Raziel de Jesús Estrada Martínez

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN
TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.
ESTUDIO DE LA CAPACIDAD FERMENTATIVA DE

MICROORGANISMOS SILVESTRES EN CULTIVOS MIXTOS,
PARA LA PRODUCCIÓN DE ALCOHOL A PARTIR DE
RESIDUOS CÍTRICOS
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO
ACADÉMICO DE
MAESTRO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA
EN LA ESPECIALIDAD DE
PROCESOS AGROINDUSTRIALES
PRESENTA
Q. RAZIEL JESÚS ESTRADA MARTÍNEZ
MÉRIDA, YUC. DICIEMBRE 2013

TÍTULO
TÍTULO
ESTUDIO DE LA CAPACIDAD FERMENTATIVA DE

MICROORGANISMOS SILVESTRES EN CULTIVOS MIXTOS,
PARA LA PRODUCCIÓN DE ALCOHOL A PARTIR DE
RESIDUOS CÍTRICOS
Presenta: Q. Raziel Jesús Estrada Martínez
Directora de Tesis: Dra. Ingrid Mayanín Rodríguez Buenfil
Co-Directora de Tesis: Dra. María de los Ángeles Sánchez Contreras
Asesora: Dra. Neith Aracely Pacheco López
Asesora: M. C. Tania González Flores
I
RESUMEN
RESUMEN
Se estudió la capacidad fermentativa de microorganismos silvestres de la especie Candida

glabrata (LR2, LR5 y T1) y Candida tropicalis (LR4) para la producción de alcohol a partir
de diferentes fuentes de carbono. Estas cepas demostraron tener la capacidad de fermentar
glucosa para producir alcohol. Las mejores condiciones medio ambientales para favorecer el
crecimiento fueron: 35o C y 200 rpm, indistintamente para las cepas empleadas en medio
YPD. Las mejores condiciones medio ambientales para producción de alcohol variaron para
cada cepa, siendo las mejores condiciones de 45o C para Candida glabrata (LR2), 35o C para
Candida tropicalis (LR4), 40o C para Candida glabrata (LR5) sin agitación en los casos
anteriores y para la cepa Candida glabrata (T1) de 35o C y 200 rpm, en medio YPD. Las
cuatro cepas probadas asimilaron de forma adecuada glucosa, fructosa y sacarosa, variando los
resultados de asimilación en el resto de los azúcares. La cepa Candida tropicalis (LR4) tuvo
los mejores resultados en galactosa y la cepa Candida glabrata (T1) en xilosa, produciendo
alcohol a partir de estas fuentes de carbono. La cepa LR4 produjo la mayor concentración de
alcohol en los cultivos individuales empleando una mezcla de azúcares donde, a partir de 100
g/L produjo 35.31 ± 4.78 g/L con una productividad de 3.92 ± 0.53 g/Ld y a partir de 200 g/L
produjo 44.5 ± 0.1 g/L de alcohol con una productividad de 6.4 ± 0.01 g/Ld. El esquema
secuencial para la formulación de cultivos mixtos resultó ser el más adecuado para el
aprovechamiento total de azúcar (200 g/L) consumiendo un 85.2 ± 2.0 % con una producción
de alcohol de 46.8 ± 2.6 g/L (7.8 ± 0.44 g/Ld) a los 6 días de fermentación. Este esquema
consistió en inocular la cepa Candida tropicalis (LR4) al inicio de la fermentación y 24 h
después se inoculó la cepa Candida glabrata (T1), a 35o C y 200 rpm, estas condiciones
resultaron ser las más adecuadas para el consumo de la mezcla de azúcares a nivel matraz ya
que se obtuvo una productividad de 19.02 ± 0.28 g/Ld. En el bioreactor, el cultivo secuencial a
las condiciones mencionadas y con una aireación de 0.25 vvm, resultó ser lo más adecuado
para la fermentación de la mezcla de azúcares, teniendo una producción de alcohol de 34.34 ±
0.25 g/L y una productividad de 15.26 ± 0.11 g/Ld. Al fermentar un hidrolizado de limón
persa se obtuvo un consumo total de azúcar del 98.13 ± 0.04 %, una producción de alcohol de
11.71 ± 0.02 g/L, una productividad de 10.09 ± 0.02 g/Ld,y un rendimiento de 0.44 ± 0.01
g/g., similar a lo reportado en la literatura para residuos lignocelulósicos.
II
ÍNDICE DE CONTENIDO
TÍTULO...................................................................................................................................... I
RESUMEN ................................................................................................................................II
ÍNDICE DE CONTENIDO ................................................................................................... III
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLA ....................................................................................... VI
DEDICATORIAS ................................................................................................................... XI
AGRADECIMIENTOS ........................................................................................................ XII
1.- ANTECEDENTES ............................................................................................................... 1
2.- JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................ 3
3.- HIPÓTESIS .......................................................................................................................... 4
4.- OBJETIVOS ......................................................................................................................... 5
4.1 Objetivo general ............................................................................................................... 5
4.2 Objetivos específicos ........................................................................................................ 5
5.- FUNDAMENTACIÓN ........................................................................................................ 6
5.1 Biomasa lignocelulósica................................................................................................... 6
5.1.1 Composición de la biomasa lignocelulósica ............................................................ 7
5.1.2 Biomasa cítrica para la producción de etanol ...................................................... 10
5.2 Bioetanol ......................................................................................................................... 13
5.2.1 Bioetanol de segunda generación .......................................................................... 15
5.2.2 Sistemas de producción de Bioetanol .................................................................... 16
5.2.3 Estatus actual en la producción de bioetanol ....................................................... 19
5.3 Microorganismos en el proceso de fermentación........................................................ 20
5.3.1 Fermentación de carbohidratos por levaduras .................................................... 23
5.3.2 Rutas metabólicas para la fermentación de carbohidratos ................................ 26
5.3.3 Fermentación en cultivos mixtos ........................................................................... 30
5.4 Factores que afectan en la fermentación de carbohidratos ....................................... 33
5.5 Aplicación Industrial ..................................................................................................... 36
6.- MATERIALES Y MÉTODOS.......................................................................................... 38
6.1 Microorganismos ........................................................................................................... 38
6.2 Medios de cultivo ........................................................................................................... 38
6.2.1 Medio de cultivo 1 ................................................................................................... 38
6.2.2 Medio de cultivo 2 ................................................................................................... 38
6.2.3 Medio de cultivo 3 ................................................................................................... 39
6.2.4 Medio de cultivo 4 ................................................................................................... 39
6.3 Determinación de las condiciones medio ambientales para el crecimiento y
fermentación de levaduras silvestres a nivel matraz ........................................................ 40
6.3.1 Cinética de fermentación para la obtención de las condiciones adecuadas de
crecimiento y producción de alcohol .............................................................................. 41
III
6.4 Obtención del perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados en

medio sintético ..................................................................................................................... 43
6.4.1 Prueba preliminar de asimilación de carbohidratos ........................................... 43
6.4.2 Perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados................... 44
6.4.3 Cinética de fermentación para la obtención del perfil de asimilación ............... 45
6.4.4 Modificación en el esquema de propagación........................................................ 45
6.5 Evaluación de la capacidad fermentativa de cultivos individuales y mixtos en
mezclas de azúcares ............................................................................................................. 46
6.5.1 Comparación de dos medios de fermentación ..................................................... 46
6.5.2 Fermentación de cultivos individuales y mixtos .................................................. 47
6.5.3 Cinéticas de fermentación de cultivos individuales y mixtos en mezcla de
azúcares ............................................................................................................................ 48
6.6 Establecimiento de las condiciones de fermentación con cultivos mixtos en medio
sintético a nivel matraz........................................................................................................ 49
6.6.1 Cinéticas para la obtención de las condiciones de fermentación en cultivo mixto
........................................................................................................................................... 50
6.7 Evaluación de la capacidad fermentativa del cultivo mixto seleccionado a nivel
fermentador de 3 L .............................................................................................................. 51
6.7.1 Cinética de fermentación igualando las mejores condiciones obtenidas a nivel
matraz ............................................................................................................................... 51
matraz con ajuste de pH ................................................................................................. 51
6.7.3 Cinética de fermentación con modificación de aeración y agitación ................. 52
6.8 Métodos de análisis ........................................................................................................ 55
6.8.1 Determinación de la biomasa celular .................................................................... 55
6.8.2 Determinación de peso seco de la biomasa ........................................................... 55
6.8.3 Determinaciones de azúcares y alcohol ................................................................ 56
6.8.4 Cálculo de parámetros cinéticos de crecimiento .................................................. 57
6.8.5 Parámetros cinéticos de producción de etanol ..................................................... 58
6.8.6 Análisis estadístico .................................................................................................. 59
7.- RESULTADOS Y DISCUSIONES ................................................................................... 60
7.1 Microorganismos ........................................................................................................... 60
7.1.1 Aislamiento de los microorganismos .................................................................... 60
7.1.2 Identificación de los microorganismos ................................................................. 61
fermentación de levaduras silvestres a nivel matraz ........................................................ 61
7.2.1 Crecimiento ............................................................................................................. 61
7.2.2 Fermentación .......................................................................................................... 68
medio sintético ..................................................................................................................... 76
IV
7.3.1 Prueba preliminar de asimilación de carbohidratos ........................................... 76

7.3.2 Perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados................... 78
7.3.3 Modificación del esquema de propagación .......................................................... 90
7.4 Evaluación de la capacidad fermentativa de cultivos individuales y mixtos en
mezclas de azúcares ............................................................................................................. 97
7.4.1 Comparación de dos medios de fermentación ..................................................... 97
7.4.2 Fermentación con cultivos individuales .............................................................. 100
7.4.3 Fermentación con cultivos mixtos ....................................................................... 111
sintético a nivel matraz...................................................................................................... 119
7.5.1 Cinética de crecimiento utilizando diferentes esquemas de inoculación ......... 119
7.6 Evaluar la capacidad fermentativa del cultivo mixto seleccionado en un hidrolizado
de residuos cítricos a nivel fermentador de 3 L .............................................................. 125
7.6.1 Condiciones similares a matraz sin ajuste de pH y con ajuste de pH ............. 126
7.6.2 Cinéticas de crecimiento con diferentes niveles de aireación y agitación........ 129
7.6.3 Cinética de fermentación de un hidrolizado de limón persa (Citrus latifolia) 135
8.- CONCLUSIONES ............................................................................................................ 139
9.- RECOMENDACIONES .................................................................................................. 141
10.- BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 143
11.- ANEXO 1 TÉCNICAS ANALÍTICAS......................................................................... 154
12.- ANEXO 2 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ........................................................................ 159
13.- ANEXO 3 PRESENTACIONES EN CONGRESOS .................................................. 169
V
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLA
Índice de tablas
Tabla 1. Composición de la biomasa lignocelulósica (Ingram y col., 1999) .............................. 7

Tabla 2. Composición química (% materia seca) en diferentes materias primas lignocelulósicas
(Boluda-Aguilar y col., 2013)................................................................................................ 11
Tabla 3. Microorganismos productores de etanol. .................................................................... 23
Tabla 4. Identificación de las levaduras silvestres .................................................................... 38
Tabla 5. Composición elemental para el crecimiento de levaduras en base a 30 g/L ............... 39
Tabla 6. Composición elemental para el crecimiento de levaduras en base a Nitrógeno por litro
(Atlas R., 2010) (Wilkins y col., 2005) ................................................................................. 40
Tabla 7. Diseño experimental 32, para la determinación de las condiciones de crecimiento y
producción de alcohol ............................................................................................................ 41
Tabla 8. Diseño factorial 4 x 7 con los factores, niveles y respuestas analizadas para la
obtención del perfil de asimilación........................................................................................ 44
Tabla 9. Diseño factorial 4 x 3 para determinar las condiciones de fermentación .................... 50
Tabla 10. Diseño 22, evaluación de la capacidad fermentativa en cultivo mixto a nivel
bioreactor ............................................................................................................................... 52
Tabla 11. Características microscópicas de los microorganismos silvestres utilizados ............ 60
Tabla 12. Parámetros cinéticos para el crecimiento de las diferentes cepas según el diseño 32
.............................................................................................................................................. .64
Tabla 13. Parámetros cinéticos para la producción de alcohol de las diferentes cepas según el
diseño 32 ................................................................................................................................ 70
Tabla 14. Condiciones de fermentación más adecuadas obtenidas a partir de los resultados
cinéticos y estadísticos .......................................................................................................... 75
Tabla 15. Orden de asimilación de las distintas fuentes de carbono según cepa ...................... 76
Tabla 16. Resultados cinéticos de crecimiento y de producción para las cepas LR2, LR4, LR5
y T1 en medio mínimo .......................................................................................................... 86
Tabla 17. Resultados cinéticos obtenidos en la comparación de los esquemas de propagación
............................................................................................................................................... 95
VI
Tabla 18. Parámetros cinéticos en la comparación de dos medios de fermentación ................. 99

Tabla 19. Parámetros cinéticos de crecimiento en mezcla de azúcares en cultivos individuales
............................................................................................................................................. 102
Tabla 20. Consumo total de azúcar y velocidades en el consumo de sustrato en el medio con
mezcla de azúcar de las cepas LR2, LR4, LR5 y T1, de forma individual ......................... 104
Tabla 21. Parámetros cinéticos de producción de alcohol en mezcla de azúcares en cultivos
individuales.......................................................................................................................... 105
mezcla de azúcar de las cepas LR4 y T1, de forma individual ........................................... 110
Tabla 23. Parámetros cinéticos de producción de alcohol y velocidades de producción en el
medio con mezcla de azúcar de las cepas LR4 y T1, de forma individual .......................... 110
mezcla de azúcar de las cepas LR4 y T1 en cultivo mixto .................................................. 115
Tabla 25. Parámetros cinéticos de producción de alcohol y velocidades de producción en el
medio con mezcla de azúcar en cultivo mixto..................................................................... 117
mezcla de azúcar de los tratamientos 5 y 9 ......................................................................... 121
Tabla 27. Parámetros cinéticos de producción de alcohol y velocidad de producción en el
medio con mezcla de azúcar del diseño factorial 4 x 3, en cultivos mixtos ........................ 123
mezcla de azúcar en las cinéticas sin y con ajuste de pH .................................................... 128
mezcla de azúcar de los tratamientos 1, 2, 3 y 4 con variaciones en la aireación ............... 131
Tabla 30. Consumo total de azúcar y velocidades en el consumo de sustrato en el hidrolizado
de limón persa...................................................................................................................... 136
Tabla 31. Consumo total de azúcar y velocidades en el consumo de sustrato en las cinéticas en
el bioreactor de 3 L con mezcla de azúcares e hidrolizado cítrico ...................................... 137
VII
Índice de figuras
Figura 1. Estructura de la celulosa .............................................................................................. 8

Figura 2. Estructura de la hemicelulosa ...................................................................................... 9
Figura 3. Estructura de la lignina .............................................................................................. 10
Figura 4. Esquema de producción de bioetanol derivado de material lignocelulósico ............. 16
Figura 5. Estrategia de fermentación de biomasa lignocelulósica (Lynd y col., 2002)............. 18
Figura 6. Catabolismo de las hexosas de Saccharomyces cerevisiae………………………… 28
Figura 7. Catabolismo de la D-xilosa y L-arabinosa en una cepa de S. cerevisiae modificada
genéticamente. ........................................................................................................................... 29
Figura 8. Esquema de propagación y cinéticas de fermentación en medio YPD ...................... 42
Figura 9. Esquema del procesamiento de las muestras ............................................................. 43
Figura 10. Esquema de cinética de fermentación de cultivos individuales y mixtos ................ 48
Figura 11. Cinética de fermentación de mezclas de azúcares con cultivos mixtos a nivel de
bioreactor de 3 L ........................................................................................................................ 53
Figura 12. Relación filogenética de tres cepas de Candida glabrata ........................................ 61
Figura 13. Cinéticas de crecimiento (peso seco) para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1
................................................................................................................................................... 62
Figura 14. Gráficas de Pareto para a) Peso seco, b) µmáx, c) Yx/s y d) gráfica de interacción
para Peso seco de la cepa LR2 en medio YPD .......................................................................... 65
para Peso seco de la cepa T1 en medio YPD ............................................................................ 68
Figura 18. Cinéticas de producción de alcohol para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1
................................................................................................................................................... 69
Figura 19. Gráficas de Pareto para a) producción de alcohol, b) eficiencia, c) Pmáx y d)
gráfica de interacción para producción de alcohol para la cepa LR2 en medio YPD ............... 72
gráfica de interacción para producción de alcohol para la cepa T1 en medio YPD .................. 75
Figura 23. Asimilación de los distintos azúcares a 540 nm después de 24 h ............................ 77
Figura 24. Gráfico de medias según cepa en la asimilación de a) fructosa y b) galactosa ........ 77
Figura 25. Cinéticas de crecimiento (peso seco) para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1,
en diferentes fuentes de carbono. .............................................................................................. 79
VIII
Figura 26. Cinéticas de crecimiento (peso seco) para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1,
Figura 27. Cinéticas de producción de alcohol para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1,
Figura 28. Cinéticas de producción de alcohol para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1,
Figura 29. Cinéticas de consumo de carbohidratos para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d)
T1, en diferentes fuentes de carbono. ........................................................................................ 83
Figura 30. Cinéticas de consumo de carbohidratos para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d)
T1, en diferentes fuentes de carbono. ........................................................................................ 85
Figura 31. a) Gráfica de Pareto y de b) interacción para la respuesta de peso seco en base al
diseño 4x7 .................................................................................................................................. 88
Figura 32. a) Gráfica de Pareto y de b) interacción para la respuesta de producción de alcohol
en base al diseño 4 x 7 ............................................................................................................... 88
Figura 33. Perfil de asimilación de diferentes fuentes de carbono en base al peso seco ........... 89
Figura 34. Perfil de asimilación de diferentes fuentes de carbono en base a la producción de
alcohol ....................................................................................................................................... 90
Figura 35. Cinéticas de crecimiento (Peso seco) en la modificación del esquema de
propagación para la cepa a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1........................................................ 91
Figura 36. Cinéticas de producción de alcohol en la modificación del esquema de propagación
para la cepa a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1.. .......................................................................... 93
Figura 37. Cinéticas de consumo de carbohidratos en la modificación del esquema de
propagación para la cepa a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1........................................................ 94
Figura 38. Gráfica de medias para a) peso seco y b) producción de alcohol en glucosa
comparando el esquema de propagación ................................................................................... 96
Figura 39. Gráfica de medias para a) peso seco y b) producción de alcohol en galactosa
comparando el esquema de propagación ................................................................................... 96
Figura 40. Gráficas de a) crecimiento (Peso seco), b) producción de alcohol y c) consumo de
carbohidratos en la comparación de dos medios de fermentación. ........................................... 98
Figura 41. Gráfica de medias para a) peso seco y b) producción de alcohol en galactosa
comparando el esquema de propagación ................................................................................. 100
Figura 42. Cinéticas de crecimiento en mezcla de azúcares en cultivos individuales............. 101
Figura 43. Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para la cepa
a) LR2 y b) LR4, c) LR5 y d) T1............................................................................................. 103
Figura 44. Gráfica de medias para a) peso seco, b) µmáx, c) producción de alcohol y d) Pmáx
en mezcla de azúcares en los cultivos individuales empleados ............................................... 106
Figura 45. Cinéticas de crecimiento en mezcla de azúcares en cultivos individuales............. 107
Figura 46. Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para la cepa
a) LR4 y b) T1. ........................................................................................................................ 109
IX
Figura 47. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para el

cultivo mixto CC1.. ................................................................................................................. 112
cultivo mixto CC2. b) Porcentaje de mezcla de las levaduras................................................. 114
cultivo mixto CC3. b) Porcentaje de mezcla de las levaduras................................................. 116
Figura 50. Gráfica de medias para a) producción de alcohol y b) Pmáx en mezcla de azúcares
en los cultivos individuales y mixtos empleados.................................................................... 118
tratamiento 5. b) Porcentaje de mezcla de las levaduras. ........................................................ 120
Figura 53. Gráfica de Pareto para a) producción de alcohol, b) Pmáx, c) Yp/s y d) Consumo
total de azúcar en mezcla de azúcares variando el tiempo de inóculo ................................... 124
Figura 54. Gráfica de interacción para a) producción de alcohol y b) Pmáx en mezcla de
azúcares variando el tiempo de inóculo................................................................................... 125
Figura 55. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol a las
mejores condiciones obtenidas a nivel matraz sin ajuste de pH. b) Porcentaje de mezcla de las
levaduras.. ................................................................................................................................ 127
Figura 56. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol a las
mejores condiciones obtenidas a nivel matraz y ajuste de pH. b) Porcentaje de mezcla de las
levaduras.. ................................................................................................................................ 129
Figura 57. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol en el
Figura 61. Gráficas de Pareto para a) producción de alcohol, b) Yp/s, c) Pmáx y d) gráfica de
interacción para producción de alcohol el diseño 22 en mezcla de azúcares ........................... 134
hidrolizado de limón persa. b) Porcentaje de mezcla de las levaduras.................................... 135
Figura 63. Gráfica de medias para a) Producción de alcohol y b) Pmáx de todos los sistemas
probados a nivel bioreactor de 3 L .......................................................................................... 138
X
DEDICATORIAS
DEDICATORIAS
A mi madre y mis hermanos, quienes siempre creyeron

en que podría alcanzar estas metas que me he trazado y
que nunca me retiraron su apoyo, confianza y sobre todo
el amor.
A Dios que me brindó la oportunidad de culminar otra

etapa en mi vida.
XI
AGRADECIMIENTOS
AGRADECIMIENTOS
Al Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco A. C.,

Unidad Sureste, por la facilidades otorgadas para la realización de este proyecto.
Al CONACYT por la beca otorgada, con numero de apoyo 327301.
Al Fondo Mixto CONACYT-Gobierno del Estado de Yucatán, Convocatoria 2011-C09 (Clave

de proyecto 169165), por el apoyo para realizar esta tesis.
A la Dra. Ingrid Mayanin Rodríguez Buenfil, por su constante dirección, apoyo, consejo,
dedicación, esfuerzo, confianza, amistad y comprensión en los momentos difíciles este trabajo
no habría sido posible.
A la Dra. María de los Ángeles Sánchez Contreras, por su constante apoyo y colaboración en
la realización de la tesis.
A la Dra. Neith Aracely Pacheco López, por su guía, apoyo, comprensión, amistad, consejo y
tiempo brindado en la realización de este trabajo.
A la M. C. Tania González Flores, por su apoyo, amistad y colaboración en el desarrollo de la

tesis.
A mi comité tutorial.
A los Doctores de la unidad sureste por el apoyo brindado y las enseñanzas compartidas.
A mis amigos y compañeros de laboratorio con los que tuve el privilegio de empezar este
camino y con los que tuve el privilegio de trabajar.
XII
ANTECEDENTES
1.- ANTECEDENTES
La producción de bioetanol (CH3CH2OH) a partir de biomasa lignocelulósica ayudaría a

reducir el consumo de petróleo crudo y la contaminación del medio ambiente (Lang y col.,
2001). Sólo en los últimos años debido al aumento de las preocupaciones ambientales y las
crisis periódicas en algunos de los países más grandes exportadores de petróleo, se ha
convertido el bioetanol, a partir de residuos biomásicos, en una viable y realista alternativa en
el mercado de la energía (Cardona y col., 2007).
Los residuos biomásicos contienen mayoritariamente celulosa, hemicelulosa y pectinas,

moléculas que han sido muy atractivas desde el punto de vista energético, ya que pueden ser
hidrolizadas para la obtención de glucosa y otros azúcares que posteriormente pueden ser
fermentados alcohólicamente (Baig y col., 2004). En el Estado de Yucatán los residuos
cítricos representan una importante fuente de biomasa lignocelulósica ya que se obtienen en
abundancia y a bajo costo. Debido a que la industria citrícola solo aprovecha el 50 % de la
materia prima, se obtienen toneladas de residuos que podrían ser utilizados para la
implementación de un proceso de fermentación.
Wilkins y col., (2005), Widmer y col., (2010) y Boluda-Aguilar y col., (2013) indican que los
azúcares presentes en los hidrolizados cítricos son: glucosa y fructosa principalmente y en
menor proporción galactosa, xilosa, arabinosa, ramnosa y sacarosa. Por lo que es necesario
que los microorganismos utilizados en la fermentación asimilen con alta eficiencia las hexosas
y pentosas presentes en los hidrolizados lignocelulósicos (Hickert y col., 2013).
La gran mayoría de los microorganismos han sido aislados del suelo, materia vegetal en
descomposición, efluentes industriales, residuos municipales, estiércol y rumen (Ten y col.,
2004), donde adquieren la capacidad de asimilar otros tipos de azúcares, por ejemplo las
pentosas (Fromanger y col., 2010), mejorando los rendimientos y productividad en la
fermentación.
1
ANTECEDENTES
También la modificación de algunos de los factores fisicoquímicos en el proceso de

fermentación, como por ejemplo la temperatura, la agitación, pH y la aireación, tienen un
efecto notable, ya que si las condiciones no son las adecuadas, puede disminuir o aún impedir
la formación del metabolito de interés (Arellano y col., 2008).
La levadura Saccharomyces cerevisiae utilizada a nivel industrial, no puede asimilar pentosas

como fuente de carbono. Se ha reportado que levaduras como la Scheffersomyces (Pichia)
stipitis, Pachysolen tannophilus y Candida guilliermondii que asimilan xilosa, presentan una
baja tolerancia a inhibidores, necesitan un suministro controlado de oxígeno para la
producción de etanol y son muy sensibles a este metabolito (Kuhad y col., 2011).
Por lo tanto este trabajo tiene como objetivo determinar la capacidad fermentativa de
microorganismos silvestres en cultivos mixtos, para la producción de alcohol a partir de
residuos cítricos.
2
JUSTIFICACIÓN
2.- JUSTIFICACIÓN
Debido al inminente agotamiento de las reservas petroleras, aunado a la problemática mundial

de emisiones de gases de invernadero a la atmósfera y el consecuente calentamiento global, las
tendencias actuales están enfocadas hacia la producción de etanol y otros alcoholes
combustibles a través de procesos fermentativos, empleando preferente biomasa
lignocelulósica. Debido a los bajos rendimientos de producción de alcohol en la industria este
no ha sido un sustituto de la gasolina convencional. Para poder aumentar los rendimientos en
la fermentación es necesario emplear cepas microbianas que asimilen con alta eficiencia
hexosas y pentosas produciendo etanol a partir de ellas.
La mayoría de los microrganismos de uso industrial están patentados y no están disponibles

para su uso libremente, lo que dificulta la expansión de los procesos de fermentación. Por lo
tanto, existe una necesidad real de disponer de cepas microbianas silvestres o cultivos mixtos,
aisladas de sustratos regionales, que tengan una alta capacidad fermentadora para la
producción de etanol. Estos microrganismos deberían tener, a las condiciones adecuadas, la
capacidad de producir el metabolito de interés, de crecer y sintetizar el producto a gran escala.
Además tener la capacidad de poder crecer en un medio líquido relativamente barato y en
diferentes fuentes de carbono que se puedan obtener en grandes cantidades, como la biomasa
lignocelulósica desecho de la industria, fuente renovable de energía y de bajo costo. Dentro de
la materia prima que podría utilizarse como sustrato están los cítricos sembrados en la
península de Yucatán. Ésta industria genera mucho desperdicio de cáscara, semilla y bagazo
ya que el fruto no se aprovecha en su totalidad. Por lo tanto, el uso de microorganismos
adecuados para la hidrólisis y fermentación de los residuos cítricos, subproductos industriales,
sería un proceso viable para el aprovechamiento y la generación de alcohol a partir de estos
desechos.
3
HIPÓTESIS
3.- HIPÓTESIS
El uso de microrganismos con un amplio perfil de asimilación de carbohidratos permitirá

obtener un proceso fermentativo eficiente con altos rendimientos de producción de alcohol a
partir de residuos cítricos.
4
OBJETIVOS
4.- OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Determinar la capacidad fermentativa de microrganismos silvestres en cultivos mixtos, para la

producción de alcohol a partir de residuos cítricos.
4.2 Objetivos específicos
1.- Determinar las condiciones medio ambientales para el crecimiento y fermentación de

levaduras silvestres a nivel matraz.
2.- Obtener el perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados en medio

sintético.
3.- Evaluar la capacidad fermentativa de cultivos individuales y mixtos en mezclas de

azúcares.
4.- Establecer las condiciones de fermentación con cultivos mixtos en medio sintético a nivel
matraz.
5.- Evaluar la capacidad fermentativa del cultivo mixto seleccionado en un hidrolizado de

residuos cítricos a nivel fermentador de 3 L.
5
FUNDAMENTACIÓN
5.- FUNDAMENTACIÓN
5.1 Biomasa lignocelulósica
La producción de alcohol a partir de la biomasa, es una forma de reducir el uso de derivados

del petróleo y de tecnologías costosas para su conversión (Demirbas, 2005). El término
biomasa incluye toda la materia orgánica que tiene su origen inmediato en un proceso
biológico. La biomasa vegetal se forma a partir de luz solar mediante la fotosíntesis, con lo
que se producen moléculas de alto contenido energético en forma de energía química. Los
combustibles procedentes de biomasa lignocelulósica son muy atractivos, ya que permiten un
rendimiento más alto por hectárea de combustible y tienden a proyectar mejor la economía.
Las materias primas obtenidas a partir de la biomasa requieren menos energía adicional para el
crecimiento y la cosecha, y puede ser aumentado en muchas circunstancias diferentes, en
contraste con los cultivos anuales, que requieren específicamente de buena calidad de la tierra
(Hamelincka y Faaij, 2006). Una razón adicional para la introducción de residuos agrícolas
como posibles fuentes de energía renovables es que los métodos actuales para su eliminación
han causado problemas ambientales (Demirbas y col., 2006).
La introducción de biocombustibles sería especialmente importante para el sector del

transporte, ya que es responsable del 18 % del consumo de energía primaria en todo el mundo.
Los procesos de conversión de la biomasa lignocelulósica se puede dividir en dos grandes
categorías: biológicos (fermentación y digestión anaerobia) y termoquímicos (combustión,
gasificación y pirólisis). Por estos métodos se transforma a la celulosa, hemicelulosa y pectina,
moléculas que se han vuelto muy atractivas desde el punto de vista energético debido a que
pueden ser hidrolizadas para la obtención de glucosa y otros azúcares que son fermentados
posteriormente, como se observa en la tabla 1 (Baig y col, 2004). El alcohol obtenido a partir
de azúcares simples y almidón es llamado de primera generación mientras que el alcohol
obtenido a partir de material lignocelulósico (también denominado biomasa) es llamado de
segunda generación (Canto, 2007). Con base en esto, Cannell (2003) destaca que una hectárea
de cultivos ricos en energía usada para la producción de biocombustibles líquidos (etanol)
puede evitar la emisión de 0.2 – 2.0 toneladas de carbono a la atmósfera en comparación con
6
FUNDAMENTACIÓN
el empleo de combustibles fósiles. Esta reducción de carbono sería favorable debido a que
disminuirían las consecuencias del efecto invernadero, entre otros factores, a nivel global.
Tabla 1. Composición de la biomasa lignocelulósica (Ingram y col., 1999)

Fracción Contenido en lignocelulosa (%) Monómeros
Celulosa 33-51 Glucosa
Glucosa, manosa, galactosa,
Hemicelulosa 19-34
xilosa, y arabinosa
Lignina 20-30 Alcoholes aromáticos
Ácido galacturónico y
Pectina 2-20
ramnosa
Hay una amplia variedad de materias primas potenciales para la producción principalmente de
etanol combustible. Árboles de rápido crecimiento, hierba, plantas enteras, subproductos
industriales, plantas acuáticas, productos de desecho (incluida la agricultura, la industria del
papel y los residuos forestales), municipales, todos representan ejemplos de recursos
lignocelulósicos y derivados. La naturaleza y disponibilidad de las materias primas
lignocelulósicas en diferentes partes del mundo depende del clima y otros factores
ambientales, las prácticas agrícolas y desarrollo tecnológico (Van Maris y col., 2006).
5.1.1 Composición de la biomasa lignocelulósica
La lignocelulosa (celulosa, hemicelulosa y lignina) es el principal y más abundante

componente de la biomasa producida por la fotosíntesis, anualmente se forman 200,000
millones de toneladas en el mundo (Ragauskas y col., 2006). La pared celular de las plantas
está formada por lignocelulosa, la composición y porcentajes de los polímeros varían entre las
especies de plantas, incluso entre la edad y la etapa de crecimiento.
5.1.1.1 Celulosa
La celulosa (figura 1) es un componente lineal estructural de la pared celular de una planta

que consiste en una cadena larga de monómeros de glucosa con enlaces β (1-4)- glicosídicos
que pueden alcanzar varios miles de unidades de glucosa en longitud. Los extensos enlaces de
hidrógeno entre las moléculas conducen a una estructura de matriz fuerte y cristalina
7
FUNDAMENTACIÓN
(Ebringerova y col., 2005). Esta retícula de numerosos grupos hidroxilo constituyen las
microfibrillas que dan a la molécula más fuerza y capacidad. A pesar de que materiales de
almidón requieren temperaturas de sólo 60-70o C para ser convertidos de la textura cristalina a
amorfa, la celulosa requiere de 320o C así como de una presión de 25 MPa para cambiar de un
estado cristalino rígido a una estructura amorfa en agua (Deguchi y col., 2006).
La celulosa es el polímero orgánico más abundante, con una composición de

aproximadamente del 30% en plantas. Algodón, lino y pastas químicas representan las fuentes
más puras de celulosa (85-95% y 60-80%, respectivamente) mientras que maderas blandas y
duras contienen aproximadamente un 45 % de celulosa (Demirbas. 2005).
Figura 1. Estructura de la celulosa (Deguchi y col., 2006)
5.1.1.2 Hemicelulosa
La hemicelulosa (figura 2) es una estructura amorfa y variable formada de heteropolímeros

incluyendo a las hexosas (D-glucosa, D-galactosa y D-manosa), así como de las pentosas (D-
xilosa y L-arabinosa) y puede contener ácidos de azúcares (ácidos urónicos), como el D-
glucurónico, D-galacturónico y ácidos metilgalacturónicos.
La cadena principal se compone principalmente de xilano con enlaces β(1-4) que incluyen
xilosa (casi 90%) y arabinosa (aproximadamente un 10%) variando en porcentaje dependiendo
de su naturaleza. Debido a la diversidad de azúcares presentes en la hemicelulosa, se requiere
de una amplia gama de enzimas para ser completamente hidrolizada en monómeros simples
(Girio y col., 2010).
8
FUNDAMENTACIÓN
Figura 2. Estructura de la hemicelulosa (Girio y col., 2010)
5.1.1.3 Lignina
La lignina (Figura 3) es un heteropolímero amorfo, aromático, rígido, tridimensional y

ramificado con un peso molecular de 10,000 Daltons formado por alcoholes aromáticos que
gracias a sus enlaces covalentes al xilano de la hemicelulosa da soporte estructural, rigidez,
impermeabilidad y protección a los polisacáridos estructurales (celulosa y hemicelulosa) y es
altamente resistente a la degradación química y biológica.
La molécula de lignina presenta un elevado peso molecular, que resulta de la unión de varios
ácidos y alcoholes fenilpropílicos (cumarílico, coniferílico y sinapílico). El acoplamiento
aleatorio de estos radicales da origen a una estructura tridimensional, polímero amorfo,
característico de la lignina (Aro y col., 2005).
La lignina es el polímero natural más complejo en relación a su estructura y heterogeneidad.

