l.

EXPLlCAClON DE TRABAJOS PRACTlCOS -2007

MlCROBlOLOGlA GENERAL- BlOQUlMlCA
MEDIOS DE CULTIVO
lNTRODUCClON
Las bacterias son organismos muy verstiles. Presentan un gran potencial en
su capacidad de utilizar disitntas fuentes de alimentos, desde sustancias
inorgnicas hasta materias orgnicas sumamente complejas. Muchas especies
han aprendido a crecer en una amplia diversidad de nichos ecolgicos con
temperatura, acidez o tensiones de oxgeno extremas.
Es muy difcil estudiar microorganismos en forma individual; lo ms prctico
es trabajar con poblaciones de los mismos. Para lograr estas poblaciones es
necesario disponer de un medio artificial que brinde a los microorganismos todos
los requerimientos nutricionales para desarrollarse. Este ambiente artificial se
denomina MEDlO DE CULTlVO.
MEDlO DE CULTlVO es toda preparacin artificial, slida, semislida o lquida
que suministra al microorganismo cada una de las sustancias fundamentales, una
fuente de energa y condiciones ambientales adecuadas para la sntesis y
mantenimiento de su protoplasma.
CULTlVOS: son las poblaciones de microorganismos que se obtienen
en los medios de cultivo.
Los cultivos pueden ser:
a) puros o axnicos, cuando la poblacin est constituida por una nica
clase de microorganismos.
b) mixtos, cuando la poblacin est constituida por ms de una clase de
microorganismos.
En la actualidad, la mayora de los grmenes patgenos se pueden cultivar fuera
de su hbitat natural. Ciertos parsitos obligados como las Rickettsias, nunca han
podido cultivarse en medios artificiales; requieren clulas vivas, cultivos de tejidos
o embriones de pollo.
CLASlFlCAClON DE LOS MlCROORGANlSMOS SEGN LA FUENTE DE
ENERGlA Y CARBONO QUE UTlLlZAN
Al disear un medio de cultivo es importante conocer los
requerimientos de energa y carbono de las especies a cultivar.
- Fuente de energia , puede ser:
- luz energa luminosa que se convierte en
energa qumica. Los microorganismos que utilizan esta fuente de energa se
denominan fototrofos.
- reacciones de oxido!reducci"n a partir de
compuestos qumicos inorgnicos u orgnicos. Los microorganismos que utilizan
esta fuente de energa se denominan quimiotrofos.
Todos los organismos requieren una fuente de energa para obtener ATP y
generar poder reductor (NADH, NADPH) por alguno de los siguientes
metabolismos:
- respiracin aerobia : aceptor final de electrones O
2
- respiracin anaerobia: aceptores finales de electrones: NO
3
-
, SO
4
=
, CO
2
,
fumarato
- fermentacin : conjunto de reacciones donde compuestos orgnicos sirven
como donadores y receptores de electrones. Se produce ATP por
fosforilacin a nivel de sustrato.
- Fotosntesis
- Fuente de car#ono , puede ser:
- CO
$
los microorganismos que utilizan esta
fuente de carbono se denominan autotrofos.
- compuestos org%nicos car#onados (azcares,
aminocidos, cidos grasos, etc). Los microorganismos que utilizan estas fuentes
de carbono se denominan heterotrofos.
De la combinacin de estas categoras surge la sig. clasificacin de
microorganismos:
Fuente de energa Fuente de carbono Categora Ejemplos
Luz CO
2
Fotoautotrofos Algas,
cianobacterias
acetato Fotoheterotrofos Alg. bacterias

Reacciones CO
2
Quimiolitotrofos Bacterias
oxidantes de
de xido-reduccin H
2
, del
azufre, de Fe
2+

compuestos orgnicos Quimioorganotrofos Hongos,
bacterias
Fotoautotrofos = fotolitotrofos
Fotoheterotrofos = fotoorganotrofos
COMPOSlClON QUlMlCA DE LOS MEDlOS DE CULTlVO
Cuando se disea la frmula del medio de cultivo, es necesario conocer en qu
categora est incluido el microorganismo a cultivar para elegir acertadamente los
componentes del medio: generalmente compuestos inorgnicos para
microorganismos fototrofos y quimiolitotrofos, y orgnicos para
quimioorganotrofos.
