Caracterización molecular de O. guerinii, O. cyanolaemus y O.

stubelii
mediante la amplificación del gen mitocondrial Citocromo C Oxidasa
subunidad I (COI)

Laura Margarita Granada Acosta

Universidad de Caldas

Facultad de Ciencias Naturales y Exactas

Laboratorio Biología Molecular

Paula Andrea Ossa López, M.Sc. PhD(C)

Diciembre de 2023

Manizales, Caldas
 Caracterización molecular de O. guerinii, O. cyanolaemus y O. stubelii
mediante la amplificación del gen mitocondrial Citocromo C Oxidasa
subunidad I (COI)

Resumen

En este trabajo se pretende determinar las diferencias o similitudes entre las tres especies
y/o poblaciones de Oxypogon presentes en Colombia, mediante técnicas moleculares, como
lo es el análisis del gen Citocromo C Oxidasa (COI) en cada población; ya que su
diferenciación taxonómica esta basada en evaluaciones morfométricas, análisis de canto y
color del plumaje.
Se resalta la necesidad e importancia de realizar comparaciones genotípicas en estos casos
y se espera que las poblaciones (ahora llamadas especies) pertenezcan a la misma especie.

Palabras clave: Gen, PCR, Molecular, Población, COI, Mitocondrial.

Planteamiento del problema y pregunta de investigación

La especie Oxypogon guerinii está presente en los páramos de Colombia, está dividida en
cuatro poblaciones distintas: cyanolaemus, guerinii y stubelii. Su caracterización se ha
realizado desde su variación morfológica, como grabaciones de vocalizaciones, plumaje y
biometría (Collar & Salaman, 2013); pero no se ha realizado un análisis molecular entre
individuos de estas poblaciones para evaluar si se trata de la misma especie, aunque un
comité de la Unión Americana de Ornitólogos (AOU, por sus siglas en inglés), llamado el
South American Classification Committee (SACC), quien tiene la misión de evaluar la
sistemática (o nombres y tratamiento taxonómico) de las aves de Suramérica; deliberó
acerca
de este trabajo y aceptó tratar a Oxypogon como cuatro especies válidas . Por ello, se
plantea la pregunta: ¿Las tres poblaciones de Oxypogon guerinii en Colombia pertenecen a
la misma especie o pueden considerarse diferentes especies?

Justificación

Analizar molecularmente estas poblaciones de la misma especie nos permite tener más
información sobre su taxonomía y evolución, y para comprender su filogenia (Avise 2000;
Runge et al. 2007; Barlow et al. 2011) , lo cual ampliará el panorama en la interpretación de
componentes ecológicos e implementar estrategias para la conservación de Oxypogon
guerinii.

Marco teórico

Oxypogon es un género de colibríes de la familia Trochilidae. Está distribuida en los

páramos de Colombia y Venezuela (Oxypogon Gould 1848 - Encyclopedia of Life, s. f.), y
cuenta con tres especies: Oxypogon guerinii, Oxypogon cyanolaemus y Oxypogon stubelii
(Gill, Frank; Donsker, David & Rasmussen, Pamela, 2020).

Descripción de Oxypogon guerinii (Boissonneau, 1840), traducido del Francés

“Longitud total: 10 centímetros. Desde el pico 8 milímetros. De la cola 4 centímetros. -
Partes superiores de un verde oscuro. Debajo de un blanco sucio; garganta manchada de
marrón, así como los lados del pecho donde estas manchas tienen reflejos verdes, el blanco
de la parte baja del cuello sube a cada lado en un pequeño collar que se termina casi en la
mitad de la parte inferior del cuello; cola grande bastante bifurcada, de un verde cobrizo
brillante, con la mitad de las plumas blancas, a excepción de las dos intermedias que son de
color verde oscuro; alas un poco más cortas que la cola, negruzcas bastante oscuras con
reflejos violáceos, con pequeñas coberteras verdes; pico recto y negro; patas negras.
Esta ave parece ser sólo un macho o una hembra joven; pero se distingue fácilmente por lo
extremadamente corto de su pico.”

Ecología
Varios investigadores sugieren que algunas comunidades de colibríes y flores particulares
exhiben patrones en morfología y fenología que muestran adaptaciones evolutivas
relacionadas con la competencia entre las especies de cada grupo y relaciones mutualistas
entre las aves y las flores polinizadas(Stiles 1975, Gutiérrez-Z. 2008) . Los colibríes se
alimentan además de néctar, de pequeños artrópodos diariamente para suplir sus
necesidades de proteínas y vitaminas Baker
& Baker 1982, Hainsworth & Wolf 1976).
Es notable que O. guerinii forrajea principalmente en flores de asteráceas. Esta familia se
destaca por su alta diversidad en el páramo: en este ecosistema existen cuatro veces más
especies y dos veces más géneros de Asteraceae que de Poaceae (Ricardo Salamanca,
2011).

