Manual Bacteriologico Bartonelosis

MINISTERIO DE SALUD
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
DIAGNSTICO BACTERIOLGICO
DE LA BARTONELOSIS HUMANA
Instituto Nacional de Salud

Calle Cpac Yupanqui 1400, Lima 11, Per
Telfono: (0511) 471-9920 Fax: (0511) 471-0779
Correo electrnico: revmedex@ins.gob.pe
Pgina web: www.ins.gob.pe
DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA O ENFERMEDAD DE CARRIN
O ENFERMEDAD DE CARRIN
Lima, 2006
DIAGNSTICO
BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA
MINISTERIO DE SALUD
Ministerio de Salud
DE LA BARTONELOSIS HUMANA O
ENFERMEDAD DE CARRIN
ELABORACIN:
Biloga Gladis Ventura Egsquiza
Bilogo Carlos P. Padilla Rojas
Centro Nacional de Salud Pblica
Instituto Nacional de Salud
Lima, 2006
I NSTITUTO N ACIONAL
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
Catalogacin hecha por el Centro de Informacin y Documentacin

del Instituto Nacional de Salud (INS)
Ventura Egsquiza, Gladis; Padilla Rojas, Carlos P.

Diagnstico bacteriolgico de la Bartonelosis humana o enfermedad de
Carrin / Elaborado por Gladis Ventura Egsquiza y Carlos P. Padilla Rojas.
Lima: Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2006.
52 p. : 14.8 x 21 cm.
1.
INFECCIONES POR BARTONELLA / diagnstico 2. PER
I. Ventura Egsquiza, Gladis

II. Padilla Rojas, Carlos P
III. Instituto Nacional de Salud (Per)
IV. Per. Ministerio de Salud
ISBN 9972-857-57-3
Hecho el Depsito Legal en la Biblioteca Nacional del Per N: 2006-8865
Ministerio de Salud, 2006
Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jess Mara, Lima, Per
Telfono: (511) 431-0410
Instituto Nacional de Salud, 2006
Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara, Lima-Per
Telfono: (511) 471-9920 Fax: (511) 471-0979
Correo elctrnico: revmedex@ins.gob.pe
Pgina web: www.ins.gob.pe
Publicacin aprobada con R.J. N
Portada: Frotis sanguneo con 100% de hemates infectados. Giemsa X 1000. INS
Se autoriza su reproduccin total o parcial, siempre y cuando se cite la fuente.
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
CONTENIDO
RESOLUCIN JEFATURAL ....................................................................................... 5
INTRODUCCIN ........................................................................................................ 7
SECCIN 1: BIOSEGURIDAD .................................................................................... 9
1.1.AGENTE INFECCIOSO ......................................................................................... 10
1.2.PELIGROS PARA LA SALUD ............................................................................... 10
1.3.EPIDEMIOLOGA ................................................................................................... 10
1.4.DISEMINACIN ..................................................................................................... 10
1.5.VIABILIDAD .......................................................................................................... 10
1.6.DATOS GENERALES ........................................................................................... 11
1.7.RIESGOS EN EL LABORATORIO ........................................................................ 11
1.8.PRECAUCIONES ................................................................................................... 11
1.9.MANEJO DE MATERIAL EN CASO DE ACCIDENTES .......................................... 12
SECCIN 2: PROCEDIMIENTO DE OBTENCIN DE MUESTRA ............................ 13
2.1.OBTENCIN DE MUESTRAS ................................................................................ 13
2.1.1. Objetivo
2.1.2. Tipos de muestra
2.2. CONDICIONES GENERALES .............................................................................. 13
2.3. OBTENCIN DE MUESTRAS DE SANGRE ......................................................... 14
2.3.1. Errores comunes al preparar los frotis sanguneos
2.3.2. Riesgos relacionados con la puncin venosa
2.4. OBTENCIN DE MUESTRAS DE TEJIDO (BIOPSIAS) DE ERUPCIONES
O VERRUGAS ...................................................................................................... 17
2.4.1. Objetivo
2.4.2. Materiales para la obtencin de biopsias
2.4.3. Procedimientos
SECCIN 3: CONSERVACIN Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS
Y CULTIVOS .............................................................................................................. 18
3.1.OBJETIVO ............................................................................................................ 18
3.2. CONDICIONES ESPECFICAS ............................................................................. 18
3.2.1. Muestras de sangre y biopsias para pruebas moleculares
3.2.2. Remisin de cultivos
3.2.3. Informacin bsica que debe acompaar a las muestras
SECCIN 4: DIAGNSTICO BACTERIOLGICO ................................................... 22
4.1.DIAGNSTICO DIRECTO MEDIANTE COLORACIN DEL FROTIS
SANGUNEO CON COLORANTE GIEMSA .................................................................. 23
4.1.1. Objetivo
4.1.2. Materiales para coloracin
4.2.PROCEDIMIENTOS DE LA COLORACIN DE LA MUESTRA SANGUNEA ......... 24
4.2.1. Coloracin sobre varilla de vidrio
4.2.2. Coloracin mediante la inversin de la lmina
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
4.3 OBSERVACIN Y LECTURA MICROSCPICA DE LOS

FROTIS SANGUNEOS ......................................................................................... 28
4.4. ERRORES DURANTE LA LECTURA DE LMINAS ............................................. 32
4.5.DIAGNSTICO MEDIANTE CULTIVOS ................................................................. 33
4.5.1. Condicin especfica de la muestra
4.5.2. Materiales para el cultivo
4.5.3. Preparacin de la muestra sangunea
4.5.4. Procedimiento para el cultivo en placas
4.5.5. Procedimiento para el cultivo en medio bifsico
4.5.6. Lectura de cultivos
4.5.7. Subcultivos
4.5.8. Identificacin de Bartonella bacilliformis
4.6. CRIO CONSERVACION DE LAS CEPAS ............................................................. 42
SECCIN 5: BIBLIOGRAFA ..................................................................................... 43
ANEXOS
ANEXO 1
ANEXO 2
ANEXO 3
ANEXO 4
ANEXO 5
PREPARACIN DE REACTIVOS Y COLORANTE GIEMSA .................... 45

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO MONOFSICO ..................... 47
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO BIFSICO .............................. 48
PREPARACIN DEL MEDIO GEL DE FASES .......................................... 50
PREPARACIN DEL MEDIO DE CRIOCONSERVACIN DE CEPAS ........ 51
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
INTRODUCCIN
La enfermedad de Carrin o Bartonelosis humana es una enfermedad

infecciosa cuyo agente etiolgico es la Bartonella bacilliformis, que es
transmitida por la picadura de mosquitos del gnero Lutzomyia.
La enfermedad presenta una primera fase hemtica, anmica o febril, con
una letalidad alta cuando el tratamiento no es administrado oportunamente;
la segunda fase es la histioide o verrucosa que aparece varios meses
despus. Entre ambas fases, se presenta una fase intercalar asintomtica
que puede durar de una a tres semanas o varios meses. Esta enfermedad
es endmica en algunas regiones del Per, Ecuador y Colombia.
Existen indicios de que la Bartonelosis era conocida por culturas
precolombinas de Per y Ecuador, por la presencia de lesiones que
semejan a la fase verrucosa de la enfermedad, en huacos de cermica
antropomrfica y en monolitos de la cultura preinca Huaylas encontrados
en el departamento de Ancash. Durante la conquista, los espaoles
sufrieron una enfermedad con la caracterstica de verruga sangrante y
mortal, siendo diezmados por ella. Durante la Repblica, se registr una
grave epidemia mientras se construa el ferrocarril central.
Existen zonas endmicas en Ancash, Cusco, Cajamarca, Amazonas, Lima,
Piura, La Libertad, Huancavelica, Hunuco, Ayacucho y Junn. Durante el
Fenmeno el Nio de los aos 1997-1998, se produjeron cambios
climatolgicos que incrementaron la densidad del vector en varios valles
interandinos y se presentaron rebrotes despus de muchos aos en los
valles de Caete-Yauyos en Lima, Pataz en Trujillo, Quillabamba en Cusco
y en zonas donde no haba reportes anteriores de enfermedad como el
Valle del Urubamba en el Cusco.
El ao 2002 se present otro brote, en una zona no endmica, en la localidad
de Caaris, departamento de Lambayeque. Durante el 2004 se han
presentado casos no autctonos en Madre de Dios; y entre marzo y abril
del 2005, se present un brote despus de muchos aos en Huarochir
Lima Este; y recientemente en setiembre de 2006 se present un caso
fatal en una persona que visit la cuenca de Santa Eulalia
La localizacin, diagnstico, confirmacin y tratamiento de los casos
agudos de esta enfermedad, se constituyen en actividades fundametales
de un sistema de vigilancia. En este sentido, siendo el diagnstico
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
bacteriolgico necesario para confirmar la sospecha clnica, se requiere la

