UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS

Determinación de residuos de sulfadiazina en leche cruda transportada por la

Asociación de Transportistas de Leche Cruda (ASOLECRUM) del cantón
Cayambe mediante Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC)

Trabajo de investigación presentado como requisito previo para la obtención del título
de Químico de Alimentos

Autor: Espinoza Bravo Miller Angel

Tutora: Ana María Hidalgo Almeida

DMQ, octubre 2018

 DEDICATORIA

A mis padres Miller y María.

A mis hermanas Judith y Adriana.
A Amelia, quien llegó en el mejor momento de nuestras vidas.

i
 AGRADECIMIENTOS
A la MSc. Ana María Hidalgo, tutora de la presente investigación y guía
profesional durante el proceso de desarrollo de esta.
A los miembros del tribunal, MSc. Wilson Parra y MSc. David Chuquer por su
aporte en mi formación académica, así como en el presente trabajo de investigación.

Al personal técnico del Laboratorio OSP, en especial al Dr. Yandri Infante y Dr.
Geovanny Garófalo por su aporte y ayuda constante en el cumplimiento satisfactorio de
los objetivos de la presente investigación.

Al Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública – INSPI por su

contribución como parte del patrocinio del presente trabajo.
A la Asociación de Transportistas de Leche Cruda del Cantón Cayambe –
ASOLECRUM por haber permitido su participación en la presente investigación.
A mi alma mater, la Universidad Central del Ecuador, a la Facultad de Ciencias
Químicas, y de manera especial a sus docentes MSc. Lorena Goetschel, Ing. Milene Díaz
e Ing. Irma Gonza, por fomentar la investigación y despertar siempre mi inquietud y
creatividad.
Agradezco de manera infinita a mis padres, Miller y María, pilares fundamentales
de nuestro hogar, quienes con su ejemplo me han demostrado que todo llega a su tiempo
y que con esfuerzo, ingenio y dedicación todo es posible. A mis hermanas Judith y
Adriana, por su gran ejemplo y su manera única de animarme en los momentos más
difíciles. A mi sobrina Amelia, la pequeñita que llegó a unir más nuestra familia, a alegrar
nuestros días y llenarlos de risas y felicidad.

A mis amigas, Diana y Alina, quienes han estado siempre apoyándome con sus
consejos aun cuando nuestras vidas en la universidad tomaron caminos diferentes. A mis
amigas Shirley, Alexandra y Mishel, con quienes supe compartir el mayor tiempo posible
durante nuestra formación académica y que a pesar de los altibajos nunca se alejaron;
como un gran personaje de la historia pronunció “Los verdaderos amigos se tienen que
enfadar de vez en cuando.”

A mis compañeros universitarios y de laboratorio, por su ayuda, ideas y

conocimientos compartidos durante toda la carrera y en el desarrollo de la investigación.
A todas las personas que de alguna manera aportaron significativamente en la
realización del presente trabajo de investigación. Muchas gracias.

“Maravillarse es el primer paso para un descubrimiento.”

Louis Pasteur

ii
iii
iv
v
 LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN
El proyecto de investigación “Determinación de residuos de sulfadiazina en leche
cruda transportada por la Asociación de Transportistas de Leche Cruda (ASOLECRUM)
del cantón Cayambe mediante Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC)”, se
realizó en Quito DM, en el laboratorio de Oferta de Servicios y Productos (OSP), Área
de Alimentos de la Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Central del Ecuador.

vi
 ÍNDICE DE CONTENIDOS

Resumen .......................................................................................................................... xi
Abstract........................................................................................................................... xii
Introducción ...................................................................................................................... 1
Capítulo I .......................................................................................................................... 3
El problema....................................................................................................................... 3
1.1 Planteamiento del problema .................................................................................... 3
1.2 Formulación del problema ...................................................................................... 4
1.2.1 Preguntas de investigación. .............................................................................. 4
1.3 Objetivos ................................................................................................................. 5
1.3.1 General. ............................................................................................................ 5
1.3.2 Específicos. ...................................................................................................... 5
1.4 Justificación e importancia ..................................................................................... 5
Capítulo II ......................................................................................................................... 7
Marco teórico.................................................................................................................... 7
2.1 Antecedentes de investigación ................................................................................ 7
2.2 Fundamentación teórica .......................................................................................... 8
2.2.1 Leche. ............................................................................................................... 8
2.2.2 Antibióticos. ................................................................................................... 10
2.2.3 Sulfonamidas. ................................................................................................. 14
2.2.4 Sulfadiazina. ................................................................................................... 15
2.2.5 Límite Máximo de Residuos. ......................................................................... 16
2.2.6 Antibióticos en los alimentos. ........................................................................ 17
2.2.7 Resistencia a los antibióticos.......................................................................... 17
2.2.8 Cromatografía................................................................................................. 18
2.2.9 Otros métodos cuantitativos para la determinación de sulfonamidas. ........... 20
2.3 Fundamentación legal ........................................................................................... 20
2.4 Hipótesis ............................................................................................................... 22
2.4.1 Hipótesis de trabajo. ....................................................................................... 22
2.4.2 Hipótesis alternativa. ...................................................................................... 22
2.5 Sistema de variables.............................................................................................. 22
Capítulo III ..................................................................................................................... 23
Metodología de Investigación ........................................................................................ 23
3.1 Diseño de la Investigación .................................................................................... 23
3.1.1 Enfoque de la investigación. .......................................................................... 23
3.1.2 Nivel de la investigación. ............................................................................... 23
3.1.3 Tipos de investigación. ................................................................................... 23
3.2 Población y muestra .............................................................................................. 24
3.2.1 Población. ....................................................................................................... 24
3.2.2 Muestra. .......................................................................................................... 24
3.3 Diseño experimental. ............................................................................................ 24
3.3.1 Muestreo. ........................................................................................................ 24
3.3.2 Recolección de las muestras. .......................................................................... 25
3.3.3 Almacenamiento de las muestras. .................................................................. 25

vii
 3.3.4 Procesamiento de las muestras. ...................................................................... 26
3.3.5 Verificación del método. ................................................................................ 26
3.3.6 Análisis de las muestras. ................................................................................ 27
3.4 Matriz de operacionalización de variables ............................................................ 29
3.5 Técnicas e instrumentos de recolección de datos ................................................. 29
3.5.1 Validez de los instrumentos de recolección de datos. .................................... 30
3.6 Técnicas y Procesamiento de datos....................................................................... 30
Capítulo IV ..................................................................................................................... 31
Análisis y discusión de resultados .................................................................................. 31
4.1 Corrección de la concentración ............................................................................. 31
4.2 Verificación de desempeño del método ................................................................ 31
4.2.1 Linealidad. ...................................................................................................... 31
4.2.2 Cálculo del porcentaje de recuperación. ........................................................ 34
4.2.3 Cálculo del límite de detección del método (LOD) ....................................... 35
4.2.4 Cálculo del límite de cuantificación del método (LOQ) ................................ 36
4.2.5 Curva de calibración media. ........................................................................... 36
4.3 Resultados del análisis .......................................................................................... 37
4.3.1 Análisis de varianza (ANOVA). .................................................................... 40
4.3.2 Diagrama de cajas simultáneo. ....................................................................... 41
4.3.3 Gráfico de medias........................................................................................... 42
Capítulo V....................................................................................................................... 43
Conclusiones y Recomendaciones.................................................................................. 43
5.1 Conclusiones ......................................................................................................... 43
5.2 Recomendaciones ................................................................................................. 43
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 45
ANEXOS ........................................................................................................................ 49

viii
 ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Composición media de la leche vacuna. ............................................................ 9

Tabla 2. Aportación de nutrientes por la leche fresca (%) de la dieta recomendada (FAO-
OMS) aportado por 1 litro de leche/día. .................................................................. 10
Tabla 3. Insumos pecuarios con sulfonamidas registrados en AGROCALIDAD......... 11
Tabla 4. Límite máximo de residuos de Sulfonamidas en leche de bovino, ovino y
caprino. .................................................................................................................... 22
Tabla 5. Matriz de operacionalización de variables. ..................................................... 29
Tabla 6. Resultados de las áreas de los picos en los cromatogramas del estándar de
sulfadiazina.............................................................................................................. 32
Tabla 7. Resultados del análisis de recuperabilidad de muestras fortificadas. .............. 35
Tabla 8. Resultados del estándar de concentración 20 μg/kg ........................................ 35
Tabla 9. Resultados del análisis cromatográfico de las muestras de leche cruda. ......... 39
Tabla 10. Estructura de una tabla ANOVA de un factor. .............................................. 41
Tabla 11. Análisis de varianza de las réplicas de las muestras. ..................................... 41

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Fórmula estructural de la sulfadiazina ........................................................... 15

Figura 2. Diagrama de bloques que muestra los componentes de un típico aparato para
HPLC ....................................................................................................................... 18
Figura 3. Esquema de un detector de matriz de diodos. ................................................ 19

ÍNDICE DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Curva de calibración para sulfadiazina N°1 ................................................. 32

Gráfico 2. Curva de calibración para sulfadiazina N°2 ................................................. 33
Gráfico 3. Curva de calibración para sulfadiazina N°3 ................................................. 33
Gráfico 4. Curva de calibración para sulfadiazina N°4 ................................................. 33
Gráfico 5. Curva de calibración para sulfadiazina N°5 ................................................. 34
Gráfico 6. Curva de calibración media para sulfadiazina .............................................. 37
Gráfico 7. Representación gráfica del análisis por triplicado de las muestras de leche
cruda con respecto al límite máximo de residuos (LMR) ....................................... 38
Gráfico 8. Representación gráfica de las concentraciones promedio del análisis de las
muestras con respecto al límite máximo de residuos (LMR) .................................. 38
Gráfico 9. Resultados de concentraciones de sulfadiazina en muestras de leche cruda 40
Gráfico 10. Diagrama de caja para los resultados de las concentraciones de sulfadiazina
de las muestras ........................................................................................................ 42
Gráfico 11. Gráfico de medias para los resultados de las concentraciones de sulfadiazina
de las muestras ........................................................................................................ 42

ix
 ÍNDICE DE ECUACIONES

Ecuación 1. Ecuación para sulfadiazina ........................................................................ 34

Ecuación 2. Ecuación para calcular la desviación estándar ........................................... 35
Ecuación 3. Ecuación para el cálculo del LOD ............................................................. 36
Ecuación 4. Ecuación para el cálculo del LOQ ............................................................. 36

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo A. Esquema Causa- Efecto. ................................................................................ 49

Anexo B. Categorización de variables. .......................................................................... 50
Anexo C. Instrumentos y matrices de recolección de datos........................................... 51
Anexo D. Validación de los instrumentos y matrices de recolección de datos. ............. 55
Anexo E. Recolección de datos. ..................................................................................... 58
Anexo F. Cromatogramas del análisis de sulfadiazina. ................................................. 63
Anexo G. Fotografías del proceso de investigación....................................................... 67
Anexo H. Especificaciones fisicoquímicas del estándar de sulfadiazina utilizado. ....... 69
Anexo I. Instructivo para toma de muestras de leche cruda de AGROCALIDAD. ...... 70

x
Determinación de residuos de sulfadiazina en leche cruda transportada
por la Asociación de Transportistas de Leche Cruda (ASOLECRUM)
del cantón Cayambe mediante Cromatografía Líquida de Alta Eficacia
(HPLC).
Autor: Miller Angel Espinoza Bravo
Tutora: MSc. Ana María Hidalgo Almeida

Resumen

En la presente investigación se determinaron las concentraciones residuales de antibiótico

sulfadiazina en 19 muestras de leche cruda tomadas de la Asociación de Transportistas
de Leche Cruda de Cayambe (ASOLECRUM), mediante un muestreo discrecional, en las
que se realizó una extracción con solventes orgánicos según el método oficial propuesto
por la Asociación Oficial de Químicos Analistas (AOAC) y un posterior análisis mediante
Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC). Se verificó el método y se elaboraron 5
curvas de calibración con estándar de sulfadiazina en concentraciones de 50, 100, 200,
300 y 1000 μg/kg. Las concentraciones residuales obtenidas mediante el cálculo de la
concentración a partir de la ecuación de las curvas de calibración, se compararon con el
límite máximo de residuos (LMR) para sulfadiazina establecido por el reglamento
N°37/2010 sobre sustancias farmacológicamente activas y su clasificación en relación
con los límites máximos de residuos en los alimentos de origen animal de la Unión
Europea (UE), donde 12 de un total de 19 muestras de leche cruda superaban el límite
permitido para sulfadiazina, el mismo que se especifica como 100 μg/kg. 7 muestras no
superaron el LMR, de las cuales 6 fueron menores al límite de detección del método y 1
se encontró entre el límite detección y el límite máximo de residuos.

Palabras clave: Antibiótico, Leche, Sulfadiazina, AOAC, Cromatografía, Límite

Máximo de Residuos.

xi
Determination of Sulfadiazine residues in raw milk transported by the
Association of Raw Milk Carriers (ASOLECRUM) of Cayambe by
High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
Author: Miller Angel Espinoza Bravo

Tutor: MSc. Ana María Hidalgo Almeida

Abstract

In this research, residual concentrations of sulfadiazine antibiotic were determined in 19

samples of raw milk taken from the Association of Raw Milk Carriers of Cayambe
(ASOLECRUM), by means of a discretionary sampling, in which an extraction with
organic solvents was carried out according to the official method proposed by the
Association of Official Analytical Chemists (AOAC) and a subsequent analysis using
High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The method was verified, and 5
calibration curves were elaborated with sulfadiazine standard in concentrations of 50,
100, 200, 300 and 1000 μg/kg. The residual concentrations obtained by calculating the
concentration from the equation of the calibration curves, were compared with the
Maximum Residue Limit (MRL) for sulfadiazine established by Regulation N°37/2010
on pharmacologically active substances and their classification regarding maximum
residue limits in foodstuffs of animal origin in the European Union (EU), where 12 of 19
samples of raw milk exceeded the limit allowed for sulfadiazine, which is specified as
100 μg/kg. 7 samples did not exceed the MRL, of which 6 were less than the detection
limit of the method and 1 was found between the detection limit and the maximum residue
limit.

Keywords: Antibiotic, Milk, Sulfadiazine, AOAC, Chromatography, Maximum Residue

Limit.

xii
 Introducción

Los antibióticos son utilizados de distintas maneras en medicina veterinaria, pero

la más común es su utilización en forma terapéutica, para tratar diferentes tipos de
enfermedades de la misma manera que en la medicina humana. (Errecalde, 2004)
El uso de antibióticos ha contribuido esencialmente a incrementar la producción
de alimentos de origen animal y a reducir las pérdidas ganaderas.(Trolldenier, 1988). Por
ello, la determinación cuantitativa de residuos de antibióticos en alimentos se considera
importante para asegurar que el consumo de un producto no cause daño en la salud
humana.
Con la finalidad de asegurar la inocuidad y calidad de la leche cruda se requiere
de técnicas sensibles, reproducibles y confiables, que permitan su determinación y
cuantificación. El método de determinación por Cromatografía Líquida de Alta Eficacia
(HPLC, por sus siglas en inglés) y su previa extracción con solventes orgánicos propuesto
por la Asociación Oficial de Químicos Analistas (AOAC, por sus siglas en inglés) es un
método oficial para la cuantificación de antibióticos del grupo de las sulfonamidas en
leche cruda de bovino.
En el presente trabajo de investigación se analizan y determinan concentraciones
de residualidad de antibiótico sulfadiazina en muestras de leche cruda de bovino tomadas
de la Asociación de Transportistas de Leche Cruda del cantón Cayambe
(ASOLECRUM), con la finalidad de verificar el cumplimiento del LMR establecido por
la normativa de la Comunidad Europea, mediante el método de cromatografía líquida de
alta eficacia con detector ultravioleta (UV).
La efectividad del método ensayado se comprueba realizando mediciones de
recuperabilidad, linealidad, límites de detección y cuantificación, así como la correlación
de los resultados obtenidos.
El desarrollo del presente proyecto de investigación se lo realizará en cinco
capítulos, los mismos que se describen a continuación:
Capítulo I. El problema, donde se conoce el tema analizando el problema,
definiendo la importancia de este y desarrollando un objetivo general y varios específicos
importantes para su resolución.
Capítulo II. Marco teórico, donde se toman en cuenta antecedentes o estudios
previos relacionados con el tema de investigación, se plantea la hipótesis y se definen las
variables de estudio.
Capítulo III. Metodología de la investigación, aquí se describe el diseño
experimental y las metodologías que se emplean para el desarrollo práctico de la
investigación.

