En cuanto a los agentes de seleccin, el

antibitico higromicina y el herbicida imazapyr han sido reportados como los ms
eficientes. La transparencia 79 muestra diferentes etapas en el proceso de
transformacin de soja. Los cultivos embriognicos, derivados de cotiledones
inmaduros, fueron bombardeados con un can gnico PDS 1000/He y puestos en
medio de seleccin con higromicina. Aquellos explantos que sobrevivieron a la
seleccin, continuaron siendo cultivados a travs de diferentes estadios embrionarios
hasta su conversin en plantas completas. En la foto B puede observarse la expresin
transitoria del gen uidA en un ensayo histoqumico.
La biobalstica tambin ha sido un instrumento eficiente para la transformacin de
Manihot esculenta Crantz (mandioca) a partir de cotiledones. En la transparencia 80 se
observan cotiledones bombardeados (figura A) con un can gnico de chorro de
partculas (PIG), que expresan transitoriamente el gen uidA. A partir de los cotiledones
se obtuvieron brotes en seleccin con higromicina (figuras B y C), los cuales
regeneraron plantas completas (figuras D y E). Se constat la expresin estable del
gen uidA en hojas (figura F).
Las figuras de la transparencia 81 muestran la expresin transitoria del gen que
codifica la Protena de Fluorescencia Verde (GFP) en embriones somticos de Glycine
max (figuras A y B) y Triticum aestivum (figuras C, D y E) y la expresin estable del
mismo gen en hojas de Petunia hybrida (figura F). Todos los explantos fueron
bombardeados con un can gnico de chorro de partculas (PIG).
Junto con los mtodos basados en Agrobacterium tumefaciens, el bombardeo de
micropartculas es una de las tcnicas ms usadas para la transformacin gentica de
plantas. Asimismo, el bombardeo con micropartculas se ha usado con xito para
transformar animales, microorganismos y organelas como cloroplastos y mitocondrias.
El mtodo es sumamente til para analizar la funcin y regulacin gnica, encarar
problemas que requieren expresin transitoria o integrativa, transferir ARN viral y
estudiar vas metablicas. Tradicionalmente se ha adherido el ADN a microproyectiles
de oro o tungsteno para ser transferido, pero tambin se ha hecho lo mismo con
bacterias, levaduras o fagos. Asimismo, se ha utilizado el sistema de bombardeo como
estrategia complementaria en la transformacin mediada por Agrobacterium para
provocar orificios en los tejidos blanco y facilitar as la entrada de la bacteria. Sin
embargo, las tcnicas de bombardeo presentan limitaciones tal como se discutir ms
adelante. Algunas especies oponen una resistencia natural a la penetracin de las
partculas, dada por cutculas endurecidas, paredes celulares lignificadas o superficies
vellosas. La principal limitacin del mtodo contina siendo la baja relacin entre el
total de clulas sometidas al bombardeo y el nmero de clulas que logran incorporar
de manera permanente el transgen.

Transferencia de ADN mediada por electroporacin y/o mtodos qumicos

Transparencias 83-93
Otro sistema de transferencia directa de ADN se basa en la permeabilizacin de las
membranas plasmticas de los protoplastos para favorecer el ingreso del material
gentico. Las paredes celulares representan barreras fsicas significativas para la
transferencia de ADN, mientras que los protoplastos, por tratarse de clulas
desprovistas de paredes celulares, constituyen un tipo de explanto blanco ms
apropiado. La obtencin de protoplastos requiere la incubacin de tejido vegetal en un
medio suplementado con enzimas fngicas pectocelulolticas para digerir las paredes
celulares, siendo necesario en algunos casos el agregado de hemicelulasas. Las

