UN RECORRIDO POR EL NACIMIENTO DE LA ENZIMOLOGA Y LOS ORGENES DE LA BIOQUMICA ACTUAL Juan Jos Aragn Departamento de Bioqumica de la UAM e Instituto

de Investigaciones Biomdicas Alberto Sols UAM-CSIC EN MEMORIA DE ROBERTO MARCO I. INTRODUCCIN Cuando recib la amable invitacin de Jess Lizcano a participar en el nmero-homenaje de la revista Encuentros Multidisciplinares dedicado a Roberto Marco, de la cual fue uno de sus principales impulsores, me pareci oportuno dedicar mi contribucin a recorrer con una visin de conjunto parte de los que fueron hitos esenciales en el origen del estudio de los enzimas, que supusieron de hecho el nacimiento de la bioqumica moderna. La razn de su eleccin estriba en que este tema conjunta, a mi entender, las dos vertientes definitorias de la actividad cientfica de Roberto: su inicio como historiador de la ciencia mdica -afn que siempre tuvo presente- y su desarrollo posterior como investigador seero en el mbito de la bioqumica y la biologa molecular, donde se introdujo precisamente a travs de la experimentacin sobre enzimas, para pasar luego definitivamente al campo de la biologa del desarrollo. Slo unas lneas para centrar el tema en torno al cual girar esta contribucin. Es ya de comn conocimiento que los enzimas - nombre designado por la Real Academia Espaola de la Lengua como ambiguo (Real Academia Espaola, 2001), y por tanto utilizable igualmente en masculino o femeninoson los agentes biolgicos responsables de que puedan tener lugar la mirada de procesos qumicos que median la actividad vital, o lo que es igual, la vida misma. La responsabilidad de estos agentes se asienta sobre sus elementos ms bsicos y caractersticos, su exquisita especificidad por un lado, que les permite distinguir entre la inmensa variedad de los compuestos biolgicos y de sus intercambios qumicos en el medio vivo y, por otro, su capacidad extrema de acelerar (catalizar) la velocidad de las reacciones propias de este medio hasta rangos de 105 a 1014 veces como promedio, pudiendo alcanzar incluso las 1017 veces. Esta enorme eficacia de los enzimas es la razn de la suavidad de las condiciones con que pueden acontecer los fenmenos vitales, un hecho que tanto ha llamado la atencin en biologa a lo largo del tiempo y que hizo concebir muy pronto la necesidad de la catlisis (Berzelius, 1837). De forma que la inmensa mayora de los procesos vitales necesitan ser catalizados, aun los ms sencillos. El corolario es inmediato: no hay vida sin catlisis, la cual es responsable de las caractersticas distintivas de lo vivo, como la complejidad estructural, la capacidad de extraer, transformar y utilizar la energa del medio ambiente e incluso de la que es la quintaesencia de los seres vivos, su capacidad de autorreplicacin. La aparicin de la catlisis se constituye as en el gran salto en la evolucin molecular hacia la vida. Arthur Kornberg, el maestro de Roberto Marco durante su etapa postdoctoral en los Estados Unidos, supo ilustrar bien el papel central de los enzimas en la biologa al escribir que What gives the cell its life and personality are enzymes. They govern all body processes; malfunction of even one enzyme can be fatal. Nothing in nature is so tangible and vital to our lives as enzymes, and yet so poorly understood and appreciated by all but a few scientists (Kornberg, 1989, p. 36). II. UNA CONTRIBUCIN CLAVE DE ROBERTO MARCO A LA ENZIMOLOGA DE HOY. Roberto Marco -es bien sabido por los que tuvimos la suerte de tratarle- posea una lucidez intelectual muy por encima de la media. Una prueba de ello -entre las mltiples que podran citarse1

fue que tan tempranamente como en su etapa de becario predoctoral, junto a su maestro Alberto Sols, publicasen ambos un trabajo que clarific, y en cierta medida revolucion, el conocimiento an nebuloso que por aquel entonces se tena del funcionamiento de los enzimas en dependencia de los agentes que regulan su actividad, los metabolitos (compuestos del metabolismo celular que intervienen como substratos y reguladores), en conjuncin con otras protenas, muchas de ellas enzimas a su vez. El trabajo se titul: Concentrations of Metabolites and Binding Sites. Implications in Metabolic Regulation (Sols and Marco, 1970). Con la exigencia de someterse sistemticamente a las condiciones de la fisiologa celular -tan caracterstica de Sols-, y la aplicacin estricta