Laura Marcela Mira Uribe

Estudiante de Ingeniería biológica

Embryos produced in vitro vs in vivo

• Desarrollan una menor

competencia.
• Están expuestos a mayor
estrés ambiental, debido a las
condiciones de cultivo.

• Tienen problemas de
implantación. IMAGEN

• Presentan blastómeras de
tamaños irregulares.

• Pueden tener irregularidades

en expresión génica.

• Problemas epigenéticos.
Production bovine somatic cell nuclear
transfer (SCNT) embryos

• Es una metodología con menor producción que la

fertilización in vitro.

• También se usa el protocolo de cambio de medio al tercer

día de cultivo, esta practica hasta ahora es la mejor para
mejorar la producción de blastocistos, sin embargo
genera mucho estrés.

• Los protocolos de transferencia y los medios de cultivo no

garantizan que se desarrolle el embrión.
Exosomes
Los exosomas son pequeñas
vesículas secretadas por la mayoría
de los tipos de células en cultivo.
Los exosomas se forman
intracelularmente por la brotación
hacia el interior de la membrana
limitante de los compartimentos
endocíticos, lo que conduce a
endosomas que contienen
vesículas, llamados cuerpos
multivesiculares (MVB). Las MVB
finalmente se fusionan con la
membrana plasmática, liberando así
sus vesículas internas (es decir,
exosomas) en el medio extracelular.
 Objetivos
Optimizar el sistema de cultivo in vitro de
embriones bovinos clonados por transferencia
nuclear de células somáticas.

Comprobar si los embriones SCNT secretan

exosomas y que efecto tienen estos en el desarrollo
embrionario.

Evaluar el protocolo de cambio de medio al día 3

cultivo.
Pie
Pie de imagen // Imagen
de imagen Imagen pequeña
pequeña
justificada
justificada a
a la
la derecha
derecha

Facultad de Ciencias
Sede Medellin
Maduración in-vitro de oocitos

Medio de maduración
• TCM-199, Gibco.
• 10% (v/v) FBS.
• 1 μg/mL17β-estradiol.
• 0.075 IU/mL human menopausal
gonadotropin
• 5%CO2 at 38.5ÊC for 21 h.
 Producción de embriones
SCNT

Then the embryos were activated in 5 μMionomycin for 4 min,

followed by 4 h exposure to 1.9 mM dimethynopyridine in
mSOFaa
Cultivo in-vitro de embriones SCNT

• BCM
• 8 mg/mL BSA
• 2 mg/mL PVA
• 3 mM myoinositol
• 1 mL/100 mL ITS (Insulina, Transferrina y Selenio)
• 10 ng/mL EGF
• 5% CO2 a 38.5°C
• Gotas de 50μL
• Cultivo durante 7 días
Experimento 1
 Isolation, purification, and
identification of exosomes

3 día de cultivo

10 ml
Resultados experimento 1

Fotografía
de
microcopia
electrónica
luego de
realizar el
procedimien
to anterior.
 Se observan las
microesferas
aldehyde/sulfate
Latex bead con
los exosomas,
que se incubaron
con un antigeno
especifico para
el marcador de
memdrana CD9.
Experimento 2
 Metodología de cultivo

Renovación Suplementació
Cultivo
de medio 3 n con
continuo
día exosomas 3
día
Apoptosis detection
 Quantitative real-time PCR (q-PCR)

Se uso el Kit Cells-to-Signal™ para extraer el RNA y el Kit PrimeScript™

RT Reagent para la PCR
Immunofluorescence
 Embryo transfer
• La transferencia de los embriones se
realizo en vacas de Keyuan Cloning
Company que tenían entre 2 y 5
años, al séptimo día del ciclo estral
natural es decir no fueron
sincronizadas.
 Conclusiones
• Fueron los primeros en comprobar
que los embriones SCNT pueden
producir exosomas.
• Se comprobó que es mejor no
realizar en recambio de medio al
tercer día.
Gracias