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SEMESTRE 2013-I
IV CICLO
GUIA DE PRCTICA
DE
MICROBIOLOGIA MDICA
ASOCIACIN
UNIVERSIADA PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA MDICA
INDICE
Pgina
Recomendaciones generales
Microscopia: estudio y manejo del microscopio
Mtodos de coloraciones: coloraciones simples., diferenciales y especiales
Coloracin diferencial de Gram
Coloracin diferencial de Ziehl-Neelsen
Coloracin especial: coloracin de Leishman y Vago
Medios de cultivo: simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales
Siembra bacteriana. Medios de aislamiento
Metabolismo bacteriano
Pruebas de sensibilidad a los antibiticos (antibiograma)
Reaccin antgeno anticuerpo: Aglutinacin
Fagocitosis
Reaccin de Precipitacin
Pruebas Inmunoenzimaticas: ELISA
Preparacin de Antgenos bacterianos
Aislamiento e Identificacin de cocos Gram positivos: Genero Staphylococcus
Aislamiento e Identificacin de cocos Gram positivos: Gnero Streptococcus
Aislamiento e Identificacin de cocos Gram negativos: Genero Neisseria
Aislamiento e Identificacin de bacilos Gram positivos: Genero Bacillus
Aislamiento e Identificacin de bacilos Gram positivos: genero Listeria
Estudio microbiolgico de la flora normal de la Secrecin Bucofarngea
Aislamiento e Identificacin de bacilos acido- alcohol- resistentes: Genero Mycobacterium.
Aislamiento e identificacin de bacilos Gram positivos: genero Corynebacterium
Aislamiento e Identificacin de bacilos Gram negativos: Genero Pseudomona
Aislamiento e Identificacin de bacilos Gram negativos: Genero Brucella. Hemocultivo y
Serologa
Aislamiento e Identificacin de Enterobacterias: Coprocultivo
Estudio e Identificacin de Vibrio cholerae
Estudio e Identificacin del Genero Leptospira
Estudio e Identificacin de Bartonella
Estudio e Identificacin de Treponema Prueba de VDRL RPR
Cultivo de muestras de infecciones urinarias: Urocultivo
Aislamiento de virus en huevos embrionados y en ratones lactantes.
Estudio e Identificacin de Hongos Ambientales
Estudio e Identificacin de Hongos Dermatofitos
Estudio de Hongos Levaduriformes: Observacin de cortes histopatolgicos
Estudio de Hongos Dimrficos: Observacin de cortes histopatolgicos
ANEXOS: SEMINARIOS:
Gentica Microbiana e Ingeniera Gentica
Vacunas Antimicrobianas. Programa de Vacunacin
Antibiticos y quimioterpicos
Enfermedades de transmisin sexual. SIDA
Arbovirus. Dengue y Fiebre amarilla
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9
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ASOCIACIN
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
ASIGNATURA DE MICROBIOLOGA MDICA
1. El estudiante deber asistir a las clases prcticas llevando consigo la Gua de Prcticas,
mandil, plumn indeleble para escribir sobre vidrio y lpices de colores.
2. No se podr ingresar sin mandil, guantes y mascarilla a la sala de prcticas, para evitar
contaminaciones
3. Durante las prcticas no se debe comer, beber ni fumar, para evitar o prevenir posibles
contaminaciones.
4. Sobre la mesa de trabajo slo debern colocar su gua de prctica y su libreta de apuntes.
5. Eliminar el material de desecho, como papeles, trozos de algodn, etc. al tacho de basura
6. Las coloraciones deben efectuarse en el lavadero de cada mesa de prctica para evitar que se
tian la mesa de trabajo, ropa o manos.
7. Colocar las lminas preparadas sobre hojas de papel blanco.
8. Dejar los cultivos ya usados, en la canastilla de tubos. Tener cuidado que permanezcan
debidamente cerrados y en posicin vertical para evitar que se derramen.
9. Las lminas coloreadas a desecharse debern ser colocadas en frascos de boca ancha con
desinfectante.
10. Todos los cultivos que se preparen debern incubarse, teniendo en cuenta las siguientes
anotaciones:
Nombre o iniciales de los estudiantes
Nombre del germen, nmero de mesa, turno y fecha de la siembra
Las placas debern ser invertidas, a menos que el profesor de instrucciones contrarias
Los tubos debern estar bien tapados y colocados en gradillas
Los alumnos se responsabilizan de colocar estos cultivos en estufa a 37C
11. Al finalizar el trabajo:
Limpiar con algodn los objetivos del microscopio
Tener cuidado de dejar el objetivo de menor aumento frente al condensador y que no
queden lminas sobre la platina
Limpiar la mesa de trabajo
Comprobar que la llave de gas este cerrada
Lavarse prolijamente las manos con jabn.
12. El Protocolo de cada prctica ser controlado por el profesor al final de la prctica.
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SIGNATURA DE MICROBIOLOGA MDICA
PRCTICA N 1
MICROSCOPIA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO
I.
OBJETIVO
1. Conocer e identificar correctamente las partes pticas y mecnicas del microscopio
compuesto.
2. Familiarizar al alumno con el uso correcto, cuidado y conservacin del microscopio.
II. MATERIALES
Microscopios
Lminas portaobjetos
Laminillas cubreobjetos
Lminas coloreadas
Suero fisiolgico
Pipeta Pasteur
Plumn indeleble
Papel lente
Tela de felpa(25 cm)
Fibra de pelo y lana
Condensador
Brazo y Pie
Charnela
PARTE OPTICA
Ocular
Objetivos
Espejo
Lentes de condensador
Diafragma
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ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA
PRACTICA N 2
INTRODUCCION
La mayor parte de los colorantes usados en Microbiologa son de tres tipos:
A) Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromforo) es el anin llamados colorantes
cidos Ej. Eosinato de sodio Eosina.
B) Aquellos cuyo cromforo es el catin llamados colorantes bsicos Ej. Cloruro azul de
metileno.
C) Los colorantes neutros, compuestos por bsicos y cidos Ej. Hematoxilina (bsico) Eosina
(cido).
En los trabajos bacteriolgicos generalmente se usan colorantes bsicos como el azul de metileno,
cristal de violeta, fucsina bsica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de los colorantes
derivados de la anilina.
Las coloraciones pueden ser segn el nmero de colorantes que utilizan:
A) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul de
lactofenol
B) Diferenciales: cuando utilizan ms de un colorante como la coloracin de Gram, y Ziehl Neelsen.
C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares
como la coloracin de Leishman, Vago, Hiss (para capsula), Wirtz conklin (para espora) etc.
A. COLORACIONES SIMPLES
Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la morfologa de los
microorganismos.
MATERIAL
Muestra con mezcla bacteriana
Lminas portaobjetos
Laminillas cubreobjeto
Asa bacteriolgica de Kolle en aro
Colorante Azul de metileno
Colorante Tinta China
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RESULTADO: Observar la capsula en los microorganismos sin teir resaltan sobre un fondo oscuro.
Como la capsula de la levadura Cryptococcus
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ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA
B. COLORACIONES DIFERENCIALES
Son aquellas coloraciones que utilizan ms de un colorante y, generalmente el segundo colorante es
llamado colorante de contraste. Entre los ms usados tenemos la coloracin de Gram y la de Ziehl
Neelsen o tambin llamado cido- alcohol resistente
COLORACION DE GRAM
Es una coloracin diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram
negativas, segn la estructura y composicin de la pared celular. En las Gram negativas, el
peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas no estn entrelazadas; en las Gram positivas la
mayora presenta muchas capas de peptidoglucano.
Existen varias modificaciones del Gram, una de ellas es la de Kopeloff
MATERIAL
PROCEDIMIENTO
1. Dividir la lmina en 3 partes: 1/3 para rotular el N de muestra y 2/3 para la preparacin del
frotis.
2. Con el asa bacteriolgica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el
centro de la lmina portaobjeto, extendindola en espiral del centro a la periferia, para obtener
una preparacin en capa fina.
3. Fijar la muestra, mediante el secado del frotis a temperatura ambiente, o con la ayuda de la llama
dbil del mechero de Bunsen.
4. Colocar la lmina portaobjetos con la preparacin sobre la varilla de coloracin.
5. Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, luego agregar 1- 2 gotas de la solucin de
bicarbonato de sodio, dejar actuar por 2 minutos.
6. Lavar con agua corriente (evitar la cada del chorro de agua directamente sobre el frotis)
7. Cubrir con Lugol durante 1- 2 minutos, lavar luego con agua.
8. Decolorar el frotis con una solucin de alcohol- acetona (inclinar la lmina y decolorar hasta que
no arrastre colorante) mximo por 10 segundos. Luego lavar con agua.
9. Cubrir con el colorante de contraste fucsina bsica durante 30 segundos. Luego lavar con agua.
10. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama dbil del mechero de Bunsen
11. Observar al microscopio con el objetivo de inmersin.
RESULTADOS
Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram negativas de color rosado.
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PRACTICA N 3
COLORACION DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN
INTRODUCCION
Coloracin diferencial que permite la tincin de microorganismos que poseen elevado contenido de
lpidos, como el gnero Mycobacterium (bacilo tuberculoso), llamados tambin cido-alcoholresistente. Al teirse los microorganismos con el colorante primario (fucsina bsica fenicada) que es
soluble en sustancias lipoides y aplicando el calor, el colorante es forzado a penetrar en la clula y en
esta forma resistir a la decoloracin.
MATERIAL
Lminas con frotices de bacilo tuberculoso
Set de coloracin Ziehl-Neelsen:
Fucsina fenicada al 5% (colorante primario)
Alcohol cido (alcohol etlico con 3% de HCl)
Azul de metileno (colorante de contraste)
Mechero de alcohol
PROCEDIMIENTO
1. Cubrir con fucsina fenicada el frotis realizado en la lmina y calentar la preparacin con el
mechero de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento por
tres veces, evitando que hierva el colorante.
2. Lavar con agua corriente.
3. Decolorar con alcohol cido hasta que se aprecie una coloracin rosada.
4. Lavar con agua corriente
5. Cubrir con colorante de contraste: Azul de metileno por un minuto.
6. Lavar con agua corriente
7. Secar y observar con lente de inmersin.
RESULTADO
Las bacterias cido alcohol resistentes se tien de color rojo y las no cido alcohol resistentes se
tien de color azul.
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la prctica.
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PRACTICA N 4
INTRODUCCION
Son coloraciones especiales que permiten colorear algunas bacterias que no tienen afinidad con los
colorantes de anilina como: las espiroquetas. As como tambin la coloracin de microorganismos
presentes en la sangre.
COLORACION DE LEISHMAN
Es una coloracin especial policromtica utilizada para demostrar la presencia y morfologa de
microorganismos en sangre y tejidos como: Bartonella, Hongos, Rickettsias.
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
5.
COLORACIN DE VAGO
Es utilizado para la coloracin de grmenes espirilares y espiroquetas, que no se colorean por el
mtodo de Gram, ni por el Ziehl-Neelsen y que se colorean muy dbilmente con el Leishman.
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MATERIALES
Lmina portaobjetos
Palito mondadientes
Solucin fisiolgica al 0.85%
Set de coloracin de Vago:
Mercuro cromo al 2%
Violeta de genciana
Asa de siembra en aro
Microscopio con lentes de 100X
Aceite de inmersin
PROCEDIMIENTO
1. En una lamina colocar una gota de suero fisiolgico al o.85%
2. Con el palito mondadientes obtener una muestra de sarro dentario y realizar un frotis en capa
fina extendiendo en sentido espiral de adentro hacia fuera.
3. Fijar el frotis al calor suave
4. Cubrir con Mercuro cromo durante 3 minutos
5. Lavar con agua corriente
6. Cubrir el frotis con Violeta de genciana por 3 minutos
7. Lavar con agua corriente
8. Secar y observar al microscopio con objetivo de inmersin.
RESULTADOS
Coloracin Leishman: Los microorganismos se tien de color rosado oscuro
Coloracin de Vago: Observar Treponema phagadeni, espiroqueta que se encuentra formando parte
de la flora normal de la boca, en forma de espiral y de color violeta- rosado.
