Tcnicas de tincin.

Fundamentos
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el
microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio
que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes.
Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la
presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas,
paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas,
proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque
tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes.
Despus de la fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores cambios
estruturales en el protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido
fijadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo
inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de
las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que
son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no
pueden realizarse con mucha precisin.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica
por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas
cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes
celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos.
Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.
Otros colorantes son molculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los
constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos
colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son
sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos
de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depstos de
grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn.
Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra
sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina
mordiente; un mordiente habitual es el cido tnco. El mordiente se combina con un
constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son
suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante
simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color
tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la
presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no
celular no se tie.

La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin
teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil
de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no
tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como
la tinta china (que es una suspensin de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un
colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar
el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar
la presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas.
Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya
que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados
o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones
completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan
artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos
estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

Preparacin de un frotis
Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a
teir (si es lquido) o se hace rodar el hisopo con que se tom la muestra. Una vez que el
hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no est estril, ya no puede ser
empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estril para transferir
una pequea cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Este material
es suspendido en una gota de agua o solucin salina previamente colocada sobre el
portaobjetos. Cuando se trata de colonias muy pequeas que pueden perderse en una gota
de lquido se emplea una varilla delgada de madera estril con la cual se toca la colonia
obtenindose as una fraccin apreciable del desarrollo. El material se frota directamente
sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el
portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de
un mechero de Bunsen hasta que el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero no
queme.

Examen de muestras al microscopio

Segn la manipulacin que efectuemos sobre la muestra a observar y segn los colorantes
que empleemos durante el proceso, podemos hablar de diferentes modalidades de tincin.

Examen microscpico directo de las muestras

clnicas Sin Tincin
No se utiliza ningn tipo de colorante.
Es el montaje directo hmedo o examen en fresco: las
muestras se extienden directamente sobre la superficie de
un portaobjetos para su observacin. El material que es
demasiado espeso para permitir la diferenciacin de sus
elementos puede diluirse con igual volumen de solucin
salina fisiolgica estril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del
material.
Este tipo de preparacin se emplea para detectar trofozotos mviles de parsitos intestinales
como G

quistes
T

de
i

otros
h

En la imagen: C

d
o

parsitos,

m
n

, E

larvas
s

, huevos y

gusanos

adultos,

, hifas de hongos, etc

sp en un examen en fresco.

Examen microscpico de las muestras clnicas levemente modificadas

Tincin Simple
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las
estructuras celulares se tien con la misma tonalidad
(Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).
El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite
ver

elementos

de

hongos

ya

que

el

KOH

digiere

parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de

la clula husped, pero no acta sobre los polisacridos de
las paredes celulares de los hongos.
La
(C

tinta
r

china
y

Nigrosina

permite
o

observar

clulas
),

levaduriformes

sobre

todo

en

capsuladas
LCR.

Los

polisacridos capsulares rechazan la tinta china y la cpsula aparece como un halo claro
alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las
preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.
En
n

la
e

imagen:
f

C
a

r
s

en una tincin con tinta china.

Examen microscpico de las muestras clnicas muy modificadas

Diferencial

Tincin

Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras

celulares se diferencian en funcin de los diferentes
colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitucin
qumica.
Los ejemplos clsicos sera la tincin de GRAM o la de
Ziehl-Neelsen
En la imagen: BGN y levaduras en una tincin GRAM

microfotografa: Daniel Val

Examen de muestras al microscopio: la tincin GRAM

La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio
bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad
prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa
las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos,
etc) se basan justamente en la tincin de GRAM
Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la
siguiente: el Frotis fijado con calor se tie 1 min con
Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin
Yodada durante 1 min y se lava de nuevo con agua,
decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y
cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg.
Lavar y secar.
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll
en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en
dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los trminos positivo y negativo
no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos
morfologicos distintos de bacterias).

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las

diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la
clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la
lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el
peptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectandas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%90% de la pared de la clula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la clula gramnegativa,

por

otro

lado,

contiene

una

capa

mucho

ms

delgada,

nicamente

de

peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos,

lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es
peptidoglicano.
Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales
de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con algn detalle la tincin
de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqu de su
funcionamiento.
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal
violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el
exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las grampositivas como las
gramnegativas, estn teidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente
activo es aqu el I2

; el KI simplemente hace soluble el I2

en agua. El I2

entra en las

clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las
clulas

grampositivas

como

las

gramnegativas

se

encuentran en la misma situacin.

Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una
mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es
soluble

el

complejo

I2

-cristal

violeta.

Algunos

organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que

otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial
entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su
resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe
probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de
alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la
clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La
delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la
clula se decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas
(tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste
deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las
molculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la
pared celular. Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero
las gramnegativas son incoloras.

Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus
de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas, mientras que las
grampositivas permanecen azules.
Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:
1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s
solo tiene poca afinidad con las clulas.
2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las
clulas grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo
preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.
3) Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal
violeta - yodo.
El carcter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos organismos
son ms grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas veces
grampositivos y otras gramnegativos.

Morfologa ultramicroscpica de las bacterias:

estructuras internas
Pared celular
Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cpsulas y cubiertas mucilaginosas, y
en la periferia de una delicada membrana que est en inmediato contacto con el citoplasma,
se encuentra la pared celular, que es una estructura rgida que da forma a la clula. Las
paredes celulares pueden destruirse o romperse en condiciones especiales.
Constituyentes importantes de la pared celular son los aminocidos, aminoazcares,
azcares y grasas. Estas sustancias (protenas, Hidratos de carbono, grasas) estn enlazadas
formando el polmero complejo que forma la pared celular.
Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gramnegativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las bacterias grampositivas contienen menos aminocidos que las gram-negativas; el contenido graso es
mucho ms elevado en las gram-negativas que en las gram-positivas. Este hecho se ha
propuesto como explicacin del mecanismo de la reaccin al gram (ver las dos imgenes
juntas).

Bacteria Gram Positiva

Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos

clases de cidos teicoicos. cido Lipoteicoico que est en
la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y
unido a la membrana citoplsmica. Y cido teicoico de la
pared que est en la superficie y se une slo a la capa de
peptidoglicano. El cido Teicoico es el responsable del
determinante antignico del organismo.

Bacteria Gram Negativa

Tiene una capa delgada de peptidoglicano

(mureina) unida a una membrana exterior
por lipoprotenas. La membrana exterior
est hecha de protena, fosfolpido y
lipopolisacrido. En el lipopolisacrido, la
porcin de lpido est embebida en el
fosfolpido y el antgeno O polisacrido
est en la superficie. El lpido se llama
Lpido
A
y
es
txico,
pero
el
lipopolisacrido
entero
se
llama
Endotoxina. La pared de la clula tiene
poros llamado Porines para el transporte
de substancias de peso molecular bajo.
Entre la membrana citoplsmica y la pared
celular hay un espacio periplsmico con
enzimas
hidrolticas,
enzimas
inactivadoras de antibiticos y protenas
de transporte.

Tambin existen diferencias en la composicin de la pared entre las clulas de las diversas
especies.

Membrana Citoplsmica (citoplasmtica o protoplasmtica)

Inmediatamente debajo de la pared celular, existe una membrana fina, o envoltura, que se
denomina membrana citoplsmica o protoplsmica y est formada por una bicapa de
fosfolpido integral y protenas perifricas empotradas. La membrana citoplsmica tiene una
significacin funcional de suma importancia. Se trata de una membrana semipermeable,
selectiva, que controla el paso de los elementos nutritivos dentro de la clula y la salida de
los productos de desecho. Tiene enzimas respiratorias y durante la divisin celular el
cromosoma se une a la membrana de la clula en el sitio llamado Mesosoma.

Citoplasma
El material celular contenido dentro de la membrana citoplsmica puede dividirse en tres
partes, regin citoplsmica, de apariencia granular, la cual es rica en RNA, regin nuclear o
cromatnica, que es rica en DNA, y la parte lquida que mantiene disueltos los elementos
nutritivos.

El

RNA,

combinado

con

protenas,

forma

partculas

corpsculos

macromoleculares, de unos 200 A de dimetro, que forman una masa densa y compacta en
todo el citoplasma. Estas partculas de RNA-protena se denominan ribosomas, y son el
equivalente en las bacterias de los microsomas, o partculas que se encuentran en las clulas
animales y vegetales.

