Introduccin a los Mtodos Cromatogrficos

Tema 10

INTRODUCCION A LOS METODOS CROMATOGRAFICOS

Los mtodos que se utilizan en anlisis qumico presentan una selectividad ms o menos alta, si bien, existen muy pocos que sean verdaderamente especficos. Por ello, en muchas ocasiones, la separacin del analito de las posibles sustancias interferentes suele ser una etapa fundamental en los procedimientos analticos. Sin duda, la Cromatografa es uno de los mtodos de separacin ms poderosos que se hayan descubierto. Fue desarrollada originalmente por el botnico ruso M. S. Tswett como tcnica para la separacin de pigmentos vegetales coloreados, y la I.U.P.A.C.* la define como:
"Un mtodo utilizado inicialmente para la separacin de los componentes de una muestra en la cual los componentes se distribuyen en dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra se mueve. La fase estacionaria puede ser un slido, un lquido sobre un soporte slido, o un gel. La fase estacionaria puede estar contenida en una columna, extendida en forma de capa o dispuesta en forma de pelcula . La fase mvil puede ser gaseosa o lquida".

El trmino "cromatografa" posiblemente derive de las palabras griegas "chroma" (color) y "graphein" (escribir), aludiendo a que los pigmentos vegetales separados se ponen claramente de manifiesto como bandas coloreadas. Sin embargo, el mismo Tswett indica que tambin pueden separarse sustancias incoloras por el mismo procedimiento. Cuando se utiliza una columna rellena de CaCO3 (figura 10.1.a.), en la que se introduce un extracto de hojas verdes en ter de petrleo, y seguidamente se aade disolvente puro (eluyente) es posible la separacin de clorofila, carotenos y xantofilas. En estas separaciones, la fase estacionaria es el relleno (CaCO3), la fase mvil es el ter de petrleo y los componentes a separar, los distintos pigmentos vegetales, los cuales se encuentran sometidos a dos fuerzas contrarias: el disolvente tiende a arrastrarlos hacia la salida y el CaCO3 a retenerlos. Como este ltimo efecto es

* I.U.P.A.C. "Compendium of Analytical Nomenclature". Pergamon Press. Oxford (1977).

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diferente para los distintos pigmentos, stos se mueven a diferente velocidad y emergen de la columna a distintos tiempos (figura 10.1.b.c.d.)
disolvente puro (eluyente) extracto de hojas verdes en ter de petrleo

CaCO 3

eluato

Figura 10.1. Separacin hipottica de tres componentes de una mezcla por cromatografa en columna.

Cuando se mide la concentracin de cada componente a la salida de la columna y se representa en funcin del volumen de fase mvil, o del tiempo transcurrido desde la introduccin de la muestra, se obtiene una grfica como la representada en la figura 10.2., denominada "cromatograma"*.

volumen o tiempo

Figura 10.2. Cromatograma de la mezcla de tres componentes de la figura 10.1.

* Aunque es posible recoger distintas fracciones de fase mvil que sale de la columna y determinar en cada

una de ellas la concentracin de soluto, normalmente el efluente se monitoriza continuamente con un detector que mide alguna propiedad fsica o qumica del soluto o de la fase mvil.

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La cromatografa es una tcnica cuyo campo de aplicacin se extiende a todas las reas de la Qumica y de la Bioqumica. Asimismo, es importante en Biologa, Control de Calidad, Investigacin, Anlisis, separaciones a escala preparativa y medidas fisicoqumicas. Asimismo, puede aplicarse con el mismo xito tanto a escala micro como macro, siendo posible su utilizacin industrial para la separacin de los componentes en los ms diversos materiales: azcares, tierras raras, productos farmacuticos, etc.

CLASIFICACION DE LOS METODOS CROMATOGRAFICOS

Los mtodos cromatogrficos pueden clasificarse atendiendo a distintos factores: estado fsico de las fases mvil y estacionaria (gas-lquido, lquido-lquido, etc), soporte utilizado (columna, papel, etc), mecanismo de la separacin (adsorcin, reparto), e incluso el tipo de soluto (cromatografa inica, cromatografa de protenas, etc). En el cuadro de la figura 10.3. se muestra una clasificacin en funcin de algunos parmetros mencionados anteriormente.

1. 2. 3. 4.

Cuando se utiliza como fase mvil un fluido a presin y temperatura superiores a la crtica se tiene un tipo de cromatografa denominada de fluido supercrtico. Adems de los mecanismos mencionados existen otros tales como: fase enlazada, interaccin inica, afinidad, quelacin. El mecanismo es de adsorcin cuando la fase mvil en un lquido polar. El mecanismo puede ser de reparto cuando la fase mvil es un lquido no polar

Figura 10.3. Clasificacin de los mtodos cromatogrficos

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Segn la naturaleza de la fase mvil, los mtodos cromatogrficos se clasifican en dos grupos: cromatografa lquida y cromatografa de gases (adems de la mencionada en el pie de la figura 10.3. de fluidos supercrticos), segn que la fase mvil sea un lquido o un gas respectivamente. En cromatografa lquida, cuando la fase estacionaria es polar y la fase mvil nopolar, se denominan sistemas normales, o de fase normal. En estos sistemas, la retencin del soluto se incrementa generalmente con su polaridad. Por otra parte, si la fase estacionaria es menos polar que la fase mvil, el sistema se designa como de fase inversa, y en stos, las especies polares tienen poca afinidad por la fase estacionaria, siendo eluidos ms fcilmente. En cuanto al soporte, o la tcnica utilizada para desarrollar el cromatograma, pueden distinguirse dos categoras: plana y en columna. En cromatografa plana, la fase estacionaria puede estar constituida por una hoja de papel (cromatografa en papel) o por una capa de un slido distribuido uniformemente sobre una lmina de vidrio, plstico o aluminio (cromatografa de capa fina). Por otra parte, la fase estacionaria puede estar contenida en una columna, en cuyo caso la tcnica se denomina cromatografa en columna. Cuando la fase estacionaria es un lquido, ste debe inmovilizarse sobre un soporte slido inerte, o sobre la propia columna. Evidentemente, la cromatografa plana est limitada al uso de fase mvil lquida, debido a las dificultades inherentes para confinar un gas o un fluido supercrtico en una superficie plana. Sin embargo, la cromatografa en columna puede utilizarse en las modalidades de lquidos, gases y fluidos supercrticos. En el caso de la cromatografa lquida en columna existen dos modalidades, que pueden denominarse en funcin de su desarrollo cronolgico como cromatografa clsica en columna y cromatografa de alta resolucin (CLAR o HPLC)*