celulasas y hemicelulasas degradan la pared celular, en tanto que las pectinasas

digieren la matriz de pectina que mantiene adheridas a las clulas. El uso de enzimas
disponibles comercialmente posibilit el aislamiento de protoplastos de prcticamente
cualquier tejido vegetal, siempre que el mismo no est lignificado.
Luego de la digestin, los protoplastos deben ser aislados y lavados. Por otro lado,
con el objetivo de optimizar la transferencia de ADN a protoplastos, se utilizan distintas
tcnicas que incrementan la permeabilidad de las membranas plasmticas. Es comn
el uso de policationes tales como polietilenglicol (PEG), polivinil alcohol (PVA) y DEAdextrano que actan como fusgenos e incrementan la endocitosis del ADN debido a
que sus cargas positivas interaccionan con las cargas negativas del ADN y de la
membrana plasmtica. Adems del uso de fusgenos, los tratamientos con Ca2+ y
calor pueden incrementar la precipitacin del ADN. La obtencin de la primera planta
transgnica viable derivada de protoplastos de Nicotiana sp. se report en 1984. La
transformacin de protoplastos en soluciones que contienen PEG provee frecuencias
relativamente bajas de plantas transgnicas. Sin embargo, debido al gran nmero de
clulas disponibles en estos sistemas, si se dispone de buenos mtodos de seleccin
y de protocolos de regeneracin eficientes, es siempre posible obtener plantas
transgnicas. Una contribucin a la transformacin mediada por PEG fue la fusin con
liposomas. En este caso, el ADN es previamente incorporado a liposomas, a partir de
las cuales es transferido a las clulas. Los liposomas estn constituidos por lpidos de
carga neutra similares a los que componen la membrana plasmtica y pueden ser
producidos en diversos tamaos. El ADN es empaquetado in vitro y luego transferido a
los protoplastos. Para hacer ms eficiente la fusin se utilizan tratamientos con PEG u
otros policationes. Aunque el sistema es muy laborioso y la eficiencia de
transformacin es baja, se ha reportado la obtencin de plantas transgnicas de
tabaco y trigo por esta tcnica. La transparencia 84 muestra un esquema
representativo del aislamiento y purificacin de protoplastos de hojas de Nicotiana
tabacum. Las hojas cosechadas son puestas en contacto con la solucin enzimtica
durante 16 h, al cabo de las cuales se procede a separar los protoplastos del tejido no
digerido.
Un mtodo alternativo para permeabilizar las membranas celulares y facilitar el ingreso
del ADN es la electroporacin, la que consiste en exponer a las clulas vegetales a
intensos campos elctricos para provocar la apertura de poros y promover la captura
del ADN. Los protoplastos se obtienen siguiendo los pasos mencionados en la
transparencia anterior, se incuban luego en una solucin buffer conteniendo el ADN
(plsmido con el gen de inters y el gen de seleccin) y son expuestos a pulsos
elctricos de alto voltaje y de duracin variable. El campo elctrico causa la formacin
de poros reversibles en la membrana plasmtica, permitiendo as el pasaje de ADN a
la clula. Se han determinado las condiciones ptimas para la transformacin de
clulas de distintas especies, incluyendo la intensidad del campo elctrico, la densidad
de protoplastos y la composicin del buffer de cultivo. La electroporacin sola no
produce altas tasas de transformacin, pero la eficiencia puede incrementarse
acoplndola al uso de policationes como el polietilenglicol (PEG). La transformacin
por electroporacin ha sido documentada en una amplia variedad de especies y tipos
de tejidos, pero la disponibilidad de protocolos de regeneracin de plantas enteras a
partir de protoplastos resulta una limitante en la mayor parte de los casos. La
transparencia 85 muestra los pasos a seguir para la transformacin de protoplastos de
tabaco por electroporacin. Se muestran tambin distintas tipos de cubetas y
electroporadores comerciales.
La transparencia 86 muestra distintas fases del cultivo de protoplastos electroporados
con un gen que confiere resistencia a kanamicina y de la regeneracin de plantas de
Nicotiana tabacum a partir de los mismos. A: protoplastos luego de la electroporacin;