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PRACTICA N 5
MEDIOS DE CULTIVO: SIMPLES, ENRIQUECIDOS, SELECTIVOS Y
DIFERENCIALES,
INTRODUCCION
Para el aislamiento de bacterias de un material patolgico, es necesario su cultivo en medios
especiales con una determinada concentracin de iones de hidrgeno, sales, compuestos
nitrogenados, hidratos de carbono, humedad y temperatura. Segn su utilizacin pueden ser: simples,
enriquecidos, selectivos y diferenciales.
MATERIALES
0.3 g
1.0 g
0.5 g
0.5 g
100 ml
7.0 - 7.4
14
Goteros de vidrio
Trpodes con malla de Asbesto
Tubos de 16x150 mm
Tubos de 13x100 mm
Placas Petri
Frascos estriles
Agua destilada
Tubo con sangre citratada
Caldo peptonado
Peptona
2.0 g
Cloruro de sodio
1.0 g
PREPARACION
I.
1. Caldo nutritivo; primero disolver los ingredientes en los 100 ml de agua destilada y someter al
calor hasta su completa dilucin. Luego tomar el pH con el papel indicador. Si el medio es cido
agregar gota a gota la solucin de NaOH; si el medio es alcalino agregar gota a gota solucin de
HCl hasta lograr el pH indicado. Envasar y esterilizar al autoclave a 121C por 15 Minutos.
Controlar la esterilidad incubando a 37C por 24 horas. Luego dejar en refrigeracin hasta su
utilizacin.
2. Agar nutritivo o simple; disolver primero el Agar en los 100 ml de agua destilada tibia, luego
agregar los dems ingredientes. Controlar el pH con ayuda de las soluciones de NaOH HCl.
Luego envasar y esterilizar a 121C por 15 Minutos y controlar la esterilidad por incubacin a
37C por 24 horas. Dejar luego en refrigeracin hasta su utilizacin.
II.
MEDIOS ENRIQUECIDOS
1. Para el Agar Sangre; primero preparar Agar simple y esterilizar en autoclave, luego dejar
enfriar hasta una temperatura de 45C y adicionar 5ml de sangre citratada o desfibrinada.
Mezclar con movimientos rotatorios hasta obtener un buen homogenizado y distribuir en Placas
Petri estriles; dejar luego solidificar y realizar el control de esterilidad. Mantenerlo en
refrigeracin hasta su utilizacin. El color normal del medio debe ser rojo cereza.
2. Para el Agar chocolate; preparar primero Agar sangre y someterlo a una temperatura de 80C
hasta que se torne color chocolate, luego repartir en placas Petri estriles y realizar control de
esterilidad y dejarlo despus en refrigeracin.
III.
MEDIOS SELECTIVOS
3. Para el Agar Mac Conkey; disolver el medio en los 100 ml de Agua destilada, calentar hasta su
completa disolucin. Autoclavar a 121 C por 15 Minutos y repartir en placas estriles.
4. Para el Agar SS; disolver el medio deshidratado en 100 ml. de Agua destilada, someter al calor
hasta su completa disolucin. Repartir luego en placas estriles. No necesita autoclavar.
IV.
MEDIOS DIFERENCIALES
1. Para el Agar TSI (Hierro tres azcares); disolver el medio en 100 ml de Agua destilada, hervir
hasta su completa disolucin. Distribuir en tubos de 13x100mm y esterilizar en autoclave a 121
C por 15 Minutos. Luego de autoclavar colocar los tubos en plano inclinado. El medio al final
tendr un color rojo naranja.
2. Para el Agar Citrato Simmons, seguir los pasos para el Agar TSI, el medio tendr un color
verde.
3. Para el Agar Urea; disolver el medio en agua destilada, hervir hasta su completa disolucin y
autoclavar. Despus adicionar 5 ml de Solucin de Urea al 40% esterilizada por filtracin;
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PROTOCOLO
Realizar un cuadro indicando:
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A.
B.
C.
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PRACTICA N 6
INTRODUCCION
Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un
incremento marcado del nmero de clulas. Algunas especies alcanzan una poblacin mxima a las
24 horas y otras necesitan un perodo ms prolongado para alcanzar su mximo desarrollo.
Los microorganismos que desarrollan en medios de cultivo en el laboratorio, se denominan cultivos
y el resultado de la multiplicacin bacteriana colonia, as como el procedimiento por el cual se pone
en contacto un microorganismo con un medio de cultivo, se llama siembra.
Existen varias
tcnicas de siembra, siendo las ms usadas : La siembra por estra, por dispersin-agotamiento,
por inoculacin y por puntura.
Las principales caractersticas morfolgicas que presentan las colonias son:
FORMA
ELEVACIN
BORDE
SUPERFICIE
TAMAO
CONSISTENCIA
CROMOGENESIS
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
A) TIPOS DE SIEMBRA
Siembra por estra: Diseminar en forma de zigzag, una pequea cantidad de muestra bacteriana
sobre la superficie del medio de cultivo slido con la ayuda de un Asa de siembra en aro.
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DESCRIPCION DE LA
SIEMBRA
MEDIO DE CULTIVO
USADO
OBSERVACION DE
COLONIAS
MEDIO DE CULTIVO
USADO
ESTRIA
DISPERSION
AGOTAMIENTO
PUNTURA
INOCULACIN
CARACTERISTICA
DE LA COLONIA
FORMA
ELEVACIN
BORDES
SUPERFICIE
TAMAO
CONSISTENCIA
CROMOGENESIS
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PRACTICA N 7
METABOLISMO BACTERIANO
INTRODUCCION
La identificacin bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinacin de las caractersticas
de las colonias y morfologa con tincin de Gram u otras coloraciones. Sin embargo, la
caracterizacin final de un aislamiento bacteriano desconocido, para identificarlo a nivel de gnero y
especie se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimticos que son nicos para cada especie y
sirvan como marcadores de identificacin.
En el laboratorio, estos sistemas enzimticos se detectan inoculando una pequea porcin de la
colonia bacteriana aislada en una serie de medios de cultivo que contienen substratos especficos e
indicadores qumicos que permiten detectar cambios del pH o la presencia de subproductos
especficos.
I.
Como producto de la fermentacin de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que se
detecta como pequeas burbujas o grietas en el medio o por desplazamiento del mismo hacia arriba
del tubo.
El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales de
hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso (FeS).
MATERIAL
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de siembra inocule una porcin pequea de la colonia en el centro del tubo y estre la
superficie del pico de flauta.
2. Rotular e incubar a 37C por 18- 24 horas.
INTERPRETACION
Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubacin indicada.
1. Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
2. Fermentacin de la glucosa nicamente: (rojo/amarillo), esto se debe a que la glucosa (que se
encuentra en baja concentracin con respecto a los otros azcares), ha sido utilizada y la cantidad
de cido producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinos generados por la
utilizacin de la peptona; adems los cidos pueden ser utilizados.
Estos procesos, que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el fondo,
por no estar en contacto con el oxgeno, slo hay fermentacin y el medio permanece cido.
3. Fermentacin doble o triple de carbohidratos:(Amarillo/amarillo).La fermentacin de la
glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos azcares produce gran cantidad de cidos, por lo que
el tubo permanece amarillo.
4. No fermentacin de carbohidratos:(rojo/anaranjado). Se presenta nicamente utilizacin
oxidativa de peptonas, por lo que slo la superficie del tubo se alcaliniza.
5. Produccin de gas: Formacin de burbujas (CO2 e H+), grietas o desplazamiento del medio.
PROCEDIMIENTO
1. Por la tcnica de inoculacin, sembrar independientemente la cepa control MR positivo y
negativo, en el medio MR- VP. Rotular los tubos e incubar durante 48- 72 horas a 37C.
2. Proceder del mismo modo con las cepas VP controles, incubar por 18- 24 horas.
INTERPRETACION
1. Para la prueba Rojo de Metilo, aadir al cultivo unas gotas del reactivo del mismo nombre,
cuyo rango de viraje est entre pH 4.4(rojo) y 6.0 (amarillo). La prueba positiva se
manifiesta de color rojo estable y la negativa de color amarillo- naranja.
2. Para la prueba de Voges- Proskauer, agregar al cultivo 0.6 ml(12 gotas) de Alfa naftol y 0.2
ml (4 gotas) de KOH. Agitar el tubo por 1 minuto y dejarlo en reposo durante 15 minutos. Es
importante aadir los reactivos en el orden especfico.
Una prueba positiva, color rojo localizado en la mitad superior o en todo el tubo es
observada dentro de los primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza despus de una hora los
cultivos pueden presentar un color cobrizo, siendo esta una interpretacin falsa positiva.
En la prueba negativa no cambia el color inicial del medio de cultivo.
II.
21
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
La aparicin de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo, pocos
segundos despus de haber agregado el reactivo es indicativo de la presencia de indol y
constituye una prueba positiva. Las bacterias que ha pesar de desarrollar en el medio, pero
que no producen indol, al agregar el reactivo, este aparecer sin cambio alguno, siendo esta
una prueba negativa.
III.
PRINCIPIO
La utilizacin del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con
citrato con formacin de subproductos alcalinos. El medio (Citrato de Simmons)incluye
citrato de sodio, un anin como nica fuente de carbono y fosfato de amonio como nica
fuente de nitrgeno.
Las bacterias que pueden utilizar citrato tambin pueden extraer nitrgeno de la sal de
amonio, con produccin de amonio(NH3), alcalinizando el medio por conversin del NH3 en
hidrxido de amonio(NH4OH), detectndolo con el indicador de pH incorporado el azul de
bromotimol cuyo rango de viraje esta entre pH 6.9(verde) y pH 7.8(azul).
MATERIALES
Cepa control citrato positivo y negativo.
Medio de Citrato de Simmons en plano inclinado
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la tcnivca de estra en cada tubo la
cepa citarto positiva y negativa.
2. Rotular los tubos e incubar a 37C por 18- 24 horas.
22
INTERPRETACION
Prueba positiva:Color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie del medio
inclinado.
Prueba negativa: No hay cambio de color ni crecimiento.
IV.
------------------Ureasa
PROCEDIMIENTO
1. Por medio de la siembra por estra, sembrar la cepa positiva y negativa. No inocular en el
fondo.
2. Incubar durante 18- 24 horas a 37C
INTERPRETACION
Prueba positiva: se observa de color rosado en la superficie o en todo el medio.
Prueba negativa: El medio permanece del color original
V.
PRUEBA DE LA CATALASA
La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias aerobias y facultativas
anaerobias.
El perxido de hidrgeno (H2O2) es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo
de los carbohidratos y s se acumula es letal para el microorganismo.
La catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno de acuerdo a la siguiente
reaccin:
2 H2O2 --------> 2 H2O + O2
La prueba es de vital importancia en la diferenciacin de los estreptococos (catalasa
negativa) de los estafilococos (catalasa positiva).
23
MATERIALES
Cepas Control: S. aureus, Streptococcus Enterococcus
Solucin de Perxido de hidrgeno (H2O2) al 3%
Medio de cultivo: cualquier medio slido, no inhibitorio, y sin sangre ya que los
eritrocitos poseen actividad de catalasa, por lo que su presencia puede dar resultados
falsos positivos.
PRUEBA EN LMINA
a) Con el asa bacteriolgica en punta o un aplicador estril, picar el centro de una colonia
bien aislada y transferir l inoculo a un portaobjetos limpio.
b) Aadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%
c) Observar si se forman burbujas o no inmediatamente despus que se aade el reactivo.
d) Descartar la lmina en un recipiente con desinfectante.
PRECAUCIONES
1. El orden de la prueba en lmina no debe invertirse cuando se use asa de platino, ya que
puede resultar falso positivo. El alambre de nichrone no interfiere en el resultado de la
prueba.
2. La prueba debe realizarse en cultivos de 18- 24 horas; cultivos ms viejos pueden perder
su actividad de catalasa dando una reaccin falsa negativa.
3. El H2O2 es extremadamente acstico, por lo que se debe evitar que toque la piel, en caso
que ocurra inundar el rea afectada con alcohol de 70% para neutralizar la accin. NO
DEBE USARSE AGUA.
INTERPRETACION
Prueba cualitativa: La aparicin rpida y prolongada de burbujas, de gas o efervescencia
son indicativas de catalasa positiva. Algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la
catalasa que descomponen el H2O2, dando pocas burbujas diminutas durante 20- 30, stas
no son catalasa positivas.
VI.
24
PROCEDIMIENTO
1.
2.