Un medio de cultivo est integrado por:
&' Elementos energticos ( constituti)os:
a) Macroelementos (g/l):
Fuente de carbono : puede ser CO
2
compuestos carbonados
orgnicos. Se utilizan en la construccin de innumerables molculas
necesarias para la clula. Los hidratos de carbono se consideran
*uente de car#ono ( energ+a por excelencia en los quimioorganotrofos.
Los ms comunes son:
- hexosas como glucosa, fructosa, galactosa;
- pentosas como arabinosa, xilosa, ramnosa;
- disacridos como lactosa, sacarosa, maltosa;
- trisacridos como rafinosa;
- polisacridos como almidn, glucgeno;
- alcoholes como glicerol, sorbitol, manitol; y
- glucsidos como salicina, y esculina.
Fuente de nitrgeno: muchos organismos son autotrofos respecto de la
fuente de nitrgeno y pueden crecer utilizando molculas sencillas
como NO
3
-
, NH
3
N
2
. El nitrgeno es metabolizado para proveer
protenas, cidos nucleicos y polmeros de pared. Otros
microorganismos pueden incorporar nitrgeno en forma de
aminocidos, bases pricas o pirimdicas.
En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, el aporte de
nitrgeno es realizado por las peptonas, que son los productos de la
hidrlisis cida o enzimtica de protenas de origen animal o vegetal
(carne, soja, casena, gelatina, harina de maz y girasol). Esos
productos de hidrlisis pueden tener longitud variable, desde
aminocidos, hasta dipptidos, tripptidos, polipptidos, albumosas,
proteosas.
La hidrlisis cida puede ser realizada con HCl H
2
SO
4
y presenta las
siguientes desventajas:
- el triptofano se destruye
- se pierde el l0% de vitaminas presentes
- desaparecen casi completamente los polipptidos
Se prefiere la hidrlisis enzimtica que emplea diferentes proteasas
actuando a pH especficos, ej. papana a pH 6.5, tripsina a pH 8.5,
pepsina a pH 2.
Las peptonas son fuente de nitrgeno y, en ausencia de ,idratos de
car#ono en el medio de cultivo complejo, cumplen la funcin de fuente
de carbono y energa. Aportan vitaminas del grupo B, trazas de metales
y fosfatos que dan carcter "buffer" al medio.
Las peptonas de origen vegetal pueden aportar carbohidratos
fermentables.
Fuente de fsforo: se suelen agregar fosfatos de sodio o potasio que
tambin confieren poder buffer al medio de cultivo (pH cercano a 7). Si
se agrega yema de huevo al medio de cultivo, el aporte de P es
realizado por los glicerofosfolpidos de la yema. El fsforo se incorpora
a cidos nucleicos, fosfolpidos, polmeros de membrana, ATP, y
sustancias de reserva (grnulos de volutina)
Fuente de azufre: se adiciona como SO
4
=
, cisterna o metionina. En la
clula se incorpora a aminocidos y diferentes coenzimas.
Fuente de calcio, magnesio y potasio : potasio, calcio y magnesio se
adicionan como sales inorgnicas. Son cationes que estabilizan
macromolculas aninicas. K
+
acta como coenzima y estabilizador de
RNA. Mg
2+
se integra a colorofila en organismos fotosintticos. Ca
2+
abunda en esporas como dipicolinato de calcio.
Fuente de sodio: sodio contribuira a equilibrar la presin osmtica del
medio extracelular. Es un catin requerido por bacterias haloflicas. Se
suele suministrar como NaCl.

b) Microelementos o trazas (mg ug/ml): suelen estar naturalmente
presentes como contaminantes de los macroelementos.
Frecuentemente esenciales:
Mn: estimula el crecimiento, favorece la esporulacin.
Fe: cofactor de enzimas para la funcin respiratoria en citocromos,
catalasa y flavoprotenas. En adecuada concentracin favorece la sntesis de
toxina diftrica.