Distribución: Oxypogon guerinii Se distribuye desde 3200 hasta 5200 m de altura sobre el
nivel del mar desde el norte de la cordillera Oriental hacia eL norte hasta el departamento
de Cundinamarca.
Figura 1. Distribución Oxypogon guerinii. Wikiaves Icesi.(2023) Oxypogon guerinii
(Bearded Helmetcrest) (Eds.). WikiAves Icesi

Oxypogon cyanolaemus se encuentra en las montañas de Santa Marta, al norte de

Colombia, donde permanece entre los 3000–4800 m (Todd & Carriker 1922).
Figura 2. Distribución Oxypogon cyanoleamus. Wikiaves Icesi.(2023) Oxypogon
cyanolaemus (Blue-bearded Helmetcrest) (Eds.). WikiAves Icesi

Oxypogon stubelii está en el centro de Colombia (Nevado del Ruiz en la frontera Tolima-
Caldas).

Figura 3. Distribución de Oxypogon stubelii. Wikiaves Icesi.(2023) Oxypogon stuebelii

(Buffy Helmetcrest) (Eds.). WikiAves Icesi

Oxypogon lindenii es una especie de ave de la familia Trochilidae, endémica de los

páramos de la Sierra de Mérida, en Venezuela.

Gen Citocromo Oxidasa Subunidad I

El gen mitocondrial Citocromo Oxidasa I, es la subunidad principal del complejo
Citocromo C Oxidasa (Figura 4.), se encuentra en bacterias y en la mitocondria de
eucariotas, es la última enzima en la cadena de transporte de electrones respiratorios y a
menudo se usa como un código de barras de DNA para identificar especies animales debido
a que tiene una tasa alta de sustitución, presentando variación de la secuencia entre especies
del mismo género (Hebert et al., 2003a; Hebert et al., 2003b; Luo et al., 2011).

Figura 4. Complejo proteico transmembrana: Estructura del citocromo c (color verde),

portador de electrones desde el complejo III al complejo IV y el complejo IV conocido
como citocromo c oxidasa (color púrpura).

Se presenta como un método taxonómico estandarizado, empleando secuencias cortas de

DNA, siendo una herramienta de investigación rápida, económica y muy aceptada entre la
comunidad científica, ya que solo requiere de pequeñas muestras del espécimen, por lo que
no es necesario sacrificar a los individuos colectados para su identificación. Además de
ello, refleja una variación intraespecífica de un gran número de especies en el mundo y
complementa la taxonomía tradicional.
En la última década, estudios realizados en grupos animales como aves, peces, mamíferos,
lepidópteros, hemípteros y otros insectos han demostrado que el fragmento COI presenta
una variación interespecífica lo suficientemente amplia para permitir una buena
correspondencia entre la identificación molecular y la identificación basada en caracteres
morfológicos de las especies (Hebert et al., 2003c; Hebert et al., 2004; Ward et al., 2005;
Borisenko et al., 2008; Park et al., 2011).

Objetivos
 Determinar mediante pruebas moleculares las diferencias genotípicas entre las
cuatro poblaciones de O. guerinii.
 Explicar las posibles causas de sus diferencias fenotípicas presentes en las cuatro
poblaciones.

Materiales y métodos

Área de muestreo
Se realizarán los muestreos en las zonas descritas anteriormente, en la distribución de las
poblaciones de O. guerinii

Capturas. Se capturarán individuos de O. guerinii, O. lindenii, O. cyanolemus y O. stubelii

con cinco redes de niebla con ojo de malla de 30 mm, todas de 9x3 m. Las aves serán
capturadas en las ubicaciones antes mencionadas para tomar 3 mL de sangre a cada
individuo de cada población a comparar, la sangre fue conservada congelada o en etanol
utilizando el kit DNeasy® Blood and tissue de QIAGEN.