Por esta razón no es posible describir una estructura definida de la lignina; sin embargo, se han
propuesto numerosos modelos que representan su estructura.
9
FUNDAMENTACIÓN
Figura 3. Estructura de la lignina (Aro y col., 2005)
5.1.2 Biomasa cítrica para la producción de etanol
Los cítricos son uno de los más abundantes cultivos en el mundo, con una producción anual de
aproximadamente de 102 millones de toneladas métricas en el 2007 (González-Molina y col.,
2010). Los principales cultivos cítricos son la naranja, la mandarina y el limón.
En el estado de Florida (EUA) se generan alrededor de 10 millones de toneladas de naranja al

año con un desecho de alrededor de 5 millones de toneladas (Wilkins y col., 2005). Los
desechos cítricos están formados principalmente de las cáscaras, semillas y membranas del
fruto. La biomasa obtenida es convertida en pulpa de cítricos, pero debido a su bajo costo en el
mercado, los investigadores se han enfocado a la conversión de este desecho en azúcares
fermentables por hidrólisis enzimática y su posterior fermentación. Los desechos obtenidos de
la mandarina y del limón son otro tipo de materia prima con una alta producción a nivel
mundial y con potencial para la obtención de etanol (Boluda-Aguilar y col., 2010) debido a su
alto contenido de carbohidratos como se demuestra en la tabla 2.
10
FUNDAMENTACIÓN
Utilizando residuos cítricos, Wilkins y col. (2005), Boluda-Aguilar y col., (2010, 2013)
concluyeron que los carbohidratos que principalmente se obtienen de los residuos son: glucosa
y fructosa como carbohidratos mayoritarios, y en menor proporción sacarosa, galactosa,
xilosa, arabinosa y ramnosa. Con base en los carbohidratos obtenidos, Wilkins y col., (2005)
calcularon el rendimiento de azúcares que fermentarían diferentes organismos obteniendo un
40.7 % para la cepa S. cerevisiae y para la E. coli, un 59.03 %.
Tabla 2. Composición química (% materia seca) en diferentes materias primas lignocelulósicas (Boluda-Aguilar
y col., 2013)
Cenizas Azúcar Grasas Proteína Pectina Lignina Celulosa Hemicelulosa
Cáscara de 5.0 10.1 1.6 7.5 16.0 8.6 22.5 6.0
mandarina
Cáscara de 2.5 6.5 1.50 7.0 13.0 7.6 23.1 8.1
limón
Cáscara de 2.6 9.6 40 9.1 23.0 7.5 37.1 11.0
naranja
Cáscara de
8.1 8.1 0.5 12.5 8.5 11.6 26.57 5.60
toronja
Cáscara de 1.0-2.8 ND ND 9.0-14.0 6.0-15.0 1.0-4.0 29.0-51.0 10.0-20.0
soya
Rastrojo 4.0-8-0 ND ND 4.0-9.0 ND 16.0-23.0 31.0-41.0 20.0-34.0
de maíz
Paja de
1.0-10.0 ND ND 2.0-6.0 ND 5.0-19.0 32.0-49.0 23.0-39.0
trigo
ND: no detectado
Con estos porcentajes calcularon el etanol teórico obteniendo de 5.07 a 5.46 % y 6.43 a 6.76
% en peso, respectivamente. Con los datos anteriores, observaron que la segunda cepa daba
mejores rendimientos al fermentar los carbohidratos, aunque fue constante la producción de
alcohol en la fermentación de los residuos naranja para ambas cepas.
Boluda-Aguilar y col., en (2010) y (2013), estudiaron la fermentación de residuos de

mandarina y limón obteniendo como producto etanol y como co-productos ácido
galacturónico y D-Limoneno. En ambos casos la materia prima recibió un tratamiento de
explosión a vapor con la finalidad de eliminar la mayor cantidad de aceites esenciales ya que
son inhibitorios para el crecimiento de los microorganismos. En ambos casos, con la ayuda de
este pretratamiento, se obtuvo un contenido de aceites esenciales por debajo del 0.05 % (v/w)
reportado como la concentración mínima inhibitoria para la producción de etanol en levaduras
a 37o C (Wilkins, 2009). El máximo contenido de etanol obtenido en la fermentación de
11
FUNDAMENTACIÓN
mandarina fue de 50-60 L/1000 kg de cáscara de mandarina fresca y de D-Limoneno de 0.02

% (v/w) y para el caso del limón se obtuvo una producción de 60 L/1000 kg de cáscara de
limón fresco y de D-Limoneno de 0.025 % (v/w). El Estado de Yucatán es uno de los
principales productores de cítricos a nivel nacional, entre los diversos frutos podemos
encontrar la naranja dulce, naranja agria, limón persa, limón italiano, toronja y mandarina. La
producción citrícola anual en el estado de Yucatán alcanza las 249 mil 351 toneladas, con una
superficie de cultivo de 19 mil 603 hectáreas y más de 13 mil productores dedicados a este
rubro. Y se estima una producción nacional estimada para el 2013 de 6 millones de toneladas
de cítricos.
De la actividad citrícola local se pueden obtener diferentes productos como lo son los frutos
frescos, el jugo y aceites naturales que es su mayor porcentaje son comercializados a nivel
nacional e internacional. Las plantas destinadas a la elaboración de estos productos de
consumo humano solo aprovechan la mitad de la materia prima, lo que implica 125 mil
toneladas de residuos como corteza, semillas y pulpa (SIAP, 2012). La rápida fermentación de
estos subproductos debido a las condiciones atmosféricas que prevalecen en el estado (altas
temperaturas y humedad) convierten a estos desechos en un foco de contaminación de suma
importancia. Los subproductos cuentan con un alto contenido energético que podrían ser
aprovechados para la producción de combustible mediante la fermentación de ésta biomasa
(Osorio y col. 2003). El interés en la utilización de residuos frutícolas se justifica por el bajo
costo de estos materiales y la naturaleza renovable (Lozano, 2008).
En relación a este tema, Zhou y col. (2008) plantearon una vía para el aprovechamiento
integral de las cáscaras de cítricos, en el que el proceso utiliza la levadura Saccharomyces
cerevisiae para la hidrólisis y la fermentación simultánea con agitación continua, a un pH de
4.2 - 4.8 en planta piloto. En este estudio se recuperaron subproductos como el D-limoneno y
los residuos finales fueron utilizados como alimento para rumiantes. Entre los resultados
obtuvieron de la cáscara de cítricos un 4 % de etanol (w/v) y afirman que esta nueva
tecnología ofrece una alternativa para el aprovechamientos de las cáscaras del sector citrícola
usando diversos microorganismos fermentadores.
12
FUNDAMENTACIÓN
En otro estudio, Lennartsson y col. (2012) utilizaron una cepa zigomicetes, Mucor indicus,
que tiene la capacidad de crecer en hidrolizados de cítricos y resistir hasta 2% de D-limoneno
considerado como un inhibidor de crecimiento. Además esta cepa tiene la capacidad de
asimilar ácido galacturónico proveniente de la degradación de la pectina en condiciones
aeróbicas. Este hongo asimila glucosa, fructosa y produce glicerol.
5.2 Bioetanol
Para reducir el consumo de petróleo crudo y la contaminación del medio ambiente, la

producción de bioetanol (CH3CH2OH) a partir de biomasa surge como una alternativa viable
para tratar de erradicar estos problemas (Lang y col., 2001). La consideración primordial
consiste, en la producción de bioetanol a partir de recursos renovables y la determinación de la
viabilidad económica y técnica de uso de alcohol como combustible de automoción mezclado
con gasolina (Goldstein, 1981) ya que el etanol representa, en los últimos años, un importante
combustible renovable líquido para vehículos de motor (Lewis, 1996).
El uso de gasohol (etanol y la mezcla de gasolina) es una de las alternativas que se ha

empleado para reducir la contaminación ambiental en todo el mundo provocada por los
combustibles fósiles. Su producción nacional y el uso de etanol como combustible puede
ayudar a disminuir la dependencia al petróleo y además de reducir el déficit comercial, crear
puestos de trabajo en las zonas rurales, reducir la contaminación atmosférica y reducir el
cambio climático global debido a la acumulación de dióxido de carbono.
El etanol, a diferencia de la gasolina, es un combustible oxigenado que contiene 35% de

oxígeno, lo que reduce emisiones de partículas y de NOx de la combustión. Cuando se quema,
etanol derivado de los procesos de fermentación no produce aumento neto de dióxido de
carbono en la atmósfera. También, éste combustible, es un aditivo que mejora el octanaje y
elimina el agua libre que se genera al conectar las líneas de combustible en climas fríos o por
contaminación directa (Lang y col., 2000).
13
FUNDAMENTACIÓN
El uso de bioetanol como combustible de transporte se refiere a la combustión de la mezcla de

combustible (5, 10 hasta un 85% de etanol en gasolina) utilizando un vehículo con motor de
combustión interna. El tubo de salida de emisiones en este caso es el aspecto más importante a
considerar ya que la mezcla de etanol y gasolina pura, sin duda producen diferentes emisiones.
Hasta en un 10% de etanol en la mezcla de combustible puede ser utilizado en un vehículo
convencional, mientras que un combustible con una mezcla del 85 % necesita un motor
modificado (Flexfuel).
De acuerdo con Festel (2008), la densidad energética del bioetanol (21.14 MJ/L) es de
alrededor del 33-34% menor que la de la gasolina convencional (32 MJ/L). Sin embargo, la
eficiencia en la combustión de una mezcla de combustible en términos de distancia recorrido
en kilómetros es determinada también por el tipo de vehículo, tipo de carretera, composición
del combustible y la velocidad del vehículo. Un alto porcentaje de etanol en la mezcla de
combustible parece ser más útil para ver claramente el desempeño del bioetanol en
comparación con la gasolina actualmente empleada (Bai y col., 2010).
Sin embargo, la producción de etanol es un proceso complicado. La transformación de

recursos biomásicos, cultivos ricos en energía, exige el acondicionamiento o pre-tratamiento
de la materia prima para la fermentación de los azúcares y convertirlos en etanol (Lozano,
2008). La complejidad de este proceso explica en parte por qué el etanol no ha jugado un
papel de liderazgo en comparación con los combustibles más baratos derivados del petróleo.
La formación de etanol utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae a partir de sustratos

como la caña de azúcar, el trigo, el maíz y los cítricos han sido ampliamente estudiados
(Alberts y col., 2009) (Widmer y col., 2010). Sin embargo, existe una necesidad de desarrollar
técnicas que contemplen a los residuos lignocelulósicos con la finalidad de evitar el uso de
sustratos del mercado de los alimentos.
14
FUNDAMENTACIÓN
5.2.1 Bioetanol de segunda generación
Una característica importante del bioetanol de segunda generación en comparación con el de

primera generación está en el tipo de materia prima empleada. El bioetanol de primera
generación utiliza azúcar comestible y almidón como materias primas, mientras que el
bioetanol de segunda generación utiliza biomasa lignocelulósica no comestible. El término de
biomasa se utiliza a menudo en un sentido más amplio.
Por ejemplo, Lal (2005), adopta una definición de biomasa renovable a toda materia orgánica
incluyendo materiales vegetales, productos animales y estiércol, subproductos del
procesamiento de alimentos y agricultura, así como desechos urbanos. La conversión de la
biomasa en bioetanol consiste en varios pasos de procesamiento (figura 4), tales como
tratamiento previo para reducir el tamaño de partícula, eliminar lignina u otros inhibidores, la
hidrólisis de la hemicelulosa a pentosas, la hidrólisis de la celulosa para producir hexosas y la
fermentación para convertir ambos azúcares en bioetanol.
La levadura es utilizada convencionalmente para convertir principalmente glucosa, pero

recientemente algunos microorganismos son conocidos por ser capaces de consumir tanto
pentosas como hexosas, dando un rendimiento más alto de bioetanol (Kuhad y col., 2011)
Diferentes configuraciones se pueden organizar para la obtención del bioetanol como pueden
ser SHF (hidrólisis y fermentación separada), la SSF (sacarificación y fermentación
simultáneas), la SSCF (sacarificación y co-fermentación simultánea) o el más avanzado
proceso CBP (bioproceso consolidado). Estos diferentes procesos representan un nivel
creciente en la tecnología. La co-fermentación de hexosas y pentosas junto con el proceso
CBP en teoría darán un mayor rendimiento y requerirán menos energía. Sin embargo, estos
procesos avanzados todavía están en etapas de desarrollo y se clasifican como tecnologías a
mediano y largo plazo. El inconveniente del uso de tales tecnologías del futuro es que ninguna
se podrá validar ya que no existen procesos comerciales similares (Wiloso y col., 2012).
15
FUNDAMENTACIÓN
Figura 4. Esquema de producción de bioetanol derivado de material lignocelulósico (Sandoval, 2010)
Las enzimas celulolíticas utilizadas para hidrolizar los polímeros de la biomasa lignocelulósica
en monómeros de azúcar son conocidas por ser un factor dominante en costo global de la
producción de bioetanol. El proceso para la producción de las enzimas es muy costoso. El
proceso de destilación y la deshidratación del etanol utilizados para aumentar la pureza del
compuesto requieren una gran cantidad de energía, esto resultaría de gran impacto sobre el
balance neto de energía y en los costos de producción de bioetanol (Wiloso y col., 2012).
5.2.2 Sistemas de producción de Bioetanol
Cuatro procesos biológicos son empleados en el proceso de producción de etanol a partir de

biomasa lignocelulósica. 1) La producción de enzimas celulolíticas, 2) la hidrólisis de
materiales celulósicos, 3) la fermentación de hexosas y 4) la fermentación de pentosas. Para
que este proceso se lleve a cabo se han reportado diferentes configuraciones, que difieren en el
grado de consolidación de los cuatro pasos. En la figura 5, se presentan diferentes estrategias
16
FUNDAMENTACIÓN
donde una fracción de la biomasa lignocelulósica se utiliza para producir celulasas, pero la
mayoría se utiliza directamente en el proceso de producción de etanol.
El proceso más simple es la hidrólisis y la fermentación separada (SHF), donde los pasos se
realizan independientemente y es posible utilizar diferentes organismos en cada una. La
ventaja es que cada paso puede realizarse a las condiciones óptimas de la misma. Sin embargo,
la glucosa y celobiosa podrían ser productos inhibidores en la actividad enzimática
disminuyendo los rendimientos de hidrólisis, también se ha observado la contaminación
microbiana asociado al proceso de fermentación a escala industrial (Talebnia y col., 2010). La
sacarificación y fermentación simultánea (SSF) combina la hidrólisis y la fermentación de
hexosas en un solo paso. El proceso tiene la ventaja que los azúcares no inhiben las celulasas
durante la hidrólisis por que se utilizan de inmediato por los microorganismos de
fermentación. Los azúcares inhiben el proceso de mucho más que el etanol.
Con la SSF se tienen los mayores rendimientos de etanol y la necesidad energética es mucho
menor, pero también necesita más enzimas, que son una de las piezas más costosas en todo el
proceso. También, disminuye el número de reactores y por lo tanto en el costo de inversión.
Sin embargo uno de los principales inconvenientes es que la temperatura óptima necesaria
para la sacarificación rara vez es la más adecuada para la fermentación, reduciendo la
eficiencia de hidrólisis (Hasunuma y Kondo, 2012). Un enfoque más consolidado, es la
sacarificación y co-fermentación simultánea (SSCF), donde la hidrólisis y la fermentación de
hexosas y pentosas se producen en un solo paso. Uno de los principales problemas de este
sistema es que los microorganismos que utilizan pentosas también prefieren hexosas como
principal sustrato.
Por lo que si un microorganismo, como por ejemplo, la S. cerevisiae es inoculado junto a otro
microorgnismo existe una competencia en el consumo de las hexosas y pentosas, lo que suele
dar como resultado un rendimiento de etanol más bajo. Para superar este efecto secuencial de
fermentación de hexosas y pentosas se ha propuesto, que los microorganismos que fermenten
pentosas sean añadidos al sustrato después de que se completó el consumo de las hexosas,
pero en el mismo reactor.
17
FUNDAMENTACIÓN
Figura 5. Estrategia de fermentación de biomasa lignocelulósica (Lynd y col., 2002)
Sin embargo, los rendimientos de etanol de fermentación secuencial siguen siendo bajos.
Reportes demuestran el uso de microorganismos modificados genéticamente como la S.
cerevisiae o Z. mobilis, que tienen altos rendimientos y tolerantes al etanol, para que
fermenten las pentosas junto con las hexosas (Cardona y col., 2007).
El proceso que se conoce como bioproceso consolidado (CBP), trata de integrar los cuatro
procesos un uno solo. La tendencia en la tecnología de procesamiento de la biomasa entra en
este bioproceso ya que se cree que tiene el mayor potencial en ahorro de costos. La razón
principal de esto es que la producción de celulasas puede constituir más del 50 % de todo el
proceso en costos, además, no se necesita sustrato adicional para la producción de enzimas
(Lynd y col., 2002).
18
FUNDAMENTACIÓN
5.2.3 Estatus actual en la producción de bioetanol
Durante los últimos diez años, ha habido un aumento dramático en la producción de bioetanol
a partir de 16.9 billones de litros en el 2000 hasta billones de litros en el 2009 (Sorda y col.,
2010). La producción está dominada por los EE. UU. y Brasil con base en el grano de maíz y
jarabe de caña de azúcar, respectivamente. Pero su uso como combustible, ha sido retardado
por las crecientes preocupaciones de competencia con los alimentos, la producción real de
energía neta, y las consecuencias relacionadas con el cambio de uso del suelo (De Olivera y
col., 2005).
La competencia con los alimentos en EE. UU. se refleja en la reasignación de 20 % de maíz a

la producción de etanol en el 2006, y esta asignación se ha culpado en parte por el aumento de
los precios en los alimentos en los últimos años (Sorda y col., 2010). En Brasil, el costo de
producción de etanol a partir de caña de azúcar es muy alto y viene dado por el precio de las
materias primas que representan el 70% del costo total de la producción (Soccol y col., 2010).
Teniendo en cuenta esto, existe una necesidad de explorar nuevas materias primas alternativas,
como la biomasa lignocelulosa.
Este tipo de materia prima disponible en abundancia en muchos países, y su utilización sólo
compite con los recursos alimenticios de forma limitada. En muchos casos, este tipo de
materia prima no necesita de tierra fértil y extensa para su generación, de modo que su
potencial es muy alto y se espera reducir el impacto ambiental y social en gran medida con la
generación de biocombustibles. Otra motivación para explotar tales biocombustibles basados
en lignocelulosa es mejorar el balance de emisiones de gases de efecto invernadero. Aunque
hay mucho potencial para la biomasa lignocelulósica como materia prima, la producción de
bioetanol en muchos países hasta ahora ha sido desalentadora.
En los EE. UU., por ejemplo, los altos costos de producción hacen que el bioetanol como
biocombustible de transporte sigue siendo muy caro (Schnoor, 2011). La razón de estos altos
costos se debe en parte a las características de la biomasa ya que se necesitan tecnologías de
procesamiento avanzadas, incluyendo pretratamiento, hidrólisis de la celulosa y hemicelulosa,
19
FUNDAMENTACIÓN
y co-fermentación de los azúcares obtenidos (Hamelinck y col., 2005). Como resultado de

ello, recientemente, el gobierno de EE. UU. ha reducido el mandato de etanol celulósico de
250 a 6 millones de galones por año (Schnoor, 2011).
Esto sugiere que la tecnología de conversión para la producción de bioetanol en la etapa

comercial sigue siendo insuficiente. Todavía se necesita más tiempo para el desarrollo de
tecnología avanzada y eficiente. En conclusión Phalan (2009), menciona que la promesa de
la situación de los biocombustibles todavía pueden no ser aplicables en gran medida en
algunos países, pero en general puede contribuir a diversificar la oferta y reducir la
dependencia neta de los combustibles fósiles.
5.3 Microorganismos en el proceso de fermentación
La fermentación etanólica es un proceso biológico, en el cual el material orgánico es

convertido por microorganismos en compuestos más simples, como los carbohidratos. Éstos
posteriormente son fermentados para producir etanol, dióxido de carbono, y otros compuestos
tales como hidrógeno y ácidos orgánicos; dependiendo del tipo de microorganismo y la ruta
metabólica de conversión. Durante todo el proceso de conversión de biomasa lignocelulósica
en etanol, existen principalmente dos tipos de microorganismos, los que convierten los
carbohidratos fermentables a etanol y los que producen enzimas para catalizar las reacciones
de hidrólisis del material lignocelulósico (Lin y col., 2006).
Las levaduras silvestres aisladas de la materia orgánica pueden ser utilizadas en varios campos
industriales y biotecnológicos gracias a los múltiples mecanismos de adaptación que han
desarrollado, así como para la producción de etanol. Levadura, es un nombre genérico que
agrupa a una variedad de especies tanto patógenas para plantas y animales, como especies no
solamente inocuas sino de gran utilidad. Las levaduras son hongos unicelulares y la mayoría
son ascomicetos. Generalmente, son células ovales o cilíndricas y su división es habitualmente
por gemación. Durante el proceso de gemación, se origina una pequeña yema que aumenta de
tamaño gradualmente y se separa de la célula.
20
FUNDAMENTACIÓN
Las levaduras normalmente no desarrollan un micelio, sino que permanecen en estado

unicelular durante todo el ciclo de crecimiento, aunque algunas pueden presentar crecimiento
micelar. Los microorganismos, en este caso las levaduras, nos ayudan a realizar el proceso de
fermentación y obtener el etanol. La fermentación alcohólica implica la degradación de las
hexosas, por la vía glucolítica, hasta piruvato y, posteriormente, la actuación de las llamadas
enzimas alcohologénicas, que producen etanol como producto final de la fermentación,
regenerando el poder reductor, en forma de NAD. En términos químicos se establece la
ecuación formulada por Gay-Lussac en el año 1820:
C6H12O6 2(CH3-CH2OH) + 2CO2

Glucosa Etanol Anhídrido carbónico
Por lo tanto es importante conocer la cinética de crecimiento de los cultivos microbianos para
pronosticar la evolución del cultivo, el consumo del sustrato y la acumulación de etanol. La
modificación de algunos de los factores físicos, como por ejemplo la temperatura, agitación y
el pH, tiene un efecto notable sobre un proceso fermentativo, ya que si el valor utilizado no es
adecuado puede disminuir o aún impedir la formación de un determinado metabolito (Arellano
y col., 2008). La mayoría de las levaduras tolera un rango de pH entre 3 y 10, pero prefieren
un medio ligeramente ácido con un pH de 4.5 a 6.5. Los microorganismos utilizados en la
industria para la producción de etanol, son seleccionados para proporcionar la mejor
combinación posible de características para el proceso y equipo usado. Las características
deseadas en el proceso industrial de producción de etanol dependen del microorganismo usado
en la fermentación.
Las características deseadas de los microorganismos para la producción de alcohol son:

Altos rendimientos de producto por unidad de sustrato consumido
Velocidades de fermentación altas
Tolerancia a una elevada concentración de etanol
Viabilidad a temperaturas elevadas
Estabilidad bajo condiciones de fermentación adecuadas
Tolerancia a pH ácido
21
FUNDAMENTACIÓN
Los microorganismos degradadores de carbohidratos proceden de diversas fuentes, la gran

mayoría de ellos han sido aislados del suelo, materia vegetal en descomposición, efluentes
industriales, residuos municipales, estiércol y rumen (Ten y col., 2004). El rumen es una
adaptación simbiótica entre la vaca y un ecosistema microbiano, que facilita el
almacenamiento y procesamiento de diferentes nutrientes durante su consumo. Las tres
grandes poblaciones que predominan en el ecosistema ruminal son las bacterias, los
protozoarios y los hongos. El rumen tiene un tamaño relativamente grande, con una capacidad
de 100 a 150 litros en una vaca o 6 litros en una oveja, y se encuentra a una temperatura de 38-
42°C (Yokoyama y col., 1988) y a un pH de 5.5 – 7 (Krause y col., 2006).
Los microorganismos que viven en el rumen son capaces de digerir las paredes celulares de las
plantas (celulosa y hemicelulosa) que consumen los bovinos para producir azúcares simples
(glucosa) como fuente de energía. Entre los microorganismos del rumen se pueden mencionar
la especie bacteriana Ruminococcus albus que fermenta celulosa, celobiosa y glucosa, entre
otros carbohidratos, originando como principal producto de fermentación ácido acético, etanol
y en menor proporción los ácidos láctico y fórmico (Grudsky y col., 1983). La diversidad de
microorganismos del rumen es importante porque la presencia de especies distintas aporta un
conjunto mayor de genes y complemento de enzimas, así como reacciones bioquímicas
precisas para una conversión máxima de productos alimenticios en células microbianas y
productos de fermentación.
De la misma forma los microrganismos que viven en el intestino de las termitas tienen
enzimas eficientes que son capaces de transformar celulosa en azúcares para la producción del
etanol. El tracto intestinal de las termitas comprende uno o varios compartimentos dilatados
del intestino grueso, que albergan la mayor parte de la microbiota intestinal y son
considerados como cámara de fermentación análoga a la del rumen de las ovejas y del ganado
(es decir, ambientes anóxicos o anaerobios, con una microbiota sensible al oxígeno).
Las actividades metabólicas más importantes, que tradicionalmente se atribuyen a la

microbiota intestinal son, primero, la hidrólisis de la celulosa y hemicelulosa, en segundo
lugar, fermentación de los productos de despolimerización de cadena corta, ácidos grasos, que
22
FUNDAMENTACIÓN
luego son reabsorbidos por el huésped, y tercera, la fijación de nitrógeno intestinal. (Breznak y
Brune, 1994) (Brune A., 1998).
5.3.1 Fermentación de carbohidratos por levaduras
La cinética de crecimiento y el consumo de azúcar dependen cualitativamente y

cuantitativamente en la especie de levadura, tipo y concentración del azúcar, la disponibilidad
de oxígeno, y otros parámetros ambientales, que incluyen temperatura, pH, composición del
medio, y la presencia de metabolitos. Durante la fermentación, pentosas (5C) y hexosas (6C)
son transformadas a etanol en condiciones anaeróbicas o aeróbicas, históricamente la levadura
(Saccharomyces cerevisiae) se ha usado para fermentar hexosas, principalmente glucosa.
Otros microorganismos como Zymomonas mobilis o E. coli se han utilizado para fermentar
tanto hexosas y pentosas (Dwivedi y col., 2009). Muchas revisiones han sido publicados en la
producción de etanol por microorganismos fermentativos, muchas bacterias y levaduras has
sido reportadas por su capacidad de asimilar diferentes fuentes de carbono y producir etanol a
partir de ellas (tabla 3).
Tabla 3. Microorganismos productores de etanol.

Tipo de Sustrato Rendimiento
Microorganismo Referencia
microorganismo asimilable (%)
Saccharomyces Glucosa, galactosa, Siqueira y col.,
Levadura 43-87
cerevisiae maltosa, sacarosa (2008)
Glucosa, xilosa, Drapcho y col.,
Pichia stipitis Levadura 83-92
arabinosa, manosa (2008)
Glucosa, xilosa, Kumar y col.,
Candida shehatae levadura 75-90
arabinosa, manosa (2007)
Glucosa, xilosa,
sacarosa, Jamai y col.,
Candida tropicalis levadura 76-85
celobiosa, sorbitol, (2007)
maltosa
Pachysolen Glucosa, xilosa, . Zhao y col.,
levadura 75-80
tannophilus glicerol (2008)
Kluyveromyces Kádár y col.,
Levadura Glucosa 70-80
marxianus (2004)
Zymomonas Glucosa, xilosa, Davis y col.,
Bacteria 80-92
mobilis fructosa, sacarosa (2006)
Además de un alto rendimiento, un problema importante en la fermentación es la tolerancia de

los microorganismos al producto de fermentación en sí. Una estrategia para superar esto es
23
FUNDAMENTACIÓN
tener un sistema en el que el etanol se elimine continuamente para mantener una baja
concentración dentro del sistema. Otro problema son los compuestos inhibidores que se
producen durante el pretratamiento termoquímico. Estos pueden ser reducidos en un paso de
detoxificación adicional, pero esto tiene un costo elevado.
El mejoramiento de la tolerancia de los microorganismos a estos inhibidores, sería otra

estrategia (Van maris y col., 2006). La levadura Saccharomyces cerevisiae ha sido el
principal microorganismo utilizado para la obtención de etanol industrial; pero una de sus
limitantes es que no fermentan las pentosas por lo que son modificadas genéticamente para
producir alcohol a partir de xilosa o arabinosa (Karhumaa, 2007). Muchos trabajos se centran
en la búsqueda de levaduras que fermenten pentosas, los mejores resultados en rendimiento y
productividad la dan la Candida shehatae y la Pichia stipitis (Hahn y col, 2006), teniendo
mejor rendimiento la Candida shehatae que produce 44 g/L de etanol.
En relación a esto, Govindaswamy y Vane (2006) utilizaron una cepa de Saccharomyces

cerevisiae 424A (LNH-ST) modificada genéticamente donde se introdujeron genes de Pichia
stipitis para la fermentación de glucosa y xilosa. Las tasas de crecimiento y producción de
alcohol se realizaron en diferentes medios de peptona, extracto de levadura, glucosa y/o xilosa
(20 ± 0.8 g/L de sustrato).
Obteniendo las tasas más bajas de crecimiento en medios que contenían xilosa pura en
comparación a los medios que contenían mezclas de xilosa y glucosa o glucosa pura. También
se tuvo una µ máx de 0.291 h-1 en medio de YPD en comparación al medio YPX (0.206 h-1),
donde ambos contenían 20 g/L de sustrato. En los medios que contenían glucosa y xilosa, la
glucosa se agotó primero y después la xilosa. La producción de alcohol máxima se obtiene en
el medio YPD con 7.9 g/L y la producción más baja en el medio YPX con 4 g/L. En otro
estudio Zhao y col. (2008) observaron cómo se comportaba la cepa Pachysolen tannophilus
1771 en la asimilación de diferentes mezclas de glucosa y xilosa.
En los sustratos mixtos la glucosa fue el azúcar preferido y el consumo de la xilosa empieza al
terminarse el primer sustrato, presentando una etapa de adaptación en el consumo de la xilosa.
24
FUNDAMENTACIÓN
La tasa de consumo de glucosa (1.28 g L-1 h-1) fue superior a la tasa de consumo de la xilosa
(0.34 g L-1 h-1) en la fermentación de éstos azúcares reductores. La más alta concentración de
etanol (6.90 g/1) se obtuvo en la 12da hora en la fermentación de 100 % de glucosa, mientras
que la menor concentración de etanol (2.70 g/L) se obtuvo a las 48 horas de fermentación de
xilosa al 100 %.
Sin embargo el crecimiento presentó resultados diferentes obteniendo los valores más altos
(6.65 g/L) en la fermentación de xilosa pura y la más baja (5.22 g/L) en la fermentación de
glucosa pura. Entre las cepas silvestres más prometedoras se encuentra la Pichia stipitis que
puede asimilar tanto glucosa como xilosa y un amplio rango de sustratos donde resalta la
celobiosa (Agbogbo y col., 2006) y la cepa Kluyveromyces marxianus que aparte de poder
asimilar xilosa, es un microorganismo termotolerante el cual podría ser usado en zonas
tropicales donde la temperatura es elevada (Kumar y col., 2009).
Actualmente López-Álvarez y col., (2012) utilizan la cepa Kluyveromyces marxianus UMPe-1

en la fermentación de agave en la industria tequilera. Esto es debido a que mejora las
propiedades organolépticas y los rendimientos en la producción de alcohol en comparación a
la cepa Saccharomyces cerevisiae, utilizada comúnmente en éste tipo de ingenios. A nivel
industrial, la levadura UMPe-1 muestra una velocidad máxima de consumo de azúcar
fermentable de 2.27 g/L h-1 y la producción de etanol es de 1.38 g/L h-1, proporcionando 58.78
g/L de etanol a 72 h de fermentación, que corresponde al 96% de rendimiento.
Martín y col. (2010) proponen el uso de la cepa Candida tropicalis NBRC 0618 para la
producción de etanol y xilitol como subproducto, a partir de residuos de la poda de árboles de
olivo (producto renovable, bajo costo y residuo agroindustrial), que añade un valor a la
viabilidad económica del proceso. La materia fue tratada con una hidrolisis con temperatura
(200o C) buscando obtener azúcares fermentables. A las condiciones de 30o C, una agitación
de 500 rpm y un pH de 5.0 tuvieron un rendimiento de 0.44 g g-1 de etanol y 0.13 g g-1 de
xilitol. Watanabe y col. (2010) utilizan la cepa Candida glabrata NFRI3164 silvestre y la
misma cepa modificada genéticamente suprimiendo la respiración con el fin de realizar una
comparación en la producción de etanol. Reportan que esta cepa tiende a tolerar temperaturas
25
FUNDAMENTACIÓN
de entre 40 a 50o C, por lo que la que la convierte atractiva para su uso en sistemas airados y
con altas temperaturas.
Obtuvieron que la cepa modificada genéticamente, a las condiciones de 42o C y una agitación
150 rpm, obtiene 17.0 g/l de etanol a las 48h con un rendimiento teórico del 66.6 % y una
productividad de 0.35g l-1 h-1 que son los mejores resultados de la comparación realizada.
Fromanger y col. (2010), estudiaron la cinética en fed-batch de la levadura Candida shehatae
fermentando xilosa y glucosa por separado como fuente de carbono. Las condiciones de
crecimiento fueron en medio aeróbico a pH de 4.5 y con temperatura de 30o C. Considerando
al oxígeno como un parámetro importante por controlar, se obtuvo utilizando a la xilosa y con
1.19 mmolO2 g/ peso seco celular (DCW) h una máxima producción de etanol de 48.81g/L y
utilizando glucosa con 0.30 mmolO2 g/DCW h una máxima producción de etanol de 54.19
g/L.
5.3.2 Rutas metabólicas para la fermentación de carbohidratos
En muchos procesos de fermentación, la oxidación de azúcares simples bajo condiciones

anaerobias involucra dos fases: la oxidación de la glucosa y el metabolismo de piruvato. El
metabolismo de la glucosa ocurre de la misma manera tanto en la respiración aerobia como en
la respiración anaerobia y se da frecuentemente a través de la vía glucolítica de Embden–
Meyerhof–Parnas o EMP (Bai y col., 2008). A través de esta ruta una molécula de glucosa es
metabolizada y dos moléculas de piruvato son producidas. Bajo condiciones anaerobias, el
piruvato es posteriormente reducido a etanol con emisiones de CO2 obteniéndose un
rendimiento estequiométrico teórico de 0.511g de etanol y 0.489g de CO2 por 1g de glucosa
metabolizada (Kosaric y col., 2001).
En la glucólisis se producen dos moléculas de ATP los cuales son empleados para llevar a
cabo la biosíntesis de las células de la levadura lo cual involucra una variedad de
bioreacciones que requieren energía. Además, la producción de etanol está estrechamente
ligada al crecimiento celular del microorganismo, lo que significa que la biomasa se obtiene
como un subproducto. Sin el consumo continuo de ATP por parte del microorganismo que
26
FUNDAMENTACIÓN
está en crecimiento, el metabolismo glucolítico se vería interrumpido inmediatamente, debido

a la acumulación intracelular de ATP, causando una inhibición a la fosfofructoquinasa (PFK),
una de las enzimas de regulación más importantes en la glucólisis (Kosaric y col., 2001).
Como se ha mencionado anteriormente, la levadura Saccharomyces cerevisiae es la especie de
levaduras utilizada por excelencia para la obtención de etanol a nivel industrial puesto que es
un microorganismo de fácil manipulación y recuperación, no es exigente en cuanto a su
cultivo, no presenta alto costo, tolera altas concentraciones de etanol, en la fermentación
produce bajos niveles de subproductos, es osmotolerante, capaz de utilizar altas
concentraciones de azúcares, por lo que en este caso se utilizará para conocer como una
levadura puede asimilar diferentes carbohidratos.
De forma silvestre fermenta glucosa, el azúcar predominante en todos los hidrolizados

lignocelulósicos con altos rendimientos incluso en condiciones anaeróbicas. La asimilación de
la glucosa solo requiere un gradiente de concentración a través de la membrana plasmática.
Después de la absorción, entra a la vía EMP, ésta oxida la glucosa a dos piruvatos, dando
como resultado la formación neta de dos ATP por glucosa (Figura 6).
En anaerobiosis, el NADH formado por el gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa es

reoxidado a través de la fermentación alcohólica. Este equilibrio redox consiste en la
combinación de la actividad de la enzima piruvato descarboxilasa y de la alcohol
deshidrogenasa. Pero, obviamente, la glucosa no es sólo el carbohidrato presente en los
hidrolizados. Para que se puedan fermentar carbohidratos tres criterios tienen que ser
cumplidos (Van Maris y col., 2006):
La presencia de un transportador funcional en la membrana plasmática,

La presencia de la enzima(s) que introducen los carbohidratos a la ruta glucolítica y
El mantenimiento de un equilibrio redox cerrado.
La manosa y la fructosa son dos isómeros de la glucosa que se producen en los hidrolizados de
la biomasa lignocelulósica y que pueden ser fermentados por la cepa silvestre S. cerevisiae,
27
FUNDAMENTACIÓN
después de la fosforilación por la hexoquinasa, la manosa-6-fosfato se isomeriza en fructosa-

6-fosfato gracias a la fosfomanosa isomerasa, codificada por el gen PMI40.
Figura 6. Catabolismo de las hexosas de Saccharomyces cerevisiae. Números subrayados representan enzimas
en el metabolismo. Los nombres de los genes que codifican las enzimas se dan entre paréntesis. Glucosa: 2.7.1.1,
la hexoquinasa (HXK1/HXK2); 2.7.1.2, glucoquinasa (GLK1); Galactosa: (a través de la ruta de Leloir) 2.7.1.6,
galactoquinasa (Gal 1); 2.7.7.12, galactosa-1-fosfato-uridilitransferasa (Gal 7); 5.1.3.2, UDP-glucosa-4-epimerasa
(Gal 10; 5.4.2.2, fosfoglucomutasa (Gal5/PGM2). Manosa: 2.7.1.1, hexoquinasa I (HXK1); 5.3.1.8, manosa-6-
fosfato isomerasa (PMI40). G-3-P; gliceraldehido-3-fosfato; DHAP, dihidroxi-acetona-fosfato; PEP, fosfoenol
piruvato, PPP, ruta de las pentosas fosfato (Van Maris y col., 2006)
La hexoquinasa es también responsable de la fosforilación de la fructosa en fructosa-6-fosfato,

que se metaboliza posteriormente a través de la glucólisis. Como la manosa y glucosa pueden
competir por los mismos transportadores de hexosas, las cinéticas de utilización mixtas de
sustrato se determinan por su concentración en el hidrolizado. La galactosa es otro azúcar que
puede ser fermentado pero antes es asimilado utilizando al transportador galactosa permeasa
(Gal2p), y posteriormente convertida en glucosa-6-fosfato a través de la ruta de Leloir (Leloir,
1951).
Esta vía, que une a la galactosa en la ruta glucolítica, consiste en tres reacciones. Después de
la fosforilación de la galactosa por la galactoquinasa (Gal1p), la galactosa-1-fosfato
28
FUNDAMENTACIÓN
uridililtransferasa (Gal7p) convierte la UDP-glucosa y la galactosa-1-fosfato a UDP-galactosa

y glucosa-1-fosfato. La UDP-galactosa se reconvierte en UDP-glucosa por la uridina
difosfoglucosa-4-epimerasa (Gal10p; Van Maris y col., 2006). Por último, la glucosa-1-fosfato
se convierte a glucosa-6-fosfato por la fosfoglucomutasa (figura 6). En la cepa K .marxianus,
la alta cantidad de glucosa presente en los hidrolizados generalmente llevan a la represión del
metabolismo de la galactosa, evitando el consumo simultáneo de glucosa y galactosa. No es el
caso en la mezcla glucosa y fructosa que son asimilados de forma simultanea (Fonseca y col.,
2013).
Figura 7. Catabolismo de la D-xilosa y L-arabinosa en una cepa de S. cerevisiae modificada genéticamente. Los
nombres de genes correspondientes a las enzimas se da entre paréntesis en la leyenda de esta cifra. 1.1.1.21,
aldosa / xilosa reductasa (Gre3/xyl1); 1.1.1.9, xilitol deshidrogenasa (Xyl2/xyl2); 2.7.1.17, xiluloquinasa
(Xks1/xyl3); 5.3.1.5, xilosa isomerasa (xylA); 1.1.1.12, arabinitol 4-deshidrogenasa (Lad1); 1.1.1.10, L -
reductasa xilulosa (lxr1); 5.3.1.4, L-arabinosa isomerasa (araA); 2.7.1.16, L-ribuloquinase (araB), 5.1.3.4, L-
ribulosa-5-fosfato de 4-epimerasa (Arad). G-3-P, gliceraldehído-3-fosfato; PPP, ruta de las pentosas fosfato (Van
Maris y col., 2006)
La xilosa es uno de los componentes importantes de la biomasa lignocelulósica, pero pocas

levaduras son capaces de fermentar xilosa a etanol. El metabolismo de las pentosas se da en la
vía de las pentosas fosfato donde la xilosa es transformada a partir de xilulosa-5-fosfato hasta
fructosa-6-fosfato o gliceraldehido-3-fosfato para la producción de etanol (Figura 7).
29
FUNDAMENTACIÓN
En las levaduras que fermentan xilosa, dos oxidorreductasas están involucradas en el proceso,
xilosa reductasa (XR) y xilitol deshidrogenasa (XDH). Los cofactores que utilizan estas
enzimas son diferentes NADP+ y NADH, respectivamente. NADPH y NAD+ necesitan ser
regenerados para mantener el equilibrio redox. Bajo condiciones aeróbicas la NADH se puede
reoxidar a través de la cadena respiratoria con oxígeno molecular. Por cada NADH que es
reoxidado por XR un xilitol es producido como subproducto (Van Maris y col., 2006).
La L-arabinosa se metaboliza a través de las reacciones catalizadas por la aldosa (xilosa)

reductasa, L–arabinitol-4-deshidrogenasa, L-xilulosa reductasa, D-xilulosa reductasa y D-
xiluloquinasa (figura 7). Esta vía consiste en dos oxidaciones de NAD+ y dos reducciones
NADPH, lo que resulta un desequilibrio redox por los cofactores en condiciones anaeróbicas.
La sobreexpresión de todos los genes estructurales de la vía de L-arabinosa fúngica (Xyl1,
Lad1, Lxr1, Tyl2 y Xks1) dio como resultado la primera cepa capaz de fermentar L-arabinosa
a etanol. Las levaduras recomendadas para la fermentación de mezclas de D-glucosa y D-
xilosa son la Candida tropicalis y Candida glabrata que produce tanto etanol y xilitol
(Sánchez y col., 2008, Wang y col., 2013). La Candida tropicalis, tiene la capacidad para
metabolizar compuestos fenólicos (Yan y col., 2005) y así cualquiera de los productos de
degradación de la lignocelulosa, éstos inhibidores parecen no tener influencia en el proceso de
fermentación.
5.3.3 Fermentación en cultivos mixtos
En la actualidad, hay muchos casos en que la utilización de cultivos mixtos parece ser
ventajoso sobre un solo microorganismo. Podemos observar las biotransformaciones en la
naturaleza que tienen lugar por la combinación de las vías metabólicas de diferentes
microorganismos. Un cultivo mixto es definido como la incubación anaeróbica o aeróbica
ocasionalmente de microorganismos no especificados, en condiciones sépticas. Algunos
ejemplos de la coexistencia de diferentes microorganismos son los suelos de los bosques, las
pilas de compost, las zonas aerobias y anaerobias del agua, las fermentaciones espontáneas de
los jugos azucarados y la piel humana (Barder y col., 2010).
30
FUNDAMENTACIÓN
En un hábitat natural, diferentes microorganismos pueden competir por sustratos, como actuar
de forma simbiótica. Para una degradación eficiente de la celulosa, hemicelulosa y pectina, no
siempre se presenta de forma natural en un solo microorganismo, por lo que se ha recurrido
tanto a la ingeniería genética como a los cultivos mixtos, en donde crecen simultáneamente
dos o más cepas, de tal forma que sus efectos sinérgicos se vean reflejados en una mejor
perspectiva de degradación de sustratos con mezclas complejas de carbohidratos. Los
microorganismos que tienen un amplio rango de asimilación de sustratos son interesantes
debido a que un metabolismo rápido y eficiente de los azúcares que incluya tanto las
fracciones de celulosa como de hemicelulosa es crítico para una conversión eficiente de la
biomasa lignocelulósica para la obtención de biocombustibles.
En la actualidad, la cooperación natural de diferentes microorganismos se utiliza en sólo unas

pocas aplicaciones en la industria biotecnológica. En algunos casos los microorganismos son
utilizados para el tratamiento de aguas residuales, producción de biogás, recuperación
biológica de suelos y la producción de alimentos tradicionales (Barder y col., 2010). Algunos
ejemplos del uso de cultivos mixtos en la industria alimentaria son la producción de queso,
yogur, chucrut, kéfir, salami, el whisky, la cerveza belga Lambic, entre otros. El crecimiento
microbiano y la formación del producto no se realizan a través de la regulación externa, sino
por la modificación de las condiciones interna, tales como las concentraciones disponibles de
oxígeno, pH, sustrato y el producto deseado en los ejemplos antes mencionados. Una de las
ventajas adicionales de los cultivos mixtos es la posibilidad de la utilización de productos
secundarios (por ejemplo, suero de leche o melazas) ya que son más baratos que la glucosa
como sustrato para la producción biotecnológica de productos químicos. Por otra parte, los
procesos a partir de cultivos mixtos pueden ayudar a encontrar nuevas sustancias de interés
industrial, debido a que un número de vías metabólicas secundarias que se llevan a cabo por
las características del microorganismos o por la sinergia generada el cultivo mixto (Oh y col.,
2007)
La producción de etanol por fermentación de almidones y los materiales celulósicos está

ganando creciente interés debido a la economía cada vez mayor de producción de bioetanol
causada por el alto precio del petróleo. Abate y col. (1996) describe la producción de etanol
31
FUNDAMENTACIÓN
por un co-cultivo de Zymomonas mobilis y Saccharomyces sp. con mayores rendimientos y

tasas de producción que con cualquiera de microorganismos en cultivo puro. La utilización de
inulina de alcachofa como un sustrato para la producción de etanol por un cultivo mixto de Z.
mobilis y Kluyveromyces fragilis fue descrita por Szambelan y col. (2004), donde se logró una
conversión de 94% del máximo teórico.
En el caso de sorgo como un sustrato para la producción de etanol, Mamma y col. (1996)
sugiere un proceso de fermentación cultivo mixto con Saccharomyces cerevisiae y Fusarium
oxysporum, en donde la hidrólisis de la celulosa y la fermentación de los azúcares liberados se
producen simultáneamente en este ejemplo. La utilización de materiales celulósicos para la
producción de etanol se ve obstaculizada por la falta de un progreso adecuado en la
producción de monosacáridos a partir de celulosa y una eficiente utilización de todos los
azúcares formados. Dado que los productos de hidrólisis a menudo causan la inhibición por
retroalimentación de las enzimas utilizadas para la hidrólisis, se propone realizar la hidrólisis y
fermentación simultáneas de los diferentes sustratos.
Entre las ventajas de este proceso está evitar la acumulación de glucosa y disacáridos y no
producir una inhibición por producto de las enzimas celulolíticas (Sun y Cheng, 2002). La
conversión simultánea de glucosa y xilosa a etanol por el cultivo mixto de Z. mobilis y P.
stipitis se informó por Fu y col. (2009). Maki y col., (2009) informó sobre las aplicaciones de
Clostridium thermocellum junto con otras cepas de Clostridium sp. o Termoanaerobacterium
saccharolyticum. Donde la cepa C. thermocellum sólo puede metabolizar glucosa, mientras
que los otros microorganismos pueden utilizar las pentosas derivadas de la hemicelulosa. Al
utilizar este cultivo mixto en el proceso de fermentación de un hidrolizado lignocelulolítico
mejora la formación de producto debido a que se evita la competencia por sustrato entre las
especies.
La mezcla de S. cerevisiae y Pichia stipitis o C. shehatae se ha estudiado en el trabajo de

