INMUNOPRECIPITACIN

La base de esta tcnica consiste en concentrar al mximo la protena de inters para posteriormente desarrollar el immunoblotting, de tal forma que el nmero de bandas inespecficas obtenidas por esta tcnica disminuye considerablemente. En el tejido homogeneizado vamos a tener el antgeno de inters mezclado con otros muchos. Para poder concentrarlo, primero se aade el anticuerpo primario a una concentracin saturante, para que todo el antgeno presente en el tejido se una al anticuerpo (fase de inmunoabsorcin). Despus de la incubacin con el anticuerpo primario se realiza una segunda fase en la que se aade protena G, que est unida a sefarosa. La protena G es una protena de la pared celular de Streptococcus que une la fraccin constante (Fc) de las inmunoglobulinas G (IgG) con gran afinidad. Adems del receptor para la Fc, tambin tiene sitios de unin especficos para la albmina y para la fraccin ab (Fab) de las inmunoglobulinas. La protena G est unida a la sefarosa a travs del extremo amino terminal y el grupo -amino de la lisina. La sefarosa confiere un carcter insoluble al complejo protena G/sefarosa, con lo que resulta fcil separarlos por centrifugacin.

Anticuerpo primario

Protena G conjugada con sefarosa

Inmunoabsorcin

Y Y Y Y Y Y YY

Y Y Y Y Y Y Y Y

Y Y

Y Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y Y Y Y Y

Protena G/sefarosa

Centrifugacin

Lavado de la protena G1: (Protein G Sepharose, Fast Flow Streptococcus sp.

Sigma: P-3296)

1. Lavar el conjugado de agarosa dos veces en tampn de lavado (Hepes 20 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM, Tritn X-100 al 0,1%, glicerol al 10%) centrifugando durante diez minutos a 12000 rpm a RT. Descartar el sobrenadante. 2. Resuspender el conjundo en tampn de lavado para que quede una suspensin de agarosa del 50% del volumen total.

Incubacin con el anticuerpo primario:

1. Calcular la cantidad de tejido necesaria para tener, en un volumen final de 100 l, un total de 750 g de protena. Llevar a 100 l con tampn de homogeneizacin. 2. Aadir 5 l de anticuerpo primario e incubar durante una hora a 4 C en agitacin orbital. 3. Aadir 20 l de suspensin de agarosa (10 l de agarosa/vol) e incubar en agitacin orbital durante toda la noche.

Lavado de los complejos de protena G:

1. Centrifugar las muestras 1 min a 13000 rpm. 2. Descartar el sobrenadante y aadir al precipitado 1 ml de buffer I. 3. Agitar y girar a 4 C durante 20 min. 4. Centrifugar 1 min a 13000 rpm. Volver a aadir buffer I e incubar de nuevo 20 min. 5. Repetir el mismo proceso con el buffer II. 6. Repetir con el buffer III 7. Centrifugar 1 min a 13000 rpm. Descartar el sobrenadante, limpiando bien. 8. Aadir 15 l de tampn de carga y calentar a 99C durante 5 min. 9. Centrifugar 1 min a 13000 rpm. 10. Recoger el sobrenadante y pasar a un tubo limpio. Puede cargarse directamente en una PAGE o bien congelarse a 20C.
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Existen casas comerciales, como por ejemplo Santa Cruz (sc-2002), que venden la protena G para uso directo, sin necesidad de lavarla previamente.

REACTIVOS:

Buffer I: - 10 ml de Core buffer: 7,35 g Trizma base, pH 7,4, para 100ml. - 7,5 ml NaCl. - 5 ml detergente mix: 0,29 g Trizma base, 10 ml NP-40, 5 mg de Nadeoxycholate, para 100 ml. - 26,5 ml de agua (hasta 50 ml). - 50 l Na3VO4 1 M (en el momento de uso). Buffer II: - 10 ml de Core buffer. - 25 ml de NaCl. - 0,5 ml de detergente mix. - 14,5 ml de agua (hasta 50 ml). - 25 l Na3VO4 1 M (en el momento de uso). Buffer III: - 1 ml de Core buffer. - 0,25 ml de detergente mix. - Agua hasta 50 ml. - 25 l Na3VO4 1 M (en el momento de uso).