1
 Capítulo IV. Análisis y discusión de resultados, donde se muestran los resultados
del análisis, así como su tratamiento estadístico,
Capítulo V. Conclusiones y recomendaciones, en este apartado se confirma si los
objetivos de la investigación fueron alcanzados con éxito, así como también se hacen
recomendaciones para tener en cuenta en la investigación o futuros trabajos de la misma
línea de investigación,
Bibliografía. Donde se detallan todas las referencias consultadas.

2
 Capítulo I

El problema

1.1 Planteamiento del problema

La leche de bovino es la más consumida a nivel mundial, por su alto contenido

en proteínas de excelente valor biológico, además de otros compuestos esenciales como
grasa, vitaminas y minerales. Al ser un alimento de origen animal de consumo masivo,
éste debe estar exento de agentes químicos o biológicos que sean ajenos a su composición
natural, como hormonas, plaguicidas o antibióticos.
Ecuador inicia una gran producción lechera desde los años 1950. La provincia de
Pichincha, conformada por 8 cantones, cuenta con la mayor producción de leche a nivel
nacional. Además del cantón Mejía, que actualmente es el máximo productor nacional
de leche, se encuentra el cantón Cayambe, donde la producción lechera forma parte de
su tradición. Cayambe ha sido cuna de la producción artesanal de productos lácteos, así
como de industrias que hoy en día tienen una gran proyección nacional. (CIL, 2015)
En Ecuador, la Agencia de Regulación y Control Fito y Zoosanitario
(AGROCALIDAD) ha intensificado los operativos de control en las distintas áreas del
sector lácteo, desde los proveedores ganaderos lecheros hasta los silos de las industrias
lácteas, logrando controlar 460 mil litros de leche desde el mes de agosto de 2018 y
decomisando 18870 litros con problemas de calidad, con la finalidad de garantizar la
inocuidad de la leche cruda en toda la cadena productiva. (AGROCALIDAD, 2018)
El uso de antibióticos en vacas lecheras por parte de los grandes, medianos y
pequeños productores ganaderos, asegura un buen estado de salud del animal, evitando
enfermedades infecciosas que pudieran migrar a la leche. (Torres Toapanta, 2015)
El uso inadecuado y desmesurado de medicamentos veterinarios en vacas
lecheras puede dar como resultado la contaminación de la leche con niveles de residuos
de estos fármacos. Las sulfonamidas al igual que las tetraciclinas son los grupos de
antibióticos más comúnmente utilizados en la ganadería, principalmente por su fácil
adquisición, bajo costo, poseen un amplio espectro de acción y porque son los más
conocidos por los ganaderos.
La sulfadiazina fue escogida como objeto de estudio por ser un antibiótico muy
comúnmente utilizado en la ganadería, así como por su amplio espectro de acción en las
infecciones que sufre el ganado bovino.
El mal manejo de las vacas tratadas con antibióticos o el irrespeto al tiempo de
retiro, responden a varios motivos, como el desconocimiento de la existencia de medidas
para tal finalidad o falta de información sobre el registro de los medicamentos

3
antibióticos y un Límite Máximo de Residuos (LMR) establecido. (Torres Toapanta,
2015)
Actualmente, el método cualitativo para la identificación de antibióticos en leche
cruda se basa en un kit colorimétrico de respuesta rápida.
Se ofrece una gama completa de kits de prueba de antibióticos de alta sensibilidad,
para identificar los residuos de antibióticos y mejorar el control de los procesos. Estos
kits permiten la detección de una amplia variedad de antibióticos, entre ellos, los beta-
lactámicos, tetraciclinas, sulfonamidas y aminoglucósidos (BioLact, 2012). Sin embargo,
este kit sólo permite obtener resultados cualitativos y presuntivos; a pesar de su fácil
utilización y su rápida respuesta, no permite obtener resultados cuantificables de los
residuos de antibióticos.
El uso de kits de identificación de antibióticos no es suficiente para un adecuado
control de calidad de la leche y de los productos que se obtienen a partir de ella, teniendo
que recurrir a métodos de confirmación que nos permitan obtener información para la
cuantificación e identificación inequívoca del analito (Talero-Pérez, Medina, & Rozo-
Núñez, 2014). Por ello es necesario implementar un procedimiento de cuantificación de
residuos de antibióticos presentes en leche cruda destinada a consumo humano para
asegurar que el contenido de dichos medicamentos veterinarios sea menor al aceptado
como nivel seguro según los LMR establecidos por el Codex Alimentarius y la Unión
Europea.
La cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) es una técnica que permite
obtener resultados cuantificables con una alta sensibilidad, precisión y exactitud, con
límites de cuantificación del orden de μg/kg, mediante el uso de estándares de
concentración conocida.
1.2 Formulación del problema

¿Existe presencia de residuos de sulfadiazina que superen los LMR en las

muestras de leche de la Asociación de Transportistas de Leche Cruda (ASOLECRUM)
del cantón Cayambe?
1.2.1 Preguntas de investigación.

• ¿Se utiliza sulfadiazina en el tratamiento de enfermedades del ganado bovino?

• ¿Cómo se verificará el método analítico?
• ¿Qué procedimiento se utilizará para la determinación de residuos de sulfadiazina
en las muestras de leche cruda?
• ¿Cuántas de las muestras de leche cruda analizadas cuantitativamente por HPLC
superan el límite máximo de residuos?

4
1.3 Objetivos

1.3.1 General.

Determinar la presencia o ausencia de residuos de sulfadiazina en muestras de

leche cruda de la Asociación de Transportistas de Leche Cruda (ASOLECRUM) del
cantón Cayambe por Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC).

1.3.2 Específicos.

• Investigar si la sulfadiazina se está utilizando en el tratamiento de

enfermedades del ganado bovino, mediante obtención de información en la
Agencia de Regulación y Control Fito y Zoosanitario (AGROCALIDAD) y
recolección de datos en los lugares de distribución de insumos veterinarios de
Cayambe.
• Verificar el desempeño del método analítico mediante los indicadores de
eficiencia.
• Analizar los residuos de sulfadiazina según el método oficial AOAC 993.32
Multiple Sulfonamide Residues in Raw Bovine Milk.
• Comparar los resultados de concentraciones de sulfadiazina obtenidos con el
límite máximo de residuos (LMR) establecido por la Unión Europea.
1.4 Justificación e importancia

El mal uso o exceso de administración de agentes antibióticos en medicina

veterinaria son algunas de las causas principales de la presencia de éstos en la leche cruda
de bovino, que producen alteraciones en la salud del consumidor, como problemas
alérgicos, tóxicos y algunos asociados a las resistencias bacterianas; siendo el más grave
y de preocupación mundial el último de ellos por ser principalmente el más difícil de
controlar. (Errecalde, 2004)
La resistencia a los antimicrobianos (RAM) es un fenómeno natural en los
microorganismos en respuesta al uso indebido de antimicrobianos en los seres humanos
y animales. Esto representa un desafío para la salud pública mundial, debido a que los
tratamientos de las infecciones que se generan son difíciles, costosos y en algunos casos,
imposibles de controlar. (OMS, World Health Organization, 2014)
La producción de leche en el cantón Cayambe es la segunda más importante del
Ecuador, justo después del cantón Mejía. Según el diagnóstico del plan de desarrollo de
Cayambe, para el año 2010 se produjeron aproximadamente 64532 litros de leche, un
aumento del 70% en la producción desde el año 2000. (IEE, 2013)

Los kits de respuesta rápida utilizados en la determinación de la presencia de

agentes antimicrobianos en leche cruda son herramientas bastante útiles y eficaces para
la determinación cualitativa de dichos compuestos. Sin embargo, su respuesta cualitativa
y presuntiva es la que hace recurrir a métodos confirmativos que permitan obtener
resultados cuantificables, repetibles y reproducibles.

5
 Con los antecedentes mencionados, la finalidad e importancia de este trabajo
investigativo es evidente, la oferta de productos lácteos de buena calidad y que sean
inocuos para el consumo humano, la aceptación de la materia prima en los centros de
acopio para evitar pérdidas económicas y la preocupación por la salud de los
consumidores, son los principales motivos por los que la detección de residuos de
medicamentos antibióticos en la leche cruda es importante, generando datos cuantitativos
que definirán la aceptación o rechazo de la materia prima. El uso de la Cromatografía
Líquida de Alta Eficacia (HPLC) para la determinación de residuos de antibióticos en
leche cruda permite resultados comparables con curvas de calibración en concentraciones
a nivel de microgramos/kilogramo (μg/kg) y métodos que pueden ser validados
determinando sus límites de detección, cuantificación e incertidumbre, brindando mayor
confiablidad, precisión y exactitud en los resultados obtenidos.
Estos resultados pueden ser comparados con el límite máximo de residuos (LMR)
establecido por el reglamento N°37/2010 sobre sustancias farmacológicamente activas y
su clasificación en relación con los límites máximos de residuos en los alimentos de
origen animal de la Unión Europea (UE), ya que la normativa alimentaria en la cual
Ecuador se basa, CAC/MRL 02-2005 del Codex Alimentarius o su actualización en
sesión número 38 del año 2015, no especifica un LMR para sulfadiazina en alimentos.

6
 Capítulo II

Marco teórico

2.1 Antecedentes de investigación

Alrededor de todo el mundo existe un creciente interés en que los productos de

consumo humano de origen animal estén exentos de cualquier componente ajeno a su
composición original. Benavides et al. (2009) nos indica que la determinación de residuos
de antibióticos en leche cruda permite vislumbrar la necesidad de un plan de vigilancia
constante, con el empleo de métodos sensibles de cuantificación.

En la Academia China de Ciencias de la Agricultura, She et al. (2010) en su

investigación desarrollaron un método para determinar 24 sulfonamidas en leche cruda
de bovino en 10 minutos mediante el método de Cromatografía Líquida de Ultra
Resolución (UPLC, por sus siglas en inglés) con Espectrometría de Masas (UPLC-
MS/MS). Se logró reducir el tiempo de análisis y costos de pretratamiento con una alta
velocidad de separación, selectividad, sensibilidad y repetibilidad, comparados con otros
métodos analíticos.
Arroyo-Manzanares, Gámiz-Gracia, & García-Campaña (2014) en la
Universidad de Granada, España, pusieron a prueba dos métodos de extracción para la
determinación de 9 sulfonamidas reguladas por la Unión Europea en muestras de leche,
el primero es una micro extracción líquido-líquido dispersiva y el segundo una
modificación del método QuEChERS, logrando determinar que ambos métodos son
alternativas bastante útiles a la extracción en fase sólida, en términos de simplicidad,
reduciendo el uso de solventes orgánicos y aumentando el porcentaje de recuperación.
Sin embargo, el método de micro extracción proporcionó límites de detección más bajos
que el método QuEChERS. Ambos métodos utilizan la técnica HPLC empleando un
detector de fluorescencia.

En la Universidad Austral de Chile, Pozo K., Manquian T., Neira C., & Mansilla
T. (2004) en su investigación sobre residuos de sulfamidas en miel, evaluaron el método
cromatográfico HPLC para 9 sulfamidas, aunque la matriz en este caso no es leche,
obtuvieron resultados reproducibles, con una precisión y exactitud aceptables y con un
porcentaje de recuperación dentro del rango especificado.
En un estudio realizado en Perú por Vera A., Ortiz Z., & Cayro Ch. (2008) donde
se analizaron residuos de antibióticos mediante kits de respuesta rápida para beta-
lactámicos y tetraciclinas se determinó la presencia de tetraciclinas en 61 muestras de un
total de 99, representando el 61,6%.

7
 En Ecuador, Zapata Soria (2016) en su investigación sobre residuos de
sulfonamidas en leche bovina tomadas en la parroquia Alóag del cantón Mejía, obtuvo
resultados del análisis que demostraron la presencia de antibióticos del grupo de las
sulfonamidas en 3 de las 6 muestras analizadas de leche cruda. Estas muestras
sobrepasaron los LMR establecidos por el Codex Alimentarius.

Brito (2017) en Ecuador, realizó un análisis semi-cuantitativo mediante kits

ELISA en muestras de carne obtenidas del centro de faenamiento de la Empresa Pública
Metropolitana de rastro Quito- La Ecuatoriana, analizó varios tipos de antibióticos entre
ellos la sulfadiazina, llegando a demostrar que su presencia en músculo era nula, no así
para tetraciclinas y beta-lactámicos, donde a pesar de existir presencia de residuos de
estos antibióticos, no superaban los LMR de la normativa vigente.

En conclusión, existen muchas investigaciones y autores que han logrado

determinar antibióticos del grupo de las Sulfonamidas, Tetraciclinas y de otros grupos
muy comúnmente utilizados como factores de crecimiento o de forma terapéutica,
mediante la utilización de métodos presuntivos, cualitativos, semi-cuantitativos y
cuantitativos. Sin embargo, la utilización de métodos presuntivos y cualitativos no son
suficientes para determinar la calidad de una leche cruda ni para asegurar la salud de los
consumidores, y por ello, la cromatografía juega un papel muy importante en la
determinación de residuos de estos medicamentos de uso veterinario, que nos permite
identificarlos y cuantificarlos para así realizar una comparación con los LMR permitidos
en la legislación alimentaria, asegurando un pertinente control de la calidad de la materia
prima y del producto terminado y de la salud de los consumidores. Observamos también
que, a nivel nacional, la información de este tipo de investigaciones es limitada y que la
normativa nacional nos remite al Codex Alimentarius, donde no aparece un LMR para
sulfadiazina, no siendo así en países vecinos como Perú, donde el LMR para este
antibiótico en leche es de 100 μg/kg. En chile, se ha fijado el LMR para el grupo de
Sulfonamidas en 25 μg/kg en leche.
2.2 Fundamentación teórica

2.2.1 Leche.

La leche es el producto de la secreción normal de las glándulas mamarias de

animales bovinos lecheros sanos, obtenida mediante uno o más ordeños diarios,
higiénicos, completos e ininterrumpidos, sin ningún tipo de adición o extracción. (INEN,
2014)
La leche cruda es aquella que no ha sido cometida a ningún tipo de calentamiento
(es decir que la temperatura no haya superado la de la leche inmediatamente después de
ser extraída de la ubre, no más de 40°C) o no haya sufrido tratamiento térmico, salvo el
de enfriamiento para su conservación, ni ha tenido modificación alguna en su
composición. (INEN, 2014)

8
 La leche es un producto muy inestable y perecedero, alterándose principalmente
por la contaminación microbiana. Está compuesto por tres fases, la acuosa, donde se
encuentran disueltos los azúcares, sales, proteínas, vitaminas y aminoácidos; la fase
sólida, en estado coloidal está formada por proteínas complejas, principalmente la
caseína, además de fosfatos y sales de calcio insolubles; la tercera fase, la lipídica
emulsionada, está formada por grasas, esteroles y vitaminas liposolubles. (Primo Yúfera,
1998)
2.2.1.1 Composición de la leche.

