MICROSC

OPIO
FIJACION : primer paso para obtener una preparación
permanente
- Evitar la autolisis
- Prevenir la actividad y proliferación de bacterias
- Endurecer las células de manera que resistan mejor a
los siguientes pasos
- Aumentar la afinidad de las estructuras celulares por
los colorantes utilizados
El formaldehido y el
glutaraldehido fijan a las células
mediante la combinación con los
grupos amino de las proteínas,
estabilizando la estructura
cuaternaria de la proteína
El tetroxido de osmio y el
glutaraldehido son los fijadores
mas utilizados en la microscopia
electrónica por que coagulan las
proteínas, causando cambios
mínimos en la estructura celular
Se realiza con un
MICROTOMO
- En microscopio óptico esta
incluidos en parafina o resinas
plásticas y cortadas con un
espesor de 1 a 6 um (cuchillas
de acero)
- En el microscopio electrónico
los tejidos deben ser incluidos en
resinas mas rígidas ( tipo epoxi )
con cortes de 0,02 0,1 um en
este para cortarlas se usan
 Tinción
- La mayoría de los colorantes se comportan como una base o
como un acido
- Los colorantes básicos tienen su grupo cromoforo (catiónico)
carga eléctrica positiva
- Los colorantes ácidos tienen su grupo cromoforo (anionico)
carga eléctrica negativa
Colorantes básicos
- Azul de tuluidina, azul de metileno y hematoxialina
Colorantes ácidos
- Eosina, orange G y fuscina acida
Microscopio óptico
- Parte mecánica - Parte óptica
- soporte - condensador
- objetivo
- ocular
Condensador

- Se llama poder de
resolución de un
sistema óptico a su
capacidad de separar
detalles
En la practica el poder de resolución es expresado por el limite
de resolución el cual equivale a la mínima distancia que debe
existir entre dos puntos para que aparezcan individualizados
- El limite de resolución de las mejores lentes utilizados en los
microscopios ópticos comunes es de 0,12 um
- Por lo tanto su riqueza de detalles de la imagen dada por un
microscopio óptico es su limite de resolución y no su poder de
aumentar el tamaño de los objetos
OBJETIVO
- Una de las características mas importantes de un objetivo
es su abertura numérica
Microscopio de polarización
- Sustancias o tejidos sufren
desdoblamiento por rayos (polarizados)

- cristalino, anisótropos o
birrefringentes (doble refracción)
- amorfo, isótropos o
monorrefringentes
- esta compuesto de una platina rotatoria
(añadida 2 polarizadores) uno debajo de
la platina(polarizador) y otro encima de
ella junto al ocular (analizador)
Microscopio de polarización

Función:
- Distinguir las sustancias
monorrefringentes de las
birrefringentes
- puede estudiarse tejido oseo,
dientes, fibras de colágeno, fibras
musculares, fibras nerviosas etc
Microscopio de contraste de fase
- Se usa para que las estructuras
celulares aparezcan oscuras (fase
positiva) o claras ( fase negativa)
- Se usa para el estudio de células
vivas
- Es útil para observación de las
células cultivadas cuyo crecimiento y
división pueden ser fácilmente
seguidos sin el uso de colorantes
Microscopio confocal
- Las células aisladas y los cortes de
tejido son mas gruesos que el plano
focal del microscopio óptico
- Este procedimiento tiene la
desventaja de proporcionar un plano de
la imagen enfocada que pierde nitidez
debido a la interferencia de los rayos
luminosos que pasan a través de los
planos fuera del foco
Microscopio confocal
- Generalmente, las células se someten a un compuesto
fluorescente y la luz emitida se procesa en un ordenador
- El microscopio
electrónico permitió la
visualización de las
estructuras celulares que
no son visibles al
microscopio óptico por
contar con un poder
resolutivo mucho mayor
Microscopio electrónico de
barrido
- Utiliza haz de electrones
- Tiene ventaja de proporcionar
imágenes tridimensionales
- El microscopio electrónico de
transmisión tiene un poder de
resolución mucho mas alto
- Objetos de 1 cm o mas
pueden ser examinados enteros
- Citoquimica
- Incluye diversas técnicas para la identificación y localización
de las moléculas que forman parte de las células
- Pueden ser examinadas en el microscopio óptico y electrónico