Kordowska y Targonski (2002), donde la producción de etanol a partir de glucosa varió de
0.38 hasta 0.45 g/g. Al introducir xilosa en el medio con glucosa se obtuvieron rendimientos
de 0.28 hasta 0.40 g/g, siendo más bajos que al utilizar solo la hexosa. También la Candida
32
FUNDAMENTACIÓN
tropicalis ha sido utilizada en cultivo mixto con la cepa Zymomonas mobilis para el
aprovechamiento de residuos agroindustriales de bajo costo en la producción de etanol. Patle y
Lal (2008) utilizan este cultivo mixto para la fermentación de los residuos sólidos, producto de
la elaboración de la tapioca, conocidos como thippi (complejo de almidón, pectina, fibra y
proteínas). Después de un proceso de hidrólisis enzimática y a escala de un fermentador de 1
L, obtuvieron una producción de 72. 8 g/L de etanol que corresponde el 93.18 % de
rendimiento teórico, usando el cultivo mixto; cuando solo utilizaron la Z. mobilis tuvieron una
producción de 65.3 g/L de etanol (rendimiento 82.83 %) y al utilizar C. tropicalis fue una
producción de 61.2 g/L (rendimiento 76.58 %). Ya en escala de fermentador de 10 L el
rendimiento teórico para la producción de etanol fue de 78.82 %. En otro estudio, el proceso
de fermentación se llevó a cabo mediante un cultivo mixto de Trichoderma harzianum,
Phanerochaete chrysosporium, Mucor hiemalis, y la levadura, S. cerevisiae. El proceso se dio
de la siguiente forma: donde en el primer paso fue la desintegración del material
lignocelulósico de su estructura compleja por hongos lignocelulolíticos (Trichoderma
harzianum y/o Phanerocheate chrysosporium). El segundo paso es la despolimerización de
carbohidratos complejos (celulosa y hemicelulosa) en azúcares reductores (glucosa, fructosa,
xilosa, etc.), utilizando enzimas celulolíticas producidas por hongos celulolíticos (T.
harzianum / Mucor hiemalis), y el tercer paso la fermentación de los azúcares por la levadura
(S. cerevisiae) para la producción de etanol. Concluyen que con la mezcla de las cepas T.
harzianum y S. cerevisiae se obtiene el mayor rendimiento con 4% w/v o 31.6 g/L de etanol
(Zahangir y Nassereldeen, 2009).
5.4 Factores que afectan en la fermentación de carbohidratos
Idealmente, la producción de etanol a partir de hidrolizados lignocelulósicos requerirá que los

microorganismos fermentadores de pentosas y hexosas realicen este proceso en presencia de
compuestos inhibidores producidos durante la hidrólisis. Los compuestos inhibidores podrían
ser ácidos débiles, tales como ácido acético, furaldehidos y otros compuestos fenólicos,
principalmente furfural e hidroximetilfurfural, como resultado de varias reacciones complejas
durante el tratamiento fisicoquímico de la biomasa (Mussato y Roberto, 2006).
33
FUNDAMENTACIÓN
De los ácidos orgánicos que se producen en los hidrolizados lignocelulósicos, el ácido acético
es el más común de los hidrolizados de la hemicelulosa, mientras que los ácidos
hidroxicarboxílicos como el ácido glicólico y el ácido láctico también están presentes cuando
se lleva a cabo una hidrólisis alcalina. Además, el ácido fórmico se genera de la degradación
de la lignina (Klinke y col., 2002). El citosol de las levaduras tienen generalmente un pH más
elevado que el medio circundante, pero al existir ácidos orgánicos débiles en el medio, éstos se
difunden fácilmente a través de las membranas biológicas causando una acidificación
citosólica que puede inducir a la apoptosis (Ludovico y col., 2001).
Los derivados del furano, principalmente furfural y el 5-HMF, se derivan de la deshidratación

de pentosas y hexosas durante la hidrólisis, éstos son considerados de los inhibidores más
fuertes en los hidrolizados lignocelulósicos. Aunque el furfural es más tóxico que el 5-HMP,
los dos compuestos actúan sinérgicamente para suprimir el crecimiento de la levadura (Liu y
col., 2004). Por lo general, los furanos se han implicado en una amplia gama de efectos,
incluyendo la inhibición del crecimiento celular y la utilización de glucosa, reducción de la
actividad enzimática y en la productividad de etanol, daño en el ADN y la inhibición en la
síntesis de proteínas y ARN (Liu y col., 2004).
Wahlbom y Hahn-Hägerdal (2002) informaron que durante la fermentación de xilosa,

disminuyó la producción de xilitol después de la adición de furfural, posiblemente debido a
que NADH se oxida a NAD+ durante su reducción a alcohol furfurílico, lo que sugiere que el
furfural presente en los hidrolizados lignocelulósicos podría ser beneficioso para la
fermentación de xilosa a etanol. También mencionaron que el 5-HMF, que requiere NADPH
para su reducción, no afectó en la producción de xilitol.
También, los procesos fermentativos requieren de condiciones de operación que garanticen el

buen desempeño de los microorganismos. A partir de esto, se ha visto que el manejo de estos
microorganismos presenta ciertas dificultades, específicamente en las condiciones de medios
de cultivos y del proceso de fermentación a nivel industrial. Debido al interés generado en la
producción de etanol a altas concentraciones, se ha visto como este factor afecta el desempeño
de los microorganismos fermentadores causando inhibición en el crecimiento microbiano y la
34
FUNDAMENTACIÓN
reducción en el rendimiento producto/sustrato. En general, una concentración de etanol mayor

al 6 % (p/v) tiene un efecto inhibitorio sobre todos los microorganismos.
La mayoría de las cepas toleran una concentración de 5.5 % (p/v) de etanol en el medio de
cultivo (Sridhar y Rao, 2004). Otro de los factores a considerar es la temperatura,
microorganismos tales como la Zymomonas mobilis crecen entre 25 y 40º C, con un
crecimiento optimo a 30º C. La composición y la estructura de la membrana plasmática y la
concentración de fosfolípidos se afecta cuando la bacteria alcanza una temperatura de 40º C, lo
cual conlleva a una pérdida de la integridad de la membrana. Posteriormente, la elevada
temperatura resulta en la acumulación de etanol dentro de la célula, lo cual tiene un
significativo efecto en la viabilidad de las células (Petersson y col., 2007).
En el caso de levaduras como las especies del género Saccharomyces la velocidad de

producción de alcohol incrementa de forma estable hasta los 30º C y de forma suave hasta los
36º C, pero disminuye a temperaturas superiores a los 37° C. Algunas cepas son capaces de
crecer a temperaturas por encima de los 37º C y son comúnmente nombradas como
termofílicas, mientras que otras tienen una temperatura máxima superior a los 45º C y son
comúnmente llamadas termotolerantes (Sridhar y Rao, 2004).
También muchos microorganismos crecen en condiciones anaeróbicas y el oxígeno en exceso

tiene un efecto negativo sobre la producción de etanol. En las bacterias, por ejemplo, la
aireación induce la producción de subproductos incluyendo acetatos, acetaldehídos y lactatos y
además, el oxígeno tiene un efecto inhibitorio sobre el consumo de sustrato y el crecimiento
microbiano. A bajas concentraciones de sustrato, las velocidades de crecimiento y el
rendimiento de biomasa son independientes de la presencia de oxígeno. De forma opuesta, a
altas concentraciones de sustrato, decrecen los parámetros de crecimiento (Chandraraj y col.,
2004).
35
FUNDAMENTACIÓN
5.5 Aplicación Industrial
En la actualidad existen procesos patentados donde se ha demostrado los diversos procesos de

fermentación utilizando levaduras como monocultivo modificado o cultivos mixtos como
medio para la obtención de etanol a nivel industrial con altos rendimientos.
Spindler y col., (1992) en la patente U.S. No. 5100791, demuestran un proceso de

fermentación utilizando la levadura Brettanomyces custersii que tiene la capacidad de
fermentar celobiosa y glucosa a etanol, debido a que produce su propia enzima β-glucosidasa.
Esta levadura realiza un proceso de sacarificación donde degrada hemicelulosa y celulosa,
transformándolas en D-celobiosa, D-glucosa, manosa y D-galactosa. Las condiciones de
crecimiento fueron utilizando un rango de pH de 3.5 a 6.0 y de temperatura de 30 a 39o C,
donde con la temperatura optimizada a 37o C y utilizando 15 % de celobiosa en medio
sintético obtuvieron 65 g/L de etanol. Como se ha visto, el uso de cultivos mixtos para la
mejor degradación de los azúcares fermentables, son un medio para mejorar la eficiencia del
proceso de fermentación. Con base en esto, podemos observar en la solicitud de patente U.S.
No. 0151532 A1 (2011) que implementa un proceso para la producción de etanol, un producto
de la fermentación del co-cultivo de un miembro del género Paenibacillus genéticamente
modificado y un microorganismo etanologénico, como podría ser una levadura o la E. coli. El
uso de este cultivo mixto generó una producción máxima de etanol a las 96 h de 46.3 g/L
utilizando como sustrato material lignocelulósico pre-tratado de pino.
Debido a que muchas veces no se alcanzan los rendimientos deseados en el proceso de

producción de alcohol, la patente U.S. No. 0201093 (2011) propone una solución a los bajos
rendimientos en la producción de alcohol. La invención implementa un proceso para el
aumento de crecimiento y mejorar el metabolismo de la levadura. El uso de iones de
bicarbonato aumenta el rendimiento de las levaduras y por esta acción mejoran los productos
de la fermentación en general, por ejemplo, fermentación de etanol, la industria del queso, de
la cerveza y el vino. Se cree que los bajos niveles del ión bicarbonato desencadenan un
ambiente de pH óptimo, que permite a las células de levadura reproducirse eficientemente
consumiendo por ejemplo, glucosa.
36
FUNDAMENTACIÓN
Los mecanismos responsables de este efecto pueden ser: 1) los bajos niveles de bicarbonato
alteran la permeabilidad de la membrana, permitiendo que más glucosa entre en la célula y por
lo tanto más producción de etanol. 2) Los niveles bajos de la sal puede reducir los protones en
el exterior de la mitocondria en la levadura, estimulando los procesos que buscan mantener
este gradiente, ya que es importante para la generación de energía celular (éste proceso mejora
el metabolismo de la glucosa en la levadura).
Se comenta que la estimulación o el retraso en el crecimiento de la célula depende de la

cantidad de bicarbonato de sodio que se utilice en el medio. Las condiciones para que esto se
dé son: una fermentación anaerobia de 35 a 60 h, una temperatura de 30 a 40o C y un pH de 4 a
5. Los microorganismos utilizados en el proceso de fermentación de esta patente (U.S. No.
0201093 (2011)) pueden ser cualquiera capaz de convertir los carbohidratos complejos a
carbohidratos simples, por ejemplo, las especies Kluyveromyces, Candida, Pichia,
Bretanomyces y Saccharomyces. Los resultados que obtuvieron fue que al utilizar un medio
sintético (25 g de glucosa, 1 mL de urea (45%) en 250 mL de agua) y entre 200 y 500 ppm de
bicarbonato de sodio como fuentes de carbono para la Saccaromyces cerevisiae se tiene 2.4
g/L con 0 rpm y 4.8 g/L con 200 y 500 rpm, manteniendo una concentración de 2.4 g/L de la
levadura durante 48 h. La producción de alcohol pudo estar restringida por el bajo porcentaje
de glucosa como fuente de carbono. Debido a que la fuente de carbono que comúnmente se
utiliza es la obtenida de la biomasa vegetal, la solicitud de patente WO. No. 127545 A1
(2011), propone un proceso para la obtención de alcohol a partir de residuos biomásicos
provenientes de fibras celulósicas (madera), en donde la sacarificación por hidrólisis
enzimática y la fermentación se da en un solo reactor. Al final del proceso comentan que la
concentración residual de azúcares se encuentra entre el rango de 0 a 20 g/L y de etanol está
en 40 a 120 g/L usando la cepa Saccharomyces cerevisiae y como agente hidrolítico la
Zymomonas mobilis que fueron modificadas genéticamente.
37
MATERIALES Y MÉTODOS
6.- MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Microorganismos
Se utilizaron 3 cepas de levaduras silvestres (LR2, LR4 Y LR5) aisladas de líquido ruminal de
bovino fistulado del Estado de Yucatán, y 1 cepa silvestre aislada de termita de madera (T1)
identificadas como se muestra en la tabla 4:
Tabla 4. Identificación de las levaduras silvestres

Cepa Levadura NRRL*
LR2 Candida glabrata -
LR4 Candida tropicalis Y-50876
LR5 Candida glabrata -
T1 Candida glabrata Y-50877
*NRRL (ARS Culture Collection, USA): Número de registro en el banco de cepas.
6.2 Medios de cultivo
6.2.1 Medio de cultivo 1
Para la determinación de las condiciones medio ambientales en el crecimiento y fermentación

de levaduras silvestres a nivel matraz se utilizó el medio YPD, el cual está constituido por
dextrosa (20 g/L), extracto de levadura (10 g/L) y peptona de caseína (20 g/L).
Para la obtención del perfil de asimilación preliminar e individual de azúcares de los

microorganismos aislados en medio sintético se utilizó el siguiente medio (tabla 5):
38
Tabla 5. Composición elemental para el crecimiento de levaduras en base a 30g/L
Aporte real
ELEMENTOS (g/30g Requerimiento de
REACTIVO PESO (g/L) del elemento
de Cel) las levaduras (g/L)
(g/L)
Glucosa (C6H12O6) 70.5
Fructosa (C6H12O6) 70.5
Ramnosa (C6H12O5) 64.2
Galactosa (C6H12O6) 70.5
Carbono 28.2 Arabinosa 28.2 de C
70.5
(C5H10O5)
Xilosa (C5H10O5) 70.5
Sacarosa
66.5
(C12H22O11)
Sulfato de amonio 2.7 de N
Nitrógeno 2.7 12.72
(NH4)2SO4 3.1 de S
Oxígeno 9.6 - - -
Hidrógeno 1.95 - - -
Fosfato de amonio 0.78 de P
Fósforo 0.78 2.4
(NH4PO3) 0.35 de N
Azufre 0.07 Sulfato de magnesio 0.2 de S
0.75
Magnesio 0.15 MgSO 4 0.15 de Mg
Cloruro de potasio
Potasio 1.2 2.3 1.2 de K
KCl
Cloruro de sodio
Sodio 0.003 0.0075 0.003 de Na
NaCl
Cloruro de calcio
Calcio 0.09 0.25 0.09 de Ca
CaCl2
Sulfato ferroso 0.002 de Fe
Hierro 0.002 0.0004
FeSO4 0.0009 de S
Para evaluar la capacidad fermentativa de cultivos individuales y mixtos en mezcla de

azúcares, así como para establecer las condiciones de fermentación con cultivos mixtos en
medio sintético a nivel matraz se empleó el medio de cultivo establecido en la tabla 6.
Para evaluar la capacidad fermentativa del cultivo mixto seleccionado a nivel de 3 L, se utilizó
un hidrolizado de harina integral (cáscara, semillas, bagazo, etc) de limón persa (Citrus
latifolia) proporcionado por el CIATEJ Unidad Sureste; el hidrolizado se obtuvo mezclando 1
L de una solución de HCl al 3 % con 100 g de harina libre de polifenoles y pectina,
posteriormente se esterilizó a 120o C por 15 min. Una vez estéril, se ajustó el pH a 4.8
39
utilizando 1 L de buffer de citrato. Por último, para la reacción de sacarificación enzimática el

medio se ajustó hasta obtener una proporción 1:20 (harina:agua), se adicionó la enzima
Novozymes en una concentración de 1.7 mg/mL de medio. Las condiciones de la
sacarificación enzimática fueron de 50o C por 60 h a 120 rpm. El hidrolizado presentó el
siguiente perfil de carbohidratos en g/L: Sacarosa, 1.09 ± 0.01; Glucosa, 11.98 ± 0.61; Xilosa,
2.18 ± 0.40; Arabinosa, 4.74 ± 0.44; Fructosa. 6.83 ± 0.34; lo que representa un total de 26.83
± 0.36 g/L de azúcares fermentables. No se detectó galactosa en el hidrolizado. El hidrolizado
tuvo una concentración de fósforo de 150.31 + 1.82 mg/L y de nitrógeno-amino libre 168.21 +
2.94 mg/L.
Tabla 6. Composición elemental para el crecimiento de levaduras en base a Nitrógeno por litro (Atlas R., 2010)
(Wilkins y col., 2005)
Fuentes de carbono (%) Sales (g ó mg/L)
(NH4)2SO4 5.0 g
Glucosa 51
KH2PO4 1.0 g
MgSO4-7H2O 0.5 g
Fructosa 30
NaCl 0.1 g
CaCl2-2H2O 0.1 g
Galactosa 8
KI 1.0 mg
H3BO3 0.5 mg
Arabinosa 7
ZnSO4-7H2O 0.4 mg
MnSO4-4H2O 0.4 mg
Xilosa 2
FeCl3 0.2 mg
Na2MoO4-4H2O 0.2 mg
Sacarosa 2
CuSO4-5H2O 0.04 mg

fermentación de levaduras silvestres a nivel matraz
Se realizó un diseño factorial 32 con 9 tratamientos llevando a cabo los ensayos en orden
aleatorio. Los factores evaluados fueron (Tabla 7) la temperatura (35, 40 y 45 °C) y la
velocidad de agitación (0, 100 y 200 rpm).
40
Tabla 7. Diseño experimental 32, para la determinación de las condiciones de crecimiento y producción de
alcohol
FACTORES CODIFICADOS FACTORES SIN
CODIFICAR
NÚMERO ORDEN A B Temperatura Agitación
DE DE (°C) (rpm)
CORRIDA CORRIDA
1 5 - - 35 0
2 7 O - 40 0
3 8 + - 45 0
4 3 - O 35 100
5 9 O O 40 100
6 2 + O 45 100
7 4 - + 35 200
8 1 O + 40 200
9 6 + + 45 200
6.3.1 Cinética de fermentación para la obtención de las condiciones adecuadas de

crecimiento y producción de alcohol
El preinóculo (1 mL de glicerol, para cada cepa por duplicado) fue cultivado en 10 mL en tubo
con medio de YPD (medio 1) y crecidas por 24 h a las condiciones establecidas en el diseño
experimental. A partir de 10 mL de YPD con la cepa ya crecida, después de 24 h, se
inocularon matraces Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio YPD previamente ajustado
a pH de 4.5 (Figura 8). Se tomaron distintas muestras a lo largo de la cinética y se
almacenaron en viales en congelación a -20o C, para la determinación posterior de biomasa,
azúcares consumidos y producción de etanol.
41
Figura 8. Esquema de propagación y cinéticas de fermentación en medio YPD
Para el procesamiento (Figura 9) de las muestras se recolectaron 10 mL del medio líquido a

diferentes tiempos durante 24 h. De estos, se tomó 1 mL de muestra para su cuenta al
microscopio en una cámara Neubauer, los 9 mL restantes se centrifugaron a 4o C, 5300 rpm
por 20 min para la separación de las células.
El sobrenadante fue congelado para la determinación posterior de los azúcares reductores

libres y la determinación de etanol. El paquete celular producto de la centrifugación fue
utilizado para la determinación del peso seco, éste se realizó en charolas de plástico a peso
constante previamente taradas, a las cuales se les colocó la muestra y fueron secadas en un
horno a 60o C por 24 h y posteriormente se calculó el peso seco por la diferencia de peso.
42
Figura 9. Esquema del procesamiento de las muestras

medio sintético
6.4.1 Prueba preliminar de asimilación de carbohidratos
Se tomaron viales Eppendorf de las cepas (LR2, LR4, LR5 y T1 mantenidos a -20o C) y se
adicionaron por duplicado a tubos que contenían 9 mL de los diferentes azúcares, glucosa,
xilosa, fructosa, ramnosa, galactosa, arabinosa y sacarosa utilizando el medio de cultivo 2. Se
incubaron durante 24 h y se tomó lectura del crecimiento por densidad óptica (D.O.) a 540 nm.
Para obtener las diferencias de crecimiento se le resto al tiempo final, la densidad óptica del
tiempo inicial.
43
6.4.2 Perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados
Para poder corroborar si los microrganismos tenían la capacidad de producir alcohol se

realizaron cinéticas de crecimiento y producción de alcohol en el medio 2, según el diseño
factorial 4 x 7 que comprende dos factores (tabla 8), el primer factor cepa (LR2, LR4, LR5 y
T1) y el segundo factor azúcares (glucosa, fructosa, sacarosa, xilosa, arabinosa, galactosa,
ramnosa), todos los experimentos fueron realizados por duplicado. El esquema de trabajo fue
similar al presentado en la figura 8.
Tabla 8. Diseño factorial 4 x 7 con los factores, niveles y respuestas analizadas para la obtención del perfil de
asimilación
Factores Niveles Respuestas
LR2 Crecimiento poblacional (x106 cel/mL)
LR4
Cepa
LR5 Peso seco (g/L)
T1
Glucosa Producción de alcohol (g/L)
Sacarosa
Fructosa Eficiencia (%)
Azúcares Galactosa
Xilosa
Arabinosa
Ramnosa
44
6.4.3 Cinética de fermentación para la obtención del perfil de asimilación
El preinóculo (1 mL de cada cepa mantenida en glicerol a -20oC, por duplicado) fue cultivado
en un tubo con 10 mL de medio mínimo de sales (medio 2) donde la única fuente de carbono
fueron los distintos azúcares y se crecieron por duplicado por 10 h a las condiciones de 35o C
y 200 rpm. A partir de los 10 mL del medio mínimo con la cepa ya crecida, después de 10 h,
se inocularon en matraces Erlenmeyer de 500 mL con 250 mL del medio mínimo de sales
(medio 2) previamente ajustado a pH de 4.5 y se ajustaron a las mejores condiciones para
producción de alcohol.
Se tomaron distintas muestras (10 mL) a lo largo de la cinética y se almacenaron en viales en

congelación a -20o C, para la determinación posterior de biomasa, azúcares consumidos y
producción de etanol.
De estos, se tomó 1 mL de muestra para su cuenta al microscopio en una cámara Neubauer,

los 9 mL restantes se centrifugaron a 4o C, 5300 rpm por 20 min para la separación de las
células (Figura 9). El sobrenadante fue congelado para la determinación posterior de los
azúcares reductores libres y la determinación de etanol. El paquete celular producto de la
centrifugación fue utilizado para la determinación del peso seco.
6.4.4 Modificación en el esquema de propagación
Debido al estrés que podría generarse a las levaduras por realizar un preinóculo en un medio
mínimo de sales (medio 2), se realizaron ensayos de comprobación donde se modificó el
esquema de propagación. El preinóculo (1 mL de glicerol, para cada cepa por duplicado) fue
cultivado en un tubo con 10 mL de medio YPD y se crecieron por duplicado durante 24 h a las
condiciones de 35o C y 200 rpm.
Ya crecido el microorganismo, se centrifugó a 4o C, 5300 rpm por 20 min, el sobrenadante fue

desechado, y el paquete celular se lavó por duplicado con solución salina al 0.85%. El paquete
celular libre de medio YPD, fue resuspendido con 25 mL de medio mínimo (medio 2) y se
45
inoculó en matraces Erlenmeyer de 500 mL con 250 mL del medio mínimo de sales
previamente ajustado a pH de 4.5, a las mejores condiciones para producción de alcohol
determinadas previamente en la sección 6.3.1.El análisis de las muestras se realizó según el
esquema que se presenta en la figura 9.
6.5 Evaluación de la capacidad fermentativa de cultivos individuales y mixtos en mezclas

de azúcares
6.5.1 Comparación de dos medios de fermentación
Con la finalidad de mejorar los rendimientos de producción de alcohol en las dos cepas
propuestas como más adecuadas para su mezcla en cultivo mixto se realizó una comparación
en el medio mínimo de sales (tabla 5) y un medio modificado de crecimiento de levaduras en
base al contenido de nitrógeno (tabla 6), al medio se le eliminaron los aminoácidos con la
finalidad de que la única fuente de carbono sean los azúcares (Atlas, 2010).
El preinóculo (1 mL de glicerol, para cada cepa por cuadriplicado) fue cultivado en un tubo
con 10 mL de medio YPD y se crecieron por duplicado durante 24 h a las condiciones de 35o
C y 200 rpm.
Ya crecido el microorganismo, se centrifugó a 4o C, 5300 rpm por 20 min para separar las
células, el sobrenadante fue desechado, y el paquete celular se lavó por duplicado con solución
salina al 0.85%. El paquete celular libre de medio YPD, fue resuspendido con 25 mL de medio
mínimo de sales (medio 2) y del medio base nitrógeno (medio 3), y se inocularon en matraces
Erlenmeyer de 500 mL con 250 mL de ambos medios previamente ajustado a pH de 4.5 que
contenían cada uno glucosa (70 g/L) como única fuente de carbono, a las mejores condiciones
para producción de alcohol, determinadas en la sección 6.3.1. El análisis de las muestras se
realizó según el esquema que se presenta en la figura 9.
46
6.5.2 Fermentación de cultivos individuales y mixtos
Para la fermentación de cultivos individuales y en cultivo mixto empleando mezcla de

azúcares como fuente de carbono, se seleccionó el medio a base de nitrógeno (tabla 6). Se
utilizaron las cuatro cepas en cultivos individuales, donde fueron inoculadas al 100 % al inicio
de la fermentación en la mezcla de carbohidratos.
Se formularon tres cultivos mixtos con las dos cepas que produjeron una mayor concentración
de alcohol (LR4 y T1), en el primer cultivo mixto se inoculó al 60 % la cepa LR4 y al 40 % la
cepa T1 (CC1) al inicio de la fermentación, el segundo se inoculó al 20 % la cepa LR4 y al 80
% la cepa T1 (CC2) al inicio de la fermentación y el tercero se inoculó al 100 % la cepa LR4
al inicio de la fermentación y posteriormente de forma secuencial (48h) se inoculó al 100 % la
cepa T1 (CC3).
Se utilizaron las condiciones de 35o C y 0 rpm (cultivo estático) para la cepa LR4 y el cultivo
mixto CC1 donde en mayor proporción se encuentra la cepa LR4, estas condiciones fueron las
más adecuadas para producir alcohol de acuerdo a la sección 6.3.1. Para la cepa T1 y el cultivo
mixto CC2 donde en mayor proporción se encuentra la cepa T1, fueron 35o C y 200 rpm y para
cultivo mixto CC3 se utilizaron las condiciones de la cepa LR4 hasta las 48 h fueron
modificadas a las condiciones de producción de alcohol para la cepa T1.
47
Figura 10. Esquema de cinética de fermentación de cultivos individuales y mixtos
6.5.3 Cinéticas de fermentación de cultivos individuales y mixtos en mezcla de azúcares
El preinóculo (1 mL de cultivo conservado en glicerol a -20o C, para cada cepa) fue inoculado
en un tubo con 10 mL de medio YPD y se cultivaron por duplicado durante 24 h a las
condiciones de 35o C y 200 rpm (figura 10). Se realizó un segundo pase de propagación
agregando los 10 mL de YPD con las células crecidas a un matraz de 250mL con 100 mL de
YPD durante 10 h a las condiciones de 35o C y 200 rpm.
Una vez crecido el microorganismo, se realizó una cuenta al microscopio para ajustar la
población inicial a 20 x106 cel/mL para cada microorganismo en cultivo individual y en los
cultivos mixtos se ajustó a las diferentes proporciones establecidas para tener una población
inicial total de 20 x106 cel/mL en la mezcla para las cepas LR4 y T1. Una vez obtenido el
volumen necesario para ajustar la población de forma individual y en proporción para la
formulación del cultivo mixto, el microorganismo que fue crecido en medio YPD,
48
posteriormente se centrifugó a 4o C, 5300 rpm por 20 min, el sobrenadante fue desechado, y el

paquete celular se lavó por duplicado con solución salina al 0.85%.
El paquete celular libre de medio YPD, fue resuspendido con 25 mL de medio mínimo base
nitrógeno (tabla 6) y se inoculó en matraces Erlenmeyer de 500 mL con 300 mL del medio
mínimo base nitrógeno previamente ajustado a pH de 4.5, como única fuente de carbono se
utilizaron carbohidratos a las condiciones reportadas por Wilkins (2005) y Boluda-Aguilar
(2013) donde para los cultivos individuales se utilizaron en una concentración final de 100 g/L
y para los cultivos mixtos de 200 g/L de carbohidratos.
Las cinéticas de fermentación se ajustaron a las mejores condiciones para producción de

alcohol para cada cepa o mezcla de microorganismos (de acuerdo a los resultados de la
sección 6.3.1.) y el análisis de las muestras se realizó similar al esquema que se presenta en la
figura 9. Donde la determinación del peso seco solo se realizó para los cultivos individuales y
el consumo de la mezcla de azúcares fue monitoreada por HPLC.

sintético a nivel matraz
Se realizó un diseño factorial 4 x 3 con 12 tratamientos realizando los ensayos en orden

aleatorio. Los factores evaluados fueron (tabla 9) tiempo de inóculo (1, 2, 4, 6 días) y la
velocidad de agitación (0, 100 y 200 rpm). Las cinéticas fueron realizadas secuencialmente,
inoculándose primero la cepa LR4 a sus mejores condiciones de fermentación (35o C y cultivo
estático) y posteriormente fue inoculada la cepa T1 variándose el tiempo de inóculo y las
velocidades de agitación cuando se ha formado el cultivo mixto.
49
Tabla 9. Diseño factorial 4 x 3 para determinar las condiciones de fermentación
en cultivo mixto
Tiempo de
TRATAMIENTO Agitación (rpm)
inóculo (días)
1 1 0
2 2 0
3 4 0
4 6 0
5 1 100
6 2 100
7 4 100
8 6 100
9 1 200
10 2 200
11 4 200
12 6 200
6.6.1 Cinéticas para la obtención de las condiciones de fermentación en cultivo mixto
El preinóculo (1 mL de cultivo conservado en glicerol a -20o C, para cada cepa) fue cultivado
en un tubo con 10 mL de medio YPD y se crecieron por duplicado durante 24 h a las
condiciones de 35o C y 200 rpm (figura 10). Se realizó un segundo pase agregando los 10 mL
de YPD con las células crecidas a un matraz de 250 mL con 100 mL de YPD durante 10 h a
las condiciones de 35o C y 200 rpm.
población a 20 x106 cel/mL para la cepa LR4 que se inoculó al inicio de la fermentación, a las
condiciones de 35o C y 0 rpm que son las más adecuadas para la producción de alcohol. El
diseño factorial 4 x 3 se aplicó dependiendo del día de inóculo de la cepa T1, donde una vez
crecido el microorganismo se ajustó la población a 20 x 106 cel/mL. Antes de inocular ambos
microorganismos, el medio de YPD donde fueron crecidos se centrifugó a 4o C, 5300 rpm por
20 min, el sobrenadante fue desechado, y el paquete celular se lavó por duplicado con solución
salina al 0.85%. El paquete celular libre de medio YPD, fue resuspendido con 25 mL de
50
medio mínimo base nitrógeno (tabla 6) y se inoculó en matraces Erlenmeyer de 500 mL con
300 mL del medio mínimo base nitrógeno previamente ajustado a pH de 4.5, como única
fuente de carbono se utilizaron carbohidratos en las proporciones reportadas por Wilkins
(2005) y Boluda-Aguilar (2013) donde la concentración final fue de 100 g/L. Una vez
formado el cultivo mixto se modificaron las condiciones de fermentación a 35o C y 200 rpm
las más adecuadas para la segunda cepa. El análisis de las muestras se realizó similar al
esquema que se presenta en la figura 9. Donde la determinación del peso seco ya no se realizó
para los cultivos y el consumo de la mezcla de azúcares fue monitoreada por HPLC.
6.7 Evaluación de la capacidad fermentativa del cultivo mixto seleccionado a nivel

fermentador de 3 L

matraz
Buscando igualar la producción de alcohol y la productividad que se obtuvo a nivel matraz en

el mejor tratamiento en cultivo mixto secuencial, las cepas LR4 y T1 fueron propagadas en
medio YPD a las condiciones de crecimiento 35o C y 200 rpm (Figura 11). La cepa LR4 se
inoculó al inicio de la fermentación a sus mejores condiciones de producción de alcohol 35o C
y 0 rpm y la cepa T1 se inoculó pasado un día a las condiciones de 35o C y 200 rpm en un
bioreactor (Applikon Biotechnology). Se tomaron muestras a distintos tiempos durante 4 días
y se analizaron como se ha indicado anteriormente.

matraz con ajuste de pH
Para evaluar el efecto por la disminución en el pH que se presentó en la cinética anterior

realizada, las cepas LR4 y T1 fueron propagadas en medio YPD a las condiciones de
crecimiento 35o C y 200 rpm (Figura 11). La cepa LR4 se inoculó al inicio de la fermentación
a sus mejores condiciones de producción de alcohol 35o C y 0 rpm y la cepa T1 se inoculó
pasado un día a las condiciones de 35o C y 200 rpm en un bioreactor (Applikon
51
Biotechnology) de manera similar a lo descrito en el inciso anterior. Se ajustó el pH a 4.5,

durante toda la fermentación, con HCl 0.5 M y NaOH 0.5 M dosificado automáticamente por
el equipo. Se tomaron muestras a distintos tiempos durante 4 días y se analizaron como se ha
indicado anteriormente.
6.7.3 Cinética de fermentación con modificación de aeración y agitación
Para tratar de obtener una mayor concentración de alcohol y una productividad similar a la
obtenida a nivel matraz, se realizó un diseño factorial 22 con 4 tratamientos realizando los
ensayos en orden aleatorio. Los factores evaluados fueron (Tabla 10) agitación (200 y 300
rpm) y la aireación (0.25 y 0.50 vvm).
Tabla 10. Diseño 22, evaluación de la capacidad fermentativa en cultivo mixto a nivel bioreactor
Aireación
Tratamiento Codificados Agitación (rpm)
(vvm*)
1 - - 200 0.25
2 - + 200 0.50
3 + - 300 0.25
4 + + 300 0.50
* vvm: volumen de aire por volumen de medio por minuto (l/l/min).
Para la cinética de fermentación se utilizó un bioreactor de 3 L (Applikon Biotechnology), con

un volumen de mezcla de azúcares y medio de sales con base nitrógeno de 2 L esterilizado.
Debido a que la cepa LR4 se inocula al inicio de la fermentación las condiciones que se
utilizaron fueron 35o C y 0 rpm que son las más adecuadas para la producción de alcohol, la
cepa T1 (35o C) se inoculó 1 día después de inoculada la cepa LR4 y en éste momento se
aplicó el diseño factorial 22.
52
Figura 11. Cinética de fermentación de mezclas de azúcares con cultivos mixtos a nivel de bioreactor de 3 L
El preinóculo (1 mL de cultivo conservado en glicerol a -20o C, para cada cepa) fue cultivado
en un tubo con 10 mL con medio YPD y se crecieron por duplicado durante 24 h a las
condiciones de 35o C y 200 rpm (figura 11). Se realizó un segundo pase agregando los 10 mL
de YPD con las células crecidas a un matraz de 250 mL con 100 mL de YPD durante 10 h a
las condiciones de 35o C y 200 rpm. Se realizó un tercer en un matraz Erlenmeyer de 500 mL
con 300 mL de medio YPD durante 10 h a las mismas condiciones de crecimiento.
población a 20 x106 cel/mL para la cepa LR4 que se inoculó al inicio de la fermentación, y
para la cepa T1 que se inoculó al día posterior, donde una vez crecido el microorganismo se
ajustó también la población a 20 x 106 cel/mL. Antes de inocular ambos microorganismos, el
medio de YPD donde fueron crecidos se centrifugó a 4o C, 5300 rpm por 20 min, el
sobrenadante fue desechado, y el paquete celular se lavó por duplicado con solución salina al
0.85%.
53
El paquete celular libre de medio YPD, fue resuspendido con 250 mL de medio mínimo base
nitrógeno (tabla 6) y se inoculó en un bioreactor de 3 L que contenía 2 L del medio mínimo
base nitrógeno previamente ajustado a pH de 4.5, como única fuente de carbono se utilizaron
carbohidratos en las proporciones reportadas por Wilkins (2005) y Boluda-Aguilar (2013)
donde la concentración final fue de 100 g/L. Se utilizó un antiespumanete (Sigma) para
disminuir la espuma que se formó en la parte superior del medio de fermentación. El análisis
de las muestras se realizó similar al esquema que se presenta en la figura 9. Donde la
determinación del peso seco ya no se realizó para los cultivos y el consumo de la mezcla de
azúcares fue monitoreada por HPLC.
6.7.4 Cinética de fermentación con el hidrolizado de limón persa (Citrus latifolia)
Para la cinética de fermentación con el hidrolizado de limón persa (Citrus latifolia) se utilizó
un bioreactor de 3 L (Applikon Biotechnology), con un volumen de hidrolizado de 1.3 L y se
ajustó el nitrógeno y fósforo a 350 mg/L (Romo, S. 1993). Se pesaron 0.7421 g/L de N4H2PO4
que ajustaría el fósforo, esta cantidad aporta 90 mg/L de nitrógeno, por lo que fue necesario
adicionar 0.43 g/L de (NH4)2SO4 para ajustar el nitrógeno en el hidrolizado a la cantidad
establecida.
Las cepas LR4 y T1 fueron propagadas en medio YPD a las condiciones de crecimiento 35o C
y 200 rpm (Figura 11). Debido a que la cepa LR4 se inoculó al inicio de la fermentación las
condiciones que se utilizaron fueron 35o C y 0 rpm que son las más adecuadas para la
producción de alcohol, la cepa T1 se inoculó 1 día después a las condiciones de 35o C, 200
rpm y 0.25 vvm, las mejores condiciones obtenidas en el diseño anterior planteado (tabla 10).
54
6.8 Métodos de análisis
6.8.1 Determinación de la biomasa celular
La determinación de la población microbiana total se realizó por el método de cuanta directa

al microscopio utilizando una cámara de Neubauer, bajo un microscopio con el objetivo 40X.
Para calcular el número de células se utilizó la siguiente fórmula:
. é
ú é = ( )( )
.
Dónde:
D: Dilución efectuada para el conteo;

