1783422030.guía de Laboratorio de Bioquímica 2013A

1
Gua de Laboratorio de Bioqumica General
L.D. Caicedo
GUA DE LABORATORIO DE
BIOQUMICA
Por: Luz Dary Caicedo Bejarano
Universidad Santiago de Cali

Facultad de Ciencias Bsicas
Programa de Qumica
2013
L.D. Caicedo
INTRODUCCIN AL TRABAJO EN EL LABORATORIO

De: RIASCOS, M. NAVIA, C.G. Prcticas de laboratorio de qumica general. Universidad
del Valle, Departamento de Qumica. 2000.
NORMAS DE SEGURIDAD:
l llegar al laboratorio, conozca donde se localiza la fuente de agua, la ducha, los
extintores y las salidas de emergencia. Aprenda a usarlos adecuadamente y no dude en

utilizar este equipo si es necesario. Es importante reiterar al iniciar la practica de
laboratorio los seguros de las puertas que son acceso a las salidas de emergencia.
Utilice la ducha de seguridad si su ropa se incendia o si sobre su ropa se derrama gran
cantidad de un reactivo corrosivo. Qutese de inmediato la prenda afectada. El pudor no
cuenta en ese momento, solo cuenta la rapidez con la cual usted enfrente el problema.
2. Antes de entrar al laboratorio adems de tener presente las normas de seguridad es
importante que lea muy bien la gua, realice un diagrama de flujo y consulte la
peligrosidad y modo de empleo de los reactivos a utilizar. Sea consciente de los riesgos
que corre al realizar determinados procedimientos en el laboratorio, sea prevenido y
actu con cautela. Destine una libreta para el curso del laboratorio en la cual consignara
toda la informacin que debe conocer y manejar antes, durante y despus de las
practicas de laboratorio.
3. Vstase adecuada y cmodamente el da de laboratorio. Evite ropa inflamable. Use
pantaln largo y preferiblemente de algodn. No lleve anillos ni pulseras durante el
tiempo que dure el laboratorio. Pngase calzado con suela antideslizante, no utilice
sandalias que dejen los dedos destapados. Si su cabello es largo utilice un gancho para
sujetarlo. En todo momento utilice bata de laboratorio completamente abotonada, esta
puede protegerlo de algunas quemaduras y evitar que sus ropas se deterioren por
salpicaduras de reactivos. Mantenga y lave su bata de laboratorio aparte de la ropa que
usa normalmente.
4. Proteja siempre en forma adecuada sus ojos. El riesgo de una lesin grave en los
ojos, obliga a que todos (estudiantes, profesores y visitantes) en el laboratorio lleven
siempre una proteccin adecuada, desde el inicio hasta el final de la practica. Los ojos
pueden sufrir daos irreversibles por salpicaduras de reactivos o esquirlas de vidrio que
vuelan en un accidente. MANTENGA PUESTAS LAS GAFAS DE SEGURIDAD aun
cuando usted no este realizando algo peligroso; sus vecinos pueden tener un accidente y
afectarlo a usted. Recuerde una pequea gotica de reactivo concentrado puede
ocasionarle la perdida de la visin.
En caso de que lleguen salpicaduras de reactivos lave inmediatamente con abundante
agua. Si solo un ojo es afectado, proteja el sano durante el lavado. Abra bien los
prpados y mueva el ojo afectado en diferentes sentidos, Avise a su instructor de
inmediato y acuda al mdico lo antes posible.
L.D. Caicedo
Nunca use lentes de contacto ya que las sustancias qumicas pueden penetrar por
capilaridad debajo de ellos por lo que no ser fcil de enjuagarlos.
5. Nunca trabaje solo sin supervisin en el laboratorio. No realice ningn experimento sin
previa autorizacin.
6. Mantenga su rea de trabajo limpia, seca y ordenada. Siga cuidadosamente las

instrucciones para el ensamble de equipo y antes de ponerlo en funcionamiento haga
que su instructor lo revise. Mantenga libros y objetos personales retirados del sitio de
trabajo. Ellos pueden interferir su labor y resultar peligrosos, si usted salpica o riega un
reactivo lmpielo rpidamente. Provase de un pedazo de dulce abrigo para la limpieza
de las mesas de trabajo.
7. Lea los rtulos de los reactivos cuidadosamente. El uso errneo de sustancias puede
causar serios accidentes. Evite contaminar los reactivos puros. Nunca devuelva el
exceso de reactivo a los frascos tome solo la cantidad que usted va a necesitar.
Rotule correctamente los envases de las soluciones preparadas para las practicas y de
los desechos producidos en las mismas. El rotulo debe contener en el caso de las
soluciones: Nombre, formula, concentracin, fecha de preparacin y persona
responsable. Y en el caso de los desechos: Nombre practica, fecha, composicin,
concentracin, persona responsable.
Los procedimientos para la recuperacin de desechos o su eliminacin previamente
inocuos sern realizados en un trabajo coordinado por su instructor.
8.La mayora de los productos qumicos del laboratorio son txicos; algunos ms txicos
que otros como soluciones concentradas de cidos y bases fuertes, corrosivos para la
piel. En el manejo de los productos qumicos, evite el contacto con la piel, ojos y mucosa
en todos los casos. Si ocurren salpicaduras sobre la piel elimnelas previamente con un
trapo seco y seguidamente lave inmediatamente el rea afectada con bastante agua fra;
en el caso de soluciones corrosivas la rapidez con que usted actu es factor importante
para evitar dao en la piel. Debido al peligro de reabsorcin, no use nunca solventes
orgnicos en el lavado
9. Evite las chanzas, juegos y manifestaciones de cario y visitas de sus amigos hasta
que termine la practica de laboratorio. No permita bajo ningn motivo la presencia de
nios en los laboratorios.
10. NUNCA INGIERA COMIDAS O BEBIDAS Y NUNCA FUME
LABORATORIO. Lave sus manos antes y despus de terminada la practica
EN
EL
11. Las lesiones ms comunes en un laboratorio de qumica son las cortaduras y

quemaduras. Descarte el material de vidrio que se ha resentido o quebrado y depostelo
en el lugar indicado para tal propsito. Pula con fuego las puntas cortantes de tubos y
varillas de vidrio. Nunca intente forzar la entrada de un tubo de vidrio o termmetro por el
agujero de un tapn. Previamente asegrese de lubricar con glicerina o agua jabonosa,
tubo y agujero. Proteja sus manos con varias capas de toalla o unos guantes resistentes
mientras inserta el vidrio o el material cortante en el tapn. Nunca toque con su piel
L.D. Caicedo
mallas de calentamiento, material de vidrio, aros y materiales de laboratorio que

previamente hayan sido sometidos a calentamiento. Si es necesario hacerlo usted
deber ser extremadamente cuidadoso de lo contrario podra ocasionarle quemaduras
muy graves.
12. Muchos qumicos que usted utiliza son txicos y pueden ocasionarle severas
quemaduras en las mucosas si usted los ingiere. Siempre utilice una pera de caucho
para succionar o extraer los lquidos con una pipeta, NUNCA UTILICE LA BOCA NI
PRUEBE UN REACTIVO.
13. Cualquier experimento en el cual se puedan producir humos txicos o irritantes,
deber realizarse dentro de la campana extractora (revisar su funcionamiento antes de
iniciar el procedimiento). Para probar el olor de una sustancia, coloque la boca del
recipiente alejada de su nariz, y con su mano ventilen poco los vapores hacia su nariz.
No inhale profundamente, olfatee suavemente.
14. Nunca agregue agua a un cido concentrado. Diluya el cido lentamente adicionando
el cido al agua con agitacin constante. Las bases debern ser diluidas en forma
anloga. Nunca mezcle los cidos concentrados con bases concentradas sin tomar las
precauciones del caso. Recuerde que se produce una reaccin fuertemente exotrmica.
15. Los mecheros pueden causar serias quemaduras. Encindalo solo cuando vaya a
utilizarlo. Previamente perctese que no hayan lquidos inflamables como alcohol,
benceno, ter o acetona. Estos debern encontrarse a una distancia prudencial. Nunca
use mechero para calentar lquidos inflamables. Use una malla de calentamiento
elctrico, una plancha o un bao mara.
16. Cuando caliente un liquido en un tubo de ensayo, coloque la boca del tubo lejos de
usted y de sus vecinos, hgalo en forma suave. Nunca caliente un liquido en un
recipiente completamente cerrado.
17. No agregue residuos qumicos a las canecas destinadas para desechos domsticos.
No emplee los vertederos para eliminar todo tipo de desechos como papel, pedazos de
vidrio, algodn, etc. Nunca arroje en el vertedero lquidos inflamables o voltiles,
sustancias corrosivas o compuestos que puedan producir vapores txicos mucho menos
sustancias slidas.
18. Al finalizar la practica de laboratorio, devuelva todo el equipo desarmado, limpio y
seco. Revise que las instalaciones hidrulicas y de gas estn cerradas. Equipos,
campanas de extraccin y extractores de pared estn apagadas.
PLAN DE EVACUACIN
econocimiento del lugar: Consiste en identificar los pasillos que conducen a las
salidas de emergencia, revisar que los seguros que tengan se puedan retirar fcilmente y
a cual lugar conducen.
2. Trazar la ruta de evacuacin desde la primera puerta hasta el lugar donde las
personas no corran riesgos.
L.D. Caicedo
3. Identificar en el grupo los lideres, estos deben ser personas que no sean nerviosas,
requiere personal que acte con calma pero rpido e inteligentemente. Ellos ayudaran a
calmar al resto de personas, y a conducirlas en orden por la ruta establecida.
4. Informar el plan al grupo de estudiantes y recomendarles:
Caminar rpido pero NO CORRER.
No empujar, ni armar desorden.
No gritar, el pnico lo siembra una sola persona y por lo general es contagioso.
Bajar con cuidado las escaleras de evacuacin.
No cargar implementos innecesarios en el momento de la evacuacin. Estos
pueden entorpecer el desplazamiento normal.
No devolverse por objetos u otras personas. De las personas que quedan se
encargan los lideres. El devolverse puede ocasionarle lesiones fsicas
irreversibles incluso prdida de la vida.
Personas inexpertas no pueden colaborar, en lugar de ayudar entorpecen la
labor. La mejor ayuda que cada persona puede aportar es evacuar en silencio
rpida y ordenadamente.
En caso de incendios evacuar de la siguiente manera: De ser posible humedecer
un pauelo o trapo y ponrselo en la nariz. Despejar el lugar arrastrndose por el
piso ya que a esta altura hay una capa de oxgeno(esta cantidad de oxgeno est
entre el piso y el humo).
REGLAMENTO PARA LA EVALUACIN DEL LABORATORIO
a calificacin correspondiente al trabajo en el laboratorio es individual. Esta
calificacin debe ser emitida al final de cada sesin de laboratorio, el estudiante tiene
derecho a conocerla inmediatamente y a efectuar reclamaciones en caso de no estar de
acuerdo con ella. Para colocar esta nota se debe tener en cuenta los siguientes factores:
El estudiante debe conocer, antes de iniciar el curso, el peso que el instructor le dar a
cada uno de estos factores.
Para emitir la nota de trabajo en laboratorio es indispensable que el instructor
interaccione fuertemente con el estudiante desde la primera sesin de laboratorio. Sin
una fuerte interaccin entre el instructor y el estudiante no se podr emitir una
calificacin correcta.
2. El informe de la prctica de laboratorio debe ser entregado por el estudiante a los
siete(7) das calendario siguiente a su realizacin. Es obligacin del instructor de
laboratorio dar a conocer a sus estudiantes la calificacin del informe y las
correspondientes correcciones dentro de los ocho (8) das hbiles siguiente a la entrega
por parte del estudiante.
3. Es obligacin del instructor de laboratorio hacer conocer a sus estudiantes, antes de
iniciar el curso, el tipo de informe de laboratorio que exigir y las pautas que seguir en
su calificacin.
L.D. Caicedo
4. El incumplimiento sin causa justificada con las prcticas o no entrega de los trabajos
acadmicos exigidos(informes de laboratorio en este caso), dentro de las fechas
establecidas, se sanciona con una calificacin de cero.
5. La copia de un informe de laboratorio de otro del mismo semestre o semestres
anteriores, es considerada como fraude y se sanciona con una calificacin de cero, en
ese informe.
FORMATO DE EVALUACIN DE LA PRCTICA DE LABORATORIO DE

BIOQUMICA
LABORATORIO # ___ TEMA: _______________________ GRUPO No. ____
FACTORES DE
EVALUACIN
NOMBRES DE LOS ESTUDIANTES QUE ASISTIERON A

LA PRCTICA
Destreza experimental
1.5 PUNTOS
Respuestas orales en
clase
Orden y aseo
0.5 PUNTOS
Cumplimiento del
horario
0.5 PUNTOS
Diagrama de flujo
1.5 PUNTOS
Iniciativa y creatividad
medidas de seguridad
1.0 PUNTO
Bata de laboratorio
Gafas
Otras observaciones
PAUTAS A SEGUIR EN LA PRESENTACIN DE INFORMES DE

LABORATORIO
uena redaccin, ortografa, normas generales en cuanto a unidades, abreviaturas
entre otras.
1. El informe se presentar en hojas de tamao carta con mrgenes segn las
normas tcnicas de ICONTEC.
L.D. Caicedo
2. El texto se copiar a doble espacio, iniciando los prrafos en el margen

izquierdo; las tablas y/o figuras irn numeradas en forma consecutiva con
nmero arbicos y llevarn un titulo lo ms breve posible. Ej: Figura 1
3. El contenido debe ser claro y conciso con respecto a la explicacin y anlisis de
los resultados obtenidos.
4. Todo informe debe incluir:
a. INTRODUCCIN: Comprende el planteamiento del problema, sin
desarrollar el tema ni dar conclusiones. Debe destacarse bases tericas
o prcticas del trabajo, objetivos, importancia. (vale 0.5/5)
b. PARTE EXPERIMENTAL: Publicar lo realizado, expresando en sus
propias palabras (Se aclara que no es transcribir el procedimiento que
aparece en las guas de laboratorio), indicando las variaciones a las
guas que se hayan tenido que hacer en el proceso. Los datos deben
presentarse en forma tabular donde sea permitido y tener en cuenta las
unidades SI para las mediciones. (Vale 1.0/5)
c.
RESULTADOS Y DISCUSIN: Esta es la parte ms crtica de su

informe. Recuerde que cada supuesto realizado debe ser explicado.
Deben aparecer las ecuaciones que haya aplicado. Recuerde que los
datos y resultados deben ir acompaados de sus unidades y reportarse
en forma tabular o grfica donde sea necesario. (Debe escoger la mejor
representacin). La discusin debe realizarse de acuerdo a los
resultados obtenidos en la prctica, haciendo un anlisis y dando las
posibles fuentes de error. (Vale 2.0/5)
d. CONCLUSIN: Ser el balance final de las prctica o investigacin. Se

presentaran en forma lgica, clara y concisa los resultados de la misma.
Un ltimo punto son las causas de error analizando su efecto sobre los
resultados obtenidos. (Vale 0.5/5)
e. ANEXO: Generalmente los informes tienen preguntas de consulta, aqu
deben aparecer estas respuestas. (Vale 1.0/5)
f.
NOTA: Durante todo su informe deben aparecer las llamadas para sus
citas bibliogrficas con nmeros arbigos en forma exponencial con lo
que dar los crditos respectivos en la seccin de bibliografa, que es la
ltima parte de su informe, la cual es obligatoria.
g. BIBLIOGRAFA: Segn las normas de ICONTEC para libros con autor,

libros con editor, publicaciones seriadas y normas tcnicas.
L.D. Caicedo
COLORIMETRIA Y ESPECTROFOTOMETRIA
De: PRIETO, S., AMICH, S., SALVE, M.L. Laboratorio clnico, principios generales. McGrawHill, Interamericana. 1. edicin. 1997.
FUNDAMENTOS TERICOS
1.
INTRODUCCIN
1.1.1
Naturaleza de la radiacin electromagntica
a radiacin electromagntica es una forma de energa radiante. Tiene propiedades
ondulatorias, propagndose en forma de ondas. En este fenmeno ondulatorio se

definen:
Longitud de Onda (): Se define como la distancia entre dos mximos de un ciclo
completo del movimiento ondulatorio. Esta distancia se expresa, segn el Sistema
-9
Internacional de Unidades (SI), en nanmetros (nm, 10 m). Se pueden encontrar
otras unidades, ya obsoletas, que serian ngstroms (A) y milimicras(m). La relacin
entre estas medidas es:
1nm =1m = 10 A = 10 9 m
Frecuencia (): Es el numero de ciclos por segundo. Es inversa a la longitud de
onda:
Siendo c = velocidad de la luz.