B: protoplastos cultivados en divisin; C: protoplastos formando callos en medio con

kanamicina (izquierda) y sin kanamicina (derecha); D: plantas en medio de
enraizamiento con kanamicina (planta resistente a la izquierda y planta no resistente a
la derecha); E: plantas floreciendo; F: germinacin en medio selectivo. Las plantas
transgnicas continan desarrollndose mientras que las no transgnicas se tornan
clorticas.
La transparencia 87 muestra un esquema de la transformacin de protoplastos de
Oryza sativa por electroporacin. En este protocolo, la formacin de callos de los
cuales se obtienen los protoplastos se induce a partir de semillas. Luego de la
electroporacin, los protoplastos son cultivados en medio lquido junto a clulas
nodrizas de tabaco, las que han sido elegidas por su alta tasa mittica. Los factores
mitognicos secretados por las mismas inducen la divisin de los protoplastos. Como
se muestra en el panel inferior, los protoplastos pueden cultivarse mezclados con las
clulas nodrizas o separados de las mismas por membranas de tipo Millicell (filtro de
nylon, papel de filtro Millipore u hoja de celofn). Uno de los agentes selectores que
mejor actan en arroz es el antibitico higromicina. En este caso, se realiz una doble
seleccin con higromicina de los callos obtenidos a partir de protoplastos
electroporados antes de inducir la regeneracin de plantas completas.
Es tambin posible co-transformar protoplastos por electroporacin. En la
transparencia 88 se muestra una etapa del protocolo de transformacin de
protoplastos de arroz con dos plsmidos diferentes. Uno de los plsmidos porta el gen
hmr de resistencia a higromicina y el otro, el gen de inters no seleccionable ms el
gen reportero uidA. Luego de la electroporacin, los protoplastos son cultivados en
medio suplementado con higromicina. Los protoplastos que resisten la seleccin son
cultivados en un medio con reguladores de crecimiento para estimular la regeneracin
de la pared celular y la divisin celular. Las clulas se dividen formando colonias y tras
sucesivos subcultivos en diferentes medios regeneran plantas completas por
organognesis o embriognesis. Un porcentaje considerable de los protoplastos
electroporados incorpora simultneamente el gen de resistencia a higromicina, el gen
de inters y el reportero y, en consecuencia, las plantas derivadas de stos poseen los
dos genes. Para diferenciar estas plantas de aquellas derivadas de protoplastos que
slo incorporaron el gen de seleccin, es necesario determinar la presencia de los
genes de inters en un anlisis posterior. Generalmente, esto se realiza utilizando la
tcnica de PCR e iniciadores especficos.
La transparencia 89 muestra fotografas del aislamiento, cultivo y electroporacin de
protoplastos de Citrus sinensis (naranjo dulce) obtenidos a partir de callos
embriognicos y del proceso posterior de regeneracin de plantas completas. Los
explantos expresan de forma transitoria y estable el gen de la Protena de
Fluorescencia Verde (gen gfp), el que ha sido utilizado como gen reportero.
La tabla de la transparencia 90 muestra ejemplos de especies vegetales
transformadas por mtodos qumicos (fusin mediante policationes, tratamiento con
liposomas) y/o por mtodos de electroporacin de protoplastos. Se informan los genes
de seleccin y los agentes selectores usados. Aunque la transformacin de
protoplastos resulta un mtodo relativamente simple y efectivo, no se utiliza con
mucha frecuencia, especialmente por la escasa disponibilidad de protocolos
optimizados para regenerar plantas a partir de protoplastos.
Si bien la electroporacin se utiliza como tcnica de transformacin de bacterias y
protoplastos, tambin ha sido empleada para transferir ADN a clulas o tejidos
intactos, es decir que presentan paredes celulares. Los explantos vegetales utilizados
en este caso pueden ser microesporas, polen, fragmentos de hoja, embriones, callos,