F: Factor de la cámara (0.25 x 106).
6.8.2 Determinación de peso seco de la biomasa
La biomasa se determinó por gravimetría. Las muestras tomadas durante la cinética se

centrifugaron a 5,300 rpm durante 15 min a 4 oC. El paquete celular lavado (x2, 15 mL de
agua destilada) se secó en estufa a 60o C hasta obtener un peso constante. El cálculo del peso
seco se realizó con la siguiente fórmula:
( − )
= (1000)
!
Dónde:
Pf: Peso final (g)

Pi: Peso charola sin muestra (g)
Vm: Volumen de muestra (mL).
55
6.8.3 Determinaciones de azúcares y alcohol
La determinación de azúcares reductores libres (anexo 1) se efectuó de acuerdo a la técnica de

Miller (1959), la cual emplea ácido-3,5-dinitrosalicílico (DNS). La curva de calibración se
realizó con glucosa como estándar, en concentraciones de 0.1 a 1 g/L. La determinación de los
azúcares totales (anexo 1) se realizó tomando 1 mL de la solución problema se le adicionó 1
mL de fenol al 5% y enseguida se agregó 5 mL de ac. Sulfúrico para generar el efecto de
hidrólisis. El rango de concentraciones a probar fue de 0.01 a 0.1 g/L, para la curva de
calibración se realizó una solución patrón de 0.1 g/L de sacarosa. Las muestras libres de
células (5 mL) fueron diluidas con 5 mL de agua y destiladas en un microdestilador de vidrio
hasta colectar la primera fracción de 5 mL, a la cual se le determinó el contenido de alcohol
(anexo 1).
Para la determinación de etanol se realizó una reacción con solución de dicromato de potasio
acidificada durante 10 min y se realizó la determinación por espectrofotometría a una longitud
de onda de 585 nm. Para la curva de calibración se utilizó etanol grado reactivo como
estándar, en concentración de 2 a 20 g/L (Bohringer, 1964). Para todas las pruebas
colorimétricas se utilizó un espectrómetro UV-vis (Perkin Elmer, Lambda XLS)
La mezcla de azúcares se monitoreo mediante el uso de un sistema de cromatografía de alta

resolución (HPLC) Thermo Scientific Finnigan Surveyor. El sistema consistió en una bomba
Surveyor LC Plus, automuestreador Surveyor Plus y detector RI Surveyor Plus. La separación
se llevó a cabo usando una columna Phenomenex Rezex RPM-Monosaccharide Pb+2 (8%) de
300 x 7.8 mm.
La temperatura de la columna se mantuvo a 85 oC con un flujo de 0.5 mL/min y la temperatura

del detector fue de 42 oC. Las muestras fueron previamente diluidas 1:50 y filtradas antes de la
inyección utilizando filtros de acrodisco PTFE Millex millipore de 25 mm de diámetro y 0.45
µm de poro. Las concentraciones se determinaron a partir de curvas patrón elaborado con la
mezcla de estándares de azúcares grado analítico (Sigma), a concentraciones de glucosa de 0.1
a 5 g/L y el resto de los azúcares de 0.1 a 1.6 g/L.
56
6.8.4 Cálculo de parámetros cinéticos de crecimiento
Velocidad máxima de crecimiento (µmáx (h-1)). Para calcular la velocidad de crecimiento (o

tasa de crecimiento), se considera el incremento en el número de células (dx) en un intervalo
de tiempo (dt). En este caso, la ecuación que describe la cinética es la siguiente:
$
= %$
Resolviendo la ecuación anterior por el método de separación de variables, e integrado, se

obtiene:
&
$= % ( 1/$ $ = ( %
'
Como la velocidad de crecimiento µ permanece constante a lo largo de la fase exponencial,

*+
entonces ( 1/$ $ = % ( , la cual da lugar a (*, 1/$ $ = % , finalmente se integra y se
obtiene |ln $ = % | (evaluada de la biomasa final a la biomasa inicial), despejando µ:
ln 0 − ln 0
%=
La µ máx se calculó introduciendo la fórmula en una hoja de Excel (Office 2010) donde se
graficó µ vs. T donde el valor más alto, corresponde a la velocidad máxima de crecimiento.
Tiempo de duplicación. El tiempo de duplicación de las células se calculó con la siguiente

fórmula:
2
1 =
%
Constante de rendimiento de biomasa (Yx/s).
ó 6
3' =
4 7
57
6.8.5 Parámetros cinéticos de producción de etanol
Alcohol producido (EtOH)
(ΔEtOH) = (EtOH)=>?@A (B) − (EtOH)>?>D>@A (B)

C C
Constante de rendimiento de producto (Yp/s)
g
Etanol producido ( )
(Yp/s) = L
g
Consumo de sustrato ( )
L
Eficiencia de fermentación
UV
' (&,,)
T= W
Yp/s teórico = 0.51
XY/4 Z[ó\]^_
Productividad máxima
7 á$ ℎ c
` á$ ( á$) =
1 c d c e (ℎ)
Velocidad de consumo de azúcar y producción de alcohol
Se estimó la velocidad de consumo de azúcar y de producción de alcohol en la determinación

del perfil de asimilación y en las cinéticas con mezcla de azúcares por el modelo de Gompertz
usando el programa de regresión no lineal (OriginPro 8 SR0).
(lmg) ]
f(g) = h[jk
58
Dónde: o( ) es el consumo de azúcar o la producción de alcohol en el tiempo ( ); es el

máximo consumo e azúcar (%) o la producción de alcohol (g/L) en → ∞; 6 es una
constante relacionada con las condiciones iniciales cuando = 0, entonces o( ) = o, = jr
;
s es la velocidad constante de consumo de azúcar o de producción de alcohol (h-1) (Pacheco y
col., 2009).
6.8.6 Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó en cada una de las etapas del trabajo, utilizando para ello el
paquete estadístico Statgraphics Centurion XVI, donde se realizó un análisis de varianza para
determinar si existen diferencias significativas entre los factores, así mismo, el resultado
obtenido fue comprobado con la ayuda de las gráficas de medias, las gráficas de interacción,
los diagramas de Pareto y la prueba de rangos múltiples principalmente.
59
RESULTADOS Y DISCUSIONES
7.- RESULTADOS Y DISCUSIONES
7.1 Microorganismos
7.1.1 Aislamiento de los microorganismos
Los microorganismos silvestres utilizados fueron aislados por personal del CIATEJ-Unidad
sureste a partir de líquido ruminal (LR2, LR4 y LR5) de bovino fistulado del Estado de
Yucatán y del estómago de termita de madera (T1), buscando que presenten una adaptación a
la zona de aislamiento y les dé una ventaja en la asimilación de diferentes fuentes de carbono
para la producción de alcohol.
Las características observadas al microscopio de las 4 levaduras silvestres se muestran en la

tabla 11. Como se aprecia en la tabla, las cepas LR2 y LR4 que proceden la misma fuente de
aislamiento se diferencian entre sí en tamaño, forma y color de la colonia, mientras que la cepa
LR2 y LR5 son muy similares. Las cepas LR2, LR5 y T1 son muy similares, sin embargo
provienen de fuentes de aislamiento diferente.
Tabla 11. Características microscópicas de los microorganismos silvestres utilizados
Color de la Fuente de
Cepa Tamaño Forma
colonia aislamiento
LR2 (Candida glabrata) Medio Circular Blanca lechosa Líquido ruminal
LR4 (Candida tropicalis) Grande Ovalada Blanca opaca Líquido ruminal
LR5 (Candida glabrata) Medio Circular Blanca lechosa Líquido ruminal
T1 (Candida glabrata) Medio Circular Blanca lechosa Estómago de termita
Ahora bien, aún con algunas semejanzas o diferencias entre las levaduras que se emplearon
(ya sea por la fuente de aislamiento o por su morfología), se partió con la hipótesis que todas
las levaduras son diferentes y por lo tanto tendrán variación en cuanto a sus parámetros
cinéticos, por tal razón se comenzó a trabajar con todas ellas.
60
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1.2 Identificación de los microorganismos
La secuencia de los tres fragmentos amplificados de las tres cepas (LR2, LR5 y T1)
presentaron alta similitud con secuencias reportadas para la especie Candida glabrata, como
se observa en la figura 12, la relación filogenética es representada gráficamente por un
cladograma para las tres cepas de levaduras.
Figura 12. Relación filogenética de tres cepas de Candida glabrata
Se separan en dos grupos (A, (B, C)), con una razón de 0.138, con respecto al grupo
independiente de LR2 y un nodo con dos hojas para LR5 y T1. El análisis por distancias,
diferencia las cepas intra nodos con una razón mayor de 0.532, lo que sugiere que a pesar de
ser de la misma especie son cepas independientes con características fermentativas diferentes.
La secuencia amplificada de la cepa LR4 presentó una alta similitud con secuencias reportadas
para la especie Candida tropicalis.

fermentación de levaduras silvestres a nivel matraz
7.2.1 Crecimiento
En la figura 13, se presenta las curvas de crecimiento con base en el peso seco para cada una
de las cepas según el diseño factorial planteado (tabla 7) donde se obtuvieron diferentes
resultados. En todas las cepas se obtuvo que el tratamiento 7, que corresponde a las
condiciones de 35o C y 200 rpm, resulto ser el más adecuado para el crecimiento, debido a que
se obtuvo el mayor peso seco en comparación al resto de los tratamientos. La cepa LR4
(figura 13b) presentó el mejor crecimiento donde a las 24 h obtuvo un peso seco de 9.28 ±
61
0.44 g/L, seguido de la cepa LR2 (figura 13a) donde al mismo tiempo se logró un peso seco
de 7.58 ± 0.62 g/L.
10 10
a) Candida glabrata (LR2) b) Candida tropicalis (LR4)
8 8
Peso seco (g/L)
Peso seco (g/L)

6 6
4 4
2 2
0 0
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
Tiempo (h) Tiempo (h)
10 10
c) Candida glabrata (LR5) d) Candida glabrata (T1)
8 8
Peso seco (g/L)
Peso seco (g/L)
6 6
4 4
2 2
0 0
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
Figura 13. Cinéticas de crecimiento (peso seco) para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1. Tratamiento 1
(35o C, 0 rpm, círculo rojo), Tratamiento 2 (40o C y 0 rpm, círculo naranja), Tratamiento 3 (45º C y 0 rpm,
triangulo invertido verde claro), Tratamiento 4 (35oC y 100 rpm, triángulo verde oscuro), Tratamiento 5 (40o C y
100 rpm, cuadrado azul turquesa), Tratamiento 6 (45o C y 100 rpm, azul marino), Tratamiento 7 (35o C y 200
rpm, rombo morado), Tratamiento 8 (40o C y 200 rpm, rombo rojo), Tratamiento 9 (45o C y 200 rpm, triángulo
naranja).
Para la cepa LR5 (figura 13c) y T1 (figura 13d), se obtuvo que los tratamientos 7 (35o C y
200 rpm) y 5 (40o C y 100 rpm) podrían ser los más adecuados para tener un buen crecimiento
de estos microorganismos, para la cepa LR5 a las 24 h se obtuvo un peso seco de 6.32 ± 0.62
g/L en el tratamiento 7 y de 7.16 ± 0.56 g/L en el tratamiento 5, para la cepa T1 a las 24 h, se
obtuvo un peso seco de 6.94 ± 0.32 g/L en el tratamiento 7 y 5.92 ± 0.01 g/L en el tratamiento
62
5. En el resto de los tratamiento el crecimiento vario dependiendo de las condiciones

empleadas, se observa en la mayoría una fase exponencial constante durante las 24 h de
fermentación esto podría indicar que los microorganismos están consumiendo otros sustratos
como fuente de carbono debido a que el medio donde se crecieron (YPD) es rico en proteínas
y otras estructuras carbonadas y la glucosa ya se había agotado o se encontraba en baja
concentración. Los resultados menos favorables en general se presentaron con el tratamiento 9
(45o C y 200) las condiciones más altas del diseño factorial, ya que para las cepas LR2, LR4 y
LR5 no presentaron crecimiento, aunque la cepa T1 tuvo un ligero crecimiento. La cepa LR4
también no pudo crecer con las condiciones del tratamiento 3 (45o C y 0 rpm) por lo que una
nula agitación o un exceso de agitación combinado con una alta temperatura desfavorecería su
crecimiento y por consecuencia la producción del metabolito de interés.
Los resultados cinéticos promedio de crecimiento se presentan en la tabla 12 donde se

especifican los datos obtenidos en cada tratamiento probado de las cuatro cepas utilizadas, los
datos corresponden al tiempo en que se obtuvo la mayor producción de alcohol. Se puede
asumir que el tratamiento 7 (35o C y 200 rpm) es el más adecuado para lograr un mayor
población, peso seco y Yx/s para las cuatro cepas. Entre los microorganismos utilizados la cepa
LR2 obtuvo la población más alta de 439 ± 2.83 x 106 cel/mL y la cepa LR4 fue la que más
creció con base en el peso seco 4.72 ± 0.17 g/L. Salmon y col., (1998) y Fromanger y col.,
(2010) comentan que cierta cantidad de oxígeno es necesaria para que el microorganismo
genere ácidos grasos, indispensables para la membrana celular. También una fermentación
aeróbica estimularía el crecimiento e incrementaría la viabilidad celular, condiciones
reportadas por Valero y col., (2001).
Las µ máx (h-1) más altas y los tiempos de duplicación (h) más bajos se alcanzaron para las
cepas LR2 y LR4 en el tratamiento 4 (35o C y 100 rpm) con 0.60 ± 0.00 y 0.69 ± 0.03,
respectivamente, y en el tratamiento 5 (40o C y 100 rpm) para las cepas LR5 y T1 con
0.62±0.02 y 0.71±0.03, respectivamente, donde entre las cuatro cepas la T1 tuvo el valor más
alto de µ máx. El mayor Yx/s se obtuvo en el tratamiento 7 para la cepa LR4 con 0.25 ± 0.01.
63
Tabla 12. Parámetros cinéticos para el crecimiento de las diferentes cepas según el diseño 32.
T Agitación Pob. Máx. Peso seco
Trat CEPAS µ máx (h-1) Td (h) Yx/s
(oC) (RPM) (x106 cel/mL) (g/L)
LR2 179±11.31 1.87±0.04 0.34±0.02 2.10±0.07 0.10±0.00
LR4 53±13.43 1.70±0.09 0.34±0.06 2.04±0.38 0.09±0.00
1 35 0
LR5 198±2.12 1.75±0.18 0.55±0.22 1.26±0.45 0.09±0.01
T1 186±7.78 1.72±0.07 0.41±0.10 1.77±0.46 0.09±0.01
LR2 129±7.77 1.73±0.18 0.27±0.00 2.53±0.00 0.09±0.01
LR4 31±1.41 1.70±0.35 0.41±0.32 1.70±1.32 0.09±0.01
2 40 0
LR5 95±0.70 1.38±0.01 0.40±0.18 1.54±0.55 0.07±0.00
T1 164±0.70 1.55±0.09 0.36±0.07 1.93±0.37 0.08±0.00
LR2 227±6.36 1.53±0.14 0.26±0.01 2.63±0.03 0.08±0.00
LR4 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.01
3 45 0
LR5 92±5.65 1.48±0.00 0.46±0.03 1.52±0.11 0.08±0.00
T1 75±4.94 1.40±0.03 0.42±0.05 1.68±0.18 0.09±0.01
LR2 293±5.65 2.80±0.00 0.60±0.00 1.15±0.01 0.15±0.00
LR4 130±1.21 2.99±0.05 0.69±0.03 1.00±0.04 0.16±0.01
4 35 100
LR5 227±20.50 2.46±0.07 0.55±0..05 1.28±0.11 0.13±0.00
T1 453±0.70 3.14±0.17 0.41±0.04 1.72±0.18 0.17±0.01
LR2 248±6.36 2.83±0.07 0.38±0.89 1.81±0.86 0.15±0.00
LR4 95±19.09 2.14±0.38 0.41±0.11 1.70±0.48 0.11±0.02
5 40 100
LR5 199±14.14 1.97±0.06 0.62±0.02 1.13±0.04 0.12±0.00
T1 262±3.53 2.92±0.10 0.71±0.03 0.98±0.04 0.17±0.01
LR2 272±14.14 2.70±0.94 0.58±0.07 1.20±0.15 0.14±0.05
LR4 105±3.53 3.30±0.04 0.55±0.12 1.25±0.26 0.18±0.01
6 45 100
LR5 236±14.14 3.02±0.03 0.56±0.07 1.35±0.02 0.16±0.00
T1 227±12.72 2.79±0.01 0.52±0.15 1.41±0.43 0.15±0.01
LR2 439±2.83 4.22±0.31 0.57±0.04 1.22±0.09 0.22±0.01
LR4 219±13.43 4.72±0.17 0.55±0.05 1.26±0.01 0.25±0.01
7 35 200
LR5 327±34.65 3.84±0.29 0.43±0.01 1.61±0.03 0.20±0.01
T1 388±24.75 3.29±0.33 0.45±0.04 1.55±0.15 0.17±0.01
LR2 124±4.24 3.90±0.20 0.45±0.07 1.55±0.22 0.20±0.01
LR4 142±31.81 3.12±0.77 0.43±0.25 1.63±0.056 0.17±0.01
8 40 200
LR5 170±2.82 1.84±0.52 0.43±0.01 1.60±0.01 0.14±0.04
T1 205±9.89 2.26±0.05 0.51±0.02 1.35±0.08 0.13±0.04
LR2 0±0.00 0±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
LR4 0±0.00 0±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
9 45 200
LR5 0±0.00 0±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
T1 16±0.00 0.15±0.06 0.29±0.14 2.71±1.33 0.04±0.01
LR2, Candida glabrata; LR4, Candida tropicalis; LR5, Candida glabrata; y T1 Candida glabrata.
Los análisis de varianza realizados se resumen con los gráficos de Pareto (figura 14) y de
interacción para cada una de las cepas probadas. En la figura 14a, para la respuesta de peso
seco de la cepa LR2 se observa que el factor de temperatura y la interacción tienen un efecto
significativo en la respuesta. Para la respuesta de Yx/s (figura 14c), se observa que el factor de
temperatura y la interacción tienen un efecto significativo en la respuesta, principalmente la
temperatura y para la respuesta de µ máx (figura 14b) no se observa efecto por los factores.
64
Con el gráfico de interacción (figura 14d) se obtuvo que las condiciones más adecuadas para
la obtención del mayor peso seco en promedio sería utilizando una temperatura de 35o C y una
agitación de 200 rpm.
a) Gráfica de pareto para Peso seco (g/L) b) Gráfica de Pareto para µmáx
+ +
- -
AB AB
A:Temperatura A:Temperatura
B:Agitación B:Agitación
0 1 2 3 4 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4

Efectos estandarizados Efectos estandarizados
c) Gráficas de Pareto para Yx/s d) Gráfica de interacción

5 Agitación
0
+ 100
- 4 200
A:Temperatura
Peso seco (g/L)
AB
2
1
B:Agitación
0
0 1 2 3 4 35 40 45
Efectos estandarizados Temperatura (oC)
Figura 14. Gráficas de Pareto para a) Peso seco, b) µmáx, c) Yx/s y d) gráfica de interacción para Peso seco de la
cepa LR2 en medio YPD
En la figura 15a, para la respuesta de peso seco de la cepa LR4 se observa que el factor de
temperatura, agitación y la interacción tienen un efecto significativo en la respuesta. La
temperatura es el principal factor que tiene la mayor influencia en la respuesta de peso seco.
Para la respuesta de Yx/s (figura 15c), se observa que el factor de temperatura y la interacción
tienen un efecto significativo en la respuesta, principalmente la interacción y para la respuesta
de µ máx (figura 15b) se obtuvo un efecto significativo por temperatura. Con el gráfico de
interacción (figura 15d) se obtuvo que las condiciones más adecuadas para la obtención del
mayor peso seco en promedio sería utilizando una temperatura de 35o C y una agitación de 200
rpm. Seguido de una temperatura de 45o C y una agitación de 100 rpm, que el microorganismo
logre crecer a altas temperaturas es de gran interés ya que en un proceso a mayor escala los
reactores utilizados para el proceso de fermentación no necesitarían refrigeración por lo que
beneficiaría en el costo del proceso para la producción de alcohol.
65
a) Gráfica de Pareto para Peso seco (g/L) b) Gráfica de Pareto para µmáx
+ +
- -
B:Agitación AB
AB B:Agitación
0 1 2 3 4 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

c) Gráfica de Pareto para Yx/s d) Gráfica de interacción

5 Agitación
0
+ 100
- 4 200
AB
Peso seco (g/L)

3
A:Temperatura
2
1
B:Agitación
0
0 1 2 3 4 5 35 40 45
En la figura 16a, para la respuesta de peso seco de la cepa LR5 se observa que el factor de
temperatura y la interacción tienen un efecto significativo en la respuesta. La interacción es el
principal factor que tiene influencia en el peso seco. Para la respuesta de Yx/s (figura 16c), se
observa que el factor de temperatura y la interacción tienen un efecto significativo en la
respuesta, principalmente la interacción y para la respuesta de µ máx (figura 16b) se obtuvo un
efecto significativo por temperatura y agitación, siendo la agitación la que dé mayor influencia
sobre la variable.
agitación de 200 rpm. Seguido de una temperatura de 45o C y una agitación de 100 rpm, si se
observa los resultados de la temperatura de 45o C para el crecimiento por peso seco se indica
que cierta agitación es necesaria para el crecimiento de este microorganismos pero un exceso
de este factor podría afectar las características en su desarrollo para la obtención de alcohol,
por lo que es importante conocer las condiciones más adecuadas para una buena fermentación.
66
a) Gráfica de Pareto para Peso seco (g/L) b) Gráfica de Pareto para µmáx
+ +
- -
AB B:Agitación
B:Agitación AB
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
c) Gráfica de Pareto para Yx/s d) Gráfica de interacción

4 Agitación
0
+ 100
- 200
AB 3
Peso seco (g/L)

2
A:Temperatura
1
B:Agitación
0
0 1 2 3 4 35 40 45
En la figura 17a, para la respuesta de peso seco de la cepa T1 se observa que el factor de
temperatura y la interacción tienen un efecto significativo en la respuesta. Siendo la
temperatura el principal factor que tiene influencia en el peso seco. Para la respuesta de Yx/s
(figura 17c), se observa que el factor de temperatura y la interacción tienen un efecto
significativo en la respuesta, principalmente la interacción y para la respuesta de µ máx (figura
17b) no se obtuvo un efecto significativo por temperatura y agitación, así como tampoco de la
interacción de estos factores.
agitación de 200 rpm. Seguido de una temperatura de 35o C y una agitación de 100 rpm, estos
dos tratamientos podrían son los más adecuados para el crecimiento de la cepa T1 sin
diferencia significativa.
67
a) Gráfica de Pareto de Peso seco (g/L) b) Gráfica de Pareto por µmáx
+ +
- -
A:Temperatura AB
AB B:Agitación
B:Agitación A:Temperatura
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4

c) Gráfica de Pareto por Yx/s d) Gráfica de interacción

4 Agitación
0
100
+
-
200
AB 3
Peso seco (g/L)

2
A:Temperatura
B:Agitación
0
35 40 45
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
Temperatura (oC)
Efectos estandarizados
cepa T1 en medio YPD
7.2.2 Fermentación
En la figura 18, se presenta las curvas de producción de alcohol para cada una de las cepas
según el diseño factorial planteado (tabla 7) donde se obtuvieron diferentes resultados. En el
caso de la cepa LR2 (figura 18a), la producción de alcohol se da constante durante 10 h para
la mayoría de los tratamientos hasta observar una estabilidad por alrededor de 8 h donde a las
20 h empieza a detectarse una disminución en la concentración de alcohol, este descenso en la
concentración podría deberse a un consumo por parte del microorganismo o evaporación
(Zhao y col., 2008). En el tratamiento 3 (45o C y 0 rpm) se observó una baja producción de
alcohol durante 8 h que empieza una constante producción hasta las 16 h donde se obtiene la
mayor concentración de alcohol y para el tratamiento 9 (45o C y 200 rpm) no se obtuvo
Para la cepa LR4 (figura 18b), se destacan los tratamientos 4 (35o C y 100 rpm), el 7 (35o C y
200 rpm) y el 1 (35o C y 0 rpm) donde se observó la velocidad más rápida en la producción de
alcohol, destaca que en éstos tratamientos se mantenga la misma temperatura y la variación
sea por la agitación. En el tratamiento 4, se observa que la producción máxima de alcohol se
obtiene a las 8 h y empieza una caída en la concentración de alcohol donde a las 18 h se tiene
68
menos de 2 g/L. No se presentó una producción de alcohol en el tratamiento 3 (45o C y 0 rpm)

y 9 (45o C y 200 rpm), por lo que la cepa LR4 para poder producir alcohol a 45o C necesita de
cierta agitación (100 rpm) aunque resulta uno de los tratamientos menos indicados para
obtener una alta producción.
12 12

10 10
P rod ucción d e alcoh ol (g /L )

Producción de alcohol (g/L)
8 8
6 6
4 4
2 2
0 0
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
12 12

10 10
P rod ucción d e alcoho l (g/L )
8 8
6 6
4 4
2 2
0 0
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
Figura 18. Cinéticas de producción de alcohol para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1. Tratamiento 1 (35o
C, 0 rpm, círculo rojo), Tratamiento 2 (40o C y 0 rpm, círculo naranja), Tratamiento 3 (45º C y 0 rpm, triangulo
invertido verde claro), Tratamiento 4 (35oC y 100 rpm, triángulo verde oscuro), Tratamiento 5 (40o C y 100 rpm,
cuadrado azul turquesa), Tratamiento 6 (45o C y 100 rpm, azul marino), Tratamiento 7 (35o C y 200 rpm, rombo
morado), Tratamiento 8 (40o C y 200 rpm, rombo rojo), Tratamiento 9 (45o C y 200 rpm, triángulo naranja).
69
Para la cepa LR5 (figura 18c) se observó una producción constante de alcohol a partir de las 4
h donde se destaca el tratamiento 5 (40o C y 100 rpm) donde se obtiene la máxima
concentración a las 4 h.
Tabla 13. Parámetros cinéticos para la producción de alcohol de las diferentes cepas según el diseño 32.
Azúcar
T Agitación Alcohol Eficiencia Pmáx
Trat o CEPAS Yp/s consumido
( C) (RPM) (g/L) (%) (g/Lh)
(g/L)
LR2 7.94±0.64 0.43±0.04 84.30±8.32 0.79±0.06 18.45±0.17
LR4 8.00±0.07 0.42±0.01 82.40±2.75 0.80±0.01 19.00±0.42
1 35 0
LR5 8.30±0.36 0.43±0.01 84.31±2.77 0.83±0.04 19.26±0.02
T1 8.80±0.17 0.45±0.01 88.23±1.38 0.73±0.01 19.70±0.11
LR2 7.53±0.51 0.38±0.02 74.50±4.17 0.63±0.04 19.56±0.04
LR4 7.40±2.68 0.39±0.015 76.50±29.08 0.62±0.23 19.20±0.04
2 40 0
LR5 9.31±0.07 0.48±0.00 94.11±0.00 0.78±0.01 19.42±0.16
T1 8.79±0.09 0.45±0.00 88.23±0.00 0.74±0.01 19.48±0.02
LR2 8.70±0.81 0.45±0.05 88.24±9.70 0.54±0.05 19.14±0.22
LR4 0±0.16 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.06
3 45 0
LR5 6.91±0.21 0.39±0.01 76.47±2.77 0.58±0.02 17.64±0.08
T1 7.45±0.04 0.45±0.00 88.23±0.00 0.47±0.01 16.46±0.06
LR2 8.20±0.05 0.43±0.00 84.30±0.00 1.03±0.01 18.90±0.01
LR4 7.62±0.057 0.42±0.02 82.40±4.17 1.10±0.08 18.15±0.23
4 35 100
LR5 8.94±0.13 0.47±0.01 92.15±2.77 0.89±0.01 19.19±0.18
T1 8.90±0.17 0.46±0.01 90.20±1.39 0.89±0.01 19.24±0.11
LR2 7.99±0.41 0.42±0.02 82.40±4.17 0.80±0.04 19.13±0.03
LR4 6.88±0.90 0.36±0.06 70.59±11.08 0.57±0.08 19.12±0.32
5 40 100
LR5 7.06±0.09 0.43±0.00 84.31±0.00 1.77±0.02 16.41±0.28
T1 7.96±0.09 0.45±0.00 88.23±0.00 0.66±0.01 17.58±0.08
LR2 8.04±1.34 0.43±0.06 84.30±12.48 0.67±0.11 18.81±0.21
LR4 5.90±0.42 0.32±0.01 62.70±2.75 0.42±0.03 18.41±0.59
6 45 100
LR5 7.59±0.38 0.40±0.01 78.47±2.77 0.40±0.01 19.06±0.28
T1 8.03±0.22 0.42±0.02 82.35±4.15 0.42±0.01 19.27±0.26
LR2 7.62±0.45 0.40±0.03 78.40±5.58 0.76±0.04 19.00±0.14
LR4 7.80±0.45 0.41±0.04 80.40±6.92 0.78±0.04 18.90±0.43
7 35 200
LR5 8.76±0.13 0.45±0.01 88.24±1.38 0.73±0.01 19.62±0.02
T1 8.90±0.16 0.47±0.02 91.17±4.15 0.89±0.01 19.22±0.22
LR2 9.40±0.21 0.50±0.01 98.03±2.77 0.94±0.02 18.80±0.23
LR4 6.20±0.13 0.33±0.00 64.70±0.00 0.52±00.101 18.63±0.44
8 40 200
LR5 7.39±0.55 0.49±0.04 96.10±6.93 1.23±0.10 15.31±0.42
T1 6.78±0.53 0.37±0.03 72.54±5.55 0.85±0.01 18.37±0.21
LR2 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00
LR4 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00
9 45 200
LR5 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00
T1 1.38±0.19 0.32±0.04 62.75±6.93 0.08±0.03 4.33±0.17
El tratamiento 9, como al igual que la cepa LR2 y LR4, no fue favorable para la producción de
alcohol para la cepa LR5. Se destaca el tratamiento 2 (40o C y 0 rpm) que a las 12 h se obtiene
la mayor concentración en comparación al resto de los tratamientos. Para la cepa T1 (figura
70
18d), las condiciones de 35o C y 200 rpm fueron las más adecuadas para su crecimiento, así
como para la producción de alcohol, ya que obtiene la mayor producción de alcohol a las 4 h
donde mantiene la misma concentración hasta las 20 h donde se observa una ligera
disminución.
Con respecto a los resultados de los parámetros cinéticos de producción (tabla 13), se tiene
que a la cepa LR2 le favorece el tratamiento 8 (40o C y 200 rpm) produciendo 9.40 ± 0.21 g/L
de alcohol seguido por el tratamiento 3 (45o C y 0 rpm) con 8.70 ± 0.81 g/L de alcohol, donde
entre estos tratamientos no hubo una diferencia significativa. Para la cepa LR4 y LR5 les
favoreció el tratamiento 1 (35o C y 0 rpm) donde se obtuvo 8.00 ± 0.07 g/L y el tratamientos 2
(40o C y 0 rpm) con 9.31 ± 0.07 g/L de alcohol, respectivamente. Para la cepa T1 se aprecia
que con el tratamiento 4 (35o C y 100) y el 7 (35o C y 200rpm) se obtiene una concentración
máxima de alcohol de 8.90 ± 0.16 g/L por lo que estos tratamientos favorecerían la producción
de alcohol en medio YPD para esta cepa.
La mayor eficiencia fue para la cepa LR2 en el tratamiento 8 (40o C y 200 rpm) que fue de
98.03 ± 2.77 % seguido de la cepa LR5 donde en el mismo tratamiento obtuvo una eficiencia
del 96.10 ± 6.93 %. Existen reportes de la utilización de microorganismos en medio YPD para
conocer la capacidad de producción de alcohol, la cepa LR2 presenta una eficiencia (98.03 ±
2.77 %) similar a la reportada por López-Álvarez y col., (2012) donde utilizan una cepa
silvestre Kluyveromyces marxianus para la producción de etanol con una eficiencia del 98%.
La cepa LR5 presenta una eficiencia (96.10 ± 6.93 %) ligeramente más baja que la reportada
por Hayashi y col., (2011) que utilizan una cepa mutante Zymomones mobilis con deficiencia
respiratoria, donde obtienen una eficiencia del 97.4 %. Pero ambas cepas (LR2 y LR5)
presentan una eficiencia superior a la cepa Saccharomyces cerevisiae modificada
genéticamente que presenta una eficiencia del 76.5 %, reportada por Govindaswamy y Vane
(2007). Los análisis de varianza realizados se resumen con los gráficos de Pareto (figura 19) y
de interacción para cada una de las cepas probadas. En la figura 19a, para la respuesta de
producción de alcohol para la cepa LR2 se observa que la interacción de la temperatura y
71
agitación tiene un efecto significativo en la respuesta, así como en la eficiencia (figura 19b)
en la producción de alcohol.
Para la producción máxima (Pmáx) (figura 19c) se observa que solo la temperatura tiene un
efecto significativo en la variable. Con el gráfico de interacción (figura 19d) se obtuvo que las
condiciones más adecuadas para la obtención de la mayor producción de alcohol en promedio
sería utilizando una temperatura de 40o C y una agitación de 200 rpm, seguido por las
condiciones de 45o C y 0 rpm.
a) Gráfica de Pareto para producción de alcohol (g/L) b) Gráfica de Pareto para Eficiencia
+ +
- -
AB AB
B:Agitación A:Temperatura
A:Temperatura B:Agitación
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

c) Gráfica de Pareto para Pmáx

d) Gráfica de interacción
10 Agitación
0
100
+
- 8 200
A:Temperatura
AB
4
2
B:Agitación
0
0 1 2 3 4 35 40 45
Figura 19. Gráficas de Pareto para a) producción de alcohol, b) eficiencia, c) Pmáx y d) gráfica de interacción
para producción de alcohol para la cepa LR2 en medio YPD
En la figura 20, para las respuestas de producción de alcohol, Pmáx y eficiencia de la cepa LR4
se observa que la temperatura es el principal factor que influye en éstas respuestas. En la
gráfica de interacción se observa que los mejores resultados de producción de alcohol en
promedio se podrían obtener a las temperaturas de 35, 40 o 45o C con 0 rpm.
En la figura 21a, para las respuestas de producción de alcohol para la cepa LR5 se observa
que la temperatura, la agitación y su interacción tienen un efecto significativo sobre la
respuesta. Para la eficiencia (figura 21b) en la producción de alcohol la temperatura y la
72
interacción tienen un efecto significativo sobre la respuesta. En ambas respuestas se observa

que el mayor efecto lo tiene la temperatura.
a) Gráfica de Pareto para producción de alcohol (g/L) b) Gráfica de Pareto para eficiencia
+ +
- -
AB AB
0 1 2 3 4 5
0 1 2 3 4 5
c) Gráfica de Pareto para Pmáx d) Gráfica de interacción

10 Agitación
0
+
Producción de alcohol (g/L) 100
- 8 200
A:Temperatura
B:Agitación
4
2
AB
0
0 2 4 6 8 35 40 45
Para la Pmáx (figura 21c) no se observó un efecto significativo por los factores empleados. Con
la gráfica de interacción (figura 21d) se observa que los mejores resultados de producción de
alcohol en promedio se podrían obtener utilizando las condiciones de temperatura de 40o C y 0
rpm.
Al igual que la cepa LR4, en la cepa LR5 se obtiene la mayor producción sin una agitación en
el sistema, esto podría deberse a que la fermentación alcohólica se da en anaerobiosis (Kosaric
y col., 2001) debido a la baja difusión de oxígeno en el medio evitando que la ruta metabólica
se dirija al crecimiento en alta concentración del microorganismo (Van Maris y col., 2006).
73
a) Gráfica de Pareto para producción de alcohol (g/L)
b)
Gráfica de Pareto para eficiencia
+ +
- -
AB AB
0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4

10 Agitación
0
+

100
- 8 200
A:Temperatura
AB
4
2
B:Agitación
0
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4 35 40 45
En la figura 22a, para las respuestas de producción de alcohol para la cepa T1 se observa que
la temperatura, la agitación y su interacción tienen un efecto significativo sobre la respuesta,
donde la temperatura presenta el mayor efecto sobre la producción de alcohol.
Para la eficiencia (figura 22b) en la producción de alcohol se obtuvo que los factores de
temperatura, agitación y su interacción tienen un efecto significativo sobre la respuesta, donde
la agitación presenta el mayor efecto. Para la Pmáx (figura 22c), solo la temperatura y la
agitación tienen un efecto significativo sobre la obtención de la mayor productividad en la
Con la gráfica de interacción (figura 22d) se observa que la temperatura de 35o C con una
agitación de 0, 100 o 200 rpm podría obtener la mayor producción de alcohol en promedio,
seguido de 40o C y 200 rpm, en este caso para la cepa T1 le beneficia una alta agitación.
74
a) Gráfica de Pareto para producción de alcohol (g/L) b) Gráfica de Pareto para eficiencia
+ +
- -
A:Temperatura B:Agitación
B:Agitación AB
AB A:Temperatura
0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 6

10 Agitación
0
100

+
- 8 200
A:Temperatura
AB
4
2
B:Agitación
0
0 2 4 6 8 35 40 45
para producción de alcohol para la cepa T1 en medio YPD
Con los resultados cinéticos obtenidos y con base al análisis estadístico correspondiente, se
determinaron las condiciones más adecuadas tanto para el crecimiento como para la
fermentación alcohólica de las distintas cepas (tabla 14).
Tabla 14. Condiciones de fermentación más adecuadas obtenidas a partir de los resultados cinéticos y
estadísticos
Cepas Crecimiento poblacional Producción de alcohol
LR2 (Candida glabrata) 45o C, 0 rpm
LR4 (Candida tropicalis) o
35o C, 0 rpm
35 C, 200 rpm
LR5 (Candida glabrata) 40o C, 0 rpm
T1 (Candida glabrata) 35o C, 200 rpm
Las cuatro cepas presentaron resultados favorables para el crecimiento utilizando las
condiciones de 35o C y 200 rpm, aunque la cepa LR4 se destaca entre ellas. Mientras que para
la etapa de fermentación hubo una diferencia en las condiciones necesarias para obtener la
mayor concentración del metabolito. La característica de termotolerancia observada en la cepa
75
LR2 la hace atractiva para ser empleada en procesos fermentativos a nivel industrial en climas
tropicales.

medio sintético
7.3.1 Prueba preliminar de asimilación de carbohidratos
Con base en la prueba preliminar de asimilación de azúcares se observa en la figura 23 que

los mejores resultados de asimilación se obtienen en glucosa (Glu), fructosa (Fru) y sacarosa
(Sac). Los resultados más bajos de asimilación se obtienen en galactosa (Gal), ramnosa (Ram)
y xilosa (Xil). En los resultados para glucosa se observa que se tiene un similar consumo entre
los microorganismos, solo la cepa LR4 presenta una asimilación más baja. La cepa LR2 tiene
la capacidad de crecer mejor que las otras cepas utilizando fructosa como sustrato. La cepa
LR4 tiene la capacidad de asimilar más adecuadamente la xilosa y galactosa, según lo
observado en la figura 23. La arabinosa (Ara) presenta los más bajos resultados de
asimilación, pero se destaca la cepa LR5 que asimila mejor que las cepas LR2 y LR4 donde no
se tienen resultados positivos de consumo en este sustrato. Tomando como base estos
resultados (tabla 15), se tiene el siguiente perfil de asimilación: la cepa LR2 asimila
mayormente y en orden de importancia glucosa, fructosa, sacarosa y en menor proporción
ramnosa, galactosa y xilosa. La cepa LR4 asimila glucosa, sacarosa, fructosa, seguido en baja
cantidad por galactosa, xilosa y ramnosa.
Tabla 15. Orden de asimilación de las distintas fuentes de carbono según cepa
Cepa Glu Xil Ara Sac Fru Gal Ram