La luz esta formada de fotones, paquetes discontinuos de energa. La energa de un
foto depende de su frecuencia y de su longitud de onda:
E h *
h *C
Siendo h = constante de Plank (6,62* 10 27 erg/seg)

Como se puede observar en la relacin anterior, la relacin entre la longitud de onda
y la energa de una adicin electromagntica es inversa, de manera que cuanto
mayor es la longitud de onda de un haz de luz, menor es su energa.
L.D. Caicedo
El espectro electromagntico cubre un amplio intervalo de energa radiante,

incluyendo desde los rayos gamma, de longitud de onda corta, hasta ondas de radio,
de longitud de onda larga.
El espectro electromagntico se divide en regiones que abarcan intervalos de
longitudes de onda ms estrechos
ESPECTRO ELECTROMAGNTICO
Longitud de
Onda (nm)
Rayos
Gamma
(R8)
0,1
Longitud de Onda
180-220
220-340
340-430
430-475
475-495
495-505
505-555
555-575
575-600
600-620
620-700
Rayos X Ultravioleta Visible

(UV)
Infrarrojo Microondas
(IR)
750
180
Nombre de la regin
UV corto
UV
Visible
Visible
Visible
Visible
Visible
Visible
Visible
Visible
Visible
390
Color absorbido
No visible
No visible
Violeta
Azul
Verde-azul
Azul-verde
Verde
Verde-amarillo
Amarillo
Naranja
Rojo
400*10
Color complementario
-----------------------Amarillo-verdoso
Amarillo
Naranja
Rojo
Prpura
Violeta
Azul
Azul-verde
Verde-azul
1.1.2 Descomposicin del espectro en colores y sus complementarios.

El ojo humano responde a la radiacin electromagntica entre los 380 y 750 nm
aproximadamente, pero actualmente disponemos de instrumentos que suplen nuestra
limitacin. y permiten la medida de radiaciones de longitudes de onda mayores (IR) y
menores (UV).
La luz solar, o la luz emitida por un filamento de tungsteno, es una mezcla de radiaciones
de distinta longitud de onda que al ojo humano se reconoce como blanca.
En la regin visible, la luz se descompone en colores y sus colores complementarios. Si
hacemos incidir un haz de luz blanca sobre una solucin que absorbe luz a una longitud
de onda determinada, esta transmitir todas las dems longitudes de onda, apareciendo
a la vista del color complementario al que corresponde a la longitud de onda absorbida.
En consecuencia, una luz que se observa de un color determinado al ojo humano,
deber ser iluminada para las mediciones fotomtricas con un haz de luz de longitud de
onda del color que absorbe, es decir, el complementario.
Ejemplo: una solucin de color rojo se irradia con una luz de aproximadamente 500 nm.
10
L.D. Caicedo
1.2 Fenmenos de interaccin entre luz y materia

Cuando se produce una interaccin entre un haz de luz y la materia, se producen, entre
otros, fenmenos de absorcin o emisin energtica.
1.2.1 Proceso de absorcin. Cuando una pelcula, que se encuentra en estado de
reposo o estado fundamental interacciona con un haz de luz, absorbe energa, y pasa
a lo que se denomina estado excitado.
En la partcula se producen cambios que dependen de las caractersticas de la propia
partcula (tipo de enlaces, etc.)y de la energa (longitud de onda) de la luz que
interacciona.
La partcula en estado excitado tiende a regresar espontneamente a su estado
fundamental, desprendiendo la energa absorbida en forma de calor:
A0 h * A* A0 calor
0
Siendo A = absorbente en estado fundamental

A*= absorbente en estado excitado
h* =energa del fotn absorbido
h= constante de Plank
= frecuencia de la radiacin
1.2.2 Espectro de absorcin. Cada especie absorbente(cromgeno) tiene lo que se
llama un espectro de absorcin caracterstico. Este espectro representa la relacin entre
la longitud de onda incidente y la absorbancia que presenta una solucin de la especie,
en condiciones definidas de trabajo. Al grafico que resulta de representar en un eje de
coordenadas absorbancia (ordenadas) frente a excitacin de onda (abscisas) es a lo que
llamamos espectro de absorcin.
Los espectros de absorcin son de utilidad tanto para seleccionar la longitud de onda
ms adecuada para una medida cuantitativa (excitacin de onda a la que la excitacin es
mxima), como para fines de excitacin cualitativa.
Proceso de emisin. Algunos compuestos tienen la excitacin, tras ser excitados, de

retornar a su estado fundamental, excitacin una emisin de energa radiante. La luz
emitida se puede medir, y ello consiste el principio de algunas tcnicas, como la
Fotometra de llama, o la Fluorescencia.
A0 h * 1 A* A0 h * 2
Siendo A0= absorbente en estado fundamental
A*= absorbente en estado excitado
h * 1 = energa de excitacin
h * 2 = energa de emisin
11
L.D. Caicedo
1.3 Espectrofotometra de absorcin

La espectrofotometra de absorcin consiste en la medida de la radiacin que llega a un
detector tras producirse un fenmeno de absorcin de luz por parte de una sustancia
absorbente. En qumica clnica, el material en estudio es generalmente una solucin, y
las medidas se hacen ordinariamente dentro del espectro comprendido entre los 220 y
800nm
La expresin determinacin fotomtrica se defini originalmente como la medida de
una intensidad de luz, sin tener en cuenta la longitud de onda; por otro lado, se
denominaron determinaciones espectrofotomtricas a aquellas que median la
intensidad de la luz en un espectro de longitudes de onda mucho ms estrecho.
Hoy da, ya no constituyen una base valida para la distincin entre fotmetro y
espectrofotmetro la longitud de onda de medida: ambos aparatos se distinguen por el
sistema que poseen para seleccionar la longitud de onda medida; as, se conoce como
fotmetro o colormetro a aquel que emplea filtros, mientras que el espectrofotmetro
es aquel que emplea prismas o redes de difraccin.
Las determinaciones espectrofotomtricas han tenido un gran auge en los ltimos aos.
Sus principales ventajas son la sensibilidad relativamente elevada, la facilidad con que
permiten realizar determinaciones rpidas, y un grado de especificidad relativamente
alto. Todo esto, unido a su adaptacin en los auto analizadores, la hacen tcnica
imprescindible hoy por hoy en el laboratorio clnico.
2.
LEYES DE ABSORCIN
uando un haz de luz de intensidad lo incide sobre una cubeta cuadrada que
contiene una solucin coloreada que absorbe luz a una determinada longitud de onda, se
produce en la solucin un proceso de absorcin, y el haz de luz que sale despus de
atravesar la cubeta tiene una intensidad menor, Is:
Se define como transmitancia la relacin entre la luz incidente y la luz transmitida:
T= Is/Io
En la practica se define el porcentaje de transmitancia:
% T= Is/Io *100
Para evitar interacciones por parte del solvente o de la cubeta, y considerar as solo la
absorcin del compuesto de inters, hay que hacer una primera medida con una
solucin de referencia o blanco, que contiene todos los posibles compuestos que
participan en la lectura, menos el compuesto a medir.
Todas las medidas que se hagan con posterioridad sern referidas a que esta medida
inicial, y se deben hacer en la misma cubeta que se utilizo para la medida del blanco.
12
L.D. Caicedo
El valor experimental de la transmitancia, el de Absorbancia (A), ya que la relacin entre

la concentracin de una solucin y su transmitancia es inversa y logartmica y
concentracin mientras que la relacin entre la absorbancia y la concentracin es
directamente proporcional:
A log Is / Io log %T log 1 / T

100
log 100 log T
%T
A 2 log %T
log
De esta relacin matemtica se deduce que la relacin logartmica entre A y %T se

traduce en dos escalas:
%T va de 0 a 100.... Si %T 100 A 2 log 100 0

A va de a 0.... Si %T 0 A 2 log 0
En los aparatos que se usan hoy en da, las lecturas de %T son transformadas en
absorbancia y presentadas as al operador, pero conviene no olvidar que la absorbancia
no es en si misma una cantidad medible, sino que se obtiene por clculo matemtico a
partir de los datos de transmitancia que mide el sistema fotomtrico.
Si representamos grficamente en un eje de coordenadas la relacin entre absorbancia y
concentracin, observamos una lnea recta, y la proporcin es directa; la grfica
resultante de representar %T frente a concentracin es una curva, y la proporcin es
inversa; si empleamos papel semilogartmico, la grfica de %T frente a concentracin se
convierte en una recta.
Como hemos dicho, al aumentar la concentracin del compuesto absorbente en solucin,
ms luz es absorbida y menos transmitida, lo que se observa en las grficas.
La relacin entre las cantidades de absorbente en una solucin y el grado en que esta
solucin absorbe la luz, se encuentra regida por las Leyes de absorcin.
La Ley de Beer establece la relacin entre el grado de absorbancia de una solucin y
otras dos variables: la concentracin del absorbente y la longitud del trayecto que el
haz de luz recorre a travs de la solucin. Segn esta ley, la absorbancia de una
solucin es directamente proporcional a la concentracin y a la longitud del paso de luz:
Aa x b x c
Siendo: A = Absorbancia
a = coeficiente de absorcin
b = longitud del paso de luz en centmetros
c= concentracin de absorbente
Esta ecuacin constituye la base de anlisis cuantitativo de las determinaciones

espectrofotomtricas.
13
L.D. Caicedo
Los valores de absorbancia no tienen unidades. El coeficiente de absorcin es una

constante, relacionada con la naturaleza qumica del soluto, y tiene unidades recprocas
a, b, c.
El coeficiente de absorcin
a se denomina coeficiente de extincin molar,
representado con el smbolo cuando las unidades de b son centmetros y las de c son
moles / litro. El coeficiente de extincin molar es constante para un compuesto dado
cuando se fijan condiciones de longitud de onda, pH, solvente, temperatura, y otros
factores. Sus unidades son 1/mol x cm.
En la prctica, el significado del coeficiente de extincin molar es el siguiente: cuanto
mayor sea en una sustancia(cromforo) para unas condiciones de trabajo
determinadas, mayor ser la absorbancia de ese compuesto en esas condiciones de
trabajo y, por tanto, mayor ser la sensibilidad del mtodo que lo emplea.
(Para una
misma concentracin de cromgeno, si aumenta, A aumenta.)
La ley de Beer tiene una aplicacin prctica: determina los mtodos experimentales para
averiguar la concentracin de una sustancia de inters en una solucin. Basndonos en
la relacin lineal entre absorbancia y concentracin, podemos conocer la concentracin
de una solucin problema de dos maneras:
a. Por comparacin con una solucin conocida:
Si tenemos dos soluciones, P(problema) y S(estndar de concentracin conocida),
podemos establecer la siguiente relacin matemtica entre ellas:
As Cs
Ap
Cp Cs x
Ap Cp
As
Siendo:
Cp= concentraciones del problema;
Ap= absorbancia del problema;
Cs= concentracin de la solucin estndar
As= absorbancia la solucin estndar
Conocemos el valor de Cs, y para la serie de anlisis determinamos experimentalmente
el valor de As y el de Ap; con estos datos, calculamos el cociente Cs/As, estableciendo
as el valor de un factor, que es constante, y que multiplicado por las absorbencias de
sucesivos problemas que se ensayen en la misma serie, nos dar el valor de las
concentraciones de estas soluciones problema.
Cp
Cs
x Ap F x Ap siendo : F Factor
As
b. Curva de calibracin:
Es la representacin grfica en un eje de coordenadas de absorbancia(ordenadas) frente
a concentracin(abscisas).
14
L.D. Caicedo
El mtodo de trabajo con curva de calibracin consiste en ensayar varias soluciones de

concentraciones conocidas, y determinar absorbancias; a continuacin, se construye la
curva de calibracin(que debe ser una recta), representando las concentraciones frente a
sus absorbancias grficamente. Una vez ensayadas las soluciones problema, su
concentracin se averigua por interpolacin de las absorbancias de las soluciones
problema en la recta de calibracin.
Estas dos formas de trabajo slo son vlidas si el cromgeno obedece la ley de Beer, y
tanto las soluciones estndar como los problemas son ledas en idnticas condiciones.
En las determinaciones fotomtricas se deben conocer la linearidad que es el intervalo
de concentraciones del cromgeno entre las cuales existe una relacin lineal entre
concentracin y absorbancia, es decir, se cumple la Ley de Beer. Cuando la
concentracin de cromgeno en la solucin sobrepasa los limites de linearidad, la Ley
de Beer deja de cumplirse, convirtindose la recta de la grfica en una curva a partir de
ese punto de concentracin. La lectura de una absorbancia fuera de los limites de
linearidad, se traduce en una concentracin falsamente baja de cromgeno; ante esta
situacin, hay que diluir la muestra, para que su concentracin entre dentro de los limites
de linearidad.
3.
INSTRUMENTACION
odos los fotmetros y espectrofotmetros constan esencialmente de:
Fuente estable de energa radiante.
Rendijas de entrada y salida.
Selector de longitud de onda.
Cubeta destinada a contener la muestra.
Detector de energa radiante.
Presentacin de datos.
3.1
TIPOS DE APARATOS:
En base al sistema selector de longitud de onda, los aparatos se clasifican en dos tipos:
Fotmetros: Emplean filtros, obteniendo luz monocromtica a longitudes de onda
discretas.
Espectrofotmetros: Emplean monocromadores, del tipo de prismas o redes de
difraccin, obteniendo luz monocromtica en un intervalo continuo de longitudes de
onda.
Segn la disposicin de los componentes fotomtricos, se pueden clasificar en
espectrofotmetros de haz simple o de doble haz.
Espectrofotmetros de haz simple:
Constan esquemticamente de los componentes antes mencionados: la luz emitida pasa
a travs de un monocromador que seleccionar la longitud de onda deseada; unas
rendijas de entrada y salida consiguen que el haz de luz sea estrecho, y evitan la luz
15
L.D. Caicedo
difusa; la luz pasa a travs de la cubeta, donde no se produce el proceso de absorcin;