La composición de la leche y sus características organolépticas pueden variar en

el transcurso del periodo de lactación. Según este periodo se distinguen tres tipos:
calostro, la leche del final del ciclo y la de la lactación completa, cada una con
composiciones químicas diferentes. (Spreer, 1973)
La leche normal de bovino tiene una composición media de 87,5% de agua, 3,5%
de grasa, 3,5% de proteínas, 4,7% de lactosa y 0,8% de cenizas. Dependiendo de la raza
bovina la cantidad de materia grasa puede variar, este contenido depende también de la
alimentación de las vacas. (Spreer, 1973)
Estos datos concuerdan con varios autores, como (Alais, 1985) en cuyo libro
“Ciencia de la leche” describe la composición de la leche de vaca y realiza una
comparación de la composición química de ésta con la de otros animales, incluso la
humana.
Según (Fennema & Tannenbaum, 2000) la composición media de la leche vacuna
es la que consta en la Tabla 1. En la Tabla 2 se encuentra el aporte nutricional de la leche
fresca según (Primo Yúfera, 1998).

Tabla 1. Composición media de la leche vacuna.

Componente medio Porcentaje

Agua 86,6
Grasa 4,1
Proteína 3,6
Lactosa 5,0
Cenizas 0,7
Fuente: (Fennema & Tannenbaum, 2000)

9
Tabla 2. Aportación de nutrientes por la leche fresca (%) de la dieta recomendada (FAO-
OMS) aportado por 1 litro de leche/día.

% respecto
a la DR
Kcalorías 600 17
Proteínas 32 g 68
Riboflavina (B2) 1,7 mg 120
Cobalamina (B12) 0,005 mg 125
Niacina (PP) 1 mg 55
Vitamina A 0,3 mg 35
Vitamina C 20 mg 27
Calcio 1,2 mg 130
Fósforo 1g 100
Fuente: (Primo Yúfera, 1998)
2.2.1.2 Producción de leche en Ecuador.

Según (INEC, 2014) en base a la Encuesta de superficie y producción

agropecuaria continua ESPAC – 2014, Manabí encabeza el sector pecuario con el ganado
bovino. Sin embargo, son Azuay y Pichincha las provincias con mayor producción de
leche, registrándose un 15,06% y 13,30% de la producción nacional respectivamente.

2.2.2 Antibióticos.

Los agentes antimicrobianos son sustancias obtenidas mediante síntesis o en

algunos casos naturalmente, a partir de cultivos de microorganismos. Algunos, llamados
semisintéticos, se obtienen mediante la modificación de la estructura química de aquel
que fue obtenido naturalmente (Errecalde, 2004). Los antibióticos tienen la capacidad de
inhibir los procesos metabólicos de las bacterias, ya sea destruyéndolas (acción
bactericida) o inhibiendo su reproducción (acción bacteriostática). (Parra Trujillo, Peláez
Suárez, Londoño Arango, Peréz Almario, & Rengifo Benítez, 2003)
Un medicamento veterinario es cualquier sustancia que se aplica o administra a
animales destinados a la producción de alimentos, como ganado para la producción de
carne o leche, aves de corral, entre otros, ya sea con fines terapéuticos, profilácticos o de
diagnóstico, o para modificar las funciones fisiológicas o el comportamiento. (FAO,
2018)
2.2.2.1 Antibióticos utilizados en ganado bovino.

El uso de antibióticos a nivel mundial ha contribuido esencialmente a incrementar

la producción de alimentos de origen animal. Además de ser utilizados en la profilaxis y
de forma terapéutica en el control de enfermedades infecciosas, los antibióticos juegan
un papel importante en la conservación de alimentos y regulación de procesos de
fabricación. (Trolldenier, 1988)
Cuando se utilizan medicamentos en animales productores de alimentos, debe
considerarse el efecto de dicho medicamento en toda la población de animales dentro del

10
entorno de producción, así como en la cadena de producción hasta el consumo humano.
Abordar la seguridad de los alimentos como la carne, leche y huevos no solo implica la
evaluación de la seguridad de los residuos de medicamentos, sino también otros efectos
como la seguridad ambiental y la selección de patógenos bacterianos resistentes. (Papich,
2018)

La mastitis ha sido uno de los principales problemas que han podido disminuirse
con el uso de antibióticos. Sin embargo, su administración intramamaria, provoca la
presencia de residuos químicos en la leche. A pesar de que se cree que los tratamientos
térmicos inhiben la actividad de los medicamentos veterinarios, algunos estudios indican
que la penicilina pierde únicamente un 8% de su actividad con la pasteurización y el 50%
con la esterilización, la ebullición por otro lado destruye el 90% de los residuos de
tetraciclinas. (Parra Trujillo et al., 2003)
2.2.2.2 Antibióticos utilizados en ganado bovino en el Ecuador.

La Agencia de Regulación y Control Fito y Zoosanitario (AGROCALIDAD)

tiene a su cargo el registro de los insumos agropecuarios para garantizar y controlar la
eficiencia de estos, mediante la dirección de registro de insumos pecuarios.
AGROCALIDAD, mediante la dirección de registro de insumos pecuarios nos permite
la búsqueda de información sobre los medicamentos veterinarios que se encuentran en
circulación a nivel nacional (AGROCALIDAD, 2018). En la Tabla 3 se observan los
insumos pecuarios con al menos una sulfonamida en su composición que se encuentran
registrados en la Agencia de Regulación y Control Fito y Zoosanitario
(AGROCALIDAD). Según información obtenida del laboratorio de calidad de la leche
de AGROCALIDAD en base a la encuesta realizada por ECUAJUGOS S.A. a 250
ganaderos del país, el ceftiofur encabeza la lista con un 24,74%, las sulfonamidas
representan el 1,37% de frecuencia de uso.

Tabla 3. Insumos pecuarios con sulfonamidas registrados en AGROCALIDAD.

INSUMOS PECUARIOS REGISTRADOS EN AGROCALIDAD
Tipo: Veterinario
Subtipo: Farmacológico, Materias primas
Nombre de producto Fabricante/Formulador Composición Presentaciones
Bolsas de pap para las
Sulfadimidina sódica, presentaciones 100 g,
APSASOL SULFAPOL Andrés Pintaluba - España
excipientes c.s.p. 1 kg, 5 kg, 10kg, 200
kg, 400 kg, 500 kg
Ácido Bórico,
BOLOS UTERINOS DE Laboratorios ARANDA, Oxitetraciclina HCl, Envases de 25 Bolos
SULFA UREA S.A. de C.V. - México Sulfatiazol sódico, de 13 gramos
Urea, vehículo c.b.p.
Sobres de aluminio
OXITETRACICLINA 12% + SINTERNAC S.A. - Oxitetraciclina, más polipropileno
SULFAMERAZINA 10% Ecuador Sulfamerazina interior para 25 g, 100
g
Sulfacloropiridazina
Bolsa de papel
SULFACLOR T QUIMTIA S.A. - Perú sódica, Trimetoprim,
aluminio de 1 kg, 5 kg
excipientes c.s.p.
Sulfadimidina sódica, Sobres de aluminio +
SINTERNAC S.A. -
SULFACOX Trimetoprim, polipropileno interior
Ecuador
excipientes de 1 kg, 100 g, 25 g

11
Continuación. Insumos pecuarios con sulfonamidas registrados en AGROCALIDAD.
SULFADIAZINA - - Tambor de 25 kg
Gotero de 10 ml, 60
ml, Frasco de 100 ml,
SULFADIAZINA + REPROSALUD CIA Sulfadiazina,
200 ml, 1 L, Galón de
TRIMETOPRIM LTDA. - Ecuador Trimetoprim
3,75 L, 4 L, Caneca
20 L
Frascos de vidrio de
SULFADIAZINA + REPROSALUD CIA Sulfadiazina,
10 ml, 20 ml, 100 ml,
TRIMETOPRIM 48% LTDA. - Ecuador Trimetoprim
250 ml
SULFADIMETOXINA AGROCHEM S. A. Sulfadimetoxina -
SULFADIMIDINA BP AGROCHEM S. A. Sulfadimidina Tambores de 25 kg
SULFADOXINA USP - Sulfadoxina Tambores de 25 kg
Frascos de polietileno
Sulfametoxazol,
LABORATORIOS blanco 20 ml, 50 ml,
SULFADROG Trimetoprim, vehículo
DROGAVET S.A. - Perú 100 ml, 250 ml, 500
c.s.p.
ml, 1 L, 5 L, 20 L
Frascos vidrio ámbar
KYROVET Sulfadiazina sódica,
tipo III 10 ml, 50 ml,
SULFAGAN LABORATORIES S.A. - Trimetoprim,
100 ml, caja de 15
Colombia excipientes c.s.p.
frascos x 10 ml
SULFAMERAXINA AGROCHEM S.A. Sulfameraxina Tambores de 25 kg
SULFAMETACINA AGROCHEM S.A. Sulfametacina Tambores de 25 kg
SULFAMETOXAZOL - Sulfametoxazol Tambores de 25 kg
SULFAMETOXAZOL BASE AGROCHEM S.A. Sulfametoxazol Tambores de 25 kg
SULFAMETOXIPIRIDACINA AGROCHEM S.A. Sulfametoxipiridacina Tambores de 25 kg
SULFAMETOXIPIRIDACINA Sulfametoxipiridacina
AGROCHEM S.A. Tambores de 25 kg
SÓDICA sódica
Frasco de vidrio
Sulfadimidina sódica,
SULFANTIPESTINA AGROCHEM S.A. ámbar tipo I 50 ml,
vehículo acuoso c.s.
tipo II 100 ml, 500 ml
SULFAPREX PREMEZCLA Sulfadiazina,
LABORATORIOS Saco de papel
MEDCAMENTOSA PARA trimetoprima,
CALIER S.A. - España multicapas 25 kg
PORCINO Y OVINO excipientes
Sulfamonometoxina,
SULFAPRO MONTANA S.A. - Perú Bolsa 100 g, 1 kg
Trimetoprim
FARMATEC LTDA. - Amprolio, Sobre trilaminado
SULFAPROL
Colombia Sulfaquinoxilina pouche 1 kg
SULFAQUINOXALINA AGROCHEM S.A. Sulfaquinoxalina Tambores de 25 kg
Frascos blancos de
LIVISTO S.A. de C.V. –
SULFAQUINOXALINA-LH Sulfaquinoxalina polietileno 100 ml, 1
El Salvador
L
Sulfamecetamida Frasco ampolla de
sódica, menadiona vidrio con tapón de
LABORATORIOS
SULFASOD-K bisulfito de sodio goma, precinto de
GALMEDIC
(vitamina K3), aluminio y etiqueta 20
excipientes c.s.p. ml, 100 ml
Sulfaquinoxalina,
sulfamerazina,
sulfametazina,
Sobres y fundas de
LABORATORIOS sulfatiazol,
SULFATEX aluminio 25 g, 100 g,
LLAGUNO - Ecuador trimetoprim, vitamina
1 kg
A, B1, calcio, potasio,
sodio, magnesio,
excipientes c.s.p.
Sulfaquinoxalina,
sulfamerazina,
sulfametazina,
Sobres de aluminio
sulfatiazol,
hermético laminado
SULFATEX-2 FAVETEX S.A. - Ecuador trimetoprim, vitamina
de polietileno 25 g, 50
A, vitamina B1,
g, 100 g, 1 kg
calcio, potasio, sodio,
magnesio, excipientes
c.s.p.

12
Continuación. Insumos pecuarios con sulfonamidas registrados en AGROCALIDAD.
SULFATIAZOL AGROCHEM S.A. Sulfatiazol Tambores de 25 kg
Sulfametazina, tilosina
Frasco plástico 100
SULFATIL - base (como fosfato),
ml
excipiente c.b.p
LABORATORIOS Sulfadoxina, Frasco de vidrio color
SULFATRIM
BIOMONT S.A. - Perú trimetoprim ámbar 20 ml, 100 ml
Sulfacloropiridacina
SULFA-TRIMETHOPRIM LH LIVISTO S.A. de C.V. – Frascos 100 g, 500 g,
sódica, trimetoprim,
75% El Salvador 1 kg, 5 kg
excipientes c.s.p.
Viales de vidrio color
Sulfametacina,
SULFA-TRIMETHOPRIM LH LIVISTO S.A. de C.V. – ámbar y clase
trimetoprim,
INYECTABLE El Salvador hidrolítica II 50 ml,
excipientes c.s.p.
100 ml, 250 ml
Sulmetoxazol,
Frasco de vidrio de
SULFATROPIN LAPISA S.A. - México trimetoprim, vehículo
100 ml, 250 ml
c.b.p.
Sobres de papel
Sulfadimetoxina
JAMES BROWN aluminio 20 g, 100 g,
SULFAVIT sódica, vitamina A,
PHARMA C.A. - Ecuador balde de polietileno
vitamina K
2,5 kg
Sulfaquinoxalina
sódica, Sulfametacina
sódica,
Sulfadimetoxina
sódica, Trimetoprima, Pote 1 kg, sobre 100
SULFYVIT AVIHOL CIA. LTDA.
Prednisolona, g, bolsa 5 kg
Vitamina A, Vitamina
E, Vitamina D3,
Vitamina C, Vitamina
K3, excipientes c.s.p.
Fosfato de tilosina,
Funda 1 kg, 5 kg, 10
TILCOMIX SULFA PREMIX - sulfametazina sódica,
kg, 15 kg, 25 kg
excipientes c.s.p.
ALURA ANIMAL Fosfato de tilosina,
Funda 1 kg, 5 kg, 10
TILOMIX SULFA PREMIX HEALTH & NUTRITION sulfametazina sódica,
kg, 15 kg, 25 kg
S.A.S. - Colombia excipientes c.s.p.
LABORATORIOS
QUÍMICOS Sulfadiazina sódica, Sobre 20 g, 100 g,
TRISULFALITE
INDUSTRIALES S.A. – trimetoprim 500 g, 25 kg
Costa Rica
Trimetoprim,
LABORATORIOS Frascos de vidrio 200
TRI-SULFAND ORAL Sulfadiazina,
VETERLAND - Colombia ml, 1 L
excipientes c.s.p.
Sulfadiazina sódica,
FARMATEC LTDA. - trimetoprim Envases 100 ml, 200
TRISULFARM
Colombia micronizado, ml, 500 ml, 1000 ml
excipientes c.s.p.
ALI LILLY AND
Fosfato de tilosina,
TYLAN 100 SULFA G COMPANY LIMITED – Funda de 25 kg
Sulfametazina
Reino Unido
Sulfadiazina sódica,
LIVISTO S.A. de C.V. – Frascos 100 ml, 500
TYLO-SULFAN trimetoprim,
El Salvador ml, 1 L
excipientes c.s.p
Fuente: (AGROCALIDAD, 2018)
Adaptado por: Miller Espinoza

13
 2.2.3 Sulfonamidas.

