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Soluciones ELISA Protocolos
Soluciones ELISA Protocolos
El ELISA se basa e el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad
tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre
un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin
de un substrato especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotmetro o un colormetro.
Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacin:
Anticuerpos marcados:
ELISA Directo
ELISA Indirecto
ELISA sndwich
Doble (DAS)
Heterlogo (HADAS)
Antgeno marcado
ELISA competitivo
ELISA Directo.
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos especficos. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados.
Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antgenos, el complejo quedar
solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
ELISA Indirecto.
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados
deficientemente o no fijados.
Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado para
eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y
que se encuentran fijados a los antgenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
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Pasos generales de un ELI SA.
1. Tapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo.
2. Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos.
3. Unin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno tapizado en el pocillo
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antgeno o anticuerpo no unido
5. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
8. Adicin del substrato
9. Unin del substrato a la enzima
10. Desarrollo del color
ELISA Sndwich DAS (Double Antibody Sandwich).
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados
deficientemente o no fijados.
Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si est presente el agente patgeno de
diagnstico (antgeno), reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antgenos que no hayan
reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el
soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados
a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
ELISA Sndwich HADAS.
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados
deficientemente o no fijados.
Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si est presente el agente patgeno de
diagnstico (antgeno), reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antgenos que no hayan
reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el
soporte), los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado
para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionado.
Adicin de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos
marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
ELISA Competitivo.
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados
deficientemente o no fijados.
Adicin en concentracin conocida de una mezcla de antgenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y
antgenos desconocidos objeto de estudio. Paralelamente, aadir nicamente antgenos del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados
con una enzima. Lavar para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son
anlogas, el antgeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte. Si hay diferencia en las
lecturas de ambos pocillos, el antgeno objeto de estudio, est relacionado serolgicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el
soporte y la diferencia de densidad ptica, es proporcional a la concentracin del antgeno problema en la muestra.
Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes grupos:
ELISAs para detectar antgenos: ELISAs sndwich.
ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs indirectos.
La fase slida debe ser de un tipo que permita un fcil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unin de
antgenos o anticuerpos sobre su superficie. Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350L son especialmente ventajosas para procesar
un elevado nmero de muestras y un vez tapizadas, el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco
y a baja temperatura. Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse estriles y con o sin tapa.
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Microplacas de poliestireno de 96 pocillos
Las tcnicas de ELISA se realizan mediante la adicin secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado. Cada una de
las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatizacin de todas y cada una de las etapas.
Esta completa automatizacin se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nmero de muestras y necesitar una elevada
repetibilidad de resultados.
Lavador de placas de 96 pocillos
Lector de placas de 96 pocillos
Adsorcin de antgenos y anticuerpos (tapizado).
Los mtodos empleados son dos fundamentalmente:
Dilucin del antgeno o anticuerpo en tampn carbonato (pH 9,6) e incubacin posterior durante 3h a 37C o 16h a 4C.
Tratamiento a 40-50C en tampn fosfato (PBS) o en agua fisiolgica tamponada pH 7,2-7,4 hasta desecacin.
Solucin de lavado.
Solucin salina con Tween 20 como agente tensioactivo:
ClNa ................................................... 8,5gr
Tween 20 ........................................... 0,5mL
Agua destilada .................................... 1000mL
Conjugados.
La enzima escogida como marcador debe unirse fcilmente a antgenos y anticuerpos, encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener
un substrato cromognico o fluorognico conveniente y de fcil preparacin. Las enzimas ms utilizadas son fosfatas alcalina, peroxidasa de
rbano y -galactosidasa; a continuacin se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una as como los substratos que se
emplean con cada una de ellas.
Las operaciones de marcado o conjugacin, llevan implcitas dos etapas:
Purificacin de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacin generalmente salina de las protenas del antisuero,
seguida de una dilisis y purificacin de la fraccin de anticuerpos mediante filtracin molecular, cromatografa o separacin en gradiente de
densidad mediante ultracentrifugacin. Finalmente, se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mg/mL.
Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehdo o el del m-
periodato sdico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales).
