CROMATOGRAFÍA

Mikhail Tswett, 1906

Separación de pigmentos vegetales usando una
columna de carbonato cálcico
CROMATOGRAFÍA

Separación de los componentes

de una mezcla (muestra),
disueltos en una fase móvil a
medida que se van desplazando
con diferente velocidad a través
de una fase estacionaria
 TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS

ESTADO FÍSICO DE LAS FASES:

Fase Móvil
- Gaseosa (Cromatografía de gases)
- Líquida (Cromatografía Líquida)

Fase Estacionaria
- Líquida (inmovilizada, soporte)
- Sólida
 TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS

CRITERIOS DE SEPARACIÓN:

1. REPARTO (F. estacionaria “líquida”)

Los componentes de la mezcla se reparten entre las fases móvil
y estacionaria en función de sus características. La composición
de la fase móvil es constante.

2. ADSORCIÓN (F. estacionaria sólida)

Los componentes de la mezcla quedan retenidos sobre la
superficie de la fase estacionaria y hay que cambiar la
composición de la fase móvil para eluirlos.
 CROMATOGRAFÍA DE REPARTO

1.SOLUBILIDAD
Fase “Normal”: F. Estacionaria polar, F. Móvil apolar

Fase Reversa: F. Estacionaria apolar, F. Móvil polar

2. TAMAÑO (exclusión molecular)

Fases móvil y estacionaria líquidas idénticas
separadas por una especie de tamiz o malla
 CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

1. INTERCAMBIO IÓNICO
Fase estacionaria positiva: Intercambio aniónico
Fase estacionaria negativa: Intercambio catiónico

2. INTERACCIÓN HIDROFÓBICA
Fase estacionaria hidrofóbica

3. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD BIOLÓGICA

Fase estacionaria con ligandos inmovilizados

4. ADSORCIÓN INESPECÍFICA
hidroxiapatita, colorantes inmovilizados
 TIPOS DE CROMATOGRAFíA
Tipo de Tipo de cromatografía
interacción/reparto
Reparto Solubilidad •Fase Normal
•Fase Reversa
Tamaño •Exclusión Molecular

Interacción Electrostática •Intercambio aniónico

•Intercambio catiónico
Hidrofóbica

Afinidad biológica •Ligandos inmovilizados

•Inmunoafinidad
Afinidad inespecífica •Hidroxiapatita
•Colorantes
 FORMATO

1. COLUMNA 2. “BATCH” o TANDAS 3. SUPERFICIES PLANAS

- Sistemas manuales - Papel
- Equipos automatizados - Capa fina
(HPLC) (TLC, thin layer chromatography)
 TERMINOLOGÍA

• FASE ESTACIONARIA: (matriz, soporte cromatográfico)

componente estático de la cromatografía

• FASE MÓVIL: (eluyente) solvente que arrastra a través de la

columna los componentes de la mezcla a analizar

• ELUCIÓN: paso de fase móvil a través de una columna hasta

lograr la salida de los solutos

• ELUIDO: fase móvil que se recoge a la salida de una columna

 TERMINOLOGÍA
• CROMATOGRAMA: Perfil cromatográfico, Perfil de elución.
Representación gráfica de la cuantificación de solutos en el
eluído de una columna

• VOLUMEN DE ELUCIÓN: volumen de fase móvil que pasa a

través de la columna hasta que sale cada soluto

• VOLUMEN MUERTO: volumen de elución de una molécula que

viaja a través de la columna con la velocidad de la fase móvil,
que no experimenta ningún retraso. También se llama
VOLUMEN DE EXCLUSIÓN
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

Registrador
Solventes
(fase móvil)

Bomba(s)

COLUMNA
Detector
(UV)
Mezclador

Inyector
Colector de
fracciones
 HPLC:
High Performance Liquid Chromatography
Waters, Millipore
Perceptive BioSystems, BioCAD
SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS
MEDIANTE HPLC
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
(manual)
SEPARACIÓN DE COMPONENTES CELULARES
POR ULTRACENTRIFUGACIÓN
ELIMINACIÓN DE MOLÉCULAS PEQUEÑAS
MEDIANTE DIÁLISIS
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

Volumen de líquido
2.0
en los intersticios (Vo)

Absorbancia (280 nm)

Volumen de líquido
en las partículas (Vi)
Volumen ocupado
por la matriz (Vg)

VT = Vo+ Vi + Vg
Volumen total 0.0
20 40 60 80 100 120
de líquido (Vt)
Volumen de elución (ml)