semillas o yemas. En algunos casos, los explantos son pre-tratados con soluciones
enzimticas (degradacin parcial de las paredes celulares) o heridos en forma
mecnica para facilitar la entrada del ADN. Se han reportado resultados positivos de la
transformacin de clulas o tejidos intactos por electroporacin de Oryza sativa,
Nicotiana tabacum, Triticum aestivum, Zea mays, Citrus sp, etc. La transparencia 91
muestra un dispositivo (figura A) usado para transformar embriones de Triticum
aestivum. La electroporacin se realiza en una cmara especial en la que los
embriones son montados en gotas de alginato sobre discos de agarosa (figuras B, C, y
D). Durante la electroporacin los embriones quedan en contacto con el buffer de
electroporacin enfrentados con el ctodo de la cmara de electroporacin (figura D).
La transparencia 92 muestra diferentes tejidos de Coffea arabiga (cafeto)
electroporados sin pretratamiento enzimtico (figuras A y B) y con pretratamiento
enzimtico (figuras C-F) en los que se observa expresin transitoria del gen uidA. Los
embriones somticos en estado de torpedo resultaron ser los explantos ms
apropiados para la transformacin por electroporacin. Este hecho se manifiesta en el
incremento de la frecuencia de expresin transitoria del gen uidA y en un aumento de
la capacidad regenerativa de los embriones. El autor de este trabajo concluye que el
pretratamiento con enzimas facilita el ingreso del ADN.
La transparencia 93 muestra los resultados de la transformacin de pro-embriones de
Nicotiana tabacum mediante electroporacin sin previa permeabilizacin de las
membranas. Los pro-embriones expresan transitoriamente los genes reporteros uid A
y gfp.
Transformacin con whiskers de carburo de silicio
Transparencias 94-95
En 1990 se report una nueva tcnica de transferencia de ADN que utiliza fibras muy
finas, conocidas como whiskers, para generar orificios en las paredes celulares. Las
fibras ms utilizadas en este mtodo son cristales de carburo de silicio de 0,3-0,6 m
de dimetro y 10-100 m de longitud. Las fibras de silicio se agregan a una
suspensin conteniendo el tejido vegetal (por ejemplo suspensiones celulares,
embriones o callos) y ADN plasmdico, y luego se mezclan con un agitador tipo Vortex.
Como resultado de la agitacin, los whiskers penetran la pared celular y la membrana
plasmtica, permitiendo el ingreso del ADN. La eficiencia de la tcnica depende del
tamao de la fibra, los parmetros de mezcla (agitacin), la forma de los recipientes
utilizados, el material vegetal y las caractersticas de las clulas vegetales,
especialmente el espesor de la pared celular. Las principales ventajas de este mtodo
residen en su bajo costo y en la rapidez y sencillez con que pueden realizarse los
ensayos. Sus principales desventajas son la baja eficiencia de transformacin, la
disminucin de la capacidad regenerativa de los tejidos daados por el proceso y la
necesidad de trabajar con extrema precaucin debido a la toxicidad del carburo de
silicio para la salud humana. Aunque el proceso ha sido utilizado con callos friables,
este tipo de callo est limitado a unos pocos genotipos de maz y avena. Muchos
cereales producen callos embriognicos muy compactos y duros que no son
fcilmente transformables por este mtodo. Sin embargo, se han introducido mejoras a
la tcnica que permitieron la transformacin transitoria y estable de Oryza sativa,
Triticum sp., Hordeum vulgare, Zea mays, Nicotiana tabacum, Lolium multiflorum,
Lolium perenne, Festuca arundinacea y Agrostis stolonifera, sin necesidad de iniciar
suspensiones celulares. La transparencia 95 muestra la transformacin de
suspensiones celulares de maz con whiskers de carburo de silicio. Las suspensiones
celulares fueron puestas en una solucin conteniendo los whiskers y el ADN