Co: interviene en la sntesis de vitamina B
l2
.
Cu: presente en oxidasa terminal de la cadena respiratoria.
Esenciales en casos especiales : B, Al, Si, V, As, Se, Mo, Sn, Be, F, etc.
lnhibidores del crecimiento : Au, Ag, Cd, Cr, Pb, y cualquier
microelemento a concentracin mayor que l0
-4
M puede resultar txico
para el desarrollo de los microorganismos.
$' Factores de crecimiento
Son compuestos orgnicos especficos requeridos en muy bajas
concentraciones que no pueden ser sintetizados por la clula que los
necesita. Por esta razn, deben ser agregados al medio de cultivo. Ej.:
principalmente vitaminas del grupo B, algunos aminocidos, purinas,
pirimidinas, cidos grasos. Hay ejemplos clsicos como los factores X y V
(porfirinas) de la sangre requeridos por la bacteria Haemophilus
influenzae para crecer. El suero fetal bovino, que aporta numerosos
factores de crecimiento, es imprescindible para el cultivo de clulas
animales.
Cmo surge la necesidad de un factor de crecimiento? La capacidad de
sintetizar un compuesto esencial est relacionada con una secuencia de
reacciones catalizadas por enzimas que se completa satisfactoriamente.
Cuando por alteraciones genticas, alguna enzima de la secuencia no
puede ser sintetizada, la serie de reacciones se bloquea en algn paso y
no finaliza con xito. El compuesto que por esta razn dej de
sintetizarse, se convierte en un *actor de crecimiento.
En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, los factores de
crecimiento pueden ser aportados por diversos extractos:
-Extracto de carne: su funcin es ser complemento vitamnico de las
peptonas. Pero tambin aporta sustancias nitrogenadas como:
aminocidos, bases pricas y pirimdicas, cidos orgnicos, creatina,
xantina, hipoxantina, cido rico, urea, y sustancias no nitrogenadas como
glucgeno, fosfatos de hexosas, cido lctico, sales inorgnicas.
La calidad de este tipo de extracto vara con la carne empleada, el tiempo
y la temperatura de extraccin.
-Extracto de levadura: se obtiene por autolisis o plasmolisis de las clulas
de levadura. Su funcin es ser suplemento vitamnico de las peptonas,
pero tambin aporta mezclas de aminocidos y pptidos, y carbohidratos.
-Extracto de malta: es un interesante sustituto del extracto de levadura ya
que posee adecuado contenido de vitaminas, carbohidratos y
aminocidos. Es el extracto soluble en agua de la malta de cebada.
-' .gentes solidi*icantes
Su agregado al medio de cultivo es opcional.
El ms usado:
- el agar, es un polisacrido cido derivado de algas marinas, formado
principalmente por galactosa con un grupo sulfato cada l0 a 50 restos.
Suele contener sustancias nutritivas en pequeas concentraciones, y por
esto no puede ser utilizado en medios de composicin qumica
estrictamente definida destinados a autotrofos. Se usa sin problemas en
medios de cultivo complejos para quimioorganotrofos.
Se agrega al l.5-2% en medios de consistencia slida normal, al 0.2-0.3%
en medios semislidos o blandos, al 5% en medios de consistencia muy
firme para detener el crecimiento de grmenes muy mviles, y al 0%
cuando se preparan medios lquidos (caldos).
Sus caractersticas:
- Funde a 80-l00C y permanece lquido hasta 50-55C.
- A 45-55C se pueden agregar suspensiones de clulas sin afectar la
viabilidad (supervivencia) de las mismas.
- Permanece slido a 37C, temperatura de incubacin de la mayora de las
bacterias patgenas del hombre.
- No es txico para las bacterias, ni es degradado por stas.
- Utilizado al l.5-2%, permite el aislamiento de colonias (poblaciones de
microorganismos derivadas de una nica clula), lo que resulta imposible
en medios lquidos!
- Es transparente, lo que facilita la visualizacin de las colonias.
