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ACADÉMICOS

PRÁCTICA No.6
PRUEBAS PRELIMINARES PARA BÚSQUEDA DE SANGRE EN MANCHAS.

INTRODUCCIÓN

Las evidencias más comúnmente encontradas en la escena del crimen son los restos de sangre, pelos y diferentes fluidos
corporales. Establecer su origen aporta información útil en el proceso judicial y en definitiva el hallazgo específico de sangre
humana y su posterior individualización; es por esto que las manchas encontradas se han constituido como un elemento
esencial en la solución de investigaciones judiciales.

Para caracterizar la naturaleza del fluido sanguíneo presente en una mancha se lleva a cabo pruebas preliminares como
las pruebas de orientación o tamizaje; pruebas muy sensibles que indican la posible presencia de sangre. Si las pruebas
de orientación son positivas, se continua el proceso con las pruebas de confirmación; una vez identificada la mancha de
sangre, se procede a realizar pruebas de especie como las pruebas caseth Abacard y, finaliza con las pruebas de
individualización como hemoclasificación y perfiles genéticos.

La Prueba de orientación como la de piramidón tiene un fundamento colorimétrico que a partir de reacciones químicas de
óxido-reducción permiten la detección de peroxidasas, catalasas y/o agentes óxidos reductores (como el hierro presente
en el grupo HEM de la hemoglobina), los cuales tienen la capacidad de descomponer el peróxido de hidrógeno en agua
más oxígeno; este último oxida un substrato no coloreado del tipo leucobase para transformarlo en un compuesto
coloreado. Se entiende como un resultado POSITIVO, el desarrollo de tonalidad de lila a morado sobre el soporte;
indicando la posible presencia de sangre y como una reacción NEGATIVA, la ausencia de tonalidad lila a morado; indicando
la ausencia de un fluido de naturaleza sanguínea.

Las pruebas de confirmación tienen como fin detectar toda sustancia que sea sangre. Se llaman también de certeza y
ponen de manifiesto algún elemento característico de la sangre. Pueden ser microquímicas, microscópicas, y
espectroscópicas. Las microquímicas se basan en la presencia de algunos derivados de la hemoglobina que son capaces
de formar cristales que se pueden observar al microscopio. Las más importantes son las pruebas de Takayama y Teicham.
Sin embargo, han entrado en desuso debido a su alta toxicidad; las pruebas microscópicas permiten observar elementos
formes de la sangre son útiles en manchas recientes y las pruebas espectroscópicas permiten observar el espectro de
absorción de la sangre en un aparato denominado espectrofotómetro.

Para el diagnostico de especie se han utilizado pruebas como la globulina humana que se fundamenta en una reacción
inmunológica de aglutinación indirecta. Pero actualmente la prueba más utilizada es la prueba inmunocromatográfica, a
través de un caseth, permite identificar la presencia de Inmunoglobulina G, para confirmar la presencia de sangre humana
en una muestra. La inmunocromatografía es una prueba cualitativa de confirmación, específica para sangre humana que
detecta la presencia del antígeno inmunoglobulina G presente en la hemoglobina, a través de anticuerpos monoclonales
anti-Hemoglobina humana.
En la columna del caseth se presenta una reacción de reconocimiento antígeno-anticuerpo en presencia de hemoglobina
y se puede evaluar por la formación de una banda de color rojo en la zona test (T) y en la zona control (C) confirmando
la naturaleza sanguínea de origen humano en la muestra. Si la muestra analizada no tiene presencia de sangre humana,
se identifica por ausencia de banda de color en la zona test (T) y formación de banda sólo en la zona control (C).
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Pruebas de Individualización
Se fundamentan en marcadores de tipo genético, es decir, características de la sangre que están establecidas
genéticamente, son heredables y permanecen estables a lo largo de la vida. El proceso puede comenzar con los
marcadores genéticos más sencillos, el objetivo es lograr excluir a un individuo como fuente de origen de la sangre
estudiada o no excluirlo como origen de ella con la probabilidad más alta posible. Para un diagnóstico certero se utiliza la
prueba de marcadores genéticos de tipo molecular como el ADN, siempre y cuando, la muestra sea suficiente; esté bien
conservado y exista muestra de referencia para realizar el cotejo. Uno de los primeros métodos usados para estudiar el
fluido sanguíneo en el campo de la criminalística es la clasificación de grupo sanguíneo, protocolo que se seguía antes de
2005 mediante la técnica de absorción-elusión en manchas de sangre, para descartar un indiciado de la investigación (si
no presentaba coincidencia, tanto el grupo sanguíneo de la muestra analizada como la muestra de referencia). Hoy en día,
este proceso de hemoclasificación, no hace parte de los protocolos estandarizados para analizar manchas de sangre en
los laboratorios de biología en Colombia. Sin embargo, la clasificación de grupos sanguíneos es útil para sospechosos y
manchas líquidas, específicamente las pruebas de clasificación directa que consiste en la detección de antígenos
específicos presentes en la superficie de las células sanguíneas mediante anticuerpos comerciales denominados Anti A,
Anti B y Anti D. La unión entre antígenos y anticuerpos se pone de manifiesto por la aglutinación

OBJETIVOS

Evaluar la presencia de componentes sanguíneos usando pruebas preliminares que analizan la presencia de sangre en
manchas.