Directo: Se aaden a las placas sobre la bacteria dos o tres gotas del reactivo.
Indirecto: Se toma con el asa un poco de la colonia bacteriana y se extiende sobre los
discos o tiras de papel que tienen ya el reactivo de oxidasa
INTERPRETACIN
Las colonias bacterianas con actividad Citocromo oxidasa desarrollan inmediatamente un
intenso color azul oscuro.
VII.
PRUEBA DE LA HEMOLISINA
Algunos microorganismos son capaces de producir una serie de enzimas y sustancias txicas
que pueden ser detectadas al sembrar el microorganismo en una placa de Agar sangre,
produciendo la lisis de los eritrocitos, segn el tipo de lisis que producen pueden clasificarse
en tipo Alfa, Beta y Gamma.
MATERIALES
Cepa bacteriana
Placas con Agar sangre de carnero
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa en aro sembrar la cepa bacteriana en la placa de Agar sangre
2. Incubar por 18 24 horas a 37 C
25
INTERPRETACIN
Hemlisis tipo Alfa: Es un tipo de hemlisis incompleta, hay un enverdecimiento del medio
debido a la salida de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a
compuestos del tipo de la biliverdina
Hemlisis tipo Beta: Hay una lisis completa de los eritrocitos observndose una zona clara
alrededor de la colonia
VIII. PROTOCOLO
PRUEBAS
BIOQUMICAS
TSI
(FermentacinH2S)
VP
VOGESPROSKAUER
MR
ROJO DE
METILO
INDOL
CITRATO
CATALASA
UREASA
CITOCROMO
OXIDASA
LIA
(Agar Lisina
Hierro)
HEMOLISINA
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MEDIO DE
CULTIVO
REACTIVO Y /O
INDICADOR
LECTURA
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ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA
PRACTICA N 8
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA)
INTRODUCCION
Es una prueba de laboratorio clnico que se utiliza para medir la actividad antibacteriana de los
antibiticos y quimioterapeticos empleados en el tratamiento de las enfermedades infecciosas.
La medida de la actividad antibacteriana puede realizarse por los siguientes mtodos:
Mtodo de dilucin
Mtodo de Difusin en Agar
OBJETIVOS
1. Realizar la tcnica de difusin en Agar simple para determinar la susceptibilidad a los
antibiticos.
2. Interpretar los resultados del mtodo utilizado.
3. Precisar las indicaciones y limitaciones de la tcnica empleada.
DILUCION EN TUBO
Permite estimar cuantitativamente la susceptibilidad de un antibitico, midiendo la concentracin
inhibitoria mnima (CIM), es decir, la concentracin ms baja que inhibe el crecimiento in vitro
bacteriano.
Consiste en la preparacin de una serie de diluciones del antibitico estudiado en caldo o en medio
agar al cual se inocula luego una suspensin del germen. Luego de una incubacin por 24 horas, se
puede observar la CIM como la dilucin ms alta en la que no existe crecimiento macroscpico
bacteriano. Esta tcnica es costosa por la cantidad de material que se utiliza.
DIFUSION EN AGAR (Segn Kirby- Bauer y col.)
Es un mtodo simple de rutina en Microbiologa mdica, para seleccionar el antibitico o
quimioterpicos ms adecuado en la terapia de las enfermedades infecciosas. Consiste en sembrar la
muestra en estudio sobre toda la superficie de una placa de Agar y colocar luego discos de papel
filtro que contienen los antibiticos y que despus de una incubacin de 24 horas, se observan las
zonas de inhibicin alrededor de cada disco de antibitico. La cantidad de antibitico presente en el
disco difiere para los distintos frmacos.
MATERIALES
27
Torundas estriles
Discos impregnados con diferentes antibiticos o quimioterpicos (sensi- disck).
Pinzas
Mecheros
PROCEDIMIENTO
1. Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo y sembrar
uniformemente sobre la superficie de la placa de Agar.
2. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Con la pinza en condiciones estriles, colocar los discos impregnados con los diferentes
antimicrobianos sobre la superficie del Agar. La distancia entre los discos debe ser de 20mm.
4. Incubar a 37C durante 24 horas.
LECTURA
a) Medir en milmetros el dimetro de las zonas de inhibicin del desarrollo bacteriano alrededor de
los discos, incluyendo el dimetro del disco.
b) Comparar con la tabla el dimetro de las zonas de inhibicin obtenidas y determinar si el
microorganismo es Resistente (R), intermedio (I), o sensible (S) a los diferentes antimicrobianos
utilizados.
Un resultado intermedio (I) indica que el aislado es menos susceptible de lo normal, pero puede
responder a dosis altas del antibitico.
La cantidad de antibitico presente en el disco depende de la concentracin y de su capacidad de
difusin en el Agar.
c) Anotar e interpretar los resultados.
Antimicrobiano
Amikacina
Amoxicilina +
clavulanico
Ampicilina
Cefalotina
Cefotaxima
Ceftazidima
Ceftriaxona
Cefuroxina
Ciprofloxacin
Cloranfenicol
Gentamicina
Sulfazotrim
Tetraciclina
Tobramicina
Cdigo
Resistente
Sensible
Antimicrobiano
Cdigo
Gram negativo
AK-MK
14
17
Ac.nalidixico
NA
AM
AMP
CFM
CTX
CAZ
CRO
RBA
CIP
C
GM-GE
SUT
T
NN
18
17
18
23
20
17
18
21
18
15
18
19
15
Cefepima
Ciprofloxacin
Clindamicina
Cloranfeicol
Eritromicina
Gentamicina
Nitrofurantoina
Norfloxacin
Oxacilina
Penicilina
Rifampicina
Sulfazotrim
Tetraciclina
Vancomicina
FEP
CIP
CM-DA
C
E
GM-GE
FD
NOR
AO
P
RIF
SUT
T
V
13
13
14
14
14
13
14
15
12
12
12
14
12
Resistente
Gram positivo
21
14
15
14
12
13
12
14
12
10
19
16
12
14
9
Sensible
16
18
21
17
18
18
15
17
17
13
20
20
18
19
12
PROTOCOLO
Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados que se han obtenido en la prctica
desarrollada.
28
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PRACTICA N 9
REACCION ANTIGENO ANTICUERPO: AGLUTINACIN
PROTOCOLO:
Realizar una aglutinacin cualitativa y una cuantitativa
29
Aglutinacin cuantitativa
TUBOS
REACTIVOS
ANTISUERO
ANTIGENO
TITULO
0.08
0.04
0.02
0.01
0.005
1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
RESULTADO:
Ttulo del suero: .
30
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PRACTICA N 10
FAGOCITOSIS
La lnea celular de defensa est ntimamente asociada con la lnea humoral. La fagocitosis o el
englobamiento de partculas extraas por ciertas clulas es un fenmeno no especfico, pero se
incrementa cuando intervienen anticuerpos especficos o complementos. Entre las clulas
fagocticas se encuentran los polimorfonucleares y los macrfagos (monocitos libres). A estas
sustancias que demuestran habilidad para hacer a los antgenos ms susceptibles a la fagocitosis se
les llama OPSONINAS.
FAGOCITOSIS IN VITRO
Las pruebas OPSONOCITOFAGICAS son difciles de realizar, en comparacin con otras pruebas
serolgicas, pero en ciertos sistemas es la nica a ser utilizada. El antgeno y la sangre total
(conteniendo los anticuerpos, complemento y leucocitos) se incuban juntos y luego, muestras de
estas mezclan se colorean.
El ndice fagoctico es el nmero promedio de partculas ingeridas por cada 100 Neutrfilos de la
sangre.
MATERIAL
Cultivo en caldo de Staphylococcus y/o
Klebsiella
Tubos de 13x100 con 0.5 ml de EDTA
sdica al 1%
Una jeringa de 5 ml con aguja N 20
Pipetas Pasteur con perilla de jebe
Lminas portaobjetos
Colorante Wright
Agua tamponada
Bao Mara a 37C
Centrfuga
Gradilla
Microscopio con objetivo de inmersin
Aceite de cedro
PROCEDIMIENTO
1. Con la jeringa hipodrmica recolectar 5 ml de sangre venosa.
2. Colocar en cada tubo con EDTA, 5 ml de sangre y mezclar suavemente.
3. Agregar 0.5 ml de cultivo bacteriano a cada tubo respectivamente.
4. Llevar los tubos a Bao Mara por 30 minutos, mezclando suavemente cada 10 minutos.
5. Centrifugar a 3000 r.p.m. por 5 minutos, cada tubo.
6. Recolectar con una pipeta Pasteur los elementos formes de la capa de glbulos blancos de cada
tubo.
7. Realizar los frotices y colorear con Wright:
Cubrir el frotis con colorante Wright por espacio de 3 minutos.
Aadir agua tamponada y soplar suavemente realizando una buena mezcla.
Despus de 15 minutos, lavar con agua de cao.
Secar y observar con objetivo de inmersin.
RESULTADO
Se observar la presencia de grmenes intracelulares que han sido fagocitados.
31
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PRACTICA N 11
REACCION DE PRECIPITACION
INTRODUCCION
Es una reaccin antgeno- anticuerpo, en el que el antgeno es de naturaleza soluble. Cuando se
mezcla un antgeno soluble con su anticuerpo correspondiente se forma un precipitado en la zona de
equivalencia y visibles por lo general macroscpicamente. Las reacciones de precipitacin pueden
realizarse en un gel como el Agar.
INMUNODIFUSION SIMPLE
Llamada tcnica de Mancini, se utiliza para determinar la concentracin de Inmunoglobulinas en el
suero humano. En el que, un anticuerpo conocido se incorpora a un medio de Agar noble y se deja
gelificar; luego se realizan perforaciones en el Agar donde se coloca el antgeno, procedindose
luego a incubar, luego de lo cual, se realiza la lectura observndose la formacin de un halo circular
de precipitacin cuyo dimetro es proporcional a la concentracin antignica.
INMUNODIFUSION DOBLE
Llamada tambin mtodo de Ouchterloni, es til para comparar antgenos, detectar anticuerpos
precipitantes, anticuerpos antinucleares y antgenos en enfermedades. En esta prueba se emplea Agar
semi-slido en portaobjetos, en el cual se efectan perforaciones, los cuales se llenan con los
elementos reaccionantes (antgeno- anticuerpo) y luego de 12 a 24 horas de incubacin a temperatura
ambiente, observamos la aparicin de bandas de precipitacin.
MATERIALES
Suero positivo
Antgeno
Lminas de vidrio con Agar noble al 1%
Placas Petri
Pipetas capilares
Lminas preparadas y coloreadas
PROCEDIMIENTO
1. Con una pipeta capilar, colocar el suero (contiene los anticuerpos) en el orificio central.
2. Depositar en los orificios perifricos los antgenos a estudiar.
3. Colocar las lminas en una cmara hmeda.
RESULTADO
Observar las bandas de precipitacin que se forman:
Identidad total
: Las bandas de precipitacin se unen.
Identidad parcial
: Se observa un espoln.
No identidad
: Las bandas se cruzan.
32
INMUNOELECTROFORESIS
Es til para la separacin de las protenas en un campo elctrico, permitiendo medir e identificar
componentes sricos: IgA, IgM, IgG, IgD e IgE, cadenas livianas y componentes monoclonales.
Resulta de la combinacin de la electroforesis con la inmunodifusin. En una primera fase los
antgenos son colocados en las perforaciones realizadas en el Agar y separados de acuerdo a su
movilidad en un campo elctrico, luego de una corrida electrofortica, se coloca el antisuero en una
especie de surco longitudinal que se abre en el Agar frente a las protenas que han migrado. Luego
de incubar, se forman bandas de precipitacin frente a las Inmunoglobulinas reaccionantes.
Sensibilizar una placa de poliestireno, tubo perla, esto consiste en absorber la superficie de la
placa con el anticuerpo especfico antiviral o anticuerpo de captura.
Luego se aade la muestra clnica, si esta contiene antgeno viral se unir al anticuerpo de
captura
Esta unin se detectar mediante otro anticuerpo marcado con una enzima. Las enzimas ms
usadas son la peroxidasa, fosfatasa alcalina biotina- aviclina.
Luego, lavar cuidadosamente para eliminar el anticuerpo marcado no combinado con el
antgeno.
Aadir el sustrato de la enzima.
Observar la presencia de color.