Columnas cromatogrficas
Las columnas convencionales usadas en cromatografa lquida y de gases tienen dimetros relativamente grandes: 2-4 mm en CG y 4-6 mm en HPLC. Estas columnas contienen la fase estacionaria empacada, consistente en un slido o un lquido voltil recubriendo a un soporte slido inerte. Desde 1957 se han venido desarrollando distintos tipos de columnas capilares (tambin denominadas columnas tubulares abiertas) utilizadas inicialmente en CG y
* Las siglas HPLC corresponden a las iniciales de la denominacin en ingls High Performance Liquid

Chromatography.

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extendindose posteriormente a CL e incluso a cromatografa de fluidos supercrticos. Estas columnas son mucho ms estrechas y mucho ms largas que las columnas empacadas. En ellas, la fase estacionaria slida est constituida por una capa porosa (figura 10.4.a) y la fase estacionaria lquida puede estar recubriendo directamente la pared interna de la columna (figura 10.4.b.), o sobre un soporte slido (figura 10.4.c.).
fase estacionaria slida fase estacionaria lquida soporte slido recubierto con fase estacionaria lquida

pared de la columna

Figura 10.4. Columnas tubulares abiertas. a) de capa porosa. b) con pared recubierta. c) con soporte recubierto.

Las columnas tubulares abiertas proporcionan mayor resolucin, requieren menor tiempo para el anlisis y presentan mayor sensibilidad que las columnas empacadas, si bien, se maneja una cantidad de muestra considerablemente menor y no son tiles para separaciones preparativas en las que se trate de aislar cantidades relativamente grandes de compuesto.

Mecanismo de las separaciones cromatogrficas

La naturaleza de las interacciones entre los distintos componentes de la muestra y las dos fases, mvil y estacionaria, permite clasificar los sistemas cromatogrficos desde este punto de vista, si bien, puede considerarse que la fase estacionaria es la que gobierna el modo de separacin. Las fuerzas implicadas en estas interacciones suelen ser dbiles, tales como fuerzas de Van der Waals o enlaces de hidrgeno. La cromatografa de adsorcin se tiene cuando la fase estacionaria es un slido adsorbente de gran rea superficial (gel de slice, almina, etc.). Los centros activos situados sobre la superficie del slido (por ejemplo, los grupos silanol de la gel de slice) interaccionan con los grupos funcionales polares de los compuestos a separar (figura 10.5.a.). La separacin se produce como consecuencia de la distinta intensidad de las mencionadas interacciones para unos y otros compuestos.

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Las primitivas separaciones de Tswett corresponden a un mecanismo de adsorcin. Actualmente an se utiliza la adsorcin en algunas separaciones por cromatografa lquida en columna, si bien, su principal campo de aplicacin corresponde a la cromatografa de capa fina. Por otra parte, las aplicaciones de la adsorcin en cromatografa de gases se limitan fundamentalmente a separaciones donde los analitos son gases permanentes. Una caracterstica importante del adsorbente es el tamao de partcula. En principio, la retencin es proporcional al rea superficial, la cual, a su vez, depende del tamao de partcula y de la estructura interna de las partculas de adsorbente. Cuanto menor sea el tamao de partcula, mayor ser el rea superficial del adsorbente y, en consecuencia, mayor el nmero de centros activos disponibles para la adsorcin. La cromatografa de reparto tiene lugar cuando se utiliza un lquido como fase estacionaria. Para inmovilizar este lquido se utiliza un soporte slido (gel de slice, celulosa, tierra de diatomeas, poli-estireno, etc.) de gran rea superficial. En cromatografa lquido-lquido, para evitar que se mezclen las fases se utiliza como fases mvil y estacionaria dos lquidos de polaridades muy diferentes. Si el lquido estacionario es polar (por ejemplo, etilen-glicol), la fase mvil ser no polar (por ejemplo, hexano). En este caso, los solutos polares son retenidos ms fuertemente que los no polares. La forma citada es la de operacin normal, si bien tambin puede operarse con una fase estacionaria no polar (por ejemplo, decano) y con una fase mvil polar (por ejemplo, agua). Esta forma de proceder se denomina de fase inversa. En cualquier caso, la separacin se produce porque las molculas de soluto se distribuyen entre las dos fases segn su solubilidad relativa en cada una de ellas* (figura 10.5.b.). En la cromatografa de intercambio inico, la fase estacionaria es una matriz rgida, en cuya superficie existen grupos funcionales cargados positiva o negativamente (A) y contra-iones de carga opuesta (M), susceptibles de intercambiarse con iones de la misma carga contenidos en la fase mvil (figura 10.5.c.) Intercambio catinico: Matriz-A M+ + X+ > Matriz-AX+ + M+
* Frecuentemente, en cromatografa lquido-lquido, la fase estacionaria est unida quimicamente al soporte

slido, en lugar de estar simplemente depositado sobre el. En este caso, se tiene la denominada cromatografa de fase enlazada (bonded-phase chromatography, BPC). El mecanismo de las separaciones por esta tcnica es complejo, si bien, parece que implica una combinacin de adsorcin y reparto, dependiendo de las condiciones experimentales. En HPLC, la utilizacin de la BPC est muy generalizada.