del anlisis cuantitativo con una visin integradora huella clara de Roberto-, este trabajo se convirti pronto en un clsico a la hora de abordar cuantitativamente las funciones celulares a travs de los enzimas que las gobiernan, sorteando los vagos anlisis cualitativos considerados hasta entonces, como indicaron los autores al principio del artculo: The rapidly increasing interest in the study of the regulation of cell functions suggests the convenience of giving up the old qualitative approach in biochemistry for a more comprehensive quatitative one, if a deeper understanding of the real cellular processes is to be obtained (p. 227). Sols y Marco afrontaron -y ensearon a los dems a solventar- el problema bsico que la concentracin de enzima, junto con la de los metabolitos y sus varios sitios ligantes, suponen para evaluar correctamente el control que estos agentes ejercen sobre la actividad enzimtica. El hecho, frecuente hasta entonces, de no analizar con claridad la magnitud de la unin de un metabolito dado a su sitio o sitios ligantes estaba en el fondo de muchos resultados inexplicados. El anlisis crtico que ellos realizaron sobre estos presupuestos supuso una forma enteramente nueva y clarificadora de abordar la regulacin metablica, llegando a conclusiones mucho mas cercanas a la realidad celular, que en no pocas ocasiones abatieron paradigmas hasta entonces aceptados como tales. Con este trabajo se plante el hecho (por primera vez con completo rigor, por extrao que hoy parezca) de que a la hora de evaluar la accin de un metabolito sobre un proceso dado (su efecto sobre un enzima), es ineludible distinguir entre la concentracin del metabolito en cada uno de sus estados: total, libre y ligado; puesto que slo el segundo tiene valor para modificar el proceso, mientras que el ltimo, adems de condicionar el anterior, impone un nivel bsico de actividad de encontrarse ya unido al enzima responsable, sin tener en cambio efecto alguno sobre el mismo de hallarse ligado a otros enzimas o protenas diferentes. Merece la pena destacar tambin la distincin que establecieron entre la concentracin molar intracelular de una protena enzimtica determinada y lo que ellos denominaron normalidad de sitios de unin para un metabolito dado, al tener en cuenta que estos sitios no siempre corresponden al nmero de subunidades de una protena, bien porque se compartan entre varias o bien porque algunas puedan permanecer inactivas; distincin tanto ms llamativa si se considera que el estudio de la estructura cuaternaria de protenas era an de muy corta edad, siendo escasas las protenas cuya estructura tridimensional se haba resuelto por entonces mediante difraccin de rayos X (abordaje siempre formidable pero verdaderamente gigantesco en aquella poca). Todas estas consideraciones, que hoy pueden parecer obvias, no lo eran as antes de la publicacin de este artculo, en el que incluyeron tambin un buen nmero de casos de enzimas y metabolitos reguladores analizados con sus nuevos presupuestos, al igual que casos de desbalances manifiestos entre las concentraciones de unos y otros agentes. Los presupuestos sobre los que desarrollaron sus anlisis, en poco tiempo se hicieron extrapolables a otros procesos bioqumicos -mas all de la estricta regulacin enzimtica-, que son dependientes de la unin de un ligante a una protena o bien de la unin de protenas diferentes entre s, de manera que este tipo de anlisis implica hoy la prctica generalidad de la regulacin biolgica. El impacto de este trabajo fue muy notable desde el principio, convirtindose pronto en cita casi obligada a la hora de realizar anlisis de regulacin metablica. Circunstancia bien conocida por los investigadores de este campo, pero que sin embargo no puede objetivarse con los sistemas actuales de
2