- Al solidificar, forma una trama suficientemente abierta para permitir la
difusin de los nutrientes del medio de cultivo en todas direcciones, y
suficientemente cerrada segn la concentracin empleada- para impedir
la movilidad de los microorganismos.
Otros solidificantes:
- Agarosa : es agar muy transparente libre de sulfatos. Se usa intensamente
para fines especficos en lnmunologa y Biologa Molecular.
- Silicagel : es silicato diluido en HCl. Se emplea en medios de cultivo para
autotrofos, cuando debe excluirse materia orgnica del medio de cultivo.
- Gelatina : es una protena obtenida por hidrlisis del colgeno. Fue el
primer solidificante usado en Microbiologa, pero es degradado por la
mayora de las bacterias (lo comen, por lo que el medio inicialmente slido
termina convertido en medio lquido) y la temperatura de incubacin no
puede ser mayor a 22C (es el punto de fusin) con lo que cultivos slidos
a temperaturas ms altas resultan inviables.
- Albmina de huevo, suero : a 80C estas protenas coagulan y solidifican
el medio de cultivo.
/' .gua
El agua representa una altsima proporcin (80-90%) del peso total de una
clula y es fundamental para la realizacin de todos los procesos
metablicos, funciones enzimticas, solvatacin de materiales orgnicos e
inorgnicos, donacin de electrones para organismos fotosintticos. Los
medios de cultivo se preparan en el laboratorio con agua destilada lo que
estandariza su composicin y asegura la ausencia de iones como Ca
2+
y
Mg
2+
que pueden precipitar con fosfatos o generar reacciones
indeseables.
CONDlClONES FlSlCAS DE UN MEDlO DE CULTlVO
An cuando las condiciones qumicas del medio de cultivo estn cubiertas, el
crecimiento y desarrollo de los microorganismos no tendr lugar si se
desconocen las siguientes condiciones fsicas:
- temperatura: cada especie tiene su temperatura ptima de crecimiento.
mesfilos: 35-37C
psicrfilos: l5-20C
termfilos: 50-60C
-presin osmtica: la mayora de las bacterias crece en 0.l a l% NaCl. Las
halfilas requieren concentraciones superiores.
-presencia de oxgeno: segn sus requerimientos de O
2
las bacterias se clasifican
en:
aerobios estrictas: requieren oxgeno para crecer. Metabolismo
respiratorio.
microaerfilos: necesitan bajas tensiones de O
2
y una atm
enriquecida en CO
2
. Pueden
realizar respiracin aerobia.
anaerobios obligados: el O
2
les resulta txico. Crecen en medios
muy reducidos (sin O
2
).
Metabolismo fermentativo.
anaerobios aerotolerantes: crecen en ausencia de O
2
(metabolismo fermentativo) y
cuando son expuestos al O
2
no mueren.
anaerobios facultativos: pueden crecer en condiciones aerobias
(metabolismo respiratorio)
como anaerobias (metabolismo fermentativo).
-humedad: todas bacterias necesitan un ambiente mucho ms hmedo para su
desarrollo que los hongos. En condiciones ambientales adversas, algunas
especies producen estructuras de resistencia a la desecacin llamadas esporas
que permanecen viables durante tiempo prolongado hasta que el ambiente sea
propicio para la germinacin. Producen esporas los gneros Clostridium (ej. C.
tetani,, C. botulinum), Bacillus (ej. B. cereus, B. subtilis), porosarcina, entre
otros.
- luz: es importante para los microorganismos fotosintticos.
-pH: la mayora de las bacterias crece en medio neutro o ligeramente alcalino (7
7.6). Excepciones son los lactobacilos (pH 5, acidfilos), !ibrio cholerae (pH 8.6,).
Los hongos crecen a pH menor que 7.
CLASlFlCAClON DE LOS MEDlOS DE CULTlVO
a) 0or su consistencia (esto depende de la inclusin o no de un agente
solidificante)
-lquidos (no permiten el aislamiento de colonias)
-slidos (permiten el aislamiento y observacin de colonias)
b) 0or su origen (esto depende de que la frmula se pueda describir
qumicamente con precisin)
-sintticos: estrictamente definidos desde el punto de vista
qumico, generalmente
se usan para cultivar fototrofos y quimiolitotrofos.