Introduccin a los Mtodos Cromatogrficos Intercambio aninico: Matriz-A+M + Y > Matriz-A+Y +M

La fase mvil suele ser una solucin acuosa tamponada y la separacin se produce por la competencia que se establece entre los iones de la fase mvil y los iones del analito por los centros activos de la resina. Este tipo de cromatografa se utiliza ampliamente en qumica inorgnica para la separacin de iones metlicos, as como en sistemas biolgicos para la separacin de compuestos inicos solubles en agua.
interfase fase mvil

fase estacionaria slida

fase mvil

fase estacionaria lquida

soluto

.
centros activos

a) adsorcin

b) reparto

fase mvil

grupo funcional

fase estacionaria slida

fase mvil

fase estacionaria slida

+
contrain

c) intercambio inico

d) exclusin

Figura 10.5. Representacin esquemtica de algunos mecanismos de separaciones cromatogrficas.

La cromatografa de exclusin tambin se denomina cromatografa de filtracin en gel o cromatografa de permeacin en gel. En ella, la fase estacionaria consiste en un slido inerte que contiene pequeos poros en los que pueden penetrar las molculas

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de tamao reducido, pero no las grandes (figura 10.5.d.). El grado de retencin depende del tamao de las molculas (solvatadas) y del tamao de los poros. Las molculas pequeas pueden penetrar en los poros pequeos, mientras que las de tamao intermedio pueden penetrar solo en algunos poros, siendo excluidas de los otros, y las molculas grandes son excluidas completamente, Estas ltimas se desplazan con la fase estacionaria y son eluidas en primer lugar. Este tipo de cromatografa resulta especialmente adecuada para la separacin de especies orgnicas de peso molecular elevado de otras molculas pequeas*.

FUNDAMENTOS TEORICOS
Se presentan seguidamente los conceptos en los que se basan las separaciones cromatogrficas y aquellos parmetros que son de utilidad para comprender y mejorar la calidad de los cromatogramas.

CONSTANTE DE DISTRIBUCION Y SEPARACIONES

Los componentes a separar, en su desplazamiento a lo largo del sistema cromatogrfico se mueven a diferentes velocidades, dependiendo de la afinidad de cada uno por la fase estacionaria, respecto a la fase mvil. Cada uno de ellos se distribuye entre las dos fases segn un equilibrio caracterizado por una constante denominada constante de distribucin o coeficiente de distribucin. Para el componente A, Amvil <> Aestacionaria KA=
AS AM

donde [AS] es la concentracin de A en la fase estacionaria, y [AM] la concentracin de A en la fase mvil. Este modelo es anlogo al utilizado en sistemas de extraccin simple, si bien, la cromatografa es un sistema dinmico en el que los procesos de
* En el extremo opuesto a la cromatografa de exclusin puede situarse la denominada cromatografa de

afinidad. En sta, la fase estacionaria consiste en una especie bioactiva unida a un soporte slido. La separacin se produce en funcin de la afinidad qumica entre los diferentes solutos y el lquido bioactivo. Se utilizan interacciones altamente especficas, tales como las existentes entre un antgeno y un anticuerpo. El compuesto activo es retenido por la fase estacionaria, siendo eluidos los dems. Posteriormente, un cambio en el pH o en la composicin de la fase mvil origina la liberacin de la especie retenida, haciendo posible su elucin.

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separacin tienen lugar continuamente, con solutos movindose sobre la fase estacionaria y tratando de alcanzar el equilibrio definido por K. En cualquier caso, cuanto mayor sea el valor de K, mayor ser la afinidad del componente en cuestin para la fase estacionaria y menor ser la velocidad a la que se mueve a travs del sistema. Para una muestra que contenga los componentes A, B y C, y que se introduzca como una banda estrecha sobre una fase estacionaria, si KA > KB > KC el componente A se desplazar a lo largo del sistema ms lentamente que el B, y ste ms despacio que el C. En cromatografa plana, los componentes A, B y C se ponen de manifiesto por la presencia de manchas, mientras que en cromatografa de gases o en HPLC, donde normalmente se utilizan mtodos instrumentales como detectores a la salida de la columna en los que se monitoriza continuamente la composicin de la fase mvil, la seal obtenida es proporcional a la cantidad de soluto presente en el eluyente, con lo que se obtienen picos ms o menos Gaussianos, como los representados en la figura 10.7.(Los picos se ensanchan por una serie de causas que se considerarn posteriormente).

A BC

A B C

. A+B+C

COLUMNA

DETECTOR

Figura 10.7. Separacin cromatogrfica de una mezcla de tres compuestos.

RETENCION Y DISTRIBUCION
El cromatograma simplificado representado en la figura 10.8 corresponde a una muestra que contiene un solo analito (A). El pico pequeo (B), corresponde a una especie no retenida por la columna y que a menudo est contenida en la muestra, pero que puede aadirse para facilitar la identificacin de los picos*. En la misma figura se muestran algunos datos y smbolos caractersticos.

* En cromatografa de gases con detector de conductividad trmica suele inyectarse, junto con la muestra,

unos micro-litros de aire,.

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tM: tiempo muerto (tiempo requerido para que una especie no retenida alcance el detector) VM: volumen muerto (volumen de fase mvil que se requiere para eluir una especie no

retenida)

tR: tiempo de retencin (tiempo transcurrido desde la introduccin de la muestra hasta que el componente alcanza el detector) VR: volumen de retencin (volumen de fase mvil que se requiere para eluir un soluto de la columna cromatogrfica) h: altura de pico; w: anchura de pico; w1/2: anchura de pico a la semialtura w0,1: anchura de pico a un dcimo de la altura.