Estructuras Citoplasmticas
Nucleoide (cuerpo cromatnico)
Las clulas bacterianas no contienen el ncleo caracterstico de las clulas de las plantas y
animales superiores. Sin embargo, contienen en el citoplasma "cuerpos" que se consideran
como una estructura nuclear, el ADN de la clula bacteriana se encuentra confinado en este
espacio, es nico y circular, doble hlice sin protenas. Como no se trata de un ncleo
discreto, se ha sugerido que se d a estas estructuras las denominaciones de cuerpo
cromatnico, nucleoides, equivalentes nucleares, y aun cromosomas bacterianos. Se
demuestra con el mtodo de tincin de Feulgen, especfico para el DNA, y por microscopia
electrnica, porque la sustancia nuclear es menos densa que el citoplasma cincundante.
Ribosomas
Tienen estrecha relacin con la sntesis de protenas (30S y 50S para formar un complejo
70S).
Plsmidos
Lazos extracromosmicos de ADN, algn cdigo para la resistencia a drogas, toxinas y otros
factores.
Endosporas
Algunas bacterias pueden transformarse en pequeos ovoides o esferas, que son formas
celulares muy resistentes, denominadas esporas, o endosporas, porque se producen
intracelularmente.

Todos

los
d

organismos
i

de

los

gneros

Bacillus

se caracterizan, en parte, por su propiedad

de producir esporas. Tambin tienen esta propiedad otros gneros de bacterias verdaderas,
pero slo en casos aislados. Las bacterias capaces de esporular pueden crecer y reproducirse
en forma de clulas vegetativas durante muchas generaciones. Sin embargo, en cierto
perodo del desarrollo del cultivo en medio nutritivo apropiado, se produce, dentro del
citoplasma, la sntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora.

Tincin GRAM: Morfologa Bacteriana

Ya hemos visto que la tincin de GRAM aporta dos ideas bsicas para la deficinin
"taxonmica" de las bacterias: el color que adquieren tras la tincin y la forma que presentan
las clulas bacterianas.
En lo relativo a la coloracin, ya hemos explicado anteriormente que hablamos de
microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teidos de color azul-violeta y de Gram
negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado.
Formas bsicas en que se puede visualizar la morfologa bacteriana en una tincin GRAM:

Cocos
Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. Diplococos, aparecen por
pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en
grupos irregulares, a veces de gran tamao

forma

Divisin a lo largo del mismo plano, formando

esfrica:

cadenas cortas

Divisin a lo largo de 2
planos diferentes:

se llama
Coco

Divisin a lo largo de 3 planos

2 cocos juntos:

4 - 20 en cadenas:

Diplococos

Estreptococos

Ttradas
regularmente: Sarcinas

Bacilos
grandes variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

Forma de vara:

Dos bacilos juntos:

Cadenas de bacilos:

se llaman Bacilos

Diplobacilos

Estreptobacilos

Empalizadas, Bacilos
lado con lado o en
figuras en X, V o Y

irregularmente:
Estafilococos

Espirales (Treponemas, Borrelias ...)

Forma espiral rgida se

Si la espiral es flexible y ondulada se

llama: Espirilo

llama: Espiroqueta

Utilizamos el trmino Pleomorfismo para referirnos a la adopcin de diferentes formas en una

misma especie.

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Positivas

Cocos Gram-positivos
Racimos:

forma

, como S

tpica

Cadenas:

o
a

c
u

o
r

forma

grupo B

m
p

o
o

n
o

i
c

a
o

de
c

e
c

tpica
como

de

,
c

Tetradas:
M

forma
r

tpica

de

Bacilos Gram-positivos
Gruesos:

forma

tpica
i

de
u

m
C

forma
s

como

Finos:
L

e
c

n
u

s
m

tpica
i

de
s

Ramificados:
A

forma
i

tpica

y
i

c
a

e
,

de
t

como

grficos obtenidos de: http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas

Cocos Gram-negativos
Diplococos:
N

forma
s

Tambin
s

usual
a

d
e

de
p
i

como

s
l

aparecen con morfologa de diplococos.

puede ser pleomrfico, y a veces aparece como coco

Gram-positivo.

Cocobacilos:

forma
n

usual
b

de

, que puede ser Gram-positivo o Gram-negativo,

y, a menudo, Gram-variable.

Bacilos Gram-negativos
Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae,
como E

Cocobacilos:
H

forma
m

usual
h

como
l

Curvados: forma usual de V

i
s
p
,
como
c
h
o
l
e
r
a
e
,
C
a
m
p
y
l
o
b
a
s
p
, como C
.
j
e
j

de
u

i
V

o
.

c
u

t
n

e
i

Forma
F

de
s

aguja
o

fina:

forma

usual
i

de
m

grficos obytenidos de: http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm

Otras tinciones de uso habitual

RODAMINA-AURAMINA
Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los
fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen
de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio,
empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecfica. Todos los microorganismos
cido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parsitos, se tien con estos
colorantes.
Un aspecto importante de la coloracin rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden
ser reteidos con la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tincin con
el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersin. De esta forma, los resultados
positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que adems permiten la
diferenciacin morfolgica.

