CAPITULO IV

RESPIRACIN AEROBIA

4.1. DEFINICIN Y CARACTERSTICAS DE LA RESPIRACIN AEROBIA

La respiracin aerbica implica reacciones que suministran energa y que dependen del oxigeno. Si el substrato es un azcar simple y se le extrae el mximo de energa, obtenemos el proceso representado en la siguiente reaccin: C6HI1206+ 6 O2 6CO2 + 6H2O Adems, probablemente se formen cerca de 38 molculas de ATP. Todos los tomos de hidrgeno son removidos y reaccionando con el oxigeno forman agua, que es otro producto microbiano. Los tomos de carbono son separados uno del otro y adheridos al oxigeno con el fin de producir dixido de carbono que es otro producto microbiano.(Figura N 4.1). Este es el ejemplo clsico de la respiracin aerbica, dado que se verifica en animales y en una variedad de microorganismos y plantas. En vista de que el oxigeno desempea un papel prominente debido a que reacciona con los tomos de hidrgeno y de carbono se reconoce a esta reaccin como oxidacin. Dentro de la clula, el proceso se lleva a cabo a travs de pequeas secuencias, cada una catalizada por una enzima y con la produccin de ATP (adenosinatrifosfato), en ciertas etapas. De esta manera, la energa qumica disponible se convierte en luz y calor por medio de una combustin que se utiliza en la formacin de ATP en la oxidacin celular. Las clulas no son completamente eficientes en el uso de la energa y producen algo de calor ms el ATP correspondiente. Las bacterias son muy verstiles en cuanto a la gran variedad de compuestos orgnicos que utilizan en la respiracin aerbica. A pesar de que el trmino respiracin siempre se aplic a la respiracin animal y al intercambio de oxigeno y dixido de carbono, ahora tiene un significado ms amplio. La respiracin aerbica incluye todas las reacciones que proveen energa a la clula, siempre y cuando el oxigeno sirva como aceptor del hidrgeno, como en el ejemplo previo. Se dice que el oxigeno es el

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aceptor terminal del hidrgeno, o bien, de los electrones que acompaan a los tomos de hidrgeno. Figura N 4.1. Procesos del Metabolismo Celular

Fuente: (Atlas R.M. y R. Bartha. 2005).

La definicin ms precisa de respiracin aerbica es: la serie de reacciones que suministran energa, en las cuales el oxigeno es el aceptor final de electrones. La respiracin aerbica realizada por las clulas microbianas o por preparaciones de tejidos puede medirse al registrar el grado de consumo de oxigeno. (Figura N 4.2) Figura N 4.2. Respiracin Aerobia

Fuente: (Dreyfus Corts Georges, 1995).

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4.2. ASIMILACIN DEL OXIGENO El concepto de respiracin se deriva del clsico proceso respiratorio de Lavoisier, segn el cual los organismos vivos consumen oxgeno de un modo anlogo a la combustin de la materia orgnica. De hecho, muchos microorganismos llevan a cabo dicho proceso en el cual el oxgeno molecular se convierte en agua en tanto que algn sustrato orgnico desaparece el medio y todosu carbono se recupera como CO2. El desarrollo de muchos microorganismos en cultivo puro en un medio con glucosa se realiza de acuerdo con la estequiometra:

Todo el hidrgeno de la glucosa ha pasado al oxgeno para formar agua. Sin embargo, las bacterias del cido actico pueden reducir el O2 a H2O sin formar CO2. En muchos hongos microscpicos se lleva a cabo una degradacin parcial de la glucosa anloga a la oxidacin del etanol, con la acumulacin de productos orgnicos caractersticos que estn parcialmente oxidados y son diferentes del acetato. Figura N 4.3. Figura N 4.3. Respiracin Aerobia. Metabolismo energtico ms eficiente. Eucariotas, mayora de bacterias y 50 % de archaeas

Fuente: (Koolman, J. y K, H. Rohm. 2004).

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Algunos ejemplos ilustrativos pueden ser los siguientes:

Por lo tanto es consistente considerar que la reduccin del oxgeno en la respiracin puede llevar tanto la mineralizacin como a la degradacin parcial de los sustratos orgnicos.

El oxgeno tambin puede reducirse biolgicamente con reductores inorgnicos como H2, compuestos reducidos de nitrgeno o con compuestos reducidos de azufre o hierro. Esto tiene lugar en el desarrollo de bacterias que pueden crecer en medios minerales utilizando CO2como nica fuente de carbono. De hecho, el mismo proceso respiratorio puede considerarse independiente O2, porque existen microorganismos que pueden utilizar en su lugar NO3-, SO42-, CO2. . De ah que se distinga una respiracin aerobia de otra anaerobia.

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En todo caso, la respiracin est ligada a un proceso generador de energa para el crecimiento. No obstante, la reduccin biolgica del O2 no siempre va unida a la produccin de ATP. La fosforilacin que se lleva a cabo con la reduccin de oxigeno y el sistema de transposicin de protones y la reaccin ATPsica es una caracterstica obligada de algunas bacterias estrictamente aerobias como Azotobacter, Caulobacter y muchas Pseudomonas. Sin embargo, ya hemos visto que este mismo sistema puede funcionar anaerobiamente en la reduccin del CO2 a cido actico o a metano, y tambin tiene lugar en la reduccin de NO-3 y de SO42-. 4.3. PRINCIPALES ENZIMAS QUE PARTICIPAN El mecanismo de la respiracin aerobia consiste de una va de reacciones enzimticas de las cuales los principales productos de la respiracin anaerobia son oxidados para proporcionar energa, agua y bixido de carbono. Aunque el oxgeno es un reactivo solamente en el paso final del proceso aerobio, es una reaccin indispensable y el mecanismo podra cesar si el oxgeno fuera retenido.Cuadro N 4.1 y Figura N 4.4. Cuadro N 4.1. Enzimas participantes de las reacciones de la Respiracin Celular

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Fuente : Murray, R. K. et. al. 2005. Figura N 4.4. Esquema simplificado del Sistema de Ciclo de Krebs