-naturales o complejos: se preparan a partir de sustancias
naturales de origen ani-
mal o vegetal de composicin qumica no
rigurosamente
constante: leche, suero, macerado de
maz, peptonas, ex
tractos de carne, levadura. Son aptos para
el cultivo de
quimioorganotrofos. Son los que
prepararemos y usaremos en el
Laboratorio de Microbiologa.
c) 0or su composici"n
- comunes: incluyen una frmula nutritiva bsica que permite el
crecimiento de microorganismos poco exigentes.
- enriquecidos: mejoran su calidad nutritiva por el agregado de
componentes muy ricos como leche,
sangre, huevo, lquido asctico, extracto proteico de cianobacterias. Se
utilizan en el cultivo de bacterias exigentes.
d) 0or su *unci"n
- Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que sembrados con
poblaciones mixtas de microorganismos, favorecen la multiplicacin de ciertos
grupos e inhiben el desarrollo de las especies restantes. Para funcionar de esta
manera incluyen compuestos qumicos especficos o requieren condiciones
fsicas especiales (temperatura, pH).
Ej.: agua peptonada alcalina favorece el desarrollo de !ibrio cholerae tolerante
a pH alto e inhibe otros microorganismos presentes en la misma muestra; caldo
selenito contiene selenito de sodio que favorece la proliferacin de especies
como almonella y higella pero inhibe otras enterobacterias; caldo EC a
44.5C, una temperatura que favorece a Escherichia coli y no a otras bacterias.
- Medios selectivos: son medios slidos que de manera parecida a los
anteriores, permiten el desarrollo de ciertos microorganismos e impiden el
desarrollo de otros. La selectividad se logra alterando las condiciones fsicas del
medio de cultivo o agregando compuestos qumicos inhibidores. Ej:
- cam#iando p1: para favorecer el desarrollo de "actobacillus, un gnero
implicado en la produccin de yogur, se puede agregar cido actico a los
medios de cultivo para obtener un pH final de 5.4, totalmente inadecuado para
muchas bacterias acompaantes.
- altas concentraciones osm"ticas en agar manitol salado con una
concentracin de NaCl de 7.5% muy pocas bacterias pueden crecer, salvo las
que presenten una elevada tolerancia a NaCl, como taph#lococcus aureus
- agregando antispticos: colorantes como verde brillante, cristal violeta y
eosina, se utilizan para inhibir grmenes Gram positivos mientras los Gram
negativos desarrollan sin dificultad. Las sales biliares se usan con el mismo
propsito.
- agregando anti#i"ticos: en lngeniera Gentica es prctica rutinaria la inclusin
de antibiticos (ampicilina, tetraciclina) en los medios de cultivo para poner en
evidencia la presencia de bacterias genticamente manipuladas. Estas clulas
son resistentes a uno o ms antibiticos y pueden desarrollar en un medio que
los incluye, mientras las clulas acompaantes, sensibles a los antibiticos, no
pueden crecer. En Microbiologa Clnica, se usan antibiticos de espectro de
accin reducido que inhiben o destruyen microorganismos cuyo estudio no
interesa, a la vez que no afectan los grmenes que se estn investigando.
-Medios diferenciales: permiten demostrar caractersticas metablicas de un
determinado grupo de microorganismos. Por ej.: puede el germen A utilizar
glucosa por una va fermentativa? Si agregamos glucosa a un medio de cultivo
slido y un indicador de pH que indique por cambio de color si el azcar ha sido
fermentado o no, estaremos analizando una caracterstica metablica de A.
Existen medios diferenciales donde se pueden detectar varias caractersticas
metablicas distintas. La clave es incluir en la frmula del medio de cultivo a usar:
, el sustrato adecuado para la caracterstica metablica que se desea estudiar y
un sistema indicador que refleje por variacin de color u otro fenmeno
perceptible, los cambios que hayan tenido lugar. Las pruebas bioqumicas que
veremos en los Trabajos Prcticos son claros ejemplos de medios de cultivo
diferenciales.