la luz no absorbida es transmitida al detector, que convierte la energa radiante en
energa elctrica, que es registrada en un lector.
Al trabajar con estos aparatos, es necesario un ajuste inicial a 0 por100 de transmitancia,
que se consigue sustituyendo la cubeta por un sistema que no deje pasar la luz hasta el
detector. A continuacin se hace un blanco, colocando una cubeta con todos los
componentes de la solucin de trabajo exceptuando el cromgeno, y haciendo un ajuste
a 100 por 100 de transmitancia (o de absorbancia). Se hacen lecturas de
estndares(soluciones de concentracin conocida), y a continuacin las de las
soluciones problema(concentracin desconocida), y se averigua la concentracin de los
problemas por comparacin con los estndares.
Espectrofotmetros de doble haz:
Se clasifican tales en el espacio y en el tiempo.
1. Espectrofotmetros de doble haz en el espacio:
Todos los componentes estn duplicados menos la lmpara. Dos haces de luz pasan al
mismo tiempo a travs de los diversos componentes separados en el espacio. Esta
disposicin compensa las variaciones de intensidad de la fuente de energa radiante y
tambin las variaciones de absorbancia a medida que se vara la longitud de onda de
lectura en una operacin de barrido.
2. Espectrofotmetros de doble haz en el tiempo:
Normalmente utilizan los mismos componentes que un instrumento de haz simple. Dos
haces de luz pasan a travs de los mismos componentes, pero no en el tiempo. Emplean
un chopper, consiste en un interruptor rotativo del haz luminoso(es una rueda giratoria
con secciones plateadas y rendijas alternas) colocado a continuacin de la rendija de
salida. Un sistema de espejos dirige la porcin de luz reflejada por el chopper a travs de
una cubeta de referencia y de ah al detector comn. El detector ve alternativamente el
haz de luz procedente de la muestra y el de referencia. Esta disposicin compensa la
variacin de la fuente de energa radiante, as como las variaciones de sensibilidad del
detector.
3.2
COMPONENTES
Fuente de energa radiante

La misin de la fuente de energa es proporcionar energa radiante en forma de luz
visible o no visible.
Existen distintas lmparas que emiten en distintas zonas del espectro visible y UV.
Lmparas de filamento de tungsteno:
Se utiliza habitualmente como fuentes de radiacin para longitudes de onda del
espectro visible y UV prximo; son fuente de un espectro continuo de energa
radiante entre 360 y 950 nm.
Lmparas de filamento de haluros de tungsteno:
Son de mayor duracin, producen mayor luz a longitudes de onda cortas, y
emiten energa radiante de mayor intensidad que las de filamento de tungsteno.
Se emplean frecuentemente las de yoduro de tungsteno.
16
L.D. Caicedo
Lmparas de hidrgeno y deuterio:

Producen un espectro continuo en la regin UV(220 a 360 nm). Se emplean para
medidas en esta regin del espectro, siendo ms usada la de deuterio, de mayor
intensidad que la de hidrgeno.
Lmparas de vapores de mercurio:
Emiten un espectro discontinuo o espectro de lneas(313, 365, 405, 436 y
546 nm). Son muy tiles para propsitos de calibracin de longitudes de onda,
pero no son utilizadas en muchos espectrofotmetros. Se emplean en
espectrofotmetros para cromatografa HPLC.
Consideracin prctica:
Es importante tener en cuenta que la cantidad de luz emitida por una lmpara no es
constante en un intervalo continuo de longitudes de onda, presentado mximos y
mnimos, propiedad que vara en los diferentes tipos de lmparas, e incluso con los
diferentes fabricantes; esto nos llevar a buscar siempre el tipo de lmpara que resulte
ms adecuado en la prctica para los anlisis que queremos realizar. Conviene tener
tambin en cuenta que las lmparas sufren con las subidas y bajadas bruscas de
tensin, que se traducen en cambios en las lecturas de absorbancias, y que la lmpara
tiene una vida limitada, hacindose necesaria su vigilancia para el buen funcionamiento
del instrumento.
Rendijas:
La funcin de las rendijas de entrada es reducir al mximo la luz difusa y evitar que la luz
dispersa entre el sistema de seleccin de longitud de onda.
Las rendijas de salida tienen como funcin impedir que la luz difusa atraviese la cubeta,
lo que generara desviaciones a la Ley de Beer.
Sistemas de seleccin de longitud de onda
Su finalidad es seleccionar la longitud de onda o intervalos de longitud de onda
deseados para el anlisis. Se clasifican en filtros y monocromadores.
Filtros:
Es un mecanismo sencillo compuesto por un material que transmite selectivamente una
longitud de onda y absorbe todas las dems. Existen dos tipos:
Filtros de vidrio y filtros Wratten:
Basados en la transmisin selectiva de la luz. Los filtros Wratten consisten en una capa
de gelatina coloreada entre dos laminas de vidrio transparente. Los filtros de vidrio estn
compuestos por una o ms capas de vidrio coloreados. Ambos tipos transmiten ms
energa radiante en una parte del espectro que en otras. Son preferibles los filtros de
vidrios por ser ms duraderos, y menos susceptibles de dao por el calor y la luz solar.
Filtros de interferencia:
Basados en el principio de interferencia. Cuando la luz choca con una fina pelcula, una
parte es reflejada en la superficie frontal de la pelcula mientras que la que penetra en
ella es reflejada por la cara interior. Este ltimo rayo de luz ha viajado ms que el
primero, y la diferencia de recorrido viene dada por el espesor de la pelcula. Si ambos
rayos reflejados(en la cara frontal y en la cara interior de la pelcula) estn en fase, su
intensidad queda duplicada, mientras que si estn fuera de fase se anulan entre s. De
esta forma, cuando la luz blanca incide sobre una pelcula de este tipo, algunas de sus
17
L.D. Caicedo
longitudes de onda quedan aumentadas, mientras que otras se anulan. Los filtros de
interferencia separan intervalos ms estrechos de longitud de onda que los de vidrio.
Monocromadores:
Los monocromadores son capaces de dar bandas espectrales mucho ms estrechas que
los filtros, y tienen la ventaja adicional de poderse ajustar fcilmente dentro de una
amplia zona del espectro. El elemento dispersante de la luz puede ser un prisma o una
red de difraccin.
Prismas:
Son fragmentos con forma de cua, de vidrio, cuarzo, cloruro sdico o cualquier otro
material que permita la transmisin de la luz. Debido a la variacin del ndice de
refraccin en funcin de la longitud de onda, la luz que penetra en el prisma se dispersa
en mayor o menor medida segn la longitud de onda de la luz. La dispersin de la luz no
es lineal, es decir, se hace cada vez menor a medida que se acortan las longitudes de
onda. Cuando se pretende trabajar en la zona visible del espectro y en la UV prxima, se
pueden utilizar prismas de vidrio, pero para trabajar en el UV lejano, han de ser de
cuarzo.
Redes de difraccin:
Consisten en un gran nmero de lneas(hendiduras) paralelas, situadas a distancias
iguales entre s, trazadas sobre un vidrio o una superficie metlica. Cuando incide la luz
blanca sobre ella, cada hendidura se comporta como un pequeo prisma; la luz se refleja
o atraviesa la red de manera que la luz blanca se descompone en varios colores.
Parmetros de los sistemas de seleccin de longitud de onda:
Con excepcin de los mecanismos pticos lser, la luz obtenida con cualquier sistema
selector de longitud de onda no es verdaderamente monocromtica, sino que comprende
un intervalo de longitudes de onda.
Es un sistema selector de longitudes de onda con una anchura igual para las rendijas de
entrada y salida, la luz que emerja de la rendija de salida se representa por un tringulo
issceles y se definen varios parmetros:
Ancho de banda:
Es el intervalo de longitudes de onda que pasan a travs de la rendija de salida
de un mecanismo selector de longitudes de onda.
Longitud de onda nominal de un haz de luz:Es la longitud de onda en la que se
halla el mximo de intensidad de luz. Se emplea para definir los filtros.
Anchos de banda nominal:
Corresponde a aquellas longitudes de onda centradas sobre la longitud de onda
mxima, que transmite el 75 por el 100 del total de la luz presente en el haz
emergente. Describe el grado de monocromaticidad de un monocromador.
El grado de monocromaticidad de un monocromador puede variar. En los
monocromadores, la rendija de entrada enfoca la luz sobre el prisma o red de difraccin
sobre la cual ser dispersada. La rendija de salida determina el ancho de banda de la luz
que ser seleccionada del espectro de dispersin. Aumentando el ancho de la rendija de
18
L.D. Caicedo
salida, el ancho de banda de la luz emergente se hace ms amplio, con lo cual aumenta
la intensidad de la energa, pero disminuye la pureza espectral.
En los monocromadores de red de difraccin, la rendija de salida puede ser fija, lo que
resulta en un paso de banda constante. Por el contrario, en los monocromadores de
prisma, la rendija de salida es variable.
Cubetas:
Es el recipiente donde se coloca la muestra para la medicin espectrofotomtrica.
Formas:
Pueden ser redondas, cuadradas, o rectangulares, y de tamao menor o mayor.
Habitualmente tienen 1 cm de paso de luz. Se obtienen mejores resultados trabajando
con las cubetas de lados paralelos, a ser posible fundidas en lugar de cementadas. Las
de forma redonda se deben marcar e introducir en el aparato siempre en la misma
posicin.
Materiales:
La mayora estn fabricadas en vidrio, lo cual permite trabajar satisfactoriamente entre
longitudes de onda que van de 320 a 950 nm. Tambin existen cubetas de plstico. Para
medidas por debajo de 320 nm(UV) es necesario emplear cubetas de cuarzo, que
tambin se podran emplear para mediciones a longitudes de onda superiores, pero su
costo lo desaconseja.
Sistemas de deteccin:
Existen dos tipos de detectores empleados tanto en las regiones del visible como del UV:
clulas fotovoltaicas y fototubos. La eleccin de uno u otro sistema depende
fundamentalmente de la energa radiante de que se disponga. Si se han empleado como
selectores filtros o monocromadores de baja dispersin, stos proporcionarn un haz de
luz de suficiente energa como para emplear clulas fotovoltaicas. Si se emplean
monocromadores de elevado poder resolutivo, hay que recurrir a fotomultiplicadores para
la deteccin.
Fotoclulas o clulas fotovoltaicas semiconductoras, o clulas con capa de
barrera:
Consisten en una lmina de cobre sobre la que se ha depositado una capa de material
semiconductor, como selenio u xido cuproso. Esta capa est cubierta por una capa de
metal transparente que sirve como electrodo colector. Al iluminarse a travs del electrodo
transparente, se produce un flujo de electrones que puede ser medido con un
ampermetro. Estos detectores son resistentes, relativamente econmicos, y sensibles
desde el UV hasta los 1000 nm. No se requiere ningn aporte externo de energa, y la
corriente producida es directamente proporcional a la energa que llega.
Las fotoclulas muestran el llamado efecto de fatiga, consistente en que presentan una
subida inicial de corriente que luego decrece gradualmente hasta el equilibrio. Por ello,
conviene esperar unos 30-60 segundos entre lecturas.
Fototubos multiplicadores:
Es un tubo que contiene en su interior un ctodo consistente en una placa de metal que
emite electrones de forma proporcional a la energa que incide sobre ella.
Contiene adems un nodo, que recoge los electrones, y de 9 a dinodos o niveles de
energa.
19
L.D. Caicedo
Los electrones producidos en el primer choque contra el ctodo pasan a chocar contra
una superficie secundaria, donde cada electrn produce entre 4 y 6 electrones
adicionales que van a otro nivel(dinodos), y as sucesivamente, multiplicndose de este
modo el efecto del primer choque de la luz contra el ctodo, hasta que los electrones
llegan al nodo, y la seal se amplifica en cientos o miles de veces.
Los fototubos tienen un rpido tiempo de respuesta, no muestran efectos de fatiga tan
altos como otros detectores, y son muy sensibles.
Sistemas de presentacin de datos:
La energa elctrica del detector se refleja en sistemas de lectura y presentacin de
datos. Estos pueden ser sistemas de lectura directa, que suelen ir amplificados a
aparatos con detectores del tipo fotoclulas, o bien pueden introducir amplificadores de
seal, como ocurre en los aparatos con fototubos.
Hoy en da todos los aparatos incorporan ya la lectura digital, la cual, unida tambin a la
introduccin de microprocesadores, permite clculos directos de concentracin con
arreglo a factores de calibracin prefijados, y lectura contra estndares, o curvas de
calibracin en memoria.
A esta presentacin digital de resultados se une tambin la posibilidad de conexin de
registradores, de gran utilidad en el estudio de reacciones cinticas, y en la realizacin
de barridos a travs de intervalos de longitudes de onda del espectro.
4.
ASPECTOS PRACTICOS
4.1
Empleos de blancos
ntes de efectuar una lectura, se debe hacer siempre un blanco: esta maniobra
eliminar las posibles interferencias de absorcin o reflexin por parte de la propia

cubeta o el solvente de cromgeno.
Consiste en hacer una primera medida en la misma cubeta, slo con el solvente; se
establecer una intensidad inicial relativa a la cubeta y a la solucin, que marcar las
condiciones iniciales de trabajo. La absorbancia del blanco se restar de las
absorbancias que se midan para los problemas.
Hay distintos tipos de blancos:
Blanco de suero:
La lectura inicial se hace con el suero diluido en la misma proporcin en un solvente
inerte, con el que no reaccione. Elimina las posibles interferencias que puede producir la
propia muestra(p. ej.: hemlisis, lipemia, bilirrubinemia, color de la orina, etc.), antes de
que se produzca la reaccin.
Blanco de reactivos:
Elimina las posibles interferencias que pueda introducir el reactivo. La lectura inicial se
hace con el reactivo, antes de adicionarle la muestra.
20
4.2
L.D. Caicedo
Desviaciones de la Ley de Beer:
Son desviaciones producidas en la linearidad de la relacin entre concentracin y

absorbancias. La recta se curva antes de su limite de linearidad. Pueden causarlas
varios factores.
Se miden concentraciones muy elevadas de cromgeno.
La radiacin incidente no es monocromtica.
La absorbancia del solvente es significativa comparada con la del soluto.
La luz es transmitida por otros mecanismos(luz errtica, o luz monocromtica
que llega al detector).
Los lados de la cubeta no son paralelos.
Si hay interferentes(otros cromgenos absorben tambin a esa longitud de
onda).
Si existe fenmeno de fluorescencia.
4.3
Curvas de calibracin:
La curva de calibracin relaciona las absorbancias con las concentraciones. Se