Realizar las principales pruebas utilizadas para la detección de sangre en elementos materiales probatorios.

MATERIALES Y REACTIVOS PROPORCIONADOS EN EL LABORATORIO:

Placas excavadas de porcelana
Tubos Ependorf
Agua destilada, solución desinfectante y alcohol antiséptico
Ampirona (preparada en etanol)
Ácido Acético Glacial 1/3
Peróxido de Hidrógeno al 3%
Anticuerpos comerciales Anti A, Anti B y Anti D
Lancetas
Placas de hemoclasificación
Vórtex
Placas de vidrio o portaobjetos
Cassettes para confirmación de sangre humana
Pipetas pasteur

MATERIALES Y REACTIVOS PROPORCIONADOS POR EL ESTUDIANTE:

Manchas problema
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Tubo vacutainer con muestra de sangre total (un tubo para todo el salón). Intentar llevar los diferentes tipos de sangre, A,
B, AB, O
Gasas, Tijeras, pinzas, papel Kraft, sobres de papel pequeños
Papel absorbente
Palillitos

PROCEDIMIENTO

Previamente al inicio del laboratorio se debe tener una prenda o aplicador impregnados con sangre.

Tomar la muestra para el análisis:

• Registrar fotográficamente el EMP`

• Identificar en el EMP y/o EF los sitios con manchas presuntivas de contener material biológico
• Delimitar y numerar de manera indeleble (en un sitio que no interfiera con el análisis), los sitios seleccionados para
toma de muestra registrando ésta información en la Hoja de Trabajo.
• Cortar cada mancha presuntiva y depositar éstos fragmentos de tela o escobillón en los sobres de papel
previamente rotulados

Preparación de Extractos:

• Marcar los tubos ependorf para cada mancha a analizar incluyendo los controles positivos y negativos
• Agregar un trozo de la mancha (0,5x0,5 cm. Aproximadamente)
• Agregar Agua destilada (1 ml)
• Agitar.

Análisis de las muestras:

Pruebas de orientación:

• Marcar cada pozo de las láminas excavadas de porcelana con el número de la muestra que se depositará en cada
uno.
• Adicionar tres gotas de cada extracto (incluyendo los controles), en el pozo respectivo de la placa.
• Agregar tres gotas del reactivo de piramidón
• Agregar tres gotas de ácido acético
• Agregar tres gotas de Peróxido de Hidrógeno
• Realizar la lectura de cambio de color inmediatamente se adiciona el último reactivo

Prueba de diagnóstico especifico

 Leer las instrucciones de la prueba (caseth) antes de iniciar el procedimiento.

 Saque el dispositivo y desempáquelo (verifique su fecha de vencimiento).
 Tomar el gotero
 Marcar la muestra
 Tomar el gotero y según las instrucciones tomar el extracto.
 Perpendicularmente agregar al dispositivo de la muestra dos gotas del extracto.
 Esperar el tiempo indicado en las instrucciones (utilice un cronometro) no respetar el tiempo puede llevar a
falsos negativos o que la muestra se aclare por exceso de tiempo.
 Realice la lectura correspondiente de acuerdo con la formación de las líneas.

Pruebas de individualización
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Hemoclasificación en Sangre Total

Depositar en una placa de vidrio 3 gotas de sangre total y marcarlas así: a, b, RH.
Agregar a cada gota de sangre una gota del antisuero respectivo, así: anti A, anti B, anti D.
Mezclar con un palillo y buscar la aglutinación. Recuerde que la lectura es directa.

Procedimiento para realizar la

hemoclasificación

La aglutinación directa se utiliza para la detección de antígenos específicos que se encuentran naturalmente sobre la
superficie de las células sanguíneas o sobre microorganismos mediante el uso de anticuerpos casi siempre
comerciales. La unión entre antígenos y anticuerpos se pone de manifiesto por la aglutinación, es muy importante tener
en cuenta la dosis de este antígeno y anticuerpo que se ponen a reaccionar.

Prueba directa hemoclasificación: Búsqueda de Ag

SUERO ANTI-A ANTI-B GRUPO

PACIENTE SANGUINEO
1 - - O
2 +++ - A
3 - +++ B
4 +++ +++ AB
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Prueba de hemoclasificación indirecta: búsqueda de Acs:

GLÓBULOS B
A ANTIGENO ANTICUERPO GRUPO

ROJOS
SUERO
1 +++ - B ANTI -A B
2 - +++ A ANTI-B A
3 - - AyB No tiene AB
4 +++ +++ No tiene ANTI-A y B O

RESULTADOS
En el informe pericial incluir formato de solicitud de análisis, registros fotográficos y descripción de resultados

PREGUNTAS

¿Enuncie y explique otras técnicas de diagnóstico de orientación?

¿Investigue que es el grupo Bombay y cuál es su utilidad?
¿Cuáles son los principales interferentes en la prueba de orientación?

BIBLIOGRAFIA

Peñuela Arroyo Luz Estella; El papel del Bioanalista Forense frente al sistema acusatorio. Señal Editora.