plasmdico portando los genes uidA y bar. La mezcla fue agitada con la ayuda de un
dispositivo de tipo Vortex (figura A). La incorporacin del ADN fue corroborada por la
expresin transitoria del gen uidA (figura B). Las clulas transformadas formaron callos
en seleccin con fosfinotricina (figura C) y regeneraron plantas transgnicas (figuras D,
E y F). El tratamiento con herbicida revel que las plantas han heredado el gen bar en
forma mendeliana (figura F). Este trabajo fue el primero en que se report la
produccin de plantas transgnicas mediante whiskers de carburo de silicio.
Transferencia de ADN por microinyeccin
Transparencias 96-99
La microinyeccin es un mtodo de transferencia directa, mediante el cual se inyecta
ADN en las clulas utilizando pipetas microcapilares de vidrio bajo control
microscpico. Esta tcnica se utiliz por primera vez en clulas animales durante los
aos 40, cuando se hizo posible la generacin y manipulacin de microagujas, y su
uso se extendi posteriormente a las clulas vegetales. La tcnica requiere de un
micromanipulador y se realiza bajo microscopio. Durante la transferencia de ADN,
cada clula es inmovilizada con una pipeta succionadora. Las clulas microinyectadas
se dejan recuperar en una gota de medio suspendida en una cmara hmeda y,
posteriormente, son cultivadas in vitro para regenerar plantas. La microinyeccin fue
ideada principalmente para la transformacin de grandes clulas animales, como las
huevas de los peces. Sin embargo, se han desarrollado protocolos para microinyectar
ADN en protoplastos, cultivos embriognicos, clulas en suspensin y estructuras
multicelulares vegetales. La microinyeccin de protoplastos requiere inmovilizar a los
mismos en gotas de alginato, polilisina o agarosa. La microinyeccin presenta varias
ventajas: a) requiere pequeas cantidades de ADN; b) puede aplicarse virtualmente a
cualquier tipo de clula; c) permite la inyeccin conjunta de ADN con otras molculas
biolgicamente activas; d) permite regular el nmero de molculas a transferir; e)
puede monitorearse a las clulas blanco durante y despus de la transferencia de
ADN; f) permite la introduccin no slo de ADN sino tambin de cromosomas dentro
de las clulas. Por todas estas caractersticas, constituye un mtodo muy aplicable al
estudio de funciones celulares y de la fisiologa de plstidos. Sin embargo, su
aplicacin a la transformacin de plantas ha sido muy limitada hasta el presente
debido a las dificultades para penetrar la pared celular mediante micropipetas e
inyectar el ncleo celular (generalmente la vacuola celular ocupa un volumen
preponderante). La presin de turgencia de las clulas vegetales suele dificultar
tambin el procedimiento de inyeccin. Utilizando este mtodo, se han obtenido
plantas transgnicas de Nicotiana tabacum, Petunia sp., Brassica napus y Hordeum
vulgare.
La microinyeccin de fluorocromos, anticuerpos, protenas y material gentico es
ampliamente utilizada por los bilogos a pesar de sus desventajas relacionadas con la
insercin de microcapilares. En clulas pequeas, el sellado de la membrana
plasmtica alrededor de la herida provocada por la punta de la pipeta (alrededor de 0,7
m de dimetro) es a menudo incompleto. Adems, en la mayora de las clulas
vegetales y en algunos casos de animales la alta presin celular exacerba los
problemas de sellado, despus de la penetracin de la pipeta la presin celular se
distiende porque los lquidos celulares son forzados a entrar al capilar.
Desafortunadamente en clulas vegetales muy turgentes como elementos de plantas
superiores, la prdida de presin celular es acompaada por un drstico cambio en la
ultraestructura celular. Sin embargo, la prdida de ultraestructura no ocurre cuando las
clulas son tratadas con capilares de 0,1 m. En comparacin con los capilares
convencionales, esta minscula punta de pipeta reduce el dao celular y la prdida de

