Universidad de San Carlos de Guatemala

Facultad de Agronomía
Área de Ciencias
Subárea de Ciencias Químicas
Laboratorio de Bioquímica
Jueves/Vespertina
Jacqueline Sucely Ovando Tubac 201503355

Estudio cuantitativo de proteínas por

espectrofotometría

1. Introducción

Para poder realizar cualquier estudio biomolecular es necesario poner en práctica

diferentes técnicas que permitan cuantificar y cualificar a nivel bioquímico, siendo
uno de los métodos más sencillos para la caracterizar de forma físico-química es la
espectrofotometría. La utilización de esta práctica ayuda a conocer cuál es la
concentración de un compuesto en solución partiendo de la cantidad de luz que
absorbe, despide o dispersa un objeto en diferentes longitudes de onda de luz visible
y no visible.

Para la realización de la práctica de laboratorio fue necesario la utilización de un

simulador virtual para realizar la cuantificación de proteínas, también fueron
realizados análisis cualitativos y cuantitativos entre la absorbancia y la
concentración, respondiendo a una hoja de trabajo de ejercicios de las actividades
anteriormente mencionadas.

2. Objetivos Específicos:
✓ Conocer la relación entre absorbancia y transmitancia.
✓ Conocer los diferentes métodos para la cuantificación de las proteínas

Marco Teórico

Uno de los métodos analíticos más utilizados, la espectrofotometría, se basa en la

relación entre la absorción de luz de un compuesto y su concentración. Cuando la luz
monocromática (una longitud de onda) cae sobre un medio homogéneo, parte de la
luz incidente es absorbida por el medio y parte es transmitida, debido a la intensidad
de la luz, disminuye de Po a P, donde Po es la intensidad. es la intensidad de la luz
incidente y P es la luz transmitida. Según el compuesto a medir y el tipo de
absorbancia, la muestra puede estar en fase líquida, sólida o gaseosa. En las regiones
visible y ultravioleta del espectro electromagnético, las muestras generalmente se
disuelven para formar soluciones. Cada sustancia tiene su propio espectro de
absorción, que es una curva que indica la cantidad de energía radiante absorbida por
la sustancia en cada longitud de onda del espectro electromagnético, es decir, en una
determinada longitud de onda de energía radiante y absorción, es decir, longitud de
onda dada A una determinada longitud de onda de energía radiante, cada sustancia
absorbe una cierta cantidad de radiación que es diferente de la radiación absorbida
por otro compuesto

1. Ley de Lambert:

Esta ley establece que cuando pasa luz monocromática por un medio homogéneo, la
disminución de la intensidad del haz de luz incidente es proporcional al espesor del
medio, lo que equivale a decir que la intensidad de la luz transmitida disminuye
exponencialmente al aumentar aritméticamente el espesor del medio absorbente.

2. Ley de Beer:

La intensidad de un haz de luz monocromática disminuye exponencialmente al

aumentar aritméticamente la concentración de la sustancia absorbente, cuando este
haz pasa a través de un medio homogéneo.

La relación matemática que da cuenta de esta ley se muestra a continuación:

P / P0 = e -k’c

donde :

Po : Intensidad de la luz incidente P : Intensidad de la luz transmitida

c : Concentración de la solución

k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de onda

de la luz incidente, de la

concentración de la solución, y frecuentemente, de la naturaleza del medio.

Ambas leyes se combinan en una sola, generando la Ley de Lambert-Beer

log P0 / P = a b c ó A=abc

A = log P0 / P = - log T

donde :

a : Absortividad b : Longitud o espesor del medio (longitud de la cubeta)

c : Concentración de la solución P/Po= T : Transmitancia

Absorbancia(A) : Se define como la cantidad de energía radiante absorbida por una

sustancia pura o en solución. Matemáticamente, corresponde al logaritmo negativo
de la transmitancia.T, transmitancia expresada como fracción decimal %T,
transmitancia

expresada como porcentaje.

A = - log T = 2 – log %T

Pero.

T = P / P0 = 10-abc

Luego

A = - log ( P / P0 ) = - log 10-abc

A=abc

Esta ecuación establece que la absorbancia es una función lineal de la concentración,

donde a es una constante de proporcionalidad llamada absorbancia. El tamaño
depende de las unidades b y c. Si la concentración c se expresa en moles por litro y la
longitud de la cubeta b se mide en centímetros, entonces la constante a se denomina
absorbancia molar (ξ). DespuésA = ξ b c

Mediciones de transmitancia y absorbancia.