Fuente: (Brook, G. F.; Janet Butel y Sthepan, A. Morse, 2005)

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4.4. CICLO DE LOS CIDOS TRICARBOXILICOS (CAT) 4.4.1.Caractersticas y Rol Bioqumico del CAT El ciclo de Krebs tambin conocido como ciclo del cido ctrico es la va comn final de oxidacin del cido pirvico, cidos grasos y las cadenas de carbono de los aminocidos. Figura N 4.5. El CAT es la va metablica ms importante para la generacin de ATP en las bacterias aerobias. La oxidacin completa de una molcula de acetato a CO2 genera tres molculas de NADH + H+, una molcula de ATP y un par de e-. Estos ltimos entran en las cadenas respiratorias directamente reduciendo el FAD. Los nucletidos de la piridina reducidos se re oxidan tambin a travs de las cadenas respiratorias. En las bacterias anaerobias se encuentra la mayor parte de los enzimas del CAT, pero stos no tienen la capacidad de transformar el cetoglutarato en acido succnico. El ciclo queda interrumpido en este punto y no es funcional como sistema terminal de oxidacin. Las bacterias auttrofas obligadas tampoco tienen un CAT funcional. Carecen de cetoglutarato deshidrogenasa y tienen niveles muy bajos de las deshidrogenasas succnica y mlico. El CAT tampoco es funcional en los metilotrofos obligados que tienen sistemas membranosos transversales al eje mayor como Methylomonas, Methylobacter y Methylococcus. La primera reaccin del ciclo ocurre cuando la coenzima A transfiere su grupo acetilo (de 2 carbonos) al compuesto de 4 carbonos (cido oxalactico) para producir un compuesto de 6 carbonos (cido ctrico). El cido ctrico inicia una serie de pasos durante los cuales la molcula original se reordena y contina oxidndose, en consecuencia se reducen otras molculas: de NAD+ a NADH y de FAD+ a FADH2. Adems ocurren dos carboxilaciones y como resultado de esta serie de reacciones vuelve a obtenerse una molcula inicial de 4 carbonos el cido oxalactico.

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El proceso completo puede describirse como un ciclo de oxalactico a oxalactico, donde dos tomos de carbono se adicionan como acetilo y dos tomos de carbono (pero no los mismos) se pierden como CO2. Figura N 4.5. Etapas Generadoras de Energa del Ciclo de Krebs

Fuente: (Mathews, C. K, K. E. Van Hold y K. G. Ahern, 2002)

Ahora que hemos descrito las caractersticas del sistema de transporte de electrones, podemos considerar su funcin en la oxidacin del cido pirvico, el intermediario clave en la oxidacin de la glucosa. El cido pirvico conserva la mayor parte de la energa presente en la glucosa y la mayora de los organismos aerobios son-capaces de oxidar completamente ese compuesto a CO2 a travs de una serie de pasos denominados ciclo del cido tricarboxlico. El NADH2 formado en el ciclo del cido tricarboxlico es oxidado de nuevo por medio de un sistema de transporte de electrones, con produccin concomitante de ATP por medio de la fosforilacin oxidativa.

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El cido pirvico es primero descarboxilado, determinando la produccin de una molcula de NADH2 y de un radical acetilo acoplado con la coenzima A (CoA). El acetilcoenzima A (abreviado. acetil-CoA) constituye una forma activada del acetato, siendo el enlace del acetil-CoA rico en energa.

Adems de resultar un intermediario fundamental del ciclo del cido tricarboxlico, el acetil-CoA tambin desempea muchas otras funciones importantes en la biosntesis.

El grupo acetilo del acetil-CoA se combina con el compuesto tetracarbonado cido oxalactico, conduciendo a la formacin de cido ctrico, un cido orgnico de seis carbonos, utilizndose la energa del enlace rico en energa del acetil-CoA para llevar a cabo esta sntesis. Despus siguen reacciones de deshidratacin, descarboxilacin y oxidacin, y son liberadas dos molculas de C02. Por ltimo, es regenerado el cido oxalactico, y puede servir de nuevo como un aceptor de actilo, completndose as el ciclo. En la Figura N 4.6. se representa una visin de conjunto de las reacciones del ciclo.

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Figura N 4.6. Esquema detallado del Ciclo de Krebs

Fuente: (Nelson, D.L y M.M. Cox y C.M.,2005)

4.4.2. Sistemas Enzimticos del CAT

En el CAT existen siete sistemas enzimticos. Todos los sistemas enzimticos son reversibles excepto la oxidacin de cetoglutarato, la cual requiere TPP, cido

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lipoico, CoA, FAD y NAD+. Una excepcin la constituye Chlorobium thiosulfatophilum, donde se ha encontrado una reaccin de carboxilacin de succinil CoA

dependiente de la ferredoxina, unida a una 2 oxoglutarato sintasa.

El oxalacetato es el compuesto clave del CAT porque es el aceptor de acetil-CoA. Esta reaccin est catalizada por la citrato sintasa.

Este sistema es inhibido por el -cetoglutarato, por NADH+H+, ATP y el succinil-CoA La segunda etapa est constituida por unas reacciones de hidratacin catalizadas por la enzima aconitatohidratasa.

Se forma una mezcla en equilibrio de cido ctrico, cis-aconitico isoctrico. Se conocen varias aconitasas. Se requiere Fe2+. El tercer sistema es el de la isocitrato deshidrogenada (ICDHasa).

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No se ha demostrado la existencia de una oxalosuccnico descarboxilasa por lo que el mismo enzima debe catalizar las dos reacciones. La cuarta reaccin est constituida por el sistema de la deshidrogenasa: -cetoglutarato

El sistema de la cetoglutarato deshidrogenasas comprende un complejo de enzimas que llevan a cabo una descarboxilacin oxidativa del cetoglutarato semejante a la del piruvato. En esta reaccin se produce la segunda mlecula de CO2. Participan el NAD+, Mg2+, el cido lipoico y el TPP en a y el ADP y Pi en b. Se origina ATP. El FAD interviene para la regeneracin del lipoico:

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El sistema de la cetoglutarato deshidrogenasa juega un importante papel regulador en las bacterias anaerobios facultativos. Es extraordinariamente sensible a la deficiencia de oxgeno y est sujeta a represin por la glucosa. En condiciones anaerobias, el CAT deja de existir como va metablica cclica y la formacin de cetoglutarato tiene un sentido puramente biosintticos; el succinato para las necesidades biosintticas se forma a partir del oxalacetato por lo que se denomina un brazo reductor del CAT.