Las sulfonamidas también conocidas como sulfamidas o simplemente “sulfas”

fueron los primeros agentes antimicrobianos que se utilizaron en la prevención y cura de
infecciones bacterianas, conocidos como los más antiguos (Larrea & Boggio, 2007). Fue
obtenida por Gelmo en el año 1908 mientras trabajaba con colorantes para lana, pero
utilizada contra infecciones bacterianas un cuarto de siglo después. (Sumano López &
Ocampo Camberos, 2006). “Debido a que han sido utilizadas por muchos años, muchas
cepas de bacterias han llegado a ser resistentes.” (Bill, 2006)

Las sulfamidas son fármacos de amplio espectro, utilizadas para el tratamiento de

infecciones provocadas por organismos aerobios grampositivos y gramnegativos.
Actualmente, el valor terapéutico de las sulfamidas administradas solas es bastante
reducido, por lo que se combinan habitualmente con trimetoprima, ormetoprima o
aditoprima, conocidas éstas como sulfamidas potenciadas. (Martín-Jiménez, 2002)
Las sulfonamidas son unos de los grupos más antiguos de antimicrobianos que
todavía se usan en la actualidad, sin embargo, la resistencia es común cuando éstos se
utilizan solos, es decir, sin la adición de trimetoprim u ormetoprim. (Papich, 2018)
2.2.3.1 Características fisicoquímicas.

La mayoría de las sulfonamidas se consideran derivadas de una estructura similar

al ácido ρ-aminobenzoico (PABA), denominada sulfanilamida. Una sustitución en el
grupo amida produce sulfonamidas con mayor potencia, espectro antibacteriano e índice
terapéutico más amplios (Sumano López & Ocampo Camberos, 2006). Para que las
sulfonamidas puedan tener carácter bactericida, en ocasiones se comercializan
combinadas con compuestos como trimetoprim y ormetoprim. (Bill, 2006)
La sulfanilamida “(…) se obtiene a partir de la hidrólisis alcalina o ácido de la N-
acetilsulfanilamida, producto de la acción del amoníaco sobre el cloruro de
acetilsulfanilo”, siendo el grupo ρ-aminobenceno sulfonamida esencial en la acción
antibacteriana dado su parecido al ácido ρ-aminobenzoico, precursor del ácido fólico y
ácidos nucleicos en las bacterias. (Martín-Jiménez, 2002)
Todas las sulfonamidas poseen un color blanco cristalino, se comportan como
ácidos orgánicos débiles y forman sales con bases fuertes, y “(…) se diferencian entre sí
en el radical (R) unido al grupo amido en N1 (-SO2NHR) y, a veces, en el sustituyente
del grupo amino en N4 (NH2)” (Larrea & Boggio, 2007). Son solubles en medios
alcalinos, más que en ácidos o neutros. Son poco solubles en agua, pero un poco más en
suero. A veces cristalizan en la orina de ciertos animales sobredosificados o
deshidratados. En veterinaria se emplean más comúnmente las sales sódicas de las
sulfonamidas. (Sumano López & Ocampo Camberos, 2006)

14
 2.2.4 Sulfadiazina.

La sulfadiazina es un antibiótico de la familia de las sulfonamidas o sulfamidas,

que fueron los primeros agentes quimioterapéuticos utilizados en la prevención y cura de
infecciones bacterianas. Su nombre químico es 4-amino-N2-
pirimidinilbencensulfonamida-2-sulfanilamidopirimidina, de peso molecular de 250,28
Da y cuya fórmula condensada es C10H10N4O2S, su fórmula estructural se muestra en la
figura 1. Es insoluble en agua, pero soluble en alcohol y acetona. En veterinaria se la
utiliza combinada con trimetoprim (Sumano López & Ocampo Camberos, 2006). La
solubilidad de este tipo de fármaco en agua es de 300 mg/100 ml, mientras que su sal
sódica es de 40 g/100 ml. Cuando se administra sola, posee acción bacteriostática. (Booth
& McDonald, 1987)

Figura 1. Fórmula estructural de la sulfadiazina

Fuente: (Sumano López & Ocampo Camberos, 2006)
La sulfadiazina es administrada a menudo en combinación con trimetoprim para
tratar infecciones respiratorias, de tracto urinario, urogenital, infecciones por protozoos,
infecciones de huesos y articulaciones, piel y tejido suave. (Papich, 2018)
2.2.4.1 Farmacocinética.

Una difusión pasiva rige la absorción de las Sulfonamidas y su velocidad de

absorción depende de varios factores como el estado de ionización, afinidad lipofílica del
fármaco, entre otros (Booth & McDonald, 1987). Los bovinos absorben este tipo de
fármaco más lento desde el tracto gastrointestinal que el cerdo y la oveja. En bovinos la
vida media de eliminación es de casi 2½ h. El volumen de distribución es de 0,720 L/kg
en la primera semana y de 0,590 L/kg en la sexta semana. En general, la vida media de
la sulfadiazina es de 5,7 a 3,6 h, y del trimetoprim de 8,4 h, la misma que se reduce a 0,9
h en la sexta semana. La cualidad ácida de la orina ayuda en la eliminación del
trimetoprim, sin embargo, favorece la cristalización de las sulfas. (Sumano López &
Ocampo Camberos, 2006)
Existe controversia en si la sulfadiazina puede o no migrar a la glándula mamaria.
Autores como (Sumano López & Ocampo Camberos, 2006) indican que la relación
pKa/pH de la sulfadiazina impide su entrada a la glándula mamaria. Sin embargo,
(Larrea & Boggio, 2007) indica que, para muchas sulfamidas, luego de una aplicación,
se ha encontrado en leche entre 0,5-2% de la dosis total. En animales no monogástricos,
como los rumiantes, el trimetoprim puede quedar atrapado en el rumen cuando se
administra de forma oral y degradado en cierto grado, reduciéndose la cantidad de

15
trimetoprim absorbida. “(…) Las sulfonamidas pueden incluso pasar a la leche de las
hembras en estado de lactancia.” (Bill, 2006)
Según (Papich, 2018) la vida media de una dosis por vía intravenosa de
sulfadiazina-trimetoprim de 10 mg/kg en ganado bovino de 5 años, es de 4,1 horas.
Las sulfonamidas se distribuyen a la mayoría de los fluidos corporales, pero no
así a los tejidos, como lo hace el trimetoprim. Las concentraciones de sulfonamidas en
tejidos son menores que las concentraciones plasmáticas. Su elevada capacidad de unión
a las proteínas afecta la distribución de las sulfonamidas y aumenta su vida media.
(Papich, 2018)
La principal vía de eliminación de las sulfonamidas es mediante los riñones, ya
sea como el compuesto original o como metabolitos. Además, pequeñas concentraciones
de sulfonamidas también son excretadas mediante las lágrimas, heces, bilis, leche y
sudor. (Papich, 2018)
2.2.4.2 Indicaciones y dosis.

Este tipo de fármaco puede ser considerado como de amplio espectro, debido a
que actúa contra bacterias grampositivas y algunas gramnegativas, sin embargo, los
microorganismos anaerobios obligados suelen ser resistentes (Larrea & Boggio, 2007).
Normalmente se encuentra comercialmente la sulfadiazina en proporción 1:5 con
trimetoprim, esta concentración ha sido la óptima para infecciones provocadas por
Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Corynebacterium sp., Bordetella sp., Clostridium
sp., y microorganismos gramnegativos como Proteus sp., Salmonella sp., Pasteurella sp.
Y Klebsiella sp. Se recomienda para infecciones del tubo digestivo, vías respiratorias y
vías urinarias. En bovinos, se administran 25-44 mg/kg/día por vía intramuscular o
intravenosa. En becerros, 48 mg/kg/día intravenosa o intramuscular. (Sumano López &
Ocampo Camberos, 2006)
2.2.4.3 Tiempo de retiro.

En bovinos, el tiempo de retiro pertinente para una concentración de sulfadiazina-

trimetoprim de 200 mg/ 40 mg, es de 10 días en ganado utilizado para la producción de
carne y de 2 ½ días para ganado productor de leche. (Sumano López & Ocampo
Camberos, 2006)
2.2.5 Límite Máximo de Residuos.

Expresado por el Codex Alimentarius como límite máximo Codex para residuos
de medicamentos veterinarios (LMRMV), es la concentración máxima de residuos que
resulta del uso de un medicamento veterinario (expresada en mg/kg o μg/kg del peso del
producto fresco). Los LMR pueden reducirse para que se ajusten a las buenas prácticas
en el uso de medicamentos veterinarios. (FAO, 2018)

16
 Según (Errecalde, 2004) el LMR es el máximo nivel de residuos aceptable en un
determinado alimento para que un humano que lo consume no supere su ingesta diaria
admisible (IDA).
En ecuador, AGROCALIDAD, según resolución 0064, adopta los LMR fijados
por el Codex cuando existan o en su defecto, los fijados por la UE en su reglamento (CE)
N°37/2010 sobre sustancias farmacológicamente activas y su clasificación en relación
con los límites máximos de residuos en los alimentos de origen animal y 470/2009 para
insumos veterinarios; o en su defecto por la FDA en sus guías destinadas a contaminantes
inaceptables en alimentos; en alimentos de origen animal y tolerancia de residuos de
drogas en alimentos. (AGROCALIDAD, 2017)
2.2.6 Antibióticos en los alimentos.

La presencia de agentes antimicrobianos en los alimentos se ha asociado a varios

problemas, como: alérgicos, tóxicos y aquellos asociados a las resistencias bacterianas.
Las sulfamidas es un grupo de antibióticos capaz de desencadenar reacciones alérgicas.
Uno de los más grandes problemas de salud de los consumidores no está dado por los
residuos que se puedan encontrar en los alimentos, sino por la transferencia de bacterias
que han desarrollado resistencia en los mismos animales, pudiendo incluso transferir su
material genético a bacterias humanas. (Errecalde, 2004)
2.2.7 Resistencia a los antibióticos.

La resistencia a los fármacos es un concepto relativo que depende de la dosis o

concentración. Se distinguen 3 clases de resistencia:
a) Resistencia primaria o natural. Resistencia frente a un quimioterapéutico sin
contacto previo.
b) Resistencia secundaria o adquirida. Es aquella producida espontáneamente como
mutación y queda fijada genéticamente; adquirida durante el contacto con un
antibiótico.
c) Resistencia transmisible (infecciosa). De origen no genético, depende del
acoplamiento de varios determinantes en un plásmido R, los mismos que
controlan e inducen la producción de enzimas. (Trolldenier, 1988)
La resistencia es una interferencia en el proceso de selección natural, donde el
antibiótico se convierte en el primer factor de selección. (Errecalde, 2004)

La resistencia a los antimicrobianos se produce cuando los microorganismos

(bacterias, virus, hongos o parásitos) sufren cambios que producen que los medicamentos
utilizados anteriormente para curar las mismas infecciones dejen de ser eficaces (OMS,
2017). Esta resistencia no es la misma para todos los miembros de la población, algunos
pueden ser altamente susceptibles, es decir que pueden ser eliminados con bajas
concentraciones del antibiótico, y otros muy resistentes, aún en concentraciones
elevadas. (Errecalde, 2004)

17
 2.2.8 Cromatografía.

Según define la IUPAC, “La Cromatografía es un método, usado primariamente

para la separación de los componentes de una muestra, en la cual éstos se distribuyen en
dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras la otra se mueve. La fase estacionaria
puede ser un sólido, un líquido retenido sobre un sólido o un gel. La fase móvil puede
ser líquida o gaseosa” (Quattrocchi, Abelaira de Andrizzi, & Laba, 1992). La fase móvil
lleva a través de la fase estacionaria los componentes de una mezcla, y su separación se
basa en la diferencia de velocidades de migración entre los componentes de la fase móvil.
(Skoog, West, Holler, & Crouch, 2015)
La cromatografía es un método potente de separación, inventado y denominado
así por Mikhail Tswett a principios del siglo XX, quien lo utilizaba en la separación de
pigmentos, como la clorofila. La palabra cromatografía proviene del griego chroma que
significa “color”, y grephein que significa “escribir”. (Skoog, Holler, & Crouch, 2008)
2.2.8.1 Cromatografía de líquidos de alta eficacia.

La cromatografía de líquidos es la técnica analítica de separación más

ampliamente utilizada por varias razones, las mismas que incluyen su sensibilidad, su
capacidad para separar especies no volátiles de termolábiles, su aplicabilidad en
componentes muy importantes en la industria, entre otras.
Su importancia radica en que la mayoría de los compuestos no son lo
suficientemente volátiles para que se les pueda aplicar cromatografía de gases. La
cromatografía líquida de alta eficacia utiliza presiones elevadas para forzar al disolvente
a pasar por una columna que contiene partículas muy finas, con la finalidad de obtener
separaciones de alta resolución (Harris, 2007). En la Figura 2 se pueden apreciar los
componentes clásicos de un sistema HPLC.

Figura 2. Diagrama de bloques que muestra los componentes de un típico aparato para
HPLC
Fuente: (Skoog, West, Holler, & Crouch, 2015)

18
 2.2.8.2 Detector Ultravioleta (UV).

El detector UV es el más utilizado en HPLC, debido a que posee buena

sensibilidad y un rango lineal, además de que permite la detección de analitos en el orden
de los nanogramos. Este detector opera en el rango de 190 a 350 nm, aunque en algunos
equipos se puede extender desde 350 a 700 nm, por ello se denomina detector
UV/Visible. La concentración del analito problema se determinar aplicando la ley de
Beer: A = ε.b.C, siendo “A” la absorbancia, “ε” la absortividad molar del analito, “b” el
camino óptico de la celda en cm y “C” la concentración de analito en la muestra es
moles/L. (Quattrocchi, Abelaira de Andrizzi, & Laba, 1992)
Existen dos tipos de detectores UV, aquellos de longitud de onda fija y los de
longitud de onda variable. Los primeros operan a longitudes de onda prefijadas,
utilizando lámparas, como la de mercurio, que emiten a 254 nm, además se puede regular
la longitud de onda con la utilización de filtros, especialmente de óxido de fósforo,
permitiendo trabajar a diferentes longitudes de onda: 313, 334, 365 nm. En el caso de los
de longitud de onda variable, se trata de un espectrofotómetro, es mucho más versátil,
debido a que permite elegir la longitud de onda de trabajo libremente. Trabaja con una
lámpara de Deuterio o de Xenón. (Quattrocchi, Abelaira de Andrizzi, & Laba, 1992)

2.2.8.3 Detector ultravioleta con matriz de diodos.

Es un tipo de detector de longitud de onda variable, pero tiene un principio

completamente diferente. Se utiliza una lámpara de deuterio o xenón para emitir luz en
todo el rango del espectro UV. La luz es focalizada por lentes acromáticos a través de la
muestra y de la lentilla holográfica. La luz dispersa de la rejilla se dispone a caer en una
matriz de diodos lineal. Una ventaja de este detector es que toma el espectro UV del
eluyente continuamente a lo largo del desarrollo del cromatograma (W. Scott, 1998). En
este tipo de detector el espectro completo de la lámpara es enfocado en la celda de la
muestra (Morgan & Smith, 2011). Un esquema de este tipo de detector se observa en la
Figura 4.

Figura 3. Esquema de un detector de matriz de diodos.

Fuente: Handbook of HPLC, 1998

19
 2.2.9 Otros métodos cuantitativos para la determinación de sulfonamidas.