LECTURA
33
PLACAS CON
GLICO-PROTEINA
DEL VHI
SUEROS
OBTENIDOS
CONJUGADO
DE PACIENTE
CONTROL +
SUSTRATO A
20 ul.
Cromognico
(Ag-Ac color
celeste)
INCUBAR
30 min a
37
(Peroxidasa con Ig G
Antihumana) 5ul C/
pozo
Buffer Perxido
Hidrogeno 100
ul
INCUBAR
30 min a
37
CONTROL +
Absorber
CONTROL -
CONTROL -
LAVAR
twin
salino
1/10
(5 veces)
LAVAR
twin
salino
1/10
SECAR
la placa
SECAR
la placa
CONTROL -
PACIENTE
PACIENTE
PACIENTE
34
SUSTRATO B
SOLUCION
DE
PARADA
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PRACTICA N 13
PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS
INTRODUCCION
Antgeno es toda sustancia que introducida parenteralmente en el hombre o en los animales, induce
la formacin de anticuerpos o la aparicin de fenmenos de hipersensibilidad. "In vitro" y en
presencia de factores accesorios, pueden reaccionar con el anticuerpo especfico, dando lugar a
fenmenos perceptibles.
Los Antgenos ms comunes en Medicina son: las bacterias, virus, toxinas, esporas de hongos,
hemates, suero, etc.
Se aplican en las inmunizaciones y consisten en inocular un antgeno en dosis adecuadas y
generalmente progresivas con las siguientes finalidades.
1. Inducir en el hombre o en los animales, la formacin de anticuerpos que los protejan contra
determinados procesos infecciosos. Este mtodo conocido como vacunacin confiere inmunidad
adquirida activa.
2. Obtener antisueros, o sea sueros que contengan anticuerpos, los cuales sern empleados en:
a) Seroterapia, para el tratamiento de diferentes enfermedades, como la difteria, ttanos, etc.,
en las cuales se administran anticuerpos pre- formados confiriendo al paciente una
inmunidad adquirida pasiva.
B) La tipificacin de especies bacterianas, lo que ha dado lugar a verdaderos esquemas de
clasificacin, como el de Kauffmann-White para las Salmonellas, el de Ewing para las
Shigellas y el de Kauffmann-Knipschildt- Vahlne para Escherichia coli.
I.
A.
MATERIAL
35
B.
PROCEDIMIENTO
1. Con una pipeta graduada, agregar 2 cc. de suero fisiolgico estril a los cultivos
bacterianos presentados en medio slido
2. Recoger por lavado todo el desarrollo bacteriano, tratando de no arrastrar Agar
3. Filtrar a travs de gasa estril
4. Separar la suspensin en cantidades iguales en dos tubos de 13x100
5. Para preparar el Antgeno somtico "O", medir la cantidad de suspensin bacteriana
de uno de los tubos y agregar fenol en volumen necesario para alcanzar una
concentracin de 0.5%.
Se puede as mismo inactivar las fracciones flagelares, sometiendo el antgeno a la
ebullicin durante dos horas, o tratndolo con alcohol absoluto.
6. Para preparar el Antgeno flagelar "H", inactivar las fracciones somticas en el otro
tubo de suspensin bacteriana, agregando formol puro hasta alcanzar una concentracin
del 0.5%
7. Ambas suspensiones para poder ser inoculadas, se llevaran a una densidad de 9x10 8
grmenes por cc. para lo cual se agregan con pipeta Pasteur a un tubo con 10 cc. de
suero fisiolgico, gotas de cada uno de los antgenos concentrados hasta alcanzar una
turbidez similar al tubo N3 de la Escala de MacFarland.
Este es un Mtodo turbidimtrico de clculo bacteriano, que consiste en diluir el antgeno y
apreciar la turbidez obtenida comparndola con la de los tubos patrones de un nefelmetro o
determinndola con exactitud mediante un Espectrofotmetro.
El Nefelmetro ms conocido es el de MacFarland, que se obtiene de la siguiente manera:
Preparar una solucin de Cloruro de Bario al 1%
Otra de cido sulfrico al 1%.
Colocar una serie de 10 tubos vacos y estriles
Agregar las soluciones, de acuerdo al siguiente cuadro:
TUBO N
10
Cl2Ba 1%
0.1 cc.
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
H2SO4 1%
9.9 cc.
9.8
9.7
9.6
9.5
9.4
9.3
9.2
9.1
9.0
Bacterias
por cc.
3.0 x
108
6.0 x
108
9.0 x 1.2 x
108
109
1.5 x
109
2.7
x
109
3.0
x
109
36
La unin de ambos reactivos qumicos forma un precipitado blanco de Sulfato de bario que al
homogenizarse da una turbidez que es ms intensa cuanto mayor es la cantidad de Cloruro de bario
empleado. A cada tubo corresponde una concentracin de grmenes determinada, de acuerdo a lo
sealado en el cuadro.
C. CONTROL DE ESTERILIDAD
Sembrar cada uno de los antgenos preparados, en caldo nutritivo y/o Agar sangre, con la
finalidad de controlar su esterilidad
Realizar la observacin a las 18 24 horas, no debe haber crecimiento bacteriano.
Resultado: Realizar un protocolo del trabajo realizado en la prctica.
D. INOCULACION
1. Inocular en la vena marginal de la oreja del conejo dosis de 0.25 cc., 0.5cc., 0.75cc., 1.0cc.,
1.5cc., 2.0cc., 2.5cc., hasta 3.0cc., del antgeno, con intervalo de 4 a 5 das.
2. Realizar la sangra despus de 4 das de la ltima inyeccin.
37
ASOCIACIN
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PRACTICA N 14
INTRODUCCION
Los Estafilococos pertenecen a la Familia Micrococcaceae y son organismos redondos u ovales,
agrupados generalmente en forma de racimos, inmviles, no esporulados, y Grampositivos en los
cultivos jvenes. Son habitantes naturales de la flora nasal, boca, piel e intestinos, pero como
patgeno es causante de diversos procesos infecciosos que van desde fornculos, abscesos,
intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales. De las tres especies conocidas S. aureus, S.
epidermidis y S. saprophyticus, slo dos tienen importancia mdica. Slo la especie patgena S.
aureus produce una enzima llamada coagulasa.
MATERIALES
PROCEDIMIENTO:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
38
Estudiar la bacteria sembrada en las placas con Agar hipertnico de Chapman y Agar sangre,
por el mtodo de dispersin-agotamiento y con 24- 48 horas de incubacin a 37C
Realizar un frotis de las placas sembradas y colorearlas con Gram.
Observar placas sembradas con las diferentes especies de Staphylocococcus, estudiando las
caractersticas de las colonias en medios de Agar sangre y Agar Hipertnico de Chapman
(tamao, forma, pigmento, hemolisis, etc.)
De la placa con Agar sangre y Agar Hipertnico de Chapman, tomar una asada de una colonia
de color amarillo e inocularlo el tubo con caldo plasma e incubar a 37C (Prueba de la
coagulasa)
Realizar la prueba de la Catalasa.
Agar hipertonico de Chapman o manitol salado contiene: Manita, Cloruro de sodio al 6.5% y
como indicador de pH el rojo de fenol
Sembrar las especies en una placa Petri con disco de novoviacina
RESULTADOS:
1. Caractersticas macroscpicas de la muestra:
2. Resultado de la coloracin realizada
3. Resultado de la reaccin de la Coagulasa, en caldo plasma observar que slo S. aureus coagula
el plasma.
4. Resultado de la reaccin de Catalasa, agregando agua oxigenada y observando la aparicin de
burbujas en las tres especies.
5. Resultado en Agar hipertnico de Chapman observar las colonias amarilla (manita positivas) de
S. aureus y S. saprofiticus; y color rosado (manita negativa) en S .epidermidis.
6. Observar la presencia de hemlisis en las placas con Agar sangre
7. La novoviacina permite diferenciar S. epidermidis de S. saprofiticus. S. epidermidis es sensible
y S. saprofiticus resistente.
PROTOCOLO:
Realizar un protocolo de trabajo indicando: la especie bacteriana que se trabajo, tamao de la
colonia, forma que presenta, pigmento, hemlisis, y otras caractersticas que crea conveniente.
CEPAS
BACTERIANAS
TRABAJADAS
39
MH
o
Manitol
salado
AS
(Agar
sangre)
COAGULASA
CATALASA
GRAM
Caracterstica
morfolgica
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PRACTICA N 15
Solucin de Desoxicolato al 2%
Tubo con ClNa al 6.5%
Lminas portaobjetos
Set de colorantes de Gram- Kopeloff
Asas de Kolle, pinzas
Microscopio, aceite de inmersin.
PROCEDIMIENTO
1. Observar el desarrollo de Streptococcus en el medio de caldo BHI, si el crecimiento produce
turbidez o sedimento.
2. Observar el desarrollo de la bacteria en Agar sangre, sembrado por el mtodo de dispersin y
agotamiento e incubado a 37C por 18- 24 horas. Realizar un frotis en la lmina portaobjetos y
colorear por Gram.
40
Hidrlisis
De
Hipu
Escu
rato
lina
Metabo
lismo
de la
Inulina
Desarro
llo en
NaCl
6.5%
Bacitra
cina
Opto
chin
GRUPO B
S. agalactiae
R*
P*
GRUPO C, F, G
- hemolticos
GRUPO Viridans
R*
N*
- hemolticos
GRUPO A
S. pyogenes
R
S
N
N
N
P
N
S. pneumoniae
S= Sensible; R= Resistente; N= Negativo; P= Positivo; *= Reaccin variable
41
Desoxi
colato Sodio
P*
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PRACTICA N 16
INTRODUCCION
Las Neisserias son cocos Gram negativos, que se presentan caractersticamente en pares, con los
lados adyacentes aplanados, simulando granos de caf. Comprende varias especies, entre stas N.
gonorrhoeae, y N. meningitidis, causan frecuentemente enfermedad significativa en el hombre. En
muestras clnicas del tracto urogenital u otras, se tien adicionalmente con el colorante azul de
metileno, observndose las Neisseria intra y extracelularmente.
Estos microorganismos son exigentes y requieren medios enriquecidos como el Agar chocolate, que
le proporciona una rica fuente de hierro y el Agar Thayer Martin.
La mayora de las especies requieren para el crecimiento una humedad relativamente alta y una
tensin de CO2 entre 5 a 10%. Desarrollan a temperaturas exactas entre 35 a 37C y un pH de 7.2 a
7.6.
Todas las especies producen catalasa y Citocromo- oxidasa, que permiten diferenciarlos de otros
microorganismos morfolgicamente similares.
La diferenciacin bioqumica se realiza por pruebas de utilizacin de hidratos de carbono: Glucosa,
maltosa, sacarosa y lactosa.
El diagnstico de gonorrea requiere una estrecha cooperacin entre el mdico y el laboratorio.
Se debe considerar los siguientes aspectos:
a) Recoleccin correcta de la muestra.
b) Seleccin del recipiente apropiado para el transporte y rpido envo al laboratorio.
c) Seleccin del medio de cultivo apropiado
d) Aislamiento e identificacin de la bacteria en el laboratorio.
MATERIALES
42
METODOLOGIA
1. Observar en el medio de Thayer Martin y Agar chocolate, las colonias pequeas, circulares de
bordes continuos, blanco- grisceos, convexas, brillantes o ligeramente opacas si corresponden a
N. gonorrhoeae y si es N. meningitidis colonias pequeas de borde entero, circulares,
translcidas o ligeramente opacas.
2. Dejar caer una gota del reactivo de oxidasa sobre una colonia y observar entre los 2- 3 minutos el
cambio de color del rosado al marrn o negro, que corresponde a una prueba de oxidasa positiva.
3. Realizar un frotis de la colonia oxidasa positiva y colorearla por el Gram. Comparar con la
lmina control.
4. Realizar un frotis de la muestra clnica de secrecin endocervical y colorearla con el azul de
metileno.
PROTOCOLO
MEDIO DE CULTIVO
MUESTRA
COLONIAS
TAMAO
AGAR CHOCOLATE
SECRECION
ENDOCERVICAL
OXIDASA
PRUEBAS
BIOQUIMICAS
43
CATALASA
GRAM
AZUL DE
METILENO
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PRACTICA N 17
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS:
GENERO BACILLUS
INTRODUCCION
El gnero Bacillus agrupa microorganismos aerobios Grampositivos, formadores de esporas y que
pueden sobrevivir en el ambiente por muchos aos. Algunas especies causan enfermedades en el
hombre y los animales como el B. anthracis causante de la enfermedad conocida como
"carbunco", otros como el B. cereus, B. subtilis, B. megaterium y B. mycoides son saprofitas y se
encuentran en el suelo, agua y aire.