La quinta etapa es la deshidrogenacin del succinato, catalizada por la succinato deshidrogenasa. (5)

La succinato deshidrogenasa toma los e- y queda en estado reducido. Su reoxidacin requiere FAD. Tambin se requiere Fe2+. Es el nico enzima del CAT que se encuentran en la fraccin particulada. La succinato deshidrogenasa es inhibida por el oxalacetato. Cuadro N 4.2.

La sexta reaccin final del CAT es la deshidrogenacin del malato por la fumarato hidratasa: (6)

La reaccin final del CAT es la deshidrogenacin del malato a oxalacetato, catalizada por la malato deshidrogenas que requiere NAD+:

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(7)

En E. coli, la Malato deshidrogenasa dependiente de NAD+ es soluble, pero en Azotobacter agilis y Micrococcus luteus hay, adems, un sistema particulado. La primera puede estar ausente en Serratia marcescens, Pseudomonas fluorescens y P. ovalis, que tienes el sistema particulado ligado directamente al O2. Este sistema tambin puede hallarse en Lactobacillus. En E. coli se encuentra una malato deshidrogenasa dependiente de NAD+ constitutiva y, adems, otra dependiente de NADP+ inducible. Esta ltima cataliza la reaccin:

Malato deshidrogenasa (descarboxilante (NADP+))

Este enzima es inhibido por el oxalacetato y acetil CoA. Tambin es inhibido por el AMP cclico. Al parecer tiene una funcin biosinttica en relacin con la formacin de cidos grasos. En Micrococcus sp. es la nica deshidrogenasa del malato presente y juega un importante papel en la carboxilacin del cido pirvico a malato. En Chromatium no hay ninguno de los dos sistemas antes sealados de deshidrogenacin del mlico. Sin embrago, el malato se convierte en oxalacetato por una descarboxilacion a piruvato seguida de una recarboxilacin del piruvato a oxalacetato.

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Cuadro N 4.2. Enzimas, Coenzimas, Tipo de reaccin de cada molcula participante del Ciclo de Krebs. Molcula I. Citrato II. cis-Aconitato III. Isocitrato Enzima 1. Aconitasa 2. Aconitasa 3. Isocitrato deshidrogenasa 4. Isocitrato deshidrogenasa 5. -cetoglutarato deshidrogenasa 6. SuccinilCoAsintetasa 7. Succinato deshidrogenasa Tipo de reaccin Deshidratacin Hidratacin Oxidacin H2O NAD+ NADH + H+ Reactivos/ Productos/ Coenzimas Coenzima H2O

IV.Oxalosuccinato

Descarboxilacin Descarboxilacin oxidativa Hidrlisis NAD+ + CoA-SH GDP + Pi FAD H2O NAD+ NADH + H+ NADH + H+ + CO2 GTP + CoA-SH FADH2

V. -cetoglutarato

VI. Succinil-CoA

VII. Succinato VIII. Fumarato IX. L-Malato X. Oxaloacetato

Oxidacin

8. FumaratoHidratasa Adicin (H2O) 9. Malato deshidrogenasa 10. Citrato sintasa Oxidacin Condensacin

Fuente: (Mathews, C.K.; K.E. Van Holde y K.B. Ahern, 2002)

4.5. BALANCE ENERGTICO DE LAS REACCIONES OXIDATIVAS

Contabilidad total de la Produccin Aerbica del ATP Cuando una Molcula de Glucosa o Glucgeno se degrada mediante las Vas aerbicas produce un Total de: 38 Molculas de ATP (Degradacin Aerbica de la Glucosa).

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39 Molculas de ATP (Degradacin Aerbica del Glucgeno): La Produccin GlucolItica Neta del ATP por el Glucgeno es una Molcula de ATP Adicional en Comparacin con la Glucosa.

Observando el balance parcial del ciclo de Krebs, se comprueba que en este proceso no se obtiene energa directamente bajo la forma de ATP (slo se obtiene 1 GTP que es equivalente a 1 ATP). En cambio se obtienen cantidades de coenzimas reducidas (NADH y FADH2), y es a travs de la oxidacin posterior que se obtendr la energa para sintetizar ATP.Cada coenzima NADH equivale a 3 ATP y cada coenzima FADH2 equivale a 2 ATP. Cuadro N 4.3
Cuadro N 4.3 - Balance Parcial de la Respiracin PROCESO SUSTRATO PRODUCTOS 2 cido pirvico 2 ATP 2 NADH 2 Acetil CoA ENTRADA AL CICLO DE KREBS 2 cido pirvico 2 CO2 2 NADH 4 CO2 2 GTP (equivalentes a 2 ATP) 6 NADH 2 FADH2 6 CO2 2 ATP Glucosa 2 GTP 10 NADH 2 FADH2 Fuente: (Koolman, J. y K, H. Rohm, 2004).

GLUCLISIS

Glucosa

CICLO DE KREBS

2 Acetil CoA

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La produccin de ATP en la oxidacin aerobia de glucosa por clulas eucariotas es la siguiente:

Va glucoltica Fosforilacin a nivel de sustrato (ATP) Fosforilacin oxidativa con 2 NADH 2 piruvato a 2 acetil-CoA Fosforilacin oxidativa con 2 NADH Ciclo de los cidos tricarboxlicos Fosforilacin a nivel de sustrato (GTP) Fosforilacin oxidativa con 6 NADH Fosforilacin oxidativa con 2 FADH2 Rendimiento aerbico total 2 ATP 18 ATP 4 ATP 38 ATP 6 ATP 2 ATP4 6 ATP

Rendimiento total de ATP

36 a 38 ATP

En algunas clulas el costo energtico de transportar los electrones desde el NADH formado en la gluclisis a travs de la membrana mitocondrial interna deprime el rendimiento neto de estos 2 NADH a slo 4 ATP.