estandarizacin y definirse las pautas para la correcta obtencin de
muestras de sangre y realizacin del frotis sanguneo, cultivo, aislamiento
e identificacin de la Bartonella bacilliformis.
El Instituto Nacional de Salud pone a disposicin este manual de
procedimientos orientado al diagnstico de la enfermedad de Carrin con
el objeto de fortalecer la capacidad diagnstica de los establecimientos de
salud.
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
SECCIN 1
BIOSEGURIDAD
1.1. AGENTE INFECCIOSO
NOMBRE: Bartonella bacilliformis
CLASIFICACIN
PHYLUM BXII. Proteo bacteria
CLASE I.
Alpha proteo bacteria
ORDEN VI.
Rhizobiales
FAMILIA II
Bartonellaceae
GENERO
Bartonella
ESPECIE
bacilliformis
SINNIMOS: Bartonelosis humana, fiebre de La Oroya, enfermedad de

Carrin, verruga peruana, anemia grave de Carrin
CARACTERSTICAS: Bacilos Gram negativos; mviles con flagelos polares.
Figura 1. Bartonella baciliformis con flagelos unipolares. Microscopa electrnica.

Cortesa: Dr. Luis Solano. Instituto de Medicina Tropical Daniel Alcides Carrin,
Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
1.2. PELIGROS PARA LA SALUD

Patogenicidad: Caracterizada por dos formas clnicas diferentes: (a) la
anemia febril (fiebre de la Oroya) manifestada por fiebre irregular, anemia
grave, linfoadenopata generalizada y delirio; (b) la erupcin drmica (verruga
peruana) caracterizada por ndulos pequeos tipo hemangioma,
acompaada por dolores musculares y articulares, puede ser precedida
por la fiebre de la Oroya.
1.3. EPIDEMIOLOGA
Limitada a los valles interandinos de Per, Ecuador y el sudoeste de
Colombia donde el vector est presente.
RANGO DE HOSPEDEROS: Humanos.
DOSIS INFECTANTE: No conocida.
MODO DE TRANSMISIN: Por la picadura de mosquitos del gnero
Lutzomyia, o por transfusin sangunea.
PERODO DE INCUBACIN: Usualmente de 16 a 22 das, ocasionalmente
de tres a cuatro meses.
COMUNICABILIDAD: No se ha documentado transmisin de persona a
persona, la sangre del paciente permanece infecciosa para el mosquito
por varios meses despus de la enfermedad.
1.4. DISEMINACIN
RESERVORIO: Humanos
ZOONOSIS: No
VECTORES: Mosquitos del gnero Lutzomyia.
1.5. VIABILIDAD
SUSCEPTIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS: Susceptible a penicilina,
estreptomicina, ciprofloxacino, cloramfenicol, tetraciclina, azitromicina.
RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS: Acido nalidxico, se ha encontrado
resistencia in vitro a penicilina, ampicilina, tetraciclina y vancomicina.
DE
S ALUD
10
DIAGNSTICO
SUSCEPTIBILIDAD A LOS DESINFECTANTES: Susceptible a los

desinfectantes comunes como el etanol 70%, el hipoclorito de sodio 1%, y
el formaldehdo 2%.
INACTIVACION FSICA: Sensible al calor.
SOBREVIDA FUERA DEL HUESPED: Puede sobrevivir en agua de cao a
temperatura ambiente hasta por siete das.
1.6. DATOS GENERALES
VIGILANCIA: Buscar sntomas, demostrar la presencia del microorganismo
en sangre o en las lesiones de la piel.
PRIMEROS AUXILIOS / TRATAMIENTO: Terapia antibitica
INMUNIZACIN: Ninguna.
PROFILAXIS: Ninguna.
1.7. RIESGOS EN EL LABORATORIO
INFECCIONES ADQUIRIDAS EN EL LABORATORIO: Un caso reportado
hasta 1988; infeccin de un mdico al momento de hacer una transfusin
a un paciente anmico (Rebagliati, 1940).
FUENTES / MUESTRAS: Sangre, lesiones de la piel.
RIESGOS PRIMARIOS: Inoculacin parenteral accidental, contacto con
mosquitos infectados (medio ambientales o en el laboratorio).
RIESGOS ESPECIALES: Ninguno.
1.8. PRECAUCIONES
REQUERIMIENTOS DE CONTENCIN: Nivel de bioseguridad II, aplicable
a las prcticas, equipos y edificaciones para realizar las actividades que
tengan material infeccioso o potencialmente infeccioso.
ROPA DE PROTECCIN ADECUADA: Mandil de laboratorio con manga
larga y puos cerrados; guantes cuando se trabaje con material infeccioso.
OTRAS PRECAUCIONES: Evitar la inoculacin accidental y seguir reglas
generales de seguridad en el uso de agujas.
11
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
1.9. MANEJO DE MATERIAL EN CASO DE ACCIDENTES

DERRAMES: Permitir que los aerosoles se depositen; utilizando ropa de
proteccin, cubrir cuidadosamente el derrame con papel absorbente y
aplicar una solucin de hipoclorito de sodio al 1% empezando en el
permetro y terminando en el centro; permitir un tiempo de contacto
adecuado (30 minutos) antes de limpiar.
ELIMINACIN: Descontaminar todos los desechos antes de eliminarlos,
por esterilizacin en autoclave, desinfeccin qumica o incineracin.
ALMACENAMIENTO: En contenedores sellados que estn apropiadamente
etiquetados, en un laboratorio de bioseguridad de nivel II.
Nota: Aunque la informacin, opiniones y recomendaciones de seguridad se han

compilado de fuentes que se consideran confiables, no aceptamos responsabilidad
por la precisin, suficiencia, confiabilidad o por cualquier prdida o dao resultante
del uso de esta informacin. La aparicin de nuevos riesgos es frecuente y esta
informacin puede no estar completamente al da.
DE
S ALUD
12
DIAGNSTICO
SECCIN 2
PROCEDIMIENTOS DE OBTENCIN DE MUESTRAS
2.1. OBTENCIN DE MUESTRAS
La efectividad y xito del diagnstico bacteriolgico depende en gran medida
de la obtencin y el transporte oportuno de las muestras al laboratorio, por
esta razn el equipo de salud involucrado debe entender la naturaleza
crtica de mantener la calidad de las muestras durante todo el proceso.
2.1.1. Objetivo
Describir los procedimientos para la obtencin de muestras de sangre
para el diagnstico directo mediante coloracin Giemsa, aislamiento
bacteriano y pruebas moleculares.
2.1.2. Tipos de muestra
a) Para el diagnstico directo:
Frotis sanguneo de sangre perifrica en lminas portaobjetos.
b) Para aislamiento - cultivo:
Sangre total con anticoagulante en tubos al vaco con citrato de sodio,

heparina o EDTA.
Sangre total inoculada directamente al medio de cultivo bifsico

(inmediatamente despus de la extraccin de la muestra
sangunea).
Biopsias de las lesiones, colocadas en recipiente estril.
c) Para diagnstico histopatolgico:
Biopsias de las lesiones en formol al 10%
2.2. CONDICIONES GENERALES