VENTAJ AS DESVENTAJ AS
Incrementa su tasa de reaccin en
presencia de alcoholes.
Sufre inhibicin inducida por anticuerpos.
Tetrmero de 300kDa.
Frecuentemente causa impedimento
estrico.
SUBSTRATOS
Producto insoluble Producto soluble
-
g
a
l
a
c
t
o
s
i
d
a
s
a
MUG (fluorescente)
em
=440nm
AMPGD (luminiscente)
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VENTAJ AS DESVENTAJ AS
Se inactiva por agentes quelante almacena y manipula
narse a +4C durante ms
omo
ubstratos comerciales
disponibles.
s, la
n de conjugacin que la
trico.
Ms cara que la peroxidasa.
Estable cuando se
adecuadamente.
Puede almace
de 6 meses.
Disponible co mo enzima libre o c
conjugado.
Ms estable que la peroxidasa.
Pequeo tamao ( 86kDa).
Amplia variedad de s
acidez y los fosfatos orgnicos.
Menor relaci
peroxidasa.
Necesita tampones especficos.
Puede causar impedimento es
F
o
s
f
a
t
a
s
a
a
l
c
a
l
i
n
a
SUBSTRATOS
Producto insoluble Producto soluble
BCIP/NBT
ex
=360nm;
em
=440nm
AMPPD (lumi
p-NPP:
Amarillo: =405-410nm
4-MUP (fluorescente)
niscente)
VENTAJ AS DESVENTAJ AS
Estable cuando se almacena y manipula
adecuadamente.
s
nzima libre o como
o estrico.
Amplia variedad de substratos come
disponibles
La peroxidasa end Puede almacenarse a +4C durante m
de 6 meses.
Disponible como e
conjugado.
Bastante barata.
Pequeo tamao ( 40kDa).
Relacin de conjugacin 4:1.
No causa impediment
rciales
.
Incompatible con bastantes estabilizantes
(azida sdica, etc.).
gena y algunos metales
interfieren en su actividad.
SUBSTRATOS
Producto insoluble Producto soluble
P
e
r
o
x
i
d
a
s
a
l: =650nm
Amarillo: =450nm
DAB
4CN
zul:
rillo: =450nm
S:
5-410nm
)
sh)
Esteres de acridina (quimioluminiscente
flash)
TMB:
Azu
TMB:
A =650nm
Ama
ABT
Azul verdoso: =40
OPD
Amarillo: =490nm
HPPA (fluorescente)
ex
=320nm;
em
=404nm
HPA (fluorescente)
Lumino l (quimioluminiscente glow
Polifenoles (quimioluminiscente fla
Luciferina (bioluminiscente glow)
Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccin de IgGs y es la utilizacin de protena A o G
a. Aquella dilucin del conjugado que produzca menor reaccin inespecfica
rro del conjugado an a costa de aumentar el tapizado.
e la parada de la
H o tanto, el mtodo de deteccin de los complejos antgeno-anticuerpo
y as tenemos sistemas de deteccin colorimtricos, fluorescentes y luminiscentes que a continuacin pasamos a desarrollar:
marcadas con peroxidasa.
Una vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacin; esta conservacin se suele realizar mediante
liofilizacin, congelacin a 70C o filtrado estril y conservacin a -20C mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado estril.
La bsqueda de la concentracin ptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado; para cualquier ELISA que utilice anti-
anticuerpos conjugados, se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1:100 hasta 1:2000) frente a sucesivas diluciones de
antisuero en placas tapizadas con antgeno a concentracin idne
(menor color de fondo o background) con muestras negativas e implique una clara distincin de las muestras positivas, ser la ptima. La
eleccin de una concentracin de conjugado ptima va completamente ligada a planteamientos econmicos en los que se ha de procurar el
mayor aho
La eleccin del substrato es de gran importancia para la estandarizacin del mtodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta, como son
sensibilidad, especificidad, repetibilidad, facilidad de lectura y complejidad de preparacin, as como estabilidad despus d
reaccin.
oy en da existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y, por l
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