evaluacin de citaciones bibliogrficas, posiblemente debido a la fuente en que se public o a la forma en que el artculo fue originalmente indexado. III. LOS ENZIMAS Y EL ORIGEN DE LA BIOQUMICA MODERNA. La historia es una necesidad bsica en el ejercicio de la labor cientfica. Deca el bilogo evolucionista Ernst Mayr (1904-2005), que Actually, most scientific problems are far better understood by studying their history than their logic (Mayr, 1982, p. 6), lo que en parte recuerda la afirmacin de Aristteles de que las cosas se entienden mejor cuando uno ha logrado ver con alguna claridad como se formaron (citado en Lain Entralgo, 1978). Incluso la propia exposicin de un hallazgo o de la solucin a un problema no resuelto, en la forma habitual de una publicacin, sita al cientfico en un contexto histrico como ha sealado Herbert Friedman: Scientific papers have a time-honored way of presenting discovery in the framework of antecedents, of showing the authors or authors new ideas and observations against the background of accepted fact or established theory. Hence scientists, by consciously placing themselves in a given intellectual universe, necessarily write their own history (Friedman, 1981, p. xiv). De manera que, sin ser ni plido reflejo de historiadores profesionales, los investigadores de profesin estamos obligados a recurrir a la historia si queremos explicarnos la razn de ser de un aspecto determinado de la ciencia, y en el caso de este artculo el del origen de los enzimas, puesto que fue su descubrimiento lo que marc el inicio de la bioqumica actual. En la protohistoria de este desarrollo, un movimiento tan oscuro y complejo como la Alquimia ofrece un antecedente de inters con el empleo de los elixires. Los alquimistas, protobioqumicos se les ha llamado (Florkin, 1972) por ser los primeros en usar el laboratorio -para ellos tambin oratorio-, crean firmemente, por diversas consideraciones, en la posibilidad de la transmutacin de los metales y en particular su conversin en oro, como es conocido. Transmutacin que slo se imaginaba posible en presencia de la piedra filosofal, cuya preparacin era tarea primordial, o tambin por accin de los elixires, como se extendi entre los alquimistas europeos. Curiosamente, se consideraba a un elixir como una substancia capaz de inducir un cambio qumico con slo estar presente y que poda actuar en cantidades muy pequeas. Concepto, que como es fcil de apreciar estaba bastante cercano al trmino moderno de catalizador. Elixires a cuya bsqueda se lanzan afanosamente los alquimistas, pudiendo serlo adems cualquier substancia del laboratorio, y que tenan tambin otras connotaciones, como poseer las mximas propiedades mdicas: devolver la juventud, inducir larga vida e incluso la inmortalidad. Los trabajos de los alquimistas, aunque estriles en sus fines, condujeron no obstante a progresos en la qumica, como fue el descubrimiento del alcohol y de los cidos minerales y el desarrollo de tcnicas de laboratorio, particularmente la destilacin. En el siglo XIII la alquimia adquiere respetabilidad filosfica con Roger Bacon y, en particular, con San Alberto Magno quien emplea, quizs por primera vez, la palabra afinidad en el sentido actual al decir que "el azufre ennegrece la plata y abrasa en general a los metales a causa de la afinidad natural que tiene por ellos " (citado en Garca Font, 1976). A lo largo del siglo XIX fueron descubrindose agentes biolgicos diversos con capacidad cataltica (enzimas), algunos ya mencionados. E incluso ya en el siglo XVIII, Ren Ramur (16831757) y Lzaro Spallanzani (1729-1799) establecieron la actividad digestiva del jugo gstrico o de la saliva, mucho antes de que el fenmeno de la catlisis fuese reconocido. Pero el proceso cuyo estudio contribuy ms directamente al conocimiento de los enzimas y al desarrollo de la bioqumica moderna fue sin duda la fermentacin alcohlica, cuya naturaleza fue motivo de preocupacin prcticamente desde la antigedad, con intenso inters para los alquimistas y los adeptos a la teora del flogisto. En los siglos XVII y XVIII, las ideas circulantes sobre este proceso eran considerablemente complejas. Mentes como la de Robert Boyle (1627-1691) lo asociaban a la fiebre, por la propiedad comn de elevacin de la temperatura, y por la misma poca tambin se le lig a la digestin. Un
3