Figura 10.8. Cromatograma: parmetros caractersticos.

Anteriormente se ha indicado que la mayor o menor retencin de los componentes de una muestra por la fase estacionaria depende de las correspondientes afinidades. Estas, a su vez, dependen de diversos factores, entre los que cabe mencionar:
* Interacciones electrostticas entre especies de carga opuesta, como las que tienen lugar en separaciones por cromatografa inica. * Interacciones por fuerzas de van der Waals del tipo dipolo-dipolo (orientacin) o del tipo dipolo-dipolo inducido (induccin) * Interacciones por fuerzas de dispersin entre molculas neutras o grupos funcionales. * Formacin de enlaces de hidrgeno.

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El tiempo de retencin puede considerarse que est constituido por dos componentes. Uno de ellos es el ya mencionado tiempo muerto, que es el mismo para todos los analitos en un sistema cromatogrfico determinado, y el otro es el denominado tiempo de retencin ajustado, t'R, que es el tiempo que realmente se invierte en la retencin de un soluto por la fase estacionaria, y que se define como t'R = tR tM Las caractersticas de retencin de los componentes suelen describirse en la prctica por el factor de retencin o factor de capacidad, k', definido como,

k =

'

masa de soluto S masa de soluto M

mS mM

y relacionado con el coeficiente de distribucin y los volmenes de fase mvil y fase estacionaria por: mS VM m S VM AS ' VM =k . = = K= VS m M VS AM m M VM

donde VM y VS son los volmenes de fase mvil y estacionaria respectivamente. La relacin VM/VS se denomina relacin de fases, , y es uno de los parmetros que se utilizan para caracterizar una columna cromatogrfica, particularmente en cromatografa de gases. La medida directa de mS y mM suele ser difcil, por lo que la determinacin del factor de retencin generalmente se lleva a cabo a partir de los tiempos de retencin, parmetros fcilmente medibles en el cromatograma. Para ello, el factor de retencin puede considerarse que es,

k =
o lo que es lo mismo*,

'

tiempo de permanencia del soluto en la fase estacionaria tiempo de permanencia del soluto en la fase mvil
tR tM tM

k =

'

Como el volumen es proporcional al tiempo (VR = tR F, siendo F la velocidad de flujo de fase mvil a travs de la columna y VM = tM F), cualquier relacin que se
permanezca en la fase estacionaria y en la fase mvil y esta relacin de probabilidad es tambien igual a la relacin entre el tiempo que en promedio una molcula de soluto permanece en la fase estacionaria y en la fase mvil.
* La ecuacin k' = m /m representa la relacin entre la probabilidad de que una molcula de soluto s M

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exprese como un cociente de tiempos puede escribirse como el cociente de los volmenes correspondientes. Por ello, k =
'

t R t M VR VM = tM VM

El factor de capacidad es un parmetro importante porque es independiente de la velocidad de flujo de la fase mvil y de las dimensiones de la columna, y puede usarse para comparar retenciones en instrumentos diferentes. Los factores de retencin grandes favorecen una buena separacin, pero tambin incrementan el tiempo de elucin y el ancho de banda. Idealmente, las separaciones se realizan en unas condiciones en las que los factores de capacidad para las especies de una mezcla oscilan entre 1 y 5. El volumen de retencin es un parmetro de utilidad en muchas ocasiones. De la expresin anterior se deduce que, VR = VM (1 + k') y sustituyendo k' por K VS/VM, se tiene, VR = VM (1 + K VS/VM) VR = VM + K VS

que es una ecuacin importante en cromatografa, si bien, en cromatografa de adsorcin debe modificarse de la forma siguiente: VR = VM + kA As donde kA es el coeficiente de adsorcin y As el rea superficial del adsorbente. La capacidad de una determinada fase estacionaria para separar dos componentes A y B se expresa mediante el factor de separacin o factor de selectividad, , definido por:
= kB kA
' '

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y, por otra parte, puede determinarse fcilmente de forma directa midiendo los tiempos de retencin de las especies A y B sobre un cromatograma experimental, ya que,

tR B tM tR A tM

EFICACIA DE LAS COLUMNAS CROMATOGRAFICAS

La observacin de los picos cromatogrficos muestra una gran semejanza con las curvas de error normal o Gaussianas, lo cual puede explicarse de la forma siguiente: durante el desplazamiento por el interior de una columna cromatogrfica, una partcula individual de analito experimenta miles de transferencias entre las fases mvil y estacionaria. El tiempo de residencia en una fase dada es muy irregular, pudiendo ser muy pequeo en algunas etapas, y relativamente grande en otras. Por ello, el tiempo de permanencia de la partcula en el interior de la columna tambin ser irregular, ya que solamente se eluye cuando reside en la fase mvil; algunas partculas se desplazarn rpidamente, debido a que permanecen ms tiempo en la fase mvil, mientras que otras lo harn con mayor lentitud, como consecuencia de su mayor permanencia accidental en la fase estacionaria. Debido a que los procesos individuales mencionados transcurren de forma aleatoria, se obtiene una dispersin de los tiempos de residencia en la columna (o de las velocidades) alrededor de un valor medio, originndose un pico Gaussiano como el representado en la figura 10.9., y en el que casi un 96 % del rea se encuentra dentro del intervalo comprendido entre ms y menos dos veces la desviacin estndar alrededor del mximo.

Respuesta del detector

w 1/2 =2.35
1/2

h w=4
Volumen

Figura 10.9. Pico cromatogrfico ideal.

