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Peroxidase And

Nuclear Density Analysis

Lic. T.M. Jose Luis


Vargas
M ètodo de
Mètodo de IMPEDANCIA
IMPEDANCIA

• Ley de Ohm:
U=RI
U= Voltaje
R= Resistencia
I= Corriente
• Mala conducciòn
de la electricidad
HISTOGRAMA
HISTOGRAMA G.
G. ROJOS
ROJOS
• ADE: Distribución
Heterogènea: A.
Adquirida
Homogènea: A. Genética

• VCM: Tamaño
Macrocìtico
Normocìtico
Microcìtico

• HCM,CHCM: Cantidad
Normocròmica
Hipocròmica

• RBC,HTO,Hb:
Poliglobulia
Normalidad
Anemia
SUBPOBLACIONES
SUBPOBLACIONES WBC
WBC
•• LINFOCITOS:
LINFOCITOS:
Variantes
Variantes de
de Linfocitos
Linfocitos yy
Linfocitos
Linfocitos maduros
maduros
•• CEL
CEL GRANDES
GRANDES
MONONUCLEARES:
MONONUCLEARES:
Monocitos,
Monocitos, Linea
Linea
Mieloide, LINFOCITOS
Mieloide, Promonocitos,
Promonocitos, LINFOCITOS
Prolinfocitos
Prolinfocitos GRANULOCITOS
GRANULOCITOS
CELULAS
CELULAS
MONONUCLEARES
MONONUCLEARES
GRANDES
•• GRANULOCITOS:
GRANULOCITOS: Todos
Todos GRANDES

los
los PMN
PMN màs
màs cayados
cayados o
o
segmentados
segmentados

•• Gràfica
Gràfica Normal
Normal segùn
segùn
poblaciòn
poblaciòn predominante
predominante
acorde
acorde aa la
la edad:
edad:
NIÑOS
NIÑOS (( LINFOCITOS
LINFOCITOS ))
ADULTOS
ADULTOS (( PMNPMN ))
HISTOGRAMA DE
PLAQUETAS
Generalidades de dispositivo Láser
• Láser es un acrónimo de Light Amplification by Stimulated Emission of
Radiation (Emisión de luz por emisión estimulada de radiación).

• La energía generada por un Láser está dentro de la porción óptica del


espectro electromagnético, según ilustra la figuraUn haz Láser es no
ionizante y abarca desde el ultravioleta (100 – 400 nm), visible (400-700
nm) e Infrarrojo (700 nm – 1 mm).
Propiedades de un haz Láser
1. Monocromaticidad
Propiedades de un haz Láser
2. Direccionabilidad
Propiedades de un haz Láser

3.Coherencia
RBC/PLT/RTC
RBC/PLT/RTC Methods
Methods
High Angle Scatter Detector
Measures:
Density/HGB conc/Refractive Index

Laser
Zero Angle:
Retic Absorption/Staining

Low Angle Scatter Detector


Measures: Size/Volume
ADVIA
ADVIA 120
120
HEMOGLOBINA
HEMOGLOBINA
El
El reactivo
reactivo ADVIA
ADVIA 120
120 HGB
HGB
contiene
contiene:: Cámara de reacción de HGB

-- Cianuro
Cianuro de
de potasio
potasio,, 20
20 mmol /L
mmol/L
-- Oxido
Oxido de
de Dimethilaurilamina
Dimethilaurilamina,, 2.0%
2.0%
Reacci ón
Reacción::

-- Los
Los eritrocitos
eritrocitos son
son hemolizados
hemolizados para
para liberar
liberar la
la hemoglobina
hemoglobina..
Lámpara
-- El
El grupo
grupo Hem
Hem sese oxida
oxida de
de su
su forma
forma ferrosa
ferrosa aa fférrica
érrica
UFC Filtro +Fotodiodo
yy se
se combina
combina con
con el
el cianuro
cianuro para
para formar
formar::

HEMOGLOBINA+ reactivo HGB META HEMOGLOBINA CIANOMETA HB.