NARANJA DE ACRIDINA
El fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico ya sea en su forma nativa o
desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la
fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentracin. El naranja de acridina
ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo
est vivo y roja si est muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el cido
nucleico, el germen viable se inactivar poco tiempo despus de la tincin.

El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha

sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la
tincin de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para
la deteccin inicial de hemocultivos positivos.

ZIEHL-NEELSEN (BAAR)
Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos
miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de
resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por
esto
t
m
C

se
u
a
r

denominan
b
r
y

cido-alcohol

resistentes.

y
p

Las

como

los
r

micobacterias

parsitos

coccdeos

como

se caracterizan por sus

propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere

calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.
Se ha desarrollado una coloracin de cido-alcohol resistencia modificada que diferencia las
especies de N

(bacterias ramificadas filamentosas cuyas

paredes celulares contienen cidos-grasos de unos 50 tomos de carbono), de los

actinomiceos
N

(muy
a

semejantes
i

pero

no

son decoloradas por la mezcla cido-

cido-alcohol

resistentes).

alcohol estndar pero no por un tratamiento ms suave con cido sulfrico 0,5 a 1%. Estos
microorganismos se denominan cido-alcohol resistentes parciales o dbiles.
El frotis se tie durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave. Lavar con agua.
Decolorar con alcohol etlico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teir durante 3060 seg con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar

BLANCO DE CALCOFLOR
Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflor aumentando
considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Segn fue descrito por
Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen
inicial de los materiales clnicos. Tambin se emplea para aumentar la visualizacin de los
elementos morfolgicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratoros ha
suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz
blanco-azulada o verde manzana, segn la fuente luminosa que se utilice.

TINCIN DE ESPORAS (WIRTZ-CONKLIN)

Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus,
producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las
condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas
extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma
vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora
al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma
vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. Algunas de las bacterias
productoras de endosporas son patgenas para el hombre, por lo que su estudio y observacin
son de enorme inters.

OBJETIVOS
1. 1. Observar las endosporas y su disposicin en las formas vegetativas.
2. 2. Comparar las distintas morfologas y disposiciones que adoptan las endosporas en
las especies empleadas.
MATERIAL NECESARIO
- Portaobjetos con frotis bacterianos previamente preparados.
- Colorantes:
a) Solucin de verde malaquita (5%)
b) Solucin de safranina (0,5%)
- Pinzas de madera
- Mechero Bunsen o de alcohol
- Microscopio y aceite de inmersin

FUNDAMENTO
Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los
factores ambientales adversos. Adems, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el
microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin.
La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes:
1.- Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente.
2.- Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con
agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo colorante.

REALIZACIN
Se emplearn cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias
produzcan las esporas. Esta tincin es delicada en su realizacin y para poder obtener unos
resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las instrucciones.
1. 1.

Preparar

los

frotis

bacterianos indicados.
2. 2.

Teir

con

verde

malaquita. Con unas pinzas de madera

colocar la muestra encima de la llama del
mechero de forma que el colorante humee
durante 5 min.
Nota: evitar que la muestra
hierva. Aadir ms colorante si ste se
evapora; es importante que la muestra no se
seque.
3. 3.

Lavar con abundante

agua el exceso de colorante.

4. 4.

Teir con safranina 1

5. 5.

Lavar con abundante

min.
agua el exceso de colorante.
6. 6. Secar la preparacin.
7. 7.

Observar la preparacin

al microscopio. Anotar la disposicin y la

morfologa de las tres especies del gnero Bacillus.

Tincin de esporas

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

La posicin y la morfologa de la endospora en el interior de la bacteria constituyen
un carcter taxonmico til para diferenciar especies dentro de un mismo gnero.
Las tres bacterias empleadas en esta prctica difieren en la
disposicin y morfologa de las endosporas. B. sphaericus posee una

Localizacin y morfologa de las esporas en Bacillus

endospora esfrica con localizacin terminal y deformante de la clula
vegetativa, por lo que suele ser denominada "en palillo de tambor". B.
thuringiensis tiene localizada la endospora elipsoidal en el centro de
la clula vegetativa, lo que provoca un abombamiento caracterstico
denominado

"en

huso".

B.

subtilis

forma

una

subterminal no deformante.

Bibliografa:
http://www.danival.org/notasmicro/tincion/_madre_tincion.html

espora

cilndrica