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Por otra parte, la anchura de los picos est directamente relacionada con el tiempo de residencia en la columna (inversamente proporcional a la velocidad de flujo de la fase mvil), ya que a mayor tiempo, mayor dispersin, de forma que las especies eluidas al final presentan picos ms anchos que las eluidas al comienzo, como se muestra en la figura 10.2. El ensanchamiento de los picos de los distintos componentes del analito acta en detrimento de la separacin, de forma que el objetivo en cromatografa es la obtencin de picos estrechos y simtricos. El trmino "eficacia" de una columna, o mejor, de un sistema cromatogrfico, se utiliza para describir el ensanchamiento de las bandas de los solutos en su movimiento a travs de la columna, papel o placa. Los tratamientos que normalmente se utilizan estn relacionados con cromatografa en columna, si bien, pueden extenderse fcilmente a la cromatografa plana. El tema de la eficacia de un sistema cromatogrfico se aborda desde dos puntos de vista: la teora de platos y la teora cintica, que se consideran brevemente a continuacin.

Teora de los platos en Cromatografa

Se basa en considerar que la columna cromatogrfica es como si estuviera constituida por numerosas, pero discretas capas estrechas, denominadas platos tericos, en trminos anlogos a lo que ocurre en la teora de la destilacin fraccionada o de la extraccin en contracorriente. Se considera que en cada plato se establece un equilibrio del componente entre la fase mvil y la fase estacionaria, y el desplazamiento del analito a travs de la columna se trata como una transferencia de la fase mvil desde un plato al siguiente. La eficacia de la columna aumenta al hacerlo el nmero de estas transferencias, esto es, al aumentar el nmero de platos tericos. El nmero de platos tericos, N, se define como

N=

tR

donde tR es el tiempo de retencin del analito y la desviacin estndar del pico Gaussiano. Como, w = 4 (figura 10.9.),
t N = 16 R w
2

Introduccin a los Mtodos Cromatogrficos expresin que permite obtener N midiendo directamente en el cromatograma.

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En la prctica, es ms frecuente medir la anchura de pico a la semi-altura, w1/2, en cuyo caso,

N =

tR

= 5.54

tR w
1 /2

1 /2

2.35

(En esta ecuacin, como en la anterior, pueden utilizarse volmenes de retencin, en lugar de tiempos, en cuyo caso, el ancho se medir tambin en unidades de volumen). Es evidente que el nmero de platos tericos ser directamente proporcional a la longitud de la columna, de forma que si esta se representa por L, la denominada altura equivalente a un plato terico, (AEPT* H) ser:

H=

L N

Es necesario indicar que las columnas se comportan a menudo como si tuvieran distintos nmeros de platos para distintos solutos en una mezcla. Los picos simtricos (Gaussianos) se originan cuando el coeficiente de distribucin, K, (K=CS/CM), es constante e independiente de la cantidad de soluto. En realidad, casi siempre se obtienen picos asimtricos, ya que la relacin CS/CM suele variar con la cantidad de soluto, obtenindose isotermas (representacin grfica de CS frente a CM) no lineales. En la figura 10.10. se muestran tres isotermas y las formas de los picos correspondientes.
CS
.

CS

CS

CM

CM

CM

Respuesta

Respuesta

Respuesta

10 % h

Figura 10.10. Isotermas y forma de los picos cromatogrficos.

* En literatura inglesa, HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate).

Claudio Gonzlez Prez

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La isoterma representada en la figura 10.10.b. suele presentarse en sistemas de adsorcin con centros activos donde la fase estacionaria retiene fuertemente al soluto. Cuando estos centros se saturan, K disminuye, al no existir sitios de retencin fuerte disponibles, lo que se traduce en la presencia de una cola ms o menos pronunciada. El comportamiento representado en la figura 10.10.c. suele observarse en sistemas de reparto en los que las interacciones soluto-fase estacionaria son relativamente dbiles comparadas con las interacciones soluto-soluto, o cuando se aade una cantidad de analito excesivamente grande (sobrecarga). En este caso, la fase estacionaria sobrecargada tiende a comportarse como una fase lquida constituida por el mismo soluto y, como "lo semejante disuelve a lo semejante", el valor de K aumenta con la concentracin y el pico presenta un frente difuso y una cola muy poco pronunciada. El clculo del nmero de platos cuando los picos son asimtricos es ms complicado que cuando son simtricos. Para ello se han propuesto diversos mtodos, siendo uno de los ms empleados el que hace uso de la relacin

41.7 t R w 0,1 N= a + 1.25 b

donde w0,1 es la anchura de pico a un dcimo de la altura, y a/b (ver figura 10.10.) el denominado factor de asimetra. La teora de platos explica satisfactoriamente la forma de los picos cromatogrficos, si bien, falla al intentar justificar el ensanchamiento de los mismos. Por otra parte, se basa en unas supuestas condiciones de equilibrio que, en realidad no se alcanzan, debido al movimiento continuo de la fase mvil.

Teora cintica
La teora cintica considera que el ensanchamiento de las bandas (o picos) cromatogrficos se produce como consecuencia de que los distintos procesos de transferencia de masa durante el desplazamiento de una especie a lo largo de la columna ocurren a velocidad finita. Segn esta teora, la forma de los picos depende de los siguientes factores: * Difusin por turbulencia y trayectorias seguidas por la fase mvil. * Difusin longitudinal del soluto a lo largo de la columna.