La utilización de métodos cuantitativos en la determinación de residuos de

medicamentos veterinarios en alimentos de consumo humano ha llevado a los
investigadores a experimentar con nuevas técnicas de extracción para disminuir el uso de
solventes contaminantes del medio ambiente, reducir tiempos de extracción y costos de
pretratamiento.
She et al. (2010) lograron reducir a 10 minutos la determinación de 24 sulfamidas
mediante el tratamiento de muestras de leche bovina con acetonitrilo, seguido de una
homogeneización, ultrasonicación y centrifugación. La extracción consiste en colocar 5
g de muestra de leche en un tubo de centrífuga de 50 ml con 20 ml de acetonitrilo, agitar
por 2 min, homogeneizar por 3 min y ultrasonar por 5 min. Esta mezcla luego se transfiere
a un embudo de separación con 5 g de sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua de
la leche y es centrifugada por 5 min. El sobrenadante se extrae y se evapora hasta
sequedad, para luego ser redisuelto en 2 ml de la fase móvil (ácido acético al 0,2% y
acetonitrilo en proporción 9:1)
Un método alternativo es la extracción en fase sólida, utilizado por Zapata Soria
(2016) para la determinación de 2 sulfamidas en muestras de leche bovina. Consiste en
tratar la muestra con una solución buffer y hexano, obteniendo la separación de las fases,
el sobrenadante es extraído y se le vuelve a añadir la solución buffer con agitación y
posterior centrifugación, a esta mezcla se le añade ácido tricloroacético y se somete a
refrigeración para luego filtrarla y volver a refrigerarla, finalmente se procede a la
extracción y purificación en fase sólida utilizando el método SPE (Oasis HLB Waters).
La fase móvil utilizada en el sistema HPLC es ácido acético diluido.
2.3 Fundamentación legal

• Cabe mencionar a la Constitución de la República del Ecuador, donde en el Título

II, Capítulo segundo, Sección primera Agua y alimentación, Artículo 13 indica
que: “Las personas y colectividades tienen derecho al acceso seguro y permanente
a alimentos sanos, suficientes y nutritivos; preferentemente producidos a nivel
local y en correspondencia con sus diversas identidades y tradiciones culturales.
El Estado ecuatoriano promoverá la soberanía alimentaria.” Asimismo, en el
título IV, Capítulo tercero Soberanía Alimentaria, Artículo 281, numeral 13
especifica que será responsabilidad del Estado: “Prevenir y proteger a la
población del consumo de alimentos contaminados o que pongan en riesgo su
salud o que la ciencia tenga incertidumbre sobre sus efectos” (Constitución de la
República del Ecuador, 2008).
• Además, en la Ley Orgánica del Régimen de la Soberanía Alimentaria, en el
capítulo IV denominado Sanidad e Inocuidad Alimentaria, el artículo 24 sobre la
finalidad de la sanidad indica que: “La sanidad e inocuidad alimentarias tienen
por objeto promover una adecuada nutrición y protección de la salud de las
personas; y prevenir, eliminar o reducir la incidencia de enfermedades que se

20
 puedan causar o agravar por el consumo de alimentos contaminados” (Soberanía
Alimentaria, 2011).
• Es importante mencionar también a la Resolución 0064 Plan Nacional de
Vigilancia y Control de Contaminantes en la Producción Primaria, cuyo objetivo
es vigilar y controlar los límites y/o niveles máximos de contaminantes
permitidos de los principales productos agropecuarios del país, a través de
programas de muestreo, con la finalidad de garantizar productos agropecuarios
aptos para el consumo humano y animal (AGROCALIDAD, 2017).
• En la guía de Certificación de Buenas Prácticas Pecuarias (BPP) emitida por
AGROCALIDAD, Capítulo VII Del manejo de los productos de uso veterinario
y fitosanitario, artículo 17 sobre la utilización de los productos de uso veterinario,
especifica que todos los productos farmacológicos, biológicos, químicos, aditivos
y alimentos medicados para uso y consumo animal deben estar registrados en
AGROCALIDAD, además que la prescripción de éstos debe realizarse bajo la
responsabilidad de un profesional médico veterinario, especificando los tiempos
de retiro que se encuentran en la etiqueta de producto, para que los residuos en
los alimentos de dichos medicamentos no representen un riesgo para el
consumidor. (AGROCALIDAD, 2010) Este mismo concepto ha sido publicado
en el Capítulo VI, artículo 27 de la Guía de Buenas Prácticas Pecuarias de
Producción de Leche emitida el 23 de octubre de 2012 por AGROCALIDAD
(AGROCALIDAD, 2012).
• La Norma Técnica Ecuatoriana INEN 9:2012 quinta revisión especifica que los
límites máximos de residuos de medicamentos veterinarios para la leche serán los
que determine el Codex Alimentarius.
• CAC/MRL 2-2015 es el documento que el Codex Alimentarius pone a
disposición para identificar los límites máximos de residuos de medicamentos
veterinarios en alimentos. Ecuador toma este documento como referencia en su
Norma Técnica Ecuatoriana INEN 9:2012, literal 4.5. Sin embargo, el límite
máximo para sulfadiazina en alimentos no se encuentra especificado en el
documento, para ello se tomará como referencia la normativa europea.
• Reglamento N°37/2010 sobre sustancias farmacológicamente activas y su
clasificación en relación con los límites máximos de residuos en los alimentos de
origen animal de la Unión Europea (UE) y el documento en línea
EMEA/MRL/023/95 del Comité de Productos Médicos Veterinarios, de la
Agencia Europea Para la Evaluación de Productos Veterinarios se tomarán como
referencia para identificar los límites máximos de residuos de sulfadiazina.
• El método de ensayo utilizado en el presente trabajo de investigación es propuesto
por la Asociación Oficial de Químicos Analíticos (AOAC) para la identificación
mediante Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC) de residuos de
antibióticos en leche cruda, AOAC 993.32 Multiple Sulfonamide Residues in Raw
Bovine Milk.
En la Tabla 4 se muestran los LMR de sulfadiazina en leche y en tejido de bovino
establecidos por la Unión Europea.

21
Tabla 4. Límite máximo de residuos de Sulfonamidas en leche de bovino, ovino y
caprino.

Antibiótico Especie animal LMR μg/kg (UE)

Sulfonamidas (todas las
Bovino, ovino,
sustancias pertenecientes al 100*
caprino
grupo de las sulfonamidas)
* Los residuos combinados totales de todas las sustancias del grupo de las sulfonamidas no deben
sobrepasar los100 μg/kg.
Fuente: (Comisión Europea, 2009)

2.4 Hipótesis

2.4.1 Hipótesis de trabajo.

Las muestras de leche cruda tomadas de la Asociación de Transportistas de Leche

Cruda de Cayambe (ASOLECRUM) superan los límites máximos de residuos (LMR)
para sulfadiazina establecidos por la Unión Europea (UE).
2.4.2 Hipótesis alternativa.

Las muestras de leche cruda tomadas de la Asociación de Transportistas de Leche

Cruda de Cayambe (ASOLECRUM) no superan los límites máximos de residuos (LMR)
para sulfadiazina establecidos por la Unión Europea (UE).

2.5 Sistema de variables

El objeto o “unidad de análisis” de esta investigación es la concentración residual

de antibióticos en leche cruda, con su variable de caracterización “muestras de leche
cruda tomadas de ASOLECRUM de la ciudad de Cayambe” y su variable de interés “la
concentración residual de antibiótico sulfadiazina”.

Variable de caracterización

• Muestras de leche cruda de cada transportista de la Asociación de Transportistas

de Leche Cruda de Cayambe (ASOLECRUM).
Variable de interés

• Concentración residual de sulfadiazina.

22
 Capítulo III

Metodología de Investigación

3.1 Diseño de la Investigación

3.1.1 Enfoque de la investigación.

La “Determinación de residuos de sulfadiazina mediante Cromatografía Líquida

de Alta Eficacia (HPLC) en leche cruda transportada por la Asociación de Transportistas
de Leche Cruda (ASOLECRUM) del cantón Cayambe”, corresponde al paradigma
cuantitativo, debido a que se realizó un estudio, en el cual se determinó la concentración
residual de medicamentos veterinarios en leche cruda con la finalidad de explicar,
predecir, controlar los fenómenos así como verificar teorías y leyes para regular dichos
fenómenos (Espinel, 2014). El resultado obtenido se comparará con los límites máximos
permisibles establecidos por las normas de la Comunidad Europea.
3.1.2 Nivel de la investigación.

La “Determinación de residuos de sulfadiazina mediante Cromatografía Líquida

de Alta Eficacia (HPLC) en leche cruda transportada por la Asociación de Transportistas
de Leche Cruda (ASOLECRUM) del cantón Cayambe”, es una investigación descriptiva,
ya que se mide y se recolecta información sobre los residuos de los medicamentos
veterinarios en leche cruda mediante la determinación de residualidad. (Hernández
Sampieri, Fernández Collado, & Baptista Lucio, 2014)
3.1.3 Tipos de investigación.

La “Determinación de residuos de sulfadiazina mediante Cromatografía Líquida

de Alta Eficacia (HPLC) en leche cruda transportada por la Asociación de Transportistas
de Leche Cruda (ASOLECRUM) del cantón Cayambe” por la fuente de datos es una
investigación de campo, debido a que la obtención de las muestras se realizó en las
oficinas de ASOLECRUM, además por el lugar es experimental, ya que las muestras
fueron trasladadas al laboratorio para cuantificar el contenido residual de medicamentos
veterinarios. Asimismo, se apoya en una investigación bibliográfica ya que, mediante
indagación documental, de trabajos previos, bibliografía impresa y digital se logra
conocer estudios ya realizados sobre la temática y logra enriquecer esta investigación, es
bibliográfica también porque utiliza información teórica de varios autores para conocer
las consecuencias que la presencia de residuos de estos medicamentos en los alimentos
podrían causar en la salud humana, además de información oficial propuesta por
organismos internacionales.

23
3.2 Población y muestra

3.2.1 Población.

La población investigada fueron las 21 comunidades pequeñas productoras de

leche (Anexo E, literal a), donde los transportistas que conforman la Asociación de
Transportistas de Leche Cruda de Cayambe (ASOLECRUM) individualmente la
recolectan y posteriormente la distribuyen a empresas del sector.
3.2.2 Muestra.

Las muestras de leche cruda se receptaron en las instalaciones de ASOLECRUM

en el cantón Cayambe, las mismas que fueron tomadas siguiendo el instructivo
INT/CL/010 Rev. 5 establecido por el laboratorio de control de calidad de leche de la
Agencia de Regulación y Control Fito y Zoosanitario (AGROCALIDAD) (Anexo I). Se
registraron los datos de los transportistas según formato FO01 (Anexo C, literal a)
utilizando para la codificación de las muestras un sistema alfanumérico donde se colocó
la letra M referente a la palabra muestra y el número correspondiente desde 1 hasta 19.

Para la presente investigación se analizaron 19 muestras compuestas, es decir,

cada una de un transportista específico y a su vez éste de diferentes comunidades, los
datos de estas se encuentran registradas en el Anexo E, literal a.
3.2.1.1 Muestreo discrecional.

Se utiliza este tipo de muestreo no probabilístico ya que los transportistas

muestreados fueron elegidos deliberadamente para participar en la investigación.
3.2.1.2 Muestra analítica.

Las muestras de leche se mantuvieron en ultra congelación a -70°C durante 4

meses, se tomó una muestra analítica de 10ml por ensayo una vez descongeladas en agua
a no más de 40°C y se procedió a la extracción. El ensayo se realizó por triplicado.

3.3 Diseño experimental.

3.3.1 Muestreo.

Se receptaron, mediante un muestreo discrecional, las 19 muestras de leche cruda

provenientes de los diferentes transportistas en las oficinas de ASOLECRUM del cantón
Cayambe una vez que ellos recibieron la leche de las comunidades del sector, luego de
receptadas y codificadas desde M1 hasta M19, se mantuvieron en cadena de frío hasta su
transporte al laboratorio para su posterior congelación a -70°C, hasta su análisis. Según
el método oficial AOAC, las muestras de leche cruda y los residuos de sulfamidas son
estables a -80°C por aproximadamente 12 meses, y a -15°C por 3-4 meses. El volumen
de leche recolectado por transportista en el momento del muestreo, el volumen de la
muestra y las comunidades de recolección se observan en el Anexo E, literal a.

24
 3.3.2 Recolección de las muestras.

MÉTODO: Se realizó el muestreo por parte de los transportistas como indica el

instructivo INT/CL/010 Rev. 5 establecido por el Laboratorio de control de calidad de
leche de la Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de la Calidad del Agro
(AGROCALIDAD).

Las muestras fueron representativas del volumen total de leche de donde se

extrajo. Conservadas y manejadas adecuadamente de manera que mantengan sus
características originales hasta su análisis en el laboratorio.

Para el muestreo se sugirieron las siguientes medidas preventivas:

• Se lavarán las manos y se desinfectarán con alcohol antiséptico.

• Se abrirá el recipiente estéril.
• Con la ayuda de un cucharón se tomará la cantidad necesaria para llenar el
recipiente estéril.
• Se rotulará con marcador de tinta indeleble según sistema alfanumérico desde M1
hasta M19.
• Se llenará el instrumento de recolección de datos FO01 (Anexo C, literal a).
EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

- Contenedor térmico.
- Hielo en cubos.
- Cucharón para la toma de muestra.
- Envases recolectores estériles de 100 ml (plástico, polietileno y polipropileno).
- Papel absorbente desechable.
- Marcador de tinta indeleble.
- Formato de registro de datos de los transportistas.
- Alcohol antiséptico (alcohol etílico al 70%).
3.3.3 Almacenamiento de las muestras.

MÉTODO:

- Se colocaron las muestras en un contenedor térmico con tapa, con cubos de hielo.
- Se almacenaron en condiciones adecuadas para su conservación, hasta el destino
final.
- Se colocaron en un ultracongelador a -70 °C.
EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

- Contenedor térmico.
- Cubos hielo.
- Ultra congelador.

25
 3.3.4 Procesamiento de las muestras.

MÉTODO:

- Se constató que los envases de plástico con las muestras se encontraban sellados
y sin presencia de signos de alteración.
- En el momento del análisis las muestras se descongelaron en agua caliente a no
más de 40°C.

EQUIPOS Y MATERIALES

- Olla con tapa.

- Cocineta eléctrica.
3.3.5 Verificación del método.

MÉTODO: AOAC Official Method 993.32. Multiple Sulfonamide Residues in

Raw Bovine Milk. Liquid Cromatographic Method. (Horwitz, 2012). Por tratarse de un
método oficial, éste se verificó previo al análisis de las curvas de calibración y de las
muestras de leche cruda. Según (Eurachem, 2016), si es necesario adaptar o cambiar el
método validado por alguien más, entonces será necesaria la revalidación
correspondiente, es así que al tratarse de una verificación, el método descrito a
continuación es una traducción del método oficial.
3.3.5.1 Preparación de las soluciones estándar.

(a) Solución madre (1000 μg/ml).- Se pesó alrededor de 10 mg, al mg más cercano,
del estándar de sulfadiazina a temperatura ambiente en un vidrio reloj, se
transfirió a un matraz volumétrico de 10 ml. Se disolvió con metanol grado
HPLC, se agitó hasta disolución completa; luego se mantuvo la solución, para
que se reequilibre a la temperatura ambiente, se diluyó a volumen de aforo con
metanol (grado HPLC), y se mezcló completamente.
(b) Solución intermedia (10 μg/ml).- Usando pipetas, se transfirió 1,0 ml de la
solución madre (a) en un matraz volumétrico de 100 ml, se diluyó a volumen con
agua desionizada y destilada (tipo I, grado HPLC), y se mezcló completamente.
(c) Solución de fortificación (1 μg/ml de sulfadiazina).- Usando pipetas de 10 ml,
se transfirieron 10,0 ml de la solución intermedia (b) en un matraz volumétrico
de 100 ml, se diluyó con agua tipo I y se mezcló completamente.
(d) Estándar de sulfadiazina.- (1) 200 μg/kg.- Se diluyeron 10,0 ml de la solución
de fortificación (c) en 50 ml de agua tipo I en un matraz volumétrico de 50 ml y
se mezcló completamente. (2) 100 μg/kg.- Se diluyeron 10,0 ml de la solución de
fortificación (c) en 100 ml de agua tipo I en un matraz volumétrico de 100 ml y
se mezcló completamente. (3) 50 μg/kg.- Se diluyeron 5,0 ml de la solución de
fortificación (c) en 100 ml de agua tipo I en un matraz volumétrico de 100 ml y
se mezcló completamente.