2.2.1. Todas las muestras de sangre deben ser consideradas como
potencialmente patgenas, por eso deben ser manipuladas tomando las
medidas de proteccin y tratadas como altamente infecciosas, para evitar
posibles contagios de enfermedades como hepatitis viral B, C, VIH, etc. Se
debe usar guantes durante todo el procedimiento de obtencin de muestras.
13
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
2.2.2. Elegir el lugar correcto para obtener la muestra, usando una tcnica
asptica que evite la contaminacin de la muestra con flora normal.
2.2.3. Obtener suficiente cantidad de muestra de sangre (5mL) para
asegurar el aislamiento del germen y evitar los resultados falsos negativos.
2.2.4. Obtener las muestras antes de la administracin de algn agente
antimicrobiano. Si la muestra ha sido tomada despus de haber iniciado
terapia antibitica, el laboratorio debe ser informado al respecto.
2.2.5. Las muestras se colocan en un recipiente secundario apropiado
para su transporte al laboratorio para evitar cualquier derrame, y por lo
tanto los riesgos que de ello se derivan.
2.2.6. Luego de ser obtenidas, enviar las muestras al laboratorio tan pronto
como sea posible.
2.2.7. Las muestras deben conservarse en forma adecuada.
2.2.8. El paciente debe ser informado en forma clara y sencilla de acuerdo
con su grado de instruccin, sobre los procedimientos que se van a realizar
con las muestras biolgicas que de l se han obtenido.
2.3. OBTENCIN DE MUESTRAS DE SANGRE
2.3.1. Procedimiento
Para la obtencin de muestras de frotis sanguneo y sangre total seguir las
indicaciones del Manual de procedimientos de laboratorio para la obtencin
y envo de muestras, Norma Tcnica N 15.
2.3.2. Errores comunes al preparar las muestras de frotis sanguneo.
Se deben seguir las siguientes indicaciones para evitar errores:
No colocar la cantidad adecuada de sangre en la lmina. El tamao de

la gota para hacer el frotis sanguneo, idealmente es una gota similar a
aquella formada cuando se hace una gota con una aguja hipodrmica
N 21.
-
Si la gota es muy grande el extendido ser muy grueso, se formar

una pelcula con varias capas superpuestas de clulas, la coloracin
quedar oscura y durante el examen no se podrn observar las
clulas que estn por debajo de otras y que podran estar infectadas.
DE
S ALUD
14
DIAGNSTICO
En caso contrario si la gota es muy pequea, se obtendr un frotis

de distribucin pobre y no homognea de las clulas, por lo tanto no
se examinar la cantidad adecuada de glbulos rojos disminuyendo
la posibilidad de encontrar clulas infectadas.
No usar lminas con grasa (sin lavar) para hacer el frotis. En estas
lminas la sangre se esparcir en forma irregular, lo que dificultar la
lectura.
No usar lminas mal enjuagadas. Las lminas con algn rastro de

detergente pueden alterar el colorante en el momento de la tincin.
No usar lminas con borde astillado o irregular para hacer el frotis. En

este caso la sangre se esparcir irregularmente, el frotis no ser
homogneo, y se formarn muchas colas dificultando la lectura.
No guardar las muestras inadecuadamente. Al dejar las muestras de

frotis expuestas al ambiente externo, la presencia de insectos, polvo,
entre otros, podran daar la muestra.
No preparar las muestras sobre lminas rayadas. En este caso tambin

se producen extendidos irregulares y no homogneos de la muestra de
sangre.
No colorear las muestras mucho tiempo despus de haberlas obtenido.

Esto dificulta la coloracin de la lmina y por lo tanto se tienen resultados
insatisfactorios.
2.3.3. Riesgos relacionados con la puncin venosa
Sangrado excesivo.
Desmayo o sensacin de mareo.
Hematoma.
Punciones mltiples para localizar las venas: el tamao de las venas

vara dependiendo de un paciente a otro y de una parte del cuerpo a
otra, por tal razn obtener muestras de sangre de algunas personas
puede ser ms dificultosa que en otras.
Infeccin local (flebitis).
15
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
2.4. OBTENCIN DE MUESTRAS DE TEJIDOS MEDIANTE BIOPSIAS DE

ERUPCIONES O VERRUGAS
2.4.1 Objetivo
Describir los procedimientos para la obtencin de muestras de tejidos
para cultivo.
2.4.2. Materiales para la obtencin de biopsias
Ficha de informacin bsica.
Fichas de consentimiento informado.
Sacabocados dermatolgico (punch), de diferentes dimetros, segn

el tamao de la lesin: #3, #4, #5, #6 y #8.
Frascos estriles con formol al 10%.
2.4.3. Procedimientos
Las muestras de biopsias se obtienen de las verrugas del paciente, de la
siguiente manera:
Identificar la verruga en la que se realizar el procedimiento, no debe

tener infeccin secundaria.
Realizar la asepsia de la lesin y de 3 a 4 cm alrededor del rea afectada.
Tcnicas estndar.
Colocar un campo fenestrado para evitar la contaminacin.
Infiltrar la lesin con xilocana al 5% sin epinefrina, se utilizar de 0,5 a

1mL por verruga, se hace un habn en la base de la verruga y se infiltra
dermis y tejido celular subcutneo.
Se toma el sacabocados adecuado al tamao de la lesin, lo ideal es

que cubra toda la verruga siempre y cuando su localizacin lo permita.
Cuando la lesin es en la cara, slo se tomar una muestra pequea

con punch # 3.
La muestra se toma mediante movimientos rotatorios y ejerciendo una

presin sostenida pero suave, calculando que se haya alcanzado el
tejido celular subcutneo (TCSC).
DE
S ALUD
16
DIAGNSTICO
Luego la muestra se retira con una pinza quirrgica estril, si la muestra

estuviera fijada al TCSC se puede utilizar una tijera quirrgica para
liberarla.
Cortar la biopsia en dos, una para patologa y otra para estudios

bacteriolgicos.
Colocar las biopsias para cultivo y pruebas moleculares en un frasco

estril con tapa segura y mantenerla en refrigeracin. Enviar las
muestras lo ms pronto posible (mximo tres das).
Colocar las biopsias para estudios de anatoma patolgica en frascos

conteniendo formol al 10%. Conservarlas y enviarlas a temperatura
ambiente.
No se necesita realizar sutura para la hemostasia, esta se realiza por

compresin.
Luego de que haya cesado el sangrado se coloca sobre la lesin un

antibitico en crema y se cubre con una gasa estril.
Se debe realizar curaciones diarias en el lugar de la toma de muestra

para evitar sobreinfeccin.
Figura 2. Obtencin de muestra de tejido por biopsia con sacabocado.
17
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
SECCIN 3
CONSERVACIN Y TRANSPORTE DE LAS
MUESTRAS Y CULTIVOS
3.1. OBJETIVO
Describir los procedimientos y condiciones para la conservacin y transporte
de las muestras para diagnstico de la enfermedad de Carrin.
3.2. CONDICIONES ESPECFICAS
3.2.1. Muestras de sangre y biopsias
Las muestras de sangre y tejidos preferentemente deben ser