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* Equilibrio del soluto entre las fases mvil y estacionaria no suficientemente rpido. Los tres factores mencionados normalmente se identifican con los parmetros A, B y C y su contribucin al ensanchamiento de las bandas cromatogrficas conducen a la ecuacin de van Deemter:

H=A+

B +Cu u

donde u es la velocidad lineal media de la fase mvil (u=L/tM; L=longitud de la columna; tM=tiempo muerto). Este modelo es el clsico, y puede considerarse anticuado, si bien, se expondr aqu por su sencillez y valor didctico. Por otra parte, la teora se desarroll inicialmente para cromatografa de gases con columnas empacadas, pero puede extenderse sin demasiadas dificultades a otros tipos de cromatografa, incluyendo columnas tubulares abiertas e incluso a cromatografa plana.

Trmino A (difusin por turbulencia)

Este primer factor surge de la multitud de trayectorias de distintas longitudes que toma la fase mvil que fluye a travs de la columna, que est empacada con partculas de diferentes tamaos y formas acomodadas de manera irregular. Segn se observa en la figura 10.11., donde se representan las trayectorias seguidas por dos molculas durante la elucin, la distancia recorrida entre las lneas a y b por la molcula 1 es mayor que la recorrida por la molcula 2, por lo que sta llegar antes a la lnea b.
1

fase mvil

a Figura 10.11. Trayectorias de la fase mvil.

El trmino A es independiente de la velocidad de la fase mvil, pero es funcin del tamao de las partculas de la fase estacionaria, de forma que

Claudio Gonzlez Prez A = dp

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donde es una constante que depende de las dimensiones, geometra y uniformidad del empaquetamiento de la columna, y dp es el dimetro medio de las partculas de la fase estacionaria. Segn la expresin anterior, partculas pequeas y uniformemente empaquetadas conducirn a columnas ms eficaces, si bien, ello implicar el empleo de presiones altas. Por otra parte, el trmino A es cero para columnas tubulares abiertas, debido a que la fase estacionaria en tales columnas se deposita directamente sobre la pared de la columna.

Trmino B (difusin longitudinal)

El segundo factor que contribuye al ensanchamiento de las bandas es la difusin longitudinal del soluto en la fase mvil. Se produce debido a que la concentracin de soluto es menor en los bordes de la banda que en el centro, por lo que una banda de soluto que se mueva a lo largo de la columna (de a hasta b en la figura 10.12.) se ensanchar cuando las molculas se difundan hacia las zonas de menos concentracin, hacia adelante y hacia atrs de la banda.

perfil de concentraciones

fase mvil

Figura 10.12. Ensanchamiento de banda debido a la difusin longitudinal.

La difusin longitudinal se dificulta por las partculas contenidas en la columna y el coeficiente de difusin en la fase mvil, DM, de forma que, B = 2 DM donde es un factor de impedimento que depende de las caractersticas del relleno de la columna ( suele ser 0.7 para columnas con relleno y 1.0 para columnas tubulares abiertas) La contribucin cromatografa lquida, lquidos. Sin embargo, mayores que en fase del trmino B al valor de H suele ser despreciable en por los bajos valores de los coeficientes de difusin de los los coeficientes de difusin de los gases suelen ser 105 veces lquida. Por otra parte, como la difusin consume un cierto

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tiempo, el trmino de difusin en la ecuacin de van Deemter depende de la velocidad de la fase mvil, disminuyendo a medida que aumenta sta.

Trmino C (resistencia a la transferencia de masa)

El trmino C est relacionado con el hecho de que el equilibrio para la distribucin del soluto entre las fases mvil y estacionaria se establece tan lentamente que una columna cromatogrfica siempre opera en condiciones lejos del equilibrio. En realidad, el trmino C puede descomponerse en dos, CS y CM, segn se considere la transferencia de masa en la fase estacionaria y en la fase mvil. La resistencia a la transferencia de masa en la fase estacionaria es despreciable para fases slidas, ya que la transferencia del analito sobre la superficie de un adsorbente es muy rpida. Sin embargo, para fases estacionarias lquidas, el trmino depende del espesor de la pelcula (df) y del coeficiente de difusin del analito (DS)
df CS = DS
2

En la prctica, las fases estacionarias lquidas poco viscosas presentan un espesor de pelcula favorable. El trmino CM describe la resistencia a la transferencia de masa en la fase mvil. En la figura 10.13. se representa el ensanchamiento de banda originado por el hecho de que el equilibrio no se produce instantneamente.
Fase mvil

Equilibrio
Fase estacionaria

Fase mvil

No equilibrio
Fase estacionaria

Figura 10.13. Ensanchamiento de banda originado por el no equilibrio en la transferencia de masa. Perfiles de concentracin en las fases mvil y estacionaria.

Si la fase mvil se mueve rpidamente, y el soluto no puede "salir" con rapidez de la fase estacionaria, entonces la zona del soluto en la fase mvil se adelanta respecto a la fase estacionaria.

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En cromatografa de gases, los efectos de la fase mvil, CM, son mucho menores que los correspondientes de la fase estacionaria, CS, mientras que en HPLC, CM y CS tienen valores comparables. En la figura 10.14. se representa la variacin de los tres trminos de la ecuacin de van Deemter en funcin de la velocidad de la fase mvil. Ntese que la contribucin del trmino A es independiente de la velocidad, mientras que B/u aumenta cuando la velocidad disminuye y que Cu predomina a velocidades elevadas.

H B +Cu u Cu A

A+

B/u u
Figura 10.14. Representacin esquemtica de la ecuacin de van Deemter.

Las curvas de la ecuacin de van Deemter son similares para CG y para CL, presentando, en todos los casos un valor mnimo de H para una determinada velocidad de la fase mvil (condicin ptima). A velocidades inferiores a la ptima la difusin longitudinal (B) origina un incremento en la altura de plato y un ensanchamiento de la banda, mientras que a velocidades superiores, la resistencia a la transferencia de masa (equilibrio lento) entre fases provoca que el soluto se extienda. A partir de la ecuacin de van Deemter pueden deducirse las condiciones experimentales que minimicen el valor de H. As, el valor de H disminuye con el tamao de partcula (dp) y con un empaquetamiento uniforme (), as como operando con capas finas de fase estacionaria lquida (df2) de baja viscosidad y a temperatura elevada (para incrementar DS).