Las mediciones de absorbancia o transmitancia se hacen por comparación entre la

muestra problema y un estándar arbitrario o referencia. Como la referencia debe
poseer un porcentaje de transmitancia de 100%, esta es llamada referencia de 100%.,
o una absorbancia de cero.
 3. Resultados

Hoja de trabajo práctica 3.

Estudio cuantitativo de proteínas
Nombre Carné

Jacqueline Sucely Ovando Tubac 201503355

Instrucciones: Realice la siguiente hoja de trabajo. Deje constancia de sus cálculos en

donde sea necesario. Evite copiar textos donde se le solicita analizar. Adjunte el
archivo en formato pdf previo al día y hora límites indicadas en el aula virtual.

SERIE I (30 pts)

Instrucciones: Responda los siguientes cuestionamientos en base al video
https://youtu.be/MPWLQxa0Eio .

a) ¿Cuál es el valor de la absorbancia y la transmitancia de la solución F y A?

Incluya el uso de la fórmula 2 - log(transmitancia) y compare resultados.

Muestra Absorbancia Transmitancia

A 0.01 98
F 0.01 97

A= 2-Log (98) = 8x10-3

F= 2-Log (97) = 0.01

b) Describa el procedimiento realizado para la calibración del espectrofotómetro.

Se rota el botón de interruptor de corriente y control cero se gira en sentido de las

agujas del reloj, posterior se enciende la luz piloto y se debe de esperar entre 5-10
min para que se caliente y logre la estabilización, la aguja de transmitancia se coloca
en cero, girando el botón de interruptor de corriente y control cero. Luego del ajuste
ya se pueden colocar las muestras.

c) ¿De qué se compone la muestra No? 2, 3, y 5? Indique sustancia y el objetivo

de ellas.

(9.5 ml de Sulfato de sodio al 26% + 0.5 ml de solución de proteína)+ Reactivo

de Biuret

No.2 2 ml Solución ((9.5 ml de Sulfato de

sodio al 26% + 0.5 ml de solución de
proteína) + 8 ml Reactivo de Biuret
No.3 2 ml Solución ((9.5 ml de Sulfato de
sodio al 26% + 0.5 ml de solución de
proteína) + Biuret
No.5 2 ml Solución ((9.5 ml de Sulfato de
sodio al 26% + 0.5 ml de solución de
proteína) +Biuret

La prueba de biuret se utiliza para determinar la la presencia de un enlace peptídico

en una sustancia, esta va reaccionar cuando haya al menos 2 enlaces peptídicos
reaccionando, produciendo un color violeta cuando se trata con un sulfato de cobre
alcalino o sulfato de cobre alcalino. Sí la muestra se mantiene de color azul, no hay
proteínas; su resultado será negativo. Por otro lado, al haber un cambio y su
coloración es purpura o violeta, esta indica la presencia de proteínas, la intensidad va
a depender
Del numero de complejos péptido-cobre (Aryal, 2020)

SERIE II (70pts)
Instrucciones: Diríjase al simulador virtual
http://biomodel.uah.es/lab/abs/espectro.htm y de acuerdo a la visto en el laboratorio,
realice las siguientes actividades (también puede guiarse en el panel de instrucciones
presentes en el simulador). Trabaje de manera clara, ordenada y legible cada uno de
los aspectos.

ACTIVIDAD I Relación entre absorbancia y concentración utilizando el reactivo para-

nitrofenol (pNF).

Cuadro 1. Resultados obtenidos de la relación entre absorbancia y concentración.

Muestra mL de mL de agua mL total Absorbancia Concentración
pNF
1 1 2 3 0.543 20.25
2 2 1 3 1.070 39.9
3 3 0 3 1.6 60

0.543(60)
= 𝟐𝟎. 𝟐𝟓
(1.609)

1.070(60)
= 𝟑𝟗. 𝟗
(1.609)

1.6(60)
= 𝟔𝟎
(1.609)

a) Análisis cualitativo (10 puntos):

Observe los resultados obtenidos y la relación entre el color de las cubetas y el valor
de la absorbancia, explique con base científica esta relación (cite la autoría).

Ley de Lambert-Beer expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de

longitud de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución:
A = log I/Io = ε·c·l
La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración –a
mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas-; también depende
de la distancia que recorre la luz por la solución –a igual concentración, cuanto mayor
distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará-; y por último,
depende de ε, una constante de proporcionalidad -denominada coeficiente de
extinción- que es específica de cada cromóforo. (Reyes, s.f)

El p-nitrofenol, posee un color amarillo característico en disolución alcalina, con un

máximo de absorbancia a 400 nm, como muchos otros Algunas sustancias disueltas
presentan determinados colores porque absorben luz de ciertas longitudes de onda
comprendidas entre 400 nm y 700 nm (región visible del espectro) y dejan pasar luz
de otras longitudes de onda.