LR2 1 6 - 3 2* 5 4
LR4 1 5 - 2 3 4* 6
LR5 1 5 7 2 3 4 6
T1 1 6 7 2 3 5 4
* Diferencia significativa con un 95 % de confianza.
76
La cepa LR5 asimila glucosa, sacarosa, fructosa y galactosa y en pequeña cantidad ramnosa y
xilosa. Por último la cepa T1 asimila en mejor proporción glucosa, sacarosa, fructosa y le
sigue en orden de importancia ramnosa, galactosa y xilosa. Al observar que los
microorganismos pueden asimilar sacarosa indica que contienen la enzima invertasa que
hidroliza el disacárido y asimila en forma de monosacárido a la glucosa y fructosa (Fonseca y
col., 2013).
45
40
35
30
D.O. 540 nm
LR2
25
LR4
20 LR5.1
15 T1
10
5
0
Glucosa Xilosa Arabinosa Sacarosa Fructosa Galactosa Ramnosa
Figura 23. Asimilación de los distintos azúcares a 540 nm después de 24 h
En los resultados estadísticos se observó que no existe diferencia significativa entre las cepas
para la asimilación de los azúcares glucosa, xilosa, sacarosa, arabinosa y ramnosa. Con el
gráfico de medias (figura 24) se observa que la cepa LR2 (figura 24a) presenta los mejores
resultados de asimilación para fructosa y la cepa LR4 (figura 24b) para galactosa.
a) b)
Figura 24. Gráfico de medias según cepa en la asimilación de a) fructosa y b) galactosa
77
7.3.2 Perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados
Con el fin de confirmar el crecimiento de los microorganismos en los azúcares glucosa, xilosa,
fructosa, ramnosa, galactosa, arabinosa y sacarosa y la producción de alcohol a partir de ellos,
se realizaron cinéticas de crecimiento y producción de alcohol a las condiciones determinadas
en la (Tabla 14) para las cuatro cepas. Se realizó un diseño factorial 4 x 3 (tabla 8) con los
siguientes factores, el primer factor cepa (LR2, LR4, LR5 y T1) y el segundo factor azúcares
(glucosa, fructosa, sacarosa, xilosa, arabinosa, galactosa, ramnosa), con duplicados para cada
cepa en cada azúcar. Y las variables a analizar fueron crecimiento poblacional, peso seco,
producción de alcohol y eficiencia.
En la figura 25, se observan las cinéticas de crecimiento con base en el peso seco para las
cuatro cepas empleadas en glucosa, fructosa y sacarosa. La fermentación de estos tres azúcares
se realizó por 24 h debido a que son los azúcares que más fácil asimilan los microorganismos.
La cepa LR2 (figura 25a), presenta un crecimiento exponencial durante las 24 h de
fermentación en los tres azúcares utilizados obteniendo el mayor peso seco a partir de la
sacarosa al final de la fermentación.
En la cepa LR4 (figura 25b), se puede observar, un comportamiento similar que la cepa LR2
donde se presenta un crecimiento exponencial en los azúcares glucosa y sacarosa durante toda
la fermentación obteniendo un peso seco mayor que la cepa LR2 a partir de éstos azúcares en
el caso de la fructosa se observa una estabilidad en el crecimiento a las 16 h.
La cepa LR5 (figura 25c), muestra un crecimiento constante en sacarosa, pero es diferente en
los otros dos azúcares ya que en glucosa tiende a estabilizarse a las 8 h y en fructosa a las 6 h,
esto podría deberse que el microorganismo siguió consumiendo los carbohidratos para la
producción de alcohol ya que en esos tiempos todavía había glucosa en los medio formulados.
Para la cepa T1 (figura 25d), se obtiene un crecimiento con base en el peso seco superior que
el de la cepa LR5, se observa un crecimiento exponencial en glucosa y en fructosa el
microorganismo entra en la fase de estabilidad a las 10 h manteniendo constante el peso seco
obtenido.
78
1.2 1.8
1.6
1.0
1.4
0.8 1.2
Peso seco (g/L)
Peso seco (g/L)

1.0
0.6
0.8
0.4 0.6
0.4
0.2
0.2
0.0 0.0
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
1.2
2.0
c) Candida glabrata (LR5) d) Candida glabrta (T1)
1.0
1.5
0.8
Peso seco (g/L)
Peso seco (g/L)
0.6 1.0
0.4
0.5
0.2
0.0 0.0
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
Figura 25. Cinéticas de crecimiento (peso seco) para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1, en diferentes
fuentes de carbono. Glucosa (círculo negro), Sacarosa (círculo rojo) y Fructosa (triángulo invertido verde claro)
En el caso de sacarosa, presenta una estabilidad en el crecimiento a partir de las 6 h y hasta las
14 h que sigue creciendo para lograr un peso seco similar al obtenido en glucosa. En la figura
26, se muestran las cinéticas de crecimiento con base en el peso seco de las cuatro cepas
probadas en arabinosa, galactosa, xilosa y ramnosa. Se obtuvo que la LR4 (figura 26b) crece a
partir de la galactosa y la cepa T1 (figura 26d) de xilosa después de 36 h de fermentación.
La galactosa es un azúcar que puede ser asimilado utilizando la galactosa permeasa (Gal2p) y
posteriormente ser convertida en glucosa-6-fosfato a través de la ruta de Leloir (Leloir, 1951).
Pero Fonseca y col., (2013) comentan que es muy difícil que la galactosa sea asimilada con
una alta velocidad debido a que antes de entrar a la ruta glucolítica es necesaria su
transformación a partir de diferentes reacciones mencionadas por la ruta de Leloir, por lo que
es indispensable ampliar el tiempo de fermentación para poder observar si los
79
microorganismos restantes son capaces de asimilar este azúcar y producir alcohol a partir de la
galactosa.
0.35
0.6
0.30
0.5
0.25
Peso seco (g/L)
0.4
Peso seco (g/L)

0.20
0.3
0.15
0.2
0.10
0.05 0.1
0.00 0.0
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
0.30 3.0
c) Candida glabrata (LR5)
d) Candida glabrata (T1)
0.25 2.5
0.20 2.0
Peso seco (g/L)
Peso seco (g/L)
0.15 1.5
0.10 1.0
0.05 0.5
0.00 0.0
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
Figura 26. Cinéticas de crecimiento (peso seco) para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1, en diferentes
fuentes de carbono. Arabinosa (círculo negro), Galactosa (círculo rojo), Xilosa (triángulo invertido verde claro) y
Ramnosa (triángulo amarillo)
En la figura 27, se observa los resultados obtenidos en la producción de alcohol a partir de

glucosa, sacarosa y fructosa. A partir de la glucosa se obtiene la mayor concentración de
alcohol en todas las cepas utilizadas, en la cepa LR4 (figura 27b) se obtuvo la mayor
concentración de alcohol de 11.02 ± 0.16 g/L. En las cepas LR2 (figura 27a) y LR5 (figura
27c), le siguen en producción de alcohol la fructosa y por último la sacarosa.
80
10 16
14
8

12
10
6
4
6
4
2
2
0 0
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
10 10
8 8
6 6
4 4
2 2
0 0
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
Figura 27. Cinéticas de producción de alcohol para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1, en diferentes
La cepa T1 (figura 27d), muestra que puede producir alcohol a partir de sacarosa similar a lo
obtenido en glucosa, por último asimiló la fructosa. La cepa LR4 no muestra una diferencia
significativa en la producción de alcohol a partir del resto de los azúcares.
En la figura 28, se muestran las cinéticas de producción de alcohol para las cepas utilizadas
en arabinosa, ramnosa, galactosa y xilosa. Se obtuvo que la cepa LR4 (figura 28b) produce
alcohol a partir de galactosa con una fase exponencial de las 36 a las 50 h de fermentación. En
la cepa T1 (figura 28d), se obtuvo una producción de alcohol a partir de xilosa superior a la
producida por la cepa LR4 de galactosa, se observa una fase exponencial de producción de
alcohol a partir de las 48 h.
81
1.0 1.8

1.6
1.4

1.2
1.0
0.5
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0 0.0
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
1.0
5
c) Candida glabrata (LR5)
4
0.5
0.0 0
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
Figura 28. Cinéticas de producción de alcohol para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1, en diferentes
La presencia de las enzimas xilosa reductasa (XR) y xilitol deshidrogenasa (XDH) beneficia la
asimilación de la xilosa y la producción de etanol a partir de ésta fuente de carbono (Van
Maris y col., 2006). En la figura 29, se observa el consumo de la glucosa, sacarosa y fructosas
en todas las cepas utilizadas para obtener el perfil de asimilación. Para la cepa LR2 (figura
29a) se observa una disminución en la concentración de los tres azúcares durante las 24 h de
fermentación donde el azúcar que más se consume es la glucosa con 38.39 ± 0.44 g/L que
representa un porcentaje de consumo del 54.46 ± 0.63 %. Le siguen en consumo la sacarosa
con 39.98 ± 0.05 g/L (52.46 ± 0.07 %) y fructosa con 27.11 ± 0.97 g/L del azúcar consumido
(38.45 ± 1.38 %).
82
80 80
70
70
Consumo de carbohidratos (g/L)

60
60
50
50
40
40
30
30
20
20 10
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
80 80
70 70
60 60
50 50
40 40
30 30
20 20
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
Figura 29. Cinéticas de consumo de carbohidratos para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1, en diferentes
En la cepa LR4 (figura 29b) se observa un consumo mayor de la glucosa con 52.36 ± 0.53 g/L
(74.26 ± 0.75 %) que es superior a lo consumido por la cepa LR2, le sigue en consumo la
sacarosa con 37.39 ± 0.15 g/L (53.03 ± 0.21 %) y la fructosa con 28.64 ± 0.04 g/L (40.62 ±
0.06 %). En las cepas LR5 y T1 se observa un consumo similar en glucosa y sacarosa, en
fructosa se observa que a paritr de las 18 h ya no hay consumo del carbohidrato. La cepa LR5
(figura 29c) tuvo un consumo de 38.18 ± 0.83 g/L (54.15 ± 1.18 %) de glucosa, de sacarosa
39.24 ± 0.24 g/L (55.65 ± 0.34 %) y por último de fructosa con 25.46 ± 0.31 g/L (36.12 ± 0.44
%). La cepa T1 que presentó un consumo similar a la cepa LR5 obtuvo un consumo de
glucosa 41.42 ± 5.59 g/L (58.75 ± 7.93 %), de sacarosa 43.11 ± 0.29 g/L (61.14 ± 0.41 %) y
fructosa 25.43 ± 0.35 g/L (36.07 ± 0.50 %). Los consumos de la cepa T1 (figura 29d) en
glucosa y sacarosa fueron superiores a la cepa LR5 con base en los porcentajes de consumo
obtenidos y muy similares sin una diferencia significativa en fructosa.
83
En la figura 30, se observa el consumo de arabinosa, galactosa, xilosa y ramnosa, para la cepa
LR4 (figura 30b) se observa un consumo de la galactosa de 9.57 ± 0.40 g/L que representa un
porcentaje de consumo del 13.57 ± 0.54 %, de resto de azúcares no se observó un consumo
importante. La cepa T1 (figura 30d) presentó un consumo de xilosa 23.22 ± 0.31 g/L (32.93 ±
0.43 %), del resto de los azúcares no se observó un consumo. Para la cepa LR2 (figura 30a) y
LR5 (figura 30b) no se observa un porcentaje de consumo importante en arabinosa, xilosa,
galactosa y ramnosa.
Los resultados cinéticos promedio de crecimiento y producción de alcohol se encuentran en la

tabla 16 donde se especifican los datos obtenidos a las mejores condiciones de producción de
alcohol de las cepas utilizadas. De acuerdo a los parámetros cinéticos obtenidos se sugiere que
las cuatro cepas probadas (LR2, LR4, LR5 y T1) asimilan principalmente glucosa, fructosa y
sacarosa, y tienen la capacidad de producir alcohol a partir de éstas fuentes de carbono.
En glucosa, la cepa LR4 se destaca debido a que obtuvo el mayor peso seco con 1.27 ± 0.06
g/L, el mayor porcentaje de consumo de azúcares con 74.26 ± 0.75 % (52.36 ± 0.53 g/L) a las
24 h de fermentación y con una producción máxima de alcohol de 11.02 ± 0.16 g/L de etanol
que representa una eficiencia del 41.18 ± 0.00 %. Aunque la cepa T1 tuvo el mayor
crecimiento poblacional, esto no se ve reflejado en la eficiencia de producción de alcohol
(24.51 ± 4.16 %) siendo la más baja. En el caso de la sacarosa, la cepa LR4 obtuvo los valores
más altos de peso seco con 1.28 ± 0.01 g/L y la mayor producción de alcohol con 7.63 ± 0.21
g/L que representa una eficiencia del 40.19 ± 1.39 %.
84
80 72

70

75
68
70
66
64
65
62
60
60
55 58
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
72 75
70 70
68 65
66 60
64 55
62 50
60 45
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
Figura 30. Cinéticas de consumo de carbohidratos para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1, en diferentes
El mayor porcentaje de consumo de azúcar lo obtuvo la cepa T1 con 61.14 ± 0.41 % (43.11 ±
0.29 g/L) a las 24 h, esta asimilación se puede justificar debido a que obtuvo el mayor
crecimiento poblacional, pero este consumo no se refleja en el peso seco ni en la eficiencia de
la fermentación. En la fructosa la cepa LR4 presenta el mayor peso seco con 1.12 ± 0.01 g/L
seguido por la cepa T1 con 1.02 ± 0.02 g/L, el mayor porcentaje de consumo de fructosa lo
tiene la LR4 con 40.62 ± 0.06 % (28.64 ± 0.04 g/L) y también la mayor producción de alcohol
con 7.43 ± 0.15 g/L (eficiencia de 50.98 ± 0.00 %). Como se observa en la tabla 16, solo la
cepa LR4 y T1 lograron asimilar galactosa y xilosa, respectivamente y producir alcohol a
partir de ellas. En ramnosa el consumo fue muy bajo pudo haber sido utilizado solo para
mantenimiento celular ya que no se obtuvo una producción de alcohol y en arabinosa los
microorganismos no lograron fermentar el azúcar.
85
Tabla 16. Resultados cinéticos de crecimiento y de producción para las cepas LR2, LR4, LR5 y T1 en medio
mínimo
Producción de
Pob. Max. (x106 Peso seco Eficiencia
Azúcar Cepa alcohol
cel/mL) (g/L) (%)
(g/L)
LR2 60±5.65 0.57±0.04 5.92±0.05 30.39±1.38
LR4 83±7.07 1.27±0.06 11.02±0.16 41.18±0.00
Glu LR5 58±5.65 0.44±0.01 5.51±0.15 28.43±1.39
T1 136±36.76 1.22±0.04 5.05±0.07 24.51±4.16
LR2 77±14.14 0.62±0.01 5.73±0.11 30.39±1.39
LR4 76±3.94 1.28±0.01 7.63±0.21 40.19±1.39
Sac LR5 86±16.26 0.84±0.01 5.17±0.24 26.47±1.39
T1 159±4.95 1.08±0.01 5.98±0.14 27.45±0.00
LR2 39±3.53 0.49±0.01 5.41±0.30 39.21±0.00
LR4 73±3.53 1.12±0.01 7.43±0.15 50.98±0.00
Fru LR5 29±8.48 0.57±0.00 5.04±0.30 36.27±4.15
T1 78±8.48 1.02±0.02 2.76±0.07 21.56±0.00
LR2 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00
LR4 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00
Ara LR5 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00
T1 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00
LR2 2±0.5 0.02±0.02 0±0.00 0±0.00
LR4 15±2.82 0.47±0.02 1.03±0.03 21.56±0.00
Gal LR5 7±1.01 0.13±0.04 0±0.00 0±0.00
T1 6±1.08 0.11±0.01 0±0.00 0±0.00
LR2 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00
LR4 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00
Xil LR5 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00
T1 58±10.10 2.08±0.61 3.93±0.11 27.86±1.64
LR2 2±2.12 0.01±0.00 0.06±0.02 1.62±0.03
LR4 1±1.41 0.10±0.01 0.03±0.01 0.93±0.03
Ram LR5 0±0.00 0±0.00 0±0.0 0±0.00
T1 13±0.00 0.01±0.01 0.01±0.03 0.34±0.04
Se destaca la cepa LR4 en galactosa debido a que crece en poca proporción 0.47 ± 0.02 g/L en
base al peso seco, pero logra asimilar este carbohidrato mejor del resto de las levaduras.
Obtuvo una producción máxima de alcohol de 1.03 ± 0.03 g/L y se obtiene una eficiencia el
21.56 ± 0.00 %.
La cepa T1 asimiló la xilosa como única fuente de carbono obteniendo un peso seco de 2.08 ±
0.61 g/L con una producción de alcohol de 3.93 ± 0.11 g/L con una eficiencia del 27.86 ± 1.64
%. Las cepas LR4 y T1 son una gran opción para ser utilizadas en cultivos ya que en mezcla
tendrían un perfil de asimilación más amplio, lo que resultaría en un mejor aprovechamiento
de los carbohidratos de los residuos cítricos y aumentaría el rendimiento en la producción. Se
86
ha informado de que algunas levaduras, tales como Pichia stipitis y Candida shehatae son
microorganismos silvestres que fermentan xilosa, y su producción de alcohol (etanol) depende
de sus condiciones de cultivo (Fonseca y col., 2007).
En el caso de la arabinosa no se obtuvieron datos positivos por lo que se podría decir que estos
microorganismos no podrían asimilar dicho azúcar en un medio complejo con diferentes
fuentes de carbono. Resultados similares fueron obtenidos por Rodrussameeet y col., (2011)
quienes observaron la ausencia de producción de etanol en los medios adicionados con
arabinosa de una cepa silvestre Kluvyveromyces marxianus. Fonseca y col., (2007) sugieren
que, para fermentar arabinosa eficientemente existe una necesidad de superar un desequilibrio
en los cofactores de la vía de asimilación, esto está probablemente relacionado con la
dificultad de encontrar microorganismos silvestres que fermenten arabinosa, si se considera
que este carbohidrato se produce en baja concentraciones en ambientes naturales.
Los análisis de varianza realizados se resumen con los gráficos de Pareto y de interacción para
las variables de respuesta de peso seco y producción de alcohol. En la figura 31, se observa
con base en las gráficas de Pareto (figura 31a) que el tipo de azúcar tiene un efecto
significativo en la respuesta de peso seco. Con base en el gráfico de interacción (figura 31b),
se puede observar que el mejor crecimiento lo obtienen las cepas LR4 y T1, la cepa LR4
asimila principalmente glucosa y sacarosa sin diferencia significativa seguido por fructosa,
cabe destacar que la cepa LR4 es la única cepa que asimila la galactosa. En la cepa T1 se
observa que principalmente consume glucosa seguido de sacarosa y fructosa, una de las
ventajas que tiene esta cepa es que asimila xilosa, debido que es una pentosa y solo ciertos
microorganismos pueden asimilarla para la producción de alcohol, hace a la cepa T1
interesante para su uso sobre residuos lignocelulósicos ya que uno de los principales derivados
de la hemicelulosa es éste azúcar (Ingram y col., 1999).
87
a) Gráfica de Pareto para Peso seco (g/L)

b) Gráfica de interacción
1.5 Azúcar
Arabinosa
+
Fructosa
-
B:Azúcar 1.2 Galactosa
Glucosa
P eso seco (g/L)

Ramnosa
0.9 Sacarosa
Xilosa
A:Cepas
0.6
AB 0.3
0 2 4 6 8 10
0
Efectos estandarizados LR2 LR4 LR5.1 T1
Cepa
Figura 31. a) Gráfica de Pareto y de b) interacción para la respuesta de peso seco en base al diseño 4x7
En la figura 32, se observa con base en las gráficas de Pareto (figura 32a) que el tipo de
azúcar tiene un efecto significativo en la respuesta de producción de alcohol. Con la gráfica de
interacción (figura 32b) se observa que la mayor producción de alcohol se obtiene de la cepa
LR4 al asimilar glucosa como única fuente de carbono, le sigue la cepa LR2 en la producción
de alcohol a partir de glucosa, sacarosa y fructosa, sin diferencia significativa entre sí. La cepa
T1 produce principalmente alcohol a partir de sacarosa, seguido por glucosa y en menor
cantidad a partir de la fructosa.
a) Gráfica de Pareto para la Producción de alcohol (g/L) b) Gráfica de interacción

14 Azúcar
Arabinosa
+ Fructosa
P ro d u c c ió n d e a lc o h o l (g /L )
- 11 Galactosa
B:Azúcar
Glucosa
Ramnosa
8 Sacarosa
Xilosa
AB
5
A:Cepas 2
-1
0 2 4 6 8 10 12 LR2 LR4 LR5.1 T1
Cepa
Figura 32. a) Gráfica de Pareto y de b) interacción para la respuesta de producción de alcohol en base al diseño 4
x7
En la figura 33, se observa que el mayor peso seco se obtiene de las cepas LR4 y T1
principalemente a partir de glucosa, sacarosa y fructosa a las condiciones establecidas para la
producción de alcohol, la cepa LR4 se destaca en el consumo de la galactosa sobre el resto de
las cepas que logran asimililarlo pero no se ve reflejado en un crecimiento significado y menos
88
en la producción de alcohol. La cepa T1, es la cepa que asimila xilosa despues de 56 h de

fermentación de éste azúcar se obtiene el mayor peso seco de alrededor 2 g/L.
2.5
2
Peso seco (g/L)
1.5 LR2
LR4
LR5.1
1
T1
0.5
0
Glucosa Sacarosa Fructosa Galactosa Xilosa Ramnosa Arabinosa
Figura 33. Perfil de asimilación de diferentes fuentes de carbono en base al peso seco
En la figura 34, se observa que la mayor producción de alcohol se da a partir de la glucosa,

sacarosa y fructosa, donde, en estos azúcares la cepa LR4 tiene la capacidad de producir una
mayor cantidad de alcohol a las condiciones establecidas como más adecuadas para su
fermentación seguida de la cepa LR2 en glucosa, T1 en sacarosa y sin una diferencia
significativa las cepas LR2 y LR5 en fructosa.
Se destacan los resultados en galactosa donde la cepa LR4 fue la única capaz de producir
alcohol a partir de este azúcar y de la cepa T1 donde produce el metabolito utilizando a la
xilosa como única fuente de carbono. En arabinosa y ramnosa los microorganismos no
lograron crecer y producir alcohol a partir de estos azúcares, por lo que en un medio complejo
si existiera arabinosa y ramnosa estos microrganismos no tendrían la capacidad de producir
alcohol a partir de esta fuente de carbono, según los resultados que se obtuvieron. Las cepas
LR4 y T1, podrían ser utilizadas en cultivos mixtos ya que producen alcohol de forma
mayoritaria en glucosa, fructosa y sacarosa, y producen a partir de galactosa y xilosa,
89
respectivamente. Wilkins y col., (2005) y Widmer y col., (2010) reportan que los azúcares
presentes después de una hidrolisis enzimática en los residuos cítricos son: glucosa (29.58 %),
Fructosa (17.40 %), galactosa (5.55 %), arabinosa (4.06 %), xilosa (1.16 %), ramnosa (1.16
%) y sacarosa (1.09 %) que representan el 60% en materia seca de éstos residuos, la propuesta
actual es mejorar la eficiencia de producción de alcohol a partir de estos azúcares.
12
10
8
LR2
6 LR4
LR5.1
4 T1
0
Glucosa Sacarosa Fructosa Galactosa Xilosa Ramnosa Arabinosa
Figura 34. Perfil de asimilación de diferentes fuentes de carbono en base a la producción de alcohol
7.3.3 Modificación del esquema de propagación
Con la finalidad de disminuir el estrés de las células al ser crecidas en tubos con medio
mínimo para inocular en matraz y realizar la cinética de crecimiento y producción de alcohol
con el mismo medio, se realizó una modificación en el proceso de propagación celular.
Primero se inoculó en tubos con medio de YPD con la finalidad de activar y aumentar la
viabilidad celular, luego se inoculó la crema obtenida despues de las 24 h de crecimiento en un
matraz que contenia 250 mL de medio mínimo y se relizó la cinética aumentando el tiempo de
muestreo hasta las 32 h, esperando a que el microorganismo consumiera mejor el azúcar y
aumentara la producción de alcohol.
90
En la figura 35, se observan las curvas de crecimiento con base en el peso seco donde para la
cepa LR2 (figura 35a) se observa que la modificación en el esquema la benefició en el
crecimiento obteniendo un peso seco de 0.91 ± 0.02 g/L en comparación con el crecimiento
establecido que fue de 0.79 ± 0.01 g/L.
1.0 1.8
a) Candida Glabrata (LR2) b) Candida tropicalis (LR4)
1.6
0.8
1.4
1.2
Peso seco (g/L)
Peso seco (g/L)

0.6
1.0
0.8
0.4
0.6
0.4
0.2
0.2
0.0 0.0
0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30 35
3.0
1.2 c) Candida glabrata (LR5)
2.5
1.0
2.0
Peso seco (g/L)
Peso seco (g/L)
0.8
1.5
0.6
1.0
0.4
0.5
0.2
0.0 0.0
0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30 35
Figura 35. Cinéticas de crecimiento (Peso seco) en la modificación del esquema de propagación para la cepa a)
LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1. Glucosa (círculo rojo), Glucosa con pase en YPD (círculo naranja), Galactosa
(triángulo invertido verde claro) y Galactosa con pase en YPD (triángulo verde oscuro).
En la cepa LR4 (figura 35b), se observa un crecimiento mucho más rápido cuando se usa el
esquema normal aunque al final se obtienen pesos secos similares, en este caso se obtuvo un
peso seco final en el esquema normal de 1.59 ± 0.54 /L y en el esquema de propagación
modificado de 1.51 ± 0.05 g/L por lo que no existe una diferencia significativa en el
crecimiento de la cepa LR4.
91
En la cepa LR5 (figura 35c) y T1 (figura 35d) se observa que el esquema de propagación
modificado benefició en el crecimiento obteniendo para la cepa LR5 un peso seco de 1.10 ±
0.02 g/L y para la cepa T1 2.04 ± 0.05 g/L.
En ambas cepas se obtuvo un peso seco menor en el esquema de propagación normal donde
para la cepa LR5 se obtuvo 0.75 ± 0.03 y para la cepa T1 1.41 ± 0.01 g/L. Se obtuvo una
diferencia significativa en los esquemas de propagación para estás dos cepas. La cepa T1
presentó el mayor creciminto con base en el peso seco de las cuatro cepas analizadas. En
galactosa no se presentó una diferencía en el crecimiento ya que ningun microorganismo
presento un aumento en su población significativamente.
En la Figura 36, se presentan las cinéticas de producción de alcohol, en donde la modificación

del esquema de propagación ayudó a la obtención de una mayor concentración del metabolito
en las cuatro cepas analizadas.
Donde la máxima producción de alcohol se obtuvo en la cepa LR4 (figura 36b) con 13.99 ±
0.41 g/L seguido por la cepa LR2 (figura 36a) 11.96 ± 0.44, en la cepa LR5 (figura 36c) se
obtuvo 9.34 ± 0.26 g/L y para la cepa T1 (figura 36d) 7.54 ± 0.17 g/L. La baja producción de
la cepa T1 pudo ser debido a que la mayor cantidad de glucosa consumida fue utilizada por el
microorganismo para su crecimiento. Debido a que en galactosa no se presentó un crecimiento
significativo de todas las cepas probadas no se detectó alcohol ya que es un metabolito
primario asociado al crecimiento.
En la figura 37, se observan las cinéticas de consumo de los carbohidratos glucosa y galactosa
en los dos esquemas de propagación de las cuatro cepas probadas, se observó que el consumo
de la glucosa en el esquema de propagación normal se da con mayor velocidad que con el
esquema modificado con YPD, aunque al final de la cinética de fermentación se obtuvieron
similares consumos.
92
14
a) Candida glabrata (LR2) 14
b) Candida tropicalis (LR4)
12
12
P roducción de alcohol (g/L)

10
10
8
8
6
6
4 4
2 2
0 0
0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30 35
12 10
10
8
P roducción de alcohol (g/L)
8
6
4
4
2
2
0 0
0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30 35
Figura 36. Cinéticas de producción de alcohol en la modificación del esquema de propagación para la cepa a)
LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1. Glucosa (círculo rojo), Glucosa con pase en YPD (círculo naranja), Galactosa
Para la cepa LR2 (figura 37a) se obtuvo un consumo de glucosa de 38.39 ± 0.44 (54.46 ± 0.63
%) y 42.57 ± 0.08 g/L (60.38 ± 0.13 %), para la cepa LR4 (figura 37b) se obtuvo un consumo
de 52.36 ±0.53 g/L (74.26 ± 0.75 %) y 51.92 ± 0.26 (73.64 ± 0.38 %), para la cepa LR5
(figura 37c) se obtuvo un consumo de 38.18 ± 0.83 g/L (54.10 ± 1.18 %) y 41.82 ± 0.08
(59.32 ± 0.13 %) y por último la cepa T1 (figura 37d) obtuvo un consumo de 41.42 ± 5.59
g/L (58.74 ± 7.93 %) y 38.99 ± 0.31 g/L (55.30 ± 0.44 %), primero para el esquema normal y
segundo para el esquema modificado, respectivamente. Se obtuvo un consumo del 50 al 70 %
por lo que ampliando el tiempo de fermentación se esperaría una disminución en la
93
concentración de glucosa. No se presentó un consumo significativo de galactosa para todas las

cepas probadas.
80
a) Candida glabrta (LR2) 80 b) Candida tropicalis (LR4)
C onsum o de carbohidratos (g/L)

70
70
60 60
50
50
40
40
30
30
20
20 10
0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30 35
80
80
c) Candida glabrata (LR5) d) Candida glabrata (g/L)
70
C onsum o de carbohidratos (gL)
70
60
60
50 50
40 40
30 30
20 20
0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30
Figura 37. Cinéticas de consumo de carbohidratos en la modificación del esquema de propagación para la cepa
a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1. Glucosa (círculo rojo), Glucosa con pase en YPD (círculo naranja), Galactosa
Los resultados cinéticos promedio de crecimiento y producción de alcohol se encuentran en la

tabla 17 donde se especifican los datos obtenidos a las mejores condiciones de producción de
alcohol (tabla 14) de las cuatro cepas utilizadas. De acuerdo a los parámetros cinéticos
obtenidos las cuatro cepas probadas (LR2, LR4, LR5 y T1) mejoraron la asimilación de la
glucosa con base en el peso seco y la producción de alcohol al cambiar el esquema de
propagación para utilizar una activación en medio YPD, manteniéndose con resultados
similares para la galactosa. Esto sugiere que con una buena formulación del medio de cultivo
94
se podría aumentar el consumo de los azúcares y por consiguiente la cantidad de alcohol

producido para los azúcares que estos microrganismos son capaces de asimilar. Se está
trabajando para corroborar la baja asimilación del resto de los azúcares modificando el
esquema de propagación.
Tabla 17. Resultados cinéticos obtenidos en la comparación de los esquemas de propagación
Alcohol
Pob. Max. (x106 Peso seco Eficiencia
Cepa Carbohidrato producido
cel/mL) (g/L) (%)
(g/L)
Glu 60±5.65 0.57±0.04 5.92±0.05 30.39±1.38
Glu-YPD 53±12.02 0.69±0.024 11.96±0.44 54.90±2.14
LR2
Gal 2±0.5 0.02±0.02 0±0.00 0±0.00
Gal-YPD 3±2.24 0.02±0.01 0.07±0.06 2.94±1.93
Glu 83±7.07 1.27±0.06 11.02±0.16 41.18±0.00
Glu-YPD 40±4.95 1.32±0.02 13.99±0.41 52.94±1.38
LR4
Gal 15±2.82 0.47±0.02 1.03±0.03 21.56±0.00
Gal-YPD 10±2.12 0.29±0.02 0.24±0.01 6.86±0.01
Glu 58±5.65 0.44±0.01 5.51±0.15 28.43±1.39
Glu-YPD 77±14.84 0.96±0.02 9.34±0.26 44.12±1.18
LR5
Gal 7±1.01 0.13±0.04 0±0.00 0±0.00
Gal-YPD 11±0.71 0.16±0.04 0.04±0.01 1.96±0.00
Glu 136±36.76 1.22±0.04 5.05±0.07 24.51±4.16
Glu-YPD 205±40.31 1.96±0.10 7.54±0.17 38.23±0.66
T1
Gal 6±1.08 0.11±0.01 0±0.00 0±0.00
Gal-YPD 2±0.70 0.09±0.04 0±0.00 0±0.00
Con base en los resultados cinéticos de crecimiento, se muestra que la mayor población y peso
seco se obtiene en la cepa T1 cuando fue crecida en glucosa con un el esquema de
propagación en YPD, tuvo una población de 205 ± 40.31 x106 cel/mL y un peso seco de 1.96
± 0.10 g/L, la baja producción de alcohol para esta cepa pudo ser debido a que la mayor
cantidad de glucosa fue para el crecimiento del microorganismo. Con base en los parámetros
cinéticos de producción, a partir de la cepa LR4 se obtuvo la mayor producción de alcohol
cuando fue crecida en glucosa con el esquema modificado obtuvo una concentración de
13.99±0.41 g/L. La mejor eficiencia se obtuvo en los resultados obtenidos de la cepa LR2 en
el mismo esquema modificado con 54.90 ± 2.14 %.
95
a) b)
Figura 38. Gráfica de medias para a) peso seco y b) producción de alcohol en glucosa comparando el esquema de
propagación
El análisis de varianza realizado para estos azúcares demostró una diferencia estadisticamente
significativa (p<0.05) entre las cepas probadas en las respuestas de crecimiento poblacional,
peso seco, producción de alcohol y eficiencia. En la figura 38 se muestra la gráfica de medias
para la respuestas de peso seco (figura 38a) y producción de alcohol (figura 38b) en glucosa
donde se observa claramente que el crecimiento de la cepa T1 en el esquema modificado tiene
una diferencia significativa en comparación al resto de las cepas, todas las cepas presentaron
un mejor crecimiento con base en el peso seco con éste sistema de propagación. También se
observó con el gráfico de medias para la producción de alcohol que el esquema de
propagación modificado sería el adecuado para el consumo de glucosa y aumentar la
a) b)
Figura 39. Gráfica de medias para a) peso seco y b) producción de alcohol en galactosa comparando el esquema
de propagación
96
En la figura 39, se muestra la gráfica de medias para la respuestas de peso seco (figura 39a) y
producción de alcohol (figura 39b) en galactosa donde se observa claramente que el
crecimiento y la mejor producción de alcohol se obtuvo en la cepa LR4 en el esquema normal
de propagación, por lo que el esquema modificado podría no beneficiar el consumo de los
azúcares que se asimilaron en baja proporción con base al diseño factorial anterior planteado
(tabla 8).
7.4 Evaluación de la capacidad fermentativa de cultivos individuales y mixtos en mezclas

de azúcares
7.4.1 Comparación de dos medios de fermentación
Para conocer si el medio sintético propuesto en la tabla 5 es el más adecuado para realizar las
cinéticas en cultivo mixto, se comparó con un medio con base en nitrógeno (Atlas R., 2010)
(tabla 6) donde la única fuente de carbono en ambos fue glucosa (70 g/L).
En la figura 40, se puede observar las cinéticas de fermentación de la cepa LR4 y T1 en

medio mínimo de sales y en medio mínimo con base en base nitrógeno. Se obtuvo un
crecimiento constante de la cepa LR4 en el medio mínimo de sales durante toda la
fermentación, se obtuvo un peso seco (figura 40a) de 1.37 ± 0.22 g/L con una µ max 0.16 ± 0.05
(h-1) y no se observa la fase estacionaria de crecimiento, la concentración máxima obtenida de
etanol (figura 40b) fue de 13.70 ± 0.29 g/L y el porcentaje de consumo (figura 40c) de la
glucosa fue de un 52.47 ± 10.75 % (40.26 ± 7.58 g/L) a las 32 h. En el medio mínimo base
nitrógeno, se observa un crecimiento constante de la cepa LR4 durante toda la fermentación,
se obtuvo un peso seco de 1.33 ± 0.04 g/L con un µ max 0.24 ± 0.01 (h-1), la concentración
máxima obtenida de etanol fue de 14.90 ± 0.30 g/L y el consumo de la glucosa fue de un 47.16
± 1.06 % (33.19 ± 0.75 g/L) a las 32 h.
97
4.0 18
a) 16 b)
3.5
14

3.0
12
Peso seco (g/L)
2.5
10
2.0
8
1.5
6
1.0
4
0.5 2
0.0 0
0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30 35
80
c)
70
60
50
40
30
20
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
Figura 40. Gráficas de a) crecimiento (Peso seco), b) producción de alcohol y c) consumo de carbohidratos en la
comparación de dos medios de fermentación. LR4-Medio 2 (círculo rojo), LR4-Medio 3 (círculo naranja), T1-
Medio 2 (triángulo invertido verde claro) y T1-Medio 3 (triángulo verde oscuro)
En el medio mínimo de sales la cepa T1 tiene un crecimiento constante a partir de las 6 h

donde al final de la fermentación se tiene un peso seco máximo de 2.37 ± 0.18 g/L con una
µ max 0.30 ± 0.13 (h-1), una concentración máxima de alcohol de 7.97 ± 0.03 g/L y donde el
consumo de glucosa fue de un 66.95 ± 3.75 % (34.28 ± 2.64 g/L) a las 32 h. En el medio
mínimo base nitrógeno, se tiene de nuevo un crecimiento constante de la cepa T1 a partir de
las 6 h donde al final de la fermentación se tiene un peso seco máximo de 3.04 ± 0.04 g/L con
una µ max 0.28 ± 0.01 (h-1), una concentración máxima de alcohol de 16.11 ± 0.26 g/ y donde el
consumo de glucosa fue de un 57.73 ± 2.88 % (44.75 ± 2.02 g/L) a las 32 h.
98
Los parámetros cinéticos promedio de la cinética de fermentación en el medio mínimo de sales

(medio 2) y en el medio mínimo con base nitrógeno (medio 3) se presentan a continuación. En
la tabla 18, se observa que la cepa T1 tiene los mejores promedios de crecimiento en el medio
2 donde a las 32 h ya tiene un peso seco de 2.37 ± 0.18 g/L con un tiempo de duplicación
(2.54 ± 1.10 h) mucho más bajo que el de la cepa LR4. Con respecto a los parámetros cinéticos
de producción de alcohol la cepa LR4 obtiene la mayor concentración de alcohol con 13.70 ±
0.29 g/L a las 32 h esto representa una eficiencia del 68.62 ± 11.09 % y una productividad
máxima de 0.43 ± 0.01 g/Lh. En ambos casos se observa que el azúcar no fue consumida en su
totalidad.
Tabla 18. Parámetros cinéticos en la comparación de dos medios de fermentación
Pob.
Peso Producción Azúcar
T Agi Max. µ max Pmax
Cepa seco Td (h) de Alcohol Yp/s cons
(oC) (rpm) (x106 (h-1) (g/Lh)
(g/L) (g/L) (g/L)
cel/mL)
LR4* 63±26.87 1.37±0.22 0.16±0.05 4.59±1.39 13.70±0.29 0.35±0.04 0.43±0.01 39.71±4.40
35 0
LR4** 54±46.69 1.33±0.04 0.24±0.01 2.98±0.17 14.90±0.30 0.45±0.01 0.47±0.00 32.92±1.13
T1* 288±49.50 2.37±0.18 0.30±0.13 2.54±1.10 7.97±0.03 0.23±0.01 0.25±0.01 35.30±1.87
35 200
T1** 322±60.10 3.04±0.04 0.28±0.01 2.45±0.13 16.11±0.26 0.34±0.01 0.51±0.01 47.75±0.01
* Medio 2, ** Medio 3 a las mejores conciones de producción de alcohol.
Con base al medio 3, se tiene que la cepa T1 tiene los mejores promedios para crecimiento
donde a las 32 h ya que alcanza un peso seco de 3.04 ± 0.04 g/L con un tiempo de duplicación
(2.45 ± 0.13h) más bajo que la cepa LR4. Con respecto a los parámetros cinéticos de
producción de alcohol la cepa T1 obtiene la mayor concentración de alcohol con 16.11 ± 0.26
g/L a las 32 h esto representa una eficiencia del 66.66 ± 2.77 % y una productividad máxima
de 0.51 ± 0.01 g/Lh. Aunque la cepa LR4 tuvo una producción más baja de alcohol tiene una
eficiencia mayor con 88.23 ± 2.77 %.
Se realizó un análisis de varianza para determinar si existe una diferencia significativa entre
los medios, a partir del crecimiento y la producción de alcohol, los factores principales cepa y
medios, así como la interacción de éstos tuvieron un efecto significativo sobre la variable de
respuesta. En la figura 41, se observa que en la gráfica de interacción para peso seco (figura
99
41a) existe una diferencia significativa en los medios utilizados, donde el medio mínimo con
base en nitrógeno (medio 3) y la cepa T1 presentan los mejores resultados de crecimiento.
a) Gráfica de interacción b) Gráfica de interacción