4.6. LA CADENA RESPIRATORIA

Es Responsable de la Fosforilacin Oxidativa: La Produccin Aerbica dentro de la Mitocondria o mesosoma. Va Metablica Final Comn en las Clulas Aerbicas mediante la cual los Electrones derivados de los diferentes sustratos son transferidos hacia el Oxgeno. Serie de Reacciones de oxidacin-Reduccin realizadas por unas enzimas altamente organizadas. Figura N 4.7.

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Figura N 4.7. Transferencia de Electrones por la Cadena Respiratoria

Fuente: (Frenchel, T.G.M. y T. H. Blackburn, 1998) Luego de la Gliclisis y del ciclo de Krebs, los electrones pasan a la cadena transportadora de electrones, un sistema de transportadores de electrones ubicado en la membrana interna mitocondrial, que actan secuencialmente. 4.6.1. DESCRIPCION DE LA CADENA DE TRANSPORTADORES La cadena de transportadores puede ser descrita como un gran proceso de 3 eventos, que son:

142

1.

Transferencia de los electrones del NADH y FADH2 a otras sustancias, donde finalmente se reoxidan a NAD+ y FAD para seguir participando en mas reacciones redox.

2.

Los electrones transferidos participarn en la oxidacin-reduccin secuencial de +10 centros redox en 4 complejos enzimticos, antes de reducir el O2 a H2O. Durante la transferencia de los electrones, los H+ liberados por las coenzimas, sern expulsados de la matriz mitocondrial al espacio intermembrana, y creando una gradiente entre ambas. Finalmente, la G de sa gradiente electroqumica conducir la sntesis de ATP a partir de ADP y Pi a travs de la fosforilacin oxidativa.

3.

La cadena transportadora consiste de una serie de transportadores que actan secuencialmente y que estn unidos a la membrana interna. Los transportadores son protenas integrales de membrana con grupos prostticos capaces de aceptar y/o donar 1 o 2 electrones. Figura N 4.8. Figura N 4.8. Potencial de Oxido-reduccin de los Transportadores de Electrones.

Fuente: (Moat, A.G.; Foster, J.W. y M.P. Spector, 2002).

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Los transportadores realizan 3 tipos de transferencias en todo ste proceso: 1. 2. 3. Transferencia directa de electrones (asociada a metales) Transferencia de tomo de hidrgeno H+ + eTransferencia de in hidruro H- (H+ + 2e-)

Figura N 4.9. Complejos de la Cadena Respiratoria

Fuente: (Smith, C.A. y Wood, E.J., 1998) En lasFigurasN 4.9 y N 4.10 se muestra que existen 5 tipos demolculas transportadoras de electrones en ste proceso: 1. NAD+ y NADP+ 2. Flavoprotenas 3. Ubiquinona 4. Protenas Ferro-sulfuradas 5. Citocromos

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Figura N 4.10. Energa libre y Potencial de Oxido reduccin de las Coenzimas que participan en la Cadena Respiratoria.

Fuente: (Smith, C.A. y Wood, E.J., 1998) 4.6.2. Cadena Transportadora de Electrones en Bacterias En eucariotas, el NADH es el donador de electrones ms importante. En procariotas, es decir bacterias y arqueas la situacin es algo ms complicada, debido a que hay un gran nmero de donante de electrones y un gran nmero de aceptores. Si generalizamos el transporte en bacterias este podra quedar de la siguiente forma:

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Puede que los electrones pueden entrar a la cadena en tres niveles: un nivel en donde participa una deshidrogenasa, otro en la que acta un reservorio de quinonas, o en un nivel en el que acta un transportador mvil como es el citocromo. Estos niveles corresponden a sucesivos potenciales redox ms positivos o sucesivas bajadas de las diferencias en el potencial relativo en los aceptores de electrones. En otras palabras, corresponden a cambios cada vez menores en la energa libre de Gibbs.

Las bacterias pueden usar mltiples cadenas de transporte de electrones, e incluso simultneamente. Las bacterias pueden usar varios donadores diferentes de electrones. Por ejemplo, Escherichia coli, cuando crece en condiciones aerbicas usando glucosa como fuente de energa, usa dos NADH deshidrogenasas diferentes y dos quinol oxidasas diferentes, un total de cuatro cadenas de transporte que funcionan simultneamente.

Las bacterias tambin generan un gradiente de protones, para ello utilizan al menos tres bombas de protones, al igual que las mitocondrias, aunque se han descrito casos en los que solo existen dos o incluso una. Evidentemente siempre tiene que existir al menos una bomba de protones para poder generar el gradiente electroqumico, que es esencial para la generacin de ATP.

En la respiracin aerobia el aceptor final de los electrones es el oxgeno que se reduce a agua. Pero hay organismos que son capaces de respirar sin oxgeno llevando los electrones hasta otros aceptores con el mismo objetivo final, obtener mucho ATP.

Hay organismos capaces de respirar:

Nitrato, generando nitrgeno (bacterias denitrificantes) Sulfato, generando sulfuro (bacterias sulforeductoras) CO2, generando metano (bacterias metanognicas)

146

Hay algunas cadenas respiratorias bastante bien conocidas, entre las cuales se describen los siguientes ejemplos: A. Mycobacterium phlei

Uno de los sistemas de transporte de electrones mejor estudiados es el de Mycobacterium phlei. El mismo puede representarse como sigue:

La oxidacin del Malato es catalizada por dos sistemas enzimticos distintos, uno en la fraccin soluble y otro en la particulada.

En la primera se ha identificado una malato- vitamina K1 reductasa que es activada por FAD y que cataliza la reduccin de la vitamina K9H de una fraccin particulada.(Figura N4.11).