construye ensayando soluciones de distintas concentraciones, y estableciendo para cada
una de ellas su absorbancia a una determinada longitud de onda.
Para construir una curva de calibracin, se deben estudiar concentraciones que cubran
el rango que se va a encontrar en la prctica, siempre que sea posible.
Las unidades de concentracin empleadas en la curva deben ser las mismas que se
vayan a utilizar luego para expresar los resultados.
En la construccin de la curva se emplean un mnimo de tres puntos, que se representan
en la grfica, y a continuacin se traza una lnea recta que se aproxime a ellos lo ms
posible. Generalmente, a una concentracin de 0 corresponde a una absorbancia de 0.
La curva debe abarcar un rango de concentraciones que se encuentren dentro del lmite
de linealidad, para que se cumpla la Ley de Beer, y al mismo tiempo la interpolacin de
cualquier resultado en esta grfica ofrezca un resultado fiable.
4.4
Empleo de factores de calibracin:
Otra forma de trabajo consiste en utilizar lo que se llama factor de calibracin; este factor
es el resultante de la aplicacin de la ecuacin bsica de la espectrofotometra, y se halla
por una simple regla de tres, tras el ensayo de un estndar(comparando concentraciones
y absorbancias de estndar y problema).
Cs/Cp = As/Ap Cp = Cs/As x Ap
Cp = F x Ap
Para reactivos estables y sistemas fotomtricos estables, este factor se puede mantener
constante, siendo slo necesario ensayar las muestras problema, multiplicando la
absorbancia resultante por el factor, para conocer la concentracin.
21
L.D. Caicedo
Cualquier cambio en las condiciones de trabajo (reactivos, ajustes del aparato, etc.)
requiere el clculo de un nuevo factor de calibracin.
De igual manera, cuando se trabaje con una curva de calibracin, cualquier ajuste en el
aparato, o cambio en los reactivos con que se fabric, requieren la construccin de una
nueva curva.
Los aparatos deben mantenerse limpios y evitar agentes que produzcan cualquier
interferencia en el sistema fotomtrico(polvo, suciedad de lquidos derramados, etc.). Las
fluctuaciones bruscas de luz afectan al sistema ptico del aparato, que sufre con ellas;
por otro lado, hay que vigilar el estado de la lmpara, puesto que experimenta un
desgaste con el tiempo.
Las cubetas a usar deben estar perfectamente limpias, y su superficie no debe presentar
ralladura alguna. No se deben tocar con los dedos las caras de la cubeta por las que
haya de incidir el rayo de luz.
RECUERDA:
La radiacin electromagntica es una forma de energa radiante, formada por
paquetes discontinuos de energa llamados fotones. Puede ser descrita en funcin
de sus propiedades ondulatorias: longitud de onda y frecuencia de la radiacin
E h * E
h *C
El espectro electromagntico comprende un amplio intervalo de longitudes de

onda, desde rayos gamma hasta microondas.
De las interacciones entre la luz y la materia se derivan de fenmenos de
absorcin o emisin energtica.
Proceso de absorcin: un tomo, molcula o ion absorben la energa de un fotn
que incide sobre ellos.
Proceso de emisin: un elemento es excitado, y desprende su energa en forma
de energa radiante(luz medible).
Cuando se mide la absorcin de luz por una solucin, se definen los conceptos
de transmitancia y absorbancia. La absorbancia es directamente proporcional a
la concentracin. La relacin entre transmitancia y concentracin es inversa y
logartmica.
La Ley de Beer-Lambert rige la relacin entre la absorbancia de una solucin y
su concentracin:
Aa x b x c
22
L.D. Caicedo
Basndonos en la Ley de Beer, podemos comparar las absorbancias y

concentraciones de dos soluciones, y calcular as la concentracin de cualquier
solucin problema.
Para calcular la concentracin de una solucin problema, podemos recurrir al
uso de factores o curvas de calibracin.
Tipos de aparatos con arreglo al sistema selector de longitud de onda:
fotmetros(filtros) y espectrofotmetros(monocromadores).
Tipos de aparatos segn la disposicin de los sistemas fotomtricos:
Espectrofotmetros de haz simple y Espectrofotmetros de doble haz(en el
espacio y en el tiempo).
Componentes esenciales; fuente de energa radiante, rendijas, sistema selector
de longitudes de onda, cubeta, sistemas de deteccin.
Se emplean blancos que marcan las condiciones iniciales de trabajo: blanco de
suero y blanco de reactivos.
Se pueden producir desviaciones a la Ley de Beer, que hacen que la relacin
entre absorbancia y concentracin deje de ser lineal.
El empleo de las curvas de calibracin y factores exige que las condiciones de
trabajo sean estndar, y mantengan las mismas cuando se calcularon.
La prctica correcta de la espectrofotometra requiere el uso de aparatos
sometidos a un mantenimiento adecuado, as como de elementos
accesorios(cubetas, etc.)en perfecto estado.
23
L.D. Caicedo
PRCTICA DE LABORATORIO 1
Tomado de: VELEZ A. Manual de Bioqumica. Universidad Santiago de Cali. Facultad
ESPECTROFOTOMETRA
de Educacin. Qumica.
ESPECTROFOTOMETRA
a espectrofotometra es una de las tcnicas de estudio ms importantes en la
Biologa celular y en la molecular. Se basa, esencialmente, en la propiedad de la gran

mayora de las sustancias de importancia biolgica de absorber la energa radiante de
una a otra frecuencia. Esta absorcin es especfica, haciendo posible su uso como
mtodo para la identificacin y cuantificacin de tales sustancias.
ESPECTROFOTMETRO
LECTURA
GALVANMETRO
PRISMA
MUESTRA
FOTOCELDA
FUENTE DE LUZ
DIAFRAGMA
COLIMADOR
Objetivos:
1.
Efectuar el espectro de absorcin de luz visible de varias sustancias.
2.
Determinar la longitud de onda de mxima absorcin de cada una de las sustancias.
3.
Comprobar la relacin entre la absorbancia y la concentracin de la sustancia. (Ley

de Beer-Lambert).
4.
Aplicar la Ley de Beer-Lambert para determinar la concentracin de una sustancia.
5.
Aprender el manejo del espectrofotmetro.
24
Materiales:
10 tubos de ensayo
1 gradilla
2 pipetas de 1 ml
2 pipetas de 2 ml
2 pipetas de 5 ml
3 tubos para espectrofotometra
Espectrofotometro
L.D. Caicedo
Reactivos:
Azul de bromotimol(100 mg/litro)
Rojo congo(100 mg/litro)
Permanganato de potasio(100 mg/litro)
cido actico al 5%(V/V)
Amortiguador de fosfatos 0.1 M pH 7.5
Procedimientos:
Cada grupo de estudiantes trabajar con una sustancia diferente. Los resultados
de los espectros y de la Ley de Beer-Lambert se debern comparar en la discusin
de la prctica.
Solicite al profesor la explicacin sobre el manejo del espectrofotmetro que
usar el grupo. No tiene que operarlo hasta que no se tenga la informacin necesaria
para hacerlo.
1.
Determinacin de los espectros de absorcin:
1.1 Determinar el espectro del azul de bromotimol a pH 7.5.

Prepare dos tubos de ensayo as: uno con 10 ml de agua destilada que servir como
blanco y otro con 1 ml de azul de bromotimol(100 mg/l), ms 1 ml de amortiguador de
fosfatos y 8 ml de agua destilada. Mezcle bien.
1.2 Determinar el espectro del azul de bromotimol a pH cido.
blanco y otro con 1 ml de azul de bromotimol, ms 9 ml de agua destilada y una gota de
cido actico al 5%. Mezcle bien.
1.3 Determinar el espectro del rojo congo.
blanco y otro con 1 ml de rojo congo(100 mg/l), y 9 ml de agua destilada. Mezcle bien.
1.4 Determinar el espectro de una mezcla de bromotimol y rojo congo, a pH 7.5
blanco y otro con 1 ml de azul de bromotimol, ms 1 ml de amortiguador de fosfatos pH
7.5 ms 1 ml de rojo congo y 7 ml de agua destilada. Mezcle bien.
1.5 Determinar el espectro del permanganato de potasio.
blanco y otro con 1 ml de KmnO4(100 mg/l) y 9 ml de agua destilada. Mezcle bien.
1. Realice el espectro de cada sustancia midiendo la absorcin de luz cada 30 nm,
desde 400 hasta 700 nm. Cada lectura debe efectuarse con una calibracin previa
con el blanco a 100% de transmitanca.
2. Realice las graficas correspondientes de absorbancia vs. longitud de onda, en nm.
3. Cul es la longitud de onda de mxima absorcin para cada sustancia?
25
L.D. Caicedo
4. Determine la correspondencia entre el espectro de absorcin y el color de cada una

de las sustancias.
5. Qu caractersticas tiene el espectro de la mezcla del azul de bromotimol y el rojo
congo?
2.
Comprobacin de la Ley de Beer-Lambert:
Aqu se analizara la variacin de la absorcin con respecto a la concentracin de la

sustancia que absorbe.
Cada tubo, con una concentracin diferente de la sustancia, se lee a la longitud
de onda de mxima absorcin obtenida en el experimento anterior.
Se operar as: se colocar el botn de longitud de onda en el valor
correspondiente a la longitud de mxima absorcin, se calibra con el blanco a 100%
de transmitanca. Se reemplaza el blanco por las soluciones de diferente
concentracin de la sustancia. Aqu no es necesario calibrar con el blanco de nuevo,
antes de cada medicin, a menos que se sospeche que ha sucedido alteracin de la
calibracin.
Para cada una de las sustancias se deben preparar las siguientes diluciones,
partiendo de la solucin original de 100 mg/l:
Tubo No
Solucin
de
la 0.25
sustancia (en ml.)
0.5
1.0
1.5
2.0
3.0
4.0
Agua destilada
(en ml.)
9.5
9.0
8.5
8.0
7.0
6.0
10
9.75
Problema
Concentracin(mg/l)
El tubo problema contendr una concentracin de sustancia que deber ser encontrada
por medio de la grfica de absorbancia vs. concentracin.
2.1
Comprobar la Ley de Beer-Lambert con azul de bromotimol a pH 7.5

Para esto se preparan los tubos como se indica en la tabla pero debe
remplazarse 1 ml de agua destilada por 1 ml de amortiguador de fosfato pH 7.5,
en cada uno de los tubos. Mezclar bien.
2.1
Comprobar la Ley de Beer-Lambert con azul bromotimol a pH cido

Prepare las diluciones como se indica en la tabla y agregue a cada tubo 1 gota
de cido actico al 5%. Mezclar bien.
2.3
Comprobar la Ley de Beer-Lambert con rojo congo.

Prepare las diluciones como se indica en la tabla. Mezclar bien.
26
2.4
L.D. Caicedo
Comprobar la Ley de Beer-Lambert con permanganato de potasio.

Prepare las diluciones como se indica en la tabla. Mezclar bien.
En cada caso, tabule sus datos, elabore una grfica de absorbancia vs. concentracin en
mg/l y establezca la concentracin del problema.
Preguntas:
1. Cules son los fundamentos en los que se basan las tcnicas espectrofotomtricas?
2. Qu relacin existe entre los espectros de absorcin de las sustancias y el color
que poseen?
3. Qu aplicaciones tienen las tcnicas espectrofotomtricas?
4. Qu factores pueden producir desviaciones al aplicar la Ley de Beer Lambert.
27
L.D. Caicedo
LABORATORIO 1: ESPECTROFOTOMETRA
HOJA DE REPORTE
FECHA: ____________________ SEMESTRE:_________ GRUPO: _____
Asistentes: (slo los que han PARTICIPAD0 de la prctica)
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
1. Qu es un espectrofotometro?
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
2. Cules son los pasos que deben seguir para el manejo del espectrofotometro
anlogo y el digital.
a) Anlogo:
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
b) Digital:
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
28
L.D. Caicedo
DETERMINACIN DE LOS ESPECTROS DE ABSORCIN

Nombre de la sustancia: A: ______________________________________
LONGITUD DE
ONDA
400
TRANSMITANCIA
ABSORBANCIA
430
460
490
520
550
580
610
640
670
700
Nombre de la sustancia: B: Azul de bromotimol y rojo congo pH 7.5
LONGITUD DE
ONDA
400
430
460
490
520
550
580
610
640
670
700
TRANSMITANCIA
ABSORBANCIA
29
L.D. Caicedo
Realice la grfica del espectro de absorcin de las sustancias A y B
Grafica 1.
Grfica 2:
30
L.D. Caicedo
COMPROBACIN DE LA LEY DE BEER-LAMBERT: Variacin de la

absorcin con relacin a la concentracin.
Tubo No
Solucin
de
la 0.25
sustancia (en ml.)
0.5
1.0
1.5
2.0
3.0
4.0
Agua destilada
(en ml.)
9.5
9.0
8.5
8.0
7.0
6.0
10
9.75
Transmitancia
Absorbancia
Concentracin (mg/l)
Realice la grfica de la Absorbancia vs Concentracin y determine la

concentracin de la solucin problema mediante la ecuacin de la recta y curva de
calibracin.
Anexe las fichas de seguridad de los reactivos y sustancias que se han utilizado
en esta prctica.
Anexar las respuestas del cuestionario de la pgina 25.
Problema
31
L.D. Caicedo
Haga una breve discusin y conclusin de sus resultados.