La especie patgena B. anthracis, causante del carbunco en los procesos patolgicos se presenta
como un bacilo rectilneo, Gram positivo, grueso, inmvil y capsulado. En los cultivos, las colonias
son grandes, mates, rugosas con bordes festoneados (aspecto de cabeza de medusa), se agrupan en
largas cadenas, sin cpsula y conforme el cultivo envejece forman esporas.
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar la muestra en placas de Agar sangre, Agar nutritivo, caldo nutritivo y gelatina.
2. Preparar frotices para colorear con Gram, Hiss, y Wirtz Conklin.
COLORACION HISS (PARA CAPSULA)
1)
2)
3)
4)
5)
44
Preparar un frotis
Cubrir con Fucsina bsica y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 30 segundos
Lavar con solucin acuosa de Sulfato de cobre al 20%.
Lavar con agua corriente y secar
Observar al microscopio con lente de inmersin
Caldo nutritivo
Agar nutritivo
Agar sangre
Agar semislido
Hemolisis
Hidrlisis de la gelatina
Prueba de la Catalasa
Fermentacin salicina
Movilidad
45
BACILLUS
ESPECIE SAPROFITA
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PRACTICA N 18
INTRODUCCION
El gnero Listeria comprende bacilos Grampositivos, microaerfilos, no esporulados, mviles y
presentan flagelos peritricos. Se presentan aislados o en grupos de dos en cadena o en forma de V
de Y. Esta ampliamente distribuido en la naturaleza, en los vegetales en descomposicin, en el suelo,
en las heces de los portadores sanos animales y hombres. La especie patgena es Listeria
monocytogenes y la enfermedad que causa se le conoce como Listeriosis, la cual compromete los
ganglios linfticos, produce sntomas neurolgicos, encefalitis aguda y monocitosis en sangre.
El microorganismo se puede aislar de la sangre, lquido cefalorraqudeo y de las heces, desarrolla
bien en medios de cultivo comunes.
MATERIAL
PROCEDIMIENTO
1. Hacer frotices a partir de una colonia sembrada en Agar nutritivo y colorearla con Gram.
2. Preparar una lmina en fresco a partir del tubo con caldo nutritivo sembrado, entre lmina y
laminilla.
46
3. Sembrar en el Tubo con medio semislido, placas de Agar sangre, Agar nutritivo, y en los
diferentes medios diferenciales
4. Dejar en incubacin por 24 a 48 horas a 37C.
LECTURA
EN AGAR SANGRE
47
MOVILIDAD
GLUCOSA
MR
HEMOLISINA
SACAROSA
VP
CATALASA
LACTOSA
OXIDASA
MANITA
UREA
SALICINA
CITRATO
ESCULINA
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PRACTICA N 19
INTRODUCCION
La flora normal se adquiere con rapidez durante y poco despus del nacimiento, y cambia de forma
continua a lo largo de la vida. Los organismos presentes en un determinado momento dependen de la
edad, nutricin y medio ambiente del individuo, por lo que es difcil determinar la flora normal de
cada individuo ya que depende en gran parte de los factores antes enunciados; ejemplo, los lactantes
alimentados con leche materna tienen Estreptococos y Lactobacilos en su tracto gastrointestinal, en
los pacientes que estn recibiendo grandes dosis de antibiticos presentan un gran desarrollo de
levaduras.
La nariz y la boca pueden ser intensamente colonizados por bacterias como Estreptococos,
Estafilococos, difteroides, y cocos Gram negativos.
La superficie de los dientes y los surcos gingivales contienen un gran nmero de bacterias
anaerobias.
La rinofaringe esta habitada generalmente por estreptococos no hemolticos y diplococos Gram
negativos, en ella puede poblarse un gran numero de especies patgenas como Streptococcus
pneumoniae, Neisseria meningitidis, S. pyogenes, Klebsiella pneumoniae y Haemophilus
influenzae.
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
A. PRIMER DIA
1. Con ayuda de torundas estriles y el baja lengua, tomar una muestra de la orofaringe.
2. Sembrar las muestras, en los diferentes medios de cultivo.
3. Incubar las placas y tubos sembrados por 24 a 48 horas a 37C
B. SEGUNDO DIA
LECTURA
Con la ayuda del Profesor, el alumno proceder a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los
medios de cultivos.
IDENTIFICACION
Sembrar en los diferentes medios de cultivo para el estudio bioqumico correspondiente y pruebas de
patogenicidad si se requiere.
Caldo plasma en tubo
- Disco de Bacitracina
- Disco de Optochin
- Reactivo de Citocromo- oxidasa
- Reactivo de catalasa
PROTOCOLO
El alumno realizar un cuadro estadstico con los resultados obtenidos.
49
ASOCIACIN
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ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA
PRACTICA N 20
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
50
El mismo procedimiento se sigue con muestras de orina, heces, lquido cefalorraqudeo, lquido
pleural, etc.
LECTURA
Observar como los grmenes visibles por el Gram, no aparecen en la coloracin de Ziehl- Neelsen
porque no son cidos alcohol resistente.
El bacilo de Koch y los otros Mycobacterium en cambio aparecen como elementos bacilares rojos en
un fondo azul.
EXAMEN MICROSCOPICO CUANTITATIVO
Enfocar con el objetivo de 100x la lmina referencial, cuantificar la cantidad de bacilos en toda la
longitud de los 2/3 del extendido que corresponde aproximadamente a 100 campos y anotar los
resultados, segn el siguiente cuadro:
Negativo
: No se observan bacilos en 100 campos.
Positivo (+) : Menor de 1 bacilo por campo, en 100 campos.
Positivo (++) : De 1 a 10 bacilos por campo, en 50 campos.
Positivo (+++) : Ms de 10 bacilos por campo, en 25 campos.
La lectura cuantitativa permite controlar la evolucin del paciente que esta en tratamiento y permite
detectar aquellos que sean resistentes al tratamiento.
TIPIFICACIN DE MICOBACTERIAS
Se investiga la velocidad de desarrollo y la produccin de pigmento, permitiendo clasificarlos en
grupos.
I. Cepas que desarrollan en 8 ms das. Llamadas de desarrollo lento.
GRUPO I: Pigmentan por estmulo de la luz. Son fotocromgenas.
Ejemplo: M. kansasi , M. simiae
GRUPO II: Pigmentan sin necesidad de estmulo luminoso. Son escotocromgenas. Ejemplo: M.
scrofulaceum
GRUPO III: No pigmentan espontneamente, ni por estmulo luminoso.
Son no cromgenas. Ejemplo: M. tuberculosis var. Humano y
M. tuberculosis var. Bovina
II. Cepas que desarrollan en 7 das o menos.
GRUPO IV: Pueden pigmentar o no pigmentar. Ejemplo: M. fortuita
PROTOCOLO DE TRABAJO:
Realizar esquemas de lo realizado y observado en la prctica correspondiente.
51
ASOCIACIN
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PRACTICA N 21
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO
CORYNEBACTERIUM
INTRODUCCION
El gnero Corynebacterium comprende un grupo heterogneo de bacterias en el cual se incluyen
especies comensales y patgenos a animales, plantas y bacterias de suelo.
Las caractersticas comunes del gnero son:
1) Bacilos pleomrficos Grampositivos, No forman esporas
2) Las clulas se dividen abruptamente (efecto de resorte), de donde resulta su disposicin en
letras chinas,
3) Aerobios o anaerobios facultativos,
4) Catalasa positivos,
5) Citocromo oxidasa negativo.
La especie tipo es Corynebacterium diphtheriae que causa la difteria, infeccin aguda, contagiosa y
febril, caracterizada por inflamacin local y formacin de una seudomembrana en la orofaringe,
adems del dao al corazn y nervios perifricos por accin de una exotoxina (toxina difterica). Es
propagada por portadores sanos y convalecientes, su puerta de entrada es las vas respiratorias
superiores.
El gnero se divide en tres grupos:
Grupo I : Corinebacterias parsitas y patgenas para el hombre y animales;
Grupo II : Corinebacterias fitopatgenas, y;
Grupo III : Corinebacterias no patgenas.
Algunas de las especies ms frecuentemente halladas en el laboratorio clnico son: C.diphtheriae,
C.pyogenes, C.ulcerus, C.haemolyticus, C.xerosis, C.renale, C.equi, C.ovis, C.bovis, C.ovis y
C.hoffmannii (pseudodiphthericum).
La muestra debe ser tomada con un hisopo, se debe frotar enrgicamente sobre cualquier lesin
inflamatoria, adems del hisopado de garganta, se requieren muestras de nasofaringe, y enviar
inmediatamente al laboratorio o inocular directamente en el medio suero de Loeffer o Agar telurito.
MATERIAL
52
PROCEDIMIENTO
1. Tomar el inculo de la cepa de C.diphtheriae y realizar la siembra por el mtodo de
dispersin agotamiento en las placas de Agar sangre y Agar chocolate, y en el medio Pai por
estras. Incubar por 48 horas a 37C.
2. Realizar el frotis del cultivo en caldo enriquecido y colorear por Gram.
3. Realizar el frotis del cultivo y colorear por el mtodo de Albert.
4. Bioqumica: Sembrar en los medios diferenciales de Agar Urea de Christensen, en el caldo
Rojo de fenol + Glucosa, caldo Rojo de fenol + Maltosa.
COLORACION DE ALBERT
Los grnulos metacromticos conocidos tambin como de volutina, son material de reserva de
polifosfato, se distribuyen en el citoplasma, preferentemente en los extremos del bacilo, se tien
de color azul intenso y el soma bacteriano se observa muy dbilmente.
PROCEDIMIENTO
1. Realizar el frotis a partir del cultivo y fijar al calor suave.
2. Cubrir con la Solucin A de Albert (Azul de toluidina, verde de metilo, cido actico, alcohol
etlico, agua destilada) por 3 a 5 minutos.
3. Lavar con agua corriente, evitar el lavado directo del frotis.
4. Cubrir con la Solucin B de Albert (yodo metlico, yoduro de potasio, agua destilada) por 1
minuto.
5. Lavar con agua corriente, secar y observar al microscopio, objetivo de 100X
LECTURA
53
Gelatina : Negativo
Sacarosa : Negativo
Glucosa : Negativo
Maltosa : Positivo
Lactosa : Negativo
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PRACTICA N 22
INTRODUCCION
La especie Pseudomona aeruginosa es un bacilo Gram negativo, casi todas son mviles con
flagelos polares monotricos y multitricos, poseen cpsula, no forman esporas, no son exigentes
para su desarrollo In Vitro.
Pseudomona aeruginosa es la especie ms frecuentemente asociada con enfermedad humana,
principalmente quemaduras severas, pero tambin se aslan de orina, sangre, lavados bronquiales,
esputo y tracto genital femenino. En pacientes comprometidos pueden causar infecciones con
riesgo de vida fatales.
La deteccin del pigmento piocianina en el medio de cultivo es virtualmente diagnstica de P.
aeruginosa, la mayora de los aislamientos producen tambin el pigmento fluoresceina y
desarrollan bien a 42C.
MATERIAL
PROCEDIMIENTO
1. Hacer un frotis a partir de la cepa Pseudomona aeruginosa y colorear por el mtodo de
Gram.
2. Sembrar la cepa de P. aeruginosa en los diferentes medios de cultivo, por las tcnicas
conocidas.
3. Incubar a 37C por 24- 48 horas.
54
RESULTADOS
COLORACION DE GRAM: Bacilos pequeos, Gram negativos.
CALDO NUTRITIVO: Observar el crecimiento abundante en el medio, el pigmento de
color verdoso y un olor caracterstico.
AGAR MAC CONKEY: Observar colonias grises claro, no fermentadoras de lactosa.
MEDIO TSI: No hay cambios, ya que P. aeruginosa y otras especies de este gnero no
fermentan los carbohidratos [utilizan los carbohidratos slo por va oxidativa en el medio
de oxidacin- fermentacin (OF)].