turgencia. Aparentemente, las fuerzas fsicas en esta punta extremadamente fina

amortiguan la turgencia celular previniendo cambios bruscos de solutos. Sin embargo,
la inyeccin de material a travs de capilares de alrededor de 0,1 m de dimetro
requiere de alta presin para superar la resistencia al penetrar la clula. En tal sentido,
las formas convencionales de ejercer presin resultan insuficientes debido a que no
producen la presin adecuada o no permiten un control preciso sobre la extrusin de la
muestra.
En la transparencia 98 se muestra el diagrama de una femtojeringa (figura C) que
permite introducir muestras del orden de femtolitros en clulas y organelas con un
mnimo dao. El mtodo de microinyeccin que utiliza esta microjeringa se basa en la
expansin inducida por calor de un metal lquido (galistn: galio, indio y estao) dentro
de la pipeta para forzar la muestra desde la punta microcapilar y es adecuado para la
transferencia de fluorocromos y construcciones de ADN en cianobacterias y organelas
subcelulares. En la figura D se observa el sostn y calentador con la bomba y la
resistencia que genera la energa necesaria para expandir el metal. Tambin se
observan dos fotos (figura A y B) donde se compara una punta de pipeta convencional
con la punta de la femtojeringa. Finalmente, y a modo de ejemplo de su uso y
resultados, se presentan fotos con imgenes de microscopa confocal de Lucifer
yellow inyectada en una cianobacteria, en cloroplastos de Vicia faba y en el ncleo de
clulas de Xenopus distal.

Biobalstica versus Agrobacterium tumefaciens?

Transparencia 100
La transformacin gentica de plantas se remonta a principios de los aos 80, dcada
en que se demostr la capacidad del Agrobacterium para transferir ADN a clulas
vegetales. Durante las dcadas siguientes, se realizaron avances significativos en
mejorar los sistemas basados en Agrobacterium, as como en desarrollar nuevos
mtodos que permitieron la transferencia directa de ADN. Entre estos ltimos, se
incluyen mtodos como el bombardeo de micropartculas (biobalstica), la
permeabilizacin de membranas celulares por corrientes elctricas (electroporacin)
y/o por tratamientos qumicos con policationes (PEG, PVP) o fusgenos lipdicos, la
abrasin con fibras de carburo de silicio y la microinyeccin. Si bien varios de los
sistemas de transferencia directa han resultado en aplicaciones exitosas, el
bombardeo de micropartculas es actualmente el ms ampliamente utilizado. Por otra
parte, aunque existen muchos reportes sobre el uso de virus como vectores,
Agrobacterium resulta el vector biolgico ms usado para la transformacin vegetal. La
biobalstica fue desarrollada como una alternativa para resolver la ausencia de
interaccin entre muchas especies vegetales y las distintas cepas de Agrobacterium.
Sin embargo, desde la dcada del 90, el uso de cepas supervirulentas de la bacteria
ha permitido la obtencin de plantas transgnicas en especies que hasta ese momento
no eran susceptibles a Agrobacterium y que, por el contrario, haban podido ser
transformadas por biobalstica. Por su parte, el uso de los caones gnicos est
limitado por la capacidad regenerativa de las clulas bombardeadas y por la
integracin estable del ADN. Adems, la biobalstica ha evidenciado una alta
frecuencia de integracin de secuencias re-arregladas y/o truncadas, como tambin la
insercin de mltiples copias del transgn, lo que redunda en una alta probabilidad de
ocurrencia de silenciamiento gnico. Por el contrario, el Agrobacterium produce
generalmente integraciones que involucran a una o a pocas copias del transgn. Este
aspecto ha determinado que, siempre que sea posible, la mayora de los
investigadores prefieran la tcnica basada en Agrobacterium. Sin embargo, deben
considerarse tambin las crecientes evidencias que muestran que la insercin del ADN

por la bacteria no es tan definida como se crea anteriormente. En este sentido, se ha

hallado que secuencias de ADN ubicadas fuera de los bordes de la regin T de
Agrobacterium pueden integrarse tambin en el genoma de la planta receptora.
Adems, la persistencia de Agrobacterium en los tejidos de las plantas regeneradas es
otro problema que an resta resolver y que tiene implicancias sobre aspectos de
bioseguridad. Por estas razones, aunque existe una tendencia a elegir el mtodo de
Agrobacterium para transformar plantas, tanto ste como la biobalstica seguirn
constituyendo sistemas complementarios durante muchos aos.