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En la prctica, los datos para el grfico de la ecuacin de van Deemter suelen determinarse experimentalmente usando valores de tiempos de retencin, tiempo muerto y anchuras de pico, con objeto de objeto de obtener N y por tanto, H a distintas velocidades de fases mviles. En cualquier caso, normalmente suele operarse a velocidades superiores a la ptima, con objeto de reducir el tiempo necesario para la separacin.

Factores extra-columna sobre el ensanchamiento de las bandas cromatogrficas

Adems de los factores ya considerados que contribuyen al ensanchamiento de los picos y que se producen en la propia columna cromatogrfica, es necesario mencionar algunos que ocurren en otras zonas del sistema distintas de las fase estacionaria. Entre ellos, pueden considerarse los siguientes: * Introduccin de la muestra. Tericamente suele considerarse que la muestra se introduce en el sistema cromatogrfico de forma que ocupa una capa de espesor infinitamente pequeo. Sin embargo, en la realidad, la muestra ocupa un volumen finito, y a veces relativamente grande, tal como sucede en CG, donde un micro-litro de una sustancia lquida inyectada puede ocupar un volumen del orden de 0.5 mL cuando se vaporiza a 250 , y ello representa varios centmetros de longitud de columna. Adems, la lenta velocidad de vaporizacin contribuye tambin al ensanchamiento de la banda. En cromatografa lquida suelen emplearse bucles conteniendo un determinado volumen de muestra a temperatura ambiente. En estas ocasiones, la relativamente lenta eliminacin de trazas de la muestra de las paredes de la vlvula es el factor que puede contribuir al ensanchamiento de la zona. En cromatografa en papel y de capa fina la muestra deber aplicarse en forma de una gota tan pequea como sea posible.

* Volmenes muertos en el sistema de inyeccin, detector y tubos de conexin. Por volumen muerto se considera el existente entre el punto de inyeccin de la muestra y el punto de deteccin, excepto el volumen ocupado por la fase

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estacionaria, de forma que cualquier zona del sistema en la que estn presentes el soluto y la fase mvil, pero no expuesta a la fase estacionaria contribuye a la difusin del soluto y, en consecuencia, al ensanchamiento de las bandas cromatogrficas. Es evidente, que debern usarse tubos estrechos para las conexiones entre el sistema de inyeccin y la columna, y entre sta y el detector. En CG el volumen muerto constituye un verdadero problema cuando se opera con columnas tubulares abiertas, mientras que en HPLC, la menor velocidad de difusin en la fase lquida disminuye la posibilidad de mezclas. Por otra parte, el empacado de la columna es susceptible de compresin, sobre todo cuando se trabaja con presiones altas y cuando la columna ha sido objeto de sbitos y rpidos cambios de presin. En cuanto a los detectores, su propio volumen podr actuar como una verdadera cmara de mezcla. Debern disearse de forma que su volumen sea pequeo y de que se mantenga un flujo laminar en su interior.

En resumen, para minimizar el ensanchamiento de las bandas cromatogrficas por factores extra-columna, deben minimizarse todos los espacios muertos y las dimensiones de los tubos; la muestra deber aplicarse en una zona muy estrecha y deber procurarse que penetre en la columna antes de mezclarse con el eluyente.

RESOLUCION Y SU OPTIMIZACION
La separacin de solutos por un sistema cromatogrfico puede expresarse por el factor de selectividad, , ya mencionado,
=

tR B tM tR A tM

kB kA
'

'

KB KA

Sin embargo, describe la separacin entre los centros de las bandas cromatogrficas, pero no tiene en cuenta las anchuras de pico, ya que puede ocurrir que el factor de selectividad entre dos picos de dos cromatogramas diferentes sean iguales, y, sin embargo, la resolucin sea bastante diferente, como puede apreciarse en la figura 10.15.

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Figura 10.15. Selectividad y resolucin.

Por lo anteriormente mencionado, resulta ms adecuado obtener la resolucin a partir de la expresin (para picos Gaussianos)

R=
o. alternativamente,

2 t RB t RA wA wB

R=

2 t RB t RA 1.699 w 1/2 A + w 1/2 B

segn se midan anchuras de pico, o anchuras a la semi-altura respectivamente (figura 10.16.)

Figura 10.16. Medidas para calcular la resolucin.

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Si R=1.5, los dos picos solo se superponen un 0.3 %, mientras que si R=1, la superposicin es del orden del 2 %, que puede considerarse adecuada para muchos anlisis. La ecuacin anterior resulta adecuada para obtener el valor de R, pero no proporciona informacin acerca de las propiedades cinticas o termodinmicas de la columna, lo cual es importante en orden a optimizar R. Por ello, una ecuacin alternativa para la resolucin es la siguiente:

1 1 N R= 4

' '