ulterior elemento a aadir fue la generacin espontnea. La fermentacin se iniciaba tambin aparentemente de la nada, lo que fue rebatido elegantemente de forma experimental por Spallanzani, aunque sus resultados fueron rechazados sin fundamento por los defensores a ultranza de la generacin espontnea. El proceso de la fermentacin no comenz a clarificarse hasta Antoine-Laurent de Lavoisier (1743-1794) con su inmensa obra qumica, a pesar de lo prematuro de su muerte, guillotinado por el Terror ["la Rpublique na pas besoin des savants" (citado en Babor e Ibarz, 1965)], pronunci el presidente del tribunal que le conden). Lavoisier mostr mediante su anlisis elemental que un simple cambio qumico, la escisin del azcar en alcohol y dixido de carbono, reemplazaba a la hasta entonces considerada como entidad misteriosa, mantenindose constante la cantidad total de materia a lo largo del proceso, y sin sufrir cambio alguno durante el mismo la levadura adicionada. Sustancia sta ltima en forma de sedimento procedente de otra fermentacin, sin la cual el proceso no tena lugar y considerada entonces como algo meramente qumico. El problema clave fue discernir las causas del proceso, la naturaleza del fermento implicado, concretndose ya este trmino en el agente responsable de la transformacin, puesto que hasta entonces se le haba dado un significado altamente vago. El inters por resolver este problema fue tal, que en el ao octavo de la Repblica Francesa (hacia 1800), el Instituto Nacional de la Ciencias y las Artes de Francia convoc un premio consistente en una medalla de un kilogramo de oro, para quien averiguara las caractersticas que distinguen las substancias que actan como fermentos de las que sufren la fermentacin (Fruton, 1972). Interrogante que equivala a formular nada menos que el problema central de la enzimologa: conocer la diferencia entre lo que ahora llamamos enzima y lo que hoy conocemos como substrato (Friedmann, 1981). El premio no lleg a concederse y fue retirado 4 aos ms tarde por falta de fondos. Gay-Lussac (1778-1850), inspirado en la conservacin domstica de alimentos, pensaba que la fermentacin se originaba por efecto del oxgeno, tras observar que al abrir botellas mantenidas cerradas conteniendo zumo de uvas, se iniciaba la fermentacin en contacto con el aire. De manera que el fermento sera formado por accin del oxgeno en el lquido. Respecto a la levadura concluy que era algo diferente del verdadero agente de la fermentacin, al que llam fermento soluble, a la vista de la naturaleza insoluble de la levadura, que permaneca como algo misterioso. Aunque ya un siglo antes, el pionero microscopista Anton van Leeuwenhoek (1632-1723) haba revelado la existencia de partculas microscpicas a modo de glbulos en los sedimentos de la fermentacin, que eran clulas de levadura, sin que entonces se reconociesen como tales. Gay-Lussac fue, no obstante, quien estableci la ecuacin de este proceso, segn la cual una molcula de glucosa es escindida en dos molculas de dixido de carbono y dos de etanol. O al menos as se acepta en trminos generales, pues no parece que esta expresin se usase de esa forma en su notacin qumica final en tiempos de Gay-Lussac (Schlenk, 1997). La demostracin de que los agentes responsables de la fermentacin son organismos vivos y concretamente levaduras, fue realizada en 1837 de forma independiente y prcticamente simultnea por tres investigadores, Charles Cagniard-Latour (1777-1859), Theodor Schwann (1810-1882) y Friedrich T. Ktzing (1807-1893). En contra de Gay-Lussac, Schwann mostr que la putrefaccin que aparece tras pasar aire al medio fermentable ya hervido, poda evitarse si el aire se calienta antes a alta temperatura, con lo que prob adems la no formacin de microorganismos por generacin espontnea. Observ Schwann que la levadura estaba presente siempre que haba fermentacin, la cual no se produca en condiciones que visiblemente mataban este organismo, como por ejemplo el calor. Esto, junto a su intuicin refiriendo que "the exciting principle in the fermentation process must be a material that is evoked and increased by the process itself, a phenomenon that applies only to living organisms" (citado en Fruton, 1972), le llev a concluir que era el desarrollo de un organismo vivo, la levadura -el hongo del azcar como l la llam ("Zuckerpilz", luego denominado Saccharomyces)-, el agente responsable de la fermentacin. Schwann contribuy adems significativamente al
4