AGAR NUTRITIVO: Describir la colonia, observar la difusin del pigmento en el
Agar, y realizar la prueba de la oxidasa, que es positiva para P. aeruginosa.
CALDO TRIPTICASE: Agregar 1 ml de cloroformo para extraer el pigmento de la
piocianina.
PROTOCOLO
CARACTERSTICAS
MICROORGANISMOS
Pseudomona aeruginosa
Reacciones en TSI
Agar semislido
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PRACTICA N 23
INTRODUCCION
Son microorganismos pequeos, usualmente cocobacilares, inmviles no formadores de esporas.
Son Gram negativos y necesitan una tincin prolongada con la fucsina bsica de por lo menos 2
minutos en lugar de los 30- 60 segundos de tincin convencional de Gram.
La enfermedad conocida como Brucelosis o Fiebre Malta es causada por las siguientes especies
Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella abortus.
Su multiplicacin y desarrollo in vitro es muy lento, necesitan de medios especiales como el Agar
Brucella o Caldo tripticasa soya.
Para la identificacin de especies se utiliza una serie bioqumica para observar la produccin de H2S,
hidrlisis de la urea, desarrollo en medios especiales con fucsina 0.002 %, Thionina 0.002 % y
requerimiento de CO2.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
Este microorganismo puede ser aislado de la sangre, lquido cefalorraqudeo, mdula sea o biopsias
de ganglios linfticos e hgado.
I: HEMOCULTIVO
Para el Hemocultivo se utiliza el medio de doble fase (slido + lquido) de Ruiz- Castaeda. La
incubacin debe hacerse en una atmsfera de 5- 10% de CO2 a 35- 37C. Las colonias aparecen
entre el 4 al 5 da, pero los cultivos deben ser incubados hasta los 30 das antes de ser descartado
como negativo.
II: SEROLOGIA
Para el diagnstico serolgico se utilizan las tcnicas de:
1. Aglutinacin rpida en placa
2. Aglutinacin lenta en tubo (Wright)
3. Prueba de aglutinacin del 2- mercaptoethanol (2- ME)
4. Prueba modificada de Coombs (antiglobulina)
5. ELISA
56
MATERIAL
PROCEDIMIENTO
I: HEMOCULTIVO
Agregar 5 ml. de sangre de paciente sospechoso a Brucelosis en el medio de Ruiz- Castaeda, e
incubar por 4 a 5 das a 37C. Se debe esperar hasta 30 das para descartar el cultivo.
COLORACION
Realizar un frotis de la cepa desarrollada en Caldo trypticase y colorearla por el mtodo de Gram,
siguiendo las recomendaciones sealadas anteriormente.
II: SEROLOGIA
1. Con la pipeta de 0.01 colocar una gota de suero negativo en el primer crculo de la 2da. Lnea de
la lmina excavada.
2. Con la pipeta de 0.01 ml colocar en la lmina excavada, las siguientes cantidades de suero
positivo: 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml respectivamente.
3. A cada alcuota de suero aadir una gota de antgeno, equivalente a 0.03 ml.
4. Mezclar cuidadosamente por rotacin, con ayuda de un palito mondadientes empezando por el
suero negativo y la dilucin ms alta 1:400
5. Dejar en reposo por espacio de 3 minutos, luego rotar la lmina durante un minuto y dejar en
reposo por 4 minutos ms.
6. A los 8 minutos no ms, observar la presencia de grumos (aglutinacin) que indica una reaccin
positiva antgeno- anticuerpo y el titulo de anticuerpo alcanzado.
57
INTERPRETACION
SUERO
0.08
0.04
0.02
0.01
0.005
ANTIGENO
+
+
+
+
+
DILUCION / TITULO
0.03
0.03
0.03
0.03
0.03
25
50
100
200
400
+
++
+++
++++
+++++
DIFERENCIACION BIOQUIMICA
ESPECIES
DE
BRUCELLA
PRUEBAS DE DIFERENCIACION
Crecimiento en
Husped
Preferido
B.abortus
Bovino
++
Dbil
B.melitensis
Cabra, oveja
Dbil
B.suis
Cerdos
Fuerte
B.canis
Perros
Fuerte
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PRACTICA N 24
INTRODUCCION
En el intestino del hombre existe una flora bacteriana constituida por Enterobacterias (Escherichia
coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella) y otros microorganismos anaerobios y aerobios, algunos de
los cuales son patgenos para el
Hombre y causantes de enfermedades.
El diagnstico y aislamiento del microorganismo causante de la enfermedad se realiza mediante el
COPROCULTIVO, es decir el cultivo de las heces en la fase evolutiva de la enfermedad, para el
aislamiento del agente patgeno bacteriano.
La mayora de las Enterobacterias tienen una accin invasiva penetrando en la mucosa intestinal
produciendo ulceraciones o abscesos, y el modo de transmisin es generalmente por ingesta de
alimentos contaminados con heces humanas.
Escherichia coli, bacilo Gram negativo no esporulados, es miembro de la flora intestinal y en
determinadas condiciones patgena para el hombre, poseen factores de virulencia que les permite
causar infecciones en el tracto gastrointestinal as como en el sistema urinario. La E. coli
enterotoxignico (ECET) es la causa comn de la "Diarrea del viajero" y produce en el organismo
enterotoxinas potentes y poseen factores de colonizacin; la E.coli enteroinvasiva (ECEI) y la
E.coli enterohemorragica (ECEH) son causantes de diarrea sanguinolenta.
Klebsiella pneumoniae, bacilos Gram negativos a veces con cpsula producen infecciones
oportunistas en el husped comprometido (generalmente hospitalizado), el tracto respiratorio y
urinario son los lugares de infeccin ms comunes, es difcil distinguir entre colonizacin e
infeccin y son productoras de endotoxinas.
Salmonella typhi, bacilo Gram negativo mvil con flagelos peritricos son exclusivas del hombre y
causan la fiebre tifoidea; otras, causan infecciones intestinales y a veces septicemias como la
Salmonella paratyhi A, B C.
El gnero Shigella, comprende especies que son bacilos Gramnegativos inmviles, causan la
Disentera bacteriana, enfermedad que produce diarrea, moco, sangre, calambres abdominales y
fiebre. La especie S. dysenteriae es la mas virulenta.
El gnero Proteus, presenta especies que son bacilos Gram negativos rectos, mviles con flagelos
peritricos, anaerobio facultativo. Son habitantes de la flora intestinal y otras causantes de infecciones
urinarias, heridas crnicas adquiridas generalmente en el hospital.
59
MATERIALES
Muestra de heces.
Placas Petri con Agar Mac Conkey
Placas Petri con Agar SS
Placas con Agar Manitol
Tubos con Agar Sabouraud
Tubos con medio TSI, LIA
Tubos con caldo peptonado
Tubos con Citrato de Simmons
Tubos con caldo MR-VP
Frasco con Lugol
Reactivo para Citocromo-oxidasa
Reactivo de Kovacks (prueba de indol)
Reactivo para Rojo de metilo
Lminas portaobjeto y cubreobjeto
Reactivo para VP (Alfa- naftol al 5% e Hidrxido de Potasio al 40%)
Juego de colorantes para Gram
Material bsico para laboratorio
PROCEDIMIENTO
1. Realizar un estudio macroscpico de la muestra de heces (consistencia, color, presencia de
sangre, moco, etc.)
2. Realizar un estudio microscpico de la muestra con Lugol y suero fisiolgico y Gram.
3. Realizar la siembra de la muestra de heces en medios de cultivos:
a) Suspender aproximadamente un gramo de heces (dos asadas) en un tubo con 3 ml. de
solucin salina.
b) Tomar una asada de la suspensin de heces y sembrar en las placas de Agar Mac Conkey,
Agar SS, Agar Manitol, y tubos con Agar Sabouraud e incubar a 37C por 24 horas.
c) Sembrar las cepas bacterianas aisladas en medios de diferenciacin bioqumica: TSI, LIA,
Caldo peptonado, Citrato de Simonns y Caldo MR-VP. Incubar a 37C por 24 horas.
LECTURA
EN AGAR MAC CONKEY, observarlas colonias rojas (Lactosa +) que han metabolizado la
Lactosa y las colonias Lactosa negativas que no han metabolizado la Lactosa.
EN AGAR SS, observar el desarrollo de colonias Lactosa negativas y presencia de color negro en
las colonias que son SH2.
EN AGAR MANITOL Y AGAR SABOURAUD, observar el desarrollo de colonias y anotar las
caractersticas.
EN TSI (Glucosa, Sacarosa, Lactosa), cuando las bacterias metabolizan los carbohidratos toma el
medio un color amarillo y cuando producen SH2 se torna de color negro.
EN LIA (Agar, Lisina, Hierro ), observar si hay descarboxilacin y desaminacin de la Lisina y
produccin de SH2 por las bacterias. Si hay Descarboxilacin de la lisina se eleva el pH del medio
debido a la produccin de aminas, pH= 5.2 ( color amarillo), pH 6.8 (color prpura) [indicador
prpura de bromocresol]
60
DIFERENCIACION BIOQUMICA
TSI
(glucosa, sacarosa
lactosa,SH2 )
Especies
Escherichia coli
LIA
Cp
Ct
Lisina
Indol
Citrat
o
MR-VP
Oxidasa
Ac.
Sup
Ac.
Fon
Ga
s
SH2
+ -
- +
+ -
- -
+ -
Klebsiella
Salmonella typhi
Shigella
Proteus
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PRACTICA N 25
INTRODUCCION
Los miembros de la familia Vibrionaceae, se encuentran en el agua dulce y salada. Incluye los
gneros: Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas. El gnero Vibrio comprende muchas especies siendo las
de importancia mdica Vibrio cholerae, causante del clera epidmico; V. parahaemolyticus,
causante de gastroenteritis; V. vulnificus, causante de bacteriemia, infecciones en heridas cutneas,
celulitis; y V. alginoliticus, responsable de otitis externa, infeccin de heridas cutneas, tejidos
blandos.
Son bacilos Gramnegativos, curvados, con aspecto de coma de 1-5 m, se presentan solos, en
parejas o en cadenas que semejan espirilos, muy mviles, poseen un flagelo polar, no forman
esporas, sin cpsula, aerobios y oxidasa positivo.
La ltima pandemia fue producida por el biotipo El Tor, serotipo Ogawa.
Desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, el medio selectivo TCBS (tiosulfato,
citrato, sales biliares, sacarosa, indicador Azul de timol y Azul de bromotimol) y medios alcalinos.
MATERIAL
Placa Petri con medio TCBS sembrada con V. cholerae y V. parahaemolyticus
Tubos con TSI
Tubos con LIA
Tubo con Caldo peptonado
Tubo con MR-VP
Tubo con Citrato de Simmons
Desoxicolato de sodio al 0.5 %
Lminas portaobjetos
Set de coloracin de Gram
Microscopios
Aceite de cedro
PROCEDIMIENTO Y LECTURA
1. En Agar TCBS (thiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa): Se observan las colonias de V.
cholerae, de 2-4 mm de dimetro, lisas, con un centro opaco y periferia transparente, circulares,
de color amarillo (resultado de la utilizacin del citrato y formacin de cidos a partir de la
utilizacin de la sacarosa)
En Agar TCBS las colonias de V. parahaemolyticus se observan colonias circulares, de aspecto
62
PROTOCOLO
MEDIOS
Vibrio cholerae
Vibrio parahaemolyticus
TSI
Acidez superficie y
profundidad
LIA
Positiva
VP
Negativo
MR
Negativo
Negativo
Indol
Positivo
Positivo
Citrato
Negativo
Negativo
Urea
Negativo
Negativo
Oxidasa
Positiva
Positivo
Catalasa
Positiva
Positiva
Prueba de la cuerda
Positiva
Negativo
RESULTADOS
1. Realizar esquemas de lo observado en la prctica
2. Realizar las pruebas bioqumicas correspondientes.
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PRACTICA N 26
INTRODUCCION
Las Leptospiras son microorganismos helicoidales, flexibles, con las espiras estrechamente unidas,
muy mviles, con una longitud de 6 a 20 m y 0.1 m de dimetro, sus extremos semejan a ganchos
semicirculares (ocasionalmente se presentan rectos).