- 1 caso el producto se debe colorear

- 2 caso se debe dispersar los electrones (densidad a los
electrones)
- HISTOFOTOMETRO o citofotometro determina la
intensidad del color producido, midiendo de este modo la
cantidad de sustancia analizada
ADN: se demuestra por la
reacción de feulgen que
consiste en dos etapas
1 se sumerge la cuchilla con
los cortes de tejido en
solución de acido clorhídrico
caliente (hidrolisis de bases
purinas)
2 el reactivo de schiff se
combina con los grupos
aldehído de la desoxirribosa,
forman un compuesto de
ARN : El estudio citoquimico del ARN
se basa en su basofilio y las propiedades
de la enzima ribunuclesa que ataca
exclusivamente al ARN
CATECOLAMINAS : El formaldehido
reacciona con las catecolaminas
produciendo compuestos fluorescentes,
por lo tanto es posible la ubicación de la
epinefrina y norepinefrina
PROTEINAS : se
usan técnicas que
identifican aminoácidos
entre estas están
1 millón para la
tirosina
2 diaminoazobenceno
para triptófano
3 sakaguchi para
arginina
POLISACARIDOS : Un ejemplo
es la técnica para evidenciar el
glucógeno que puede ser
evidenciado por la reacción de
acido periódico Schiff (PAS)
ENZIMAS : son moléculas
orgánicas que actúan como
catalizadores de reacciones
químicas, ​es decir, aceleran la
velocidad de reacción
- Las fosfatasas y las
deshidrogenasas son ejemplos de
enzimas demostradas
citoquimicamente
- Las deshidrogenasas captan el
hidrogeno de un sustrato
DESHIDROGENASA :
- Su demostración se lleva a cabo
incubando cortes de tejido fresco
(no fijado) en un sustrato
adecuado
- Se junta con un compuesto
químico soluble y débilmente
coloreado de tipo TETRAZOL
- El compuesto coloreado e
insoluble es el FORMAZAN
FOSFATASA ACIDA:
- Son enzimas que hidrolizan
esteres de acido fosfórico a ph
acido
- Uno de los métodos para
demostrar la actividad de la
fosfatasa acida es el METODO DE
GOMORI
- Esta técnica es muy utilizada
para localizar y estudiar los
lisosomas (orgánulos ricos en
enzimas hidrolíticas entre las que
se plica generalmente las
técnicas citoquimicas
- Algunos compuestos
fluorescentes son constituyentes
normales de las células ejm
VITAMINA A , RIBOFLAVINA
(B2) Y PORFIRINAS
por lo tanto estos pueden ser
identificados y localizados por
microscopio de fluorescencia
- Uno de los de los colorantes
fluorescentes mas usado es el
naranja de acrinina que se une a los
moléculas proteicas especificas
- Se basa en la reacción de
antígeno- anticuerpo
- Los anticuerpos son proteínas
pertenecientes a las
GAMAGLOBULINAS
- Otra técnica de la
inmunofluorescencia se basa en
acoplar sustancias fluorescentes a
antígenos y anticuerpos sin que
estos pierdan la capacidad de
reaccionar
INMUNOL
OGIA
INMUNOCITOQUIMICA
DIRECTA
INMUNOCITOQUIMICA
DIRECTA
INMUNOCITOQUIMICA
DIRECTA
INMUNOCITOQUIMICA
INDIRECTA
INMUNOCITOQUIMICA
INDIRECTA
INMUNOCITOQUIMICA
INDIRECTA
INMUNOCITOQUIMICA
INDIRECTA
INMUNOCITOQUIMICA
INDIRECTA
INMUNOCITOQUIMICA
INDIRECTA
INMUNOCITOQUIMICA
INDIRECTA
Las macromoléculas tales como las
proteínas, ADN y ARN pueden ser
aisladas por cromatografía en columna
- Interacción de intercambio iónico
- Interacciones hidrofóbicas
- Filtración en gel: proteínas migran
- Interacción de afinidad Ejm complejo
antígeno-anticuerpo, enzima- sustrato y
ADN-ARN
El tamaño de las moléculas
proteicas se puede determinar
por electroforesis en gel de
poliacrilamida
- Para determinar el tamaño de las
moléculas se usa la solución de
DODECIL SULFATO DE SODIO
(SDS) este compuesto es un
detergente fuerte con carga
negativa
La radioautografia es muy
utilizada para estudiar sitios de
síntesis y el destino de las
macromoléculas
- En esta técnica los cristales de
bromuro de plata actúan como
microdetectores
- La radioautografia se puede
emplear también en el microscopio
óptico
Técnica de centrifugación
- Es posible obtener orgánulos en
estado de pureza
- También se puede obtener por
medio de ultrasonidos o un
dispositivo similar a una licuadora
domestica
- La separación de estos
componentes se conoce igual como
centrifugación fraccionada o
centrifugación diferencial
Es posible separar las células de un tejido y el aislamiento de
un tipo celular particular
- Colgenasa y tripsina (enzimas destructoras de la matriz
extracelular)
- ejm: macrófagos se aísla por tener tendencia a adherirse al
vidrio o a plásticos
Estudio de las células vivas y cultivo de
células animales y vegetales
- para estudio de la células vegetales
tienen que estar en un medio isotónico
- Las células animales o vegetales
cultivadas directamente constituyen los
cultivos primarios (estas mueren después
de 50 a 100 mitosis)
- las células inmortales se multiplican
indefinidamente constituyendo los
cultivos secundarios sufriendo alguna
mutación
Estudio de las células vivas y
cultivo de células animales y
vegetales
- las células animales o vegetales
pueden ser sometidas a diversas
técnicas de microcirugía donde
usan vidrio agujas bisturíes pipetas
y electrodos
- a través de la microcirugía se
puede determinar el PH intracelular

-La microcirugía se realiza con