-Medios de transporte: se usan cuando se transcurre cierto tiempo entre la
toma de una muestra y su procesamiento. lncluye compuestos que aseguran la
supervivencia de las clulas hasta que sean sembradas en un medio de cultivo
adecuado.
lMPORTANTE: un gran nmero de medios de cultivo tienen funciones mixtas. Ej.:
puede ser enriquecido porque lleva sangre y selectivo porque incluye algn
antibitico. Puede ser selectivo porque incluye inhibidores y diferencial porque
pone en evidencia propiedades metablicas.
EJERClClOS DE APLlCAClN
l. Para un microorganismo fotoautotrofo mencione qu componentes tendra
en cuenta para disear un medio de cultivo qumicamente definido o
sinttico que incluye:
- fuente de carbono:
- fuente de energa:
- fuente de nitrgeno:
2. Para un microroganismo quimioorganotrofo qu componentes tendra en
cuenta para disear un medio de cultivo complejo o qumicamente
indefinido que incluye:
- fuente de carbono:
- fuente de nitrgeno:
- fuente de energa:
3. En el Trabajo Prctico tendremos ocasin de preparar algunos de los
siguientes medios de cultivo:
a) Caldo nutritivo
Extracto de carne.... 0.3 g a.l. Qu aporte realiza cada
componente?
Peptona de carne .... 0.5 g a.2. Si no hay hidratos de carbono,
qu componente aporta C?
NaCl ............ 0.5 g a.3 Cul es la fuente de
energa en el medio de cultivo?
Agua destilada..... l00 ml a.4. Clasifique este medio por su
consistencia, origen y composi-
pH: 7- 7.2 cin. Qu clase de microorganismos segn
fuente de C y
energa- creceran en l?
b) Agar nutritivo
Extracto de carne.... 0.3 g b.l. Qu aporte realiza cada
componente?
Peptona de carne .... 0.5 g b.2. Qu componente aporta los
factores de crecimiento?
NaCl ............ 0.5 g b.3 Cul es la fuente de
energa en el medio de cultivo?
Agar ............ l.5 g b.4. Clasifique este medio por
su consistencia, origen y composi-
Agua destilada...... l00 ml cin. Qu clase de
microorganismos segn fuente de C y
pH: 7 -7.2 energa- creceran en l?
c) Medio BW3
K
2
HPO
4
........ 0.25 g c.l. Mencione fuente de carbono y
fuente de nitrgeno
CO
2
........ burbujeo constante c.2 Cul sera la fuente de
energa?
MgSO
4
........ 0.0375 g c.3. Por su consistencia y su origen,
cmo clasificara este medio?
Na
2
MoO
4
....... 2.5 x l0
-3
g c.4. Para qu clase de grmenes
segn fuente de C y de energa-
NaVO
3
....... l.24 x l0
-4
g sera adecuado?
KNO
3
........ l g
Agua destilada.. l000 ml
d) Cul de los siguientes componentes agregara a un medio de cultivo comn
para convertirlo en un medio enriquecido?
- agua destilada -penicilina -suero fetal bovino -
colorantes
- sangre de oveja -leche -extracto proteico de
cianobacterias
-sales biliares -antispticos -yema de huevo
-agar
e) Se desea propiciar el desarrollo de un grupo A de microorganismos
quimioorganotrofos, acidfilos y resistentes a penicilina, incluidos en una
poblacin mixta formada por los grupos A, B y C. Los grupos B y C pertenecen a
flora acompaante.
e.l. Qu medio de cultivo sera ms adecuado para lograr ese propsito?
(marque la/s respuesta/s correcta/s)
- un medio de transporte - un medio enriquecido
-un medio de enriquecimiento - un medio selectivo
-un medio slo diferencial
e.2. Disee un medio de cultivo complejo semislido que incluya una fuente de C,
una fuente de energa, una fuente de N y factores fsicos y/o qumicos que
favorezcan slo el desarrollo del grupo A.