3.1 MEDIOS 17.9 CEPAS
2 LR4
3 T1
P r o d u c c ió n d e a lc o h o l (g /L )
2.8
15.9
P e s o s e c o (g /L )
2.5
13.9
2.2
11.9
1.9
9.9
1.6
1.3 7.9
LR4 T1 2 3
CEPAS MEDIOS
Figura 41. Gráfica de medias para a) peso seco y b) producción de alcohol en glucosa comparando el esquema de
propagación
También, en el medio mínimo con base nitrógeno (medio 3) se obtienen los mejores resultados
en la producción de alcohol con una diferencia significativa entre los medios. La mayor
concentración de alcohol se tiene en la cepa T1 (figura 41b) con una diferencia significativa
entre cepas. Esto podría deberse a que el medio contiene elementos traza como son el calcio,
molibdeno, manganeso, cobre, zinc, entre otros, que no se contemplaron en el primer medio
(medio 2). Estos elementos son importantes ya que tienen diversas funciones en la vía de
producción de alcohol, como por ejemplo, el calcio aumenta la velocidad de crecimiento
(Yx/s), brinda protección y estructura a la membrana plasmática y mantiene la permeabilidad
membranal ante adversidades; el manganeso cofactor de la enzima enolasa, que incrementa el
contenido de nitrógeno en la célula, mejora la síntesis de proteínas, ayuda a una mayor
producción de tiamina (transforma carbohidratos en energía) y aumenta Yx/s; el zinc cofactor
de la enzima alcohol deshidrogenasa importante para la obtención del metabolito (Jones, et al.
1984)
7.4.2 Fermentación con cultivos individuales
Para evaluar la capacidad de asimilación de las cepas LR2, LR4, LR5 y T1 en una mezcla de
azúcares, las cepas fueron crecidas individualmente en un medio que contiene glucosa,
sacarosa, fructosa, galactosa, xilosa y arabinosa en una concentración de 100 g/L a las
100
proporciones reportadas en la literatura (Wilkins y col., 2005 y Boluda-Aguilar y col., 2013)

de residuos cítricos, las fermentaciones se llevaron a cabo durante 10.5 días a las mejores
condiciones para la producción de alcohol ya antes mencionadas (tabla 14). En la figura 42,
se observan las curvas de crecimiento para las cuatro cepas probadas, la cepa T1 tiene un
crecimiento exponencial hasta los 2.5 días y se estabiliza durante todo el tiempo de
fermentación para la producción en esta se obtuvo el mejor crecimiento en la mezcla de
azúcares, ya que los primeros días podría estar desviando su metabolismo hacia el
crecimiento. Le sigue en crecimiento la cepa LR4, el microorganismos presenta un
crecimiento exponencial hasta alrededor de los 3 días de fermentación manteniéndose con el
mismo peso seco en el transcurso del tiempo, el crecimiento de la cepa LR4 fue casi la mitad
que el de la cepa T1. En las cepas LR2 y LR5 se tiene un bajo crecimiento siendo la que
obtuvo los resultados más bajos de crecimiento la primera, este resultado se puede contrastar
con el obtenido en el medio YPD ya que la cepa LR2 obtenía uno de los mejores resultados en
crecimiento, el medio mínimo de sales base nitrógeno con mezcla de azúcares no beneficia el
crecimiento de la cepa LR2.
3.0
2.5
2.0
Peso seco (g/L)
1.5
1.0
0.5
0.0
0 2 4 6 8 10
Tiempo (días)
Figura 42. Cinéticas de crecimiento en mezcla de azúcares en cultivos individuales. LR2 (círculo rojo), LR4
(círculo naranja), LR5 (triángulo invertido verde claro) y T1 (triángulo verde oscuro)
En los parámetros cinéticos de crecimiento (tabla 19) obtenidos de las cepas probadas en base
a la mayor producción de alcohol, se observa que la cepa T1 tiene la mayor población con
240 ± 1.41 x106 cel/mL y el mejor peso seco con 2.07 ± 0.07 g/L a los 8 días de fermentación.
Los valores de µmax (h-1) y Td (h) obtenidos por las cuatro cepas muy por debajo o por arriba,
101
respectivamente a los reportados para la cepa K. marxianus en mezcla de azúcares donde en

glucosa/fructosa una µmax (h-1) de 0.42 con un tiempo de duplicación de 1.65 h en medio
mínimo.
Tabla 19. Parámetros cinéticos de crecimiento en mezcla de azúcares en cultivos individuales
Pob. Max. (x106

CEPA Peso seco (g/L) µmax (h-1) Td (h) Tiempo (d)
cel/mL)
LR2 48±3.53 0.44±0.02 0.11±0.01 7.03±1.28 8
LR4 81±7.78 1.33±0.08 0.13±0.01 5.25±0.57 9
LR5 47±3.53 0.59±0.02 0.22±0.09 3.18±1.30 7
T1 240±1.41 2.07±0.07 0.28±0.14 2.85±1.49 8
En la figura 43, se observa el porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y la producción

de alcohol. En la cepa LR2 (figura 43a) se observa que al primer día se asimilan todos los
azúcares, al 1.5 días la fructosa es el azúcar que más se ha consumido con alrededor del 58 %
en este tiempo se da una estabilidad del azúcar y de la producción de alcohol, la estabilidad en
la producción de alcohol se observa hasta el cuarto día en éste tiempo la xilosa, la galactosa y
arabinosa siguen consumiéndose por lo que podrían ser utilizado por el microorganismo para
su mantenimiento. Se obtuvo un consumo total de azúcares del 71.09 ± 0.01 %. Al octavo día
que se obtuvo la mayor producción de alcohol los azúcares que más se habían consumido son
la xilosa (89.24 ± 0.01 %), fructosa (82.76 ± 0.01 %) y sacarosa (78.32 ± 0.01 %), la glucosa
se asimila en menor proporción que éstos azúcares (65.37 ± 0.01 %). En la cepa LR4 (figura
43b), la glucosa es el azúcar que se asimila principalmente durante los primeros días de
fermentación, a los 3 días se observa un consumo del 82 % y se estabiliza el resto del tiempo
al final de la fermentación la glucosa se asimila alrededor del 99 %. Con respecto a las
pentosas, la xilosa es consumida principalmente donde a los 5.25 días se observa un consumo
del 78 % y tiende a estabilizarse el resto de la fermentación, en el caso de la arabinosa tiene un
consumo lento, similar a la sacarosa, alcanzando un consumo por arriba del 60 %. La cepa
LR4 tuvo un consumo total de azúcares del 90.67 ± 0.17 %. La mayor producción de alcohol
se obtuvo a los 9 días y los principales azúcares consumidos son la glucosa (99.10 ± 0.11 %),
fructosa (89.53 ± 0.37 %), xilosa (88.56 ± 0.01 %) y galactosa (78.15 ± 0.18 %).
102
100
a) 100 b)
40
30
80
80
Porcentaje de consumo
30
Etanol (g/L)
Etanol (g/L)
60
20 60
20
40 40
10
10
20 20
0 0 0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tiempo (días) Tiempo (días)
100
100
c) d)
30 30
80
80
Etanol (g/L)
Etanol (g/L)
60 20 60
20
40 40
10 10
20 20
0 0 0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 43. Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para la cepa a) LR2 y b) LR4,
c) LR5 y d) T1. Sacarosa (círculo rojo), Glucosa (círculo naranja), Xilosa (triángulo inerso verde claro),
Galactosa (triángulo verde oscuro), Arabinosa (cuadrado azul turquesa), Fructosa (cuadrado azul marino) y
Etanol (cuadrado con cruz)
En la cepa LR5 (figura 43c), se destaca el consumo de la fructosa alcanzando el consumo

superior al 95 % a los 8 días de fermentación, le siguió en importancia de consumo la glucosa
donde se observa un consumo constante durante los 10.5 días. Se obtuvo un consumo total de
azúcares del 71.04 ± 0.43 %, similar a lo obtenido en la cepa LR2. La mayor producción de
alcohol se obtuvo a los 7 días donde los principales azúcares consumidos son la fructosa
(97.61 ± 0.01 %), glucosa (70.73 ± 1.05 %) y xilosa (68.90 ± 0.33 %). Se observa que la
sacarosa tarda alrededor de 1.5 días para empezar a consumirse aunque al final de la
fermentación se obtuvo un consumo similar al de la glucosa. Por último, en la cepa T1 (figura
43d) se observa un consumo mayoritario de la glucosa con respecto al resto de los azúcares,
seguido por la fructosa que alcanza un consumo de alrededor del 70 % y tiende a estabilizarse
su consumo, también para la xilosa se observa una estabilidad pero obtiene un consumo
máximo a los 5 días de alrededor del 86 %, ambos azúcares se siguen consumiendo pero en
103
poca proporción. La galactosa tardo casi 1.5 días en ser consumido y la arabinosa (68.59 ±
0.01 %) fue el azúcar que menos se consumió similar a lo observado en las otras cepas. Se
obtuvo un consumo total de azúcares del 84.89 ± 0.07 %, por debajo de la cepa LR4. Aunque
no se consumió la totalidad los azúcares en las cuatro cepas usadas se destacan la cepa LR4 y
T1 obteniendo los mayores consumos, esto beneficiaría en el aprovechamiento de la mayor
cantidad de azúcares fermentables presentes en residuos cítricos.
En la figura 20, se observa el consumo total y la velocidad de consumo de azúcar en los

medios individuales para cada cepa.
Tabla 20. Consumo total de azúcar y velocidades en el consumo de sustrato en el medio con mezcla de azúcar de
las cepas LR2, LR4, LR5 y T1, de forma individual
Candida glabrata Candida tropicalis Candida glabrata Candida glabrata
CAM* (LR2) (LR4) (LR5) (T1)
Azúcar*
(%) CS** µs*** CS** µs*** CS** µs*** CS** µs***
(%) (g/Lh) (%) (g/Lh) (%) (g/Lh) (%) (g/Lh)
GLU 51 65.97±1.86 0.039±0.003 99.57±0.03 0.026±0.002 83.78±0.72 0.016±0.001 98.75±0.03 0.030±0.003
FRU 30 88.96±0.27 0.042±0.007 90.53±0.01 0.038±0.004 100±0.02 0.025±0.001 85.28±0.02 0.025±0.002
GAL 8 77.66±0.62 0.023±0.002 77.57±0.04 0.022±0.002 58.58±0.11 0.012±0.002 83.24±0.03 0.027±0.003
SAC 2 93.27±0.03 0.016±0.002 81.96±0.08 0.014±0.002 80.45±0.03 0.012±0.001 87.71±0.04 0.020±0.001
ARA 7 63.09±0.29 0.017±0.003 71.92±0.02 0.022±0.001 57.98±0.08 0.015±0.001 76.81±0.01 0.013±0.001
XIL 2 87.10±0.14 0.024±0.005 91.70±0.01 0.021±0.001 80.65±0.09 0.020±0.001 94.61±0.05 00.021±0.002
*GLU: glucosa, SAC: sacarosa, FRU: fructosa, GAL: galactosa, XIL: xilosa, ARA: arabinosa, CAM:
concentración de azúcar en los medios.
**CS: el consumo de sustrato en 10.5 días de fermentación
***µ s: Velocidad del consumo de sustrato total determinados por los ajustes al modelo de Gompertz (R2> 0.95).
En glucosa, se destaca la cepa LR4 con un consumo total de 99.57 ± 0.03 %, seguido por la
cepa T1 con un consumo de 98.75 ± 0.03 %. En fructosa, la cepa LR5 se destaca con un
consumo total de 100 ± 0.02 % y la cepa LR4 tiene un consumo máximo de 90.53 ± 0.01 %.
Éstos dos azúcares son importantes que se consuman adecuadamente ya que son los
mayoritarios en los hidrolizados cítricos (Wilkins y col., 2005 y Boluda-Aguilar y col., 2013).
En la cepa LR2, el azúcar que se consume más rápido es la fructosa con 0.042 ± 0.007 g/L,
como se puede observar en las gráficas de consumo (figura 43a) donde el azúcar es el
principal consumido. En la cepa LR4, la fructosa es también el azúcar que se consume más
rápido con una velocidad de consumo de 0.038 ± 0.004 g/L, sin una diferencia significativa
con el consumo de la fructosa por la cepa LR2. La cepa T1, asimila la glucosa con una
velocidad de consumo de 0.030 ± 0.003 g/L. Fonseca y col., (2013) reporta la existencia de
104
represión catabólica por glucosa, para el consumo de galactosa, pero no presenta este efecto
entre glucosa/fructosa y fructosa/galactosa en una cepa silvestre de K. marxianus , la represión
se observa en la cepa T1 ya que hasta que la glucosa se consumió alrededor del 40 % es
cuando la galactosa empieza a asimilarse. La fructosa es asimilada con mucha facilidad y a
gran velocidad según lo reportado en la tabla 20. Las cepas LR4 y T1 presentan el mayor
porcentaje de consumo en xilosa y arabinosa, por lo que las hace interesantes para la
asimilación de pentosas en los hidrolizados lignocelulósicos. En la tabla 21, se observan los
parámetros cinéticos de producción de alcohol en la mezcla de azúcares de los cultivos
individuales utilizados.
Tabla 21. Parámetros cinéticos de producción de alcohol en mezcla de azúcares en cultivos individuales
T Agi Prod alcohol µp*

o Cepa Yp/s Pmax (g/Ld) T (d)
( C) (rpm) (g/L) (g/Lh)
45 0 LR2 21.24±1.05 0.32±0.02 2.66±0.13 0.030±0.006 8
35 0 LR4 35.31±4.78 0.42±0.07 3.92±0.53 0.013±0.002 9
40 0 LR5 22.56±0.59 0.33±0.01 3.22±0.08 0.021±0.004 7
35 200 T1 23.08±3.09 0.27±0.03 2.89±0.38 0.047±0.007 8
LR2, Candida glabrata; LR4, Candida tropicalis; LR5, Candida glabrata; y T1 Candida glabrata
*µ p: Velocidad de producción de alcohol determinados por los ajustes al modelo de Gompertz (R2> 0.95).
Donde los mejores resultados en la producción de alcohol los obtuvo la cepa LR4 con una
producción máxima de alcohol de 35.31 ± 4.78 g/L a los 9 días de fermentación, con un
rendimiento de 0.42 ± 0.07 g/g y una productividad de 3.92 ± 0.53 g/Ld. El rendimiento es
superior obtenido por Hickert y col., 2013 al utilizar una C. shehatae HM 52.2 donde en un
medio mínimo de minerales donde la única fuente de carbono fue glucosa, xilosa y arabinosa
el rendimiento de producción total (Yp/s) fue de 0.40 g/g, pero similar al utilizar un cultivo de
S. cerevisiae y C. shehatae en el mismo medio de sales con la glucosa (20 g/L), xilosa (20
g/L) y arabinosa (10 g/L) como única fuente de carbono. Se realizó un análisis de varianza
para determinar si existe una diferencia significativa entre las cepas probadas en la mezcla de
azúcares.
En la figura 44, se ejemplifica con las gráficas de medias donde se observa una diferencia
significativa en el crecimiento con base en el peso seco (figura 44a) donde la cepa T1 tiene
los mejores resultados y en la producción de alcohol (figura 44c) donde la cepa LR4 se
105
diferencia del resto. Donde no se obtuvo diferencia significativa fue en la µ máx (figura 44b) y
en la Pmáx (figura 44d) por lo que con cualquier microorganismo se pudiera tener una buena
productividad en la producción de alcohol en la mezcla de azúcares a las mejores condiciones
de fermentación para cada cepa. Para mejorar la capacidad de asimilación de las cepas LR4 y
T1 en la mezcla de azúcares, las cepas fueron crecidas en un medio similar a los residuos con
una concentración total de azúcar de 200g/L, la fermentación también se llevó a cabo durante
10.5 días a sus mejores condiciones de producción de alcohol. En la figura 45, se observa el
crecimiento obtenido en peso seco para las cepas LR4 y T1 en una mezcla de azúcares (200
g/L), donde el crecimiento máximo para la cepa T1 en 3.5 días de fermentación fue de
alrededor 2.60 ± 0.24 g/L de peso seco más alto que el valor máximo obtenido por la cepa
LR4 (1.93 ± 0.13 g/L) después de 3 días de fermentación, la velocidad de crecimiento para la
cepa T1 (0.086 ± 0.011 g/Lh) también fue mayor que el obtenido para la cepa LR4 (0.060 ±
0.008 g/Lh).
a) b)
c) d)
Figura 44. Gráfica de medias para a) peso seco, b) µmáx, c) producción de alcohol y d) Pmáx en mezcla de
azúcares en los cultivos individuales empleados
106
Los resultados sugieren que la cepa T1 podría utilizar la fuente de carbono para la producción
de biomasa y mantenimiento celular, en lugar de la producción de metabolitos, que se refleja
en la concentración menor de alcohol.
3.0
2.5
2.0
Peso seco (g/L)
1.5
1.0
0.5
0.0
0 2 4 6 8 10
Tiempo (días)
Figura 45. Cinéticas de crecimiento en mezcla de azúcares en cultivos individuales. LR4 (círculo rojo) y T1
(círculo naranja)
En la figura 46a, se muestran los perfiles de asimilación de los azúcares que se presentan en el
medio y la producción de alcohol en el tiempo de fermentación de la cepa LR4. La cepa fue
capaz de asimilar más del 65 % de cada una de las hexosas y al menos el 40 % de las pentosas
en las concentraciones utilizadas para la fermentación. Después de tres días de fermentación,
los azúcares que se habían consumido mayoritariamente en el medio fueron la glucosa,
fructosa y galactosa con un consumo de 57, 37 y 54 %, respectivamente, representan el 48 %
del total de azúcar consumido.
Después de 7 días la glucosa y la fructosa alcanzaron un equilibrio con 80 y 60 % de azúcar

consumido, respectivamente. La galactosa presenta pequeños incrementos en el consumo hasta
alcanzar su máximo (70 %) después de 10 días de fermentación. La sacarosa se consume
gradualmente durante toda la fermentación hasta un máximo de 80 %. Con respecto a las
pentosas, el consumo de xilosa inició después de 3 días de fermentación con valores de
alrededor de 16 %, que se mantiene constante hasta 5.5 días, luego el consumo aumentó
gradualmente hasta alcanzar el valor más alto de 44 % después de 8 días y se mantuvo
constante hasta que terminó la fermentación. La arabinosa fue ligeramente consumida desde el
primer día hasta el segundo día y medio con un valor del 20 %, después se aumentó
107
rápidamente para un consumo del 40 % a los 3 días de fermentación. En general después de 10

días de fermentación, se observó que el medio contenía un 25.8 % del total de azúcares. De
nuevo los resultados mostraron que la cepa LR4 no presentan represión catabólica por glucosa
en otras hexosas evaluadas, sin embargo, pudiera existir represión catabólica en xilosa debido
a que su consumo se inició después de que se consumió un 57 % de la glucosa.
De Bari y col., (2013) observaron que el consumo de glucosa y xilosa se produce de forma
secuencial para la producción de etanol por Scheffersomyces stipitis, la asimilación de la
xilosa, aumentó significativamente sólo cuando la concentración de glucosa disminuyó.
Govindaswamy y col., (2007) informó que después de la utilización de glucosa, se asimila la
xilosa en la fermentación de un mezcla de azúcares, esto sugiere que la inhibición en la
fermentación de la xilosa es probablemente debido a la competencia para el sistema
transportador de azúcares en la levaduras, ya que la glucosa se transporta a través de la célula
por un sistema transportador de hexosas que se cree que es el mismo para el transporte de
xilosa en levaduras (De Bari y col., 2007).
En el medio de mezcla de azúcares, la asimilación de las pentosas fue mayor en comparación a

cuando se utilizó como única fuente de carbono, se podría deber a la activación de enzimas
que el microrganismo necesita para asimilar este azúcar. Fonseca y col., (2007) observaron la
asimilación de arabinosa para la formación de la biomasa con Candida arabinofermentans en
medios sin agitación. Por otro lado, Schimer-Michel y col., (2008) reportaron que la arabinosa
es metabolizada sólo después del agotamiento de la glucosa y la xilosa.
La cepa T1 (figura 46b) fue capaz de asimilar un 60 % de los azúcares totales presentes en la
fermentación. Después de tres días la glucosa, fructosa y galactosa mostraron valores de
consumo de 47, 43 y37 %, respectivamente, que representan alrededor del 40 % del total del
azúcar en el medio, este valor fue ligeramente menor al obtenido en la cepa LR4 al mismo
tiempo. La fructosa alcanzó un consumo máximo de azúcar (48 %) a los 7 días y la glucosa,
galactosa y sacarosa después de 9 días, obtuvieron valores de 65, 79 y 83 %, respectivamente.
108
50
100 a) 100
b)
30
40
80 80
Etanol (g/L)
Etanol (g/L)
30
60 60 20
20 40
40
10
20 10 20
0 0 0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 46. Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para la cepa a) LR4 y b) T1.
Sacarosa (círculo rojo), Glucosa (círculo naranja), Xilosa (triángulo inverso verde claro), Galactosa (triángulo
verde oscuro), Arabinosa (cuadrado azul turquesa), Fructosa (cuadrado azul marino) y Etanol (cuadrado con cruz)
En el consumo de pentosas para la cepa T1, la xilosa comenzó a ser consumida lentamente
después de dos días (5 %), manteniéndose constante hasta el día 5.5 y aumento gradualmente
hasta llegar a alrededor de 48 % del consumo total después de 10 días. La arabinosa mostró la
mitad de su consumo total a los dos días de fermentación y luego un consumo gradual hasta
alcanzar su valor máximo de 52 % en 9.5 días. Este resultado no es similar a lo reportado por
Schimer-Michel y col., (2008) que informaron que la arabinosa se comienza a metabolizar en
una fase posterior, cuando se han agotado tanto la glucosa como la xilosa, perfil metabólico
similar se ha observado para otras especies de Candida. Bettiga y col., (2009) informó de un
consumo paralelo de arabinosa y xilosa en una mezcla que contenía glucosa, sin embargo, se
ha obtenido con una cepa de S. cerevisiae modificada.
Las velocidades de consumo se muestran en la tabla 22, indican que la glucosa para la cepa
LR4 fue de las hexosas que se consumió más rápido (0.023 ± 0.001 g/Lh), seguido de sacarosa
y galactosa, el azúcar que se consumió más lento fue la fructosa. Según las velocidades de
consumo para las pentosas indicaron que la arabinosa fue la pentosa que más se consumió
(0.024 ± 0.003 g/Lh).
109
las cepas LR4 y T1, de forma individual
Candida tropicalis (LR4) Candida glabrata (T1)
CAM*
Azúcar* µs*** µs***
(%) CS** (%) CS** (%)
(g/Lh) (g/Lh)
GLU 51 83.2±0.10 0.023±0.001 65.0±0.31 0.020±0.002
FRU 30 66.3±0.41 0.015±0.002 48.5±0.78 0.031±0.001
GAL 8 70.1±0.01 0.022±0.002 78.9±0.12 0.019±0.002
SAC 2 80.1±0.01 0.022±0.001 82.7±0.05 0.019±0.004
ARA 7 54.3±0.11 0.024±0.003 52.1±0.33 0.014±0.003
XIL 2 43.8±0.06 0.018±0.002 47.5±0.22 0.013±0.002
**CS: el consumo de sustrato en 10.5 días de fermentación
La fructosa para la cepa T1, presenta la velocidad de consumo más alto entre los sustratos
(0.031±0.001 g/Lh) el doble a lo obtenido en la cepa LR4 para el mismo azúcar, además,
presentó una diferencia significativa al resto de los sustratos a excepción de la glucosa.
Aunque la cepa T1 presentó una velocidad de consumo de la xilosa inferior (0.013 ± 0.002
g/Lh) a la cepa LR4 (0.018 ± 0.002 g/Lh), una mejor asimilación se observó en la cepa T1. En
la tabla 23, se puede observar que la máxima producción de alcohol para la cepa T1 se
observó a los 7.5 días (28.9 ± 1.3 g/L), el tiempo donde la mayor parte de los azúcares habían
alcanzado el estado de equilibrio con un consumo total de azúcar del 58.1 ± 1.8 % donde la
contribución de las pentosas es del 4.3 %. La producción de alcohol con la cepa LR4 fue 35 %
más alta que la concentración de alcohol obtenida en la cepa T1, que puede ser explicada por
el menor consumo de glucosa y fructosa observado para la cepa T1 y por la influencia de la
agitación que favorece su crecimiento, también se favorece la disolución del oxígeno en el
medio provocando una reducción en la producción de alcohol.
Tabla 23. Parámetros cinéticos de producción de alcohol y velocidades de producción en el medio con mezcla de
azúcar de las cepas LR4 y T1, de forma individual
Producción Produccón máxima Etanol
Yp/s Productividad
Sistema TAC* (%) alcohol µp** (g/Lh)
(g/g) t (d) CS*** (%) (g/L.d)
(g/L)
LR4 74.2 ± 4.6 44.5 ± 0.1 0.32 ± 0.01 0.025 ± 0.003 7 69.1 ± 0.7 6.4 ± 0.01
T1 60.3 ± 4.4 28.9 ± 1.3 0.26 ± 0.01 0.040 ± 0.006 7.5 58.1 ± 1.8 3.9 ± 0.17
*TAC: Total consumo de sustrato en 10.5 días de fermentación
** µ p: Velocidad de producción de alcohol determinados por los ajustes al modelo de Gompertz (R2> 0.95).
*** CS: Consumo de sustrato que se obtuvo al día que se obtuvo la máxima producción de alcohol
110
Se ha informado de la capacidad de producción de alcohol por la cepa T1 con características

similares con las de Saccharomyces cerevisiae que mostraron el incremento en la
concentración de alcohol bajo condiciones de oxígeno limitado (Watanabe y col., 2008). La
producción de alcohol en ambas cepas se inició después de 0.5 días de fermentación, a pesar
de que la velocidad de producción fue mayor para la cepa T1 (0.040 ± 0.006 g/Lh), una mayor
producción de alcohol de 44.5 ± 0.1 g/L, se obtuvo para la cepa LR4, así como un mayor
rendimiento (Yp/s) y productividad (tabla 23).
Aunque la glucosa y la fructosa son los azúcares mayoritarios presentados en los residuos
cítricos (Wilkins y col., 2005 y Boluda-Aguilar y col., 2013), una completa conversión
eficiente de las hexosas y pentosas presentes en los hidrolizados lignocelulósicos a alcohol es
un requisito para aumentar al máximo la rentabilidad de un proceso industrial para la
producción de bioetanol (Fu y col., 2009).
7.4.3 Fermentación con cultivos mixtos
Debido a que la cepa LR4 mostró la mejor producción de alcohol a partir de las hexosas
evaluadas y la T1 mostró una mejor asimilación de las pentosas se evaluaron diferentes
esquemas de cultivos mixtos para obtener una conversión simultánea de mezcla de azúcares,
aumentar la asimilación total del sustrato y mejorar la producción de etanol. El primer
esquema de fermentación en cultivo mixto (CC1) se preparó con 60% de las células de la cepa
LR4 y 40 % de T1, en el mismo medio de mezcla de azúcares utilizado en las cinéticas con
cultivos individuales, éstas proporciones se ajustaron para tener un inóculo inicial de 20 x106
cel/mL, se utilizaron las condiciones más adecuadas para la fermentación de la cepa LR4 ya
que se encontraba en menor proporción.
En la figura 47a, se muestran los porcentajes de consumo de carbohidratos y la producción de

alcohol en el cultivo mixto CC1. Al igual que en los medios de cultivo con cepas individuales,
se llevó a cabo la fermentación durante 10.5 días, después de este tiempo el 73.1 ± 4.7 % del
total de azúcar que presentaban los medios se consumió, con al menor un 62 % de cada una de
las hexosas, estos valores son más altos que los obtenidos en la cepa T1 individual y similar a
111
los valores obtenidos por la cepa LR4. Después de 3 días la glucosa, fructosa y galactosa
presentan consumos de 58, 54 y 49 %, que representan alrededor del 50 % del total de
azúcares, este valor es mayor al obtenido por las dos cepas en cultivos individuales al mismo
tiempo (medio con 200 g/L de azúcares fermentables). La glucosa después de 4 días presentó
un consumo lento que fue del 24 al 82 % obtenido a los 10.5 día, se observó el mismo
comportamiento para la fructosa que alcanzó el 62.8 ± 2.78 % y la sacarosa que presentó el
74.1 ± 0.02 % al final de la fermentación (tabla 24).
La galactosa fue consumida adecuadamente llegando a un estado estacionario a los 7 días con
el 85 % del azúcar asimilado. Comparando con los azúcares individuales se obtuvo un
consumo similar en glucosa a lo obtenido por la cepa LR4 y el CC1, pero más alto que lo
obtenido en la cepa T1; el consumo de la fructosa fue 3 % superior en la cepa LR4 y 12 % en
la T1, el consumo de la galactosa también fue mayor en el medio con la mezcla de azúcares en
un 10 % para la cepa LR4 y en un 5 % para la cepa T1, sin la sacarosa se consume menos
alrededor del 20 % más bajo a lo obtenido en los cultivos individuales.
50 100
a) b)
100
Porcentaje de mezcla de la cepa
40 80
80
60
Etanol (g/L)
30
60
20 40
40
10 20
20
0 0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 2 4 6 8 10
Tiempo (días) Teimpo (dias)
Figura 47. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para el cultivo mixto CC1.
verde oscuro), Arabinosa (cuadrado azul turquesa), Fructosa (cuadrado azul marino) y Etanol (cuadrado con
cruz). b) Porcentaje de mezcla de las levaduras, LR4 (círculo rojo) y T1 (círculo naranja).
En relación al consumo de las pentosas, la asimilación de la xilosa comenzó después de dos

días de fermentación y presenta un consumo similar a la cepa T1 (6 %) para aumentar
gradualmente hasta el 45 %, similar a lo obtenido en los cultivos individuales de ambas cepas
112
(tabla 22). La arabinosa presentó un comportamiento similar que en los cultivos individuales
con un consumo del 52 %.
En la figura 47b, se muestra el comportamiento del porcentaje celular de la cepa LR4 y T1

inoculadas al mismo tiempo. En un principio, el cultivo se inició con 60 % de la cepa LR4 y
40 % de la cepa T1, a través del tiempo se observó un porcentaje más alto celular de la cepa
T1, donde la obtención de alrededor del 70 % de las células totales se presentan después de 1
día. Aunque se inoculó la cepa LR4 en mayor proporción, el porcentaje celular no permaneció
constante como se puede observar con la reducción a un promedio del 30 % durante el resto de
la fermentación. A pesar de las condiciones de crecimiento se estableció para favorecer la
producción de alcohol de la cepa LR4; la variación en la concentración celular de
microorganismo puede deberse a la diferencia en las velocidades de crecimiento de las cepas,
mayor para la T1 que para la LR4. La ausencia de agitación en los medios no afectó el
crecimiento de la cepa T1, la producción de etanol sigue siendo mayor para la cepa LR4.
Un sistema con una concentración inicial más alta de T1 (80 %) y de LR4 (20 %) se propone
con el fin de observar si una mejor asimilación de los azúcares distintos a la glucosa se podría
lograr sin disminuir la producción de alcohol, condiciones de agitación (200 rpm) se utilizaron
con el fin de favorecer a la cepa T1. En la figura 48a, muestra el comportamiento de consumo
de azúcares y producción de alcohol obtenido en el cultivo mixto CC2 con 10.5 días de
fermentación.
Se observó un consumo máximo de 73.5 ± 5.1 %, con una contribución de las pentosas en un
5 %. Después de tres días de fermentación un consumo del 74, 54 y 49 % de glucosa, fructosa
y galactosa se logró, los valores representan alrededor del 60 % del porcentaje total de los
azúcares presentes en el medio. Los valores obtenidos en este tiempo son más altos que los
obtenidos en las cepas individuales y en el CC1.
Al tercer día, se consumió un 3 % de la glucosa para alcanzar un estado estable alrededor del
día 5 con un 75 % con la velocidad de consumo más rápida obtenido en este cultivo mixto
(0.041 ± 0.004 g/Lh) en comparación a los otros dos esquemas propuestos (CC1 y CC3), la
113
fructosas y la galactosa presentan un consumo máximo después de días con valores de 68 y

83, respectivamente.
100
a) b)
40
100

80
80 30
Etanol (g/L)
60
60
20
40
40
10
20
20
0 0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 2 4 6 8 10
La velocidad de consumo más alta en el CC2 se obtuvo en fructosas (0.079 ± 0.003 g/Lh)
(tabla 24). La sacarosa se consume poco a poco hasta un consumo del 92 % a los 9 días, la
velocidad de consumo es el más pequeño en comparación con el resto de los sistemas (0.015 ±
0.001 g/Lh) para éste azúcar.
Con respecto a las pentosas en el CC2, la xilosa mostró un consumo muy lento hasta el día 6,
después, el consumo fue incrementando gradualmente hasta obtener un consumo del 47 %
similar a lo obtenido por la cepa T1 cuando fue evaluada individualmente, en el caso de la
arabinosa, empezó a ser consumido poco a poco hasta alcanzar un valor máximo después del
día 9 con 58 % con una tasa de consumo de 0.028 ± 0.002 g/Lh, este valor fue el más alto
obtenido para éste azúcar entre los sistemas evaluados.
En la figura 48b, se observa el comportamiento celular de los microorganismos a las

proporciones establecidas, los resultados indicaron que la cepa T1 mantiene un porcentaje
celular inicial similar durante toda la fermentación, con una disminución del 10 % al final de
la fermentación, una ligera variación de la cepa LR4 se observó a los 8 días donde el
porcentaje celular más grande se obtuvo con un 42 %. A pesar de una menor concentración de
114
la cepa LR4 y que las condiciones favorecían a la cepa T1, la producción de alcohol no se vio
afectada.
las cepas LR4 y T1 en cultivo mixto
CC3
CC1 CC2
(100% LR4; 2d later
CAM* (60% LR4;40% T1) (20% LR4; 80% T1)
Azúcar* 100% T1)
(%)
TAC** µs*** TAC** µs*** TAC** µs***
(%) (g/Lh) (%) (g/Lh) (%) (g/Lh)
GLU 51 82.3±0.36 0.020±0.003 77.4±0.95 0.041±0.004 95.2±0.36 0.030±0.001
FRU 30 62.8±2.78 0.042±0.002 68.2±0.12 0.079±0.003 77.8±0.01 0.019±0.003
GAL 8 86.0±0.50 0.017±0.001 83.9±0.46 0.022±0.002 83.0±0.11 0.019±0.002
SAC 2 74.1±0.02 0.023±0.003 92.1±0.10 0.015±0.001 83.0±0.51 0.023±0.002
ARA 7 51.6±0.88 0.021±0.004 58.3±0.15 0.028±0.002 57.7±0.62 0.017±0.001
XIL 2 44.9±0.52 0.012±0.003 47.4±0.15 0.012±0.003 51.3±0.15 0.023±0.002
**TAC: total de azúcar consumido en 10.5 días de fermentación
Con el fin de aumentar el consumo de azúcar total y la productividad de alcohol, se propuso

un esquema de cultivo mixto secuencial. La cepa LR4 que produce en grandes cantidades el
alcohol, se inoculó inicialmente a una concentración de 20 x 106 cel/mL, para favorecer la
asimilación de las hexosas y la producción de alcohol sin agitación, secuencialmente a los dos
días a la misma concentración se inoculó la cepa T1 y el sistema comenzó a ser agitado a 200
rpm, para mejorar la asimilación de pentosas.
En la figura 49a, se observó un consumo máximo del 85.2 ± 2.0 % del total de azúcar, donde
el 5 % de los azúcares totales consumidos son contribución por pentosas. Después de 3 días de
fermentación, el consumo del 71, 49 y 54 % de glucosa, fructosa y galactosa se logró, que
representan alrededor del 60 % del total de azúcar presentes en el medio, los resultados con
similares a lo obtenido en el sistema CC2 y mayor que los obtenido en las cepas individuales y
CC1.
Se observó un aumento gradual de la asimilación de la glucosa para hasta llegar un consumo

máximo del 95.2 ± 0.36 % con una velocidad de consumo del 0.030 ± 0.001 g/Lh. La fructosa
y galactosa presentan un consumo del 30 % al día 3, a continuación, se observó un incremento
gradual para llegar a valores de 77.8±0.01 y 83.0±0.11 g/Lh, respectivamente, con velocidades
115
de consumo de alrededor de 0.019 ± 0.003 g/Lh. La sacarosa se consume moderadamente para

llegar a 83.0 ± 0.51 después de 8 días, las tasas de consumo de éste azúcar fue similar a la
obtenida en el sistema CC1 (0.023 ± 0.002 g/Lh).
50 100
a) b)
100

40 80
80
Etanol (g/L)
30 60
60
20 40
40
10 20
20
0 0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 2 4 6 8 10
En el CC3, la xilosa mostró un consumo lento durante 4.5 días, que pudo ser debido a la
ausencia de la cepa T1 que fue inoculada hasta el segundo día, incrementando el consumo
gradualmente hasta alcanzar un 51.3 ± 0.15 % con una velocidad de consumo de 0.023 ±
0.002 g/Lh, estos fueron los valores más altos en los consumos de xilosa. La arabinosa
comenzó a ser consumida gradualmente hasta alcanzar un valor máximo de consumo a los 9
días de 57.7±0.62 % con velocidad de consumo de 0.017±0.001 g/Lh, estos valores fueron
similares a los obtenidos en el sistema CC2 (tabla 24). Los resultados concuerdan con lo
reportado por Guan y col., (2013), que evaluó la asimilación en un mezcla de azúcares
utilizando cepas no recombinantes para la producción de alcohol en un esquema secuencial de
C. shehatae y S. cereviseae o B. bruxellensis. La fermentación secuencial evaluada mostró una
mejor asimilación de azúcar total del 99 %, valores superiores a los obtenidos por las cepas
independientes.
En la figura 49b, se muestra el comportamiento celular en el cultivo secuencial, donde la cepa

LR4 mostró un crecimiento típico durante los primeros 2 días de fermentación, después de la
adición de la cepa T1 la concentración celular total incrementó y por consecuencia el
116
porcentaje celular de cada cepa se vio afectada. Después de 3 días, el porcentaje de

concentración celular para la cepa LR4 disminuyó a 30 % manteniéndose constante entre 20 y
40 % durante el resto de la fermentación. La cepa T1 aumentó su concentración celular a un
70 % y luego se mantuvo constante entre el 60 y 80 % hasta el final de la fermentación.
En el CC1 (tabla 25), la producción máxima de alcohol se obtuvo a los 8 días de fermentación
con 45.2 ± 1.3 g/L, este valor es similar a lo obtenido con la cepa LR4 (medio 200 g/L
azúcares fermentables), pero más alto que el obtenido por la T1 individual, con un rendimiento
(Yp/s) de 0.34 ± 0.01 g/g y la productividad de 5.7 ± 0.16 g/Ld. Los resultados obtenidos son
similares a los reportados por De Bari y col., (2013), quienes observaron más rápida
asimilación de azúcar en co-cultivo de Scheffersomyces stipitis y Saccharomyces cerevisiae
que en los cultivos individuales, no obstante, presentan rendimientos más bajos que los
obtenidos en concentraciones similares (0.28 ± 0.020 g/g).
Tabla 25. Parámetros cinéticos de producción de alcohol y velocidades de producción en el medio con mezcla de
azúcar en cultivo mixto
Producción Producción máxima Etanol
TAC* Yp/s Productividad
Sistema Alcohol µp** (g/L)
(%) (g/g) t (d) CS*** (%) (g/Ld)
(g/L)
CC1**** 73.1 ± 4.7 45.2 ± 1.3 0.34 ± 0.01 0.029 ± 0.004 8 66.4 ± 5.1 5.7 ± 0.16
CC2**** 73.5 ± 5.1 42.4 ± 1.6 0.31 ± 0.01 0.042 ± 0.010 5.5 65.0 ± 1.9 7.7 ± 0.29
CC3**** 85.2 ± 2.0 46.8 ± 2.6 0.30 ± 0.01 0.037 ± 0.007 6 73.7 ± 1.8 7.8 ± 0.44
**** CC1: 60 % LR4 - 40 % T1, CC2: 20 % T1 - 80% LR4 y CC3: LR4 100 % 0h - T1 100 % 48h.
En el CC2, se obtuvo una concentración máxima de alcohol de 42.4 ± 1.6 g/L a los 5.5 días, y
mostró una reducción en el tiempo de fermentación para producir alcohol que se refleja en la
velocidad de producción de 0.042 ± 0.010 g/Lh. Se observó también una alta productividad
(7.7 ± 0.29 g/Ld), mayor a lo obtenido en el CC1, En la literatura se reportan valores de
productividad por debajo a los obtenidos por Fu y col., (2009) en un cultivo mixto con
Zymomonas mobilis y Pichia stipitis, y De Bari y col., (2013), en cultivos mixtos de S. stipitis
y S. cerevisiae, en medios mínimos con una mezcla de glucosa y xilosa. El CC3, muestra una
concentración máxima de 46.8 ± 2.6 g/L al día 6, que corresponde con el momento en que
azúcar total muestra su consumo máximo. Más tarde, el metabolito disminuye a alrededor de
35 g/L al día 10.5. La producción de alcohol obtenido con este esquema es el más alto
117
obtenido entre los sistemas probados. Aunque los resultados indican que la inoculación del
microorganismo secuencialmente aumenta el consumo de azúcar y la producción de alcohol,
sólo se observan diferencias significativas con la cepa T1 evaluada individualmente.
La velocidad de producción (0.037 ± 0.007 g/Lh) fue menor que la obtenida con el CC2, sin
embargo, la productividad y el consumo de azúcar al momento en que se tuvo la máxima
producción de alcohol logró ser el más alto en comparación con los sistema CC2 y CC1 (7.8 ±
0.44 g/Ld y 73.7 ± 1.8 %) (tabla 25). De Bari y col., (2013), afirman que el consumo
simultáneo de azúcar garantiza productividades más altas como en los sistemas de cultivo
mixto utilizados. La adición de la cepa LR4 al comienzo de la fermentación favoreció la
asimilación de las hexosas y la producción de alcohol; con la cepa T1 se incrementó el
consumo de pentosas y por consecuencia mejorar la producción de alcohol.
Se realizó un análisis de varianza para conocer si existía diferencia significativa entre los
sistemas de microorganismos utilizados en la cinética de fermentación. En la figura 50, se
presenta el gráfico de medias para los sistemas con respecto a la producción de alcohol y
productividad máxima (Pmáx), los resultados indican que existe una diferencia significativa, ya
que la producción de alcohol en la cepa T1 fue muy diferente a los obtenido en el resto de las
mezclas. En promedio no hay una diferencia entre los cuatro sistemas restantes. Tampoco
existe una diferencia significativa entre los CC2 y CC3 donde se obtuvieron los mejores
resultados, por lo que cualquier sistema podría ser utilizado.
a) b)
Figura 50. Gráfica de medias para a) producción de alcohol y b) Pmáx en mezcla de azúcares en los cultivos
individuales y mixtos empleados
118
También se observo una diferencia significativa en el consumo de la sacarosa al utilizar el

cultivo mixto CC2 y en el consumo de glucosa y fructosa donde el mayor porcentaje de
consumo se da el cultivo mixto CC3. El resto de los azúcares fueron consumidos similarmente
sin una diferencia significativa. El cultivo mixto secuencial (CC3), podría ser utilizado para la
fermentación de hidrolizados de residuos cítricos ya que asimilan en mayor porcentaje glucosa
y fructosa, los principales carbohidratos en los hidrolizados y por haber obtenido una de las
mejores productividades en la producción de alcohol.