conservadas a -20 C o en cajas de teknopor conteniendo hielo seco, y
enviadas al laboratorio antes de los siete das. De no tener esas
condiciones, se pueden mantener en refrigeracin de 4 - 8 C hasta por
cinco das.
Los tubos (contenedores primarios) con las muestras de sangre, se

envuelven individualmente con papel absorbente o en bolsa plstica,
colocndolos dentro de un contenedor secundario (recipiente de plstico
o metal).
Entre los contenedores primarios y el secundario, colocar lana o algodn

en cantidad suficiente para absorber el contenido completo de todos
los contenedores primarios en caso de filtraciones o rotura del
contenedor primario.
Colocar dentro del contenedor terciario (caja de teknopor) al contenedor

secundario rodeado de hielo seco. De no tener hielo seco poner bloques
refrigerantes.
Cerrar y sellar hermticamente el ltimo empaque.
Adjuntar la ficha de informacin bsica y una lista de los contenidos en

una bolsa plstica, adherirlo al contenedor terciario.
Colocar una etiqueta o rtulo sobre el ltimo empaque, del tamao o

dimensiones suficientes, que permita colocar todos los datos. Los datos
o marcas deben ser visibles y legibles.
DE
S ALUD
18
DIAGNSTICO
DESTINO - DIRECCIN
TELFONO
NOMBRE DEL RESPONSABLE DEL TRANSPORTE
MATERIAL INFECCIOSO - RIESGO BIOLGICO
URGENTE MATERIAL BIOLGICO PERECIBLE
EN CASO DE FUGAS O DAOS NOTIFICAR A LAS AUTORIDADES
SANITARIAS
3.2.2. Remisin de cultivos
Enviar al Instituto Nacional de Salud los frascos de cultivos con

crecimiento de colonias sospechosas a Bartonella bacilliformis, para
reaislamiento, confirmacin e identificacin de especie.
El envo de los cultivos se hace a temperatura ambiente.
Los frascos deben ser rotulados con plumn indeleble (fecha de

obtencin de la muestra, nombre del paciente y cdigo).
Los frascos de cultivo se envuelven en material absorbente como

algodn o papel que permita absorber y amortiguar el material
infeccioso en caso de golpes o rotura del frasco y colocados dentro de
un envase plstico duro con tapa hermtica. Luego en un contenedor
TERCIARIO como el teknopor.
Enviar la ficha de informacin bsica respectiva en un sobre, y ste

dentro de una bolsa plstica, con los datos del destinatario.
El contenedor terciario debe marcarse sealando la orientacin del

embalaje (figura 3), tambin se deben colocar etiquetas indicando el
tipo de riesgo.
Rotular la caja trmica con los siguientes datos:
DESTINO - DIRECCIN
TELFONO
NOMBRE DEL RESPONSABLE DEL TRANSPORTE
MATERIAL INFECCIOSO - RIESGO BIOLGICO
URGENTE MATERIAL BIOLGICO PERECIBLE
EN CASO DE FUGAS O DAOS NOTIFICAR A LAS AUTORIDADES
SANITARIAS
19
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
Figura 3. Embalaje con seal de orientacin.
DE
S ALUD
20
DIAGNSTICO
3.2.3. Ficha de informacin bsica que debe acompaar a las muestras

enviadas.
Hospital o Establecimiento de Salud:

Regin:
Nombre del paciente:
Sexo:
M( )
F( )
Procedencia: Departamento:
Distrito:
Lugar y fecha probable de exposicin:
Fecha de Nacimiento:
Provincia :
Localidad :
Diagnstico presuntivo:
Observaciones:
USO DE ANTIBITICO DENTRO DE LA LTIMA SEMANA

Recuerda uso de antibitico:
Si ( )
No ( )
Si es Si. Qu antibitico:
No sabe ( )
Fecha de inicio del tto:
Nmero de dosis:
Fecha ltima dosis:

MUESTRA ENVIADA
Tipo de muestra:
frotis ( )
sangre ( )
Fecha de obtencin: ___/___/____
suero ( )
otro:
Inicio de enfermedad: ____/____/____
Examen solicitado: Cultivo ( ) Frotis sanguneo ( ) PCR (

NOMBRE DEL MEDICO:
) Biopsia ( ) otro:
FIRMA:
RESULTADO DE LABORATORIO DEL FROTS SANGUNEO

Laboratorio :
Muestra recibida:
Estado de la lmina:
Fecha de recepcin:
Resultado:
Porcentaje de parasitemia:
Fecha de envo a laboratorio de referencia:
Nombre del Responsable:
Firma:
21
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
SECCIN 4
4.1. COLORACIN DEL FROTIS SANGUNEO CON GIEMSA
La coloracin de Giemsa es una modificacin de la coloracin de
Romanowsky, est disponible en cualquier laboratorio y nos permite
detectar los glbulos rojos infectados por Bartonella bacilliformis en sus
formas bacilares, cocobacilares o cocoides. La muestra debe ser fijada
con metanol antes del proceso de tincin.
4.1.1. Objetivo
Describir los procedimientos tcnicos de tincin del frotis sanguneo
mediante el mtodo de la coloracin Giemsa.
4.1.2. Materiales para la Coloracin
Colorante Giemsa (stock).

Solucin de trabajo (colorante diluido).
Metanol.
Varillas de vidrio para coloracin.
Bandeja.
Frascos gotero.
Papel de filtro.
Pinza.
Embudo.
Reloj.
Tampn fosfato.
4.2. PROCEDIMIENTO DE LA COLORACIN DE LA MUESTRA SANGUNEA
El frotis sanguneo debe estar seco antes de la fijacin, se puede acelerar

el secado empleando calor suave como el generado por una lmpara.
Evitar utilizar demasiado calor porque esto dificulta la coloracin.
DE
S ALUD
22
DIAGNSTICO
Figura 4. Muestras de frotis sanguneo para coloracin.
Fijar el frotis sanguneo sumergiendo la lmina en un frasco con metanol

por tres segundos. Sacarlo y dejar secar o colocar la lmina sobre una
varilla de vidrio y cubrir la superficie con metanol y dejar que se evapore
por completo (Figura 5).
Figura 5. Fijacin de la muestra de frotis sanguneo.
Preparar el colorante diluido o solucin de trabajo inmediatamente antes

de iniciar la coloracin (ver anexo 1) y asegurarse que el volumen
preparado sea suficiente para las muestras que se va a colorear (aprox.
1 mL por lmina). Se debe evaluar y ajustar el colorante de trabajo en
funcin al estado y caractersticas del colorante madre.
23
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
Filtrar la solucin de trabajo con papel filtro (Figura 6).
Figura 6. Filtracin de la solucin de trabajo con papel filtro.
4.2.1. Coloracin sobre varillas de vidrio

Es la forma ms rpida y se puede colorear hasta diez lminas al mismo
tiempo.
Colocar la varilla de vidrio sobre un lavatorio o recipiente, para facilitar la

eliminacin de los lquidos usados en la coloracin.
Se colocan las lminas con los frotis sanguneos, previamente fijados

sobre la varilla, separadas una de otra para poder manipularlas con
seguridad.
DE
S ALUD
24
DIAGNSTICO
Figura 7. Muestras de frotis sanguneo fijadas para colorear.
Se cubre la extensin con el colorante de trabajo diluido 1:10 por 15

minutos. (La dilucin y el tiempo de coloracin se ajusta de acuerdo
con las caractersticas del colorante preparado).
Figura 8. Coloracin de muestras de frotis sanguneo sobre varillas.
Descartar el colorante y lavar la lmina a chorro suave y continuo de

agua de cao hasta que arrastre todo exceso de colorante.
25
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
Figura 9. Lavado de lmina.
Colocar las lminas inclinadas en una gradilla para que escurra el

agua y dejar secar a temperatura ambiente.
Proteger el frotis del polvo.
4.2.2. Coloracin mediante lmina invertida