establecimientote de la Teora Celular, considerando la clula como principio estructural y origen comn a todos los seres vivos y como unidad bsica del metabolismo, trmino acuado por l mismo. Sin embargo, la tesis de que la fermentacin alcohlica era llevada a cabo por organismos vivos encontr un fuerte rechazo, particularmente por parte de algunos de los qumicos ms influyentes, como el propio Berzelius y, especialmente, Justus von Liebig (1803-1873), que hizo contribuciones trascendentales para la qumica orgnica y que lideraba con gran poder lo que podramos llamar la "bioqumica" de entonces. Para Liebig, la fermentacin estaba relacionada con su interpretacin vitalista de la biologa. De manera que al finalizar la fermentacin, provocada por supuestas vibraciones tras la muerte de los organismos vivos una vez ausente la fuerza vital, se depositara un sedimento llamado levadura. Liebig permaneci como un convencido vitalista, rehusando creer que las levaduras estuvieran vivas. Hasta el punto de que, junto con Whler (1800-1882) -quien en 1828 sintetiz por primera vez un compuesto orgnico, la urea- escribi un panfleto annimo ridiculizando y atacando cruelmente la nocin de que la fermentacin pudiera deberse a una clula viva. Esta crtica fue particularmente sentida por Schwann, sindole adems muy perjudicial. Le impidi proseguir su actividad investigadora en Alemania, vindose obligado a exiliarse en Blgica como profesor de Anatoma de la Universidad Catlica de Lovaina y acabando de hecho con su carrera cientfica. Fue necesario esperar a la obra de Pasteur para que se hiciera justicia al hallazgo de CagniardLatour, Schwann y Ktzing. Pasteur demostr que efectivamente la fermentacin era correlativa con el desarrollo y multiplicacin de la levadura y prob la inexistencia de la generacin espontnea, lo que recibi reconocimiento general en 1872 marcando el comienzo de la moderna microbiologa (Florkin, 1972). Sin embargo, Pasteur consider insistentemente a la fermentacin como necesaria e inextricablemente ligada al mantenimiento de la levadura como clula viva. Por esta poca se haban obtenido en forma soluble diversos agentes responsables de procesos degradativos. Como la diastasa (hoy amilasa), el primer enzima purificado, por A. Payen y J.F. Persoz en 1833 extrayndolo de un extracto de malta; la sacarasa (entonces llamada invertasa), extrada de la levadura por Pierre Berthelot o la pepsina, identificada por Schwann para llamar al principio responsable de la digestin gstrica. Para estos agentes se acu el trmino de fermentos solubles (trmino ya utilizado por Gay-Lussac, aunque con sentido diferente) o desorganizados, frente a los llamados fermentos insolubles para aquellas actividades degradativas que no podan ser extradas de organismos vivos, como la propia fermentacin alcohlica, y que seran por ello los propios organismos como tales, por lo que tambin se les denomin fermentos organizados. Por aquel entonces, a mediados del siglo XIX, los fermentos conocidos como solubles, generalmente con actividades de carcter hidroltico, fueron considerados como catalizadores qumicos, segn el trmino ya acuado por Berzelius. Lo que estuvo en disputa fue la cuestin de si existiran catalizadores similares en las clulas de levadura, que seran entonces los responsables de la fermentacin de los azcares (Fruton, 1992). Esta fue la postura de Berthelot (1827-1907), proponiendo que este proceso resultara de la produccin por los organismos vivos de fermentos similares a los solubles, que actuaran como autnticos reactivos qumicos, por lo que el camino a seguir pasaba por reproducir el mismo fenmeno con medios qumicos e interpretarlos en trminos exclusivamente mecnicos. Postura, pues, directamente enfrentada a las ideas de Pasteur, para quien los verdaderos fermentos eran los seres organizados. La posicin de Berthelot fue fortalecida por Claude Bernard (1813-1878), cuyas observaciones sobre la digestin y particularmente sobre la degradacin del glucgeno por un extracto heptico, le hicieron rechazar la idea de que un proceso de degradacin qumica, como la conversin de azcar en alcohol y dixido de carbono, fuese correlativo con la vida. E igualmente coincidente con estas ideas fue Moritz Traube (1826-1894), defendiendo la naturaleza qumica de los fermentos e incluso
5