Discusin:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Conclusiones:
1. _____________________________________________
_____________________________________________
_____________________________________________
2. _____________________________________________
_____________________________________________
_____________________________________________
3. _____________________________________________
_____________________________________________
_____________________________________________
_____________________________________________
32
L.D. Caicedo
MACROMOLECULAS DE LA LEVADURA
bjetivos:
1.
Separar
por
centrifugacin
levadura.(Saccharomyces ssp).
las
principales
macromolculas
de
la
2. Identificar cualitativamente dichas macromolculas: protenas, cidos ncleicos y

glucgeno.
Materiales:
4 tubos de centrfuga
Mortero
2 pipetas de 10 ml
2 pipetas de 1 ml
1 probeta de 50 ml
1 vaso de 400 ml
1 cubeta de hielo
1 agitador
1 gradilla
15 tubos de ensayo
Plancha de calentamiento
Centrfuga refrigerada
Reactivos:
Levadura de panadera
cido tricloroactico al 5 %
Arena lavada y seca
Alcohol etlico
Reactivo de yodo(lugol)
Cloruro de sodio al 10 %
Cloruro de sodio 0.15 M
Reactivo de Orcinol
Sulfato de cobre 0.1 M
Hidrxido de Sodio 10 M
Amortiguador salino(citrato de sodio 0.015 M
y NaCl 0.15 M en volmenes iguales).
Procedimiento:
1. En un mortero coloque el equivalente a una cucharadita de levadura de panadera,
lavada y seca. Agregue una cucharadita de arena lavada y seca y triture
cuidadosamente por 5 minutos.
Agregue 15 ml de cido tricloroactico al 5 % y macere cuidadosamente por tres minutos
ms.
Deje que la arena se asiente y decante la suspensin lechosa vertindola a un tubo de
centrfuga.
Centrifugue a 3000 revoluciones durante 5 minutos.
33
L.D. Caicedo
Usted obtendr un precipitado que contiene cidos nuclicos y un sobrenadante que

contiene glucgeno.
2. Pase el sobrenadante a un tubo de ensayo y el tubo de centrfuga con el precipitado
colquelo en un bao de hielo.
Precipite el glucgeno aadiendo 2 volmenes de alcohol etlico, agitando y enfriando en
el bao de hielo.
Pase este medio a un tubo de centrfuga y centrifugue a 3000 r.p.m.
Descarte el sobrenadante y disuelva el precipitado en 1 ml de agua destilada.
Para utilizar como control coloque otro tubo de ensayo 1 ml de agua destilada y a ambos
agregue 1 ml del reactivo de yodo, el cual tie el glucgeno de pardo rojizo.
enga en cuenta los cambios y anote sus observaciones.
3. Ahora, tome el precipitado de cidos nuclicos y protenas y agrguele 15 ml de

cloruro de sodio al 10 %, agitando cuidadosamente.
Como tena este medio con el tubo de centrfuga, pselo a un tubo de ensayo y
colquelo en un bao de agua hirviendo por 10 minutos.
Enfre luego cuidadosamente y pase el medio a un tubo de centrfuga, centrifugando a
3000 r.p.m., durante 3 minutos.
El sobrenadante contiene cidos nuclicos,
precipitado protico en un bao de hielo.
pselo a un tubo de ensayo, y deje el
Tome el tubo que contiene los cidos nuclicos y preciptelos aadiendo 2 volmenes de
etanol fro, lentamente y agitando sobre un bao de hielo y djelo por unos 3 minutos.
Vierta el contenido a un tubo de centrfuga y centrifugue durante 3 minutos a 3000 r.p.m.
Descarte el sobrenadante y disuelva el precipitado en 2 ml de amortiguador salino.
Coloque en otro tubo como control 2 ml de amortiguador salino, y a ambos agregue 3 ml
del reactivo de orcinol; coloque los tubos en un bao de agua hirviendo durante algunos
minutos.
Una coloracin verde indica la presencia de ARN.
34
L.D. Caicedo
4. Tome el precipitado de protenas coaguladas y disulvalo con 2 ml de solucin salina

0.15M.
En otro tubo de ensayo, como control coloque 2 ml de la solucin salina.
Aada a cada tubo 1 ml de la solucin de sulfato de cobre, luego 2 ml de hidrxido de
sodio 10 M. Mezcle y observe.
La aparicin de un color violeta indica la positividad de la prueba (Prueba del Biuret).
Preguntas:
1. Cules son los fundamentos de las tcnicas de extraccin (Cul es la utilidad de cada
uno de los pasos que se sigue y de cada uno de los reactivos que se utiliza para purificar
las macromolculas y de las pruebas de identificacin empleadas en esta prctica.
2. Escriba las reacciones qumicas correspondientes de las diferentes pruebas de
identificacin utilizadas.
Preparacin de reactivos:
Reactivo de Orcinol:
Se disuelven 0.1 g de FeCl3 en 100 ml de HCl y se mezclan con 3.5 ml de etanol que
llevan disueltos 0.3 g de Orcinol.
Amortiguador salino:
Se mezclan citrato de sodio 0.015 M y NaCl 0.15 M en volmenes iguales.
Lugol:
Para 500 ml, pesar 0.83 g de KI y disolver en agua. Agregar 1.3 g de Yodo metlico.
Agitar fuertemente.
35
L.D. Caicedo
LABORATORIO 2: MACROMOLECULAS DE LEVADURA

HOJA DE REPORTE
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
1. Describa la apariencia del macerado inicial?
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
2. Cul es la apariencia y el color del precipitado y del sobrenadante obtenido

despus de la primera centrifugacin?
____________________________________________________________
_____________________________________________________________
3. Qu sucede con el sobrenadante cuando se le agregan los volmenes de

etanol fro? Color?
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
4. Cul es la apariencia del precipitado despus de la segunda centrifugacin?
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
5. Que observan cuando agregan el reactivo de yodo (lugol)
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
36
L.D. Caicedo
6. Cmo interpretan este resultado?

_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
7. Cmo interpretan lo que sucede al calentar el tubo que contiene cidos
nucleicos y protenas?
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
8. Describa el precipitado y el sobrenadante, productos de la tercera
centrifugacin?
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
9. Qu apariencia presenta el sedimento despus de la cuarta centrifugacin?
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
10. Cmo reaccionan las muestras de los diferentes tubos con el reactivo de
orcinol?
_____________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
11. Qu aspecto presenta la solucin de protenas despus de disolverlas con la
solucin salina 0.15M?
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
12. Qu observan al realizar el ensayo con NaOH y CuSO4 con ambas
muestras?
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
37
L.D. Caicedo
13. Qu otros aspectos desean destacar de la prctica realizada?

_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
14. Anexar las fichas tcnicas de los reactivos y sustancias empleadas en

esta prctica.
15. Anexar las respuestas del cuestionario de la pgina 33

Discusin:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
38
L.D. Caicedo
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Conclusiones:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
39
L.D. Caicedo
AMINOCIDOS
bjetivos:
1. Separar los componentes de una mezcla de aminocidos por medio de la

cromatografa de papel.
2. Determinar el Rf de algunos aminocidos en el sistema empleado.
3. Establecer la influencia de la estructura de la cadena lateral R de los aminocidos en
el Rf.
4. Analizar la reaccin de algunos aminocidos con ciertos agentes qumicos que
permiten su reconocen cualitativo y cuantitativo.
Materiales:
30 tubos de ensayo
3 gradillas
4 pipetas de 5 ml
2 pinzas para tubos
1 vaso de precipitados de 500 ml
2 tubos capilares
2 clips (debe traer el grupo)
1 papel para cromatografa
1 erlenmeyer de 500 ml con tapn
1 estufa a 110 C
1 rociador
1 secador de pelo (debe traer el grupo)
Reactivos:
Nitrito de sodio(10 g/l)
Reactivo de ninhidrina
cido ntrico concentrado
Solvente: Etanol + Agua + Amoniaco
(80-10-10 en volumen)
NaOH 10 M
cido actico glacial
Fenol(1 g/l)
Nitroprusiato de sodio(20 g/l)
Reactivo de Milln
Papel indicador de pH
Mezcla de aminocidos(1 g/l) de
alanina, leucina y cido aspartico.
Soluciones (1 g/l) de los aminocidos:
prolina, cido asprtico, leucina,
glicina, alanina, tirosina, fenialanina,
triptfano, cistena, metionina, lisina
y asparagina.
Procedimiento:
1. Separacin de aminocido por medio de cromatografa de papel
En el trozo de papel para cromatografa trace una lnea con lpiz, a 2 cm del borde
inferior (Maneje el papel por los bordes para no contaminarlo).
40
L.D. Caicedo
Sobre esta lnea y a una distancia de 2 cm de separacin, coloque 3 aplicaciones de las

soluciones siguientes (en puntos separados):
a. Alanina
b. cido asprtico
d. Mezcla de alanina, leucina y cido asprtico.
c. Leucina
Deje secar bien cada muestra antes de volver a aplicar sobre el mismo punto (Utilice el
aire caliente de un secador de pelo).
Cuando termine las aplicaciones y las muestras estn bien secas, enrolle el papel
tratando de formar un cilindro, de modo que las muestras queden hacia fuera.Sujete el
cilindro con un clip en el borde contrario al de las muestras.
Coloque el papel de filtro enrollado en el centro del erlenmeyer que contiene el solvente,
de tal modo que el borde con las muestras quede sumergido en l, y tratando de que el
papel no quede inclinado y que no toque las paredes con el recipiente.
Tpelo y deje desarrollar el cromat grama sin mover el recipiente, hasta que el frente
del solvente llegue a unos dos centmetros del borde superior.
Cuando esto ocurra, saque el papel del erlenmeyer con unas pinzas y colquelo en un
sitio ventilado para que se seque.
Una vez seco solicite al profesor el rociamiento con ninhidrina(Evite respirar estos
vapores) y djelo en la oscuridad por media hora o a una temperatura de 110 C en la
estufa, durante 5 minutos.
Saque el papel y observe las manchas. Rodee su permetro con una lnea hecha a lpiz
y determine el centro de la mancha.
Preguntas:
1. En qu consisten las manchas observadas?
2. Determine los Rf de los aminocidos en el cromatgrama.
3. Qu explicaciones pueden darse a las diferencias de migracin observadas?
2. Algunas reacciones qumicas con aminocidos:

Reaccin con ninhidrina:
En diferentes tubos de ensayo coloque 0.5 ml de solucin de los siguientes aminocidos:
prolina, cido asprtico, arginina, leucina, asparagina, metionina y tirosina.
Aada a cada tubo 0.5 ml de ninhidrina en acetona al 1 %.
Coloque los tubos en un bao de agua hirviendo por 5 minutos.
Deje enfriar a temperatura ambiente y observe la coloracin de cada tubo.
Un color azul, violeta o marrn se considera positivo.
La prolina debe dar un color amarillo.
Reaccin xantoproteica:
En sendos tubos de ensayo coloque 0.5 ml de solucin de cada uno de los siguientes
aminocidos: glicina, tirosina, triptofano, fenilalanina, y fenol.
Agregue a cada tubo 0.5 ml de cido ntrico concentrado.
Como la reaccin es exotrmica, deje enfriar y observe las cambios de color.
41
L.D. Caicedo
Agregue luego a cada tubo 2 ml de NaOH 10 M.

El cambio de coloracin amarilla en medio cido, a anaranjado en solucin alcalina,
constituye un resultado positivo.
Prueba con nitroprusiato de sodio:

Coloque en diferentes tubos de ensayo 2 ml de glicina, cisteina, tirosina, triptfano,
fenilalanina, metionina, cido asprtico, arginina.
Agregue 0.5 ml de nitroprusiato y luego 0.5 ml de hidrxido de amonio.
La aparicin de un color rojo se considera positivo.
Reaccin con cido glioxlico:
Coloque en diferentes tubos de ensayo 2 ml de glicina, tirosina, triptfano, fenilalanina,
metionina y aada 2 ml de cido actico glacial que haya sido expuesto a la luz(contiene
cido glioxlico).
Inclinando cada tubo y sin agitar deje caer lentamente por las paredes 2 ml de cido
sulfrico concentrado. Observe que se forman dos capas y en su interfase hay un
cambio de color.
Un anillo de color violeta se considera positivo.
UESTIONARIO: Para todos los casos explique el fundamento qumico de las
reacciones y escriba las ecuaciones correspondientes. En la hoja de reporte, despus de

analizar sus resultados, indique cuales reacciones son generales y cuales son
especficas.
Preparacin de reactivos:
Ninhidrina:
Ninhidrina 0.6 g y disolver en 300 ml, de acetona.
La acetona puede reemplazarse por etanol, etanol o isopropanol.
Solvente para la cromatografa:
Para 800 ml, se mezclan 640 ml de etanol, 80 ml de agua destilada y 80 ml de amoniaco.
42
L.D. Caicedo
LABORATORIO 3: AMINOACIDOS
HOJA DE REPORTE
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
1. Separacin de aminocidos por cromatografa de papel
Realicen un esquema del cromatograma despus de haber sido revelado con
nihidrina (Adhieran el cromatograma realizado)
43
L.D. Caicedo
2. Cromatografa de aminocidos:
Fase estacionaria: _________________________ Fase mvil: ______________
Revelador: _______________________________________________________
Patrones: ________________________________________________________
3. Calculen el Rf para cada uno de los aminocidos?

a) Alanina:
_________________
b) cido asprtico:
_________________
c) Leucina:
_________________
d) Mezcla:
_____________________________________
4. Qu concluyen con respecto a lo observado.

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
44
L.D. Caicedo
2. Algunas reacciones de los aminocidos.

En la siguiente tabla indique el color u otra caracterstica sobresaliente de la
reaccin positiva de los aminocidos, con las diferentes pruebas realizadas:
Aminocido
Nihidrina
Xantoproteica
Nitroprusiato
cido
de sodio
glioxlico
PROLINA
A. ASPARTICO
ARGININA
ASPARAGINA
CISTEINA
FENILALANINA
FENOL
GLICINA
LEUCINA
METIONINA
TIROSINA
TRIPTOFANO
5. Cules son las pruebas generales y cules son especficas para determinados
aminocidos?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
45
L.D. Caicedo
en esta prctica.
Anexar las respuestas del cuestionario de la pgina 39 y 40.
Discusin:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Conclusiones:______________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
_________________________________________________________________
46
L.D. Caicedo
PROTENAS
bjetivos:
1. Determinar el efecto de la temperatura, los solventes orgnicos, los pH

extremos, la concentracin salina y los iones metlicos pesados, sobre la
estabilidad de una protena en solucin.
2. Analizar algunas de las reacciones para la determinacin de la presencia de
protenas.
3. Separar una protena en solucin por medio de insolubilizacin reversible e
irreversible.
Materiales:
15 tubos de ensayo
2 gradillas
1 termmetro
1 vaso de 250 ml
4 pipetas de 5 ml
4 tubos de centrfuga
1 centrifuga
1 balanza
1 probeta de 50 ml
1 pinza de madera
Reactivos:
Solucin de albmina al 2 %
Acetona
HCl 9 N
NaCl al 20 %
Sulfato de amonio
cido tricloroactico al 50 %
NaOH 5 M
Sulfato cprico 0.1 M
Hidrxido de amonio
1 huevo (debe traerlo cada grupo)
Procedimiento:
1. Coagulacin de una protena:
Coloque 7 tubos de ensayo en una gradilla y numrelos.(De la clara de huevo obtenida
separe 5 ml, para el tubo, el resto se le agrega agua, se agita y se completan 100 ml.
Luego se filtra y se hacen con esta solucin todos los ensayos). Vierta en cada tubo 3 ml
de la solucin de albmina, excepto al No 1 que lleva los 5 ml de clara.
Realice lo siguiente:
Tubo No. 1: Se calienta suavemente y poco a poco en un bao de agua,
controlando la temperatura mediante un termmetro colocado en el interior del tubo.
Determine la temperatura a la cual se insolubiliza la protena.
Tubo No. 2: Agregue 2 ml de acetona. Deje en reposo y observe que pasa al
cabo de algunos minutos.
Tubo No. 3: Aada 1 ml de HCl 9 N. Observe.
47
L.D. Caicedo
Tubo No. 4: Agregue 2 ml de NaCl al 20 %. Observe

Tubo No. 5: Aada 2 ml de HNO3 al 20%. Observe
Tubo No. 6: Agregue 4 ml de NaOH 5 M. Observe
Tubo No. 7: Control
Preguntas:
1. Qu explicacin puede dar en cada caso?

2. Cules factores pueden causar la coagulacin de una protena?
2. Precipitacin de la protena por iones metlicos pesados

Deposite en un tubo de ensayo 3 ml de la solucin de albmina, y adale 1 ml de
acetato de plomo 0.005 M. Espere algunos minutos y observe.
Preguntas:
1. En qu consiste la reaccin observada?

