INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE

INGENIERÍA CAMPUS GUANAJUATO
INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS (EXTRAORDINARIO)

INTEGRANTES:

BERNAL GUDIÑO ALEJANDRA

LÓPEZ SÁNCHEZ CESAR FERNANDO
PADILLA GARCÍA VERÓNICA MIREYA

SILAO DE LA VICTORIA, GUANAJUATO A 19 DE JUNIO DEL 2018

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INTRODUCCIÓN

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En los últimos años, la biotecnología ha experimentado grandes avances y, paralelamente sus
aplicaciones industriales en la obtención de productos químicos, en la industria alimentaria y
farmacéutica.
Las enzimas son catalizadores empleados en diversos sectores de la industria; Los procesos
catalizados por enzimas en la industria son cada día más numerosos, ya que presentan una serie de
ventajas frente a los catalizadores convencionales no biológicos:
● Presentan una gran actividad catalítica
● Muestran una gran especificidad de sustrato
● Son muy activos a temperatura ambiente y presión atmosférica.

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A pesar de estas claras ventajas, el empleo de enzimas no se ha generalizado en los
procesos químicos industriales debido a que la mayoría de las enzimas no son estables en
las condiciones de trabajo. Por otra parte al ser solubles en agua, su separación de los
sustratos y productos es difícil, y por tanto, no se pueden reutilizar. Con la inmovilización
de las enzimas se han podido superar estos últimos inconvenientes, permitiendo que el
proceso biotecnológico sea económicamente rentable.

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La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una región
definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que
pueden ser reutilizadas repetidamente (Wingard, L.B, 1972).

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Debido a su gran utilidad la inmovilización de enzimas es objeto de estudio tratando
mediante experimentación, el determinar los parámetros que brinden una mejor
eficiencia del proceso, disminuyendo con esto las pérdidas o los altos costos.
específicamente la α-AMILASA se utiliza para la producción de etanol, para hidrolizar los
almidones presentes en los granos y producir azúcares fermentables, etc; es por ello que
es de gran interés la optimización de procesos de inmovilización de esta enzima.

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OBJETIVOS

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General:

Realizar la inmovilización de la enzima comercial α-amilasa de Aspergillus oryzae mediante la técnica

de encapsulamiento con alginato de sodio.

Específicos:

● Preparar soluciones de alginato de sodio y cloruro de calcio a concentraciones óptimas para la

inmovilización por atrapamiento.
● Realizar cuantificación de proteínas por método de Bradford.
● Lograr una concentración de proteína de 1500 μg/mL en el total de perlas
● Determinar el balance global y la eficacia del proceso de inmovilización.

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METODOLOGÍA

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10
CÁLCULOS

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Cloruro de Calcio (CaCl2); 0.2 M; 50 mL

PM CaCl2 = 110.98 g/mol

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Buffer Fosfatos

KH2PO4, PM = 136.08 g/mol

K2HPO4, PM = 228.23 g/mol
50 mL
pKa = 7.2
pH = 7
0.1 M

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Buffer Citratos

Na3C6H5O7, PM = 294.1 g/mol

C6H8O7, PM = 192.12 g/mol
50 mL
pKa = 6.4
pH = 5
0.1 M

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Alginato de Sodio
3%
1.25 mL

Enzima comercial (1500μg/mL)

(1500μg/mL)(5 mL)=7500μg= 7.5mg

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BALANCE

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CÁLCULO DE EFICIENCIA

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

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 RESULTADOS
Se preparó una solución de alginato de sodio al 3% p/v en agua destilada caliente. Después de
enfriar, se mezcló con un volumen de solución de enzima comercial de Aspergillus oryzae (la
relación de enzima y matriz fue 1:1).

Paso siguiente, con un volumen final de 2.5 mL (1.25 enzima libre y 1.25 de alginato de sodio), se
añadió gota a gota con ayuda de una jeringa a una solución (50 mL) de cloruro de calcio a 0.2 M.

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Después de 50 min, se recuperaron las perlas y se lavaron con agua destilada.
Una vez hecho esto, se almacenaron en buffer de fosfatos a pH 7 y conservadas en refrigeración a
4°C hasta la siguiente sesión. Posteriormente, se disolvieron 5 perlas en 5 mL de
buffer de citratos, de acuerdo con (Jiménez et al, 2011), se debe dejar reposar 15 min y llevarlo al
vortex durante aprox 10 min, hasta la disolución de las perlas, esto debido a que rompe enlaces
entrecruzados.
A continuación, se realizó la cuantificación de proteína total por el método de Bradford de esta
solución, así como también de la solución de CaCl2 y del buffer donde fueron almacenadas las perlas.
Los resultados se presentan a continuación. (Tabla 1).