anticipando de forma clarividente que el fracaso en aislarlos a partir de microorganismos poda deberse a su alteracin o inactivacin (Kornberg, 1989). Como veremos ms adelante, la postura de Pasteur, aunque errnea, no estuvo falta de apoyo experimental. En este marco, Willy Khne (luego Wilhelm Friedrich Khne; 1837-1900) -quien introdujo las palabras miosina y tripsina para las respectivas substancias que l mismo descubri-, acua en 1876 la palabra enzima, del griego en zme, en la levadura, en el sentido de encontrado en la levadura, y por ende extrado de ella, describiendo el objetivo que persigui con ello como "I took the liberty of giving the name enzymes to some of the better known substances that many call unorganized ferments" (Khne, 1877, p. 170). O sea, no para denominar por igual a los dos tipos de fermentos que entonces se distinguan, como en alguna ocasin se ha referido (Segel, 1993), sino para llamar a los fermentos desorganizados o solubles, reconocidos como agentes qumicos, con el fin, pues, de perpetuar la distincin con los fermentos organizados, a los que Khne consideraba -al igual que muchos entonces-, radicalmente distintos y estrictamente correlativos con las clulas vivas, enfatizando as su carcter biolgico frente al qumico de los fermentos solubles. Bien es verdad que ms tarde, el propio Khne sugiri que se llamase enzimas a todos los fermentos, pero esta propuesta no tuvo entonces repercusin (Gutfreund, 1976). Resulta irnico que el trmino ms antiguo de fermento, cuando no implicaba distincin alguna, e incluso en parte el de los elixires de los alquimistas, est mucho ms cercano al concepto actual de enzimas como agentes biocatalizadores -qumica y biolgicamente relacionados, que actan sobre reacciones diferentes- que este nuevo trmino en el sentido con que fue acuado (Friedmann, 1981). En realidad, la vieja expresin de fermento haca igualmente referencia a la levadura, a la que de hecho se llam as desde antiguo, derivndose del latn fervere, hervir, por alusin a la naturaleza agitante de los lquidos en fermentacin (Corominas y Pascual, 1980). En medio de la polmica entonces planteada, no resulta extrao que la nueva palabra de enzima no fuese bien recibida por muchos (Friedmann, 1997). Entre otros, fue rechazada enrgicamente por Felix Hoppe-Seyler (1825-1895) -quien acu el trmino bioqumica en 1877 (Florkin, 1972) e inici los primeros intentos de independencia respecto de la fisiologa-, manteniendo, al igual que Traube y Berthelot, que las fermentaciones eran procesos qumicos que tenan que tener solamente causas qumicas. En este contexto, es de mencionar que aunque, ciertamente, Emil Fischer utiliz la palabra enzima en 1894 en su clsico trabajo sobre el modelo de la llave y la cerradura al explicar la especificidad de substrato de los enzimas (Fischer, 1894)-, al igual que OSullivan y Tompson -en su tambin clsico estudio sobre la formacin del complejo enzima-substrato (OSullivan y Tompson, 1890)-, en ambos casos lo hicieron para referirse a actividades enzimticas (glicosidasas, invertasa) que se extraan de la levadura, y por ello consideradas entonces como fermentos desorganizados. As las cosas, en 1897 tiene lugar un descubrimiento absolutamente trascendental para la historia de la bioqumica. Eduard Buchner (1860-1917), en el laboratorio de su hermano Hans en Munich y con la ayuda de Martin Hahn, descubre de forma accidental que un extracto de levadura es capaz de llevar a cabo la fermentacin alcohlica. Hans Buchner pretenda usar los extractos para estudios inmunolgicos y con objeto de mejorar su preservacin, Martin Hahn sugiri aadirles sacarosa a alta concentracin, pensando en su uso domstico como conservante. Y fue Eduard Buchner el que interpret el fenmeno al percatarse de la fermentacin en esas condiciones. El descubrimiento fue un ejemplo paradigmtico de lo que en medios anglosajones se conoce como serendipidad (del ingls serendipity). Palabra de gran valor en investigacin cientfica -no aceptada an en nuestro idioma-, que fue acuada en el siglo XVIII por Horace Walpole (1717-1797), tras leer un cuento titulado El Viaje de los Tres Prncipes de Serendip (la isla de Ceiln, la actual Sri Lanka), publicado en Venecia en el siglo XVI, narrando los mltiples descubrimientos fortuitos que hacan estos prncipes gracias a su sagacidad (Remer, 1965). Walpole us esta palabra para llamar al
6