La irradiacin a 360 nm inhibe la oxidacin del malato y del succinato, pero solo la primera es reversible con adicin de vit. K1. La oxidacin del succinato comprende un compuesto metlico que se inhibe con cianuro. En el esquema se incluyen los enzimas flavinicos (FP) inhibidos por la atebrina y el punto de accin de otros inhibidores.

La NOQNO es la N-oxido-2-n-nonilhidroxiquinoleina.

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Figura N 4.11. Transporte de Electrones de Mycobacterium phlei.

x representa un componente fotolbil a 360 nm. y un componente no hemnico con hierro. indica inhibicin por el correspondiente compuesto o por efecto de la radiacin

Fuente: (Pares, I.F. y A. Jurez, 1997). B. Bacillus

El sistema de transporte de electrones en el gnero Bacillus seria:

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Como en el caso anterior la oxidacin del succinato no incluye vit. K. La menaquinona (K2) ocupa el lugar de la naftoquinona K9.

C. Enterobacteriaceas

No

tienen

citocromo

terminal.

En

condiciones

aerbicas

utilizan

preferentemente ubiquinonas y en anaerobias menaquinonas. Con nitrato utilizan ubiquinona-8, cit b y nitrato reductasa.

A continuacin se representan las cadenas respiratorias con nitrato y oxigeno como aceptores terminales de electrones respectivamente.Figura N 4.12. Figura N 4.12. Cadenas Respiratorias con Nitrato y Oxigeno como Aceptores Terminales de Electrones.

149

Fuente: (Pares, I.F. y A. Juarez, 1997). D. Respiracin del Nitrato en las Bacterias Facultativas

La respiracin del nitrato desempea un papel importante en el metabolismo de las bacterias entricas y es un punto clave para la regulacin de la variedad de los sistemas disponibles de produccin de energa.

Las cadenas respiratorias de las bacterias entricas pueden utilizar una gran variedad de sustratos (Figura N 4.12). Cada una de las distintas deshidrogenadas unidas a la membrana NADH + H+, lactato, succinato, formiato o L-glicero-3-fosfato deshidrogenadas) pueden dar electrones a un pool comn de quinona (ubiquinona-8 en condiciones aerobias y

menaquinona-8 en condiciones anaerobias), la quinona da a su vez electrones a las reductasas terminales y a los complejos citocromo o-citocromo d. hay un gran nmero de posibilidades para una simple cadena constituida por deshidrogenada-quinona-reductasa.

Los complejos citocromo o y citocromo d tiene un mecanismo similar para la transposicin protnica. La ubiquinol oxidasa libera un periplasma 2 H+ + 2 e- en tanto que la insercin de la oxidasa del oxigeno molecular consume 2 H+ + 2 een el citoplasma.

150

Durante el crecimiento del aerobio, el NADH + H+ puede ser reoxidado por la cadena respiratoria, pero en condiciones anaerbicas el NAD+ se regenera de otro modo y tienen lugar a cambios metablicos importantes. Figura N 4.13. Figura N 4.13. Mecanismo del glicolato por Pracoccus denitrificans. (1) Glioxilatoreductasa dependiente de NAD. (2) Glicinoaminotransferasa. (3) Eritro-2-hidroxiaspartato aspartatodeshidratasa. aldolasa. (4) Eritro-3hidroxi-

Fuente: (Pares, I.F. y A. Juarez, 1997).

E. Azotobacter

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Contiene ubiquinona-8 y citocromo a1, a2y citocromo oxidasa. En el bypass sobre UQ-8, tambin citocromo c4, citocromo c5 y citocromo a1. El sistema de transporte de electrones en Azotobacter es:

Los estudios de inhibicin con KCN que afecta principalmente al cit a1, han revelado la existencia de la rama lateral.

F. Bacterias Halofilas

En el esquema siguiente se representa el sistema de transporte de electrones en Halobacterium.

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4.7. FOSFORILACIN OXIDATIVA

La generacin de ATP puede lugar bien por fosforilacin a nivel del sustrato, a travs de un nmero relativamente reducido de reacciones que ya han sido descritas en los captulos referentes a la formacin de productos finales del catabolismo, o bien por fosforilacin oxidativa. Este ultimo sistema realmente el de tipo ms generalizado y es tambin el que est ligado a la cadena respiratoria. El transporte de dos protones y de dos electrones desde el NAD hasta el O2 va unido a la formacin de tres molculas de ATP a partir de ADP, correspondiendo a la reduccin de O2 a H2 O. Tericamente, en la respiracin aerobia la relacin P/O es de 3, aparte de la posible generacin concomitante de ATP por fosforilacin a nivel sustrato.

La fosforilacin oxidativa solo ocurre cuando el transporte de electrones tiene lugar en una estructura inalterada de membrana. La oxidacin de portadores de electrones va acompaada de la transposicin de protones hacia el exterior con la creacin de un gradiente de concentracin que determina la nueva entrada de protones a travs de puntos especficos, con la protena ATPasa dando lugar a la reaccin. ADP + Pi + H+ ATP + H2O

La teora quimiosintetica puede considerarse ampliamente comprobada en la respiracin aerobia y en sistemas anaerobios ligados a citocromos o sin ellos. La actividad ATPasica est circunscrita a puntos especficos de la membrana y, como consecuencia de la actividad metablica, resulta efectivamente un gradiente de pH entre fuera y dentro de la clula.

La relacin entre las concentraciones de ADP y ATP es crtica para la velocidad de respiracin. De hecho, en el efecto Pasteur el factor limitante de la penetracin de glucosa es la disponibilidad de ADP.

