Experimento Clsico

5.1

SEPARANDO ORGANELOS

n los aos 1950 y 1960, los cientficos utilizaron dos tcnicas para estudiar

organelos celulares: microscopa y fraccionamiento. Christian de Duve estuvo a la cabeza del fraccionamiento celular. En la dcada de 1950, utiliz la centrifugacin para distinguir un nuevo organelo, el lisosoma, a partir de fraccionamientos previos caracterizo: el ncleo, la fraccin mitocondrial y los microsomas. Poco tiempo despus, utiliz la centrifugacin de equilibrio de densidad para descubrir otro organelo.

Antecedentes
Las clulas eucariontes son altamente organizadas y compuestas por estructuras celulares conocidas como organelos que realizan funciones especficas. Aunque la microscopa ha permitido a los bilogos describir la ubicacin y el aspecto de diferentes organelos, es de uso limitado en el descubrimiento de la funcin de los organelos. Para ello, los bilogos celulares se han basado en una tcnica conocida como fraccionamiento celular. Aqu, las clulas se rompen, y los componentes celulares se separan en funcin de su tamao, masa y densidad, utilizando una variedad de tcnicas de centrifugacin. Los cientficos pudieron aislar y analizar los componentes celulares de diferentes densidades, llamadas fracciones. Usando este mtodo, los bilogos haban dividido la clula en cuatro fracciones: fraccin nuclear, fraccin mitocondrial, fraccin microsmica y fraccin soluble. de Duve fue un bioqumico interesado en la localizacin de enzimas metablicas subcelulares. l ya haba completado un gran cuerpo de trabajo sobre el fraccionamiento de las clulas del hgado, en el que haba determinado la localizacin de numerosas enzimas subcelulares. Mediante la localizacin de estas enzimas en fracciones celulares especificas, pudo comenzar a aclarar la funcin del organelo. Ha sealado que su trabajo se bas en dos hiptesis: el "postulado de la homogeneidad bioqumica" y "el postulado de la localizacin." En resumen, estas hiptesis propone que toda la composicin de una poblacin subcelular contendr las mismas enzimas, y que cada enzima se encuentra en un sitio discreto dentro de la clula. Armado con estas hiptesis y la poderosa herramienta de la centrifugacin, de Duve subdivide la fraccin mitocondrial. En primer lugar, identific a la fraccin ligera mitocondrial, que se compone de las enzimas hidrolticas, que ahora se sabe componen el lisosoma. Luego, en una serie de experimentos que se describen aqu, identific otra fraccin subcelular discreta, que l llam perxisoma, dentro de la fraccin mitocondrial.

El Experimento
de Duve estudio la distribucin de enzimas en clulas de hgado de ratas. Altamente activo en energa metablica, el hgado contiene un nmero de enzimas utilizables para estudio. Para buscar la presencia de varias enzimas durante el fraccionamiento, se bas en pruebas conocidas, llamadas ensayos enzimticos, para la actividad enzimtica. Para mantener la mxima actividad de la enzima, tuvo que tomar precauciones, que incluy realizar todos los pasos de fraccionamiento a 0C, porque el calor desnaturaliza las protenas, pudiendo comprometer la actividad enzimatica. de Duve utiliz centrifugacin de velocidad zonal para separar los componentes celulares, por sucesivos pasos de centrifugacin. Removi el hgado de rata y lo tritur separado por homogenizacin. Posteriormente, la preparacin cruda de clulas homogenizadas fue sometida a centrifugacin a velocidad relativa baja. Este paso inicial separa

Concentracin relativa

el ncleo de la clula, que se recoge como sedimento en la parte inferior del tubo, del extracto citoplasmtico que queda en el sobrenadante. A continuacin, de Duve subdividi el extracto citoplasmtico en la fraccin mitocondrial pesada, fraccin mitocondrial liviana y la fraccin microsomal. Logr separar el citoplasma mediante el empleo de sucesivos pasos, aumentando la fuerza de centrifugacin. En cada paso, recolectaba y almacenaba las fracciones para subsecuentes anlisis enzimticos. Cuando el fraccionamiento est completado, de Duve realiz ensayos enzimticos para determinar la distribucin subcelular de cada enzima. A continuacin, traz grficamente la distribucin de la enzima en toda la clula. A sido demostrado previamente, la actividad de la citocromo oxidasa, una enzima importante en el sistema de transferencia de electrones, fue encontrada previamente en la fraccin mitocondrial pesada. Se ha demostrado que la fraccin mitocondrial contiene otra enzima caracterizada previamente, glucosa-6-fosfatasa. La fraccin mitocondrial liviana, que se compone de los lisosomas, muestra la caracterstica actividad de la fosfatasa cida. Inesperadamente, de Duve observ un cuarto patrn cuando ensayaba la actividad de la uricasa. En lugar de seguir el patrn de las enzimas de referencia, la actividad de la uricasa estaba fuertemente concentrada en la fraccin mitocondrial liviana. Esta fuerte concentracin, en contraste a la amplia distribucin, sugiri a de Duve que la uricasa podra estar aislada en otra poblacin subcelular separada de las enzimas lisosomales. Para probar esta teora, de Duve empleo una tcnica conocida como centrifugacin de equilibrio gradientedensidad, que separa macromoleculas en base a la densidad.