hecho de encontrar algo nuevo, no por casualidad, sino cuando se va buscando otra cosa diferente, como de hecho ha ocurrido en muchos hallazgos cientficos. El descubrimiento de Buchner fue producto de una mejora tcnica; l y Martin Hahn haban perfeccionado el procedimiento de rotura de las levaduras, obteniendo extractos que estaban libres de clulas. De hecho, intentos de averiguar si un extracto de levadura fermentaba ya los haban hecho otros, pero sin xito real por la contaminacin celular de las preparaciones. Por ejemplo el mismo Pasteur, Berthelot o Claude Bernard, quien crey haberlo conseguido. En el caso de Pasteur, parece ser que adems utiliz una cepa de levadura menos adecuada que la de Buchner (Friedmann, 1997), y cuya invertasa -el primer enzima de la fermentacin, encargado de romper la sacarosa- no soportaba el procedimiento de preparacin del extracto, segn se revel mucho ms tarde del examen de sus protocolos de trabajo (Kornberg, 1989). Fueron tambin dificultades tcnicas -que impidieron a algunos repetir el experimento de Buchner-, lo que hizo que este trabajo no fuese aceptado desde el principio, amn del conservadurismo hacia las ideas de Pasteur, rechazndose con ello que pudieran existir enzimas intracelulares (Florkin, 1975; Fruton,1992). Paradjicamente, fue un discpulo de Pasteur, Emile Duclaux -quien le sustituy como director del Instituto Pasteur- el que de forma ms convincente acept el hallazgo de Buchner. Este descubrimiento tan notable -cuyo impacto trascendi las fronteras de la biologa (Friedmann, 1997)- acab, pues, con la postura de Pasteur, zanjando la polmica en torno a la necesidad de la clula viva para que la fermentacin tenga lugar y terminando as con la distincin entre fermentos organizados y desorganizados. Sin embargo, Buchner se guard de llamar enzima al agente responsable de la fermentacin y le denomin zimasa, a la vista de que, como l mismo refiri, los enzimas eran meramente agentes hidrolticos [ordinary enzymesare merely hydrolyzing agents (Buchner, 1897, p. 30)], puesto que ese era el tipo de agentes para los que -como hemos visto- se acu ese trmino, mientras que la fermentacin alcohlica era claramente un proceso de mayor complejidad (Buchner, 1897). Fue esta la razn por la cual la palabra enzima no fue universalmente aceptada hasta bien entrado el siglo XX. Todava en los aos 1930, y por lo mismo, nada menos que Warburg, el bioqumico de ms prestigio de su poca, rehusaba hablar de enzimas refirindose a ellos como fermentos (con el trmino alemn de Fermente) (Fruton, 1992). Pero como no es infrecuente en ciencia (el nihil novum sub sole de los latinos citando a Salomn) -y no se escap a los escrutinadores sagaces de la historia-, Buchner tuvo un predecesor: la investigadora rusa Maria Manasseina (1843-1903). Quien a poco de aparecer el trabajo de Buchner reclam la primaca del hallazgo, en base a la publicacin de su tesis doctoral en 1872 (25 aos antes) describiendo que la fermentacin alcohlica era posible en una suspensin carente de clulas vivas de levadura tras haber sido destruidas por calor, de cuya gran significacin supo percatarse (Lagnado, 1992). Sin embargo, la publicacin de Manasseina apenas tuvo trascendencia en su momento y no pas de ah. La polmica con Buchner tampoco tuvo, al parecer, mayor prolongacin. La mejor elaboracin del trabajo de Buchner, tanto a nivel experimental como en la discusin de sus importantes y mltiples implicaciones, al igual que su rpida difusin y el hecho tambin de que Manasseina abandon pronto su investigacin le priv a sta ltima del impacto formidable que el hallazgo del primero goz casi de inmediato. El descubrimiento de Buchner supuso el nacimiento de la enzimologa y por ende el de la bioqumica moderna, abriendo la clula para hacerla asequible al estudio de sus funciones; en curiosa coincidencia con el descubrimiento por Joseph J. Thomson (1856-1940) en 1897 de la primera partcula subatmica, el electrn, es decir, con lo que metafricamente puede considerarse como la apertura del tomo. A partir de aqu, el extracto libre de clulas se constituy en el mtodo bsico para el estudio qumico de los seres vivos. Los extractos celulares suministraron el primer puesto de observacin de un fenmeno y el punto de partida para el aislamiento y purificacin del enzima o
7