PCR. En este procedimiento me basaré en el procedimiento de Stermin et al. (2014). Se

amplificará un fragmento de la subunidad I de Citocromo Oxidasa (COI) mediante PCR, el
único gen utilizado por Tavares et al. (2010) que mostró variabilidad notable. Se diseñarán
los siguientes primers, Forward 5´ - TGATTATTCTAAACTAACCACAAG - 3´ y Revers
5´ - TCAGATACAAGTAAGGT - 3´, flanqueando un fragmento de 582 pb. Las reacciones
de PCR se realizarán en un volumen total de 20 µL que contiene 1,8 de solución tampón
10x BH4 (Bioline), 4,5 mM MgCl2, 0,3 µL de cada cebador, 0,2 µM de dNTP, 0,5U de
Taq (Bioline), 20 - 50 ng de ADN y agua. Las condiciones de la PCR serán: una
desnaturalización inicial a 94°C para 5 min, 36 ciclos de 94°C durante 40 segundos, 47°C
durante 40 segundos y 72°C durante un minuto, y una extensión final a 72°C durante 7
minutos.

Purificación y electroforesis. Los productos de la PCR se purificarán enzimáticamente

utilizando exonucleasa I y fosfatasa alcalina de camarón. También, los productos de la PCR
serán dispuestos en gel de Poliacrilamida para facilitar su visualización, separando
fragmentos según su tamaño.

Secuenciación del ADN. Las secuencias serán obtenidas de un analizador genético Applied
Biosystems 3130xl.

Análisis Bioinformático. Las secuencias serán analizadas utilizando software

bioinformático para compararlas y determinar diferencias y/o similitudes, construir árboles
filogenéticos para revisar las relaciones evolutivas entre las especies, mediante el uso del
software Geneious Prime, con el cual también se realizarán árboles filogenéticos.

Interpretación de resultados. Determinar si hay diferencias significativas entre las

especies de aves estudiadas para proporcionar información sobre la diversidad genética y
las relaciones evolutivas entre las poblaciones de aves.

Productos esperados en la investigación

Se espera que las tres poblaciones de Oxypogon en Colombia pertenezcan a la misma
especie, puesto que su caracterización ha sido netamente con datos biométricos, plumaje, y
cantos, lo cual no es suficiente para determinar si corresponden o no a la misma especie.
En cuanto a la diferencia de cantos, se tiene que una misma especie puede presentar
diferencias gracias a cuatro razones:
1. Aprendizaje Vocal: Muchas aves aprenden sus cantos a través de la imitación. El
proceso de aprendizaje vocal puede llevar variaciones individuales en la interpretación y
reproducción de los cantos. Al igual que con los humanos, hay variaciones en la forma en
que aprenden y se imitan sonidos (Marler 1970).
2. Ambiente acústico: El entorno en el que crece un ave puede influir en su canto. Si
un ave crece en un área con una variedad de sonidos, puede incorporar elementos de esos
sonidos en su canto, llevando variaciones entre individuos de la misma especie (Hipótesis
de Adaptación Acústica; Morton 1975, Rothstein & Fleischer 1987).
3. Selección sexual: En muchas especies, los cantos de machos juegan un papel muy
importante en la selección de pareja. Las hembras pueden preferir ciertos rasgos de canto, y
esto puede conducir a la evolución de variaciones dentro de una poblaciones (Darwin y las
ciencias del comportamiento, s. f.)
4. Variación geográfica: Las poblaciones de aves separadas geográficamente a
menudo desarrollan diferencias en sus cantos. Esto puede deberse a la falta de intercambio
genético entre poblaciones distantes (Gonzalez, 2014).

En cuanto a la diferencia de la coloración del plumaje en una misma especie de aves se

tiene que los principales pigmentos que confieren la variedad de colores existentes al
plumaje de las aves son las melaninas y los carotenoides. Los carotenoides varían desde el
amarillo pálido, pasando por la gama del naranja, al rojo escarlata (Mc Graw & Nogare,
2004). Son adquiridos con la dieta y transformados en pigmentos mediante la acción de
enzimas (Mahler et al., 2003). En cuanto a las melaninas existen dos tipos: la eumelanina
(responsable de los colores negro, gris y castaño oscuro) y la feomelanina (responsable de
plumas color castaño rojizo) (Mc Graw et al., 2005).
La formación de melaninas es una reacción de oxidación, donde, mediante la acción de la
enzima tirosinasa, el aminoácido tirosina se convierte en dichos compuestos. A mayor
grado de oxidación, la coloración resulta más oscura (Hearing, 1993).
Por todo lo anterior, en este trabajo se resalta la importancia de un análisis molecular de
estas tres poblaciones para reconocer y comprender sus diferencias y/o similitudes
genotípicas.
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