26
 3.3.5.2 Curvas de calibración.

Se inyectaron 80 µl de los estándares de sulfadiazina de 50, 100 y 200 μg/kg. Se

prepararon 5 curvas de calibración por 5 días utilizando el área de los picos. Se utilizó
como fase móvil fosfato diácido de potasio (PDP) y metanol en proporciones 88-12%
respectivamente, el tiempo de corrida fue de 8 minutos, a flujo de 1,200 ml/min,
temperatura de la columna de 35 °C y longitud de onda de 265 nm.
3.3.5.3 Linealidad.

Se determinó la linealidad del método con la ayuda de los coeficientes de

correlación (R2) de los datos de las 5 curvas de calibración.
3.3.5.4 Recuperabilidad.

Según método oficial AOAC, si se desea determinar el porcentaje de recuperación

se procede a fortificar 10 ml de leche de prueba con 50, 100 o 200 μl de una solución 1
μg/ml de sulfadiazina, por lo que se fortificó una porción de prueba de 10 ml de leche
con 200 μl de una solución 1 μg/ml de sulfadiazina, siguiendo el procedimiento de
extracción que se realiza a las muestras de leche cruda.
3.3.5.5 Límite de detección y límite de cuantificación.

Mediante la dilución del estándar de menor concentración utilizado para realizar

las curvas de calibración, se llevó a cabo la lectura cromatográfica. Se utilizó aquel
cromatograma que dio señal de sulfadiazina sin confundir este pico con ruido para el
cálculo del límite de detección y de cuantificación.
3.3.6 Análisis de las muestras.

3.3.6.1 Extracción de las muestras.

- Se colocó papel filtro cuantitativo en un embudo y se lavó con 5 ml de solución

extractora [Cloroformo-Acetona (2 + 1, v/v)], se descartó el filtrado.
- Se pipetearon 10 ml de las muestras individuales de leche cruda en un embudo de
separación y se tapó.
- Se añadieron 50 ml de la solución extractora.
- Se agitó por 1 minuto vigorosamente y se eliminó el gas producido por el tapón
y no por la llave, para evitar pérdidas de analito por taponamiento.
- Se agitó por 1 minuto más, eliminando el gas producido y se dejó decantar hasta
separación de las fases por 1 minuto.
- Se agitó nuevamente, según la secuencia anterior y se dejó reposar por 5 minutos
hasta separación de las fases.
- Se vació la fase de la solución de extracción (fase inferior) y se filtró a través del
papel filtro cuantitativo en un balón fondo redondo con boca esmerilada de 100
ml.

27
 - Se añadieron 25 ml más de la solución extractora en el mismo embudo de
separación y se repitió el proceso anterior. Luego de filtrar la segunda extracción
en el mismo balón de boca esmerilada, se enjuagó dos veces el papel filtro con
5ml de solución extractora y se recogieron los lavados en el mismo matraz. Se
realizó el análisis por triplicado.
3.3.6.2 Preparación de la porción de prueba.

- Cuidadosamente se evaporó el extracto de la solución hasta sequedad en un

rotavapor a 32° ± 2°C. Durante los primeros minutos se reguló cuidadosamente
el vacío para evitar la formación de espuma.
- Se disolvió el residuo en 1 ml de solución de PDP 0,1 M, agitando
energéticamente por 1 min en un agitador Vortex.
- Inmediatamente se añadieron 5 ml de hexano y se mezcló en un agitador Vortex
por 1 min.
- Se dejó que las fases se separen por 2 min; e inmediatamente se mezcló en el
Vortex por 1 min más. Se dejó que las fases se separen por ≥15 min antes de
remover la capa acuosa (inferior).
- Usando una micropipeta de 1 ml, se extrajo la capa acuosa e inmediatamente se
colocó en una jeringa con un microfiltro de 0,22 μm. Se filtró la fase acuosa
directamente en un vial de vidrio de 2 ml.
3.3.6.3 Determinación del analito.

Se inyectaron 80 µl del extracto de prueba en el sistema de cromatografía líquida,

con fosfato diácido de potasio (PDP) y metanol como fase móvil en proporciones 88-
12% respectivamente, el tiempo de corrida fue de 8 minutos, a flujo de 1,200 ml/min,
temperatura de la columna de 35 °C y longitud de onda de 265 nm.

EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

- Sistema de cromatografía líquida Dionex UltiMate 3000 UHPLC+ focused con
detector de matriz de diodos UltiMate 3000 a 265 nm.
- Columna de cromatografía líquida Purospher® STAR RP-18 endcapped (5 μm)
(LiChroCART® 150-4.6).
- Rotavapor IKA® RV 10 y Rotavapor BÜCHI® R-205.
- Pipetas volumétricas.- 10ml, 5ml. Pipetas automáticas.- 1 ml, y 5 ml.
- Puntas para pipetas automáticas de 1 ml y 5 ml.
- Papel filtro cuantitativo.
- Filtros de jeringa en PVDF (polifluoruro de vinilideno) de 0,22 µm de porosidad,
13 mm de diámetro.
- Agitador Vortex.
- Embudo de separación.- 125 ml, con tapón de vidrio y llave de teflón.
- Embudo de vástago corto, 75 mm de diámetro.
- Balón fondo redondo con boca esmerilada.- 100 ml.
- Matraces volumétricos.- 50 ml, 100 ml y 2 L.

28
 - Soporte para embudos de separación.
- Agua destilada y desionizada (tipo I, grado HPLC).
- Solución 0,1M de Fosfato diácido de Potasio (PDP).
- Solventes.- metanol (grado HPLC), n-hexano, acetona y cloroformo.
- Fase móvil.- 12% de metanol - solución PDP [12 + 88, (v/v)].
- Soluciones de enjuague.- (1) 12% de metanol – agua (12 + 88, v/v). (2) 30% de
metanol – agua (30 + 70, v/v).
- Solución extractora.- Cloroformo-Acetona (2 + 1, v/v). Preparada el mismo día
del análisis, aproximadamente 100 ml/prueba. Añadir la acetona al cloroformo,
medidos separadamente en probetas y mezclar completamente. Dejar que la
mezcla se equilibre (aprox. 10-15 min) a temperatura ambiente antes de usarla.
- Estándar de sulfadiazina (99,9%) (Anexo H).
3.4 Matriz de operacionalización de variables

Variable de caracterización

• Muestras de leche cruda de cada transportista de la Asociación de Transportistas

de Leche Cruda de Cayambe (ASOLECRUM).
Variable de interés

• Concentración residual de sulfadiazina.

Tabla 5. Matriz de operacionalización de variables.

Variables Dimensiones Indicadores

V. de caracterización
Comunidades de o Número de comunidades de
Muestras de leche cruda de
recolección estudio
ASOLECRUM.

Concentración de
o Tiempo de retención (min)
antibiótico
o Área del pico (mAU*min)
sulfadiazina en
o Concentración (μg/kg)
muestras
V. de interés
o Parámetros de la curva de
Concentración residual de
calibración
sulfadiazina. Indicadores de
o Coeficiente de correlación
eficiencia del
o Recuperabilidad (%)
método
o Límite de detección (μg/kg)
o Límite de cuantificación (μg/kg)
Elaborado por: Miller Espinoza

3.5 Técnicas e instrumentos de recolección de datos

Las muestras se identificaron individualmente mediante un sistema alfanumérico

el mismo que lleva la letra M referente a muestra y el número del 1 hasta el 19; y se
registraron los datos de las comunidades de las que se recolectó la leche cruda, así como
el volumen de recolección de cada transportista según formato FO01 (Anexo C, literal
a). Una vez recibidas las muestras, fueron codificadas, en función del listado de

29
integrantes de ASOLECRUM, desde M1 hasta M19 y detalladas en el formato de
recolección de datos (Anexo C, literal a). Se utilizó un instrumento de recolección de
datos en los lugares de expendio de insumos agropecuarios codificado como FO02
(Anexo C, literal b) para determinar la prevalencia de los medicamentos veterinarios con
sulfonamidas como parte de su composición. Los distribuidores se identificaron mediante
un sistema alfanumérico, mediante la letra D y el número del 1 al 5.
Se utilizaron dos matrices de recolección de datos para los resultados obtenidos
por cromatografía, donde se especifica el tiempo de retención (min), área del pico
(mAU*min) y concentración (μg/kg), tanto para las curvas de calibración como para las
muestras de leche cruda.
3.5.1 Validez de los instrumentos de recolección de datos.

El formato de recolección de datos de los transportistas de leche cruda de

ASOLECRUM, el formato de recolección de datos de los lugares de expendio de insumos
agropecuarios y matrices de recolección de datos, fueron validados por 3 expertos, debido
a que fueron creados por el investigador. Dichas validaciones se encuentran en el Anexo
D.
3.6 Técnicas y Procesamiento de datos

El equipo de cromatografía líquida (HPLC) utiliza el programa Chromeleon TM

Chromatography Data System (CDS), software donde al realizar la corrida
cromatográfica de las muestras, indicó el área del pico en un tiempo programado de
integración, posteriormente se calculó la concentración del analito mediante la utilización
de la ecuación de la curva de calibración media.

Se realizó un análisis de comparación con el límite máximo de residuos (LMR)

de la cantidad de muestras analizadas y la concentración en μg/kg de residuo de
antibiótico cuantificada. La comparación se efectuará para el antibiótico en cuestión,
obteniéndose 2 gráficos, el primero donde se encontrarán la totalidad de los datos por
triplicado, y el segundo con un promedio de las concentraciones, ambos especificando el
LMR establecido como 100 μg/kg por la Unión Europea. Se obtuvieron 5 gráficas de las
curvas de calibración con las concentraciones especificadas del estándar según la técnica
AOAC y posteriormente corregidas con la pureza del producto, de las cuales se obtuvo
una curva de calibración media con su respectiva ecuación.

Para la validación de las hipótesis se llevó a cabo un análisis de varianza mediante

ANOVA de un factor, donde se evaluó la F de Fisher y la probabilidad para verificar si
existe o no diferencia significativa entre las medias de las muestras.

30
 Capítulo IV

Análisis y discusión de resultados

4.1 Corrección de la concentración

La corrección de la concentración de la solución madre se realizó tomando en

cuenta la pureza del estándar de sulfadiazina especificado en el Anexo H, y el peso
utilizado para su preparación. Así, con un peso utilizado de 9,8 mg de estándar de
sulfadiazina de pureza 99,9% y aforados a 10 ml con metanol, se obtiene una
concentración de 0,98 mg/ml, es decir 979,02 μg/kg. A partir de esta solución se
obtuvieron las demás por dilución.
4.2 Verificación de desempeño del método

Para verificar el desempeño del método, previo a su aplicación en las muestras de

leche cruda, se evaluaron los siguientes parámetros:

- Linealidad (coeficiente de correlación)

- Recuperabilidad o porcentaje de recuperación
- Límite de detección
- Límite de cuantificación
4.2.1 Linealidad.

Para garantizar la confiabilidad del método se realizó la lectura cromatográfica

del área de los picos correspondiente a las concentraciones estándar especificadas por la
técnica AOAC, además, se aumentaron dos puntos (concentraciones) por encima del
máximo especificado por la técnica para asegurar aún más su confiabilidad y con la
finalidad de que todas las áreas de las muestras estén dentro de dicho rango de trabajo
(50 – 1000 μg/kg). Los resultados de las 5 curvas de calibración se muestran en la Tabla
6 y sus cromatogramas en el Anexo F.

31
Tabla 6. Resultados de las áreas de los picos en los cromatogramas del estándar de
sulfadiazina.
Concentración Concentración
Área del
teórica del corregida del Tiempo de
pico
estándar estándar retención (min)
(mAU*min)
(μg/kg) (μg/kg)
6,997 0,1126
6,977 0,1183
50 48,95 6,980 0,1150
6,977 0,1180
6,970 0,1224
6,970 0,2364
6,970 0,2374
100 97,90 6,967 0,2347
6,963 0,2317
6,960 0,2314
6,957 0,4727
6,950 0,4594
200 195,80 6,947 0,4627
6,947 0,4583
6,943 0,4639
6,933 0,7012
6,933 0,6962
300 293,71 6,930 0,6837
6,927 0,6789
6,923 0,6849
6,823 1,9703
6,823 1,9703
1000 979,02 6,823 1,9703
6,823 1,9703
6,823 1,9703
Elaborado por: Miller Espinoza
Los gráficos de las 5 curvas de calibración se muestran a continuación.

2,5000
Área del pico (mAU*min)

2,0000 y = 0,002x + 0,0631

R² = 0,9968

1,5000

1,0000

0,5000

0,0000
0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00
Concentración (μg/kg)

Gráfico 1. Curva de calibración para sulfadiazina N°1

Elaborado por: Miller Espinoza

32
 2,5000

Área del pico (mAU*min)

2,0000 y = 0,002x + 0,0607
R² = 0,9975
1,5000

1,0000

0,5000

0,0000
0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00
Concentración (μg/kg)

Gráfico 2. Curva de calibración para sulfadiazina N°2

Elaborado por: Miller Espinoza

2,5000
Área del pico (mAU*min)

2,0000 y = 0,002x + 0,0569

R² = 0,9979

1,5000

1,0000

0,5000

0,0000
0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00
Concentración (μg/kg)

Gráfico 3. Curva de calibración para sulfadiazina N°3

Elaborado por: Miller Espinoza

2,5000
Área del pico (mAU*min)

2,0000 y = 0,002x + 0,0547

R² = 0,9982

1,5000

1,0000

0,5000

0,0000
0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00
Concentración (μg/kg)

Gráfico 4. Curva de calibración para sulfadiazina N°4

Elaborado por: Miller Espinoza

33
 2,5000

Área del pico (mAU*min)

2,0000 y = 0,002x + 0,059
R² = 0,998

1,5000

1,0000

0,5000

0,0000
0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00
Concentración (μg/kg)

Gráfico 5. Curva de calibración para sulfadiazina N°5

Elaborado por: Miller Espinoza

En los gráficos de las curvas de calibración se puede observar una tendencia lineal
de la curva, obteniéndose factores de correlación (R2) cercanos a 1, por ello se aceptó el
ensayo.

4.2.2 Cálculo del porcentaje de recuperación.

El cálculo del porcentaje de recuperación se llevó a cabo dosificando 200 μl de la

solución de fortificación de sulfadiazina (1 μg/ml) en 10 ml de leche de prueba, es decir,
una concentración final de 20 μg/kg, aplicando el porcentaje de pureza y el peso del
estándar usado para la preparación de la solución madre, se obtiene una concentración
real de 19,58 μg/kg. El método oficial de la AOAC indica un porcentaje de recuperación
del 75,01%, según resultados de estudios interlaboratorios (Horwitz, 2012). Se
fortificaron 5 leches de prueba codificadas como MF1 hasta MF5.
Para el cálculo de la concentración de las muestras fortificadas se utilizó la
ecuación obtenida de la curva de calibración del Gráfico 6, la misma que relaciona la
absorbancia en unidades de (mAU*min) con la concentración del analito en cuestión en
(μg/kg). Despejando 𝑥 de la ecuación de la curva de calibración media (Ecuación 1) y
reemplazando el valor del área obtenida por cromatografía en 𝑦 se obtiene la
concentración del analito.