Este mtodo se utiliza para colorear varias lminas al mismo tiempo y para
evitar o disminuir el precipitado del colorante sobre el frotis sanguneo.
Para realizar este procedimiento se usa una bandeja especial de coloracin
de material acrlico o de vidrio.
Colocar a bandeja de coloracin sobre una superficie plana de

preferencia cerca de un lavatorio (Figura 10).
Colocar las lminas fijadas con metanol que se van a colorear en forma
invertida, es decir, con la muestra del frotis hacia abajo.
Entre lmina y lmina debe haber una distancia tal que permita correr o
agregar el colorante a cada una de las lminas.
Vaciar el colorante de trabajo a la altura de cada lmina sobre la bandeja

y dejar fluir el colorante por debajo de cada una de ellas (Figura 11).
DE
S ALUD
26
DIAGNSTICO
Figura 10. Bandeja de coloracin con las lminas colocadas en posicin invertida.
Figura 11. Proceso de coloracin mediante el mtodo de lmina invertida (A-C).
27
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
En esta forma de coloracin, el precipitado del colorante se va al fondo

de la bandeja quedando la superficie en contacto con el frotis, libre de
precipitado.
Dejar colorear por 15 - 20 minutos
Descartar el colorante y lavar la lmina a chorro suave y continuo de

agua de cao hasta que arrastre todo el exceso de colorante.
En este procedimiento el colorante de la bandeja puede ser reusado

hasta por tres veces.
Colocar las lminas inclinadas en una gradilla para que escurra el

agua y dejar secar a temperatura ambiente.
4.3. OBSERVACIN Y LECTURA MICROSCPICA DE LOS FROTIS

SANGUNEOS
Para la lectura de las lminas es importante conocer el manejo y limitaciones
del microscopio y mantenerlo en buen estado.
En la lectura se debe tener en cuenta:
a) ndice de bacteriemia
b) Forma de las bacterias
En funcin a estos parmetros se deben emitir los resultados para el
pronstico mdico.
Se lee de 50 a 100 campos por lmina con la muestra de frotis

sanguneo a 1000 aumentos (objetivo de 100x) con aceite de inmersin,
buscando la presencia de formas cocobacilares, bacilares o cocoides
que se encuentran dentro de los hemates.
Un frotis sanguneo tiene tres partes cabeza, cuerpo y cola; entre el

cuerpo y la cola generalmente se encuentra una sola capa de clulas
y los hemates estn separados, buscar esta zona para la lectura de la
muestra.
Las formas cocoides se encuentran en pares o cadenas. Si se observa

un solo hemate con forma cocoide es preferible revisar toda la lmina,
es posible que no sea la forma cocoide sino algn artefacto.
En un frotis positivo, se observan hemates deformados y muchas veces

toman la forma ameboide.
DE
S ALUD
28
DIAGNSTICO
El resultado de la lectura del frotis sanguneo se expresa en porcentaje

de hemates infectados, para lo cual se cuenta 100 hemates y se
determina cuntos estn infectados.
Si se observa que las clulas infectadas son ms del 50%, se leern

50 campos.
Si se observa que las clulas infectadas son menos del 50%, se leern
100 campos.
Si se observa que el porcentaje de hemates infectados es menor a

5%, se debe leer toda la lmina.
En el reporte se debe colocar las formas bacterianas observadas, ya

sea bacilar, cocobacilar o cocoide.
En la fase aguda de la enfermedad se observan predominantemente

formas bacilares de color rojizo o violeta, separadas o en grupos dentro
de los hemates; con menos frecuencia se ven formas cocoides.
Figura 12. Frotis sanguneo con hemates infectados con formas cocoides y bacilares.
Giemsa X1000.
29
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
Figura 13. Frotis sanguneo con 100% de hemates infectados. Giemsa X 1000.
DE
S ALUD
30
DIAGNSTICO
Figura 16. Frotis sanguneo con 40% de hemates infectados con formas cocoides
de B. bacilliformis. Giemsa X 1000.
31
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
4.4. ERRORES DURANTE LA LECTURA DE LMINAS

Los errores ms frecuentes son confundir las formas cocoides con punteado
bsofilo, precipitados del colorante, clulas de Heinz o con reticulocitos en
los cuales se colorea el ncleo.
La lectura tambin puede ser obstaculizada en el caso de extendidos
gruesos, que se colorean en tono oscuro y no se observan claramente las
formas cocoides.
Figura 17. Frotis sanguneo grueso, hemates infectados con formas cocoides y
bacilares. Giemsa X 1000.
DE
S ALUD
32
DIAGNSTICO
Figura 18. Frotis sanguneo grueso con 100% de hemates infectados

con formas cocoides. Giemsa X 1000.
4.5. DIAGNSTICO MEDIANTE CULTIVO

El cultivo de las muestras sanguneas es importante para confirmar la
sospecha clnica, y con fines epidemiolgicos.
Figura 19. Medio de cultivo de agar Columbia con sangre de carnero.
33
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
El aislamiento de Bartonella bacilliformis se puede realizar en los siguientes

medios:
En agar Columbia con sangre de carnero al 10% en placas Petri.
En medio de cultivo bifsico distribuido en frascos, constituido por una

fase slida de agar Columbia con sangre de carnero al 10% y extracto
de levadura al 0,1% y una fase lquida con medio RPMI suplementado
con suero fetal bovino; una alternativa para la fase lquida es el medio
RPMI sin suplemento o infusin cerebro corazn.
El mayor porcentaje de aislamientos (70-80%) se logra en las dos

primeras semanas de incubacin, en la tercera y cuarta semana se
obtiene el resto (20-25%).
4.5.1. Condicin especfica de la muestra
La muestra de sangre no debe de tener ms de siete das de haber

sido obtenida.
La muestra debe ser obtenida antes del tratamiento con antibiticos.
4.5.2. Materiales para el cultivo
Jeringa descartable con aguja.

Alcohol de 70.
Algodn.
Guantes estriles.
Contenedor de material contaminado.
Estufa de 28 a 29C.
Pipetas de transferencia descartables estriles.
Tubos al vaco conteniendo la muestra de sangre total.
Medios de cultivo.
4.5.3. Preparacin de la muestra sangunea
Para incrementar el aislamiento de B. bacilliformis de la sangre es

conveniente lisar los eritrocitos por medios mecnicos como el de
centrifugacin de la muestra.
4.5.4. Procedimiento para el cultivo en placas

