Microbiologia predictiva

Profa. Rosa Mara Garca Gimeno

Dpto. Bromatologa y Tecnologa de los Alimentos
Universidad de Crdoba
Grupo de Investigacin HIBRO , AGR-0170
Qu es y como surge
la microbiologa predictiva?
Cmo se hacen los modelos?
Qu tipos hay?
Qu aplicaciones tiene
en los alimentos?
Qu es la microbiologa predictiva ?
La
microbiologa predictiva
microbiologa predictiva comprende
el estudio de la
respuesta de crecimiento
respuesta de crecimiento,
o de inhibicin,
de microorganismos que crecen en alimentos,
en funcin de
factores
factores que les afecten
(temperatura, pH, gases, etc.)
y a partir de estos datos
predecir
predecir lo que suceder
durante el almacenamiento,
procesado, etc
Qu es?
Figura. Teora de los salto de obstculos
Qu es?
Nutrientes
pH y capacidad tampn
Potencial redox
Actividad de agua
Constituyentes antimicrobianos
Estructuras antimicrobianas
Factores intrnsecos
Humedad relativa
Temperatura
Atmsfera gaseosa
Factores ambientales o extrnsecos
Velocidad de
crecimiento especfico
Sinergismo
Antagonismo
Comensalismo
Factores implcitos
Cortado en rodajas
Lavado
envasado
Irradiacin
Pasterizacin
Otros
Factores de la elaboracin o
tratamiento
Qu es?
DISEO
ACUMULACION DE DATOS
AJUSTE DE LA CURVA DE
CRECIMIENTO / INHIBICIN
MODELO
VALIDACIN
PREDICCIN
Cmo se hacen?
Estrategia para Diseo experimental (Davies 1993):
Definir objetivo experimental
4.6
6.0
7.4
5
17
10
0
pH
Temperatura
NaCl
30
Enumerar todas las variables
y grado importancia
Rango de fluctuacin de
variables
Seleccin del medio o sustrato
Caractersticas del inculo
Competencia con otros
microorganismos
Cmo se hacen?
2. Acumulacin de datos
tiempo
l
o
g
(
u
f
c
)
/
g
Cmo se hacen?
2. Acumulacin de datos
Mtodos directos
Mtodos indirectos
Recuento en placas
! ! material, tiempo y de esfuerzo
Mtodos instrumentales
Mtodos elctricos: conductancia, impedancia
Turbidimetra
Citometra de flujo
Bioluminiscencia
Espectroscopa de infrarrojos
Cmo se hacen?
Ventajas:
rapidez, fiabilidad,
no destructiva,
econmica
Tiempo (horas)
L
o
g

n

m
e
r
o

d
e

c

l
u
l
a
s
Datos
experimentales
MODELOS
PRIMARIOS
AJUSTE

Parmetros de
crecimiento
fase de adaptacin ()
tasa de crecimiento
(
max
)
densidad max poblacin
(yEnd)
3. Ajuste de la curva
Cmo se hacen?
Tasa de crecimiento especfica mxima (
max
)
Tiempo de generacin (g) o tiempo de duplicacin
(Td) (doubling time)
Tiempo de adaptacin ((lag-time))
Tiempo en alcanza X nivel o ufc/ml
Tiempo en incrementarse 2 unidades logartmicas
.....
Cmo se hacen?
Parmetros cinticos que estima el modelo
tiempo (horas)
l
o
g

n

m
e
r
o

d
e

c

l
u
l
a
s
25 C
15 C
10 C
Comportamiento general de microorganismos
Cmo se hacen?
tiempo (horas)
l
o
g

n

m
e
r
o

d
e

c

l
u
l
a
s
25 C
15 C
10 C
Cuando la temperatura aumenta
la tasa de crecimiento tambin aumenta
Cmo se hacen?
tiempo (horas)
l
o
g

n

m
e
r
o

d
e

c

l
u
l
a
s
25 C
15 C
10 C
Cuando la temperatura aumenta
el tiempo de adaptacin disminuye
Lag
Cmo se hacen?
4. Modelizacin
Parmetros de crecimiento
Variables
tasa de crecimiento
tasa de crecimiento
fase de adaptacin
fase de adaptacin
nivel mximo de crecimiento
nivel mximo de crecimiento
Modelos
secundarios
Ecuacin de Arrhenius
Modelo de Raz Cuadrada
Modelo de Respuesta en Superficie
Redes neuronales
Competencia entre
microorganismos
Competencia entre
microorganismos
CO
2
CO
2
Acidos orgnicos
Acidos orgnicos
Conservantes
Conservantes
pH
pH
Temperatura
Temperatura
Cmo se hacen?
5. Validacin del modelo
1. Validacin matemtica
2. Validacin en el alimento
Representacin grfica
verifica la precisin de los modelos generados
MTODO
CRITERIOS DE DECISIN
Indices
DATOS OBSERVADOS
Cmo se hacen?
demostrar que predicen con exactitud el comportamiento de
microorganismos durante procesado, almacenamiento y distribucin
Evolucin de E. coli O157:H7 en productos crnicos cocidos
Evolucin de E. coli O157:H7 en productos crnicos cocidos
JAMN COCIDO
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 5 10 15 20 25 30
tiempo (das)
l
o
g