La centrifugacin de equilibrio gradiente-densidad puede ser realizada utilizando un nmero de diferentes gradientes, incluyendo sacarosa y glicgeno. Adems, el gradiente puede ser hecho en agua o agua pesada, que contiene el isotopo de hidrogeno deuterio, en lugar de hidrogeno. En su experimento, de Duve separ la fraccin mitocondrial rica del preparado por centrifugacin de velocidad zonal en cada uno de esos diferentes gradientes (ver Figura 5.1). Si la uricasa fuera parte de un compartimiento subcelular separado, esta podr separarse de las enzimas lisosomales en cada gradiente testeado. de Duve realiz los fraccionamientos en estas series de gradientes, luego realiz ensayos enzimticos como anteriormente. En cada caso, encontr uricasa en poblaciones separadas de la enzima lisosomal, fosfatasa acida, y la enzima mitocondrial, citocro5 4 3 2 1 20 5 4 3 2 1 20 5 40 60 80 Uricasa 40 60 80 Citocromo oxidasa

Aumento de la densidad de sacarosa (g/cm3)

Fraccin de organelo 1.09 1.11 1.15 1.19 1.22 1.25 Perxisomas (1.23 g/cm3) Despus de la centrifugacin Lisosomas (1.12 g/cm3) Mitocondria (1.18 g/cm3)

4 3 2 1 20 40 60 80 Fosfatasa cida

Percent height in tube

FIGURA 5.2 Representacin grfica del anlisis de enzimas de productos de un gradiente de sacarosa. La fraccin mitocondrial rica fue separada como se muestra en la Figura 5.1, y, a continuacin se realizaron ensayos enzimticos. La relativa concentracin de enzimas activas es trazado en el eje y; la altura de los tubos es trazada en el eje x. El punto mximo en la actividad de la citocromo oxidasa (arriba) y la fosfatasa acida (parte inferior) se observan en la parte superior del tubo. El pico en la actividad de la uricasa (en medio) migra hacia la parte inferior del tubo. [Adaptado de Beaufay et al., 1964, Biochem J. 92:191.]

Antes de la centrifugacin

FIGURA 5.1 Representacin esquemtica de la separacin

de los lisosomas, mitocondrias y perxisomas por centrifugacin de equilibrio densidad. La fraccin mitocondrial de la centrifugacin de velocidad zonal, fue separada en un gradiente de sacarosa, y los organelos fueron separados en base de su densidad. [De Lodish et al., 3ra edicin, pgina 166.]

mo oxidasa (ver Figura 5.2). Al observar repetidamente actividad uricasa en una distinta fraccin de la actividad enzimtica de lisosomas y mitocondrias, de Duve concluy que la uricasa era parte de un organelo distinto. El experimento tambin mostr that two other enzymes, catalase and D-aminocido oxidasa, segregated into the same fractions as uricase. Because each of these enzymes either produced or used hydrogen peroxide, de Duve propuso que esa fraccin representaba un organelo responsable del metabolismo del perxido y lo llam el perxisoma.

Examinando el inventario de enzimas en una fraccin determinada de la clula le dio pistas sobre su funcin. Su cuidadoso trabajo result en el descubrimiento de dos organelos: el lisosoma y el perxisoma. Su trabajo tambin proporcion importantes pistas sobre la funcin de los organelos. El lisosoma, donde de Duve encontr muchas enzimas potencialmente destructivas, ahora se sabe que es un sitio importante para la degradacin de biomoleculas. El perxisoma ha demostrado ser el lugar de oxidacin de cidos grasos y aminocidos, reacciones que producen una gran cantidad de perxido de hidrgeno. En 1974, de Duve recibe el Premio Nobel de Fisiologa y Medicina en reconocimiento de su labor pionera.

Discusin
El trabajo de de Duve en fraccionamiento celular proporciona una visin en la funcin de estructuras celulares, mientras buscaba la ubicacin de enzimas conocidas.