153

En bacterias, los valores de la relacin P/O encontrados en preparados libres de clulas enteras es siempre inferior a 3 y, con frecuencia, un poco mayor que 1. Es evidente que en las clulas enteras dichos valores puedan ser superiores. No obstante, es posible que las bacterias tenga lugar una respiracin aerobia con una relacin P/O inferior a la que se consigue en los microorganismos eucariotas gracias al sistema mitocondrial. Las grandes cantidades de NADH que resultan de la actividad del ciclo del ATC pueden utilizarse para biosntesis reductiva, sin embargo el potencial reductivo del NADH mitocondrial es ms frecuentemente utilizado para dar energa para la sntesis de ATP por la va de la fosforilacin oxidativa. La oxidacin del NADH con la fosforilacin del ADP para formar ATP son procesos que se hacen con el apoyo del transporte de electrones de la mitocondria y por la sintasa de ATP, que son complejos proteicos que se encuentran en la membrana mitocondrial interna. La cadena de transporte de electrones est compuesta por una serie de complejos proteicos que catalizan reacciones secuenciales de oxidacin y reduccin; algunas de estas reacciones son termodinmicamente competentes para permitir la produccin de ATP por la va de la ATP sintasa proveyendo que un mecanismo de acoplamiento est disponible, como por ejemplo un intermediario comn. La translocacin de protones y el desarrollo de un gradiente de protones transmembrana proveen el mecanismo de acoplamiento. Figura N 4.14. Figura N 4.14. La translocacin de protones y desarrollo del gradiente de protones transmembrana.

154

Fuente: (Mathews, C.K.; K.E. Van Holde y K.B. Ahern, 2002). Figura N 4.15. Estructura qumica de la coenzima NAD y FAD oxidadas y reducidas.

155

Fuente: Murray, R. K. et. al. 2005).

4.7.1. Proceso Metablico La fosforilacin oxidativa es una ruta metablica que utiliza energa liberada por la oxidacin de nutrientes para producir adenosn trifosfato (ATP). Aunque las diversas formas de vida utilizan una gran variedad de nutrientes, casi todas realizan la fosforilacin oxidativa para producir ATP (Figura N 4.15), la molcula que provee de energa al metabolismo. Esta ruta es tan ubicua, debido a que es una forma altamente eficaz de liberacin de energa, en comparacin con los procesos alternativos de fermentacin, como la gluclisis anaerbica.

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Durante la fosforilacin oxidativa, los electrones son transferidos desde un donante de electrones a un aceptor de electrones, como el oxgeno, a travs de reacciones redox. Estas reacciones liberan energa, la cual es utilizada para producir ATP. En eucariotas, estas reacciones redox son llevadas a cabo en las mitocondrias por una serie de complejos de protenas, mientras que en los procariotas, estas protenas se encuentran ubicadas en la membrana interna de la clula. Estos grupos relacionados de enzimas son llamados cadena de transporte de electrones. En eucariotas, estn involucrados cinco complejos de protenas, mientras que en procariotas se presentan muchas enzimas diferentes, utilizando una variedad de donantes y aceptores de electrones.

Proceso Mediante el Cual se Forma ATP en la Forma de Electrones y luego Transferidos hacia el Oxgeno Mediante una Serie de Transportadores de Electrones.

Proceso Final: El Oxgeno acepta los Electrones que van pasando y se combina con Hidrgeno para formar Agua. La energa liberada por estos electrones desplazndose a travs de la cadena de transporte de electrones es utilizada para transportar protones a travs de la membrana interna mitocondrial, en un proceso llamado quimiosmosis. Esto genera energa potencial bajo la forma de un gradiente de pH y un potencial elctrico a travs de la membrana. El almacenamiento de energa es aprovechado permitiendo que los protones fluyan de regreso a la membrana a favor del gradiente, a travs de la enzimaATP sintasa. La enzima utiliza esta energa para generar ATP desde el adenosn difosfato (ADP), en una reaccin de fosforilacin. Esta reaccin es llevada a cabo por el flujo de protones, que provoca la rotacin de una parte de la enzima.

Aunque la fosforilacin oxidativa es una parte vital del metabolismo, produce especies reactivas del oxgeno tales como superxido y perxido de hidrgeno, lo que lleva a la propagacin de radicales libres, provocando dao celular, contribuyendo a enfermedades y, posiblemente, al envejecimiento. Las enzimas

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que llevan a cabo esta ruta metablica son blanco de muchas drogas y productos txicos que inhiben su actividad. 4.7.2. Estequiometria de la Fosforilacion Oxidativa Por cada par de electrones que se originan en el NADH, se sinterizan 3 equivalentes de ATP, lo que requiere 22.4 kcal de energa. As, con 31,2 Kcal de energa disponible, est claro que el gradiente de protones generado por el transporte de electrones contiene la energa suficiente para la sntesis normal de ATP. Los electrones a partir del succinato tienen aproximadamente 2/3 de la energa de los electrones del NADH: ellos generan PMFs que son aproximadamente 2/3 de la fuerza que se genera con los electrones del NADH y llevan a la sntesis de solamente 2 moles de ATP por mol de succinato oxidado. 4.7.3. Regulacin de la Fosforilacin Oxidativa Debido a que el transporte de electrones esta acoplado a la translocacin de protones, el flujo de electrones a travs del sistema de transporte de electrones se regula por la magnitud de la PMF. Mientras ms alta es la fuerza, ms baja la proporcin de transporte de electrones, y viceversa. Bajo condiciones de reposo, con una carga alta de energa en las clulas, la demanda para sntesis nueva de ATP se limita y, aunque la PMF esta alta, el flujo de electrones hacia la matriz de la mitocondria a travs de la ATP sintasa es mnima. Cuando las demandas de energa se incrementan, como durante la actividad muscular rigurosa, el ADP en el citosol se incrementa y es intercambiado con el ATP de la mitocondria por medio del transportador transmembrana nucletido de adenina, la translocasa ADP/ATP. Las concentraciones altas de ADP hacen que la PMF sea descargada a tiempo de que los protones fluyen a travs de la ATP sintasa, regenerando as la cantidad de ATP. As, mientras la proporcin del transporte de electrones depende de la PMF, la magnitud de la PMF en cualquier momento refleja la carga de energa de la clula. A su vez la carga de energa, o ms

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precisamente la concentracin de ADP, normalmente determina la proporcin del transporte de electrones por principios de accin de masa. La proporcin del transporte de electrones usualmente se mide al determinar la proporcin de consumo de oxigeno y a esto se refiere como la tasa de respiracin celular. La tasa de respiracin se conoce como estado 4 cuando la carga de energa es alta, la concentracin de ADP es baja, y el transporte de electrones est limitado por el ADP. Cuando los niveles de ADP aumentan y el fsforo inorgnico est disponible, el flujo de protones a travs de la ATP sintasa es elevado y se observan proporciones altas en el transporte de electrones; la tasa respiratoria resultante se conoce con el nombre de estado 3. As, bajo condiciones fisiolgicas la actividad respiratoria mitocondrial esta en un ciclo entre los estados 3 y 4. Figura N 4.16. Figura N 4.16. Transporte de electrones en la membrana.