2. Qu otras sustancias la pueden producir?
Agregue ahora 1 ml de cido etilendiaminotetractico(EDTA) 0.05 M. Agite y observe.
Preguntas:
1. Porque ocurre la reaccin observada?

3. Insolubilizacin reversible e irreversible
En un tubo de ensayo coloque 5 ml de la solucin de albmina, agregue en porciones
pequeas y agitando para que se disuelva bien, 2.36 g de sulfato de amonio. Observe.
En otro tubo de ensayo, coloque 5 ml de la solucin de albmina y aada 1 ml de cido
tricloroactico al 50 %. Observe.
Centrifugue las suspensiones de ambos tubos a 3000 r.p.m., durante 10 minutos.
Separe el sobrenadante de ambos tubos por decantacin, deschelo y conserve el
sedimento de ambos tubos.
Preguntas:
1. En qu consisten los sedimentos?

Agregue a cada tubo 4 ml de agua destilada y agite bien. Observe y anote los resultados.
48
L.D. Caicedo
Preguntas:
2. Compare ambos resultados. Qu concluye?

4. Reaccin xantoproteica:
Coloque en un tubo de ensayo 3 ml de la solucin de albmina y agrguele 3 ml de cido
ntrico al 20 %. Observe.
Caliente en un bao de agua por algunos minutos. Observe.
Enfre el tubo y posteriormente aada 3 ml de hidrxido de amonio. Anote los resultados.
Preguntas:
1. Cul es el fundamento qumico de esta reaccin?
5. Reaccin de Biuret:
Coloque en un tubo de ensayo 3 ml de la solucin de albmina. Aada el mismo
volumen de hidrxido de sodio 5 M, y 5 gotas de sulfato cprico 0.1 M. Observe.
Preguntas:
1. Cul es el fundamento qumico de esta reaccin?

2. Cmo podramos saber que una sustancia desconocida es una protena?
3. Qu coloracin da la reaccin del Biuret?
RECUERDA QUE DEBES:

Interpretar todos estos resultados y elaborar las conclusiones correspondientes.
49
L.D. Caicedo
PROTENAS
FECHA: ___________ SEMESTRE: ____________ GRUPO: ________
ASISTENTES: (Slo los asistentes a la clase)
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
1. Coagulacin de protenas:
Tubo
Observaciones
1. Calor
2. Acetona
3. HCl 9N
4. NaCl 20%
5. HNO3 20%
6. NaOH 5M
7. CONTROL
OBSERVACIONES
2. Precipitacin de protenas por iones metlicos pesados
Solucin de albmina + acetato de
plomo:__________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
50
L.D. Caicedo
Qu ocurre al agregar EDTA?

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
3. Insolubilizacin reversible e irreversible:
Solucin de albmina + sulfato de amonio: _____________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Sedimento del proceso anterior + 4 ml de agua destilada:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
_________________________________________________
Solucin de albmina + cido tricloroactico:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
_________________________________________________
Sedimento del proceso anterior + 4 ml de agua destilada:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Cul de los tratamientos caus insolubilizacin reversible de la albmina de
huevo?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Porqu? ________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Cul de los tratamientos caus insolubilizacin irreversible de la albmina de
huevo?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Porqu? ________________________________________________________
51
L.D. Caicedo
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
4. Reaccin xantoproteca:
Solucin de albmina + HNO3 al 20%
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Qu observa despus de calentar suavemente?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
5. Reaccin de Biuret:
Qu cambios observa al utilizar los reactivos del proceso?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Qu observaciones tienen de la prctica en general?:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
14. Anexar las fichas tcnicas de los reactivos y sustancias empleadas en esta
prctica.
15. Anexar las respuestas del cuestionario de la pgina 46 y 47
16. Haga una breve discusin y conclusin de sus resultados.
52
L.D. Caicedo
Discusin:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Conclusiones:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
53
L.D. Caicedo
AMILASA SALIVAL
ntroduccin:
La saliva, secretada por las glndulas salivales en cantidad aproximada de un litro diario,
contiene una enzima que cataliza la hidrlisis(digestin) del almidn a travs de una
serie de intermediarios ms pequeos(dextrinas) hasta que el producto final que es la
maltosa.
Esta enzima se llama Amilasa Salival, la que en la actualidad ha sido purificada y
sintetizada en forma cristalina.
La reaccin enzimtica de la amilasa salival puede seguirse fcilmente con la prueba de
yodo.
El yodo produce un color intensamente azul con el almidn.(Realmente slo con el
componente llamado amilosa).
Cuando se hidroliza el almidn, las pruebas repetidas con yodo van desde un color azul,
pasando luego al violeta, luego al rojo o pardo rojizo (dextrinas), y finalmente
incoloro(dextrinas ms pequeas: maltosa), indicndose as el curso de la reaccin.
Objetivos:
1. Determinar algunas caractersticas de la reaccin de hidrlisis del almidn por
medio de la catlisis con la amilasa salival.
2. Medir el efecto de la concentracin de la enzima con respecto a la velocidad de
reaccin.
3. Analizar el efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad de la enzima.
4. Seguir las caractersticas cinticas de la reaccin de hidrlisis del almidn,
mediante la aplicacin de la prueba de yodo.
5. Deducir algunos factores que pueden afectar la velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas.
54
L.D. Caicedo
Velocidad de la reaccin vs. Concentracin de la enzima:

Materiales:
12 tubos de ensayo
2 gradilla
2
4
3
1
1
1
laminas de vidrio
goteros (Traerlos)
pipetas de 5 ml
hoja de papel milimetrado (traerla)
probeta de 100 ml
cronmetro o reloj con segundero (traerlo)
Reactivos:
Saliva (traer frasco para toma
de muestra de orina)
Suspensin de almidn
Lugol
Parafina
Buffer pH 6.8
Procedimiento:
Estimule su flujo salival masticando suavemente un pedazo de parafina y deposite en un
tubo de ensayo unos 5 ml de saliva.
Prepare las siguientes diluciones de saliva utilizando agua de la llave, as:
Dilucin
ml de saliva: ml de agua
1
:
9
0.5
:
9.5
0.2
:
9.8
0.1
:
9.9
Concentracin de saliva
%(V/V)
10
5
2
1
Mide la actividad de las 4 diluciones de saliva, de la siguiente manera:

1. En un tubo de ensayo coloque 2 ml de la suspensin de almidn y aada 2 ml de
amortiguador de pH 6.8 y agite.
2. Coloque una gota de la mezcla anterior sobre la lmina de vidrio y agrguele una
gota de la solucin de yodo, para comprobar la reaccin de almidn. (Debe
aparecer un color azul intenso).
3. Coloque en tubo de ensayo 1 ml de saliva de la del 10 % y vierta sobre el
contenido del tubo anterior(mezcla de almidn y amortiguador). En este
momento se inicia la reaccin y es el tiempo CERO. Agite.
4. Saque una gota de esta mezcla cada 20 segundos y colquela sobre la lmina
de vidrio y agrguele una gota de yodo.
5. Suspenda las pruebas, cuando al aadir la solucin de yodo, la mezcla quede
del mismo color que la solucin yodada.
6. Anote el color que resulte, cada vez que haga las pruebas.
7. Explique las coloraciones presentadas.
8. Sobre la base del nmero de muestras determine el tiempo transcurrido.
55
L.D. Caicedo
9. Repita los pasos de 1 hasta 5, utilizando cada vez la saliva de las otras
concentraciones. En estos casos ustedes pueden alargar los intervalos de
tiempo dependiendo de la velocidad que observen en el desarrollo de la
reaccin.
10. Compare la actividad de la saliva usada por ustedes, con la de otros grupos, en
termino de los tiempos requeridos para llegar al punto final, en los tubos en los
que agreg saliva al 2 %.
11. Compare el resultado de su propio experimento con los valores mnimo, mximo
y promedio del curso.
12. Qu explicacin podran proponer a las diferencias observadas?
13. Realice una grfica del recproco del tiempo requerido para llegar a su punto
final(1/min) y su concentracin.
Para preparar el buffer pH 6.8:
NaH2PO4 H2O
0.2 M
13.8 g/500 ml
Na2HPO4
0.2 M
14.2 g/500 ml
122.5 ml de Na2HPO4 + 127.5 ml de NaH2PO4 y se completa la solucin a 500 ml de
Diluciones de la saliva
10%
5%
9 ml agua
1 ml saliva
2%
1%
9.5 ml agua
9.8 ml agua
9.9 ml agua
0.5 ml saliva
0.2 ml saliva
0.1 ml saliva
Preparacin de las muestras para la prueba de velocidad de la

reaccin frente a concentracin de enzima
2 ml Buffer 6.8
2 ml almidn
2 ml Buffer 6.8
2 ml Buffer 6.8
2 ml almidn
2 ml almidn
2 ml Buffer 6.8
2 ml almidn
1%
10%
5%
1 ml saliva
solucin.
2%
1 ml saliva
1 ml saliva
1 ml saliva
56
L.D. Caicedo
AMILASA SALIVAL PRIMERA PARTE

HOJA DE REPORTE
Asistentes: (slo los que han asistido a la prctica)
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
1. Velocidad de la reaccin (1/t) frente a concentracin de la enzima (V/V)
Concentracin de la saliva
Tiempo de la reaccin
Velocidad de la reaccin
% (V/V)
(t en segundos)
(1/t en minutos )
-1
10
5
2
1
Tiempo
segundos
COLOR
10%
5%
2%
1%
57
L.D. Caicedo
Con los datos obtenidos realice una grfica en papel milimetrado. Anexe esta grfica 1.
Grfica 1.
Cmo interpreta la grfica realizada? _______________________________________

_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Compare sus datos con los resultados obtenidos por los otros grupos:
Grupo No.
PH de la saliva
empleada en la prctica
(t en segundos)
(1/t en minutos )
-1
1
2
3
4
5
Al analizar los datos que pueden concluir?
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
58
L.D. Caicedo
en esta prctica.
Anexar las respuestas del cuestionario de la pgina 54.
Discusin:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Conclusiones:
1_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
2_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
59
L.D. Caicedo
Velocidad de la reaccin de la enzima con relacin al pH y la

temperatura.
ateriales:
Reactivos:
14 tubos de ensayo
2 gradillas
1 vaso de 500 ml
1 lamina de vidrio
2 goteros(Traerlos)
3 pipetas de 5 ml
1 hoja de papel milimetrado
1 probeta de 100 ml
1 termmetro(traerlo)
Saliva
Suspensin de almidn
Solucin de yodo
Parafina
Amortiguadores de pH: 3.4,
5.0, 6.8, 8.0, 10.0
Otros:
Bao de agua a 37 C
Bao con hielo
Bao de agua hirviendo
Papel milimetrado
Procedimiento:
Velocidad de Reaccin vs. Temperatura

1. Prepare una dilucin de saliva de concentracin del 2 %.
2. En 4 tubos de ensayo de 2 ml de la suspensin de almidn y 2 ml del
amortiguador de pH 6.8.
3. Vierta en 4 tubos de ensayo diferentes 1 ml de la saliva del 2 %.
4. En orden trabaje con cada par de tubos(mezcla de almidn y amortiguador y el
de saliva) dejndolos durante unos 3 minutos en cada uno de los medios para
que adquieran la temperatura del sistema, as:
1 par en bao de hielo
1 par en bao a 37 C
1 par a temperatura ambiente

1 par en bao de agua hirviendo
5. Una hora el contenido de cada par de tubos.(Recuerde que es el tiempo CERO),

y proceda a realizar las pruebas con yodo tal como en la prctica anterior.
Se recomienda que para los medios de temperatura ambiente y 37 C, se hagan ensayos
cada 20 segundos; y para los baos en hielo y agua hirviendo cada 3 a 5 minutos segn
la actividad que haya mostrado la enzima.
60
L.D. Caicedo
Preguntas:
1. De las temperaturas utilizadas, cul es la ptima para la accin de la amilasa
salival?
2. Porqu disminuye la actividad de la enzima a temperaturas extremas?
3. Relacione el experimento con la temperatura del cuerpo humano.
4. Realice una grfica en papel milimetrado del 1/ tiempo vs. temperatura.
2. Velocidad de la Reaccin vs. pH
1. Vierta en 5 tubos de ensayo 1 ml de la saliva del 2 %
2. En otros tubos de ensayo eche en cada uno 2 ml de la suspensin de almidn y
amortige uno con 2 ml del buffer pH 3.4; otro con pH 5; otro con pH 6.8; el
siguiente con pH 8 y finalmente el ltimo con pH 10.
3. Realice los ensayos correspondientes con yodo como en los casos anteriores,
utilizando intervalos de 20 segundos para los pH 6.8 y 8 y de 3 a 5 minutos para
los otros casos.
61
L.D. Caicedo
Preparacin de las muestras para la prueba de velocidad de la reaccin

frente a temperatura
Dilucin de la muestra de saliva escogida
2 ml
Buffer 6.8
2 ml
almidn
2 ml
Buffer 6.8
2 ml
Buffer 6.8
2 ml
almidn
2 ml
almidn
37C
Bao de hielo
1 ml saliva
Ebullicin
1 ml saliva
1 ml saliva
Preparacin de las muestras para la prueba de velocidad de la reaccin

frente a pH
Dilucin de la muestra de saliva escogida
2 ml
Buffer 3.4
2 ml
almidn
3.4
2 ml
Buffer 5.0
2 ml
Buffer 8
2 ml
almidn
2 ml
almidn
5.0
1 ml saliva
2 ml
almidn
10
1 ml saliva
2 ml
Buffer 10
1 ml saliva
1 ml saliva
Preguntas:
1. De los pH utilizados, cul es el ptimo para la actividad de la amilasa salival?
2. Mida el pH de la saliva de todos los miembros de su grupo, utilizando el papel
indicador. Cul es el pH ms frecuente?
3. Compare con otros grupos de trabajo. Cul es el pH ms comn en el curso?
4. Cmo relaciona el pH ptimo con el pH de su saliva?
5. Tabule sus resultados y haga una grfica de 1/ tiempo vs. pH
6. Disminuye la actividad de la amilasa salival a pH extremos? Porqu?
62
L.D. Caicedo
PREPARACIN DE LOS REACTIVOS:
ara preparar los Buffer:
pH 8: 94.7 ml de Na2HPO4 + 5.3 ml de NaH2PO4 y se completa a 200 ml de solucin.

pH 3.4 y 5: cido ctrico 2.1g/ 100 ml,
Citrato de sodio 2.34g/ 100 ml
3.4: 43.8 ml de cido ctrico + 16.2 ml de citrato

5: 21.0 ml de cido ctrico + 39,0 ml de citrato
pH 10: Carbonato de sodio 1.06g /100 ml, Bicarbonato de sodio 0.84g /100 ml
10: 60 ml de carbonato + 40 ml de bicarbonato
Almidn: 2.5 g de almidn soluble + 2.5 g de sal en 500 ml
63
L.D. Caicedo
AMILASA SALIVAL SEGUNDA PARTE

HOJA DE REPORTE
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
2. Velocidad de la reaccin (1/t) frente a temperatura.
Temperatura
de la
T C
(t en segundos)
(1/t en minutos -1)
reaccin
Bao de
hielo
Ebullicin
Ambiente
aprox 25C
Corporal
37C
Con los datos obtenidos realice una grfica en papel milimetrado. Anexe la grfica
Cmo interpreta la grfica realizada: ___________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
Grfica 2.
64
L.D. Caicedo
3. Velocidad de la reaccin frente a pH

pH de la reaccin
(t en segundos)
(1/t en minutos -1)
3.4
5.0
6.8
8.0
10.0
Con los datos obtenidos realice una grfica en papel milimetrado. Anexe la grfica
Cmo interpreta la grfica
realizada?__________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
Qu otras observaciones tienen sobre la prctica?
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
Qu pueden concluir de la prctica realizada?
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
Grfica 3
65
L.D. Caicedo
en esta prctica.
Anexar las respuestas del cuestionario de la pgina 59 y 60.
Discusin:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Conclusiones:
1_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
2_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
66
L.D. Caicedo
RECONOCIMIENTO DE GLUCIDOS
bjetivos:
1. Utilizar una reaccin general y algunas especficas para la identificacin de

glcidos.
2. Efectuar algunas de las reacciones especificas para el reconocimiento de
azucares reductores.
3. Analizar la capacidad de diversos tratamientos para ocasionar la hidrlisis de la
sacarosa y del almidn.
Materiales:
40 tubos de ensayo
1 vaso de 500 ml
1 mechero de gas
4 pipetas de 5 ml y 3 de 1ml
3 gradillas
Reactivos:
cido sulfrico concentrado
2 pinzas de madera
Alcohol amlico
Reactivos de Molisch, Benedict, Bial,
Barfoed y Selivanoff.
Soluciones al 1 % de glucosa, fructosa,
arabinosa, lactosa, sacarosa, maltosa y
almidn.
Procedimiento:
1. Reaccin de Molisch:
En diferentes tubos de ensayo coloque 0.5 ml de las soluciones de los glcidos y en otro
0.5 ml de agua destilada(blanco). Agregue a cada tubo con cuidado y sin agitar, 2 gotas
del reactivo de Molisch, luego inclinando el tubo deje resbalar en cada uno 0.5 ml de
cido sulfrico concentrado; deje reposar por unos tres minutos y observe la reaccin.
Preguntas:
1. Qu tipo de glcidos pueden reconocerse por esta reaccin?