Low Angle / Volume (fL)
GLOBULOS ROJOS

Macrocrocytic

Hypochromic

Hyperchromic
120ƒL

60ƒL
Microcrocytic
28 gm/dL 41 gm/dL
High Angle / Hgb
Concentration
CONCENTRACION
CONCENTRACION DE
DE
HEMOGLOBINA
HEMOGLOBINA
MICROCITOSIS
MICROCITOSIS
MACROCITOSIS
MACROCITOSIS
HIPOCROMIA
HIPOCROMIA
HIPERCROMIA
HIPERCROMIA
ANISOCITOSIS
ANISOCITOSIS
Se relaciona con el VCM: grande, mediano, pequeño

Aniso HCVAR
ANISOCITOSIS
ANISOCITOSIS

ANEMIA DIMORFA HETEROGENEA


LEUCOCITOS
LEUCOCITOS ((Perox)
Perox)
Reacción:

- El Surfactante Sulfato dodecyl sódico y el Brij-35 en combinación con


el calor, lisa las células rojas.
El formaldeído fija las células blancas. El medio hipertónico produce
crenación y contracción de las células blancas, lo cual incrementa el
índice de refracción y permite la mejor identificación de los linfocitos
sobre el ruido.

Detector de absorción
Filtro
Detector de dispersión
Lámpara de tungsteno Corriente Analítica

Separador de luz
Campo
Obscuro
El método de peroxidasas
método
Número de Gránulos Neutrófilos

Médulo Oséa Sangre

Promielocitos
Mielocitos
# granulos

Metamielocitos
Bandas
PMN Maduros

Blastos

Maduración Celular
Perox Cytogram

Monocytes
Large Neutrophils
Unstained
Cells

Lymph and
Basophil

NRBC Eosinophils

Platelet
Clumps
Noise
METODO
METODO PEROXIDASA
PEROXIDASA

Volume
Scatter // Volume
Volume
Scatter // Volume

Scatter
Scatter

Absorption
Absorption // Staining
Staining Absorption
Absorption // Staining
Staining
BASOFILOS
12
12 uL
uL de
de sangre
sangre

ADVIA
ADVIA 120
120 BASO
BASO contiene
contiene::

-- Acido
Acido Hydrocl órico, 9.00
Hydroclórico, 9.00 mmol/L
mmol/L
-- Acido
Acido ft álico, 21.49
ftálico, 21.49 mmol
mmol/L/L
-- Preservativo
Preservativo
-- Surfactante
Surfactante

Reacci ón:
Reacción:

-- El
El reactivo
reactivo ADVIA
ADVIA 120
120 BASO
BASO contiene
contiene áácido
cido ft álico yy un
ftálico un surfactante
surfactante
el
el cual
cual lisa
lisa las
las ccélulas
élulas rojas
rojas yy destruye
destruye las
las membranas
membranas de de las
las
plaquetas
plaquetas yy leucocitos
leucocitos,, excepto
excepto bas ófilos.
basófilos.
Baso Cytogram
Baso
Saturation
Basophils
Baso
Suspect

MN

PMN
Blasts

Noise
METODO
METODO
BASOLOBULARIDAD
BASOLOBULARIDAD

Low Angle / Volume


Low Angle
Low Volume
Angle // Volume

High High Angle / Density/Lobularity


Density/Lobularity
High Angle
Angle //
Density/Lobularity
Density/Lobularity
BASOFILOS
BASOFILOS

Indice de Lobularidad

1.- Mononucleares

2.- Polimorfonucleares

3- Valle

El índice de lobularidad (LI)


proporciona una indicación del grado
de maduración de la curva
leucocitaria

Relación 2:1
BASOFILOS
Granulocitos Inmaduros

1 Neutrófilos 2 Eosinófilos 3 Polimorfonucleares

La presente muestra fue tomada a un paciente con Leucemia mieloblástica aguda.


La alarma de GI apareció porque [(%NEUT+%EOS)-%PMN] fue mayor de 5.0%.
Mapa de plaquetas
2-D

..
Plaquetas Gigantes
Microcitos.
.
Volumen (fL)

Fantasmas RBC
Palquetas

Detritus
Fragmentos de RBC’s

Indice de Refracción
ADVIA 120
PLAQUETAS
• 1.- Area
cubierta por el
citograma de
plaquetas
• 2.- Fragmentos
de RBC’s
• 3.- Plaquetas
Gigantes
Quality Of Results
Lipemic Impedance 2
200 Impedance 3
Impedance 1
150 ADVIA 120

100

50
ITP
0
0 20 40 60 80 100
Immunophenotypic Count (x 10 9/L)

‘ADVIA 120/2120 Very Close To Immuno Method’

British Journal of Haematology 2000, 108:2,228-235, Machin


RETICULOCITOS

El reactivo ADVIA 120 autoRETIC contiene:

- Oxazina 750, 11.4 mg/L


- Buffer
- N-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propane
sulfonate, 0.023 mmol/L

Reacción:

El reactivo ADVIA 120 autoRETIC contiene un detergente (surfactante)


que hace esféricos (isovolumétricamente) a los eritrocitos.
También contiene un colorante catiónico, Oxazina 750, que tiñe las células
de acuerdo a su contenido de RNA.
RETICULOCITOS
RETICULOCITOS

Absorption
BENEFICIOS RETICULOCITOS
• La ferritina es una evaluacion indirecta de la deficiencia
funcional de hierro
• Monitorear el porcentaje de células hipocrómicas
permite un monitoreo directo
• El contenido de hemoglobina (CHr) de los reticulocitos
ha demostrado ser mas sensible que el porcentaje de
hipocromia

El uso de CHr permite un monitoreo más


Después de 4 días
eficiente, que nos da la optimización del Inicio
uso de EPO y tratamientos con hierro, lo
que como consecuencia tiene un mejor
manejo del paciente anémico

Después de 2 semanas Después de 1 mes


Antecedentes
• Guideline for Reference Leukocyte Count
(Proportional) And Evaluation of
Instrumental Methods.

• CLSI (Clinical and Laboratory Standars


Institute).
SISTEMA DE
AUTOMATIZACIÓN DE
ANALISIS DE HEMOGRAMAS
MEDIANTE PROCESAMIENTO
DIGITAL DE IMÁGENES
Esquema de Captacion de
Imagen
Los resultados serán presentados visualmente vía monitor del
computador o impresión en papel. En esos resultados se
especificará lo siguiente:

· Número de elementos contabilizados en la muestra de sangre.


· Número de glóbulos rojos contabilizados, en cantidades y en
porcentaje.
· Numero de glóbulos blancos contabilizados (en cantidades y
porcentaje) y clasificados según su tipo: monocitos, linfocitos,
eosinófilos, etc.
· Número de plaquetas encontradas en la muestra analizada.
· Área y perímetro medio de los glóbulos rojos analizados.
· Área y perímetro medio de los glóbulos blancos analizados?
Introducción
• Contadores Automatizados.

• Clasificación de Sistemas Automatizados para el


conteo Diferencial.

• Limitaciones. (Alarmas, Experiencia,


Sensibilidad Analítica y Funcional, Especificidad,
etc.).
Causas de Variabilidad

• Fuentes de Variación.(preanalitica,
analítica, biológica, fisiológica y
patológica).

• Rutina vs. Tiempo Optimo para el Test.


Principios
• Selección de Método de Referencia.
– Exactitud.
– Subjetividad.
– Seguridad y Efectividad del conteo
diferencial.
Desempeño del Test
• Comparación. • Seguridad y
• Consistencia Efectividad.
Interna. • Evaluación Célula
• Establecer Valores por Célula.
de Referencia. • Datos tabulados
• Sensibilidad vs. Alarmas del
Clínica. fabricante.
Definiciones
• Anormalidad. • Falso Positivo.
• Arbitro. • Falso Negativo.
• Sistema Automatizado. • Verdadero Positivo.
• Sensibilidad Clínica. • Verdadero Negativo.
(concordancia con método de
Referencia VP).
• Especificidad Clínica
(concordancia con método de
Referencia VN).
• Evaluación de Elementos
Formes.
– Tabular leucocitos.
– Anormalidades de RBCs.
– Suficiencia, morfología,
exceso o aglutinación PLT.
Grafica de Bayes
Método de Positivo Negativo
Referencia

Positivo VP FN
(Verdadero Positivo) (Falso Negativo)

Negativo FP VN
(Falso Positivo) (Verdadero Negativo)
Conteo Diferencial de Referencia
• Colección de Espécimen.
• Condición de la Muestra.
• Prep. Lamina.
• Requerimientos.
• Coloración.
– Leucocitos Aceptables.
– Coloración reproducible.
Células Nucleadas Hematológicas
Calificación
Calificacion Conteo Neutrofilos

90
80
70
60 Serie1
50
Serie2
40
30 Serie3
20
10
0
0 20 40 60 80 100
Calificación
Calificacion Conteo Monocitos

14
Promedio de Conteos

12
10
Serie1
8
Serie2
6
4 Serie3
2
0
0 5 10 15
Conteos Individuales
Diseño de la Evaluación
• Preparación de la muestra.