El gnero Leptospira (Noguchi, 1917) pertenece a la Familia Leptospiraceae, Orden Spirochetales;
comprende 6 especies patgenas Leptospira interrogans con 18 variantes serolgicas, L. noguchi,
L. santarosai, L. borgpetersenii, L. weilii, L. kirhneri y L. inadai, y mas de 200 serovares saprofitos
comprendidos dentro de Leptospira biflexa. Se diferencian por su virulencia, sus propiedades
antignicas, reactividad frente a anticuerpos monoclonales, la prueba de la endonucleasa de
restriccin o la composicin de su DNA.
La Leptospirosis es una zoonosis de distribucin mundial. Los reservorios naturales son los roedores
y una gran variedad de animales silvestres y domsticos, los cuales eliminan con la orina el agente
etiolgico, contaminando el agua, suelo, alimento, etc. El mecanismo de transmisin puede ser
directo (orina, rganos de animales infectados) o indirecto (a travs del agua o material
contaminado. La puerta de ingreso al organismo humano es a travs de lesiones de la piel y mucosas
incluyendo la conjuntiva ocular.
Se colorean por mtodos especiales como Fontana Tribondeau (contiene nitrato de plata) y
coloracin de Kiktenko, ya que toman dbilmente los colorantes de anilina. Son visibles al
microscopio de campo oscuro en preparaciones frescas.
Desarrolla en medios especiales lquidos, semislidos y slidos enriquecidos con suero de conejo o
carnero al 8-10%, a una temperatura ptima de 28 30C, en un periodo de incubacin de 5- 10 das,
en condiciones de aerobiosis.
64
MATERIAL
Cultivo de Leptospira en medio semislido de Fletcher- modificado
Lamina control coloreada por el mtodo de Kiktenko, Vago, Fontana Tribondeau, o Rojo de
Congo.
Microscopio.
LECTURA
En el medio semislido de Fletcher- modificado observar el desarrollo de las Leptospiras en
todo el tubo y la formacin de un anillo a unos milmetros de la superficie del medio
En la coloracin de Kiktenko las Leptospiras se tien de un color rosado- violeta en fondo
incoloro, presentndose sueltas o entrelazadas, semejando la letra C S, generalmente con los
extremos en forma de semigancho y con las espiras bien unidas.
En la observacin al microscopio de campo oscuro, las leptospiras se observan como un collar
de perlas son muy mviles, realizan movimientos de translacin, rotacin y al rededor de su
eje.
RESULTADOS
1. Caractersticas del cultivo observado.
2. Realiza esquema de la observacin en las lminas coloreadas
65
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PRACTICA N 27
ESTUDIO E IDENTIFICACCON DE BARTONELLA
INTRODUCCIN
La familia Bartonelaceae comprende cinco (5) especies, siendo B. bacilliformes la causante de la
Bartonelosis humana o Enfermedad de Carrin y se transmite a travs de la picadura de un insecto
alado hematfago conocido como Lutzomya.
Bartonella bacilliformes presenta un marcado polimorfismo (bacilar, cocobacilar, cocoide), su
tamao vara entre 1- 3 m de longitud por 0.25- 0.30 m de dimetro, presenta flagelos unipolares
en nmero de 1 a 10. En los cultivos jvenes predominan las formas bacilares (forma virulenta), y en
cultivo viejo la forma cocoide (no virulenta)
Se colorea escasamente con los colorantes de anilina (Gram negativas), pero si tiene afinidad por los
colorantes derivados de Romanowski (Giemsa, Leishman, Wright).
Desarrolla en aerobiosis y microaerobiosis, a una temperatura ptima de 29C en medios
enriquecidos con peptona, triptosa, y plasma (gel de fases) y medio bifsico con sangre y plasma,
durante un periodo de incubacin de 5- 10 das. Su crecimiento es lento por lo general semanas,
enturbia el medio con sedimento y a veces se observa pelculas o tmpanos en la superficie de la
parte lquida del medio.
Puede ser aislada de la sangre (Hemocultivo) en la fase hemtica de la enfermedad, de las lesiones
eruptivas (fase verrucosa o histioide) y del LCR en los casos de neurobartonelosis.
En el laboratorio se puede aislar la bacteria por Hemocultivo (fase hemtica) usando el agar de fases,
medio de aislamiento primario, por cultivo del verrucoma (fase eruptiva); se pueden realizar
pruebas serolgicas (aglutinaciones, fijacin de complemento, Elisa, etc.), por Infeccin de los
hemates humanos por Bartonella (Danza de los hemates) e Inhibicin del movimiento de los
hemates por accin de anticuerpos especficos antibartonella
MATERIAL
Frotices coloreados por Leishman, Wrigth Giemsa procedentes de cultivo.
Cultivo de la bacteria en Medio Agar Gel de Fases
Cortes histolgicos de verrucoma coloreados con Hematoxilina eosina
PROCEDIMIENTO E INTERPRETACIN
Observar al microscopio las lminas coloreadas y apreciar la morfologa y tincin de Bartonella.
En las lminas coloreadas observar las bacterias en forma de empalizada y en forma aislada.
En los cultivos observar la turbidez del medio, la formacin de sedimento y la formacin de
pelculas o tmpanos
Realizar esquemas de las observaciones realizadas.
66
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PRACTICA N 28
ESTUDIO E IDENTIFICACIN DE TREPONEMA PRUEBA DE VDRL RPR
INTRODUCCIN
Las espiroquetas constituyen un grupo grande y heterogneo de microorganismos espirilares
mviles, dentro de las cuales se encuentra la familia Treponemataceae que comprende tres gneros
de microorganismos patgenos para el hombre: Treponema ( T. pallidum, causa la sfilis, T.
pertenue, produce el pin, T. carateneum, produce el pinto), Borrelia ( B. recurrentis produce la
fiebre recurrente, B. burgdorferi causa la enfermedad de Lyme), y Leptospira que origina
infecciones generales con fiebre, ictericia y meningitis.
La especie T. pallidum se caracteriza por ser de forma espiral delgados y miden 0.2 m de ancho y
5 a 15 m de largo, son mviles y giran constantemente, no se tien bien con los colorantes de
anilina y es difcil su cultivo en medios artificiales.
PRUEBAS DE DIAGNOSTICO
1. Las muestras obtenidas de las lesiones superficiales tempranas (lquidos tisulares) pueden
observarse en un microscopio de campo oscuro buscando las espiroquetas mviles
caractersticas.
2. Por inmunofluorescencia usando suero antitreponema marcado con fluoresceina
3. Pruebas serolgicas para sfilis, estas pueden usar antgenos treponmicos o antgenos no
treponmicos (cardiolipina purificada del corazn de buey)
4. Prueba de Floculacin (VDRL), el antgeno VDRL es una solucin alcohlica que contiene
0.03% de cardiolipina, 0.9% de colesterol y lecitina purificada; esta prueba esta basada en que
las partculas del antgeno lipido (cardiolipina) permanecen dispersas en suero normal y en
enfermos se combina con la reagina de la sfilis (la reagina es una mezcla de IgM e IgA dirigidos
contra algunos antgenos).
MATERIALES
Suero problema
Antgeno VDRL
Laminas excavadas
Pipetasgraduadas
PROCEDIMIENTO
Tomar con una pipeta 0.05 ml de suero calentado (bao Mara a 56C x 30) sobre la lamina
excavada
Aadir una gota del antgeno VDRL sobre el suero y rotar durante cuatro (4) minutos
Observar al microscopio con objetivo de menor aumento la formacin de floculos cuando la
reaccin es positiva.
RESULTADOS
N (No reactivo)
RD (Reactivo dbil)
R (Reactivo)
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........................
........................
.......................
Ausencia de floculos
Floculos pequeos
Floculos medianos y grandes
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ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA
PRACTICA N 29
CULTIVO DE MUESTRAS DE INFECCIONES URINARIAS: UROCULTIVO
INTRODUCCION
El Urocultivo es el examen de muestras de orina que permiten el aislamiento de agentes patgenos
causantes de una infeccin urinaria.
Para la obtencin de muestras debe considerarse:
La recoleccin debe ser con un mnimo de contaminacin
Establecer el momento ptimo para la recoleccin, con el objeto de tener la mejor probabilidad
de recuperar microorganismos causales.
Obtener una cantidad suficiente de la muestra para efectuar las tcnicas de cultivo necesarias.
Toda vez que sea posible, obtener las muestras antes de la administracin de antibiticos.
Normalmente la orina es estril, pero al tomarse la muestra existe la posibilidad de contaminacin
por lo que se realiza de rutina el Urocultivo cuantitativo:
1. Si existe menos de 10,000 grmenes por ml. se considera como contaminantes, siendo la muestra
negativa.
2. Cuando la orina tiene ms de 100,000 bacterias por ml, se considera que hay infeccin urinaria.
3. Si el nmero de grmenes oscila entre 1,000 a 100,000 se interpreta como dudoso y ser
necesario repetir el cultivo.
La orina debe ser procesada en el laboratorio dentro de las 2 horas siguientes a la recoleccin para
lograr recuentos de colonias exactos, luego se deber identificarlas y realizar el Antibiograma
correspondiente.
MATERIAL
Muestra de orina patolgica
Sedimento de orina
Agar Mac Conkey, Medio hipertnico de Chapman (Agar Manitol), Agar Sabouraud, en placas
Agar nutritivo en tubos con 20 ml licuado +/- 50C
Agar Mac Conkey en tubos con 20 ml licuado +/- 50C
Tubos con medio TSI, LIA, Caldo peptonado, MR-VP, Agar Citrato de Simmons, Agar Urea de
Christensen.
Tubos con 9.9 ml de Suero fisiolgico 0.85%
Pipetas de 1 ml. estriles
Placas Petri, vacas estriles
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LECTURA
1. En el sedimento de la orina los elementos que pueden observarse son: pus, eritrocitos, cristales
anormales, leucocitos, levaduras, parsitos, espermatozoides, clulas epiteliales, cilindros.
2. En los frotices coloreados por Gram, observar la presencia de bacterias Gram positivas y Gram
negativas, y por el mtodo de Ziehl- Neelsen las bacterias cido alcohol resistentes(en caso de
infeccin por Mycobacterium).
SEGUNDO DIA:
1. En la siembra de la orina sin centrifugar, observar en la placa de Agar Mac Conkey el
crecimiento de colonias lactosa positivas; en las placas de Agar Manitol, el desarrollo de
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Nota: El agente causal aislado e identificado deber ser sometido a Pruebas de Susceptibilidad
Antimicrobiana. El Antibiograma se realiza tomando 5 colonias del Agar Mac Conkey, se prepara
una suspensin en un tubo con SF al 0.85%, y se determina la Concentracin Mnima Inhibitoria
(MIC) del antibitico cuya finalidad es orientar en la teraputica y la concentracin del antibitico
alcanzado en el suero o en foco de infeccin.
El mtodo de disco-difusin estandarizado [Kirby - Bauer] es el que se usa de rutina en el
laboratorio, para dicha determinacin (MIC).
REPORTE FINAL
Disear el protocolo correspondiente, sealando:
1. La observacin macroscpica y microscpica de la muestra clnica.
2. Las caractersticas del desarrollo bacteriano, y los principios bioqumicos en cada uno de los
medios selectivos empleados.
3. Los resultados del comportamiento bioqumico.
4. La determinacin del agente patgeno causante de la infeccin urinaria.
5. Determinacin cuantitativo nmero de UFC por ml.
Nota: UFC (Unidad Formadora de Colonia)
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PRACTICA N 30
AISLAMIENTO DE VIRUS EN HUEVOS EMBRIONADOS Y EN RATONES
LACTANTES.
OBSERVACION DE LMINAS COLOREADAS
INTRODUCCION
Los virus son agentes infecciosos responsables de numerosas enfermedades del hombre, de los
animales, de las plantas y tambin de las bacterias (bacterifagos).
En este captulo analizaremos solamente los virus que producen patologa en el ser humano; debido
a sus caractersticas especiales como son su pequeo tamao y su parasitismo intracelular obligado,
los virus no pudieron ser estudiados hasta principios del siglo XX, si bien algunas de las
enfermedades producidas por ellos ya se conocan desde la antigedad (viruela, rabia, hepatitis, etc.).
Dado que los virus carecen de los constituyentes fundamentales para el crecimiento y
multiplicacin deben necesariamente utilizar los sistemas de las clula que parasitan y por ello se
denominan parsitos intracelulares obligados.