Debido a que el sistema de inoculación secuencial (CC3) resultó ser el más adecuado para el
mayor consumo de glucosa y fructosa, principales azúcares en las hidrólisis de los residuos
cítricos, así como del mayor porcentaje total de azúcares consumidos y la mayor producción
de alcohol (tabla 25), se planteó establecer las condiciones de fermentación de cultivos mixtos
variando los días de inoculación de la cepa T1 y la agitación en la mezcla de azúcares antes
mencionada, a 35o C durante 10.5 días.
7.5.1 Cinética de crecimiento utilizando diferentes esquemas de inoculación
En las figuras 51 y 52, se presenta el porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y

producción de alcohol para los tratamientos 5 y 9, respectivamente, como ejemplo de las
cinéticas realizadas en base al diseño factorial 4 x 3 presentado en la tabla 9. En estos dos
tratamientos se obtuvieron los mayores valores de productividad, necesario para la obtención
de la máxima concentración de alcohol en un menor tiempo. En la figura 51a, se observó un
consumo máximo del 89.25 ± 0.38 % del total de azúcar con una contribución de las pentosas
en un 4 %. Después de dos días de fermentación, el consumo del 98, 62 y 56 % de glucosa,
sacarosa y galactosa se logró, que representa el 60 % del total de azúcar presente en el medio,
los resultados con similares a lo obtenido en el sistema CC2 y mayor que los obtenido en las
cepas individuales y CC1.
119
100
100
a) 40 b)

80
80
Porcentaje d e consum o
30
Etanol (g/L)
60 60
20
40 40
10
20 20
0 0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 2 4 6 8 10
Figura 51. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para el tratamiento 5.
Se observó un aumento muy rápido en la asimilación de la glucosa donde del día 1 al 2 se

observa un consumo mayor al 70 % del total de la concentración en el medio. La glucosa
presenta una velocidad de consumo del 0.085 ± 0.011 g/Lh (tabla 26), siendo el azúcar que
más rápido se consume en el tratamiento 5. La fructosa y la galactosa presentan un consumo
del 47 y 59 % al tercer día, con un consumo gradual para llegar a valores de 75.71 ± 0.59 y
83.53 ± 2.94 g/Lh, respectivamente. La sacarosa se consume al 100 % a los 5 días, con una
velocidad de consumo similar a la galactosa (0.033 ± 0.004 g/Lh). La xilosa mostró un
consumo moderado durante 5 días gracias a la presencia de la cepa T1 que se inoculó pasado
un día del inicio de la fermentación, a comparación con el cultivo CC3 que por durante 4.5
días presento un consumo lento del azúcar, que pudo ser debido por la ausencia de la cepa T1
en los primeros dos días de fermentación. Se consumió un total del 94.16 ± 0.29 % del total de
la xilosa con una velocidad de consumo del 0.042 ± 0.003 g/Lh, velocidad que se encuentra
por arriba de las obtenidas en la fructosa, galactosa y sacarosa. La arabinosa presentó un
consumo lento durante los primeros 4 días, estabilizándose a una concentración de alrededor
del 50 % por el resto de la fermentación, tuvo un consumo total del 53.87 ± 6.99 % con una
velocidad de consumo 0.039 ± 0.003 g/Lh (tabla 26).
120
los tratamientos 5 y 9.
Tratamiento 5 Tratamiento 9
CAM* (1 día de inóculo y 100 rpm) (1 día de inóculo y 200 rpm)
Azúcar*
(%) µs*** µs***
TAC** (%) TAC** (%)
(g/Lh) (g/Lh)
GLU 51 100±0.00 0.085±0.011 100±0.00 0.157±0.025
FRU 30 75.71±0.59 0.024±0.001 82.41±1.59 0.015±0.002
GAL 8 83.53±2.94 0.030±0.003 85.36±0.68 0.025±0.004
SAC 2 100±0.00 0.033±0.004 100±0.00 0.039±0.003
ARA 7 53.87±6.99 0.039±0.003 62.19±0.30 0.027±0.002
XIL 2 94.16±0.29 0.042±0.003 79.35±0.64 0.083±0.017
En la figura 51b, se muestra el comportamiento celular en el tratamiento 5, donde la cepa

LR4 mostró un comportamiento típico durante el primer día de fermentación, después de la
adición de la cepa T1, la proporción de la cepa LR4 fue disminuyendo cuando la cepa T1 fue
creciendo, por lo que el porcentaje celular se vio afectado. A los 2 días, el porcentaje de
concentración celular de ambas cepas se mantuvo similar alrededor del 50 %, pero a los 5 días
el porcentaje de la cepa T1 fue mayor manteniéndose en una proporción de 80 % para la cepa
T1 y 20 % LR4 el resto de la fermentación, las proporciones finales fueron similares a lo
observado en el CC3.
En la figura 52a, muestra el comportamiento de consumo de azúcares y producción de alcohol

obtenido en el tratamiento 9 en 10.5 días de fermentación. Se observó un consumo máximo de
91.70 ± 0.26 % con una contribución de las pentosas en un 5 %, por arriba que el tratamiento 5
y por debajo a lo obtenido en el CC3, esto pudo deberse a que la cepa es inoculada cuando
todavía hay una buena cantidad hexosas en el medio. Después de dos días de fermentación un
consumo del 99, 74 y 50 % de glucosa, sacarosa y galactosa se logró, los valores representan
un 60 % del porcentaje de consumo presentes en el medio. Los valores obtenidos a este tiempo
son más altos que los obtenidos en las cepas individuales y en el CC1, y similar al CC3.
121
50
100 100
a)
40

80 80
Etanol (g/L)
30
60 60
40 20 40
20 10 20
0 0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 2 4 6 8 10
Figura 52. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para el tratamiento 9.
Al segundo día de fermentación ya tenía un consumo del 100 % de la glucosa, que pudo ser
usada principalmente para la producción de alcohol ya que este tiempo corresponde al tiempo
en que se obtuvo la concentración máxima del metabolito. La velocidad de consumo de la
glucosa fue de 0.157±0.025 g/Lh (tabla 26), superior a la obtenida en glucosa en el
tratamiento 5. La sacarosa fue consumida con una velocidad moderada (0.039 ± 0.003 g/Lh)
hasta alcanzar el 100 % a los 4 días de fermentación. La galactosa y fructosa tuvieron una
velocidad de consumo lenta hasta alcanzar un consumo total de 85.36 ± 0.68 y 82.41 ± 1.59
g/Lh los 10.5 días de fermentación, éstos azúcares pudieron ser utilizados para el crecimiento
y mantenimiento celular debido a que no se presentó una mayor producción de alcohol.
Con respecto a las pentosas, la xilosa presentó la más alta velocidad de consumo (0.083 ±
0.017 g/Lh) que se ve reflejado en el consumo total de 79.35 ± 0.64 %, obtenido a os 10.5 días
de fermentación, la xilosa fue consumida rápidamente hasta los dos días y se estabilizó
disminuyendo su velocidad de consumo después de los tres días, al contrario la arabinosa
presentó la velocidad de consumo (0.027±0.002 g/Lh) por debajo de la xilosa, pero por encima
de la velocidad de consumo de la galactosa y fructosa. La arabinosa tuvo un consumo total de
62.19 ± 0.30 % a los 6.5 días manteniéndose el resto de la fermentación.
122
En la figura 52b, se observa el comportamiento celular de los microorganismos, los resultados

indicaron que las cepas mantuvieron una proporción similar (50 %) alrededor de solo 12 h
muy por debajo a lo obtenido en el tratamiento 5 donde se mantuvieron en esa proporción por
2 días. La cepa T1 crece más rápido ganándole en proporción a la cepa LR4, desde los días. Se
observó a los 7 días que las proporciones de las cepas fue de 80 % para la cepa T1 y 20 % para
la LR4 manteniéndose así el resto de la fermentación.
En la tabla 27, se muestran los parámetros cinéticos de producción de alcohol y la velocidad

de producción del diseño 4 x 3 donde se variaron los tiempos de inoculación en la mezcla de
azúcares. Se puede observar que las mayores producciones de alcohol se obtienen en el
tratamiento 1 con 43.33 ± 0.74, tratamiento 2 con 45.27 ± 0.18, tratamiento 3 con 45.10 ± 2.81
y tratamiento 4 con 45.52 ± 0.59 g/L, con un consumo de azúcar al tiempo que se obtuvo la
mayor concentración de alcohol de entre el 82 y 89 %, al no existir una agitación en el sistema
se benefició la producción de alcohol. Estos valores de producción de alcohol son muy
similares a los obtenidos en el CC3 (46.8 ± 2.6 g/L).
Tabla 27. Parámetros cinéticos de producción de alcohol y velocidad de producción en el medio con mezcla de
azúcar del diseño factorial 4 x 3, en cultivos mixtos.
Producción Producción máxima
Yp/s Etanol Productividad
Trat TAC* (%) alcohol µp** (g/Lh)
(g/g) (g/L.d)
(g/L) t (d) CS*** (%)
1 85.59±0.98 43.33±0.74 0.56±0.01 0.032±0.004 8.0 82.22±1.01 5.41±0.09
2 92.56±1.12 45.27±0.18 0.50±0.01 0.035±0.003 7.0 83.21±0.96 6.46±0.04
3 95.77±0.41 45.10±2.81 0.50±0.02 0.030±0.004 7.0 87.21±0.45 6.44±0.57
4 95.86±0.60 45.52±0.59 0.50±0.01 0.030±0.004 7.5 89.96±1.76 6.04±0.11
5 89.25±0.38 39.93±1.05 0.50±0.01 0.124±0.048 3.0 76.39±0.09 13.31±0.35
6 91.71±0.02 33.49±0.88 0.42±0.02 0.054±0.010 8.5 90.54±0.21 3.94±0.10
7 92.16±0.14 33.74±2.84 0.44±0.01 0.029±0.006 5.5 88.06±1.53 6.13±0.42
8 92.64±0.54 32.80±0.67 0.40±0.01 0.017±0.002 8.0 89.93±0.28 4.10±0.08
9 91.70±0.26 38.04±0.56 0.49±0.01 0.184±0.057 2.0 71.81±1.99 19.02±0.28
10 96.32±0.43 40.85±2.42 0.46±0.02 0.052±0.006 5.0 88.36±1.08 8.17±0.68
11 98.62±0.11 41.20±1.86 0.45±0.02 0.040±0.005 5.0 89.69±2.25 8.24±0.37
12 94.63±0.10 40.48±5.34 0.45±0.02 0.054±0.007 7.0 84.91±1.42 5.78±0.76
Donde se mejoró fue en la productividad máxima, en el tratamiento 9 se obtuvo la

productividad más alta con 19.02 ± 0.28 g/Ld (0.79 g/Lh) a los dos días. De Bari y col.,
(2013), en cultivos mixtos de S. stipitis y S. cerevisiae, en medios mínimos con una mezcla de
123
glucosa y xilosa obtiene una productividad máxima de 17.28 ± 0.03 g/Ld (0.72 g/Lh) al
utilizar 60 g /L total de la mezcla de azúcares, éstos valores son más bajos a los obtenidos por
las cepas LR4 y T1 en cultivo secuencial con una concentración total de 100 g/L de azúcar.
Pero se encuentran por debajo a lo reportado por Fu y col., (2009) donde obtiene una
productividad de 0.830 g/Lh a partir de una mezcla de glucosa y xilosa (100 g/L).
a) b)
Gráfica de Pareto para producción de alcohol (g/L) Gráfica de Pareto para Pmáx
+
- +
B:Agitación (rpm)
-
A:Tiempo de inoculo (d)

AB
AB B:Agitación (rpm)
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4 0 1 2 3 4 5

c) Gráfica de Pareto para Yp/s d) Gráfica de Pareto para Consumo total de azúcar (%)
+
- +
-
B:Agitación (rpm)
B:Agitación (rpm)
AB
AB
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5
Figura 53. Gráfica de Pareto para a) producción de alcohol, b) Pmáx, c) Yp/s y d) Consumo total de azúcar en
mezcla de azúcares variando el tiempo de inóculo
Los análisis de varianza realizados se resumen con las gráficas de Pareto y de interacción con
respecto a las respuestas cinéticas de producción de alcohol. En la figura 53a, se observa que
con base en las gráficas de Pareto que no hay un efecto por agitación o tiempo de inóculo para
la obtención de la máxima concentración de alcohol, en la figura 53c, se observa que la
agitación y el tiempo de inóculo tienen un efecto significativo sobre el rendimiento (Yp/s).
124
a) Gráfica de interacción b) Gráfica de interacción

47 Tiempo de inoculo (d) 20 Tiempo de inoculo (d)
1 1
2 2
P r o d u c c ió n d e a lc o h o l (g /L )
44 4 16 4
6 6
41 12
P m áx
38 8
35 4
32 0
0 100 200 0 100 200
Agitación (rpm) Agitación (rpm)
Figura 54. Gráfica de interacción para a) producción de alcohol y b) Pmáx en mezcla de azúcares variando el
tiempo de inóculo
En las figuras 53b y 53d, se muestra que el tiempo de inóculo, la agitación y la interacción de
los factores tienen un efecto significativo sobre las respuestas de Pmáx y en el porcentaje del
consumo total de azúcar. En la figura 54, se pueden observar las gráficas de interacción en
base a la producción de alcohol y Pmáx, obtenidas del diseño 4 x 3 donde se varió la agitación y
el tiempo de inóculo. En la figura 54a, se indica que para obtener la mayor producción de
alcohol se podrían usar una inoculación a los 2, 4 y 6 días sin agitación, pero en el caso de la
productividad (figura 54b) las mejores condiciones son utilizando 1 día de inóculo para la
cepa T1 con 200 rpm en promedio, seguido de 1 día de inóculo pero con 100 rpm.
7.6 Evaluar la capacidad fermentativa del cultivo mixto seleccionado en un hidrolizado

de residuos cítricos a nivel fermentador de 3 L
Se utilizó un bioreactor de 3 L para evaluar la capacidad fermentativa del cultivo mixto

seleccionado, utilizando una mezcla de azúcares y sales con un volumen total de 2 L o de 1.3
L de hidrolizado de residuos de limón persa, esterilizado. Las primeras 24 horas se fermentó
con la cepa LR4 a las condiciones de 35o C y 0 rpm, cuando se inoculó la cepa T1 pasadas las
24 horas, se aplicaron las condiciones especificadas en cada caso.
125
7.6.1 Condiciones similares a matraz sin ajuste de pH y con ajuste de pH
Se realizó una cinética de fermentación a las condiciones de 35o C y 200 rpm, donde la cepa
T1 se inoculó al día que comenzó la fermentación, buscando obtener valores de productividad
similares en un reactor de 3 L, con un volumen de mezcla de azúcares de 2 L. En la figura
55a, se presenta el porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de alcohol sin
ajuste de pH a las mejores condiciones obtenidas en el diseño anterior (tabla 9).
Se observó un consumo máximo del 80.62 ± 0.43 % del total de azúcar con una contribución
de las pentosas en un 7 % por arriba a lo obtenido en los sistemas anteriores. Después de 2
días de fermentación, el consumo del 71, 58 y 52 % de glucosa, galactosa y fructosa se
obtuvo, éstos valores representan un 70 % del total de azúcar presente en el medio superior a
lo obtenido en los tratamiento 5 y 9 donde se obtuvieron las mejores productividades a nivel
matraz.
Se observó que se asimiló principalmente la glucosa donde a los 1.5 días ya tenía un consumo
del 60 % del total de la concentración en el medio a una velocidad moderada (0.047 ± 0.003
g/Lh) hasta alcanzar un consumo total a los 4 días de fermentación de 93.03 ± 0.01 % (tabla
28). La glucosa y fructosa a los dos días ya presentaban consumos del 71 y 54 %,
respectivamente. La sacarosa se consumió a una velocidad muy lenta (0.021 ± 0.007 g/Lh)
hasta alcanzar un consumo total de 54.16 ± 0.94 %.
La xilosa mostró una velocidad de consumo similar a la sacarosa con 0.025 ± 0.008 g/Lh.
Aunque la arabinosa presentó una velocidad de consumo (0.075 ± 0.007 g/Lh) mayor a las
velocidades del resto de los azúcares solo se obtuvo un consumo total del 48.29 ± 2.70 %
126
100 100
b)
a) 4
30

80 80
3
60
Etanol (g/L)
60
20
pH
2
40 40
10
20 20 1
0 0 0
0
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
Figura 55. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol a las mejores condiciones
obtenidas a nivel matraz sin ajuste de pH. Sacarosa (círculo rojo), Glucosa (círculo naranja), Xilosa (triángulo
inverso verde claro), Galactosa (triángulo verde oscuro), Arabinosa (cuadrado azul turquesa), Fructosa (cuadrado
azul marino) y Etanol (cuadrado con cruz). b) Porcentaje de mezcla de las levaduras, LR4 (círculo rojo), T1
(círculo naranja) y pH (círculo azul).
En la figura 55b, se muestra el comportamiento celular en la cinética de fermentación sin

ajuste de pH, donde la cepa LR4 mostró un comportamiento típico durante el primer día de
fermentación, después de la adición de la cepa T1, la proporción de la cepa LR4 se ve
superada a los 1.5 días por la cepa T1. Alrededor de los 3 días se obtiene una proporción de 80
% para la cepa T1 y 20 % para la cepa LR4 el resto de la fermentación, en los tratamiento 5 y
9 del diseño en matraz se observa que las concentraciones celulares terminan en las mismas
proporciones al final de la fermentación, aunque en este caso no se observó una estabilidad al
50 % para ambas cepas.
Con respecto al pH, el medio fue ajustado a 4.5, después de esterilizar se detectó un pH de 3.8
este valor no se ajustó debido a que a nivel matraz no se realizó, conformé la cepa LR4 fue
creciendo, se observó una disminución en el pH con el paso del tiempo de la fermentación
hasta estabilizarse a un pH de 2.2 la cepa LR4 podría estar liberando algún tipo de ácido
orgánico al medio disminuyendo el pH, la cepa T1 logró crecer a pesar de la disminución del
pH.
127
Tabla 28. Consumo total de azúcar y velocidades en el consumo de sustrato en el medio con mezcla de azúcar en
las cinéticas sin y con ajuste de pH
Con ajuste de pH
Sin ajuste de pH
(1 día de inóculo (T1), 200 rpm y ajuste de
CAM* (1 día de inóculo (T1) y 200 rpm)
pH)
Azúcar*
(%) µs*** µs***
TAC** (%) TAC** (%)
(g/Lh) (g/Lh)
GLU 51 93.03±0.01 0.047±0.003 98.93±0.02 0.042±0.005
FRU 30 69.18±1.77 0.047±0.006 84.54±3.79 0.060±0.014
GAL 8 89.03±0.10 0.032±0.008 91.43±4.60 0.052±0.016
SAC 2 54.16±0.94 0.021±0.007 48.93±4.29 0.061±0.022
ARA 7 48.29±2.70 0.075±0.007 79.85±2.42 0.057±0.018
XIL 2 63.43±3.33 0.025±0.008 94.12±2.99 0.055±0.014
Debido a que se obtuvo una productividad (7.72 ± 0.02 g/Ld) más baja de lo esperado en la
cinética de fermentación sin ajuste de pH, se repitió la cinética de fermentación a las mismas
condiciones ajustando el pH a 4.5 durante los 4 días de la reacción, para descartar efecto por
este factor.
En la figura 56a, se observó un consumo máximo del 89.48 ± 2.83 % con una diferencia
significativa a lo obtenido sin ajuste de pH, de nuevo la glucosa es el azúcar que se consume
mayoritariamente con 98.93 ± 0.02 %. Se observa en la tabla 28, que los consumo del resto de
los azúcares es mayor que en las cinética sin ajuste de pH, excepto en la sacarosa con un
consumo por debajo del 50 %. Cabe destacar los resultados obtenidos en la asimilación de las
pentosas donde en ambos casos se obtiene un consumo superior al 80 %, que representa una
diferencia significativa a la cinética anterior, por lo que el ajuste de pH benefició la
asimilación de las fuentes de carbono. Pero con respecto a la productividad se obtuvo un valor
muy bajo (7.57 ± 0.04 g/Ld) a lo obtenido a nivel matraz y en la cinética anterior.
128
100 30 100 5.00
a)
b)

25
80 80 4.00
20
60 3.00
Etanol (g/L)
60
pH
15
40 40 2.00
10
20 20 1.00
5
0 0 0 0.00
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
Figura 56. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol a las mejores condiciones
obtenidas a nivel matraz y ajuste de pH. Sacarosa (círculo rojo), Glucosa (círculo naranja), Xilosa (triángulo
inverso verde claro), Galactosa (triángulo verde oscuro), Arabinosa (cuadrado azul turquesa), Fructosa (cuadrado
azul marino) y Etanol (cuadrado con cruz). b) Porcentaje de mezcla de las levaduras, LR4 (círculo rojo), T1
(círculo naranja) y pH (círculo azul).
En la figura 56b, se muestra el comportamiento celular en la cinética de fermentación con

ajuste de pH a las mejores condiciones obtenidas a nivel matraz, donde se observó que durante
el crecimiento de la cepa LR4 se presentó una ligera disminución en el pH pero fue ajustado
con la adición de HCl 0.5 M o NaOH 0.5 M para mantener un pH de 4.5 estable a partir de que
se adicionó la cepa T1. Las proporciones variaron rápidamente donde a los 1.5 días ya se tenía
una proporción del alrededor del 70 % para la cepa T1 y para la cepa LR4 del 30 % , el
porcentaje de la primera cepa aumento ligeramente a los 2 días manteniéndose el resto de la
fermentación.
7.6.2 Cinéticas de crecimiento con diferentes niveles de aireación y agitación
Para tratar de obtener una mayor concentración y una productividad similar a la obtenida a
nivel matraz, se realizó un diseño factorial 22 con 4 tratamientos realizando los ensayos en
orden aleatorio, los factores se presentan en la Tabla 10. Oberoi y col., (2010) que se acelera
la producción de alcohol al incrementar los niveles de aeración, también comenta que los
microorganismos Candida sp generalmente metaboliza mejor las pentosas bajo condiciones
limitadas de oxígeno.
129
En la figura 57a, se obtuvo un consumo máximo del 88.04 ± 0.34 % del total de azúcar.
Después de dos días de fermentación, se obtuvo un consumo del 97, 58 y 57 % de glucosa,
galactosa y fructosa. Que representa un consumo del 80 % del total de los azúcares presentes
en el medio. El porcentaje se encuentra por debajo al porcentaje de consumo al mismo tiempo
en el hidrolizado (98 %). La glucosa y la sacarosa son los primeros azúcares que se consumen
en su totalidad a los 2.25 días. la fructosa presenta la velocidad de consumo más rápida con
0.079 ± 0.015 g/Lh (tabla 29).
40 100 5
100
a)
b)
80 4
80 30
Etanol (g/L)
60 3
60
pH
20
40 40 2
10
20 20 1
0 0 0 0
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
Figura 57. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol en el tratamiento 1. Sacarosa
(círculo rojo), Glucosa (círculo naranja), Xilosa (triángulo inverso verde claro), Galactosa (triángulo verde
oscuro), Arabinosa (cuadrado azul turquesa), Fructosa (cuadrado azul marino) y Etanol (cuadrado con cruz). b)
Porcentaje de mezcla de las levaduras, LR4 (círculo rojo), T1 (círculo naranja) y pH (círculo azul).
Con respecto a las pentosas, la xilosa se consume en su totalidad a los 3.25 días con una
velocidad moderada, aunque la arabinosa solo se consume en un 65.97 ± 2.12 %, presenta una
velocidad de consumo mayor (0.051 ± 0.005 g/Lh) que la sacarosa, xilosa y galactosa. A los
dos días que se obtiene la mayor producción (34.34 ± 0.25 g/L) se observa una ligera
disminución en la concentración de alcohol. En la figura 57b, se observa el comportamiento
celular de las cepas en el tratamiento 1, se observa que a partir de los 1.5 días los porcentajes
de población para ambas cepas se mantiene alrededor del 50 %. Con respecto al pH se observa
una disminución constante (2.2) hasta el día y medio manteniéndose constante el resto de la
fermentación. Fromanger y col., (2010) menciona la producción de ácidos orgánicos como el
piruvato, succinato y fumarato utilizando una Candida shehatae, podrían ser los responsables
en la disminución en el pH con limitación de oxígeno. En la figura 58a, se obtuvo un
130
consumo máximo del 89.15 ± 0.22 % ligeramente superior a lo obtenido al tratamiento 1, la

mayor producción de alcohol se obtiene a los dos días (31.73 ± 0.14 g/L) a este tiempo se tiene
un consumo del 100, 74 y 60 % para la glucosa, sacarosa y galactosa. Porcentajes similares en
este tiempo se obtuvieron para fructosa.
30 100
100 b)
a) 4

25
80
80
20 3
60
Etanol (g/L)
Y Data
60
15
2
40
40
10
1
20 20
5
0 0 0 0
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
Se obtuvo una velocidad de consumo de glucosa de 0.073±0.011 g/Lh (tabla 29), superior a lo
obtenido en el tratamiento 1, también fue el azúcar que se consumió a mayor velocidad,
seguido por la fructosa. La xilosa no se consumió en su totalidad (78.00 ± 0.14 %), esto difiere
a lo obtenido en el tratamiento 1. La arabinosa tuvo un consumo lento durante los 4 días de
fermentación alcanzando un máximo consumo de 62.64 ± 0.83 %, inferior a lo obtenido en el
tratamiento 1.
los tratamientos 1, 2, 3 y 4 con variaciones en la aireación.
Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4
CAM* (200 rpm, 0.25 vvm) (200 rpm, 0.50 vvm) (300 rpm, 0.25 vvm) (300 rpm, 0.50 vvm)
Azúcar* TAC** µs*** TAC** µs*** TAC** µs*** TAC** µs***
(%)
(%) (g/Lh) (%) (g/Lh) (%) (g/Lh) (%) (g/Lh)
GLU 51 100±0.00 0.068±0.011 100±0.00 0.073±0.011 100±0.00 0.074±0.011 100±0.00 0.175±0.034
FRU 30 67.42±0.64 0.079±0.015 73.64±1.41 0.055±0.005 85.39±0.30 0.038±0.006 90.47±3.33 0.068±0.013
GAL 8 100±0.00 0.029±0.004 93.56±0.43 0.036±0.007 73.86±0.89 0.061±0.014 96.33±0.23 0.052±0.008
SAC 2 100±0.00 0.034±0.009 100±0.00 0.039±0.010 100±0.00 0.044±0.008 94.71±4.20 0.023±0.005
ARA 7 65.97±2.12 0.051±0.005 62.64±0.83 0.037±0.004 46.05±2.86 0.038±0.006 40.90±2.95 0.183±0.026
XIL 2 100±0.00 0.043±0.006 78.00±0.14 0.047±0.004 77.56±2.85 0.068±0.010 95.94±0.08 0.039±0.007
*GLU: glucosa, SAC: sacarosa, FRU: fructosa, GAL: galactosa, XIL: xilosa, ARA: arabinosa , CAM:
131
En la figura 58b, se observa el comportamiento celular en el tratamiento 2, donde la cepa LR4

mostró un comportamiento típico el primer día de fermentación, después de la adición de la
cepa T1 se observó un crecimiento constante hasta los 2.5 días donde se observó una
proporción de alrededor del 50 % para ambas cepas. Después de los 3 días la cepa LR4
predominó el resto de la fermentación. Con respecto al pH se observó de nuevo una
disminución constante durante el crecimiento de los microorganismos. Las proporciones
finales fueron de alrededor del 55 % para la cepa LR4 y 45 % para la cepa T1.
En la figura 59a, se muestra el porcentaje de consumo de azúcar en mezcla y la producción de

alcohol para el tratamiento 3, donde se obtuvo un consumo total de azúcar del 88.86 ± 0.65 %,
similar a lo obtenido en en el tratamiento 1. La glucosa y la sacarosa son consumidas en su
totalidad después del segundo día para la glucosa y del tercer día para la sacarosa, velocidad
más alta de consumo de azúcar se obtuvo en un glucosa con 0.074 ± 0.011 g/Lh siendo la
mayor velocidad de consumo obtenido en el tratamiento 3. Martiniano y col., (2013) comenta
que las levaduras prefieren el consumo de glucosa por encima de las pentosas. La xilosa es
consumida en un 78 % con una velocidad de consumo (0.068 ± 0.010 g/Lh) superior al de la
arabinosa. En todos los tratamientos la arabinosa es el azúcar que se consume de último, esto
podría ser debido a que los microorganismos prefieren el consumo de hexosas seguido de
xilosa y arabinosa.
100
100
a) b) 4
30
80
80
3
Etanol (g/L)
60
60 20
pH
2
40
40
10
20 20 1
0 0 0
0
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
132
En la figura 59b, se observa el crecimiento celular en porcentaje de las cepas LR4 y T1 en el

tratamiento 3, donde se obtuvo porcentajes similares 0.5 días antes que lo obtenido en el
tratamiento 2, donde también la cepa LR4 se mantuvo en mayor proporción durante los dos
días siguientes de fermentación. Oberoi y col., (2010) observaron la disminución en el pH al
utilizar la cepa Candida tropicalis, en la sacarificación y fermentación de una mezcla de
azúcares.
En la figura 60a, se muestra el porcentaje de consumo en el tratamiento 4, donde obtuvo un

consumo del 92.49 ± 0.97 %, este valor es superior a lo obtenido en los tres tratamientos
anteriores pero por debajo a lo obtenido en el hidrolizado. A los dos días se tenía un consumo
alrededor del 80 % para la glucosa, galactosa y fructosa, donde al final de la fermentación
llegan a un consumo superior al 90 %, la glucosa es el único azúcar que se consume en su
totalidad, éste presenta una velocidad de consumo de 0.175 ± 0.034 g/Lh, el más alto en todos
los sistemas empleados. Cabe destacar que la xilosa se consumió al 95 % con la velocidad más
baja de consumo (0.039 ± 0.007g/Lh) presentado en todos los tratamientos. El xilitol es
producido necesariamente como cofactor regenerativo con la finalidad de mantener el
equilibrio redox celular a partir de xilosa (Martiniano y col., 2013).También Chandel y col.,
(2007) menciona que el xilitol puede ser reabsorbido por la célula para su crecimiento.
100
100 b)
a) 4
30
80
80
3
60
Etanol (g/L)
60 20
pH
2
40
40
10
20
1
20
0 0 0 0
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
133
En la figura 60b, se muestra el comportamiento celular en porcentaje donde a los 1.5 días se
observa que las cepas LR4 y T1 llegan a un porcentaje del 50 %, esta proporción se obtiene
antes que los tres tratamientos anteriores, una alta agitación y aireación beneficiaría un
crecimiento similar para ambos microorganismos.
En la figura 61, se observan las gráficas de Pareto para los parámetros cinéticos de producción
de alcohol, se observó en la figura 61a que los fatores de agitación y la aireación tienen un
efecto significativo en la producción de alcohol. En la figura 61b, se indica que la agitación
tiene un efecto significativo sobre el rendimiento y en la figura 61c, se muestra que la
agitación, la aireación y su interacción tienen un efecto significativo en la productividad
máxima.
a) Gráfica de Pareto para la producción de alcohol (g/L) b) Gráfica de Pareto para Yp/s
+ +
- -
A:Agitación A:Agitación
B:Aireación AB
AB B:Aireación
0 4 8 12 16 20 0 1 2 3 4

35 Aireación (vvm)
0.25
0.50
P ro du cc ión d e a lco ho l (g /L )
+
-
A:Agitación 33
31
B:Aireación
29
AB
27
0 10 20 30 40 50 200 300
Efectos estandarizados Agitación (rpm)
Figura 61. Gráficas de Pareto para a) producción de alcohol, b) Yp/s, c) Pmáx y d) gráfica de interacción para
producción de alcohol el diseño 22 en mezcla de azúcares
Con la gráfica de interacción (figura 61d) se observa que la mayor producción de alcohol se
obtiene a las condiciones de 200 rpm y 0.25 vvm.
134
7.6.3 Cinética de fermentación de un hidrolizado de limón persa (Citrus latifolia)
Las cepas LR4 y T1 en cultivo secuencial ( 1 día) a las condiciones tratamiento 4 (tabla 10)
que comprende una temperatura de 35o C, 200 rpm y 0.25 vvm resultaron ser los parámetros
más adecuados para fermentar el hidrolizado de limón persa (Citrus latifolia), que contiene un
total de 26.83 ± 0.36 g/L de azúcares fermentables y se enriqueció el medio ajustando la
concentración de fósforo y nitrógeno a 350 mg/L para lograr obtener la mayor producción de
alcohol.
En la figura 62a, se observó un consumo máximo del 98.13 ± 0.4 % del total de azúcares
presentes en el hidrolizado. Donde después de dos días se tenía un consumo del 94, 80 y 78 %
de glucosa, fructosa y sacarosa, respectivamente. Lo que representa un consumo del 90 % del
total de azúcares presentes en el medio, esto es superior a las cinéticas en medios mínimos y
mezcla de azúcares de los diseños anteriores. La baja concentración de azúcares iniciales pudo
haber beneficiado el consumo a alta velocidad de todos los azúcares al no presentarse
represión catabólica por las hexosas.
100
14 b) 14
a)
100
12
80 12
80 10 10
Etanol (g/L)
60
8 8
60 pH
6 40 6
40
4 4
20
20
2 2
0 0 0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 0 2 4 6
Figura 62. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol en el hidrolizado de limón
persa. Sacarosa (círculo rojo), Glucosa (círculo naranja), Xilosa (triángulo inverso verde claro), Galactosa
(triángulo verde oscuro), Arabinosa (cuadrado azul turquesa), Fructosa (cuadrado azul marino) y Etanol
(cuadrado con cruz). b) Porcentaje de mezcla de las levaduras, LR4 (círculo rojo), T1 (círculo naranja) y pH
(círculo azul).
La glucosa es el principal azúcar consumido, seguido de la fructosa y la xilosa. A los 1.16 días
(tabla 31) que se obtuvo la mayor producción de alcohol, se tenía un consumo total de 75.30 ±
1.49 % donde la glucosa fue el azúcar que ayudó a la obtención de la máxima concentración
135
de alcohol ya que se tenía un consumo del 88 %, el resto de los azúcares tenían un consumo de
alrededor del 50 %. A partir del día y medio se observa una disminución en la concentración
de alcohol, éste fenómeno se presenta en la mayoría de las cinéticas de fermentación. Zhao y
col., (2008) mencionan que el alcohol producido es consumido por los microorganismos. Abbi
y col., (1996) también reportan este fenómeno al utilizar una cepa de Candida shehatae, donde
observó la utilización de alcohol como fuente de carbono, eventualmente consumiéndose en su
totalidad en el reactor. También se reporta un crecimiento regular en la biomasa de una C.
shehatae después del consumo total de xilosa a las 24 h, con la utilización de etanol como
fuente de carbono para el crecimiento metabólico (Chandel y col., 2007).
En la tabla 30, se observa el consumo total de azúcar y las velocidades de consumo en el

hidrolizado de limón persa, se observa un consumo total de la glucosa, fructosa, sacarosa y
xilosa y un consumo del 89.44 ± 0.99 % de arabinosa. La presencia de galactosa no fue
detectada. La velocidad de consumo más alta se obtuvo con glucosa con 0.082 ± 0.011 g/Lh,
similar a lo obtenido en la velocidad de consumo de este azúcar en la cinética de fermentación
sin ajuste de pH. Pero el valor se encuentra por debajo a lo obtenido en la cinética donde se
utilizó una agitación (300 rpm) y aireación (0.5 vvm) superior a las utilizadas en la
fermentación de los residuos cítricos (0.175 ± 0.034 g/Lh).
Tabla 30. Consumo total de azúcar y velocidades en el consumo de sustrato en el hidrolizado de limón persa
Hidrolizado
CAM* (1 día de inóculo (T1), 200 rpm y 0.25 vvm
Azúcar* µs***
(%)
TAC** (%)
(g/Lh)
GLU 11.98±0.61 100±0.00 0.082±0.011
FRU 6.83±0.34 100±0.00 0.042±0.009
GAL ND ND ND
SAC 1.09±0.01 100±0.00 0.051±0.011
ARA 4.74±0.44 89.44±0.99 0.064±0.010
XIL 2.18±0.40 100±0.00 0.078±0.016
concentración de azúcar en el medio.
***µ s: Velocidad del consumo de sustrato total determinados por los ajustes al modelo de Gompertz (R2>0.95).
ND: no detectado.
136
En la figura 62b, se muestra el comportamiento celular en el hidrolizado de limón persa,

donde a la cepa LR4 le benefició el suministro de aire (0.25 vvm) al reactor debido a que la
población siempre se mantuvo superior al de la cepa T1. Debido a que no se modificó el pH la
fermentación se llevó a cabo a un pH de 4.7, éste se mantuvo durante los primeros dos días de
crecimiento debido al buffer de citrato en el que se contenía el hidrolizado al momento de ser
entregado. A partir de los 2.5 días se tuvo un aumento de pH hasta alcanzar un valor de 8.0.
Liu y col., reportan que la presencia de CO2 y H+ en el medio podría tener a la formación de
carbonatos (CO32-) que podrían alcalinizar los sistemas. También se reporta que
probablemente se deba a la lisis celular (Elmahdi y col., 2003).
La mayor producción de alcohol se obtiene en el tratamiento 1 (tabla 31), la aireación

benefició la productividad donde en el tratamiento 2 se obtienen los mejores resultados,
aunque ambos resultados estuvieron por debajo de la máxima producción obtenida a nivel
matraz. El Yp/s (tabla 31) obtenido en el hidrolizado es similar a lo obtenido por Hickert y
col., (2013) al utilizar un cultivo mixto de S. cerevisiae y C. shehatae en un bioreactor al
utilizar un hidrolizado de cáscara de arroz (0.44 g/g). También es similar al obtenido por
Martin y col., (2010) al utilizar hidrolizados de residuos de árboles de olivo (0.44 g/g).
Martiniano y col., reportan un rendimiento de 0.30 (g/g) a partir de bagazo de caña de azúcar.
Tabla 31. Consumo total de azúcar y velocidades en el consumo de sustrato en las cinéticas en el bioreactor de 3
L con mezcla de azúcares e hidrolizado cítrico
Producción Producción máxima
Yp/s Etanol Productividad
Trat TAC* (%) alcohol µp** (g/Lh)
(g/g) (g/L.d)
(g/L) t (d) CS*** (%)
Sin control
80.62±0.43 30.88±0.07 0.36±0.01 0.035±0.003 4.00 80.62±0.43 7.72±0.02
de pH
Con control
89.48±2.83 30.29±0.14 0.35±0.02 0.033±0.003 4.00 89.48±2.83 7.57±0.04
de pH
Trat 1 88.04±0.34 34.34±0.25 0.40±0.01 0.170±0.39 2.25 82.27±1.30 15.26±0.11
Trat 2 89.15±0.22 31.73±0.14 0.40±0.01 0.189±0.052 2.00 79.17±0.73 15.87±0.04
Trat 3 88.86±0.65 31.46±0.18 0.37±0.03 0.153±0.029 3.00 86.73±0.98 10.48±0.06
Trat 4 92.49±0.97 27.50±0.14 0.32±0.01 0.081±0.016 2.00 84.53±2.84 13.75±0.07
Hidrolizado 98.13±0.04 11.71±0.02 0.44±0.01 0.145±0.010 1.16 75.30±1.49 10.09±0.02
** µ p: Velocidad de producción de alcohol determinados por los ajustes al modelo de Gompertz (R2>0.95).
137
En la figura 63, se muestra la gráfica de medias para la producción de alcohol y productividad

en todos los sistemas probados en el bioreactor. En la figura 63a, se observa que el
tratamiento 1 (sección 7.6.2) presenta la mayor producción de alcohol con una diferencia
significativa y la más baja es lo obtenido en el hidrolizado, esto se debe a la baja
concentración de azúcares fermentables. En la figura 63b, la mayor productividad se obtienen
en los tratamientos 2 y seguido por el 1 (sección 7.6.2), aunque se encuentran por debajo a lo
obtenido a nivel matraz. El hidrolizado presenta mejores resultados en productividad a los
mostrados por las cinéticas similares al matraz en el reactor con y sin ajuste de pH, el empleo
de aireación benefició en la obtención de mejores resultados de productividad.
a) b)
Figura 63. Gráfica de medias para a) Producción de alcohol y b) Pmáx de todos los sistemas probados a nivel
bioreactor de 3 L
Las cepas LR4 (Candida tropicalis) y T1 (Candida glabrata) tienen la capacidad de fermentar
hexosas y pentosas por lo que muestran un alto potencial para la fermentación de hidrolizados
de residuos cítricos, por lo que es necesario optimizar las condiciones de fermentación y lograr
escalar estos procesos.
138
CONCLUSIONES
8.- CONCLUSIONES
En la evaluación de la capacidad fermentativa de microorganismos silvestres, las cepas