N

(
u
f
c
/
g
)2.3C
6.5C
10C
13.5C
17.7C
10C 0.0338 h
-1
13.5C 0.0426 h
-1
17.7C 0.0426 h
-1
Tasa de
crecimiento
0.000
0.200
0.400
0.600
0.000 0.200 0.400 0.600
Tasa de crecimiento OBSERVADA
T
a
s
a

d
e

c
r
e
c
i
m
i
e
n
t
o

P
R
E
D
I
C
T
I
V
A
A
f
B
f
>1
lado seguro
B
f
<1
lado peligroso
B
f
: factor sesgo; A
f
: factor exactitud
y=x
MTODO DE VALIDACIN
6. Prediccin
Quantitative Risk Assessment (QRA)
PMP (Pathogen Modelling Program)
Food MicroModel ? Combase
MODELOS TERCIARIOS
Objetivo prctico final
elaborar grficos y predicciones
SSP (Seafood Spoilage Predictor)
MIRINZ-software
Decision support system (DSS)
Chefcad software
Food Spoilage Predictor (FSP)
Cmo se hacen?
Tipos de modelos matemticos
Segn su finalidad:
Modelos probabilsticos
microorganismos patgenos
ej. Cl. botulinum : se calcular la probabilidad de
produccin de toxina
Qu tipo hay?
Modelos cinticos
microorganismo alterantes
ej. Lactobacillus plantarum: se buscar predecir
el tiempo de generacin, la tasa especfica de
crecimiento o el tiempo de adaptacin
Tipos de modelos matemticos
Segn el fundamento matemtico
Qu tipos hay?
Modelo mecanstico: parte de
una base terica biolgica.
Modelo emprico: ajuste a
partir de los datos obtenidos
experimentalmente
Modelos PRIMARIOS
Cambio en el
nmero de microorganismos en el tiempo
bajo ciertas condiciones ambientales
Ecuacin Gompertz
Ecuacin Baranyi y Roberts
Modelo lineal en 3 fases
Esquema propuesto por Whiting y Buchanan (1993)
Modelos SECUNDARIOS
Cambios en los
parmetros de crecimiento frente a los
factores ambientales
Modelos TERCIARIOS
Programas
informticos
Modelos Raz cuadrada
Ecuaciones polinmicas
Redes Neuronales
Artificiales
Qu tipos hay?
Quantitative Risk Assessment (QRA)
PMP (Pathogen Modelling Program)
Food MicroModel ? Combase
SSP (Seafood Spoilage Predictor)
MIRINZ-software
Decision support system (DSS)
Chefcad software
Food Spoilage Predictor (FSP)
Modelos TERCIARIOS
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 20 40 60 80 100
tiempo (h)
a
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
MODELO PRIMARIO
Baranyi y Roberts
Gompertz
Lecturas absorbancia
Qu tipos hay?
Ecuacin de Ratkowsky
( )
= b T T
min