Colocar en la cabina de seguridad el material necesario para el cultivo de
la muestra sangunea.
DE
S ALUD
34
DIAGNSTICO
Dejar que los medios de cultivo tomen temperatura ambiente.
Rotular con el cdigo del paciente las placas con agar Columbia sangre.
Desinfectar con alcohol de 70 la tapa de jebe del tubo al vaco que

contiene la muestra.
Extraer la muestra con una jeringa, a travs de la tapa de jebe o con

pipeta de transferencia.
Inocular de 0,5 a 1mL de sangre sobre el agar Columbia, dejando que

la sangre fluya sobre la superficie del medio, luego cerrar la placa.
Colocar la placa con la muestra sembrada en bolsas de polietileno de

baja densidad autosellables para mantener la humedad del medio de
cultivo que debido al largo perodo de incubacin se seca y para evitar
contaminacin con hongos saprofitos.
Incubar el cultivo a 28 C hasta por 45 das.
En el caso que el laboratorio no tenga las facilidades ideales para poder

realizar el cultivo sin correr el peligro de contaminarlo, se debe usar un
mechero de gas que d a su alrededor un amplio radio (espacio) de
esterilidad o, de lo contrario se debe utilizar el medio de cultivo bifsico.
Figura 20. Siembra del medio en placas de agar Columbia con sangre de carnero.
35
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
Figura 21. Sellado de las placas en bolsas de polietileno.
4.5.5. Procedimiento para el cultivo en medio bifsico:
Colocar en la mesa de trabajo las muestras de sangre total, contenidas

en tubos al vaco con anticoagulante.
Dejar que los medios tomen temperatura ambiente.
Levantar el diafragma y desinfectar la tapa de jebe del frasco con medio

de cultivo, con alcohol de 70 o alcohol yodado.
Extraer con una jeringa la sangre total del tubo que contiene la muestra
de sangre.
Inmediatamente, inocular a travs del tapn de jebe 0,5 a 1mL de sangre

al frasco con medio de cultivo baando la fase slida.
Si el medio de cultivo se encuentra en frascos con tapa rosca, destapar

e inocular la muestra de sangre con una pipeta de transferencia estril.
Este procedimiento debe realizarse cerca de un mechero.
Se deja reposar el frasco inclinado hasta que la sangre se impregne en

el agar por 30 minutos.
Descartar la aguja y la jeringa en un contenedor resistente a las

punturas.
Limpiar con un algodn empapado con alcohol la tapa del frasco.
Incubar el cultivo a 28-29 C hasta 45 das.
DE
S ALUD
36
DIAGNSTICO
4.5.6. Lectura de cultivos

Cultivos en placas:
Examinar los cultivos visualmente con luz transmitida o con una lupa,
todos los das hasta por 45 das.
Si se ve desarrollo de colonias entre las 24 y 72 horas, no se trata de B.

bacilliformis. Efectuar un examen microscpico de las colonias, realizar
el frotis de una colonia y teirla con colorante Gram para determinar la
forma bacteriana, y si son Gram positivas o negativas. Identificar la
bacteria mediante pruebas bioqumicas y serolgicas; podra tratarse
de una bacteria que est causando una complicacin al paciente, por
lo que es necesario identificarla y realizar el antibiograma
correspondiente.
En el aislamiento primario las colonias de B. bacilliformis se desarrollan

entre cuatro das a seis semanas de incubacin, crecen lentamente.
Son colonias pequeas de apenas 1 mm de dimetro, translcidas
tipo roco o blanquecinas. Realizar el examen del frotis de una colonia
y teirla con colorante Gram para observar la forma bacteriana.
Bartonella bacilliformis colorea muy dbilmente con la tincin de Gram.
Realizar un subcultivo de las colonias sospechosas.
Los cultivos pueden ser crioconservados en medio de infusin cerebro

corazn con 10% de glicerol a -70 C, en el Laboratorio de Referencia
Regional o Nacional (punto 4.4.).
Figura 22. Cultivo puro en placas con agar Columbia

con sangre de cinco a ses das de incubacin.
37
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
Figura 23. Cultivo puro en placas con agar Columbia con sangre de siete
das de incubacin.
Figura 24. Cultivo puro en placas con agar Columbia con sangre de
nueve das de incubacin.
DE
S ALUD
38
DIAGNSTICO
Cultivos en medio bifsico:
En el caso del medio bifsico, baar la fase slida del medio con la
fase lquida inclinndola suavemente cada cuatro o cinco das.
Si a las 24 48 horas se nota desarrollo de colonias sobre el plano

inclinado de la fase slida o se nota turbidez o lisis de los hemates en
la fase lquida, realizar un subcultivo en placas de agar sangre y Mac
Conkey, y proceder a la identificacin del microorganismo; no se trata
de B. bacilliformis, puede ser una infeccin sobreagregada.
Si se observa crecimiento de colonias, turbidez o hemlisis despus

de seis a siete das de incubacin, realizar un subcultivo en placas con
agar Columbia sangre.
Si no se observa crecimiento de colonias o turbidez despus siete u

ocho das, realizar subcultivos ciegos a los 15 das.
Los cultivos deben seguir incubndose hasta por 45 das.
Si se carece de una incubadora de la temperatura indicada, mantener

los frascos de cultivo a temperatura ambiente y enviarlos tan pronto
como sea posible al Laboratorio de Referencia Regional o al Laboratorio
de Referencia de Bartonella del INS.
Figura 25. Cultivos en medio bifsicos.
39
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
Figura 26. Observacin de colonias en medio bifsico.
4.3.7. Subcultivos
Los subcultivos deben realizarse en cabina de bioseguridad.
Desinfectar la tapa del frasco de hemocultivo con alcohol 70 .
Con una jeringa de tuberculina estril, extraer 200 L de la fase lquida

del medio e inocular en la superficie de placas con agar Columbia
sangre y colocar una gota sobre una lmina para hacer un frotis y
coloracin Gram.
Los subcultivos tambin pueden realizarse en frascos con medio

bifsico.
Observar la lmina coloreada con Gram y buscar formas bacterianas.
Incubar los cultivos a 28-29 C y observar hasta por 45 das.
Observar los cultivos con luz transmitida todos los das.
En el caso que se haya realizado la siembra primaria en placas con

agar Columbia y se noten colonias sospechosas, puede hacer un cultivo
usando un asa de siembra, coger una colonia por puntura, se puede
replicar en otra placa con agar Columbia, o se puede inocularla en
frascos con tapa rosca conteniendo medio bifsico.
DE
S ALUD
40
DIAGNSTICO
Lectura de los subcultivos

Despus de varios pasajes de cultivos o subcultivos sucesivos, el
crecimiento de las colonias es ms rpido y se hacen visibles despus de
tres a cuatro das de incubacin. Generalmente, las colonias crecen entre
los 4 y 14 das; sin embargo, debe observarse el subcultivo hasta los 45
das.
4.5.8. Identificacin de Bartonella bacilliformis
La identificacin del gnero se realiza por:
Las condiciones requeridas para el desarrollo bacteriano, como:

1. La temperatura de crecimiento, entre 28 - 29 C.
2. El perodo de incubacin, desarrolla desde los 4 hasta 45 das.
3. Desarrolla slo en medios enriquecidos.
4. El aislamiento primario es lento.
No produce hemlisis en agar Columbia con sangre de carnero.
Son Gram negativos.
Las colonias son pequeas, puntiformes y translcidas, de borde

entero; otras son ligeramente ms grandes blanquecinas, de borde
entero y se adhieren a la superficie del agar, esta adherencia es una
caracterstica fenotpica de algunas colonias. La morfologa de la colonia
y las caractersticas de crecimiento probablemente estn relacionadas
con la patogenicidad del microorganismo.
No crecen en medio de agar Mac Conkey o agar nutritivo.
No fermentan los azcares, son bioqumicamente inertes.
No crece a 37 C.
Son oxidasa negativa, catalasa positiva, ureasa e indol negativo.
Son mviles, lo que se observa en el medio de gel de fases, forman

una banda de desarrollo bacteriano de aproximadamente 6 mm, con
migracin del cultivo desde el trazo de inoculacin hacia las paredes
del tubo.
41
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
Figura 27. Medio gel de fases.
5.4. CRiOCONSERVACIN DE LAS CEPAS