Ecuación 1. Ecuación para sulfadiazina

𝑦 = 0,0020𝑥 + 0,0589

En la tabla 7 se muestra el análisis realizado de las muestras fortificadas con una

solución de concentración teórica de 20 μg/kg de sulfadiazina. Se observa que se cumple
con lo establecido según estudios interlaboratorios realizados en el método oficial de la
AOAC. Las muestras fortificadas con resultados menores a 75% de recuperabilidad
pudieron haber sufrido pérdidas del analito en el proceso de extracción.

34
Tabla 7. Resultados del análisis de recuperabilidad de muestras fortificadas.
Recuperabilidad de muestras fortificadas
Concentración
Nombre Tiempo de Área del pico Concentración
añadida % Recuperación
muestra retención (min) (mAU*min) (μg/kg)
(μg/kg)
MF1 6,567 0,3514 14,62 19,58 74,69
MF2 6,557 0,3331 13,79 19,58 70,44
MF3 6,553 0,3069 12,55 19,58 64,09
MF4 6,553 0,2681 13,41 19,58 68,46
MF5 6,557 0,3052 12,54 19,58 64,05
Elaborado por: Miller Espinoza
4.2.3 Cálculo del límite de detección del método (LOD)

En la tabla 8 se observan los resultados de la desviación estándar de las lecturas

del estándar de concentración 20 μg/kg.
En el ensayo no se trabajó con un blanco. Se llevaron a cabo varias lecturas
cromatográficas diluyendo la solución estándar de menor concentración, es decir, la de
50 μg/kg, se diluyó a 20 μg/kg, 10 μg/kg, 5 μg/kg, 0,5 μg/kg y 0,05 μg/kg. Así, se observó
que el equipo dio señal de un pico definido a una concentración mínima de 20 μg/kg.

Tabla 8. Resultados del estándar de concentración 20 μg/kg

Área del pico Concentración
(mAU*min) (μg/kg)
0,0961 18,60
0,0907 15,90
0,0897 15,40
0,0886 14,85
0,0856 13,35
Promedio ( ) 15,62 μg/kg
Desviación estándar 1,92
LOD 21,96 μg/kg
LOQ 34,82 μg/kg
Elaborado por: Miller Espinoza

Para el cálculo del límite de detección (LOD) se debe determinar la desviación

estándar, 𝑠0, de las réplicas obtenidas del estándar de 20 μg/kg según la Ecuación 2.

Ecuación 2. Ecuación para calcular la desviación estándar

0,5
𝑠0 = [∑(𝑥𝑖 − 𝑥̅ )2 /𝑛]

Donde:
𝑠0 es la desviación estándar estimada de n resultados individuales.
𝑥𝑖 es cada réplica de observación.
𝑥̅ es el promedio de las réplicas de observación.
𝑛 es el número de réplicas de observación promediadas cuando se informan resultados donde cada réplica
es obtenida siguiendo enteramente el procedimiento de medición (Eurachem, 2016).

35
 Así, para las 5 lecturas realizadas del estándar de 20 μg/kg se obtuvo una
desviación estándar de 1,92. Para el cálculo del LOD, según (AOAC, 2011), se debe
utilizar la Ecuación 3.
Ecuación 3. Ecuación para el cálculo del LOD

𝐿𝑂𝐷 = 𝑥̅ + 𝑧 𝑠0
Donde:
𝑠0 es la desviación estándar.
𝑧 es 2 x Valor Crítico Gaussiano = 2 x 1,645 = 3,30.

Así, para la desviación estándar calculada se obtuvo un LOD de:

𝐿𝑂𝐷 = 15,62 + (3,30 × 1,92)

𝑳𝑶𝑫 = 𝟐𝟏, 𝟗𝟔 𝝁𝒈/𝒌𝒈

4.2.4 Cálculo del límite de cuantificación del método (LOQ)

Para el cálculo del límite de cuantificación (LOQ) se utilizó el anexo de la guía

AOAC (AOAC, 2011), donde se calcula aplicando la Ecuación 4.
Ecuación 4. Ecuación para el cálculo del LOQ

𝐿𝑂𝑄 = 𝑥̅ + 10 𝑠0

Así, para una desviación estándar de 1,92 se tiene que el límite de cuantificación es:

𝐿𝑂𝑄 = 15,62 + (10 × 1,92)

𝑳𝑶𝑸 = 𝟑𝟒, 𝟖𝟐 𝝁𝒈/𝒌𝒈

4.2.5 Curva de calibración media.

Se obtuvo una curva de calibración media con su respectiva ecuación, la misma

que se utilizó para el cálculo de la concentración de las muestras despejando 𝑥 y
reemplazando el valor del área obtenida por cromatografía en 𝑦, así se obtiene la
concentración del analito en cuestión.

36
 2,5000

Área del pico (mAU*min)

2,0000 y = 0,002x + 0,0589
R² = 0,9977

1,5000

1,0000

0,5000

0,0000
0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00
Concentración (μg/kg)

Gráfico 6. Curva de calibración media para sulfadiazina

Elaborado por: Miller Espinoza

4.3 Resultados del análisis

El análisis de las muestras de leche cruda se desarrolló en 3 corridas

cromatográficas y los resultados por triplicado pueden observarse en la Tabla 9,
expresados en μg/kg, así como representadas en el Gráfico 7. Para el cálculo de la
concentración de las 19 muestras se utilizó la ecuación obtenida de la curva de calibración
media del Gráfico 6, la misma que se obtuvo mediante la relación del área del pico vs. la
concentración del estándar; se despejó la incógnita 𝑥 y se reemplazó el área obtenida por
cromatografía en 𝑦. En el Gráfico 8 se observan las concentraciones medias de residuos
de sulfadiazina en las muestras analizadas.

De un total de 19 muestras analizadas, 7 muestras (37%), no superaron el límite

máximo de residuos para sulfadiazina, de las cuales 6 muestras (32%) se encuentran por
debajo del límite de detección del método (21,96 μg/kg); mientras que 12 muestras (63%)
superaron el LMR establecido como 100 μg/kg por el Reglamento de la Unión Europea.
Los resultados para las muestras que presentaron una concentración mayor al
LMR establecido para sulfadiazina se pueden observar en el Anexo E, literal d.

37
 800

700

600
Concentración (μg/kg)

500

400

300

200

100

0
M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19
Identificación de muestra

Gráfico 7. Representación gráfica del análisis por triplicado de las muestras de leche
cruda con respecto al límite máximo de residuos (LMR)
Elaborado por: Miller Espinoza

800

700

600
Concentración (μg/kg)

500

400

300

200

100

0
M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19
Identificación de muestra

Gráfico 8. Representación gráfica de las concentraciones promedio del análisis de las

muestras con respecto al límite máximo de residuos (LMR)
Elaborado por: Miller Espinoza

38
Tabla 9. Resultados del análisis cromatográfico de las muestras de leche cruda.
Dionex UltiMate 3000 UHPLC+ focused con detector de matriz de diodos
Equipo
UltiMate 3000
Fecha de análisis 11-07-2018 – 13-07-2018
Analista Miller Espinoza

Tiempo de Promedio
Nombre de Área Concentración
retención concentración Observación
muestra (mAU*min) (μg/kg)*
(min) (μg/kg)
7,043 3,2276 158,44
M1 7,040 2,3582 114,97 144,87 NO CUMPLE
7,043 3,2833 161,22
7,000 7,2314 358,63
M2 7,010 7,3944 366,78 365,00 NO CUMPLE
7,013 7,4507 369,59
6,973 3,4024 167,18
M3 6,970 3,3933 166,72 166,71 NO CUMPLE
6,973 3,3834 166,23
7,043 8,0960 401,86
M4 7,040 8,1329 403,70 401,67 NO CUMPLE
7,047 8,0477 399,44
7,120 2,3639 115,25
M5 7,120 2,4221 118,16 117,18 NO CUMPLE
7,123 2,4214 118,13
N.A. 0,0000 <21,96
M6 N.A. 0,0000 <21,96 <21,96 CUMPLE
N.A. 0,0000 <21,96
7,100 13,3491 664,51
M7 7,107 13,5523 674,67 670,49 NO CUMPLE
7,107 13,5046 672,29
6,850 0,7691 35,51
M8 6,830 0,1056 2,34 <21,96 CUMPLE
6,817 0,4776 20,94
7,023 8,5794 426,03
M9 7,013 8,5331 423,71 424,39 NO CUMPLE
7,017 8,5274 423,43
6,987 3,4788 171,00
M10 6,993 3,5265 173,38 172,95 NO CUMPLE
6,997 3,5486 174,49
7,067 6,1875 306,43
M11 7,063 6,2101 307,56 306,87 NO CUMPLE
7,067 6,1915 306,63
7,043 1,5229 73,20
M12 7,047 1,5063 72,37 72,19 CUMPLE
7,050 1,4786 70,99
7,070 2,1295 103,53
M13 7,077 2,0987 101,99 102,39 NO CUMPLE
7,077 2,0921 101,66
7,057 6,0161 297,86
M14 7,057 6,0378 298,95 298,40 NO CUMPLE
7,057 6,0268 298,40
6,793 4,6355 228,83
M15 6,797 4,5586 224,99 226,04 NO CUMPLE
6,800 4,5447 224,29
N.A. N.A. <21,96
M16 N.A. N.A. <21,96 <21,96 CUMPLE
N.A. N.A. <21,96

39
 6,833 0,3211 13,11
M17 N.A. N.A. <21,96 <21,96 CUMPLE
N.A. N.A. <21,96
N.A. N.A. <21,96
M18 N.A. N.A. <21,96 <21,96 CUMPLE
N.A. N.A. <21,96
N.A. N.A. <21,96
M19 N.A. N.A. <21,96 <21,96 CUMPLE
N.A. N.A. <21,96
* Los residuos secos extraídos de 10 ml de muestra de leche son redisueltos en un volumen final de 1 ml de PDP; por lo tanto, un
análisis de 100 μg/kg en el extracto final es equivalente a 10 μg/kg de ese analito en la muestra.

800,00

700,00 670,49
Concentración (μg/kg)

600,00

500,00
424,39
401,67
400,00 365,00
306,87 298,40
300,00
226,04
166,71 172,95
200,00 144,87
117,18 102,39
72,19
100,00
19,59
0,00 0,00 2,41 0,00 0,00
0,00

Identificación de muestra

Gráfico 9. Resultados de concentraciones de sulfadiazina en muestras de leche cruda

Elaborado por: Miller Espinoza
4.3.1 Análisis de varianza (ANOVA).

Según (Eurachem, 2016) la idea central de este análisis es cuando en una serie de
datos replicados éstos se pueden agrupar de una misma manera, en este caso por
transportista de leche cruda. Siendo la varianza total, la combinación de las varianzas 𝑠 2
entre grupos y dentro de los grupos. Así, (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2012)
nos señala que se trata de un diseño completamente al azar, debido a que se están tomando
en cuenta dos fuentes de variabilidad: los tratamientos y el error aleatorio.
El objetivo de un análisis en un Diseño Completamente al Azar (DCA) es probar
la hipótesis de igualdad de los tratamientos con respecto a la media de la correspondiente
variable de respuesta. Una forma de rechazar o no una hipótesis es mediante la prueba F,
donde recurriendo a tablas se lee un valor crítico para un α y grados de libertad
correspondientes al tratamiento. Deduciendo que si el F calculado es mayor al F crítico,
se rechaza la hipótesis nula y se concluye que existe diferencia entre los tratamientos
(Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2012). El análisis de varianza se especifica en la
Tabla 10, según (Eurachem, 2016).

40
Tabla 10. Estructura de una tabla ANOVA de un factor.
Fuente de
Suma de cuadrados (SS) 𝒗 Cuadrado Medio (MS) Fexp P Fcrít
variación
Entre grupos 𝑆𝑆𝑒 𝑝−1 𝑀𝑆𝑒 = 𝑆𝑆𝑒 /(𝑝 − 1) 𝑀𝑆𝑒 /𝑀𝑆𝑖
Intra grupo
𝑆𝑆𝑖 𝑁−𝑝 𝑀𝑆𝑑 = 𝑆𝑆𝑑 /(𝑁 − 𝑝)
(residuales)
Total 𝑆𝑆𝑡𝑜𝑡 = 𝑆𝑆𝑒 + 𝑆𝑆𝑖 𝑁−1
(Eurachem, 2016)
Así, para determinar si existe diferencia significativa entre las medias de las
réplicas de las 19 muestras (transportistas), se obtiene el análisis de ANOVA, de un
diseño completamente al azar (DCA), donde se plantean las siguientes hipótesis:
Hipótesis nula: H0: La comunidad de la que proviene la leche cruda no difiere
significativamente sobre la concentración del antibiótico en las muestras.
Hipótesis alterna: H1: La comunidad de la que proviene la leche cruda difiere
significativamente sobre la concentración del antibiótico en las muestras.

Tabla 11. Análisis de varianza de las réplicas de las muestras.

Grados Valor
Origen de las Suma de Promedio de
de F Probabilidad crítico
variaciones cuadrados los cuadrados
libertad para F
Entre grupos 1874538,17 18 104141,01 1817,06 3,72E-50 1,88
Dentro de los
2177,89 38 57,31
grupos
Total 1876716,06 56
Elaborado por: Miller Espinoza

Podemos observar en el análisis de varianza que la 𝐹𝑒𝑥𝑝 es mayor que la 𝐹𝑐𝑟í, por
lo tanto, se acepta la hipótesis alterna, que la comunidad de la que provienen las muestras
de leche difiere significativamente en la concentración del antibiótico. Además, se
observa que el valor P o valor de probabilidad en menor a 0,05, lo que también hace que
se rechace la hipótesis nula.

4.3.2 Diagrama de cajas simultáneo.

Este tipo de diagrama se utiliza para describir el comportamiento de los datos.

Comparando las diferentes muestras de los transportistas, podemos observar que la
muestra 1 y la muestra 8 poseen variabilidad entre sus repeticiones, es decir, el método
de extracción realizado por triplicado se vio afectado por algún fenómeno ajeno al
proceso.

41
Gráfico 10. Diagrama de caja para los resultados de las concentraciones de sulfadiazina
de las muestras
Elaborado por: Miller Espinoza

4.3.3 Gráfico de medias.

Este tipo de gráfico se utiliza una vez que se ha rechazado la hipótesis nula
planteada mediante el análisis de ANOVA (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2012),
es decir que no hay igualdad entre las medias. En el gráfico 8 se observa una comparación
visual y estadística de las medias.