T (C)
MODELO SECUNDARIO
Qu tipos hay?
Respuesta
en
Superficie
MODELO SECUNDARIO
Qu tipos hay?
N de niveles o capas
Capa de
entrada
NaCl
NaNO
2
pH
T
h1
h2
h4
h3
h5
Parmetro de
crecimiento
Capa oculta
Capa de
salida
REDES
NEURONALES
ARTIFICIALES
N de neuronas
por capa
Grado de conectividad
entre nodos:pesos
Tipo de conexin
entre neuronas
MODELO SECUNDARIO
Qu tipos hay?
Modelo de probabilidad
MODELO SECUNDARIO
Qu tipos hay?
MODELO SECUNDARIO
Qu tipos hay?
MODELO
TERCIARIO
Direcciones web
FMM:
ComBase: http://www.ifr.ac.uk/ComBase/
PMP 6.1:
http://www.arserrc.gov/mfs/pathogen.htm
Seafood Spoilage Predictor (SSP)
http://ww.dfu.min.dk/micro/ssp
Qu
aplicaciones
tienen los
modelos en los
alimentos?
Conjunto de condiciones en funcin de la temperatura, pH y ClNa
bajo las cuales E. coli O157:H7 es capaz o no de crecer
4.5
5.5
6.5
7.5
8.5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
11
13
15
17
19
21
4.5
5.5
6.5
7.5
8.5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
11
13
15
17
19
21
pH
NaCl (%)
T (C)
7C
7-8%
5
0-200ppm
NO
2
Na
PREDICCIONES
GRFICOS
0.010
0.020
0.030
0.040
0.050
0.059
0.069
0.079
0.089
0.099
above
4.5
5.5
6.5
7.5
8.5
2
4
6
8
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
Tas a de
crecimiento(h
-1
)
pH
NaCl(%)
15C
30ppm NaNO
2
Por medio de la computarizacin de los datos
Educacin y formacin: Mostrar a
personas no tcnicas o
especializadas como sera el
comportamiento microbiano segn
los factores presentes en el medio.
Qu aplicaciones?
Escherichia coli O157:H7
E.E.U.U en 1982 por consumo de ternera
insuficientemente cocinada
Buenas Prcticas de Fabricacin (GMP)
Sistema de Anlisis de Peligros y Control
de Puntos Crticos (APPCC)
Anlisis
de
Riesgos
Evaluacin del Riesgo
Control del Riesgo
Comunicacin del Riesgo
PATGENO
EMERGENTE
ALIMENTOS
SEGUROS
4. Caracterizacin del riesgo
2. Evaluacin de la exposicin
3. Caracterizacin del peligro
1. Identificacin del peligro
EVALUACIN DEL RIESGO
1. IDENTIFICACIN DEL PELIGRO
Serogrupos de E. coli:
Enteropatgenos (EPEC)
Enterotoxignico (ETEC)
Verocitotoxignico(VETC)
Enteroinvasor (EIEC)
Enteroagregante (EaggEc)
Difusamente adherente (DAEC)
E. coli O157:H7
157 antgeno
somtico
7 antgeno
flagelar
bacilo Gram-negativo
flagelos peritricos
aerobio/anaerobio facultativo
oxidasa y catalasa negativo
1. Caractersticas
generales
se identifica el microorganismo
para determinar si constituye un
peligro potencial en el alimento
EVALUACIN DEL RIESGO
1. IDENTIFICACIN DEL PELIGRO
2. Factores de virulencia
Adherencia
Plasmido 60Mda
Gen eaeA157
Shiga toxina
Shiga toxina 2
Shiga toxina 1
Otros factores
de virulencia
Exopolisacarido
Hemolisina EHEC
Catalasa KatP
3. Incidencia de la enfermedad
Canad
Japn
Europa
Inglaterra
Gales
Alemania
Finlandia
Hungra
Italia
Espaa
1
er
brote en EEUU en 1982
Escocia
Barcelona
Septiembre 2000
158 afectados
EVALUACIN DEL RIESGO
1. IDENTIFICACIN DEL PELIGRO
4. Reservorios
Ganado vacuno
Ciervos
Ovejas
Cabras
Caballos
Perros
Pjaros
Moscas
Personas
Nios pequeos
Leche
Carne
Salchichas
Hamburguesas
Carne guisada
Sandwichs
Salami
Agua
Lechuga
Rbanos
Meln
Sidra de manzana
Brotes de alfalfa
Brotes de judas
Estiercol
EVALUACIN DEL RIESGO
2. EVALUACIN DE LA EXPOSICIN
Estudio de la inactivacin o multiplicacin de E. coli
O157:H7 durante el proceso de fabricacin del alimento
MODELOS PREDICTIVOS
Produccin de la materia prima
Elaboracin del producto
Envasado
Distribucin y venta
Consumidor
EVALUACIN DEL RIESGO
3. CARACTERIZACIN DEL PELIGRO
1 Enfermedad producida por E. coli O157:H7
2 Factores que influyen en el crecimiento y supervivencia
de E. coli O157:H7
Temperatura
pH
Aw
100 CLULAS
3 Relacin dosis-respuesta
Estudios epidemiolgicos
EVALUACIN DEL RIESGO
4. CARACTERIZACIN DEL RIESGO
Estimacin de la PROBABILIDAD de que ocurra el peligro y
de la severidad de los efectos adversos sobre la salud
2. EVALUACIN DE LA EXPOSICIN
3. CARACTERIZACIN DEL PELIGRO
1. IDENTIFICACIN DEL PELIGRO
Incorpora al estudio las estrategias para
controlar el riesgo analizado y el estudia el
porcentaje de reduccin de la enfermedad
Produccin de la materia prima
Elaboracin del producto
Envasado
Distribucin y venta
Consumidor
EVALUACIN DE LA EXPOSICIN
MODELOS
PREDICTIVOS
pH: 6.35
NaCl: 1.84%
NaNO
2
: 30ppm
Jamn de cerdo cocido
T: 13.5C?
2 clulas/g de
alimento
EVALUACIN DEL RIESGO
EVALUACIN DE LA EXPOSICIN
Predicciones de crecimiento de E. coli O157:H7
segn redes neuronales
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 25 50 75 100 125
tiempo (h)
l
o
g