Candida glabrata (LR2, LR5, T1) y Candida tropicalis (LR4) resultaron ser adecuadas para
su uso en la fermentación de los carbohidratos reportados para los residuos cítricos, y de un
hidrolizado de limón persa para la producción de alcohol.
Las condiciones de fermentación variaron para cada microorganismo, ya que con agitación se
propició el aumento de la biomasa celular y sin agitación la producción de alcohol, a pesar de
esta diferencia, todas las cepas probadas presentaron una alta eficiencia en la producción de
alcohol a partir de glucosa, sin una diferencia significativa.
Al fermentar una mezcla de azúcares a las proporciones reportadas presentes en los residuos
cítricos, se obtuvo con la cepa Candida glabrata (T1) los mejores resultados de crecimiento
con base en el peso seco (2.07 ± 0.07 g/l). La cepa Candida glabrata (LR2) tuvo velocidades
de consumo más altas para glucosa, fructosa y xilosa. Con la cepa Candida tropicalis (LR4) se
obtuvo el máximo porcentaje de consumo (90.67 ± 0.17 %) del total de la mezcla de azúcares
(100 g/l), seguido por la cepa Candida glabrata (T1). Asimismo la cepa LR4, obtuvo una
productividad máxima de alcohol de 3.92 ± 0.53 g/Ld, sin una diferencia significativa entre las
cepas; la cepa Candida glabrata (T1) obtuvo la mayor velocidad de producción de alcohol con
0.047 ± 0.007 g/Lh.
Debido a que las cepas Candida tropicalis (LR4) y Candida glabrata (T1) presentaron un
perfil más amplio de asimilación, una mayor producción de alcohol, un mejor consumo de
sustrato y alta velocidad de producción de alcohol en la fermentación de azúcares individuales
y en mezcla, fueron seleccionadas para la formulación de cultivos mixtos, donde, con los
esquemas evaluados, se obtuvo una mejor asimilación de azúcar y una mayor productividad de
alcohol en comparación con las cepas individuales. El esquema de cultivo mixto secuencial
(CC3) mostró una mejor asimilación de azúcares totales del 85.2 ± 2.0 %, teniendo valores
significativamente diferentes entre los esquemas propuestos (P<0.05). La productividad fue
mayor en los cultivos mixtos CC2 y CC3, con 7.7 ± 0.29 y 7.8 ± 0.44 g/ld, respectivamente.
139
CONCLUSIONES
Con el esquema secuencial que consistió en inocular la cepa Candida tropicalis (LR4) al
inicio de la fermentación y 24 h después la cepa Candida glabrata (T1) con agitación se
obtuvieron los mejores resultados de productividad (19.02 ± 0.28 g/ld) y la mayor velocidad
de producción de alcohol (0.184 ± 0.057 g/lh). La complementación metabólica de las cepas
en cultivo mixto mejoraron la conversión de una mezcla de azúcares y como consecuencia el
aumento de la utilización de sustrato y la productividad, por lo que el uso de cultivos mixtos
ha resultado ser una buena estrategia para la fermentación de una mezcla de azúcar similar a la
reportada para los residuos cítricos. Con el esquema secuencial en un bioreactor de 3L, se
obtuvo una disminución en la productividad y en la concentración de alcohol a lo ya obtenido
a nivel matraz. El ajuste del pH benefició una mayor consumo total de azúcar (89.48 ± 2.83
%) pero con resultados en productividad y concentración de alcohol similares a los obtenidos
sin ajuste de pH.
La interacción de la aireación y la agitación tuvieron un efecto significativo sobre la

producción de alcohol y la productividad máxima al fermentar la mezcla de azúcares en el
bioreactor de 3 L, ya que al utilizar las condiciones más altas de aireación y agitación se
observó una mejoría en el consumo de la mezcla de azúcares (92.49 ± 0.97 %) y con los
valores más bajos de agitación y aireación se logró obtener la mayor producción de alcohol
(34.34 ± 0.25 g/L). Por lo que cierta aireación es necesaria para estimular el crecimiento y
Al fermentar un hidrolizado de limón persa, se obtuvo un rendimiento de 0.44 ± 0.01 g/g

similar a lo reportado al fermentar otros residuos lignocelulósicos. La baja cantidad de alcohol
producido (11.71 ± 0.02 g/l) se debió a la concentración de azúcares fermentables presentes en
el hidrolizado de limón persa, muy por debajo a lo reportado, por lo que es necesario seguir
trabajando en la obtención de un método combinado fisicoquímico y enzimático que dé altos
rendimientos de sacarificación ya que los microorganismos de forma individual y en cultivos
mixtos pueden potencialmente ser utilizados para la asimilación de las hexosas y pentosas
presentes. Es necesario seguir evaluando las condiciones más adecuadas para fermentar los
carbohidratos en los hidrolizados de residuos cítricos y lograr una alta productividad de
alcohol.
140
RECOMENDACIONES
9.- RECOMENDACIONES
Para la conservación adecuada de las levaduras empleadas, es indispensable comparar

técnicas, para garantizar que las características fisiológicas no se modifiquen.
Aunque las levaduras denominadas como Candida glabrata presentaron distintas capacidades
fermentativas, es necesario identificar la variedad de cada una de ellas con la finalidad de
obtener información más específica de ellas para posteriormente lograr un mejor desempeño
en los procesos de fermentación.
A partir de las condiciones ya establecidas en los distintos diseños factoriales para la

fermentación de carbohidratos, se sugiere la optimización por superficie de respuesta de las
distintas etapas, así como de las distintas necesidades nutricionales necesarias para el
crecimiento y fermentación de carbohidratos por los microorganismos utilizados.
Es necesario seguir trabajando en la etapa de hidrólisis de los residuos de limón persa para
aumentar el contenido inicial de carbohidratos fermentables, debido a que al utilizar un
método combinado de HCl con una enzima celulolítica (Novozyme) se obtuvo una baja
concentración de carbohidratos fermentables, se recomienda la comparación de diferentes
métodos térmicos junto con un método químico variando la utilización de diferentes ácidos o
bases y posteriormente un consorcio enzimático a diferentes concentraciones.
Se recomienda realizar cultivos mixtos con las cepas no seleccionadas para ello, con la
finalidad de observar los perfiles de consumo en mezclas de carbohidratos, ya que la sinergia
de sus rutas metabólicas podría beneficiar en la obtención de una mayor producción de
alcohol, mejores rendimientos, productividad y el aprovechamiento de un porcentaje más alto
de los carbohidratos presentes.
Para monitorear con mayor exactitud el consumo de azúcar y la producción de alcohol, así
como para la determinación de otros compuestos como el xilitol y ácidos orgánicos que se
141
RECOMENDACIONES
producen durante la fermentación, se sugiere utilizar técnicas como la cromatografía líquida

de alta resolución (HPLC) y la cromatografía de gases (CG) en todas las etapas del proceso.
Puesto que se obtuvieron buenos rendimientos y productividades en la producción de etanol,

se recomienda escalar los procesos de fermentación a escala planta piloto y nivel industrial
tratando de reproducir los resultados obtenidos.
142
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153
ANEXOS 1- TÉCNICAS ANALÍTICAS
11.- ANEXO 1 TÉCNICAS ANALÍTICAS
Método del ácido dinitrosalicílico (DNS)
Para llevar a cabo la determinación de azúcares reductores libres se utilizó el método de ácido
dinitrosalicílico DNS (Miller, 1959).
a) Reactivos utilizados
- 10 g/L Hidróxido de sodio

- 10 g/L Ácido 3, 5 dinitrosalisílico (DNS)
- 200 g/L Tartrato de sodio y potasio
- 2 g/L Fenol
- 0.5 g/L Metabisulfito de sodio
b) Preparación de la solución DNS
Disolver los reactivos en aproximadamente 600 mL de agua destilada, dejando al final el ácido
3, 5 dinitrosalicílico, el cual se debe ir adicionando poco a poco hasta lograr una completa
disolución, posteriormente aforar a un litro con agua destilada.
c) Procedimiento
Adicionar en tubos de ensayo 0.5 mL de muestra, añadirle 1.5 mL de solución de DNS, agitar,
colocar los tubos en baño de agua a punto de ebullición durante 15 min., enfriar a temperatura
ambiente, agregar 8 mL de agua destilada y agitar. Leer absorbancia a 550 nm.
154
d) Curva de calibración
Para hacer la curva de calibración, se utilizó una solución patrón con una concentración de 1
g/L de glucosa anhidra. El rango de concentración a probar fue 0.1 a 1 g/L, se usó también un
blanco, utilizando únicamente agua destilada y se tomó como cero. A cada muestra se le leyó
la absorbancia, a éstos resultados fue necesario someterlos a un análisis de regresión lineal a
fin de predecir la cantidad de azúcares reductores libres presentes en una muestra a partir de
una absorbancia dada. Los resultados deben de multiplicarse por el factor de dilución.
e) Preparación de la muestra
Las muestras tomadas durante las cinéticas en medios líquidos y fermentación, fueron
centrifugadas a 5300 rpm por 20 min. El sobrenadante se vertió en pequeños frascos de vidrio
color ambar y se congelaron a -20 oC hasta su utilización posterior.
Azúcares reductores libres

0.9
0.8 y = 0.8022x - 0.0265
R² = 0.9971
0.7
0.6
Abs 550 nm
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Concentración
155
Determinación de alcohol
La técnica utilizada para la determinación de alcohol, fue por Dicromato de Potasio

(Bohringer, 1964).
a) Reactivos utilizados:
- Dicromato de Potasio (K2Cr2O7) 33.768 g
- Ácido sulfúrico concentrado 323 mL
- Agua destilada 1000 mL
b) Preparación del reactivo
Se diluyó el ácido sulfúrico en aproximadamente 400 mL de agua destilada, se dejó enfriar y

se agregó el dicromato diluído en aproximadamente 200 mL de agua destilada; finalmente, se
aforó con agua destilada a 1000 mL.
c) Procedimiento
A 1 mL de muestra se agregaron 2 mL de solución de dicromato, se agitaron y se dejaron

reposar durante 10 min, después de ese tiempo, se adicionaron 5 mL de agua destilada, se
agitaron nuevamente y por último se determinó la absorbancia a 585 nm.
d) Curva de calibración para la determinación de alcohol
De acuerdo con la densidad y el porcentaje de pureza del etanol, se calcularon los mililitros
necesarios a adicionar a 1 litro de agua destilada para obtener una solución patrón de 20 g/L.
Para realizar la curva de calibración, el rango de análisis de regresión lineal, se obtuvo
entonces, una ecuación, y con ella se cuantificó la cantidad de alcohol presente en las
muestras, a partir de una absorbancia dada.
156
e) Preparación de la muestra
A 5 mL de muestra, se le agregaron 5 mL de agua destilada, esto se destiló en un

Microdestilador de vidrio, cuidando que la temperatura no pasara de los 100 oC a fin de
separar el etanol. Los destilados fueron colocados en frascos color ámbar y congelados a -20
o
C hasta su utilización posterior.
Alcohol
0.9
0.8
0.7
0.6
Abs 585 nm
0.5
y = 0.0503x + 0.0003
R² = 0.9986
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Concentración (g/L)
157
Determinación de los azúcares totales por medio del método de fenol-sulfúrico
Reactivos utilizados:
Ácido sulfúrico concentrado

Fenol 5%
Procedimiento:
A 1mL de la solución problema se le adicionó 1 mL de fenol al 5% enseguida se agregaron 5

mL de ácido sulfúrico con el pipetor de forma brusca para conseguir el efecto de la hidrólisis.
Se dejó enfriar durante 5 min a temperatura a temperatura ambiente, se agita y enseguida se
pone a baño de agua fría durante 10 min. Realizar el mismo procedimiento para el blanco.
Leer absorbancia a 490 nm.
Curva de calibración:
Para hacer la curva de calibración, se utilizó una solución patrón con una concentración de 0.1
g/L de sacarosa. El rango de concentraciones a probar fue 0.01 a 0.1 g/L, se utilizó también un
blanco, utilizando únicamente agua destilada y se tomó como cero. A cada muestra se le leyó
la absorbancia, a éstos resultados fue necesario someterlos a un análisis de regresión lineal
para predecir la cantidad de azúcares totales presentes en las muestra a partir de una
concentración dada.
0.8
0.7 Azúcares totales
0.6
Abs 490 nm
0.5
0.4
0.3 y = 7.3077x + 0.0221
0.2 R² = 0.9981
0.1
0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
Concentración
158
ANEXOS 2- ANÁLISIS ESTADÍSTICO
12.- ANEXO 2 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Determinación de las condiciones medio ambientales para el crecimiento y fermentación

de levaduras silvestres a nivel matraz
Crecimiento
Análisis de varianza para peso seco de la cepa LR2 en YPD
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
A:Temperatura 7.33203 1 7.33203 10.71 0.0056
B:Agitación 2.91067 1 2.91067 4.25 0.0583
AB 7.5272 1 7.5272 10.99 0.0051
Total error 9.58634 14 0.684739
Total (corr.) 27.3563 17
Análisis de varianza para µmáx de la cepa LR2 en YPD

A:Temperatura 0.1083 1 0.1083 0.82 0.3804
B:Agitación 0.0000333333 1 0.0000333333 0.00 0.9875
AB 0.17405 1 0.17405 1.32 0.2701
Total error 1.84806 14 0.132004
Total (corr.) 2.13044 17
Análisis de varianza para Yx/s de la cepa LR2 en YPD

A:Temperatura 0.0200083 1 0.0200083 9.97 0.0070
B:Agitación 0.00853333 1 0.00853333 4.25 0.0582
AB 0.02 1 0.02 9.97 0.0070
Total error 0.0280861 14 0.00200615
Total (corr.) 0.0766278 17
Análisis de varianza para peso seco para la cepa LR2 en YPD – Suma de cuadrados (Tipo 3)
MAIN EFFECTS
A:Temperatura 8.91963 2 4.45982 36.76 0.0000
B:Agitación 4.2217 2 2.11085 17.40 0.0008
INTERACTIONS
AB 13.1231 4 3.28077 27.04 0.0000
RESIDUAL 1.09185 9 0.121317
TOTAL (CORRECTED) 27.3562 17
Todos los valores de F están basados en la media del error residual al cuadrado

A:Temperatura 11.7612 1 11.7612 11.17 0.0048
B:Agitación 6.27853 1 6.27853 5.96 0.0285
AB 5.20031 1 5.20031 4.94 0.0433
Total error 14.7436 14 1.05312
Total (corr.) 37.9837 17

A:Temperatura 0.3267 1 0.3267 6.28 0.0263
B:Agitación 0.0320333 1 0.0320333 0.62 0.4466
AB 0.0561125 1 0.0561125 1.08 0.3179
blocks 0.03645 1 0.03645 0.70 0.4176
Total error 0.676132 13 0.0520101
Total (corr.) 1.12743 17
159

A:Temperatura 0.016875 1 0.016875 8.80 0.0109
B:Agitación 0.006075 1 0.006075 3.17 0.0984
AB 0.0351125 1 0.0351125 18.32 0.0009
blocks 0.0002 1 0.0002 0.10 0.7518
Total error 0.0249153 13 0.00191656
Total (corr.) 0.0831778 17
Análisis de varianza para peso seco de la cepa LR4 en YPD – Suma de cuadrados (Tipo 3)
MAIN EFFECTS
A:Temperatura 11.9081 2 5.95407 58.72 0.0000
B:Agitación 9.53054 2 4.76527 47.00 0.0000
INTERACTIONS
AB 15.6325 4 3.90811 38.54 0.0000
RESIDUAL 0.91255 9 0.101394

A:Temperatura 4.21268 1 4.21268 7.21 0.0178
B:Agitación 0.3888 1 0.3888 0.67 0.4284
AB 6.39031 1 6.39031 10.93 0.0052
Total error 8.18432 14 0.584595
Total (corr.) 19.1761 17

A:Temperatura 0.190008 1 0.190008 7.14 0.0182
B:Agitación 0.258133 1 0.258133 9.70 0.0076
AB 0.00405 1 0.00405 0.15 0.7023
Total error 0.372386 14 0.026599
Total (corr.) 0.824578 17

A:Temperatura 0.0108 1 0.0108 6.51 0.0231
B:Agitación 0.00300833 1 0.00300833 1.81 0.1996
AB 0.01805 1 0.01805 10.88 0.0053
Total error 0.0232361 14 0.00165972
Total (corr.) 0.0550944 17
Análisis de varianza para peso seco de la cepa LR5 en YPD – Suma de cuadrados (Tipo 3)
MAIN EFFECTS
A:Temperatura 4.73348 2 2.36674 54.13 0.0000
B:Agitación 2.73991 2 1.36996 31.33 0.0001
INTERACTIONS
AB 11.3092 4 2.82731 64.67 0.0000
RESIDUAL 0.3935 9 0.0437222
160
Análisis de varianza para peso seco de la cepa T1 en YPD

A:Temperatura 4.8387 1 4.8387 8.70 0.0106
B:Agitación 0.350208 1 0.350208 0.63 0.4408
AB 3.96211 1 3.96211 7.12 0.0184
Total error 7.79078 14 0.556484
Total (corr.) 16.9418 17
Análisis de varianza para µmáx de la cepa T1 en YPD

A:Temperatura 0.000533333 1 0.000533333 0.03 0.8721
B:Agitación 0.0012 1 0.0012 0.06 0.8093
AB 0.01445 1 0.01445 0.73 0.4077
Total error 0.277617 14 0.0198298
Total (corr.) 0.2938 17
Análisis de varianza para Yx/s de la cepa T1 en YPD

A:Temperatura 0.0075 1 0.0075 5.98 0.0283
B:Agitación 0.00240833 1 0.00240833 1.92 0.1874
AB 0.00845 1 0.00845 6.74 0.0211
Total error 0.0175528 14 0.00125377
Total (corr.) 0.0359111 17
Análisis de varianza para peso seco de la cepa T1 en YPD – Suma de cuadrados (Tipo 3)
MAIN EFFECTS
A:Temperatura 4.9411 2 2.47055 131.57 0.0000
B:Agitación 6.32823 2 3.16412 168.50 0.0000
INTERACTIONS
AB 5.50347 4 1.37587 73.27 0.0000
RESIDUAL 0.169 9 0.0187778
Fermentación
Análisis de varianza para producción de alcohol de la cepa LR2 en YPD

A:Temperatura 16.4502 1 16.4502 3.89 0.0686
B:Agitación 17.9585 1 17.9585 4.25 0.0583
AB 34.8612 1 34.8612 8.25 0.0123
Total error 59.1568 14 4.22548
Total (corr.) 128.427 17
Análisis de varianza para eficiencia de la cepa LR2 en YPD

A:Temperatura 1851.08 1 1851.08 3.93 0.0674
B:Agitación 1849.59 1 1849.59 3.93 0.0675
AB 3473.61 1 3473.61 7.38 0.0167
Total error 6592.61 14 470.9
Total (corr.) 13766.9 17
161
Análisis de varianza para Pmáx de la cepa LR2 en YPD
A:Temperatura 0.616533 1 0.616533 12.88 0.0030
B:Agitación 0.027075 1 0.027075 0.57 0.4645
AB 0.13005 1 0.13005 2.72 0.1215
Total error 0.670119 14 0.0478657
Total (corr.) 1.44378 17
Análisis de varianza para producción de alcohol de la cepa LR2 en YPD – Suma de cuadrados (Tipo 3)
MAIN EFFECTS
A:Temperatura 27.9536 2 13.9768 35.28 0.0001
B:Agitación 24.142 2 12.071 30.47 0.0001
INTERACTIONS
AB 72.7653 4 18.1913 45.91 0.0000
RESIDUAL 3.5658 9 0.3962
Análsis de varianza para producción de alcohol de la cepa LR4 en YPD

A:Temperatura 108.12 1 108.12 20.69 0.0005
B:Agitación 0.946408 1 0.946408 0.18 0.6774
AB 0.0300125 1 0.0300125 0.01 0.9407
blocks 0.202672 1 0.202672 0.04 0.8469
Total error 67.9202 13 5.22463
Total (corr.) 177.219 17

A:Temperatura 12065.0 1 12065.0 21.80 0.0004
B:Agitación 82.3204 1 82.3204 0.15 0.7055
AB 4.35125 1 4.35125 0.01 0.9306
Total error 7748.89 14 553.492
Total (corr.) 19900.6 17

A:Temperatura 1.81741 1 1.81741 51.99 0.0000
B:Agitación 0.00653333 1 0.00653333 0.19 0.6721
AB 0.0006125 1 0.0006125 0.02 0.8966
Total error 0.489407 14 0.0349576
Total (corr.) 2.31396 17
MAIN EFFECTS
A:Temperatura 121.394 2 60.697 62.17 0.0000
B:Agitación 17.2545 2 8.62727 8.84 0.0075
INTERACTIONS
AB 29.784 4 7.44599 7.63 0.0058
RESIDUAL 8.78695 9 0.976328
162
Análisis de varianza para producción de alcohol de la cepa LR5 en YPD
A:Temperatura 43.9684 1 43.9684 18.91 0.0007
B:Agitación 23.3523 1 23.3523 10.05 0.0068
AB 27.2322 1 27.2322 11.71 0.0041
Total error 32.5459 14 2.3247
Total (corr.) 127.099 17

A:Temperatura 4019.78 1 4019.78 10.93 0.0052
B:Agitación 1705.99 1 1705.99 4.64 0.0492
AB 3232.48 1 3232.48 8.79 0.0102
Total error 5149.58 14 367.827
Total (corr.) 14107.8 17

A:Temperatura 0.730133 1 0.730133 3.28 0.0917
B:Agitación 0.0161333 1 0.0161333 0.07 0.7918
AB 0.112812 1 0.112812 0.51 0.4884
Total error 3.11832 14 0.222737
Total (corr.) 3.9774 17
MAIN EFFECTS
A:Temperatura 49.4518 2 24.7259 330.46 0.0000
B:Agitación 28.0902 2 14.0451 187.71 0.0000
INTERACTIONS
AB 48.8834 4 12.2208 163.33 0.0000
RESIDUAL 0.6734 9 0.0748222
Análisis de varianza para producción de alcohol de la cepa T1 en YPD

A:Temperatura 31.6875 1 31.6875 22.22 0.0003
B:Agitación 21.2534 1 21.2534 14.90 0.0017
AB 19.1271 1 19.1271 13.41 0.0026
Total error 19.9684 14 1.42631
Total (corr.) 92.0364 17
Análisis de varianza para eficiencia de la cepa T1 en YPD

A:Temperatura 438.504 1 438.504 23.03 0.0003
B:Agitación 487.178 1 487.178 25.58 0.0002
AB 461.624 1 461.624 24.24 0.0002
Total error 266.605 14 19.0432
Total (corr.) 1653.91 17
Análisis de varianza para Pmáx de la cepa T1 en YPD

A:Temperatura 0.795675 1 0.795675 51.28 0.0000
B:Agitación 0.00403333 1 0.00403333 0.26 0.6181
AB 0.148512 1 0.148512 9.57 0.0079
Total error 0.217207 14 0.0155148
Total (corr.) 1.16543 17
163
Análisis de varianza para production de alcohol de la cepa T1 en YPD – Suma de cuadrados (Tipo 3)
MAIN EFFECTS
A:Temperatura 33.1355 2 16.5678 318.64 0.0000
B:Agitación 27.7474 2 13.8737 266.83 0.0000
INTERACTIONS
AB 30.6856 4 7.67139 147.54 0.0000
RESIDUAL 0.46795 9 0.0519944
Obtención del perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados en

medio sintético
Prueba preliminar de asimilación de carbohidratos
Tabla de ANOVA para galactosa según cepa

Between groups 53.4225 3 17.8075 8.75 0.0313
Within groups 8.13885 4 2.03471
Total (Corr.) 61.5614 7
Tabla de ANOVA para fructosa según cepa

Between groups 226.005 3 75.3351 8.22 0.0348
Within groups 36.6724 4 9.1681
Total (Corr.) 262.678 7
Perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados

Análisis de varianza para peso seco según el diseño 4 x 7
A:Cepas 0.157938 1 0.157938 2.02 0.1615
B:Azúcar 7.08583 1 7.08583 90.52 0.0000
AB 0.150429 1 0.150429 1.92 0.1716
Total error 4.07066 52 0.0782819
Total (corr.) 11.4649 55
Análisis de varianza para peso seco según el diseño 4 x 7 – Suma de cuadrados (Tipo 3)
MAIN EFFECTS
A:Cepa 8661.5 3 2887.17 36.65 0.0000
B:Azúcar 87495.4 6 14582.6 185.09 0.0000
INTERACTIONS
AB 12552.5 18 697.361 8.85 0.0000
RESIDUAL 2206.0 28 78.7857
TOTAL (CORRECTED) 110915. 55
Análisis de varianza para producción de alcohol según el diseño 4 x 7

A:Cepas 5.81472 1 5.81472 1.69 0.1998
B:Azúcar 389.084 1 389.084 112.87 0.0000
AB 7.78222 1 7.78222 2.26 0.1390
Total error 179.258 52 3.44727
Total (corr.) 581.939 55
164
Análisis de varianza para producción de alcohol según el diseño 4 x 7 – Suma de cuadrados (Tipo 3)
MAIN EFFECTS
A:Cepa 25.1219 3 8.37398 555.16 0.0000
B:Azúcar 506.298 6 84.383 5594.23 0.0000
INTERACTIONS
AB 50.0969 18 2.78316 184.51 0.0000
RESIDUAL 0.42235 28 0.0150839
Modificación del esquema de propagación

Tabla de ANOVA para peso seco en glucosa según cepa
Between groups 3.4317 7 0.490243 225.40 0.0000
Within groups 0.0174 8 0.002175
Total (Corr.) 3.4491 15
Tabla de ANOVA para producción de alcohol en glucosa según cepa

Between groups 153.807 7 21.9725 352.72 0.0000
Within groups 0.49835 8 0.0622937
Total (Corr.) 154.306 15
Tabla de ANOVA para peso seco en galactosa según cepa

Between groups 0.3263 7 0.0466143 31.60 0.0000
Within groups 0.0118 8 0.001475
Total (Corr.) 0.3381 15
Tabla de anova para producción de alcohol en galactosa según cepa

Between groups 1.7739 7 0.253414 215.67 0.0000
Within groups 0.0094 8 0.001175
Total (Corr.) 1.7833 15
Evaluación de la capacidad fermentativa de cultivos individuales y mixtos en mezclas de

azúcares
Comparación de dos medios de fermentación

Análisis de varianza para peso seco según la comparación de medios – Suma de cuadrados (Tipo 3)
MAIN EFFECTS
A:CEPAS 3.67205 1 3.67205 173.01 0.0002
B:MEDIOS 0.1922 1 0.1922 9.06 0.0396
INTERACTIONS
AB 0.2592 1 0.2592 12.21 0.0250
RESIDUAL 0.0849 4 0.021225
165
Análisis de varianza para producción de alcohol según la comparación de medios – Suma de cuadrados (Tipo 3)
MAIN EFFECTS
A:CEPAS 10.2604 1 10.2604 169.95 0.0002
B:MEDIOS 43.5244 1 43.5244 720.90 0.0000
INTERACTIONS
AB 24.0818 1 24.0818 398.87 0.0000
RESIDUAL 0.2415 4 0.060375
Fermentación con cultivos individuales

Tabla de ANOVA para peso seco según cepa en mezcla de azúcares
Between groups 3.37414 3 1.12471 317.94 0.0000
Within groups 0.01415 4 0.0035375
Total (Corr.) 3.38829 7
Tabla de ANOVA para µmáx según cepa en mezcla de azúcares

Between groups 0.0428375 3 0.0142792 1.90 0.2708
Within groups 0.03005 4 0.0075125
Total (Corr.) 0.0728875 7
Tabla de ANOVA para producción de alcohol según cepa en mezcla de azúcares

Between groups 257.663 3 85.8877 10.13 0.0243
Within groups 33.9038 4 8.47596
Total (Corr.) 291.567 7
Tabla de AVOVA para Pmáx según cepa en mezcla de azúcares

Between groups 1.80794 3 0.602646 5.27 0.0712
Within groups 0.45775 4 0.114438
Total (Corr.) 2.26569 7
Fermentación con cultivos mixtos

Tabla de ANOVA para producción de alcohol según cultivos mixtos en mezcla de azúcares
Between groups 19.4977 2 9.74885 2.64 0.2179
Within groups 11.0673 3 3.6891
Total (Corr.) 30.565 5
Tabla de ANOVA para Pmáx según cultivos mixtos en mezcla de azúcares

Between groups 5.8453 2 2.92265 28.04 0.0114
Within groups 0.3127 3 0.104233
Total (Corr.) 6.158 5
166
Establecimiento de las condiciones de fermentación con cultivos mixtos en medio

Análisis de varianza para producción de alcohol según el diseño 4 x 3
A:Tiempo de inoculo (d) 1.66616 1 1.66616 0.07 0.7981
B:Agitación (rpm) 86.9556 1 86.9556 3.51 0.0758
AB 0.080645 1 0.080645 0.00 0.9551
Total error 495.987 20 24.7994
Total (corr.) 584.69 23
Análisis de varianza para Pmáx según el diseño 4 x 3

B:Agitación (rpm) 71.0649 1 71.0649 11.62 0.0028
AB 86.1955 1 86.1955 14.10 0.0012
Total error 122.282 20 6.11409
Total (corr.) 412.768 23
Análisis de varianza para Yp/s según el diseño 4 x 3

B:Agitación (rpm) 0.011025 1 0.011025 8.79 0.0077
AB 0.000125 1 0.000125 0.10 0.7556
Total error 0.0250967 20 0.00125483
Total (corr.) 0.04785 23
Análisis de varianza para porcentaje de consume según el diseño 4 x 3

B:Agitación (rpm) 33.005 1 33.005 5.87 0.0250
AB 26.2892 1 26.2892 4.68 0.0429
Total error 112.443 20 5.62213
Total (corr.) 275.079 23
Análisis de varianza para producción de alcohol según el diseño 4 x 3 – Suma de cuadrados (Tipo 3)
MAIN EFFECTS
A:Agitación 385.644 2 192.822 42.42 0.0000
B:Tiempo de inóculo 2.1911 3 0.730367 0.16 0.9207
INTERACTIONS
AB 82.0171 6 13.6695 3.01 0.0495
RESIDUAL 54.5479 12 4.54566
Análisis de varianza para Pmáx según el diseño 4 x 3 – Suma de cuadrados (Tipo 3)

MAIN EFFECTS
A:Agitación 80.0959 2 40.048 314.92 0.0000
B:Tiempo de inóculo 194.102 3 64.7008 508.79 0.0000
INTERACTIONS
AB 134.45 6 22.4084 176.21 0.0000
RESIDUAL 1.526 12 0.127167
167
Evaluar la capacidad fermentativa del cultivo mixto seleccionado en un hidrolizado de

residuos cítricos a nivel fermentador de 3 L
Cinéticas de crecimiento con diferentes niveles de aireación y agitación

Análisis de varianza para producción de alcohol según el diseño 22
A:Agitacón 25.2761 1 25.2761 376.97 0.0000
B:Aireación 21.5825 1 21.5825 321.89 0.0001
AB 0.91125 1 0.91125 13.59 0.0211
Total error 0.2682 4 0.06705
Total (corr.) 48.0379 7
Análisis de varianza para Pmáx según el diseño 22

A:Agitacón 23.805 1 23.805 2144.59 0.0000
B:Aireación 7.5272 1 7.5272 678.13 0.0000
AB 3.5378 1 3.5378 318.72 0.0001
Total error 0.0444 4 0.0111
Total (corr.) 34.9144 7
Análisis de varianza para Yp/s según el diseño 22

A:Agitacón 0.00605 1 0.00605 10.08 0.0337
B:Aireación 0.00125 1 0.00125 2.08 0.2224
AB 0.00125 1 0.00125 2.08 0.2224
Total error 0.0024 4 0.0006
Total (corr.) 0.01095 7
Análisis de varianza para producción de alcohol según el diseño 22 – Suma de cuadrados (Tipo 3)
MAIN EFFECTS
A:Agitacón 25.2761 1 25.2761 376.97 0.0000
B:Aireación 21.5825 1 21.5825 321.89 0.0001
INTERACTIONS
AB 0.91125 1 0.91125 13.59 0.0211
RESIDUAL 0.2682 4 0.06705
Producción de alcohol y productividad en todos los sistemas probados en el bioreactor

Tabla de ANOVA para la producción de alcohol según todos los sistemas probados en el bioreactor
Between groups 689.423 6 114.904 2529.33 0.0000
Within groups 0.318 7 0.0454286
Total (Corr.) 689.741 13
Tabla de ANOVA para la Pmáx según todos los sistemas probados en el bioreactor
Between groups 142.101 6 23.6835 3369.61 0.0000
Within groups 0.0492 7 0.00702857
Total (Corr.) 142.15 13
168
ANEXOS 3- PRESENTACIONES EN CONGRESOS
13.- ANEXO 3 PRESENTACIONES EN CONGRESOS
169
170
171
172
173
174
175
176
177
178
179
180
181
182
183

Raziel de Jesús Estrada Martínez

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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN

TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.

ESTUDIO DE LA CAPACIDAD FERMENTATIVA DE

MAESTRO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA

MÉRIDA, YUC. DICIEMBRE 2013

ESTUDIO DE LA CAPACIDAD FERMENTATIVA DE

Presenta: Q. Raziel Jesús Estrada Martínez

Directora de Tesis: Dra. Ingrid Mayanín Rodríguez Buenfil

Co-Directora de Tesis: Dra. María de los Ángeles Sánchez Contreras

Asesora: Dra. Neith Aracely Pacheco López

Asesora: M. C. Tania González Flores

Se estudió la capacidad fermentativa de microorganismos silvestres de la especie Candida

6.4 Obtención del perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados en

7.3.1 Prueba preliminar de asimilación de carbohidratos ........................................... 76

ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLA

Tabla 1. Composición de la biomasa lignocelulósica (Ingram y col., 1999) .............................. 7

Tabla 18. Parámetros cinéticos en la comparación de dos medios de fermentación ................. 99

Figura 1. Estructura de la celulosa .............................................................................................. 8

Figura 47. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para el

A mi madre y mis hermanos, quienes siempre creyeron

A Dios que me brindó la oportunidad de culminar otra

Al Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco A. C.,

Al CONACYT por la beca otorgada, con numero de apoyo 327301.

Al Fondo Mixto CONACYT-Gobierno del Estado de Yucatán, Convocatoria 2011-C09 (Clave

A la M. C. Tania González Flores, por su apoyo, amistad y colaboración en el desarrollo de la

La producción de bioetanol (CH3CH2OH) a partir de biomasa lignocelulósica ayudaría a

Los residuos biomásicos contienen mayoritariamente celulosa, hemicelulosa y pectinas,

También la modificación de algunos de los factores fisicoquímicos en el proceso de

La levadura Saccharomyces cerevisiae utilizada a nivel industrial, no puede asimilar pentosas

Debido al inminente agotamiento de las reservas petroleras, aunado a la problemática mundial

La mayoría de los microrganismos de uso industrial están patentados y no están disponibles

El uso de microrganismos con un amplio perfil de asimilación de carbohidratos permitirá

4.1 Objetivo general

Determinar la capacidad fermentativa de microrganismos silvestres en cultivos mixtos, para la

4.2 Objetivos específicos

1.- Determinar las condiciones medio ambientales para el crecimiento y fermentación de

2.- Obtener el perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados en medio

3.- Evaluar la capacidad fermentativa de cultivos individuales y mixtos en mezclas de

5.- Evaluar la capacidad fermentativa del cultivo mixto seleccionado en un hidrolizado de

5.1 Biomasa lignocelulósica

La producción de alcohol a partir de la biomasa, es una forma de reducir el uso de derivados

La introducción de biocombustibles sería especialmente importante para el sector del

Tabla 1. Composición de la biomasa lignocelulósica (Ingram y col., 1999)

5.1.1 Composición de la biomasa lignocelulósica

La lignocelulosa (celulosa, hemicelulosa y lignina) es el principal y más abundante

La celulosa (figura 1) es un componente lineal estructural de la pared celular de una planta

La celulosa es el polímero orgánico más abundante, con una composición de

Figura 1. Estructura de la celulosa (Deguchi y col., 2006)

La hemicelulosa (figura 2) es una estructura amorfa y variable formada de heteropolímeros

Figura 2. Estructura de la hemicelulosa (Girio y col., 2010)

La lignina (Figura 3) es un heteropolímero amorfo, aromático, rígido, tridimensional y

La lignina es el polímero natural más complejo en relación a su estructura y heterogeneidad.

Figura 3. Estructura de la lignina (Aro y col., 2005)

5.1.2 Biomasa cítrica para la producción de etanol

En el estado de Florida (EUA) se generan alrededor de 10 millones de toneladas de naranja al

Boluda-Aguilar y col., en (2010) y (2013), estudiaron la fermentación de residuos de

mandarina fue de 50-60 L/1000 kg de cáscara de mandarina fresca y de D-Limoneno de 0.02

Para reducir el consumo de petróleo crudo y la contaminación del medio ambiente, la

El uso de gasohol (etanol y la mezcla de gasolina) es una de las alternativas que se ha

El etanol, a diferencia de la gasolina, es un combustible oxigenado que contiene 35% de

El uso de bioetanol como combustible de transporte se refiere a la combustión de la mezcla de

Sin embargo, la producción de etanol es un proceso complicado. La transformación de

La formación de etanol utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae a partir de sustratos

5.2.1 Bioetanol de segunda generación