Los aislamientos que tengan caractersticas compatibles a B. bacilliformis
deben ser almacenados bajo condiciones de crioconservacin.
Procedimiento:
a. Si el subcultivo es en placa: Si se tienen subcultivos positivos y con
colonias de un solo tipo, coger con una asa de siembra las colonias
(cosechar) e inocularlas en crioviales con medio infusin cerebro corazn
con glicerol 10%.
b. Si el subcultivo es en medio bifsico: Coger con una pipeta estril de
0,5 - 2 mL de la fase lquida del medio e inocularlas en crioviales.
c. Las cepas deben guardarse por duplicado o ms a -20 o -70 C.
DE
S ALUD
42
DIAGNSTICO
SECCIN 5
BIBLIOGRAFA
Birtles R, Fry NK, Ventosilla P, Cceres AG, Sanchez E, Vizcarra H, et al.
Identification of Bartonella bacilliformis genotypes and their relevance to
epidemiological investigations of human bartonellosis. J Clin Microbiol
2002 ; 40(10): 3606-12.
Anderson BE, Neuman A. Bartonella spp. as emerging human pathogens.
Clin Microbiol Rev 1997; 10(2): 203-19.
Colichn AH, Colichn A, Solano L. La Bartonella bacilliformis en el medio
de fases. Arch Peru Pat Clin 1971; 25(1): 15-32.
Cuadra M, Cuadra AM. Enfermedad de Carrin: inoculaciones de seres
humanos con Bartonella bacilliformis, una revisin. An Fac Med 2000; 61(4):
289-94.
Dehio C. Molecular and cellular basis of Bartonella pathogenesis. Ann Rev
Microbiol 2004; 58: 365-90.
Ellis BA, Rotz LD, Leake JA, Samalvides F, Bernable J, Ventura G, et al. An
outbreak of acute bartonellosis (Oroya fever) in the Urubamba region of
Peru, 1988. Am J Trop Med Hyg 1998; 6(12): 344-49.
Garrity G, Winters M, Searles D. Taxonomic Outline of the Procaryotic Genera.
En: Garrity GM, Holt JN. Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, 2nd
edition. Berlin: Springer-Verlag KG; 2001.
Huarcaya E, Chinga E, Chavez J, Chauca J, Llanos-Cuentas A, Maguia C,
et al. Influencia del fenmeno de El Nio em la epidemiologa de la
Bartonelosis humana en los departamentos de Ancash y cusco entre 1996
y 1999. Rev Med Hered 2004; 15(1): 4-10.
Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos. Bioseguridad en
laboratorios de ensayo, biomdicos y clnicos. 3ra ed. Lima: INS; 2005.
Serie de Normas Tcnicas N 18.
Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos de laboratorio para
el diagnstico histopatolgico. Lima: INS; 1997. Serie de Normas Tcnicas
N 24.
Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos de electroforesis
para protenas y ADN. Lima: INS; 2003. Serie de Normas Tcnicas N 38.
43
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
Maguia C. Bartonelosis o enfermedad de Carrin. Lima: Editorial AFA Import

SA; 1998.
Minnick MF, Mitchell SJ, McAllister SJ. Cell entry and pathogenesis of
Bartonella infections. Trends Microbiol 1996; 4(9): 343-47.
Per, Ministerio de Salud. Doctrina, normas y procedimientos para el control
de la Bartonelosis o enfermedad de Carrin en el Per. Lima: MINSA; 1998.
Public Health Agency of Canada. Bartonella bacilliformis [pgina de
internet]. Otawa: Office of Laboratory Security, Material Safety Data Sheets,
Infectious Sustances; 2001. Fecha de acceso: enero del 2005. Disponible
en: www.phac-aspc.ge.ca/msds-ftss/msds16e.html.
Rebagliatti R. Verruga Peruana (Enfermedad de Carrin) Lima; Imprenta
Torres Aguirre; 1940.
Saettone-Len A. Verruga Peruana. Dermatol Peru 2004; 14(1-2): 121-33.
Villaseca P, Padilla C, Ventura G, Samalvides F, Yaez H, Chevarria L, et al.
Importancia de la Lutzomia peruensis en la transmisin de la enfermedad
de Carrin en el Valle Sagrado de los Incas, Urubamba-Cusco, Per. Rev
Med Exp 1999; 16(1-2): 28-30.
DE
S ALUD
44
DIAGNSTICO
ANEXO 1
PREPARACIN DE REACTIVOS Y COLORANTE GIEMSA
1. PREPARACIN DE LA SOLUCIN ALCOHLICA GIEMSA (solucin madre)
Frmula:
Colorante Giemsa en polvo, certificado
0,75 g
Alcohol metlico puro.
65 mL
Glicerina pura
35 mL
Preparacin:
A un frasco de vidrio de color mbar conteniendo perlas de vidrio de

dimetro no mayor de 5 mm, se agrega la glicerina; luego se adiciona
el colorante Giemsa, se va agitando. Finalmente, se adiciona el alcohol
metlico.
Agitar el frasco intensamente varias veces al da, durante tres das como
mnimo.
Extraer diariamente una pequea muestra del colorante preparado,

filtrarla a travs de papel filtro # 2, y probar con frotis sanguneos recin
preparados.
Cuando los elementos de la sangre aparezcan con sus colores

apropiados, entonces el colorante est listo para ser utilizado.
2. PREPARACIN DEL DILUYENTE (solucin amortiguadora)

El diluyente es una solucin amortiguadora y se usa en la preparacin del
colorante diluido o solucin de trabajo.
Las sustancias amortiguadoras actan como un adaptador que inactiva
dentro de un margen limitado cantidades variables de cido o lcali.
Frmula:
Ortofosfato disodico anhidro (Na2HPO4)
4g
Ortofosfato monopotsico (KH2PO4)
5g
Preparacin:
Mezclar bien, y disolver 1g de la mezcla en un litro de agua destilada y
ajustar el pH a 7,2.
45
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
3. PREPARACIN DEL COLORANTE DILUIDO O SOLUCIN DE TRABAJO

Frmula:
Solucin madre Giemsa.
0,05 mL
Solucin amortiguadora o diluyente.
0,95 mL
Preparacin:
En una probeta de vidrio se aade la solucin madre Giemsa al 5% con la
solucin amortiguadora.
Una forma ms rpida de preparar el colorante diluido es agregando una
gota de solucin madre por mL de solucin amortiguadora.
Despus de preparado el colorante madre, se debe determinar el tiempo
de coloracin que puede ser entre 15 - 20 minutos y la dilucin en la que se
debe preparar el colorante diluido, estas dos caractersticas se deben
ajustar en funcin al estado del colorante madre.
Recomendaciones:
Mantener el frasco de vidrio color mbar, que contiene la solucin madre

de Giemsa bien cerrado y en un lugar fresco, seco y protegido de la luz
solar directa para evitar la volatilizacin del solvente y la oxidacin del
colorante.
El material de vidrio como probetas, pipetas, cubetas y embudos

empleados en la preparacin de los reactivos y colorantes deben estar
limpios y secos.
El frasco de vidrio usado en la preparacin del colorante debe ser lavado

con detergente y enjuagado hasta que no queden residuos de ste, ya
que puede alterar el pH del colorante y estropearlo.
No se debe aadir agua a la solucin madre Giemsa, porque la mnima

cantidad de sta deteriora el colorante.
No agitar el frasco del colorante antes de utilizarlo porque se suspenden

pequeos cristales de ste que no han sido disueltos, y se quedan en
los frotis sanguneos durante el proceso de coloracin formando
precipitados.
Debe descartarse el colorante diluido no utilizado.
DE
S ALUD
46
DIAGNSTICO
ANEXO 2
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO MONOFSICO
Para preparar los medios de cultivo, la sangre de carnero debe ser estril.
Esto se comprueba mediante el cultivo de una muestra de sangre de carnero
en medios de cultivo de agar soya tripticase y agar Mac Conkey; incubar por
24 y 48 horas.
MEDIO MONOFSICO:
Frmula:
Fase slida
Medio comercial agar Columbia
Sangre de carnero desfibrinada
10%
Extracto de levadura
0,1%
Procedimiento:
Disolver 44 g del medio deshidratado y 1 g de extracto de levadura en