En los ltimos aos, se han desarrollado mtodos de diagnstico rpido para la mayora de las
infecciones virales as como drogas antivirales especficas para muchos virus.
Se emplean mtodos directos para el diagnstico de los virus, y dado que estos solo se replican en
el interior de las clulas vivas, para su cultivo in Vitro es necesario el empleo de mtodos especiales
en el laboratorio de virologa, tales como:
a) Cultivos tisulares de humanos o animales. La mayora de los virus pueden multiplicarse en
cultivo de clulas apropiadas.
b) Embriones de pollo (membrana corioalantoidea, cavidad amnitica, cavidad alantoidea y
saco vitelino).
c) Animales de laboratorio (ratones lactantes, Hmsters, monos)
d) Serologa o demostracin de anticuerpos frente al virus.
e) Demostracin directa del virus o de antgenos vricos a partir de frotis de las lesiones.
OBJETIVO DE LA PRCTICA
El aislamiento de los virus es de gran importancia en la investigacin mdica y epidemiologa y
constituye un mtodo muy extendido para el diagnstico de la infeccin.
Por lo tanto estas prcticas nos orientan a conocer los diversos mtodos de aislamiento directo o
indirecto para demostrar los efectos citopticos de los diferentes virus y sus formas como se deben
evaluar en los diferentes procesos infecciosos que generan en el ser humano.
METODOS DE DIAGNOSTICO VIROLGICO:
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PRACTICA N 31
INTRODUCCION
Los hongos ambientales se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza viviendo a
expensas de la materia inerte existente, la mayora se encuentra como saprofito, otros pueden ser
causantes de inducir hipersensibilidad as como tambin ser responsables de infecciones. Entre los
hongos ambientales comunes tenemos: Aspergillus, Penicilluim, Fusarium, Rhizopus,
Cephalosporium, Helmintosporium, Rhodotorula
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
1. Estudie las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de
micelio areo, aspecto de la colonia, produccin de pigmento y consistencia de la colonia.
2. Observar al microscpico utilizando lentes de menor y mediano aumento, las caractersticas
microscpicas de cada uno de los hongos preparados en las lminas con azul de lactofenol.
CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS AMBIENTALES
Aspergillus
Colonias al inicio de color blanco, luego vara de acuerdo a la especie en: amarillo, verde azufrado,
marrn o negro.
Microscpicamente presenta hifas tabicadas que forman conidiforos no tabicados que se ensanchan
en su extremo distal dando lugar a la cabeza aspergilar que da origen a los esterigmas y de donde
salen las conidias en cadena.
Penicillium
Colonias de color azul verdosas, pulverulento y desarrollo abundante.
Microscpicamente presenta hifas tabicadas con conidiforos ramificados en cuyo extremo se hallan
los esterigmas en forma de pincel del cual se originan las conidias en cadena.
Fusarium
Colonias de micelio areo algodonoso de color rosado violeta en la superficie.
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PROTOCOLO
Realizar esquemas o dibujos de lo observado en la prctica.
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PRACTICA N 32
PROCEDIMIENTO
1. Estudiar las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de
micelio, aspecto de la colonia , produccin de pigmento y consistencia de la colonia.
2. Observar al microscopio las caractersticas microscpicas de cada uno de los hongos preparados
en lminas.
CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS DERMATOFITOS, MALASESSIA Y PIEDRAIA.
Trichophyton rubrum
Colonias de micelio areo blanco, de aspecto algodonoso, al reverso puede observarse un pigmento
de color prpura.
Al microscopio se observan hifas septadas con microconidias ssiles piriformes, a veces puede
observarse macroconidias, clamidosporas y cuerpos nodulares.
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Trichophyton mentagrophytes
Colonias blanquecinas pulverulentas, granuladas, yesosas, al reverso puede observarse un pigmento
amarillo- pardusco.
Al microscopio se observan hifas septadas con abundante microconidias esfricas agrupadas, pueden
presentar hifas en espiral y macroconidias.
Trichophyton tonsurans
Colonias membranosas, crateriformes o cerebriformes de consistencia acartonada con
pigmentacin amarillo- castao al reverso.
Al microscopio se observan microconidias piriformes hialinas, clamidosporas, e hifas en raquetas
septadas, pueden observarse macroconidios.
Microsporum gypseum
Colonias poco elevadas pulverulentas con pigmento de color canela.
Al microscopio se observan hifas septadas, macroconidios con tabiques transversales en nmero de
4-6, rara vez se observan microconidias.
Microsporum canis
Colonias de color blanquecino poco elevado, con pigmento amarillo- naranja en el reverso de la
colonia.
Al microscopio se observan macroconidios fusiformes hasta con 8 tabiques transversales y con
pequeas excrecencias en la superficie, pueden tambin observarse microconidias y clamidosporas.
Epidermophyton floccosum
Colonias de aspecto aterciopelado, pulverulentas de color amarillo- azufre con pliegues en la
colonia.
Al microscopio se observan macroconidios con su extremo distal romo y con 3-4 tabiques
transversales, pueden encontrarse aisladas o en racimo.
Malassezia furfur (Pityrosporum)
Al microscopio se observan hifas cortas de extremos romos al lado de formas redondeadas
agrupadas; este hongo no desarrolla en medios comunes por lo que el diagnstico se da por el
examen directo de la muestra
Piedraia hortai
Los ndulos se observan en el tallo piloso como costras arenosas, duras de color pardo a negro que
envuelven completamente el tallo piloso.
PROTOCOLO
Realizar esquemas o dibujos de lo observado en la prctica
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PRACTICA N 33
ESTUDIO DE HONGOS LEVADURIFORMES.
OBSERVACION DE CORTES HISTOPATOLOGICOS.
INTRODUCCION:
Los hongos levaduriformes son frecuentes al estado saprofito en el suelo, aguas, plantas y en las
cavidades naturales del hombre como el tubo digestivo y en las regiones de los pliegues cutneos.
Muchas especies han sido vinculadas a infecciones humanas como la Candida albicans y otras
especies de Candida que puede producir infecciones agudas o crnicas en la piel o mucosas, aparato
genito- urinario, y respiratorio; otras levaduras como Cryptococcus neoformans pueden causar
infecciones cerebrales y rara vez infecciones cutneas; en el hombre la infeccin primaria es casi
siempre pulmonar.
MATERIALES
Cultivo con Candida albicans y Cryptococcus neoformans.
Lminas de Candida albicans en Agar harina de maz.
Lminas de Cryptococcus neoformans en tinta china.
Cortes histolgicos con C. albicans y Cr. neoformans.
Material bsico de laboratorio (xilol, algodn, alcohol)
Microscopios con lentes de menor y mayor aumento.
PROCEDIMIENTO
1. Estudiar las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el aspecto y
consistencia de la colonia.
2. Observar al microscopio las caractersticas que presentan cada especie de los hongos en el Agar
harina de maz, tinta china y en los cortes histolgicos.
CARACTERISTICA DE LOS HONGOS LEVADURIFORMES
Candida albicans
Las colonias son de aspecto cremoso y consistente, de color blanco perlado.
En el Agar- almidn- arroz, se observan clamidospora, pseudomicelio y blastospora que
tipifican a Candida albicans.
En los cortes histopatolgicos observar la presencia de filamentos cortos y levaduras en las
lesiones rodeadas de una zona de histiocitos.
Cryptococcus neoformans
Las colonias son de color blanquecino perlado al inicio, luego se tornan de color ocre, de aspecto
mucoide viscosas y brillantes con tendencia a deslizarse hacia el fondo del tubo de cultivo.
En las lminas con tinta china se aprecia la cpsula como un halo brillante entre el borde de la
levadura y el fondo oscuro dado por la tinta china.
En los cortes histopatolgicos, se observan como levaduras a lo largo de los vasos en las
lesiones, las cuales comprimen los tejidos vecinos y los necrosan, escasa infiltracin celular.
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PRACTICA N 34
ESTUDIO DE HONGOS DIMORFICOS.
OBSERVACION DE CORTES HISTOPATOLOGICOS.
INTRODUCCION
Los hongos dimrficos, son hongos causantes de infecciones mucocutneas y/o sistmicas en el
hombre y algunos animales.
Paracoccidioides brasiliensis
En su fase inicial esporgena, se encuentra en el suelo, fragmentos vegetales, espinas, etc. Y en su
fase de levadura en tejidos infectados.
Es el agente causante de la Paracoccidioidomicosis, infeccin crnica, granulomatosa de la piel,
mucosa, ganglios y vsceras. Es ms frecuente entre los trabajadores rurales.
Histoplasma capsulatum
En el ambiente natural se encuentra en la fase miceliar esporgena, que se desarrolla principalmente
sobre compuestos nitrogenados, tales como excretas de aves (gallina, lechuza), excremento de
murcilagos, etc., y en su fase de levadura se encuentra en tejido infectado.
Es el agente causal de la Histoplasmosis que puede afectar el sistema respiratorio en su forma
benigna pudiendo producir calcificaciones dispersas en los campos pulmonares.
Sporothrix schenckii
Hongo que vive en el suelo, sobre plantas, produce la Esporotricosis en el hombre y algunos
animales, el hongo ingresa generalmente por traumatismo con restos punzantes de vegetales
contaminados con el hongo. La infeccin esta localizada preferentemente en los ganglios linfticos
MATERIALES
Cultivo en Agar Sabouraud y Agar BHI de P. brasiliensis, H. capsulatum, S. schenckii.
Microcultivos coloreados con Azul de lactofenol
Cortes histolgicos infectados por estos hongos.
PROCEDIMIENTO
1. Estudiar las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de
micelio, aspecto de la colonia y consistencia de la colonia.
2. Observar las caractersticas microscpicas de cada uno de los hongos.
CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS DIMORFICOS
Paracoccidioides brasiliensis
En los frotices coloreados con Leishman o en cortes histolgicos, se presentan como clulas
esfricas u ovaladas de 10 a 80 micras de dimetro, con doble membrana y multigemantes.
En cultivo en Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias de micelio areo de color blanco
compacto, de crecimiento lento. Microscpicamente se observan filamentos hialinos, tabicados con
microconidias esfricas o piriformes.
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En Agar Infusin cerebro corazn (BHI), se observan colonias cerebriformes, de color beige claro.
Microscpicamente se observan clulas esfricas.
Histoplasma capsulatum
En frotices o cortes histolgicos se observan intracelularmente como nidos de levadura incluidas en
los histiocitos o polimorfonucleares. Las levaduras son pequeas, redondas u ovaladas de 1-3 micras
de dimetro.
En Agar Sabouraud glucosado, desarrolla colonias algodonosas de color blanco. Microscpicamente
se observan hifas tabicadas con escasa produccin de microconidias y gran cantidad de
macroconidias tuberculadas redondas y grandes de pared gruesa Clamidospora tuberculada.
En el medio BHI desarrolla colonias pequeas de aspecto membranoso rugoso, color marrn claro.
Microscpicamente, se observan como clulas ovaladas a veces gemantes.
Sporothrix schenckii
En Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias al inicio pequeas, blanquecinas presentando
posteriormente un aspecto hmedo, rugoso y membranoso, de un color que puede variar de crema a
negro.
Microscpicamente se observan hifas finas tabicadas con cortos conidiforos en cuyo extremo se
encuentran las conidias agrupadas dando el aspecto de una margarita.
En medio BHI, desarrolla colonias levaduriformes. Al microscopio se observan clulas en gemacin
ovales o en forma de cigarrillos Gram positivos.
PROTOCOLO
Esquematice o dibuje lo observado en la prctica.
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ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA MDICA
SEMINARIO-I
TEMA 1
TEMA 2
TEMA 3
TEMA 4
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SEMINARIO II
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SEMINARIO - III
ANTIBITICOS Y QUIMIOTERPICOS
(Mecanismos bsicos de actividad y resistencia a los antibiticos)
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SEMINARIO - IV
2. PAPILOMAVIRUS
3. VIRUS DE LA HEPATITIS B
B)
C)
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SEMINARIO - V
TEMA 3: DENGUE
a) ESTRUCTURA DEL VIRUS Y PATOGENIA
b) MANIFESTACIONES CLNICAS Y EPIDEMIOLOGA
TEMA 4: DENGUE
a) DIAGNSTICO E INMUNOLOGA
b) PREVENCIN Y CONTROL
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