Gráfico 11. Gráfico de medias para los resultados de las concentraciones de

sulfadiazina de las muestras
Elaborado por: Miller Espinoza

42
 Capítulo V

Conclusiones y Recomendaciones

5.1 Conclusiones

• Se obtuvo información sobre los medicamentos veterinarios a base de

sulfonamidas en expendio en la ciudad de Cayambe mediante la recolección de
datos en locales comerciales, observándose alrededor de 6 formas farmacéuticas
con al menos una sulfonamida en su composición. La sulfadiazina se encontró
como componente principal en 3 medicamentos de los que se venden en dichos
lugares.
• Se verificó el método oficial de la AOAC mediante la determinación de la
linealidad, recuperabilidad y límites de detección y cuantificación. La curva de
calibración presentó una tendencia lineal con un coeficiente de correlación de
0,9977, el límite de detección del método fue de 21,96 μg/kg y el límite de
cuantificación de 34,82 μg/kg.
• Se cuantificó por triplicado la cantidad de residuos de sulfadiazina expresados en
μg/kg mediante el área del pico obtenido por Cromatografía Líquida de Alta
Eficacia en un total de 19 muestras compuestas de leche cruda correspondientes
a los 19 transportistas de ASOLECRUM.
• Se compararon las concentraciones de sulfadiazina de las muestras de leche cruda
obtenidas por cromatografía con el reglamento N°37/2010 sobre sustancias
farmacológicamente activas y su clasificación en relación con los límites
máximos de residuos en los alimentos de origen animal de la Unión Europea y se
encontró que el 63% de las muestras superaron el límite máximo de residuos
establecido como 100 μg/kg.
5.2 Recomendaciones

• Se recomienda que, para evitar la presencia de residuos de éste u otro tipo de

antibióticos en los alimentos de consumo humano, se fomenten campañas de
concientización sobre el uso adecuado de estos medicamentos veterinarios.
• Dentro de la vigilancia realizada por las entidades gubernamentales para el
control de los medicamentos veterinarios, se recomienda que se realice este tipo
de análisis en diferentes localidades a nivel nacional, con la finalidad de mantener
la inocuidad de éste y otros tipos de alimentos de consumo humano.
• Con la finalidad de asegurar la inocuidad de los alimentos de consumo humano,
se recomienda que se realice este análisis en diferentes grupos de alimentos, por
ejemplo: carne de bovino, porcino o aviar, así como en sus derivados.

43
• En cuanto a la normativa que rige en Ecuador, es de suma importancia especificar
un límite máximo de residuo para sulfadiazina, ya que existe información de su
importación y utilización en el país como medicamento veterinario.

44
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48
 ANEXOS

Anexo A. Esquema Causa- Efecto.

Alimentos de origen Bacterias resistentes Poca competencia

animal sobrepasan los LMR se transfieren a humanos comercial

Se recurre a Se recurre a métodos

Pérdidas económicas combinación de antibióticos cualitativos

Residuos de sulfadiazina en leche

cruda de ASOLECRUM del
cantón Cayambe
Dosis incorrectas
No hay personal
calificado

No se conoce la Personal no
normativa nacional Equipamiento de
calificado laboratorio costoso

49
Anexo B. Categorización de variables.

- Muestras de leche cruda de transportistas de ASOLECRUM

Comunidades
productoras

Asociación de
transportistas

Muestras de
leche cruda

Muestreo Obtención de Tratamiento

discrecional información estadístico

- Concentración residual de sulfadiazina

Salud pública

Normativa
(LMR)

Concentración
residual de
sulfadiazina

Análisis Tratamiento
Extracción
cromatográfico estadístico

50
Anexo C. Instrumentos y matrices de recolección de datos.

a) Instrumento de recolección de datos de los transportistas de ASOLECRUM.

RECOLECCIÓN DE DATOS DE LOS

FO01
TRANSPORTISTAS DE ASOLECRUM
Rev 1
Hoja N°
2) Nombre del
1) Fecha:
recolector de datos:

3) Lugar:

4) Ubicación del lugar: Provincia: Cantón:

Cantidad de Cantidad
Codificación de
leche muestreada de Comunidades de recolección de leche
transportista
transportada (L) leche (ml)

51
 b) Instrumento de recolección de datos de medicamentos veterinarios.

RECOLECCIÓN DE DATOS DE
MEDICAMENTOS VETERINARIOS CON FO02
SULFONAMIDAS
Rev 1
Hoja N°
2) Nombre del
1) Fecha:
recolector de datos:

3) Ubicación: Provincia: Cantón:

Codificación de Nombre comercial Medicamento con

Composición
distribuidor del medicamento Sulfadiazina*

* Marcar con una X si el medicamento veterinario posee sulfadiazina en su composición.

Codificación de Total medicamentos Total medicamentos

distribuidor con sulfonamidas con sulfadiazina

52
 c) Matriz de recolección de datos del análisis de las curvas de calibración.

Equipo
Fecha de análisis
Analista

DÍA 1
Concentración Concentración Tiempo de Área del pico
N° de estándar
teórica (μg/kg) corregida (μg/kg) retención (min) (mAU*min)

DÍA 2
Concentración Concentración Tiempo de Área del pico
N° de estándar
teórica (μg/kg) corregida (μg/kg) retención (min) (mAU*min)

DÍA 3
Concentración Concentración Tiempo de Área del pico
N° de estándar
teórica (μg/kg) corregida (μg/kg) retención (min) (mAU*min)

DÍA 4
Concentración Concentración Tiempo de Área del pico
N° de estándar
teórica (μg/kg) corregida (μg/kg) retención (min) (mAU*min)

DÍA 5
Concentración Concentración Tiempo de Área del pico
N° de estándar
teórica (μg/kg) corregida (μg/kg) retención (min) (mAU*min)

53
 d) Matriz de recolección de datos del análisis cromatográfico de las muestras de
leche cruda, muestras fortificadas y concentración estándar de 20 (μg/kg).

Equipo
Fecha de análisis
Analista

Tiempo de Promedio
Nombre de Área del pico Concentración
retención concentración Observación**
muestra (mAU*min) (μg/kg)*
(min) (μg/kg)

* Los residuos secos extraídos de 10 ml de muestra de leche son redisueltos en un volumen final de 1 ml de PDP; por lo tanto, un
análisis de 100 μg/kg en el extracto final es equivalente a 10 μg/kg de ese analito en la muestra.
** CUMPLE, si se encuentra por debajo del LMR, NO CUMPLE, si supera el LMR. (LMR= 100 μg/kg)

54
Anexo D. Validación de los instrumentos y matrices de recolección de datos.

55
56
57
Anexo E. Recolección de datos.

a) Recolección de datos de los transportistas y las muestras en las instalaciones de

ASOLECRUM.

RECOLECCIÓN DE DATOS DE LOS

FO01
TRANSPORTISTAS DE ASOLECRUM
Rev 1
Hoja N°
2) Nombre del
1) Fecha: 20-03-2018 Miller Angel Espinoza Bravo
recolector de datos:

3) Lugar: Oficina ASOLECRUM

4) Ubicación del lugar: Provincia: Pichincha Cantón: Cayambe

Cantidad de Cantidad
Codificación de
leche muestreada de Comunidades de recolección de leche
transportista
transportada (L) leche (ml)
M1 600 100 Juan Montalvo, Espiga de Oro
M2 400 100 San Esteban
M3 400 100 San Esteban, La Compañía
M4 99 Nuevos Horizontes, San Luis
100
de Guachalá
Hacienda la Alegría,
M5 320 100
Tabacundo
M6 70 100 Chaguarpungo
M7 350 100 Hato Pucará
M8 875 100 Cangahua, Porotog
M9 1200 100 Guachalá
M10 250 100 Cochas y Chilco, Angocagua
M11 4000 100 Quiroga
M12 800 100 Juan Montalvo
M13 90 50 Juan Montalvo
M14 80 100 Cangahua
M15 200 60 Porotog
M16 1000 100 Cariacu
Cariacu, Paquiestancia, Santo
M17 1600 100
Domingo de Guzmán
Hacienda Granobles,
M18 680 100
Tupigachi, Hacienda la Alegría
M19 200 100 Tabacundo

58
 b) Recolección de datos de medicamentos veterinarios en locales de expendio de
insumos agropecuarios en la ciudad de Cayambe.

RECOLECCIÓN DE DATOS DE
MEDICAMENTOS VETERINARIOS CON FO02
SULFONAMIDAS
Rev 1
Hoja N° 1
2) Nombre del
1) Fecha: 21-08-2018 Miller Angel Espinoza Bravo
recolector de datos:

3) Ubicación: Provincia: Pichincha Cantón: Cayambe

Cantidad de
Codificación de Nombre comercial
medicamentos con Composición
distribuidor del medicamento
sulfadiazina
Zinaprim Sulfametazina, Trimetoprim
Streptosul Tetraciclina, Sulfadimetoxina, Colistina
Sulfadimetoxina Sódica, Vitamina A,
Sulfavit
Vitamina K
D1 Sultrivet Sulfadoxina, Trimetoprim
Sulfagan X Sulfadiazina sódica, Trimetoprim
Sulfadiazina +
Trimetoprim 48% X Sulfadiazina, Trimetoprim
inyectable
Zinaprim Sulfametazina, Trimetoprim
Sulfadimetoxina Sódica, Vitamina A,
D2 Sulfavit
Vitamina K
Sultrivet Sulfadoxina, Trimetoprim
Sulfametazina sódica, bromhexina
Tilotex-30
D3 clorhidrato
Zinaprim Sulfametazina, Trimetoprim
Sulfaquinoxalina, Sulfamerazina,
Sulfametazina, Sulfatiazol, Trimetoprim,
Sulfatex
Vitaminas A, B1, Calcio, Potasio, Sodio,
Magnesio, dextrosa
Oxitetraciclina +
Oxitetraciclina, Sulfamerazina
D4 Sulfamerazina
Sulfagan X Sulfadiazina, Trimetoprim
Sulfadimetoxina Sódica, Vitamina A,
Sulfavit
Vitamina K
Sultrivet Sulfadoxina, Trimetoprim
Sulfantipestina Sulfadimidina sódica
Sulfadiazina +
Trimetoprim 48% X Sulfadiazina, Trimetoprim
inyectable
D5
Sulfadimetoxina Sódica, Vitamina A,
Sulfavit
Vitamina K
Sulfadiazina, Trimetoprima, Carbonato
Sulfaprex X cálcico
* Marcar con una X si el medicamento veterinario posee sulfadiazina en su composición.

59
 RECOLECCIÓN DE DATOS DE
FO02
MEDICAMENTOS VETERINARIOS
Rev 1
Hoja N° 2

Codificación de Total medicamentos Total medicamentos

distribuidor con sulfonamidas con sulfadiazina
D1 6 2
D2 3 0
D3 2 0
D4 5 1
D5 4 2

60
 c) Resultados del análisis de las curvas de calibración.
Dionex UltiMate 3000 UHPLC+ focused con detector de matriz de diodos UltiMate
Equipo
3000
Fecha de análisis 09-07-2018 hasta 13-07-2018
Analista Miller Espinoza

DÍA 1
Concentración Concentración Tiempo de Área
N° de estándar
teórica (μg/kg) corregida (μg/kg) retención (min) (mAU*min)
1 50 48,95 6,997 0,1126
2 100 97,90 6,970 0,2364
3 200 195,80 6,957 0,4727
4 300 293,71 6,933 0,7012
5 1000 979,02 6,823 1,9703

DÍA 2
Concentración Concentración Tiempo de Área
N° de estándar
teórica (μg/kg) corregida (μg/kg) retención (min) (mAU*min)
1 50 48,95 6,977 0,1183
2 100 97,90 6,970 0,2374
3 200 195,80 6,950 0,4594
4 300 293,71 6,933 0,6962
5 1000 979,02 6,823 1,9703

DÍA 3
Concentración Concentración Tiempo de Área
N° de estándar
teórica (μg/kg) corregida (μg/kg) retención (min) (mAU*min)
1 50 48,95 6,980 0,1150
2 100 97,90 6,967 0,2347
3 200 195,80 6,947 0,4627
4 300 293,71 6,930 0,6837
5 1000 979,02 6,823 1,9703

DÍA 4
Concentración Concentración Tiempo de Área
N° de estándar
teórica (μg/kg) corregida (μg/kg) retención (min) (mAU*min)
1 50 48,95 6,977 0,1180
2 100 97,90 6,963 0,2317
3 200 195,80 6,947 0,4583
4 300 293,71 6,927 0,6789
5 1000 979,02 6,823 1,9703

DÍA 5
Concentración Concentración Tiempo de Área
N° de estándar
teórica (μg/kg) corregida (μg/kg) retención (min) (mAU*min)
1 50 48,95 6,970 0,1224
2 100 97,90 6,960 0,2314
3 200 195,80 6,943 0,4639
4 300 293,71 6,923 0,6849
5 1000 979,02 6,823 1,9703

61
 d) Resultados de muestras de leche cruda con concentraciones de sulfadiazina que
superan el límite máximo de residuos (LMR).
Tiempo de Promedio
Nombre de Área del pico Concentración
retención concentración
muestra (mAU*min) (μg/kg)
(min) (μg/kg)
7,043 3,2276 158,44
1 7,040 2,3582 114,97 144,87
7,043 3,2833 161,22
7,000 7,2314 358,63
2 7,010 7,3944 366,78 365,00
7,013 7,4507 369,59
6,973 3,4024 167,18
3 6,970 3,3933 166,72 166,71
6,973 3,3834 166,23
7,043 8,0960 401,86
4 7,040 8,1329 403,70 401,67
7,047 8,0477 399,44
7,120 2,3639 115,25
5 7,120 2,4221 118,16 117,18
7,123 2,4214 118,13
7,100 13,3491 664,51
7 7,107 13,5523 674,67 670,49
7,107 13,5046 672,29
7,023 8,5794 426,03
9 7,013 8,5331 423,71 424,39
7,017 8,5274 423,43
6,987 3,4788 171,00
10 6,993 3,5265 173,38 172,95
6,997 3,5486 174,49
7,067 6,1875 306,43
11 7,063 6,2101 307,56 306,87
7,067 6,1915 306,63
7,070 2,1295 103,53
13 7,077 2,0987 101,99 102,39
7,077 2,0921 101,66
7,057 6,0161 297,86
14 7,057 6,0378 298,95 298,40
7,057 6,0268 298,40
6,793 4,6355 228,83
15 6,797 4,5586 224,99 226,04
6,800 4,5447 224,29
* Los residuos secos extraídos de 10 ml de muestra de leche son redisueltos en un volumen final de 1 ml de PDP; por lo tanto, un
análisis de 100 μg/kg en el extracto final es equivalente a 10 μg/kg de ese analito en la muestra.
Elaborado por: Miller Espinoza

62
Anexo F. Cromatogramas del análisis de sulfadiazina.

a) Curvas de calibración
i. Estándar de sulfadiazina de concentración 50 μg/kg

ii. Estándar de sulfadiazina de concentración 100 μg/kg

iii. Estándar de sulfadiazina de concentración 200 μg/kg

63
 iv. Estándar de sulfadiazina de concentración 300 μg/kg

v. Estándar de sulfadiazina de concentración 1000 μg/kg

b) Muestras de leche cruda con presencia de sulfadiazina

i. M1

ii. M2

iii. M3

64
 iv. M4

v. M5

vi. M7

vii. M9

viii. M10

ix. M11

65
 x. M13

xi. M14

xii. M15

66
Anexo G. Fotografías del proceso de investigación.

Recepción de las muestras de leche Registro de las muestras y transportistas

Almacenamiento de las muestras Preparación de los estándares

Viales con concentraciones estándar Extracción de muestra fortificada

67
 Extracción de las muestras Evaporación a sequedad del solvente

Recuperación con solución de PDP Preparación de ranura con viales

Lectura de estándares y muestras en

Ultrasonicación de la fase móvil
HPLC

68
Anexo H. Especificaciones fisicoquímicas del estándar de sulfadiazina utilizado.

69
Anexo I. Instructivo para toma de muestras de leche cruda de AGROCALIDAD.

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