enzimas responsables, para poder investigar luego su funcin cataltica, la forma de regulacin de su actividad, su asociacin con otras enzimas y estructuras celulares y, eventualmente, el estudio de la base molecular de su funcin. La era de los cazadores de enzimas, como les llam Arthur Kornberg (Kornberg, 1989), estaba abierta. Sirva esta aportacin sencilla de contribucin al homenaje a quin adems de investigador preclaro fue compaero enriquecedor y entraable amigo, con el que compart entusiasmo ante muchos de los logros de la investigacin biolgica e ilusiones por el deber ser de nuestra Universidad, a ms de una particular aficin a la historia del conocimiento cientfico. REFERENCIAS Babor, J.A. e Ibarz, J. (1965): Qumica General Moderna. Marn. Barcelona. Berzelius, J.J. (1837): On a so far rarely observed force which is probably active in the formation of organic substances. Reimpresin abreviada en ingls de "Ueber eine, bei der Bildung organischer Verbindungen wirksame, bis jetz wenig bemerkte Kraft" in Lehrbuch der Chemie, Arnoldische Buchhandlung, Vol. 6. En: Benchmark Papers in Biochemistry, Vol. 1, Enzymes (Friedmann, H.C. ed.) p. 129-132. Hutchinson Ross. Woods Hole, Massachusetts, 1981. Buchner, E. (1897): Alcoholic Fermentation Without Yeast Cells. Reimpresin abreviada en ingls de "Alkoholische Ghrung ohne Hefezellen (Vorlufige Mitteilung)" Dtsch. Chem. Ges. Ber. 30: 117-124. En Great Experiments in Biology (Gabriel M.L. and Fogel, S. eds.) p. 27-30. PrenticeHall. Englewood Cliffs, New Jersey, 1955. Corominas, J. y Pascual J.A. (1980): Diccionario Crtico Etimolgico Castellano e Hispnico, Vol. 1. Gredos, Madrid. Fischer, E. (1894): Influence of configuration on the activity of enzymes. Chem. Soc. J. (Trans.) 57: 834-931. Reimpresin en ingls de "Einfluss der Configuration auf die Wirkung der Enzyme in Dtsch. Chem. Ges. Ber. 27: 2985-2993. En: Benchmark Papers in Biochemistry, Vol. 1, Enzymes (Friedmann, H.C. ed.) p. 217-223. Hutchinson Ross. Woods Hole, Massachusetts, 1981. Florkin, M. (1972): A history of Biochemistry, Part I Proto-Biochemistry, Part II From ProtoBiochemistry to Biochemistry. Comprehensive Biochemistry, Vol. 30. Elsevier. Amsterdam. Florkin, M. (1975): A History of Biochemistry, Part III History of the Identification of the Sources of Free Energy in Organisms. Comprehensive Biochemistry, Vol. 31. Elsevier. Amsterdam. Friedmann, H.C. (1981): Benchmark Papers in Biochemistry, Vol. 1, Enzymes. Hutchinson Ross. Woods Hole, Massachusetts. Friedmann, H.C. (1997): From Friedrich Whlers urine to Eduar Buchners alcohol. En: New Beer in an Old Bottle. Eduard Buchner and the Growth of Biochemical Knowledge (Cornish-Bowden, A. ed.) p. 67-122. Universitat de Valncia. Fruton, J.S. (1972): Molecules and Life: Historical Essays on the Interplay of Chemistry and Biology. John Wiley and Sons. New York. Fruton, J.S. (1992): A Skeptical Biochemist. Harvard University Press. Cambridge, Massachusetts. Garca Font, J. (1976): Historia de la Alquimia en Espaa. Editora Nacional. Madrid. Gutfreund, H. (1976): Wilhelm Friedrich Khne; an appreciation. FEBS Lett. 62 suppl.: E1-E2. Kornberg, A. (1989): For the Love of Enzymes. The Odyssey of a Biochemist: Harvard University Press. Cambridge, Massachusetts. Khne, W. (1877): Experiences and remarks on enzymes and ferments. Reimpresin abreviada en ingls de "Erfahrungen und Bemerskungen ber Enzyme und Fermente" Physiol. Inst. Univ. Heidelberg Unters. 1: 291-324. En Benchmark Papers in Biochemistry, Vol 1, Enzymes (Friedmann, H. C. ed.) p. 170-171. Hutchinson Ross. Woods Hole, Massachusetts, 1981. Lagnado, J. (1992): Was the First Biochemist a Woman? The Biochemist 14(5): 21-22. Lan Entralgo, P. (1978): Historia de la Medicina. Salvat. Madrid. Mayr, E. (1982): The Growth of Biological Thought: Diversity, Evolution, and Inheritance. Harvard University Press. Cambridge, Massachusetts.
8

OSullivan, C. y Tompson, F.W. (1890): Invertase: A contribution to the history of an enzyme or unorganised ferment. Chem. Soc. J. (Trans.) 57: 834-931. Reimpresin abreviada en Benchmark Papers in Biochemistry, Vol. 1, Enzymes (Friedmann, H.C. ed.) p. 208-216. Hutchinson Ross. Woods Hole, Massachusetts, 1981. Real Academia Espaola (2001): Diccionario de la Lengua Espaola. Vigsimo segunda edicin. Madrid. Remer, T.G. (1965): Serendipity and the Three Princes. From the Peregrinaggio of 1557. (Remer, T.G. ed.) University of Oklahoma Press. Norman. Schlenk, F. (1997): Early research on fermentation. A history of missed opportunities. En: New Beer in an Old Bottle. Eduard Buchner and the Growth of Biochemical Knowledge (Cornish-Bowden, A. ed.) p. 43-50. Universitat de Valncia. Segel, I.H. (1993): Enzyme Kinetics. Behaviour and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems. John Wiley & Sons, New York. Sols, A. y Marco, R. (1970): Concentrations of Metabolites and Binding Sites. Implications in Metabolic Regulation. Curr. Top. Cell. Regul. 2: 227-273.