Flujo isocrático, condiciones nativas o desnaturalizantes

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

Nombre comercial Tipo de matriz Rango tamaño

Sephadex G-50 dextran 1500 - 30000

Sephadex G-100 dextran 4000 - 150000
Sephacryl S-200 HR dextran 5000 - 250000

Ultrogel AcA 54 polyacrylamide/agarose 6000 - 70000

Ultrogel AcA 44 polyacrylamide/agarose 12000 - 130000
Ultrogel AcA 34 polyacrylamide/agarose 20000 - 400000

Bio-Gel P-60 polyacrylamide 3000 - 60000

Bio Gel P-150 polyacrylamide 15000 - 150000
Bio-Gel P-300 polyacrylamide 60000 - 400000
 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR:
Estimación de masas moleculares
Marcadores de masa molecular
2.0 25 kD Recta de calibrado
67 kD 14 kD
A280 nm

43 kD

Volumen de elución (ml)

0.0
20 40 60 80 100 120

2.0
Proteína problema
A280 nm

0.0 Log Mr
20 40 60 80 100 120
Volumen de elución (ml)
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

VENTAJAS:
• Flexibilidad en cuanto a solvente
• Condiciones poco agresivas
• Proporciona información estructural

INCONVENIENTES:
• Poco resolutiva, debido a difusión
• La muestra se diluye
• Es necesario aplicar volúmenes muy pequeños

Etapas finales de protocolos de purificación

 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR:
Columnas de “desalado”

2.0
0.3 kD
120 kD

0.0
0.2 0.4 0.6 0.8 1. 1.2

Volumen de elución (ml)

• Cambio de solvente
• Purificación de fragmentos de DNA marcados
(fragmento 200 pb: 120 kD; nucleótidos libres: aprox. 0.3 kD
INTERCAMBIO IÓNICO
 INTERCAMBIADORES IÓNICOS

FASE ESTACIONARIA: SOPORTE – GRUPO CARGADO

SOPORTES:

• RESINAS SINTÉTICAS. (P.ej. Poliestireno)

- Densidad muy alta de grupos
intercambiadores
- Muy hidrofóbicas: desnaturalización
de biomoléculas
- Eliminación de impurezas iónicas de
solventes químicos y de tampones
Purificación de agua

•POLÍMEROS NATURALES. Celulosa, agarosa

INTERCAMBIADORES IÓNICOS
 INTERCAMBIADORES IÓNICOS
Intercambiador Tipo Grupo cargado Abreviatura

CH2CH3
+
Fuerte -CH2CH2-N-CH2CH(OH)CH3 QAE
CH2CH3
De aniones Dietil-2-hidroxipropilamino etilo
CH2CH3
+
Débil -CH2CH2-N-H DEAE
CH2CH3
Dietilamino etilo

Fuerte -CH2CH2-CH2-SO3
-
SP
Sulfo propilo
De cationes -
Débil -CH2-COO3 CM
Carboxi metilo
 INTERCAMBIADORES IÓNICOS

+
carga aniónico aniónico
débil fuerte
(DEAE) (QAE)

pH
catiónico catiónico
fuerte débil
(SP) (CM)
-
 INTERCAMBIO IÓNICO

Matriz(-). Ión(+) + Soluto(+) Matriz(-) . Soluto(+) + Ión(+)

[Matriz(-) . Soluto(+)] [Ión(+)]

K=
[Matriz(-) . Ión(+)] [Soluto(+)]
 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

1. Equilibrado. Ajuste a
condiciones iniciales
+
2. Adsorción. Baja fuerza iónica.
Intercambio aniónico, pH >pI
Intercambio catiónico, pH < pI
3. Lavado. Condiciones iguales a pH
la adsorción. pI
4. Elución. Modificación de la -
fase móvil: aumento de fuerza
iónica
 INTERCAMBIO IÓNICO
GRADIENTE DISCONTINUO
0.5
2.0
Absorbancia (280 nm)

[NaCl]
(M)
----

0.0 0.0

20 40 60 80 100 120

Número de fracción
 INTERCAMBIO IÓNICO
GRADIENTE LINEAL
0.5
2.0
Absorbancia (280 nm)

[NaCl]
(M)
----

0.0 0.0

20 40 60 80 100 120

Número de fracción
 CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA

2.0 1.0

Absorbancia (280 nm)

[Sal]
(M)
- - --

0.0 0.0
20 40 60 80 100 120
Fenil-sefarosa Octil-sefarosa Número de fracción
CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA

Capacidad de facilitar interacciones hidrofóbicas

(PO4)3- > (SO4)2- > Acetato > Cl- > Br- > SCN-

(NH4)+ > K+ > Na+ > Mg2+ > Ca2+

 FORMATO

1. COLUMNA 2. “BATCH” o TANDAS 3. SUPERFICIES PLANAS

- Sistemas manuales - Papel
- Equipos automatizados - Capa fina
(HPLC) (TLC, thin layer chromatography)
 CROMATOGRAFÍA SOBRE SUPERFICIES PLANAS

- Papel
- Capa fina
(TLC, thin layer chromatography)
 CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

- Fase estacionaria: H2O retenida entre las fibras

de celulosa del papel

- Fase móvil: Solvente orgánico (mezcla)

Cromatografía de reparto, fase normal

 CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

• Aplicación de la muestra: volumen mínimo

• Desarrollo de la cromatografía: Extremo sumergido

en la fase móvil, sin tocar el punto de aplicación de la muestra.
Recipiente cerrado herméticamente. Ascendente/descendente

• Detección de las sustancias separadas:

– Directa (sustancias coloreadas o fluorescentes)
– Tinción
– Autorradiografía (compuestos radiactivos)
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

• Optimización de cromatografía en papel

• Fase estacionaria: fina capa (0.15-0.5 mm) de sólido

pulverizado sobre una superficie de vidrio, plástico o cristal.

• Celulosa, poliamida, alúmina, sílica-gel

 VENTAJAS DE LA TLC
Característica Efecto Ventaja

Elevada acción capilar Rapidez de desarrollo

Fase estacionaria
finamente dividida
Elevada superficie de
contacto f. móvil f.
estacionaria Eficiencia
cromatográfica
Ausencia de Reducida dispersión de los
estructura fibrosa solutos durante aplicación y
desarrollo Sensibilidad

Válida cualquier fase Versatilidad

estacionaria que pueda ser
pulverizada
 MÉTODOS DE TINCIÓN EN TLC
Método Aplicación Color
Inespecífico Vapores de Iodo C. orgánicos Pardo-amarillento

H2SO4 + calor C. orgánicos Negro (carbonización)

Específico 2,4- C. carbonílicos Naranja

dinitrofenilhidracina
AgNO3/OH- C. carbonílicos Marrón

Ácido iodoplatínico Bases Púrpura-negro

Verde de Ácidos Verde-amarillento

bromocresol
Ninhidrina Aminas 1rias Azul-violáceo
(aminoácidos)
Rodamina 6G Lípidos fluorescencia
 FACTOR DE RETARDO (Rf)

Frente del
solvente

soluto

Distancia migrada por el soluto

Rf =
Distancia migrada por el frente

origen
 TLC BIDIMENSIONAL

2ª dimensión
1ª dimensión

punto de
aplicación
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

+ glucose
 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

2.0
1. Equilibrado. Ajuste a condiciones
iniciales.

Absorbancia (280 nm)

2. Adsorción. Alta fuerza iónica.
Adición de
ligando libre
3. Lavado. Condiciones iguales a la
adsorción.

4. Elución.
• Competición con ligando libre
• Desnaturalización (pH,
temperatura, agentes caotrópicos)
0.0
20 40 60 80 100
Número de fracción
LIGANDOS PARA CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

Ligando Aplicación
2’,5’-ADP Deshidrogenasas dependientes de NADP+

5’-AMP Deshidrogenasas dependientes de NAD+

Arginina Serín-proteasas
Benzamidina Serín-proteasas
Calmodulina Quinasa, proteínas dependientes de calmodulina

Concanavalina A (ConA) Glicoproteínas, polisacáridos

ADN ADN y ARN polimerasas
Gelatina Fibronectina
Heparina Factores de coagulación, lipoproteínas, enzimas
específicas de ADN y ARN
Lectinas Glicoproteínas, polisacáridos
Lisina Plasminógeno, ARNr
Proteína A Anticuerpos (IgG)
Proteína G Anticuerpos (IgG)
Poli-(U), Poli-(T) Poli-(A), ARNm
Poli-(A) Poli-(U)
 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD:
PREPARACIÓN DE LA FASE ESTACIONARIA

1. Activación del soporte

2. Anclaje covalente del ligando
3. Bloqueo de grupos reactivos remanentes

NH

=
OH O + NH2-ligando O-C-NH-ligando
agarosa

agarosa
agarosa

+ CNBr
C=N
OH O OH
PROTEÍNAS DE FUSIÓN RECOMBINANTES
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
INMUNOPRECIPITACIÓN
INMUNOPRECIPITACIÓN