1000 mL de agua destilada, mezclar hasta obtener una solucin
homognea. Calentar agitando hasta la ebullicin para disolver
completamente, mantener a un pH 7,4.
Esterilizar a 121 C durante 15 minutos.
Cuando el medio se encuentra a 50 C, aadir en forma asptica 10%

de sangre desfibrinada de carnero, agitar suavemente para obtener
una mezcla uniforme y repartir en placas Petri.
Dejar que solidifique y controlar esterilidad.
Almacenar hasta por 25 das en refrigeracin.
47
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
ANEXO 3
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO BIFSICO
Para preparar los medios de cultivo, la sangre de carnero debe ser estril.
Esto se comprueba mediante el cultivo de una muestra de sangre de carnero
en medios de cultivo de agar soya tripticase y agar Mac Conkey; incubar por
24 y 48 horas.
MEDIO BIFSICO
Frmula:
Fase slida
Agar Columbia
Sangre de carnero desfibrinada
Extracto de levadura
10%
0,1%
Fase Lquida
RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal (la casa comercial Gibco
distribuye el medio de RPMI por litro).
Procedimiento:
Disolver 44 g del medio deshidratado y 1 g de extracto de levadura en

1000 mL de agua destilada, mezclar hasta obtener una solucin
homognea. Calentar agitando hasta la ebullicin para disolver
completamente, mantener a un pH 7,4.
Esterilizar a 121 C durante 15 minutos.
Cuando el medio se encuentra a 50 C, aadir en forma asptica 10%

de sangre desfibrinada de carnero. Agitar suavemente para obtener
una mezcla uniforme y repartir en frascos de 50 mL.
Inclinar los frascos sobre una de las paredes del frasco y dejar que se
solidifique el medio en plano inclinado.
Controlar su esterilidad durante 72 horas.
Preparar la fase lquida del medio de acuerdo con la cantidad de frascos

que va a preparar.
El pH del medio RPMI 1640 debe de ser 7,4.
Al medio de RPMI aadir el 10% de SBF estril.
DE
S ALUD
48
DIAGNSTICO
Aadir 3 mL de la fase lquida a cada frasco que contiene la fase slida,

este procedimiento debe ser realizado en condiciones de esterilidad.
Colocar el precinto de metal al frasco.
Controlar su esterilidad por 24 horas.
Almacenar en refrigeracin hasta por 25 das.
49
DE
S ALUD
DIAGNSTICO
ANEXO 4
PREPARACIN DE MEDIO GEL DE FASES
A. CALDO PARA LA GELIFICACIN
Bacto tryptosa
10 g
Cloruro de sodio
7g
Agua destilada
1000 ml
Disolver los ingredientes en agua destilada, ajustar a pH 7,0 - 7,2.

Esterilizar a 15 lb X 15 minutos.
B. GEL DE FASES
A 90 mL del caldo de gelificacin se le aade 1,5 mL de ClCa+ al 2%
(esterilizado por filtracin).
Aadir 10 mL de plasma de carnero.
Repartir inmediatamente 5 mL del caldo plasma en tubos con agar sangre.
Dejar en posicin vertical por 24 horas, luego llevar a 37 C para su
gelificacin y control de esterilidad
DE
S ALUD
50
DIAGNSTICO
ANEXO 5
PREPARACIN DE MEDIO DE CRIOCONSERVACIN DE CEPAS
CALDO INFUSIN CEREBRO CORAZN (BHI)
Preparar 100 mL del medio segn las indicaciones del fabricante y

luego aadir 10% de glicerol, repartir en crioviales y esterilizar por calor
hmedo a 15 lb por 15 minutos.
Almacenar en refrigeracin.
51
DE
S ALUD
CEPREDIM
SE TERMIN DE IMPRIMIR
EN EL MES DE SETIEMBRE DE 2006,
POR ENCARGO DEL INSTITUTO NACIONAL DE SALUD,
EN LOS TALLERES GRFICOS DEL
CENTRO DE PRODUCCIN EDITORIAL E IMPRENTA DE

LA UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
JR. PARURO 119. LIMA 1.
TELFONO: 619-7000 ANEXOS: 6011, 6015/ FAX: 6009
E-MAIL: CEPEDIT@UNMSM.EDU.PE
TIRAJE: 1000 EJEMPLARES

Manual Bacteriologico Bartonelosis

Cargado por

Información del documento

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Manual Bacteriologico Bartonelosis

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

MINISTERIO DE SALUD

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

Instituto Nacional de Salud

DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA O ENFERMEDAD DE CARRIN

BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA

BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA

Catalogacin hecha por el Centro de Informacin y Documentacin

Ventura Egsquiza, Gladis; Padilla Rojas, Carlos P.

INFECCIONES POR BARTONELLA / diagnstico 2. PER

I. Ventura Egsquiza, Gladis

BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA

BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA

4.3 OBSERVACIN Y LECTURA MICROSCPICA DE LOS

PREPARACIN DE REACTIVOS Y COLORANTE GIEMSA .................... 45

BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA

BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA

BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA

La enfermedad de Carrin o Bartonelosis humana es una enfermedad

BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA

bacteriolgico necesario para confirmar la sospecha clnica, se requiere la

BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA

Alpha proteo bacteria

SINNIMOS: Bartonelosis humana, fiebre de La Oroya, enfermedad de

Figura 1. Bartonella baciliformis con flagelos unipolares. Microscopa electrnica.

BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA

1.2. PELIGROS PARA LA SALUD

BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA

SUSCEPTIBILIDAD A LOS DESINFECTANTES: Susceptible a los

BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA

1.9. MANEJO DE MATERIAL EN CASO DE ACCIDENTES

Nota: Aunque la informacin, opiniones y recomendaciones de seguridad se han

BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA

Frotis sanguneo de sangre perifrica en lminas portaobjetos.

b) Para aislamiento - cultivo:

Sangre total con anticoagulante en tubos al vaco con citrato de sodio,

Sangre total inoculada directamente al medio de cultivo bifsico

Biopsias de las lesiones, colocadas en recipiente estril.

c) Para diagnstico histopatolgico:

Biopsias de las lesiones en formol al 10%

2.2. CONDICIONES GENERALES

BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA

No colocar la cantidad adecuada de sangre en la lmina. El tamao de

Si la gota es muy grande el extendido ser muy grueso, se formar

BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA

En caso contrario si la gota es muy pequea, se obtendr un frotis

No usar lminas mal enjuagadas. Las lminas con algn rastro de

No usar lminas con borde astillado o irregular para hacer el frotis. En

No guardar las muestras inadecuadamente. Al dejar las muestras de

No preparar las muestras sobre lminas rayadas. En este caso tambin

No colorear las muestras mucho tiempo despus de haberlas obtenido.

2.3.3. Riesgos relacionados con la puncin venosa

Desmayo o sensacin de mareo.

Punciones mltiples para localizar las venas: el tamao de las venas

Infeccin local (flebitis).

BACTERIOLGICO DE LA BARTONELOSIS HUMANA

2.4. OBTENCIN DE MUESTRAS DE TEJIDOS MEDIANTE BIOPSIAS DE

Ficha de informacin bsica.

Fichas de consentimiento informado.

Sacabocados dermatolgico (punch), de diferentes dimetros, segn

Frascos estriles con formol al 10%.

Identificar la verruga en la que se realizar el procedimiento, no debe

Realizar la asepsia de la lesin y de 3 a 4 cm alrededor del rea afectada.

Colocar un campo fenestrado para evitar la contaminacin.

Fecha de obtencin: _/_/____

Inicio de enfermedad: //