Fuente: (Dreyfus Corts G.1995). 4.7.4. Inhibidores de la Fosforilacin Oxidativa La va del flujo de electrones a travs del ensamblaje para el transporte de los mismos, y las propiedades nicas de la PMF, han sido determinadas por medio de el uso de varios antimetabolitos importantes. Cuadro N 4.3.

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Algunos de estos agentes son inhibidores del transporte de electrones en sitios especficos en el ensamblaje de transporte de electrones, mientras otros estimulan el transporte al descargar el gradiente de protones.Figura N 4.17.

Por ejemplo, la antimicina A es un inhibidor especfico del citocromo b. En presencia de antimicina A, el citocromo b puede ser reducido pero no oxidado. Como es de esperarse, en presencia de la antimicina A el citocromo c permanece oxidado, as como tambin los citocromos posteriores a y a3. Una clase importante de antimetabolitos son los agentes desacopladores ejemplificados por el 2,4-dinitrofenol (DNP). Figura N 4.18.

Los agentes desacoplantes actan como cidos lipoflicos dbiles, que se asocian con protones en el exterior de la mitocondria, que pasan a travs de la membrana unidos a un protn, y que se disocian del protn en el interior de la mitocondria.

Estos agentes causan tasas de respiracin mxima pero el transporte de electrones no genera ATP, debido a que los protones translocados no regresan a la matriz mitocondrial a travs de la ATP sintasa. Cuadro N 4.4.

Cuadro N 4.4. Inhibidores de la Fosforilacin Oxidativa

Nombre

Funcin inhibidor del transporte de e inhibidor del

Sitio de Accin

Rotenona

Complejo I

Amital

Complejo I

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transporte de e inhibidor del transporte de e inhibidor del transporte de e inhibidor del transporte de e inhibidor del transporte de e

Antimicina A

Complejo III

Cianuro

Complejo IV

Monxido de Carbono

Complejo IV

Azida

Complejo IV

Transportador 2,4,-dinitrofenol Agente desacoplante transmembrana de H+ Transportador Pentaclorofenol Agente desacoplante transmembrana de H+ Inhibe la Oligomicina sintasa de ATP Fraccin OSCP de la sintasa de ATP

Fuente: (Audesirk, T. y G. Audesirk. 2003)

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Figura N 4.17. Tipos de inhibidores de la fosforilacin

Fuente: (Pares, I.F. y A. Juarez, 1997).

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Figura N 4.18. Estructuras qumicas de los inhibidores fosforilativos.

Fuente: (Pares, I.F. y A. Juarez, 1997).

4.8. REACCIONES ANAPLEROTICAS Son reacciones que regeneran intermediarios del ciclo de Krebs cuando stos han sido utilizados en reacciones biosintticas, situacin en la cual no hay disponible oxalacetato (sustrato regenerador) indispensable para el inicio del ciclo.Figura N 4.19. Para que el ciclo sea funcional es necesario que haya cierta concentracin de oxalacetato, el cebador del ciclo. La degradacin de algunos aminocidos proporciona metabolitos intermediarios del C.A.T. que pueden alimentar al ciclo.

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Otra reaccin que puede suministrar oxalacetato es la de carboxilacin del piruvato: Piruvato + CO2 + ATP + H2O Oxalacetato + ADP + Pi + 2 H+

A estas reacciones, que procuran intermediarios al C.A.T., se les denomina anaplerticas. Figura N 4.19. Formacin de intermediarios al C.A.T. por las reacciones anaplerticas.

Fuente: (Murray, R. K. et. al. 2005)

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4.8.1. Mecanismos de las Reacciones Anaplerticas

En la oxidacin del piruvato se libera una molcula de CO2 y por lo tanto solo dos tomos de C ingresaran en el CAT. El drenaje de -cetoglutarato, succinato y oxalacetato con fines biosintticos produce una disipacin importante de intermediarios que puede agotar el ciclo. Hay dos sistemas para impedir que esto ocurra: a) Las reacciones anaplerticas, que generan compuestas C4 por fijacin de CO2. Estas reacciones tienen lugar principalmente cuando se utilizan azcares como sustratos. b) El relleno de compuestos C4 a partir del metabolismo de compuestos C2 por la va del glioxilato. En bacterias se han caracterizado cinco enzimas para las reacciones anaplerticas: 1. La llamada reaccin de Wood Werkman, en la cual el cido pirvico es fosforilado a fosfoenol pirvico con ATP y la piruvato fosfotransferasa. La fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (ATP) forma oxalacetato, requirindose ADP para formar ATP.

El acido fosfoenol pirvico es el verdadero aceptor de CO2 y el ADP o el IDP funcionan como aceptores de fosfato.

2. Hay una reaccin muy parecida a la anterior catalizada por una fosfoenol piruvato carboxilasa que requiere bicarbonato y fosfato inorgnico, el cual es convertido en pirofosfato:

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3. Un piruvatocarboxilasa (Cuadro N 4.5)dependiente de la biotina que produce oxalacetato desde el piruvato con ATP:

Hay una enzima diferente en los mamferos que lleva a cabo esta reaccin con acetil CoA y no es dependiente de la biotina.

4. La reaccin de los enzimas mlico (malato deshidrogenasa descarboxilante (NADP+ / NAD+)) que catalizan la carboxilacin reductora del piruvato a malato, utilizando bien NADPH + H+ o bien NADH + H+ :

No hay duda de que no todos estos enzimas se hallan presentes a la vez en el mismo microorganismo.