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 Tabla 1. Cuantificación de proteínas por método de Bradford a enzima inmovilizada

Muestra Ensayo Concentración Concentración Eficiencia (%)

(μg/mL) media (μg/mL)

α- Amilasa inmovilizada Blanco 0.000 0.000 ------

1 266.4090 266.8635 77.15

2 267.3181

Cloruro de calcio Blanco 0.000 0.000 ------

1 15.0454 14.1358 ------

2 13.2262 -------

Buffer fosfato Blanco 0.000 0.000 -------

1 26.6818 27.2272 -------

2 27.7727 --------
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 EFECTO DEL AGUA
Si bien algunas metodologías indican la preparación de la enzima comercial disolviendola en buffer
fosfato pH 7, según Cabral H et al, 2018 es posible disolverla en agua destilada.
Debido a que gracias al pH neutro del agua, no provoca cambios conformacionales en la enzima, sin
embargo al no adherirse a la molécula, es más complicado que pueda ocurrir el proceso de
gelificación. (Laboratorio de Genómica Viral y Humana. 2008)

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 EFECTO ALGINATO DE SODIO
La concentración a la que se pretendía llegar era 1500μg/mL en el total de las perlas. Basados en la
experiencia con la que se contaba y a partir de lo mencionado por nuestro autor Sachin Talekar y
Sandeep Chavare, (2012) la concentración optima de alginato de sodio oscila entre 1-4%,
obteniéndose los mejores resultados con el 3% (90% de eficiencia, fig. 1), si bien fue la
concentración utilizada, comparando con nuestros resultados al obtener una eficiencia del 77%,
podría deberse a otros factores que intervienen en la experimentación.

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Fig.1. Efecto de la concentración de alginato de sodio sobre el rendimiento de la
inmovilización (Sochin, B.2012)

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 EFECTO DE CLORURO DE CALCIO
El atrapamiento de enzimas en perlas depende de la
concentración de alginato de sodio e iones de calcio.
Prakash, (2011) menciona que se encontró que el cloruro de calcio a 1M tuvo la eficiencia más alta
(89%) y conforme se aumenta la concentración del cloruro de calcio, el rendimiento de
inmovilización de la α-amilasa fue
disminuido (Fig.2). Mientras (Anwar, 2009) menciona que dónde obtuvo más actividad relativa fue
con una concentración
de 0.3 M de cloruro de calcio.

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Fig.2. Efecto de la concentración de cloruro de calcio en el proceso de inmovilización
(Sochin, 2012).
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El cloruro de calcio sirve para la gelificación del alginato por su mala biodegradabilidad, confiriéndole
la resistencia y siendo el endurecedor (Arroyo, 1998). Tomando en cuenta esto, preparamos una
solución de CaCl2 0.2 M.
Comparando la molaridad utilizada de cloruro de calcio de 0.2M y basándonos en la fig.2, se
presenta una eficiencia teórica entre 60 y 70%, lo cual de acuerdo a nuestros resultados, cae dentro
del rango de rendimiento.

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 EFECTO DEL TIEMPO
Otro de los factores a considerar para el rendimiento de la inmovilización, es el tiempo en el cual se
deja reposando las perlas en el cloruro de calcio, ya que es primordial para que el gel sea fijado. (Dey
et al, 2003)
Debido a que el tiempo de reposo en el cual dejamos nuestras perlas fue de aprox 45 min, en
comparación con estudios de inmovilización, se recomienda que el tiempo óptimo de reposo, debe
debe oscilar entre los 120 min, esto reduce la fuga de enzima, y mejorar el rendimiento. (Fig. 3)

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Fig 3. Efecto del tiempo de reposo en cloruro de calcio (Sochin, 2012).

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 EFECTO BUFFER
De acuerdo con la literatura, el método de atrapamiento en gel de alginato no ocasiona cambios en
la conformación de la enzima inmovilizada (Arroyo, 1998) y la matriz de gel permite la difusión de
sustancias a través de él (Malajovich, 2017), lo cual podría provocar que parte del buffer en el cual se
encontraban almacenadas pudiera pasar a través de la matriz, puesto que las moléculas de agua
presentes en el buffer de fosfatos se adhieran alrededor de la biomolécula. (Laboratorio de
Genómica Viral y Humana. 2008)

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 Si bien, el buffer de fosfatos se han utilizado para preservar y conservar el pH del tratamiento
enzimático, los fosfatos, sin embargo, tienen el efecto secundario desafortunado de causar la
precipitación de los iones de calcio que son necesarios para la actividad completa de la fúngica y
amilasas bacterianas (Whistler et al, 1984).
Por lo cual, al no tener una adecuada gelificación, pudo haber entrado a través de la matriz y alterar
la conformación de la enzima.

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 PERLAS CONTROL
Olvidamos hacer perlas de control (blancos), las cuales nos ayudarían para la medición de las
absorbancias de las perlas. Al no contar con las mismas, tuvimos que utilizar agua destilada como
blanco.
Cabe mencionar que en la realización de una curva de calibración es muy importante efectuar la
medida del “ blanco”. Se llaman disoluciones blanco o simplemente blancos a las disoluciones que
contienen todos los reactivos y disolventes usados en el análisis, pero sin el analito. Los blancos miden
la respuesta del procedimiento analítico a las impurezas o especies interferentes que existan en los
reactivos o, simplemente, a las especiales características del instrumento de medida (Harris, 2001).
El no realizar la lectura de los blancos adecuados pudo haber afectado la lectura de todas las muestras,
dando así absorbancias erróneas.

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 DISMINUCIÓN DE ENZIMA
De igual manera, adicional a los factores antes descritos, cuando se realiza una inmovilización, usualmente suele haber
pérdidas. Si pierde la actividad enzimática, puede ser debido a (Eartan F, et al 2007):
• Las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturalización o desactivación de la enzima.
• La inmovilización puede conducir a un cambio conformacional que resulte en una inactividad
• Los grupos reactivos del soporte reaccionan con cualquier aminoácido que forma parte de

•
el centro activo o esencial para la actividad catalítica de la enzima
La conexión al soporte se produce de tal manera que permite el paso de
el sustrato al centro activo.

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BALANCE

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BIBLIOGRAFÍA

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