• Comparación de Leucocitos para Inexactitud e


Imprecisión.

• Sensibilidad Clínica.

• Métodos Estadísticos.
Protocolo Estudio de Sensibilidad
200 Muestras
100 Normales 100 Anormales

Método de Referencia Método Automatizado

Intervalo de Referencia

Sensibilidad Clínica

Comparar Discrepancias
Morfológicas y Numéricas

Arbitro
Reconteo & Reasignación

Sensibilidad Clínica Final


Tipos de Muestra para Estudio de
Sensibilidad
Condición Hallazgo del Conteo Conteo
Clínica conteo Absoluto Relativo
Leucotitario
Inflamación Aguda Granulocitosis >=9.0 x 10 9/ L >80 %
Desv. Izq (Bandas)
Inflamación Monocitosis >=0.8 x10 9 /L > 10%
Crónica
Inf. Parasitaria Eosinofilia >=0.5 x 10 9 /L > 7%
reacción Alérgica
Inf. Viral Linfocitosis y >=3.5 x10 9 /L > 50%
Variantes
Anemia Aplasica Granulocitopenia >= 1.5 x10 9 /L < 10%
Quimioterapia
Inf. HIV Linfopenia <= 0.1 x10 9 /L > 2%

Leucemia Aguda Cells. Inmad 0.1 x 10 9 /L > 2%

Anemia Severa NRBC >= 0.02 x 10 9 /L > 2%


…PREGUNTAS??
Tendencias en
Hematologia Automatizada
EXTENSIÓN DE LAS APTITUDES DE SISTEMAS
AUTOMATIZADOS CON EL USO DE MARCADORES
LINFOIDES
(American Journal of Clinical Pathology)

Automated Cell Counts in Cerebrospinal Fluid


This article was written with the cooperation of our 10 CSF clinical trial sites
reporting results on 325 samples. The sites include Roswell Park Cancer
Institute - Buffalo, NY; Children's Hospital - Boston, MA; Brigham and
Women's Hospital - Boston, MA; St. Mary Medical Center - Long Beach, CA;
Memorial Health University Medical Center - Savannah, GA; University of
Heidelberg - Heidelberg, Germany; Haukeland University Hospital - Bergen,
Norway; University of Mainz - Mainz, Germany; Aarhus University Hospital -
Aarhus Amtssygehus, Denmark; and Karolinska University Hospital -
Stockholm, Sweden.
Key message:
Study results demonstrate that the automated ADVIA 120 CSF Assay is an
acceptable alternative to the labor-intensive manual method.
Análisis de LCR Automatizado
• Diferencial de 5 estirpes en LCR de forma
automática y citograma propio.
• Posibilidad de hacer controles periódicos
de patologías del SNC.
• Análisis cuantitativo y cualitativo de las
sospechas de alarma.
Análisis de Liq. Amniótico Automat.
• Cuerpos lamelares (relación lecitina-
esfingomielina).
• SDR (síndrome de Distress Respiratorio.
• Maduración Pulmonar Fetal.
Cat WBC

Eos’s not counted here Eos’s average


This area includes nonlysed 2%-12% but
MN’s that are included in the may be as
MN count. Samples should be high as 35%
run at room temp to minimize
nonlysis.

Eos’s are counted in the retic channel (even without


ordering a retic). Retic reagent must be available on the
analyzer at all times when running cats.
Dog WBC
Mono’s about 1% higher on
ADVIA 120

Baso positioned
lower
Dog Retic

%Retic low on
dogs (but can
be 5%)
Guinea Pig HGB, Platelet and
RBC

Small
Platelets
Unlysed MN - can warm

Horse WBC
the blood but non-lysis
may not be eliminated

Mono’s

Eos’s are located


out to the side and
are giant in size

LUC’s
Monkey-Cyno WBC
Perox cytogram looks like a
weak staining human
Pig WBC
LUC’s

Neutrophils sometimes
weak stainers

Mono’s
Rabbit WBC
Many Baso’s

Lymph threshold is low


due to small size of
lymphs

Very little noise

Baso’s can
equal 4-10%
Sheep WBC
LUC’s

Mono’s

Lymphs

Inverted Diff
Sheep Retic

Low %Retic
…..el Laboratorio como
Fuente de Informacion
….AHORA.
• ….GRACIAS POR SU ATENCION