El cuadro no. 1 nos muestra que entre mas alta sea la concentración de p-nitrofenol
más alto será el valor de la absorbancia, el color en las cubetas también demuestran
que esto se debe a que la proporción de luz que se absorbe se ve afectada por el
número de moléculas con las que interactúa lo que quiere decir que la ley de Lambert-
beer si se cumple.

b) Análisis cuantitativo (10 puntos):

Calcule la concentración de pNF en la mezcla final de cada cubeta, sabiendo que la
concentración en la botella es de 61 µM pNF. Realice una curva en excel ponderando
los resultados de concentración frente absorbancia.

0.543(61)
= 𝟐𝟎. 𝟓𝟖
(1.609)

1.070(61)
= 𝟒𝟎. 𝟓𝟔
(1.609)

1.6(61)
= 𝟔𝟎. 𝟔𝟔
(1.609)
ACTIVIDAD II Fundamento de un ensayo de cuantificación de proteínas (ensayo de
Bradford)
Cuadro 2. Resultados del ensayo de cuantificación de proteínas (ensayo de Bradford)
Muestra Absorbancia Concentración de
proteínas
Blanco 0.564 150 3 ml de proteína
1 0.190 50.53 1 ml proteína + 2 ml de
reactivo
2 0.370 98.40 2 ml de proteína + 1 ml de
reactivo
0.016 4.26 3 ml de reactivo
3

Procedimiento :
0.190(150)
= 𝟓𝟎. 𝟓𝟑
(0.564)

0.370(150)
= 𝟗𝟖. 𝟒𝟎
(0.564)

0.016(150)
= 𝟒. 𝟐𝟔
(0.564)
a) Análisis cualitativo (15 puntos): Observe los resultados obtenidos y la relación
entre el color de las cubetas y el valor de la absorbancia, explique con base
científica esta relación (cite la autoría).

El método, descrito por primera vez por el Dr. Marion Bradford en 1976, se basa
en una reacción colorimétrica de proteínas con un tinte, Coomassie Azul
Brillante G-250. Las proteínas se unen al tinte en un ambiente ácido.,
induciendo un cambio espectral del color marrón (absorbancia máxima a 465
nm) al azul (absorbancia máxima a 610 nm). Las interacciones hidrófobas e
iónicas con las proteínas de la muestra estabilizan la forma aniónica del tinte.,
provocando un cambio de color visible (ALTERVISTA, 2021)

El color azul desarrollado es proporcional al contenido de proteína y puede

medirse espectrofotométricamente a 595 nm, la longitud de onda donde la
diferencia de absorbancia entre las dos formas coloreadas del tinte es mayor.

En el cuadro no.2 se muestran los resultados del método de Bradford, si nos

damos cuenta al contenido de proteína el color aumenta su intensidad ,
respecto a la cantidad de ella que contenga. Entre menos proteína y mas
reactivo de Bradford estén en los recipientes la longitud de onda será menor y
con ella disminuirá el color.

b) Análisis cuantitativo (15 puntos): calcule la concentración de proteínas en la

mezcla final de cada cubeta, sabiendo que la concentración en la botella es de
364 mg/L. Realice una curva de sus resultados en excel representando
concentración vs absorbancia.

0.190(364)
= 𝟏𝟐𝟐. 𝟔𝟐
(0.564)
 0.370(364)
= 𝟐𝟑𝟖. 𝟕𝟗
(0.564)

0.016(364)
= 𝟏𝟎. 𝟑𝟐
(0.564)

Uso de la curva patrón (20 puntos)

Haga uso de su curva realizada en el inciso anterior (ensayo de Bradford) y determine

la concentración de proteínas a partir de los siguientes datos de transmitancia (Utilice
la fórmula 2 – log(transmitancia)). Inserte la curva realizada y especifique de forma
clara y ordenada cómo obtuvo los resultados.

Muestr Transmitancia Concentración de

a proteínas

1 98 2.00

2 97 2.01
 3 99 0.00

4. Bibliografía

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Lara Gordillo, J. D. J., & Pérez Cruz, A. (2017). SISTEMA MECATRÓNICO PARA PROCESO DE
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Rebollo Sandoval, H. (2020). Determinación del comportamiento óptico y térmico de la resina de

pino para la elaboración de un recubrimiento de bajo costo para aplicaciones solares.