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Cuadro N 4.5. Caractersticas de las etapas de las reacciones anaplerticas Desde A Reaccin Notas

Esta reaccin es catalizada por piruvato + la piruvatocarboxilasa,

Piruvato

oxalacetato

CO2 + H2O + una enzima activada por Acetil-CoA, indicando una falta de oxalacetato. ATP oxalacetato + ADP + Pi + 2H+ El Piruvato puede tambin ser convertido en L-malato, otro intermediario, mediante una va similar. Esta reaccin es reversible pudiendo formar oxalacetato a partir

Aspartato

oxalacetato

de aspartato en una reaccin detransaminacin, va aspartato transaminasa.

glutamato + NAD+ + cetoglutarato H2O NH4+ + cetoglutarato + NADH + H +. Cuando se oxidan cidos grasos de oxidacinde cidos succinil-CoA grasos cadena impar, se forma una molcula de succinil-CoA por cada cido graso. La enzima final es la metilmalonil-CoAmutasa. Fuente: (Frenchel, T.G.M. y T.H. Blackburn, 1998) Esta reaccin est catalizada por la glutamato deshidrogenasa.

Glutamato

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4.8.2. Enzimas de las Reacciones Anaplerticas

En las reacciones anaplerticas, de hecho, donde intervienen enzimas como la piruvato carboxilasa , la acetil-CoA carboxilasa, la propionil-CoA carboxilasa y la 3-metilcrotonil-CoA carboxilasa. La fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, la malato deshidrogenasa-NADP (enzima mlica), la NADP-isocitrato deshidrogenasa, y catalizan procesos reversibles que, al menos en teora, pueden conducir a la fijacin de CO2.

La acetil-CoA carboxilasa se encuentra en el citosol y cataliza la carboxilacin de acetil-CoA a malonil-CoA y est considerada como el paso limitante en la biosntesis de cidos grados de cadena larga. La propionil-CoA carboxilasa ha sido localizada exclusivamente en mitocondrias. Las deficiencias de biotina causan una marcada reduccin de la actividad de esta enzima que est implicada en el metabolismo del propionato y los aminocidos ramificados.

La piruvato carboxilasa, se encuentra principalmente en mitocondrias y cataliza la formacin de oxalacetato a partir de piruvato. Posiblemente, esta enzima es la principal responsable de la fijacin del CO2, puesto que la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa tiene una funcin descarboxilante y la enzima mlica carece de suficiente actividad para fijar la cantidad observada de CO2. Parece que la incorporacin de CO2 a travs de la piruvato carboxilasa depende de la disponibilidad de piruvato.

La actividad anaplertica de la piruvato carboxilasa provee a-cetoglutarato y glutamina que sirven como precursores para el restablecimiento de la reserva de neurotransmisores. La malato deshidrogenasa-NADP (enzma mlica) se han encontrado en citosol y en mitocondrias y favorece la lipognesis durante el desarrollo.

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La isocitrato deshidrogenasa-NADP se encuentra en citosol y mitocondria de neuronas y favorece, posiblemente, la lipognesis. Esta enzima existe en tejidos de mamferos como dos isoenzimas, una que se encuentra en el citosol y la otra en la mitocondria. La participacin de la forma citoslica de la isocitrato deshidrogenasa-NADP en una lanzadera con el a-cetoglutarato a sido demostrada, aunque su contribucin en proveer grupos acetilo para la sntesis de cidos grasos es relativamente pequea. Las enzimas catalizadoras de las cuatro principales reacciones anaplerticas, esto es la piruvato carboxilasa, la enzima mlica, la isocitrato deshidrogenasa-NADP y la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, podran causar la oxidacin completa de los intermediarios del ciclo de los cidos tricarboxlicos, en el caso de que existiera una escasa produccin de piruvato, o como mecanismo para la oxidacin de aminocidos.

La enzima fosfoenolpiruvatocarboxilasa (PEPC) est ampliamente distribuida en clulas vegetales, bacterias fotosintticas y no fotosintticas, cianobacterias y en algas verdes. Participa en procesos de la ruta fotosinttica en la fijacin del CO2 atmosfrico en plantas C4 y en las plantas con metabolismo cido crasulceo (CAM); tambin es la enzima anaplertica ms importante de todos los tejidos vegetales, que suministra cidos dicarboxlicos al ciclo de los cidos tricarboxlicoscuando son utilizados intermediarios para biosntesis.

En la prctica parece que la piruvato carboxilasa es responsable de la mayor parte de la fijacin de CO2, dado que aproximadamente un 7-10% de todo el piruvato utilizado sirve para sustituir los intermediarios del ciclo de los cidos tricarboxlicos durante el normal funcionamiento de este ciclo.

La enzima mlica y la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa contribuyen de forma poco significativa, ya que sus estados de equilibrio favorecen mucho ms la

descarboxilacin que la carboxilacin. Adems, las reacciones de transaminacin pueden generar intermediarios del ciclo de los cidos tricarboxlicos en condiciones cinticas favorables y, por tanto, servir como funcin anaplertica.Figura N 4.20.

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Figura N 4.20. Enzimas de las reacciones Anaplerticas

Fuente: (Koolman, J. y K, H. Rohm.2004).

4.8.3 Rol bioqumico de las Reacciones Anaplerticas Por lo que podemos concluir que las reacciones anaplerticas permiten: o Reacciones que permiten la entrada de intermediarios de carbono al Ciclo de Krebs.

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Intermediarios que entren al ciclo de esta manera son sintetizados en otras rutas metablicas.

Formacin de intermediarios del Ciclo de Krebs: o o o o Oxaloacetato Malato Alfa-cetoglutarato Formacin por carboxilacin y transaminacin.

Los intermediarios del ciclo son repuestos mediante las reacciones ANAPLEROTICAS (Figura N 4.21). Figura N 4.21. Reacciones Anaplerticas

Fuente: (Ganong, W.F.1996).

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