1+k

donde k' es el valor medio de k'A y k'B. Esta expresin indica que la resolucin depende de la eficacia global de la columna (N), de la capacidad de la fase estacionaria para retener a los componentes () y de las caractersticas de retencin de cada componente (k). Segn la ecuacin anterior, la resolucin es una funcin de la raz cuadrada de N, por lo que para aumentar significativamente el valor de R es necesario aumentar mucho el de N. Esto puede hacerse incrementando la longitud de la columna, si bien esto puede llevar a un tiempo demasiado grande. Por ello, normalmente suele ser preferible optimizar k y . Una forma relativamente sencilla de mejorar la resolucin es optimizando k', lo cual puede hacerse aumentando la temperatura (sobre todo en CG) o cambiando la composicin de la fase mvil (en HPLC). En cuanto al factor de selectividad, ste puede modificarse variando la composicin de las fases mvil y estacionaria, as como la temperatura o recurriendo a factores qumicos especiales como puede ser incorporar a la fase estacionaria algn agente complejante particular. En cualquier caso, y en la prctica, en muchas ocasiones se utiliza el mtodo SIMPLEX u otros ms sofisticados para optimizacin de los mtodos analticos por cromatografa. Cuando una muestra est constituida por un gran nmero de componentes, puede ocurrir que se consigan las condiciones ptimas para la separacin de algunos , pero ello vaya en detrimento de otros. En estos casos suele recurrirse a cambiar las condiciones mientras se realiza la separacin, para lo cual, puede utilizarse la elucin con gradiente (variacin gradual de la composicin de la fase mvil durante la elucin) o la programacin de temperatura (variacin de la temperatura durante la elucin).

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LA CROMATOGRAFIA Y EL ANALISIS QUIMICO

Aunque la cromatografa es el mtodo ms importante para la separacin de especies, tambin es posible su empleo en anlisis cualitativo y, sobre todo, en anlisis cuantitativo. En anlisis cualitativo sus aplicaciones son bastante limitadas, sobre todo cuando se compara la informacin que proporciona un cromatograma con la que puede obtenerse con otras tcnicas como espectroscopia infrarroja, de resonancia magntica o de masas. De todas formas, la cromatografa es una herramienta importante para reconocer la presencia o ausencia de componentes en mezclas que contengan un nmero limitado de posibles especies de las que se conozca su identidad. Por otra parte, en ocasiones interesa conocer si un determinado componente est ausente en una muestra. En estos casos, muchas veces la cromatografa proporciona una evidencia segura en este sentido, al no aparecer el pico, o la mancha, correspondiente al patrn en las mismas condiciones de operacin. Anlisis Cuantitativo En cromatografa plana (papel y capa fina) el rea ocupada por las especies separadas es el parmetro utilizable en anlisis cuantitativo. Las aplicaciones cuantitativas de la cromatografa en columna se basan en la comparacin de la altura o del rea del pico del analito con los correspondientes a los patrones. El empleo de las alturas de pico tiene la ventaja de su fcil medida*, pero presenta el inconveniente de que debe controlarse rigurosamente la temperatura de la columna, el caudal de eluyente y la velocidad de inyeccin de la muestra, ya que estas variables alteran las anchuras de pico, y stas estn inversamente relacionadas con las correspondientes alturas. Sin embargo, el rea de pico es independiente de los efectos debidos a las variables anteriormente mencionadas, por lo que es el parmetro que normalmente se utiliza. Su medida se lleva a cabo con facilidad, ya que casi todos los cromatgrafos modernos estn provistos de integradores electrnicos digitales*. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la respuesta del detector vara de un compuesto a otro. As, por ejemplo, el detector ultravioleta depende de la absortividad de los correspondientes analitos, y el de ionizacin de llama de la
* La altura de un pico cromatogrfico se obtiene uniendo las lneas base a cada lado del pico por una lnea

recta y midiendo la distancia perpendicular desde esta lnea al pico.

* En el caso de no disponer de estos equipos, un mtodo sencillo para picos simtricos consiste en

multiplicar la altura de pico por la anchura a la semi-altura. Otros mtodos implican el uso de planmetros o incluso la determinacin gravimtrica, consistente en recortar el pico y determinar su peso relativo respecto al peso de un rea conocida del papel de registro.

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formacin de iones. Por ello, a menudo se utilizan los denominados factores de respuesta, obtenidos de la relacin entre el rea de un componente y el rea de otro componente elegido como referencia. Los mtodos de cuantificacin que principalmente se utilizan en cromatografa son las rectas de calibrado obtenidas a partir de series de patrones, el mtodo del patrn interno, el de normalizacin de reas y el de adicin estndar. La obtencin de rectas de calibrado se lleva a cabo preparando una serie de disoluciones patrn de composicin parecida a la de la muestra, obteniendo los correspondientes cromatogramas y representando las reas de pico (o las alturas) en funcin de la concentracin. En este mtodo, la fuente ms importante de error es la incertidumbre en el volumen de la muestra, sobre todo cuando se utilizan microjeringas. Estos errores pueden reducirse considerablemente con el empleo de vlvulas rotatorias, cuyo funcionamiento se ilustra esquemticamente en la figura 10.17.
Muestra (entrada) Muestra (salida) Muestra (salida) Muestra (entrada)

Eluyente

Eluyente

Columna

Columna

a)

b)

Figura 10.17. Vlvula rotatoria. a) Llenado. b) Inyeccin (introduccin de la muestra en la columna).

En el mtodo del patrn interno se aade a los patrones y a la muestra una cantidad exactamente medida de un componente puro, ausente en la muestra, utilizndose como parmetro analtico la relacin de reas de pico del analito y del patrn interno. Para aplicar este mtodo en cromatografa, es necesario que el pico del patrn interno est bien aislado de los picos de los dems componentes de la muestra, pero deber estar cerca del pico del analito.

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El mtodo de normalizacin de las reas consiste en eluir todos los componentes de la muestra, determinar las reas de todos los picos eluidos y obtener las correspondientes reas de pico corregidas (mediante los factores de respuesta del detector). La concentracin del analito se obtiene de la relacin entre su rea y el rea total de los picos de todos los componentes de la muestra. Para el componente x,

% de x =

Acorregida de x Acorregidas

. 100

Finalmente, por lo que se refiere al mtodo de adicin estndar, su uso en cromatografa est bastante limitado, debido, sobre todo, a la dificultad de inyectar de forma precisa cantidades exactamente conocidas de la muestra.