2. Explique el fundamento qumico de ella.
2. Reaccin de Benedict:
En sendos tubos coloque 1 ml de las soluciones de glcidos y en otro 1 ml de agua
destilada(patrn). Agregue a cada tubo 1 ml del Reactivo de Benedict. En un vaso tenga
agua a ebullicin y coloque en los tubos durante unos 3 minutos.
67
L.D. Caicedo
Preguntas:
1. Qu tipo de glcidos reaccionan con el Reactivo de Benedict?
2. Escriba la ecuacin qumica general para este proceso.
3. Reaccin de Barfoed:
Coloque en diferentes tubos de ensayo 1 ml de cada una de las soluciones de glcidos y
en otro 1 ml de agua destilada. Agregue a cada uno 1 ml del Reactivo de Barfoed.
Coloque los tubos en un bao a ebullicin por 3 minutos. Observe los cambios y explique
los resultados.
Preguntas:
1. Qu glcidos se podran identificar mediante esta reaccin?
2. Escriba la ecuacin qumica general para este proceso.
4. Prueba de Bial:
Coloque en diferentes tubos de ensayo 1 ml de cada una de las soluciones de glcidos y
en otro 1 ml de agua destilada. Aada a cada uno 2.5 ml del Reactivo de Bial. Coloque
los tubos en un bao hasta que su contenido comience a hervir. Un color azul verdoso
de considera positivo.
Deje enfriar los tubos y agregue a cada uno 3 ml de alcohol amlico, agite y observe.
Preguntas:
1. Qu tipo de glucidos pueden reconocerse por esta reaccin?
2. Explique el fundamento qumico de ella.
5. Prueba de Selivanoff:
Coloque en ocho tubos de ensayo 2 ml del Reactivo de Selivanoff. Agregue a cada uno 5
gotas de la solucin de cada glcido y al ltimo agua destilada. Coloque los tubos
durante 1 minuto en agua hirviendo. Un color rojo intenso se considera positivo.
Preguntas:
1. La experiencia qu tipo de glcidos identifica?
2. Cul es el fundamento qumico de esta prueba?
Preguntas:
1. Qu tratamientos provocaron la hidrlisis de la sacarosa y el almidn?
2. Qu conclusiones pueden sacar de lo observado?
68
L.D. Caicedo
Preparacin de los reactivos:

1. Molisch: 5 g de alfa-naftol en 100 ml de metanol (al usar)
2. Benedict: 1.73 de CuSO4 + 17.3 g de citrato de sodio + 10 g de Na2CO3 anhidro
y disolver a 100 ml con agua destilada.
3. Barfoed: 4.5 g de acetato de cobre + 1 ml de cido actico al 50 % y disolver a
100 ml con agua destilada.
4. Bial: 100 mg de orcinol + 100 ml de HCl concentrado + 100 mg de cloruro
frrico.
5. Selivanoff: 0.5 g de resorcinol en un litro de HCl 3 N.
69
L.D. Caicedo
PRUEBAS CUALITATIVAS PARA LA IDENTIFICACIN DE

AZCARES
Sustancia desconocida
Prueba de Molisch
No da coloracin
Da coloracin roja violeta
No es carbohidrato
Es un carbohidrato
Lugol
Color azul
Almidn
Color rojo
Incolora
Monosacrido o disacrido
Glucgeno o
eritrodextrina
Reactivo de Barfoed
No hay precipitado o
ste es muy escaso
Sacarosa
Precipitado rojo naranja

abundante en 5-7 minutos
Monosacridos
(-) Benedict
Fermentable
Hirvase con HCl y aplique la prueba de
Seliwanoff para diferenciar cetosas de aldosas
y la prueba de Bial para diferenciar pentosas
de hexosas
Precipitado
abundante en
ms de 5-7
minutos
Disacridos
70
L.D. Caicedo
RECONOCIMIENTO DE GLUCIDOS
HOJA DE REPORTE
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
GLCIDOS
REACTIVOS
MOLISCH
BENEDICT
BARFOED
BIAL
SELIVANOFF
AGUA
ALMIDN
MALTOSA
LACTOSA
SACAROSA
FRUCTOSA
ARABINOSA
GLUCOSA
DESCONOCIDO
Al analizar la tabla:
A. Cules reactivos son generales?__________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________.
________________________________________________________________
________________________________________________________________.
71
L.D. Caicedo
B. Cules reactivos se consideran especficos? Y para cules azcares?

________________________________________________________________
________________________________________________________________.
________________________________________________________________
________________________________________________________________.
C. Qu otros aspectos desea consignar?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________.
________________________________________________________________
________________________________________________________________.
OBSERVACIONES:
________________________________________________________________
________________________________________________________________.
________________________________________________________________
________________________________________________________________.
en esta prctica.
Anexar las respuestas del cuestionario de la pgina 65, 66 y 67
Discusin:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
72
L.D. Caicedo
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Conclusiones:
1_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
2_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
73
L.D. Caicedo
ALGUNAS PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS DE LOS LPIDOS
ntroduccin:
Los lpidos son compuestos insolubles en agua pero solubles en solventes orgnicos.
Generalmente se encuentran distribuidos ampliamente en la naturaleza como steres de
cidos grasos de cadena larga.
Desde el punto de vista qumico los lpidos pueden dividirse en dos grupos principales:
Simples y Compuestos.
Los esteroides y las vitaminas liposolubles se consideran tambin lpidos Derivados.
Muchos de estos compuestos son, sin embargo, alcoholes y no steres y por lo tanto no
pueden saponificarse.
Objetivos:
1. Determinar la solubilidad de las grasas en diversos solventes.
2. Realizar una saponificacin sencilla y determinar algunas propiedades de los
jabones.
3. Establecer la presencia de cidos grasos libres y de insaturaciones en las
grasas.
4. Realizar una prueba para el reconocimiento de esteroles.
Materiales:
15 tubos de ensayo
1 vaso de 50 ml
1 balanza
1 mechero de gas
1 esptula
Soporte con aro y malla
2 gradillas
5 pipetas
1 agitador de vidrio
1 vaso de 250 ml
Reactivos:
HCl al 10 %
HCl concentrado
H2SO4 concentrado
Escamas de jabn
CaCl2 (50 g/ l)
MgCl2 (50 g/ l)
(CH3COO)2Pb (50 g/ l)
Otros: Mantequilla, margarina, aceite vegetal, anhdrido actico, etanol 95 %,

cloroformo, ter etlico, benceno, tetracloruro de carbono, cido esterico, cido oleico,
fenolftalena al 1 % en etanol, acetona, solucin de colesterol en cloroformo(0.2 g/ l),
NaOH 0.1 M y soluciones de mantequilla, aceite vegetal y cido esterico.
74
L.D. Caicedo
Procedimiento:
1. Solubilidad:
Numere 10 tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 ml de aceite vegetal, y luego
agregue a cada uno independientemente 1 ml de las siguientes sustancias: agua
destilada, HCl al 10 %, NaOH 0.1 M, etanol fro, etanol caliente, cloroformo, ter etlico,
tetracloruro de carbono, y acetona. Agite cada uno y deje reposar en la gradilla por 5
minutos y observe el grado de solubilidad.
Preguntas:
1. Cules son los mejores disolventes para las grasas?
2. Cules no disuelven las grasas?
3. Cmo explicaran estos resultados?
2. Emulsificacin:
En dos tubos de ensayo coloque 3 ml de aceite vegetal. Aada a cada uno 3 ml de agua
destilada y slo a uno de los tubos agregue unas escamas de jabn. Agite bien ambos
tubos.
Preguntas:
1. Cmo se denomina la mezcla formada?
2. Cmo est constituida dicha mezcla?
Deje los tubos en reposo y obsrvelos varias veces durante 15 minutos.
1. Notan ustedes cambios en las mezclas?
2. Cmo es la estabilidad de las mezclas en los tubos?
3. Explique los resultados.
3. Saponificacin:
Coloque en un vaso en 50 ml, unos 20 ml de agua y somtalos a ebullicin(Mantenga el
volumen constante). Cuando est hirviendo aada 1 ml de cido oleico. Agregue ahora y
cuidadosamente, gota gota NaOH al 10 %, hasta que el medio sea claro. Tengan
cuidado de no aadir un exceso de lcali.
Preguntas:
1. En que consiste la solucin formada?
2. Escriba la ecuacin qumica correspondiente.
75
L.D. Caicedo
Numere ahora 5 tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 ml de la solucin anterior y

efecten las siguientes pruebas:
TUBO
1:
2:
3:
4:
5:
Sature la solucin con NaCl(slido)

Agregue 5 gotas de cido sulfrico concentrado
Agregue 5 gotas de solucin de cloruro de magnesio
Agregue 5 gotas de solucin de cloruro de calcio
Agregue 5 gotas de solucin de acetato de plomo
Observe y anote los resultados.
Preguntas:
1. Explique lo que ocurre en cada caso.
2. Escriba las reacciones qumicas correspondientes.
4. cidos grasos libres:
En diferentes tubos de ensayo coloque 1 ml de las soluciones de mantequilla, aceite
vegetal, y cido esterico en ter.
En otro tubo de ensayo coloque 10 ml de una solucin de fenolftaleina y agregue
cuidadosamente gota a gota a las muestras disueltas en ter, hasta que el color rosado
de la solucin de la solucin de fenolftalena no desaparezca, agitando el tubo(Mximo
15 gotas).
Preguntas:
1. Tenga en cuenta el nmero de gotas usadas en cada caso.
2. Qu explicacin pueden dar en cada uno de los ensayos?
5. Prueba para esteroles:

Atencin: Los recipientes y sustancias que se utilizan deben estar exentos de agua.
1. Coloque en un tubo de ensayo seco 2 ml de solucin de colesterol. Aada 5
gotas de anhdrido y luego 5 gotas de cido sulfrico concentrado.
2. Agite suavemente y deje reposar durante unos 5 minutos.
3. Observe y explique los cambios de color.
76
L.D. Caicedo
RECONOCIMIENTO DE LPIDOS
HOJA DE REPORTE
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
1. Solubilidad
Indique el grado de solubilidad o insolubilidad del aceite en cada uno de los
casos (muy soluble, soluble, poco soluble, insoluble)
HCl 10%
Etanol fro
NaOH 0.1M
ter
Agua
CCl4
Etanol caliente
Acetona
Cules son los mejores disolventes?

________________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________
2. Emulsificacin:
Qu observa en ambos medios:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Qu tan estables son las mezclas?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
77
L.D. Caicedo
3. Saponificacin:
Qu observa en cada uno de los tubos despus de realizar los ensayos?
a. NaCl _________________________________________________________
________________________________________________________________
b. H2S04
________________________________________________________________
________________________________________________________________
c. MgCl2:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
d. Ca Cl2:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
e.(CH3C00)2Pb:____________________________________________________
________________________________________________________________
4. cidos grasos libres:
Cuntas gotas del reactivo NaOH utiliz para neutralizar las muestras?
Mantequilla: ______________ Aceite vegetal___________ cido esterico:
____________
Cmo interpretan este resultado?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
6. Esteroles:
Describan lo que observan:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
78
L.D. Caicedo
1. Qu son los jabones?

2. Cmo se pueden obtener los jabones?
3. Qu enzima logra en el aparato digestivo la hidrlisis de las grasas?
4. Qu ocurre con la emulsin de agua en aceite transcurridos unos
minutos de reposo?Y con la de eter y aceite?A qu se deben las
diferencias observadas entre ambas emulsiones?.
en esta prctica.
Anexar las respuestas del cuestionario de la pgina 74 y 75
Discusin:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
79
L.D. Caicedo
Conclusiones:
1_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
2_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
3_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
4_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
80
L.D. Caicedo
TRANSAMINACION
ntroduccin:
La transaminacin es una de las reacciones ms importantes en el catabolismo y

biosntesis de los aminocidos en la clula.
Durante la reaccin de transaminacin se transfiere el grupo alfa-amino de un
aminocido al carbono alfa de un alfa-cetocido, dando como productos un nuevo
aminocido y un nuevo alfacetocido.
La reaccin de transaminacin es catalizada por las enzimas llamadas transaminasas,
que utilizan el piridoxalfosfato como coenzima. Estas enzimas se encuentran en la matriz
citoplasmtica y en las mitocondrias de las clulas de varios tejidos. Por ejemplo, en los
mamferos las transaminasas son abundantes en el hgado, corazn y rin,
principalmente.
En esta prctica pretendemos examinar la reaccin de transaminacin utilizando como
catalizador un extracto enzimtico crudo obtenido de tejido cardiaco de ternera.
Objetivos:
1. Obtener un extracto enzimtico crudo a partir de corazn de ternera.
2. Utilizar el extracto enzimtico para catalizar la reaccin de transaminacin entre
el aminocido L-alanina y el alfa-cetocido alfa-cetoglutarato.
3. Analizar las caractersticas de la reaccin efectuada mediante la utilizacin de la
cromatografa de papel.
4. Deducir la importancia de las reacciones de transaminacin en el metabolismo
general de las clulas y los organismos.
Materiales:
Reactivos:
10 tubos de ensayo
2 gradillas
2 tubos de centrfuga plsticos
1 probeta de 100 ml
1 vaso de 250 ml
4 pipetas de 5 ml
1 pipeta de 1 ml
1 embudo
papel filtro
Amortiguador de fosfatos 0.01 M, pH 7.4

Amortiguador de fosfatos M/ 15, pH 7.4
Solvente: Etanol- agua- amoniaco
(80- 10- 10 por volumen)
Ninhidrina 0.2 % en acetona
Mezcla alanina- alfacetoglutarato
Acido actico al 4 %
81
L.D. Caicedo
Otros:
1 licuadora, 1 balanza,
1 bao de agua a 37 C
1 tira de papel filtro
2 clips
1 secador de pelo
1 rociador
1 vaso de 500 ml
1 cuchilla nueva
1 erlenmeyer de 500 ml con tapn
2 tubos capilares
1 estufa a 110 C
1 centrfuga
Procedimiento:
1. Prepacin del extracto enzimtico:
Pese aproximadamente 30 g de corazn de ternero fresco, crtelo en pedazos pequeos
y colquelos en la licuadora con 60 ml de amortiguador de fosfatos 0.01 M, pH 7.4.
Homogenice durante unos 3 minutos y luego reparta el volumen en dos tubos de
centrfuga. Centrifugue a 3000 r.p.m. durante 15 minutos. Decante el sobrenadante en
un tubo de ensayo y descrtense los sedimientos.
2. Reaccin de transaminacin:
Preprese cinco tubos de ensayo con las siguientes mezclas de soluciones.