N

(
u
f
c
)
MODELO DE
REDES
Tasa de
crecimiento
0.0822h
-1
T: 13.5C
CARACTERIZACIN DEL PELIGRO
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2 4 6 8 10
Dosis ingerida (log10ufc)
%

P
r
o
b
a
b
i
l
i
d
a
d

d
e

e
n
f
e
r
m
e
d
a
d
3.57
55%
CARACTERIZACIN DEL RIESGO
0
20
40
60
80
100
0 25 50 75 100
Tiempo de abuso de temperatura (h)
%

p
r
o
b
a
b
i
l
i
d
a
d

d
e

e
n
f
e
r
m
a
r
T: 13.5 C
Jamn
de
cerdo
cocido
TIEMPO ?
Prediccin
REDES
VIDA COMERCIAL PREDICTIVA
y(t)= y
0
+
max
A(t) - Ln 1+
e
max A(t)
-1
e
ymax- y0

Baranyi y Roberts (1994)

max
yEnd
MODELOS SECUNDARIOS
ESTIMACIN DE VIDA COMERCIAL
VIDA COMERCIAL OBSERVADA
ANLISIS SENSORIAL
CALIDAD SENSORIAL GLOBAL
10
6
-10
8
ufc/g
Korkeala y Bjrkroth, 1997
Garca-Gimeno y col., 1998
Qu aplicaciones?
Vida comercial
PRED (das)
T (C)
Vida comercial
OBS (das)
13.5
17.7
10.5
17.7
13.7
10.5
13.5
10.5
17.7
10
6.5
BAL
21
16
25
20
21
27
22
31
12
20
17
24
17
19
23
21
22
16
PAVO
POLLO
JAMN
Vida comercial
PRED (das)
Vida comercial
OBS (das)
VIDA COMERCIAL PREDICTIVA
ESTIMACIN DE VIDA COMERCIAL
Qu aplicaciones?
FORMULACIN DE NUEVOS PRODUCTOS
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.700
10 12 14 16 18 20 22 24 26
Temperatura (C)
T
a
s
a

m
a
x

c
r
e
c
i
m
i
e
n
t
o

(
h
-
1
)
0% NaCl
1.2% NaCl
2.4% NaCl
0.403 h
-1
0.234 h
-1
0.187 h
-1
% NaCl
T= 17.5C
pH= 6.22
NaNO
2
= 55 ppm
Qu aplicaciones?
SCOOP
TEMPERATURA DE
ALMACENAMIENTO
DE ALIMENTOS
PERECEDEROS
Qu aplicaciones?
Etapa 1
P ELIGRO
MICROBIOLOGIA PREDICTIVA Y APPCCs
Identificacin de peligros
Ejemplo:
Materia prima contaminada con diferentes
patgenos.
a) Cual de ellos tiene mayor capacidad para
reproducirse en esas condiciones? Y en su caso,
b) Que probabilidad tenemos que crezca en
nuestras condiciones?
c) Podemos estimar el efecto del procesado sobre
estos patgenos sin recurrir al anlisis?
Qu aplicaciones?
Etapa 1
P ELIGRO
MICROBIOLOGIA PREDICTIVA Y APPCCs
Identificacin de peligros
Ejemplo: Efecto de la formulacin del producto en
el crecimiento de Aeromonas hydrophila a 7C.

0
1
2
3
4
5
6
7
0 200 400 600
A
B
C
log N
tiempo (h)
A: sal 2.3%;
pH 6.1;
B: sal 4.3%;
pH 6.1;
C: sal 2.3%;
pH 5.6
Qu aplicaciones?
T (C)
En 15 minutos En 120 minutos
7
15
20
25
30
35
0
3
10
20
35
56
0
30
108
321
978
3386
Podemos valorar las consecuencias microbiolgicas del proceso y
determinar objetivamente que etapas son crticas para la calidad y
seguridad del producto.
Etapa 2
Determinacin de puntos crticos
Ej: Que ocurrira si se perdiera el control de una
determinada etapa del proceso consistente en mantener una temperatura
de 7C/15 minutos necesarios para mantener a St. aureus a niveles
aceptables?.
Qu aplicaciones?
Incremento estimado (%) en el nmero de Staphylococcus
aureus para varias combinaciones tiempo-temperatura