Adicionar siempre de ltimo el extracto enzimtico.
Tubo #
Solucin
Alanina - cetoglutarato
Amortiguador M/15 pH 7.4
Agua destilada
Alanina acido glutmico
cido glutmico
Extracto enzimtico
2ml
1ml
1ml
1 ml
2ml
1ml
2ml
1ml
2ml
1ml
2ml
1ml
1ml
1ml
1ml
1. Tan pronto como se hayan mezclado los ingredientes del tubo No 1(control a
tiempo cero), adale inmediatamente 0.2 ml de cido actico al 4 %, mezcle
bien y coloque el tubo en un bao de ebullicin durante 3 minutos. Deje enfriar y
filtre en un tubo de ensayo. Descarte el residuo.
2. Este ser el filtrado libre de protenas del tubo No. 1. Gurdelo para la
cromatografa.
3. Antes de aadir la enzima al tubo # 2 caliente a ebullicin durante 3

minutos. Agregue la enzima y aada 0.5 ml de cido actico al 4%. Filtre
en un tubo de ensayo y descarte el residuo.
82
L.D. Caicedo
4. Los tubos 3 y 5 deben ser incubados por 30 minutos en un bao de agua

mantenida a 30 35C terminada la incubacin adase 0.5 ml de cido
actico 4% y colquelos en el bao de agua hirviendo por 3 minutos;
luego filtrelos.
5. El tubo # 4 no necesita ningn procedimiento
6. Guarde los diferentes tubos para la cromatografa.
3. Cromatografa de papel:
Coloque la tira de papel para cromatografa sobre una hoja limpia. Maneje el papel solo
por las puntas.
Trace una lnea fina con un lpiz de grafito a 2 cm del borde inferior. Marque 5 puntos
sobre la lnea, con 2 cm de separacin entre ellos.
Utilizando cinco tubitos capilares realice 3 aplicaciones o sobre cada uno de los puntos,
secando la muestra antes de volver a aplicar sobre el mismo punto, as (utilice un capilar
diferente para cada muestra):
Terminada la aplicacin, enrolle la tira de papel teniendo cuidado de que las muestras
queden afuera y manejando el papel solo por el borde superior. Sujete el borde superior
con un clip tratando de formar un cilindro.
Coloque 30 ml del solvente en el erlenmeyer sin humedecer las paredes.
Introduzca el papel enrollado dentro del erlenmeyer, con el borde que contiene las
muestras hacia abajo, en el centro del recipiente evitando el contacto entre el papel y las
paredes del vaso.
Tape el erlenmeyer con el tapn y djelo quieto hasta que el frente del solvente haya
llegado a 2 cm del borde superior. Cuando esto ocurra, saque el papel con cuidado y
culguelo en un sitio ventilado para que se seque. Una vez seco solicite al profesor que
sea rociado con el reactivo de ninhidrina (evite respirar los vapores) y colquelo en una
estufa a 110 C por 5 minutos.
Observe las manchas de color prpura que aparecen en el papel. Trace el permetro de
las manchas con lpiz establezca su Rf.
Preguntas:
1.
2.
3.
4.
5.
Identifique las manchas.

En cules tubos ocurri la reaccin de transaminacin?
En los que la reaccin no se llev a cabo, porqu sucedi esto?
Escriba la reaccin de transaminacin efectuada.
Cul es la importancia de las reacciones de transaminacin en el
metabolismo celular?
83
L.D. Caicedo
Preparacin de los reactivos:

1. Amortiguador de fosfatos:
0.67 g/ 50 ml de NaH2PO4, (Solucin A)
3.48g/ 100 ml de Na2HPO4 (Solucin B)
pH 7.4
Solucin A
Solucin B
Agua destilada
0.01 M
M/ 15
4.75 ml
6.33 ml
20.25 ml
27 ml
Llevar a 100 ml
Llevar a 200 ml
2. Alfa-cetoglutarato: 0.5 g se neutralizan hasta pH 7 con NaOH 1 N y luego se aaden

0.3 g de L-alanina. El volumen se completa hasta 50 ml con agua destilada.
84
L.D. Caicedo
TRANSAMINACIN
HOJA DE REPORTE
____________________________________________________________
_____________________________________________________________
1. Qu apariencia tiene el macerado inicial?
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
2. Cul es la apariencia y el color del sobrenadante y el precipitado despus de la

centrifugacin:
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
Reaccin de transaminacin:
Preprese cinto tubos de ensayo con las siguientes mezclas de soluciones.
Adicionar siempre de ltimo el extracto enzimtico.
Tubo #
Solucin
Alanina - cetoglutarato
Amortiguador M/15 pH 7.4
Agua destilada
Alanina acido glutmico
cido glutmico
Extracto enzimtico
2ml
1ml
1ml
1 ml
2ml
1ml
2ml
1ml
2ml
1ml
2ml
1ml
1ml
1ml
1ml
85
L.D. Caicedo
Antes de aadir la enzima al tubo # 2 caliente a ebullicin durante 3 minutos.

Agregue la enzima y aada 0.5 ml de cido actico al 4%. Filtre en un tubo de
ensayo y descarte el residuo.
3. Observa algn cambio en este tubo en cada procedimiento:
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
Los tubos 3 y 5 deben ser incubados por 30 minutos en un bao de agua

mantenida a 30 35C terminada la incubacin adase 0.5 ml de cido actico
4% y colquelos en el bao de agua hirviendo por 3 minutos; luego filtrelos. El
tubo # 4 no necesita filtracin.
4. Qu observa despus de agregar el cido actico y colocar en ebullicin durante
3 minutos:
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
5. De que color queda el extracto despus de filtrarlo:

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
Efecte la cromatografa de las soluciones de los 5 tubos.

Realice un esquema del cromatograma, despus de haber sido revelado con la
nihidrina (Adhieran al informe el cromatograma realizado?
86
L.D. Caicedo
6. Calculen los Rf para cada uno de los aminocidos.

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
7. Qu concluyen con respecto a lo observado en esta prctica:

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
8. Qu otros aspectos desean destacar de la prctica realizada.
87
L.D. Caicedo
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
en esta prctica.
Anexar las respuestas del cuestionario de la pgina 74 y 75
Discusin:
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Conclusiones:
88
L.D. Caicedo
1_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
2_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
3_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
4_______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
FUE UN PLACER HABER TRABAJADO CON USTEDES. LES DESEO

MUCHOS XITOS EN ESTA CARRERA. .
89
L.D. Caicedo
Bibliografa:
1. Mulett, J., 1980. Curso de Biologa Celular, UNIVALLE. Cali
2. Williams, B.L. y K. Wilson, 1981. Principios y tcnicas de Bioqumica
experimental, Omega, Barcelona. Pag. 137-155.
3. Freifelder, D., 1979. Tcnicas de Bioqumica y Biologa Molecular,
Revert, Barcelona, Pag. 421-450.
90
L.D. Caicedo
ANEXOS
MTODO DE LOWRY PARA DETERMINAR CONCENTRACIN DE
PROTENAS
iempo requerido: 40 minutos

Rango de sensibilidad: 5g/ml - 100g/ml
MATERIALES:
Espectroftometro
Cubetas
Pipetas
Pipetas Pasteur
Tubos (3-5 ml capacidad)
Gradillas
Vortex
REACTIVOS:
CuSO4.5H2O
Na3C6H5O7(2H2O) (Ctrato de sodio)
Na2CO3
NaOH
Reactivo de Folin-Ciocalteu
PROTOCOLO:
Solucin A: 100 ml
0.5 g CuSO4
1 g Na3C6H5O7(2H2O) (Ctrato de sodio)
Adicionar agua destilada hasta completar 100 ml
Esta solucin puede ser almacenada a temperatura ambiente en forma indefinida.
Solucin B: 1000 ml
20 g de Na2CO3
4 g de NaOHAdicionar agua destilada hasta completar 1000 ml
Esta solucin puede ser almacenada a temperatura ambiente en forma indefinida
Solucin C: 51 ml
1 ml de la solucin A
50 ml de la solucin B
Solucin D: 20 ml
10 ml Folin-Ciocalteu phenol
10 ml de agua destilada
91
L.D. Caicedo
PROCEDIMIENTO:
1. Lleve la solucin de la muestra a 0.5 ml con agua destilada
2. Adicione 2.5 ml de la solucin C
3. Mezcle y deje a temperatura ambiente por 5 10 minutos
4. Adicione 0.25 ml de la solucin D y mezcle.
5. Despus de 20 30 minutos lea A750.
6. Realice la curva de calibracin con concentraciones conocidas de una protena.
7. Determine la concentracin de su muestra problema
Pasos adicionales para purificar las protenas cuando existen sustancias interferentes.
Precipitacin con Deoxychocolate- cido tricloroactico
Tambin permite determinar la concentracin de protenas en soluciones diluidas
(< 1 g/ml)
Reactivos: 0.15% de deoxichocolate (DOC) y 72% de cido tricloroactico (TCA)
1. A 1ml de la muestra de protena aada 0.15% de DOC
2. Mezcle y deje a temperatura ambiente por 10 minutos
3. Agregue 0.1 ml de 72% TCA, mezcle y centrifuque por 5 30 minutos a
100-3000 xg.
4. Decante inmediatamente y remueva el precipitado con una pipeta.
5. redisuelva el precipitado directamente en la solucin C
92
L.D. Caicedo
PREPARACIN DE SOLUCION BUFFER FSFATO EN

DIFERENTES PH
Solucin stock A: (0.2 M NaH2PO4) Disolver 27.6 g NaH2PO4 llevar a 1 L con agua
destilada.
Solucin stock B: (Na2HPO4) Disolver 28.4g de Na2HPO4 y llevar a 1 L con agua
destilada.
PH
%A
%B
PH
%A
%B
5.8
5.9
6.0
6.1
6.2
6.3
6.4
6.5
6.6
6.7
6.8
92.0
90.0
87.7
85.0
81.5
77.5
73.5
68.5
62.5
56.5
51.0
8.0
10.0
12.3
15.0
19.5
22.5
26.5
31.5
37.5
43.5
49.0
6.9
7.0
7.1
7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
45.0
39.0
33.0
28.0
23.0
19.0
16.0
13.0
10.5
8.5
55.0
61.0
67.0
72.0
77.0
81.0
84.0
87.0
89.5
91.5
93
L.D. Caicedo

1783422030.guía de Laboratorio de Bioquímica 2013A

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

1783422030.guía de Laboratorio de Bioquímica 2013A

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

1

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

Por: Luz Dary Caicedo Bejarano

Universidad Santiago de Cali

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

INTRODUCCIN AL TRABAJO EN EL LABORATORIO

l llegar al laboratorio, conozca donde se localiza la fuente de agua, la ducha, los

extintores y las salidas de emergencia. Aprenda a usarlos adecuadamente y no dude en

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

6. Mantenga su rea de trabajo limpia, seca y ordenada. Siga cuidadosamente las

11. Las lesiones ms comunes en un laboratorio de qumica son las cortaduras y

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

mallas de calentamiento, material de vidrio, aros y materiales de laboratorio que

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

REGLAMENTO PARA LA EVALUACIN DEL LABORATORIO

a calificacin correspondiente al trabajo en el laboratorio es individual. Esta

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

FORMATO DE EVALUACIN DE LA PRCTICA DE LABORATORIO DE

NOMBRES DE LOS ESTUDIANTES QUE ASISTIERON A

PAUTAS A SEGUIR EN LA PRESENTACIN DE INFORMES DE

uena redaccin, ortografa, normas generales en cuanto a unidades, abreviaturas

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

2. El texto se copiar a doble espacio, iniciando los prrafos en el margen

RESULTADOS Y DISCUSIN: Esta es la parte ms crtica de su

d. CONCLUSIN: Ser el balance final de las prctica o investigacin. Se

g. BIBLIOGRAFA: Segn las normas de ICONTEC para libros con autor,

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

Naturaleza de la radiacin electromagntica

a radiacin electromagntica es una forma de energa radiante. Tiene propiedades

ondulatorias, propagndose en forma de ondas. En este fenmeno ondulatorio se

Siendo c = velocidad de la luz.

Siendo h = constante de Plank (6,62* 10 27 erg/seg)

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

El espectro electromagntico cubre un amplio intervalo de energa radiante,

Rayos X Ultravioleta Visible

1.1.2 Descomposicin del espectro en colores y sus complementarios.

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

1.2 Fenmenos de interaccin entre luz y materia

Siendo A = absorbente en estado fundamental

Proceso de emisin. Algunos compuestos tienen la excitacin, tras ser excitados, de

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

1.3 Espectrofotometra de absorcin

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

El valor experimental de la transmitancia, el de Absorbancia (A), ya que la relacin entre

A log Is / Io log %T log 1 / T

De esta relacin matemtica se deduce que la relacin logartmica entre A y %T se

%T va de 0 a 100.... Si %T 100 A 2 log 100 0

Esta ecuacin constituye la base de anlisis cuantitativo de las determinaciones

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

Los valores de absorbancia no tienen unidades. El coeficiente de absorcin es una

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

El mtodo de trabajo con curva de calibracin consiste en ensayar varias soluciones de

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

difusa; la luz pasa a travs de la cubeta, donde no se produce el proceso de absorcin;

Fuente de energa radiante

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

Lmparas de hidrgeno y deuterio:

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

eliminar las posibles interferencias de absorcin o reflexin por parte de la propia

Gua de Laboratorio de Bioqumica General

Desviaciones de la Ley de Beer: