2012.calculo en Biologia Molecular y Biotecnologia STEPHENSON 2ed

Cálculo en biología molecular
y biotecnología
A mis padres Mary y Dude, a mi esposa Laurie
y a mi apreciada hija Myla.
Cálculo en biología molecular
y biotecnología
Guía de matemáticas para el laboratorio
Segunda edición
ZZZPHGLOLEURVFRP
Frank H. Stephenson
A m s te r d a m B a r c e lo n a B e ijin g B o sto n F ila d e lf ia L o n d res M a d rid

M é x ic o M il á n M u n ic h O rla n d o P a r ís Rom a S id n e y T o k io T o ro n to
«á f \
--.K'ILu
ELSEVIER
E d ic ió n e n e s p a ñ o l d e la s e g u n d a e d ic ió n d e la o b r a o rig in a l e n in g lé s
C a lc u la t io n s f o r M o le c u l a r B io lo g y a n d B io te c h n o lo g y : A G u id e t o M a th e m a ti c s in th e
L a b o ra to ry
C o p y r ig h t © 2 0 1 0 E ls e v ie r In c . A ll r ig h ts re s e rv e d
Traducción:
J o r g e L lo b e r a s C a v e r o
A n n a b e l V a l le d o r F e r n á n d e z
P ro f e s o r e s A g re g a d o s d e In m u n o lo g ía ,
D e p a rta m e n to d e F is io lo g ía e In m u n o lo g ía , F a c u lta d d e B io lo g ía ,
U n iv e rs ita t d e B a rc e lo n a
Revisión científica:
F ra n c e sc V e n tu ra P u jo l
J o s é L u is R o sa L ó p ez
P ro f e s o r e s d e B io q u ím ic a y B io lo g ía M o le c u la r,
D e p a rta m e n to d e C ie n c ia s F is io ló g ic a s n ,
U n iv e rs ita t d e B a rc e lo n a
© 2 0 1 2 E ls e v ie r E s p a ñ a , S.L .
T r a v e s s e r a d e G rá c ia , 1 7-21 - 0 8 0 2 1 B a r c e lo n a , E s p a ñ a
F o t o c o p ia r e s u n d e lito ( A r t. 2 7 0 C .P .)
P a ra q u e e x ista n lib ro s e s n e c e s a r io e l tr a b a jo d e u n im p o rta n te c o le c tiv o ( a u to re s, tra d u c to re s,
d ib u ja n te s , c o rr e c to r e s , im p re so re s, e d ito res...)- E l p r in c ip a l b e n e f ic ia r io d e e se e s fu e rz o e s el
le c to r q u e a p ro v e c h a s u c o n te n id o .
Q u ie n fo to c o p ia u n ü b ro , e n la s c irc u n sta n cia s p re v is ta s p o r la ley, d e lin q u e y c o n trib u y e a la « n o »
e x iste n c ia d e n u e v a s ed icio n e s. A d e m á s, a c o rto p la z o , e n c a re c e e l p re c io d e la s y a ex isten tes.
E s te lib ro e s tá le g a lm e n te p r o te g id o p o r lo s d e re c h o s d e p r o p ie d a d in te le c tu a l. C u a lq u ie r u so
fu e ra d e lo s lím ite s e s ta b le c id o s p o r la le g isla c ió n v ig e n te , s in e l c o n s e n tim ie n to d e l e d ito r, e s
ile g al. E s to se a p lic a e n p a rtic u la r a la r e p r o d u c c ió n , fo to c o p ia , tra d u c c ió n , g r a b a c ió n o c u a lq u ie r
o tr o siste m a d e re c u p e r a c ió n d e a lm a c e n a je d e in fo rm a c ió n .
I S B N e d ic ió n o rig in a l: 9 7 8 -0 -1 2 -3 7 5 6 9 0 -9
I S B N e d ic ió n e sp a ñ o la : 9 7 8 - 8 4 -8 0 8 6 - 9 0 9 - 6
P r o d u c c ió n : S e rv ic io s e d ito r ia le s A . P a rra s
Advertencia
L a m e d ic in a e s u n á re a e n c o n s ta n te e v o lu c ió n . A u n q u e d e b e n se g u irs e u n a s p r e c a u c io n e s d e
s e g u rid a d e stá n d a r, a m e d id a q u e a u m e n te n n u e s tr o s c o n o c im ie n to s g ra c ia s a l a in v e stig a c ió n
b á s ic a y c lín ic a h a b rá q u e in tr o d u c ir c a m b io s e n lo s tra ta m ie n to s y e n lo s f á rm a c o s. E n
c o n s e c u e n c ia , s e re c o m ie n d a a lo s le c to re s q u e a n a lic e n lo s ú ltim o s d a to s a p o rta d o s p o r lo s
f a b ric a n te s so b r e c a d a fá r m a c o p a ra c o m p ro b a r la d o s is re c o m e n d a d a , la v ía y d u r a c ió n d e la
a d m in is tra c ió n y la s c o n tra in d ic a c io n e s. E s re s p o n s a b ilid a d in e lu d ib le d e l m é d ic o d e te r m i
n a r la s d o s is y e l tra ta m ie n to m á s in d ic a d o p a ra c a d a p a c ie n te , e n f u n c ió n d e s u e x p e r ie n c ia y
d e l c o n o c im ie n to d e c a d a c a s o c o n c re to . N i lo s e d ito r e s n i lo s d ir e c to r e s a s u m e n r e s p o n s a
b ilid a d a lg u n a p o r lo s d a ñ o s q u e p u d ie ra n g e n e r a r s e a p e rs o n a s o p r o p ie d a d e s c o m o c o n se
c u e n c ia d e l c o n te n id o d e e sta o b ra.
E l e d ito r
índice de capítulos
CAPÍTULO 1 Notación científica y prefijos métricos...........................................................................1

I n tr o d u c c ió n ....................................................................................................................... 1
1.1 D íg ito s s i g n if i c a t i v o s ............................................................................................ 1
1.1.1 R e d o n d e o d e d íg ito s s ig n ific a tiv o s e n lo s c á lc u lo s ....................2
1 .2 E x p o n e n te s y n o ta c ió n c i e n tí f i c a .....................................................................3
1.2.1 E x p re s a n d o n ú m e ro s e n n o ta c ió n c ie n tífic a ..................................3
1.2 .2 C o n v irtie n d o n ú m e ro s e n n o ta c ió n c ie n tífic a
a n o ta c ió n d e c i m a l ................................................................................... 5
1.2.3 S u m a n d o y r e s ta n d o n ú m e ro s esc rito s
e n n o ta c ió n c ie n tí f i c a ..............................................................................6
1 .2 .4 M u ltip lic a n d o y d iv id ie n d o n ú m e ro s e x p re s a d o s
e n n o ta c ió n c ie n tí f i c a ..............................................................................7
1 .3 P re fijo s m é tric o s .................................................................................................... 10
1.3.1 F a c to re s d e c o n v e rs ió n y s im p lific a c ió n d e t é r m i n o s ............ 10
R e s u m e n d e l c a p í tu l o ...................................................................................................14
CAPÍTULO 2 Soluciones, mezclas y medios.......................................................................................... 15

In tr o d u c c ió n .....................................................................................................................15
2.1 C a lc u la n d o d ilu c io n e s : u n a a p ro x im a c ió n g e n e ra l.................................15
2 .2 C o n c e n tr a c io n e s p o r u n fa c to r X .................................................................. 17
2 .3 P re p a ra n d o s o lu c io n e s e n p o r c e n t a j e .......................................................... 19
2 .4 D ilu y e n d o s o lu c io n e s e n p o rc e n ta je ............................................................. 2 0
2 .5 M o le s y p e s o m o le c u la r: d e f in ic io n e s ......................................................... 2 4
2 .5 .1 M o la r id a d ...................................................................................................2 5
2 .5 .2 P re p a ra n d o s o lu c io n e s m o la re s e n a g u a c o n c o m p u e sto s
h id r a ta d o s ...................................................................................................2 8
2 .5 .3 D ilu y e n d o s o lu c io n e s m o l a r e s ......................................................... 3 0
2 .5 .4 C o n v irtie n d o m o la rid a d e n p o r c e n ta je ..........................................32
2 .5 .5 C o n v irtie n d o p o rc e n ta je e n m o l a r i d a d ..........................................33
2 .6 N o r m a lid a d .............................................................................................................. 3 4
2 .7 p H ................................................................................................................................ 35
2 .8 p K a y la e c u a c ió n d e H e n d e rs o n - H a s s e lb a lc h ..........................................4 0
R e s u m e n d e l c a p ítu lo ...................................................................................................43
vi índice de capítulos
CAPÍTULO 3 Crecimiento celular.............................................................................................................. 45

3.1 L a c u r v a d e c re c im ie n to b a c t e r i a n o ......................................................... 45
3.1 .1 D a to s d e la s m u e s tr a s .........................................................................4 9
3 .2 A ju s ta n d o la c o n c e n tra c ió n d e c é l u la s .................................................... 50
3 .3 R e p re s e n ta n d o la D O 550 fre n te a l tie m p o e n u n g rá fic o l i n e a l .... 53
3 .4 R e p re s e n ta n d o el lo g a ritm o d e la D O 550 fre n te a l tie m p o
e n u n g rá fic o lin e a l...........................................................................................5 4
3.4.1 L o g a r i tm o s ............................................................................................. 5 4
3 .4 .2 L a D O 550 d e las m u estra s c o n v e rtid a a v alo re s lo g arítm ico s... 54
3 .4 .3 R e p re s e n ta n d o e l lo g a ritm o d e la D O 550
fre n te al t i e m p o .................................................................................... 5 4
3 .5 R e p re s e n ta n d o e l lo g a ritm o d e la c o n c e n tra c ió n c e lu la r
fre n te a l t i e m p o ................................................................................................. 56
3 .5 .1 C á lc u lo d e l lo g a ritm o d e lo s v a lo r e s ...........................................56
3 .6 C a lc u la n d o e l tie m p o d e g e n e r a c i ó n ........................................................57
3 .6 .1 L a p e n d ie n te y la c o n s ta n te d e c r e c im ie n to .............................57
3 .6 .2 T ie m p o d e g e n e r a c ió n ....................................................................... 58
3 .7 R e p re s e n ta n d o lo s d a to s d e l c re c im ie n to c e lu la r
e n u n g rá fic o s e m ilo g a rítm ic o ....................................... ................... ..................... ............................ 6
3.7 .1 R e p re s e n ta n d o la D O 550 fre n te a l tie m p o e n u n g rá fic o
s e m ilo g a rítm ic o ...................... ................................................... 60
3 .7 .2 C a lc u la n d o el tie m p o d e g e n e ra c ió n a p a r tir d e u n
g rá fic o s e m ilo g a rítm ic o d e la D O 550 fre n te a l t i e m p o ........61
3 .8 R e p re s e n ta n d o la c o n c e n tra c ió n c e lu la r fre n te al tie m p o
e n u n g rá fic o s e m ilo g a rítm ic o .....................................................................6 2
3 .9 C ó m o s e o b tie n e e l tie m p o d e g e n e ra c ió n d ire c ta m e n te
d e u n g rá fic o s e m ilo g a rítm ic o d e la c o n c e n tra c ió n c e lu la r
fre n te a l t i e m p o ................................................................................................. 63
3 .1 0 R e p re s e n ta n d o la d e n s id a d c e lu la r fre n te a la D O 550
e n u n g rá fic o s e m ilo g a rítm ic o .....................................................................64
3.1 1 P ru e b a d e f lu c tu a c ió n ......................................................................................66
3 .1 1 .1 E je m p lo d e la p ru e b a d e f lu c tu a c ió n ........................................ 67
3 .1 1 .2 V a ria n z a ................................................................................................. 69
3 .1 2 C á lc u lo d e la ta s a d e m u ta c ió n ....................................................................71
3 .1 2 .1 E l m o d e lo d e d is tr ib u c ió n d e P o is s o n ......................................71
3 .1 2 .2 C á lc u lo d e la ta s a d e m u ta c ió n m e d ia n te el m o d e lo
d e d is trib u c ió n d e P o i s s o n ............................................................7 2
3 .1 2 .3 A p r o x im a c ió n g rá fic a a l c á lc u lo d e la t a s a d e m u ta c ió n
a p a r tir d e lo s d a to s d e la p ru e b a d e flu c tu a c ió n .................73
3 .1 2 .4 L a ta s a d e m u ta c ió n c a lc u la d a m e d ia n te la e x te n sió n
e n p l a c a s ................................................................................................ 78
índice de capítulos v ii
3 .1 3 C á lc u lo d e la c o n c e n tra c ió n c e lu la r c o n u n h e m o c it ó m e t r o ......... 79
B ib lio g ra fía ....................................................................................................................... 81
CAPÍTULO 4 T ra b a ja n d o con b a c te rió fa g o s ................................................................................... 83

In tr o d u c c ió n .....................................................................................................................83
4.1 M u ltip lic id a d d e in fe c c ió n (m o i) ................................................................... 83
4 .2 P ro b a b ilid a d e s y m u ltip lic id a d d e in fe c c ió n ( m o i ) ............................... 85
4 .3 M e d id a d e l títu lo d e fa g o s ................................................................................ 91
4 .4 D ilu c ió n d e b a c t e r i ó f a g o s ................................................................................ 93
4 .5 M id ie n d o el ta m a ñ o d e e x p l o s i ó n .................................................................95
CAPÍTULO 5 C uantificación d e ác id o s n u c le ic o s .......................................................................... 99

5.1 C u a n tific a c ió n d e á c id o s n u c le ic o s p o r e s p e c tro s c o p ia d e
u ltra v io le ta ............................................................................................................... 99
5 .2 D e te rm in a n d o la c o n c e n tra c ió n d e A D N d e c a d e n a d o b l e ............. 100
5.2 .1 U tiliz a c ió n d e la a b s o r b a n c ia y d e l c o e fic ie n te
d e e x tin c ió n p a r a c a lc u la r la c o n c e n tra c ió n d e A D N
d e c a d e n a d o b l e .................................................................................... 102
5 .2 .2 C a lc u la r la c o n c e n tra c ió n d e A D N c o m o u n a c a n tid a d
m ilim o la r (m M ) .................................................................................... 104
5 .2 .3 D e te rm in a c ió n d e la c o n c e n tra c ió n d e A D N u tiliz a n d o
P ic o G re e n ® ............................................................................................ 105
5 .3 D e te rm in a c ió n d e la c o n c e n tra c ió n d e m o lé c u la s d e A D N
d e c a d e n a s e n c illa ...............................................................................................108
5.3.1 L a c o n c e n tra c ió n d e A D N d e c a d e n a s e n c illa
e x p r e s a d a e n [j,g/m L ........................................................................... 108
5 .3 .2 D e te rm in a c ió n d e la c o n c e n tra c ió n d e A D N d e c a d e n a
s e n c illa d e e le v a d o p e s o m o le c u la r e n p m o l/(x L ....................109
5 .3 .3 C o n c e n tra c ió n d e A D N d e c a d e n a s e n c illa
e x p r e s a d a c o m o m ilim o la r (m M ) ................................................. 110
5 .4 C u a n tific a c ió n d e o lig o n u c le ó tid o s ............................................................111
5.4.1 U n id a d e s d e d e n s id a d ó p t i c a .......................................................... 111
5 .4 .2 E x p re s a n d o la c o n c e n tra c ió n d e u n o lig o n u c le ó tid o
e n [j,g/m L ................................................................................................. 111
5 .4 .3 L a c o n c e n tra c ió n d e u n o lig o n u c le ó tid o e x p re s a d a
e n p m o l/[x L ............................................................................................. 112
5 .5 C á lc u lo d e la c o n c e n tra c ió n d e A R N ........................................................115
v iii índice de capítulos
5 .6 P e s o m o le c u la r, m o la rid a d y ta m a ñ o d e l á c id o n u c l e ic o ................. 115

5 .7 C á lc u lo d e la c o n c e n tra c ió n d e A D N a p a r tir d e u n g e l
te ñ id o c o n b ro m u ro d e e t i d i o ....................................................................... 120
R e s u m e n d e l c a p í tu l o ................................................................................................ 121
CAPÍTULO 6 M areaje d e ác id o s n ucleicos con ra d io is ó to p o s ............................................... 123

In tr o d u c c ió n .................................................................................................................. 123
6.1 U n id a d e s d e ra d ia c tiv id a d : e l c u rio ( C i ) ................................................. 123
6 .2 C á lc u lo d e l n ú m e ro d e c o p ia s d e u n p l á s m i d o .....................................124
6 .3 M a re a je d e l A D N p o r tra s la c ió n d e m e l l a s ............................................ 126
6.3 .1 C á lc u lo d e l p o rc e n ta je d e in c o rp o ra c ió n d e m a rc a
ra d ia c tiv a e n u n a tra s la c ió n d e m e l l a ..........................................127
6 .3 .2 C á lc u lo d e la ra d ia c tiv id a d e s p e c ífic a d e l p ro d u c to
d e la re a c c ió n d e tra s la c ió n d e m e l l a ..........................................128
6 .4 M a re a je d e A D N m e d ia n te c e b a d o re s a l e a t o r i o s .................................128
6.4 .1 M a re a je m e d ia n te c e b a d o re s a le a to rio s : p o rc e n ta je
d e in c o rp o r a c ió n ................................................................................... 129
6 .4 .2 M a re a je m e d ia n te c e b a d o re s ale a to rio s:
c á lc u lo d e l re n d im ie n to t e ó r i c o ..................................................... 130
c á lc u lo d e l re n d im ie n to r e a l ............................................................131
c á lc u lo d e la a c tiv id a d e s p e c ífic a d e l p r o d u c to ...................... 132
6 .5 M a re a je d e l e x tre m o 3 ' c o n la tra n s fe ra s a te rm in a l.............................133
6 .5 .1 M a re a je d e l e x tre m o 3 'c o n la tra n s fe ra s a term in al:
p o rc e n ta je d e in c o r p o r a c ió n ............................................................133
6 .5 .2 M a re a je d e l e x tre m o 3 ' c o n la tra n s fe ra s a term in al:
a c tiv id a d e s p e c ífic a d e l p r o d u c to ................................................. 134
6 .6 S ín te sis d e l A D N c o m p le m e n ta rio ( A D N c ) ...........................................135
6.6.1 S ín te sis d e la p rim e r a c a d e n a d e A D N c .....................................135
6 .6 .2 S ín te sis d e la s e g u n d a c a d e n a d e A D N c ................................... 139
6 .7 A d ic ió n d e c o la s h o m o p o lim é r ic a s ............................................................141
6 .8 T ra n s c rip c ió n in v itr o ....................................................................................... 147
R e s u m e n d e l c a p í tu l o ................................................................................................149
CAPÍTULO 7 S ín te sis d e o lig o n u d e ó tid o s .................................................................................... 155

In tr o d u c c ió n .................................................................................................................. 155
7.1 R e n d im ie n to d e la s ín te s is ..............................................................................156
índice de capítulos ix
7 .2 C á lc u lo d e l re n d im ie n to g ra d u a l y g lo b a l p o r m e d io
d e l e n s a y o d e l c a tió n d im e to x itritilo (D M T )..........................................158
7 .2 .1 R e n d im ie n to g l o b a l .............................................................................159
7 .2 .2 R e n d im ie n to g r a d u a l .......................................................................... 160
7 .3 C á lc u lo d e lo s m ic ro m o le s d e n u c le ó s id o a c o p la d o
e n c a d a c ic lo d e a d ic ió n d e u n a b a s e ........................................................ 161
CAPÍTULO 8 La re acc ió n e n c a d e n a d e la p o lim e ra s a (PCR)............................................... 165

I n tr o d u c c ió n .................................................................................................................. 165
8.1 M o ld e y a m p lif ic a c ió n .................................................................................... 165
8 .2 A m p lific a c ió n e x p o n e n c i a l........................................................................... 167
8 .3 E fic ie n c ia d e la re a c c ió n e n c a d e n a d e la p o lim e ra s a ( P C R ) ......... 170
8 .4 C á lc u lo d e la Tm d e la s e c u e n c ia d i a n a .................................................... 173
8 .5 C e b a d o r e s .............................................................................................................. 176
8 .6 Tm d e l c e b a d o r..................................................................................................... 181
8.6.1 C á lc u lo d e la Tm b a s a d o e n la c o n c e n tra c ió n s a lin a ,
e l c o n te n id o G /C y e l ta m a ñ o d e l A D N .....................................182
8 .6 .2 C á lc u lo d e la Tm b a s a d o e n in te ra c c io n e s e n tre
n u c le ó tid o s a d y a c e n te s ...................................................................... 183
8 .7 D e o x in u c le ó s id o s trifo s fa to ( d N T P ) .........................................................189
8 .8 A D N p o l i m e r a s a ................................................................................................ 191
8.8.1 C á lc u lo d e la ta s a d e e r ro r d e la A D N p o lim e ra s a ................192
8 .9 R e a c c ió n e n c a d e n a d e la p o lim e ra s a (P C R ) c u a n tita tiv a ................195
R e s u m e n d e l c a p í tu l o ................................................................................................ 2 0 7
B ib l i o g r a f í a ................................................................................................................... 2 0 9
L e c tu ra s a d ic io n a le s .................................................................................................. 2 0 9
CAPÍTULO 9 La re acc ió n e n c a d e n a d e la p o lim e ra s a a tie m p o re al (RT-PCR)...........211

I n tr o d u c c ió n .................................................................................................................. 211
9.1 L a s fa s e s d e la P C R a tie m p o r e a l .......................................................... 2 1 2
9 .2 C o n tr o l e s ............................................................................................................2 1 5
9 .3 C u a n tific a c ió n a b s o lu ta m e d ia n te e l e n s a y o T a q M a n ....................2 1 6
9 .3 .1 P re p a ra c ió n d e la s d ilu c io n e s e s tá n d a r .................................... 2 1 6
9 .3 .2 P re p a ra c ió n d e u n a c u r v a e s tá n d a r p a r a la re a c c ió n
e n c a d e n a d e la p o lim e ra s a c u a n tita tiv a (q P C R )
b a s a d a e n e l n ú m e ro d e c o p ia s ....................................................2 2 0
9 .3 .3 L a c u r v a e s t á n d a r ..............................................................................2 2 4
9 .3 .4 D e s v ia c ió n e s t á n d a r .........................................................................2 2 7
9 .3 .5 R e c ta d e re g re s ió n y la c u r v a e s tá n d a r .................................... 2 3 0
x índice de capítulos
9 .4 E fic ie n c ia d e a m p lific a c ió n ....................................................................... 2 3 2

9 .5 M e d ic ió n d e la e x p re s ió n g é n ic a ............................................................. 2 3 6
9 .6 C u a n tific a c ió n re la tiv a : e l m é to d o A A C T ..........................................2 3 8
9.6 .1 E l m é to d o 2~ T: la e le c c ió n d e u n a re fe re n c ia
e n d ó g e n a ...............................................................................................2 3 9
9 .6 .2 E l m é to d o 2 _A A C t: e fic ie n c ia d e a m p lific a c ió n .................. 2 5 0
9 .6 .3 E l m é to d o 2 -A A C t: ¿ e s tá el g e n d e re fe re n c ia
a fe c ta d o p o r e l tra ta m ie n to e x p e r im e n ta l? .............................2 5 9
9 .7 E l m é to d o re la tiv o d e la c u rv a e s t á n d a r ...............................................2 7 6
9.7 .1 M é to d o d e la c u r v a e s tá n d a r p a r a la c u a n tific a c ió n
re la tiv a .................................................................................................... 2 7 6
9 .8 C u a n tific a c ió n re la tiv a s e g ú n c in é tic a d e la r e a c c i ó n ....................2 9 4
9 .9 E l m é to d o R 0 d e c u a n tif ic a c ió n r e la tiv a ...............................................2 9 9
9 .1 0 E l m o d e lo P f a f f l ............................................................................................. 3 0 3
R e s u m e n d e l c a p í tu l o ................................................................................................3 0 6
B ib l i o g r a f í a ................................................................................................................... 3 1 0
L e c tu ra s a d ic io n a le s ...................................................................................................3 1 0
CAPÍTULO 10 ADN recombinante............................................................................................................... 313

In tr o d u c c ió n ................................................................... ..¿.....v........ ..I. 313
10.1 E n d o n u c le a s a s d e r e s tr ic c i ó n ....................................................................313
10.1.1 F re c u e n c ia d e lo s s itio s d e c o rte d e la s e n d o n u c le a s a s
d e r e s tr ic c ió n .................................................................................... 3 1 5
1 0 .2 C á lc u lo d e la c a n tid a d d e e x tre m o s d e f r a g m e n t o .......................... 3 1 6
10.2.1 C a n tid a d d e e x tre m o s g e n e ra d o s p o r m ú ltip le s c o r te s ... 3 1 7
1 0 .3 L i g a c ió n ............................................................................................................. 3 1 9
10.3.1 L ig a c ió n u s a n d o v e c to re s d e riv a d o s d e X ........................... 3 2 2
1 0 .3 .2 E m p a q u e ta m ie n to d e g e n o m a s X r e c o m b in a n te s ............. 3 2 7
10 .3 .3 L ig a c ió n c o n p l á s m i d o s .............................................................. 3 3 0
1 0 .3 .4 E fic ie n c ia d e tra n s f o rm a c ió n ..................................................... 3 3 5
1 0 .4 L ib re ría s g e n ó m ic a s : ¿ c u á n to s c lo n e s s o n n e c e s a r io s ? ................. 3 3 6
1 0 .5 L ib re ría s d e A D N c : ¿ c u á n to s c lo n e s s o n s u f i c i e n te s ? .................. 3 3 7
1 0 .6 L ib re ría s d e e x p r e s ió n ..................................................................................3 3 9
1 0 .7 A n á lis is d e lib re ría s re c o m b in a n te s p o r h ib rid a c ió n
a s o n d a s d e A D N ...........................................................................................3 4 0
10.7.1 S o n d a s d e o lig o n u c le ó tid o s ........................................................ 3 4 2
1 0 .7 .2 C o n d ic io n e s d e h ib r id a c ió n ........................................................3 4 4
1 0 .7 .3 H ib rid a c ió n c o n s o n d a s d e A D N d e c a d e n a
d o b le (A D N c d ).................................................................................3 5 0
índice de capítulos xi
1 0 .8 M e d ic ió n d e fra g m e n to s d e A D N p o r e le c tro fo re s is e n g e l ........351

1 0 .9 G e n e ra c ió n d e d e le c io n e s a n id a d a s m e d ia n te la n u c le a s a
B A L 3 1 .............................................................................................................. 3 5 9
B ib l i o g r a f í a ................................................................................................................... 3 6 7
CAPÍTULO 11 P ro te ín a ............................................................................................................................ 3 6 9
I n tr o d u c c ió n .................................................................................................................. 3 6 9
11.1 C á lc u lo d e l p e s o m o le c u la r d e u n a p ro te ín a a p a r tir
d e s u s e c u e n c ia ............................................................................................. 3 6 9
1 1 .2 C u a n tific a c ió n d e p ro te ín a m e d ia n te la m e d id a
d e la a b s o r b a n c ia a 2 8 0 n m .....................................................................373
1 1 .3 U s o d e lo s c o e fic ie n te s d e a b s o r b a n c ia y d e e x tin c ió n
p a r a e s tim a r la c o n c e n tra c ió n d e p r o t e í n a ........................................ 3 7 4
11.3.1 R e la c ió n e n tre e l c o e fic ie n te d e a b s o rb a n c ia
y e l c o e fic ie n te d e e x tin c ió n m o l a r ......................................3 7 7
1 1 .3 .2 D e te rm in a c ió n d e l c o e fic ie n te d e e x tin c ió n d e u n a
p ro te ín a .............................................................................................3 7 8
1 1 .4 R e la c ió n e n tre la c o n c e n tra c ió n e n m ilig ra m o s p o r m ililitro
y la m o l a r i d a d ...............................................................................................3 8 0
1 1 .5 C u a n tific a c ió n d e p ro te ín a m e d ia n te A 280 c u a n d o e x is te n
á c id o s n u c le ic o s c o n ta m in a n te s ............................................................3 8 2
1 1 .6 C u a n tific a c ió n d e p ro te ín a a 2 0 5 n m ................................................. 38 3
1 1 .7 C u a n tific a c ió n d e p ro te ín a a 2 0 5 n m c u a n d o e x is te n á c id o s
n u c le ic o s c o n ta m in a n te s ........................................................................... 38 3
1 1 .8 M e d ic ió n d e la c o n c e n tra c ió n d e p ro te ín a p o r e n s a y o
c o lo rim é tric o : e l e n s a y o B ra d f o rd ........................................................38 5
1 1 .9 U tiliz a c ió n d e la (3 -g alac to sid asa p a r a la m o n ito riz a c ió n
d e la a c tiv id a d d e u n p ro m o to r y la e x p r e s ió n g é n ic a .................3 8 7
11.9.1 A n á lis is d e la (3 -g alac to sid asa e n c u ltiv o s c e lu la r e s ..... 38 8
11 .9.2 A c tiv id a d e s p e c íf ic a ....................................................................3 9 0
11 .9.3 A n á lis is d e la (3 -g alac to sid asa a p a r tir d e e x tra c to s
c e lu la re s p u rific a d o s ....................................................................3 9 0
1 1 .1 0 C ro m a to g ra fía d e c a p a f in a (T L C ) y e l fa c to r
d e re te n c ió n (R f) ...........................................................................................3 9 2
11 .1 1 E s tim a c ió n d e l p e s o m o le c u la r d e u n a p ro te ín a
p o r filtra c ió n e n g e l .................................................................................... 3 9 4
1 1 .1 2 E l e n s a y o d e c lo ra n fe n ic o l a c e tiltra n s fe ra s a ( C A T ).....................3 9 9
11.12.1 C á lc u lo d e la s m o lé c u la s d e c lo ra n fe n ic o l
ac e tiltra n s fe ra s a (C A T )............................................................401
x ii índice de capítulos
1 1 .1 3 U tiliz a c ió n d e la lu c ife ra s a e n u n e n s a y o d e g e n i n d i c a d o r ..... 4 0 3

1 1 .1 4 T ra d u c c ió n in vitro: d e te rm in a c ió n d e la in c o rp o ra c ió n
d e a m in o á c id o s ............................................................................................. 4 0 4
1 1 .1 5 E l p u n to is o e lé c tric o (p l) d e u n a p r o t e í n a ........................................ 4 0 5
B ib l i o g r a f í a ................................................................................................................... 411
CAPÍTULO 12 Centrifugación ............................................................................................................... 4 1 3

In tr o d u c c ió n .................................................................................................................. 4 1 3
12.1 F u e rz a c e n trífu g a re la tiv a (F C R ) (f u e rz a g ) ....................................... 4 1 3
12.1.1 C o n v e rs ió n d e la fu e rz a g a re v o lu c io n e s
p o r m in u to ( r p m ) .............................................................................4 1 5
1 2 .1 .2 C á lc u lo d e la fu e rz a g y d e la s re v o lu c io n e s
p o r m in u to (rp m ) u tiliz a n d o u n n o m o g r a m a ...................... 4 1 6
1 2 .2 C á lc u lo d e tie m p o s d e s e d im e n ta c ió n ...................................................4 1 8
B ib l i o g r a f í a ................................................................................................................... 421
L e c tu ra s a d ic io n a le s .................................................................................................. 421
CAPÍTULO 13 Medicina forense y paternidad ..............................................................................4 2 3

In tr o d u c c ió n .................................................................................................................. 4 2 3
13.1 A le lo s y g e n o tip o s ..........................................................................................4 2 4
13.1.1 C á lc u lo d e la s fre c u e n c ia s d e l g e n o tip o ............................... 4 2 5
1 3 .1 .2 C á lc u lo d e la s fre c u e n c ia s d e a le lo s ....................................... 4 2 6
1 3 .2 L a e c u a c ió n d e H a rd y -W e in b e rg y e l c á lc u lo
d e la s fre c u e n c ia s d e g e n o tip o s e s p e r a d a s ..........................................4 2 7
1 3 .3 L a p ru e b a d e c h i-c u a d ra d o : c o m p a ra n d o lo s v a lo re s
o b s e r v a d o s fre n te a lo s e s p e r a d o s .......................................................... 4 3 0
13.3.1 V a ria n z a d e u n a m u e s t r a ............................................................. 4 3 4
1 3 .3 .2 D e s v ia c ió n e s tá n d a r d e u n a m u e s t r a ......................................4 3 5
1 3 .4 L a p ro b a b ilid a d d e in c lu s ió n (P¡) ............................................................4 3 5
1 3 .5 L a p ro b a b ilid a d d e e x c lu s ió n ( P J .......................................................... 4 3 6
1 3 .6 T ip ific a c ió n d e l A D N y p ro m e d io p o n d e r a d o ..................................4 3 7
1 3 .7 L a re g la d e la m u ltip lic a c ió n .....................................................................4 3 8
1 3 .8 ín d ic e d e p a te rn id a d ( I P ) .............................................................................4 3 9
13.8.1 C á lc u lo d e l ín d ic e d e p a te rn id a d (IP ) c u a n d o
n o s e c o n o c e e l g e n o tip o d e la m a d r e ................................... 441
1 3 .8 .2 E l ín d ic e c o m b in a d o d e p a te rn id a d ( I C P ) ........................... 4 4 3
índice de capítulos x iii
B ib l i o g r a f í a ................................................................................................................... 4 4 5
A p é n d ic e A : U s o d e l e x c e l d e m ic ro s o ft p a r a g e n e ra r g r á f i c o s ..........................................4 4 7
In d ic e a lfa b é tic o .......................................................................................................................................4 5 5
A mis padres Mary y Dude, a mi esposa Laurie
y a mi apreciada hija Myla.
Capítulo
Notación científica y prefijos métricos
■ IN T R O D U C C IÓ N
E n u n a cé lu la h a p lo id e h u m a n a h a y ap ro x im a d am en te 3 .0 0 0 .0 0 0 .0 0 0 d e pares de
b ase s d e A D N q u e co n fo rm an su g enom a. S i se aísla el A D N d e e s a c é lu la pesará
ap ro x im a d am en te 0,0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 5 g ra m o s (g). P a ra am p lifica r u n fragm ento
determ in ad o del A D N pu rificad o , utilizan d o la téc n ic a d e la re acc ió n en c a d e n a de
la p o lim e rasa (P C R ), es n ecesario a ñ a d ir 0 ,0 0000000001 m oles de ca d a un o d e los
d os ce b ad o re s a la m ez cla d e re acc ió n , q u e d a rá lugar, tras 30 cic lo s d e P C R , a m ás
d e 1.0 0 0 .000 .0 0 0 d e copias d el frag m en to seleccionado.
E n el trabajo del d ía a d ía, lo s b ió lo g o s m o lecu la res trabajan co n n ú m ero s y
m agnitudes q u e están m u y lejos d e las m ag n itu d es d e la v id a convencional. P ara
facilitar el cálcu lo co n estos v alo re s extrem os, se h an d esa rro llad o d o s m étodos,
que p erm iten tran sfo rm ar en m an e ja b les m agnitudes en o rm e s e infinitesim ales.
E stos m éto d o s u tiliz an la no tac ió n cie n tífic a y lo s p refijos m étricos. P ara ello se
re q u ie re la u tiliz ació n d e e x p o n e n tes y e n te n d er los q u e so n lo s dígitos
significativos.
1.1 D ÍG IT O S S IG N IF IC A T IV O S
D eterm in ad as téc n ic as en b io lo g ía m olecular, así co m o en o tras discip lin a s d e la
cie n cia, se b a sa n en la utiliz ació n d e instrum entos q u e s o n capaces d e d a r m edi
ciones m u y precisas. U n a in dicación d e ese n iv el de pre cisió n lo a p o rta el núm ero
d e d íg ito s q u e se m u estra en la p an ta lla d el instrum ento. L as cifras d e u n a
m ed ició n q u e re presentan los lím ites reales d e p re cisió n se d en o m in an d ígitos
significativos.
A u n q u e u n cero p u ed e se r u n va lo r tan leg ítim o com o lo s n ú m ero s en te ro s del
u n o al nueve, los d íg ito s sig n ificativ o s s o n p o r lo g en e ral diferentes a cero. S in
inform ación so b re có m o s e h iz o u n a m ed ició n o d e la pre cisió n d e los instrum en
to s utilizad o s para su ela b o rac ió n , los ceros a la izq u ierd a d e la co m a detrás d e u n o
o m ás n ú m ero s distin to s de cero se su p o n e q u e n o so n significativos. P o r ejem plo,
al afirm ar q u e el g e n o m a h u m an o es d e 3 .0 0 0 .0 0 0 .0 0 0 pb d e lo n g itu d , el único
díg ito significativo d el nú m ero es el 3. L o s n u ev e ceros n o son significativos. D el
m ism o m o d o , los ceros a la dere c h a del p u n to dec im a l q u e pre ced e a u n a serie de
2 0 1 2 . E ls e v ie r E s p a ñ a , S .L . R e s e rv a d o s to d o s lo s d e re c h o s. 1
2 CAPÍTULO 1 Notación científica y prefijos métricos
dígitos distintos d e cero se su p o n e q u e n o so n significativos. Si determ inam os que

el A D N d en tro d e u n a c é lu la de esp e rm a p e s a 0,0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 5 g , sólo el 3 y el 5
son cifras significativas. L o s 11 ceros a la izq u ierd a d e esto s d íg ito s no son
significativos.
P ro b le m a 1.1 ¿Cuántos dígitos significativos hay en cada una de las

siguientes medidas?
a) 3.001.000.000 pb
b) 0,00304 g
c) 0,000210 litros (L) (volumen obtenido con una micropipeta calibrada).
S o lu c ió n 1.1
a) Número de dígitos significativos: 4; que son: 3.001
b) Número de dígitos significativos: 3; que son: 304
c) Número de dígitos significativos: 3; que son: 210
1.1.1 R ed o n d eo d e d íg ito s s ig n ific a tiv o s en los cá lcu lo s

C u an d o se re alizan cálculos co n dos o m ás m ed icio n es, el resultado sólo p u ed e se r
ta n ex a cto com o lo es el v a lo r co n m e n o r pre cisió n . P ara ad a p tarse a esta n ece
sidad, el nú m ero o b ten id o co m o so lu ció n d e u n cálcu lo d eb e re d o n d earse para
re flejar el n iv el m ás b ajo d e pre cisió n . L as directrices ap u n ta d as en el cuadro
sig u ien te le ay u d a rán a d ete rm in a r d e q u é fo rm a h a y q u e re d o n d ear u n núm ero
co m o resultado d e u n cálculo.
Guía para redondear dígitos significativos

1 . Cuando se sum an o restan núm eros, el resultado d eb e ser redondeado de
form a q ue tenga el m ism o núm ero d e dígitos significativos decim ales com o
tien e el núm ero con m eno r núm ero d e decim ales significativos utilizado en el
cálculo.
2. Cuando se m ultiplican o dividen núm eros, el resultado d eb e ser redondeado
d e form a q ue tenga sólo tantos dígitos significativos com o tenga el núm ero
con m enos dígitos significativos utilizado en el cálculo.
P ro b le m a 1.2 Realice los siguientes cálculos y exprese el resultado utilizando

la guía para redondear dígitos significativos descrita en el recuadro anterior.
a) 0,2884 g + 28,3 g
b) 3,4 cm x 8,115 cm
c) 1,2 0,155 L
1.2 Exponentes y notación científica 3
S o lu c ió n 1.2
a) 0,2884 g + 28,3 g = 28,5884 g
La suma se redondea de forma que muestre el mismo número de dígitos
significativos decimales como el número de dígitos significativos decimales
menor que hay en la ecuación. (En este caso, el valor 28,3 tiene un dígito
significativo decimal.)
28,5884 g se redondea a 28,6 g
b) 3,4 cm x 8,115 cm = 27,591 cm2

El resultado se redondea a dos dígitos significativos, ya que hay tan sólo dos
dígitos significativos en uno de los números multiplicados (3,4 cm).
27,591 cm2 se redonde a 28 cm2
c) 1,2 L-í- 0,155 L = 7,742 L

El cociente se redondea a dos dígitos significativos, ya que hay tan sólo dos
dígitos significativos en uno de los valores (1,2 L) utilizado en la ecuación.
7,742 L se redonde a 7,7 L
1.2 E X P O N E N T E S Y N O T A C IO N C IE N T IF IC A
U n ex p o n en te es u n nú m ero escrito en la p arte su p erio r derech a (y d e m enor
tam añ o ) d e otro nú m ero (llam ado b a se) p a ra in d icar la p o ten c ia a la q u e la b a s e se
d eb e elevar. L o s ex p o n e n tes en b a s e 10 se utiliz an e n la no tac ió n cie n tífic a para
ex p resar n ú m ero s m u y gra n d es o m u y p eq u e ñ o s en fo rm a abreviada. P o r ejem plo,
p a ra el v a lo r de 103, 10 es la b a s e y 3 es el ex p o n en te. E sto s ig n ifica q u e el 10 se
m u ltip lica p o r sí m ism o tres v ec es (103 = 10 x 10 x 10 x 1.000). P ara los
n ú m ero s m enores d e 1,0 , s e u tiliz a u n e x p o n e n te n e g a tiv o p ara ex p resar los
v alo res co m o re cíp ro c o d e la b a s e 10. P o r ejem plo,
10-3 = - ^ = --------- ---------- = — — = 0,001

103 10 x 10 x 10 1.000
1.2.1 E x p re sa n d o n ú m e ro s en n o ta ció n cie n tífica

P ara ex p resar u n n ú m ero en notac ió n científica:
1. M u e v a la co m a a la d ere c h a d el d íg ito diferen te d e cero q u e h a y m ás a la
izquierda. C u en te el n ú m ero d e posicio n es q u e se h a m ovido la co m a respecto
a su p o sició n original.
2. E s crib a el nu ev o nú m ero h a s ta incluir, a la izq u ierd a y la d erech a , a to d o s los

díg ito s sig n ificativ o s (diferentes d e cero). D e scarte to d o s lo s ceros q u e se
ex tien d e n fu e ra d e esto s nú m ero s enteros.
3. C o lo q u e u n sig n o d e m ultip licac ió n y el n ú m ero 10 a la derech a d e lo s dígitos
en te ro s significativos. U tilic e u n e x p o n e n te p ara in d icar el n ú m ero d e posi
cio n e s q u e la c o m a se h a m ovido.
a. P a ra los nú m ero s su p erio res a 10 (d o n d e la co m a se m u ev e a la izquierda),
utilice u n exp o n e n te positivo.
b . P a ra lo s n ú m ero s m en o re s a u n o (d o n d e la c o m a dec im a l se m u ev e a la
d erecha), u tilic e u n e x p o n e n te negativo.
P ro b le m a 1.3 Escriba los siguientes números en notación científica.

a) 3.001.000.000
b) 78
c) 60,23 x 1022
S o lu c ió n 1.3
a) Mueva la coma hacia la izquierda nueve posiciones de forma que esté
colocada a la derecha del dígito más a la izquierda diferente a cero.
3,001000000
Escriba el nuevo número para incluir todos los dígitos significativos diferen
tes a cero y elimine todos los ceros a la derecha de estos dígitos. Multiplique
el nuevo número por 10, y añada el 9 positivo como exponente ya que el
número de salida es mayor que 10 y la coma se ha movido hacia la izquierda
nueve posiciones.
3.001.000.000 = 3,001 x 109
b) Mueva la coma una posición hacia la izquierda de forma que quede colocada
a la derecha del dígito más a la izquierda diferente a cero. Multiplique el
nuevo número por 10, y añada el 1 positivo como exponente ya que el
número de salida es mayor que 10 y la coma se ha movido hacia la izquierda
una posición.
78 = 7,8 x 101
c) 60,23 x 1022
Mueva la coma hacia la izquierda una posición deform a que quede colocada
a la derecha del dígito diferente a cero que está más a la izquierda. Dado que
la coma se ha movido una posición a la izquierda, añada un 1 al exponente
(22 + 1 = 23 = nuevo valor del exponente).
60,23 x 1022 = 6,023 x 1023

P ro b le m a 1.4 Escriba los siguientes números en notación científica.

a) 0,000000000015
b) 0,0000500042
c) 437,28 x 10“ 7
S o lu c ió n 1.4
a) Mueva la coma a la derecha 11 posiciones de forma que quede colocada a la
derecha del dígito más a la izquierda diferente a cero. Escriba el nuevo
número hasta incluir todos los dígitos significativos (diferentes a cero) a la
izquierda y a la derecha. Descartar todos los ceros que quedan fuera de estos
dígitos. Multiplique el número por 10, y escriba un 11 negativo como el
exponente ya que el número original es menor que 1 y la coma se ha
desplazado a la derecha 11 posiciones.
0,000000000015 = 1,5 x 10-11
b) Mueva la coma a la derecha cinco posiciones de forma que quede colocada a

la derecha del dígito más a la izquierda diferente a cero. Descartar todos los
ceros que quedan fuera de los dígitos diferentes a cero tanto a la izquierda
como a la derecha. Multiplique el número por 10 y utilice un exponente 5
negativo, ya que el número original es menor que 1 y la coma se ha movido a
la derecha cinco posiciones.
0,0000500042 = 5,00042 x 10~5
c) Mueva la coma dos posiciones hacia la izquierda para que se sitúe a la

derecha del dígito más a la izquierda diferente a cero. Dado que la coma
se desplaza dos posiciones hacia la izquierda, coloque un 2 positivo como
valor del exponente (—7 + 2 = —5).
437,28 x 10-7 = 4,3728 x 10-5
1.2.2 C o n v irtie n d o n ú m e ro s en n o ta ció n cie n tífic a

a n o ta ció n d ecim al
P ara ca m b ia r u n n ú m ero ex presado en n o tac ió n cie n tífic a a la fo rm a decim al:
1. Si el ex p o n e n te d e 10 es po sitiv o , m u e v a la c o m a a la d ere c h a tan tas posicio n es
co m o el v a lo r d el ex p o n en te. Si es necesario, ag reg u e ceros a la d ere c h a de los
díg ito s sig n ificativ o s p a ra re lle n ar h a sta la p o sició n d e la com a.
2. Si el ex p o n e n te d e 10 es neg a tiv o , m u e v a el p u n to dec im a l h a c ia la izq u ierd a
tan tas posicio n es co m o el va lo r d el ex p o n en te. S i es necesario, ag reg u e ceros a
la izq u ierd a d e los d íg ito s sig n ificativ o s p ara re lle n ar h a s ta la p o sició n d e la
com a.
P ro b le m a 1.5 Escriba los siguientes números en forma decimal.

a) 4,37 x 105
b) 2 x 101
c) 23,4 x 107
d) 3,2 x 10~4
S o lu c ió n 1.5
a) Mueva la coma cinco posiciones a la derecha, agregando tres ceros para
mantener el lugar de la coma desde su posición anterior.
4,37 X 105 = 437.000,0
b) Mueva la coma una posición a la derecha, agregando un cero a la derecha

del dígito significativo para mantener la nueva posición de la coma.
2 x 101 = 20,0
c) Mueva la coma siete posiciones a la derecha, agregando seis ceros para

mantener la posición de la coma.
23,4 x 107 = 234.000.000,0
d) La coma se mueve cuatro posiciones a la izquierda. Se añaden ceros para

mantener la posición de la coma.
3,2 x 10-4 = 0,00032
1.2.3 S u m a n d o y re sta n d o n ú m e ro s e sc rito s en n o ta ció n

cie n tífica
A l su m ar o re sta r n ú m ero s ex p resad o s en no tac ió n científica, es m ás sencillo
prim ero tran sfo rm ar lo s n ú m ero s d e la ecu ac ió n p ara q u e ten g a n la m ism a p o ten
c ia de 10 con el ex p o n e n te m ayor. E l v a lo r d el ex p o n e n te, p o r tan to , n o cam biará
cu an d o fin alm en te se realice el cálculo.
P ro b le m a 1.6 Realice las siguientes operaciones.

a) (8 x 104) + (7 x 104)
b) (2 x 103) + (3 x 101)
c) (6 x 10-2) + (8 x 10~3)
d) (3,9 x 10 -4 ) — (3,7 x 10 -4 )
e) (2,4 x 10~3) - (1,1 x 10“ 4)
1.2 Exponentes y notación científca 7
S o lu c ió n 1.6
a) ( 8 x 1 04) + ( 7 x l 0 4)
= 1 5 X 104 Resultado de la suma.
- 1,5 x 105 Número reescrito en el
formato estándar de notación
científica.
= 2 X 105 Número redondeado a un
dígito significativo.
b) (2 x 103) + (3 x 101)
= ( 2 x l O3) + (0,03 x 103) El número con el menor valor
de exponente expresado con
el exponente de mayor valor.
= 2,03 X 103 Resultado de la suma.
= 2x11? Número redondeado a un
c) (6 X 10“ 2) + (8 X 10-3)
= (6 x 10 2) + (0,8 X 10 2) Cambio de los exponentes al
mismo valor.
= 6,8 y 10~2 Resultado de la suma.
= 7 X 10~2 Número redondeado a un
d) (3,9 x 10“ 4) — (3,7 x 10~4)
= 0,2 x 10~4 Resultado de la resta.
= 2 X 10~5 Número reescrito en el
formato estándar de notación
científica.
e) (2,4 x 10 3) — (1,1 x 10-4 )
= (2,4 X 10 3) — (0,11 X 10^3) Cambio de los exponentes al
mismo valor.
= 2 , 2 9 - 10~3 Resultado de la resta.
= 2,3 - 10~3 Número redondeado con un
solo dígito significativo a la
derecha de la coma.
1.2.4 M u ltip lica n d o y d iv id ie n d o n ú m e ro s e x p re sa d o s

en n o ta ció n cie n tífic a
L as reglas u tiliz ad as p a ra los e x p o n e n tes e n la m u ltip licació n y d iv isió n de
n ú m ero s ex p resad o s en n o tac ió n cie n tífic a son:
L a regla d el p rod u cto: cu an d o se m u ltip lica u tiliz an d o n o tac ió n científica,

los e x p o n e n tes se sum an.
L a regla d el cocien te: cu a n d o se d iv id e u tiliz an d o notac ió n científica, el

ex p o n e n te d el d e n o m in ad o r se re sta d el e x p o n e n te d el num erador.
C u an d o realice el p ró x im o g ru p o d e p ro b lem a s, las sig u ien tes ley e s m ate

m áticas serán útiles:
P rop ied ad con m u tativa d e la m u ltip licación : el re su lta d o d e la m ulti

p licac ió n n o d ep e n d e d el o rd e n d e los factores. P o r ejem plo,
3 x 2 = 2 x 3
P rop ied ad a sociativa d e la m u ltip licación : el re su lta d o d e la m ultiplicación

no d ep e n d e d e có m o se ag ru p an los factores. P o r ejem plo,
3 x (2 x 4 ) = (3 x 2) x 4
P ro b le m a 1.7 Calcule el producto.

o
a) (3 x (5 x 102)
X
b) (2 x 103) x (6 x 1<TS)
c) (4 X 1CT2) :< (2 x 1 0 - 3)
S o lu c ió n 1.7
a) (3 x 104) x (5 x 10 2)
= (3 x 5) x (104 x 102) Utilice las reglas conmutativa
y asociativa para agrupar los
factores similares.
= 15 x 106 Suma de exponentes.
= 1,5 x 107 Número expresado en la
notación científica estándar.
= 2 x 107 Redondeo del número con un
b) (2 x 10 3) x (6 x 10-5 )
= (2 x 6) x (103 x 10~5) Utilice las reglas conmutativa
factores similares.
= 12 x 10“2 Suma de exponentes.
= 1,2 x 10~ 3 Número expresado en la
notación científica estándar.
= 1 x 10~3 Redondeo del número
con un dígito
significativo.
c) (4 x 10~2) x (2 x 10-3)
= (4 x 2) x (10“ 2 x 1 (T 3) Utilice las reglas conmutativa

factores similares.
= 8 x io ~ 2+(_3)
= 8 x 1( T 5 Suma de exponentes.
P ro b le m a 1.8 Calcule la división.
8 x 104
2 x 102
5 x 108
3 x 1CT4
8,2 x lO " 6
3,6 x 104
9 x 10~5
S o lu c ió n 1.8
. 8 x 104
2 x 102
El exponente del denominador
= - x 104“
2 se resta del exponente del
numerador.
= 4 x 102
5 x 10“
3 x 10-4
= - x 108_(_4)
se resta del exponente del
numerador.
= 1,67 x 108" (_4) Exponentes: 8 — (—4) = 8 + 4 = 1 2 .
= 2 x 1012 Número redondeado a un dígito

significativo.

3,6 se resta del exponente d
el numerador.
Número redondeado a dos dígitos
significativos.
Exponentes:
- 6 - (+4) = - 6 + (- 4 ) = - 1 0 .
_ x 10_ s _ (_ 3) El exponente del denominador se

2,5 resta del exponente del numerador.
- 3,6 x 10" 2
= 4 x 10“ 2 Número redondeado a un dígito

significativo.
1.3 P R E F IJ O S M É T R IC O S
U n p refijo m étrico es u n a n o tac ió n ab rev iad a u tiliz ad a p a ra den o ta r v alo re s m u y
gra n d es o m u y peq u e ñ o s d e u n a u n id ad b á s ic a co m o u n a altern ativ a a expresarlos
co m o p otencias d e 10. L as u n id ad e s b ásica s utiliz ad as en las ciencias bio ló g ic as
con m ás frecu e n cia son lo s m etros, g ra m o s, m oles y litros. D ebido a su sim plici
dad, lo s p refijos m étricos h an en c o n trad o u n a am p lia ap lica ció n en la b io lo g ía
m olecular. E n la tab la sig u ie n te se m u estra n lo s p refijos m ás u tilizados y los
valo re s q u e representan.
C o m o se p u ed e v e r en la T abla 1-1, u n n an o g ram o (n g ) es eq uivalente
a 1 x 10_ 9 g . P o r tan to , h a y 1 x 109 n g p o r g (el recíproco d e 1 x 10- 9 ;
1/1 x 109 = 1 x 10~9). A sim ism o , p u esto q u e u n m icro litro ((íL) es eq uivalente
a 1 x 10- 6 L , h ay 1 x 106 p,L p o r litro.
C u an d o s e ex p resan cantidades co n prefijos m étricos, g en e ralm en te se esc o g e
u n p re fijo de m an e ra q u e el v a lo r p u e d a se r escrito com o u n nú m ero su p erio r a 1,0 ,
pero in ferio r a 1.000. P o r eje m p lo , es h ab itu al ex p resar 0 ,0 0 0 0 0 0 0 5 g co m o 50 ng
e n lu g a r d e 0 ,05 [xg o 5 0 .0 0 0 pg.
1.3.1 F a c to re s d e co n v e rsió n y sim p lifica c ió n d e té rm in o s

U n a con versión es el cam bio de u n a m ed ició n ex p resad a co n u n prefijo m étrico en
u n v a lo r equ iv a le n te ex p resado m ed ian te u n prefijo m étrico diferente. S e llev a a
Tabla 1-1 Prefijos m étricos, sus abreviaturas y sus equivalencias como
exponentes de 10.
Prefijo m étrico Abreviatura Potencia de 10
giga- G 109
mega- M 106
kilo- k 103
mili- m 10“ 3
micro- M* 10-6
nano- n 10“ 9
pico- P 10-12
femto- f 10-15
atto- a 10-18
cabo m atem á tica m en te ap lica n d o u n fa cto r d e co n v e rsió n so b re los d os térm i

n o s diferentes. U n fa cto r d e co n v e rsió n es u n a re la ció n n u m éric a igual a 1. P o r
ejem plo,
1 X 106 |!g 1g
g 7 1 x 106 |xg
son factores d e co n v e rsió n , am b o s igual a 1. P u ed en utiliz arse p ara convertir

g ram os a m icro g ram o s o m icro g ram o s a g ra m o s, re spectivam ente. E l prefijo
m étrico final deseado d eb e ap a rec er en la ecu ac ió n co m o u n v a lo r en el nu m era d o r
d el fa cto r de co n versión. P u esto q u e la m ultip licac ió n o d iv isió n p o r el n ú m ero 1
no c a m b ia el v a lo r de la ca n tid a d inicial, cu a lq u ie r ca n tid a d pu ed e m u ltip licarse o
d iv id irse p o r u n fa cto r d e con v e rsió n y el resultado seg u irá sien d o igual a la
ca n tid a d original; sólo c a m b ia rá el prefijo m étrico.
A l re alizar c o n v e rsio n es entre lo s v alo res exp resad o s co n d iferentes p refijos
m étricos, los cá lcu lo s p u ed e n sim plificarse cu an d o fa cto re s d e 1 o un id ad e s
id én tica s se cancelan. U n fa cto r d e 1 es u n a ex presión en q u e se d iv id e el
térm in o entre sí m ism o . P o r ejem plo, 1 x 106/1 x 106 es u n fa cto r d e 1. D el
m ism o m o d o , u n 1 L / l L es u n fa cto r d e 1. Si en u n a c o n v e rsió n aparecen
térm inos idénticos en c u a lq u ie r p arte d e la ecu ac ió n en u n lado d el sig n o igual,
tanto co m o n u m era d o r co m o d enom inador, p u ed e n se r cancelados. P o r ejem plo,
en la c o n v e rsió n d e 5 x 10~ L a m icrolitros, se p u ed e co n fig u rar u n a ecu ac ió n
p a ra q u e los térm in o s id én tico s (e n este caso, litros) se p u ed a n ca n ce la r p a ra d a r pl
co m o v a lo r del num erador.
5x10 4 L = n p,L R eso lv ien d o p a ra n.

U tiliz ar el fa cto r d e c o n v e rsió n en
relación c o n litros y m icro litro s, con
m icrolitros co m o u n v a lo r e n el
num erador. Se ca n ce la n lo s térm inos
idénticos e n el n u m era d o r y el
denom inador. (R ecu erd e, 5 x 10- 4 L
es lo m ism o q u e 5 x 10_ L/
1,5 x 10- 4 L , p o r lo tan to , es el
num erador.)
(5 x 1)(10- 4 x 106) \iL x n A g ru p ar lo s térm in o s sim ilares.
5 x 10_4+6 p,L x n [aL M u ltip lica r lo s num eradores.
5 x 102 p,L x n [xL P o r lo tan to , 5 x 10- 4 L es
eq u iv a le n te a 5 x 102 \iL.
P ro b le m a 1.9
a) En el genoma humano hay aproximadamente 6 x 109 pb. ¿A cuánto equi
vale en kilopares de bases (kb)?
b) Convierta 0,03 ^g a ng.
c) Convierta 0,0025 mL a jxL.
S o lu c ió n 1.9
a) 6 x 109 pb = n kb. Resolver para n.
Multiplicar por el factor de conversión que relaciona kb con pb con las kb
como numerador:
1 kb
6 x 109 pb x ------- 5— = n kb
1 x 103 pb
Simplificar los términos idénticos (pb) que aparecen tanto en el denominador

como en el numerador, dejando kb como valor en el numerador.
El exponente del denominador se resta del exponente del numerador.
- x 109' 3 kb = 6 x 106 kb = n kb
Por tanto, 6 x 109 pb es equivalente a 6 x 106 kb.

1.3 Prefijos métricos 13
b) 0,03 jig = n ng. Resolver para n.

Multiplicar por el factor de conversión que relaciona g con jig y ng con g con
ng como numerador. Convertir 0,03 jxg a su equivalente en notación
científica (3 x 10~2 p,g):
, 1g 1 x 109 ng
3x10 p.g x ------- t— x ------------ = n ng
Ix IO 6^ g y
Simplificar los términos idénticos que aparecen tanto en el denominador

como en el denominador, dejando los ng como valor del numerador; multi
plique el numerador y el denominador y agrupe los términos similares.
(3 x 1 x 1)(10“ 2 x 109) ng
--------;— —w— = n ng
(1 x 1)(106)
Se suman los exponentes del numerador.
3 x 10_2+9 ng 3 x 1 0 7 ng
----------- «— = --------- «— = n ng
1 x IO 6 1 x 106
Del exponente del numerador se resta el del denominador.
- x 107" 6 ng = 3 x 101 ng = n ng
Por lo tanto, 0,03 p,g es equivalente a 30 (3 x 101) ng.
c) 0,0025 mL = n pL. Resolver para n.

Convierta 0,0025 mL en notación científica. Multiplique por el factor de
conversión que relaciona L con mL y mL con L con m L como numerador.
, , 1L 1 x 106 u i
2,5 x 10~3 m L x --------- 5----- x --------- — ¡— = n 11L
1 x 103 mL 1L r
Simplifique los términos idénticos que aparecen tanto en el denominador

como en el numerador, dejando (iL como valor del numerador. Multiplique
los valores del numerador y del denominador. Agrupe los términos similares.
(2,5 x 1 x 1)(10~3 x 106) [xL

(1 x 1) ( 103) ~ n ii
Se suman los exponentes del numerador.
2,5 X 1CT3+6 llL 2,5 x 103 iiL

--------------------5------- = ------------------ 5— = n ixL
1 x 103 1 x 103
Del exponente del numerador se resta el del denominador.
x 103-3 \í L = 2,5 x 10° p i = 2,5 (iL = n p,L
Por tanto, 0,0025 m L es equivalente a 2,5 p,L.
■ R E S U M E N D E L C A P ÍT U L O
L os d ígitos sign ificativos son los d íg ito s q u e re p rese n ta n lo s lím ites reales de
p re cisió n . S on p o r lo gen eral díg ito s distintos a cero. L o s ceros a la izq u ierd a d e la
co m a detrás d e u n díg ito d istin to a ce ro se su p o n e q u e n o son significativos. L os
c e ro s a la derech a de la co m a an te s d e u n d íg ito d istin to a cero tam b ién se su p o n e
q u e n o son significativos.
E l re d o n d eo del re su lta d o d e la su m a o d iferen c ia d e dos nú m ero s d eb e ten e r el
m ism o n ú m ero d e d íg ito s sig n ificativ o s a la dere c h a d e la c o m a co m o el núm ero
con el m e n o r n ú m ero d e díg ito s significativos a la derech a d e la co m a u tiliz ad a en
el cálculo. U n pro d u c to o co cien te d eb e te n e r sólo tan to s dígitos significativos
co m o e l n ú m ero co n el m e n o r n ú m ero d e d íg ito s sig n ificativ o s u tiliz ad o en el
cálculo.
C u an d o lo s nú m ero s se ex p resen en notac ió n científica, m u e v a la co m a a la
derech a d el d íg ito diferente a cero d e m ás a la izquierda, elim in e to d o s los ceros
que qu ed a n fu e ra d e la serie d e cifras significativas, y ex p rese el n u ev o núm ero
co m o u n pro d u c to p o r 10 q u e tien e u n ex p o n e n te igual al n ú m ero d e p osiciones
q u e la co m a se m o v ió d e su p o sició n o rig in al (c o n u n e x p o n e n te neg a tiv o si la
co m a se m u ev e a la derecha).
A l su m ar o restar nú m ero s ex p resad o s en n otación cien tífica, v u e lv a a esc rib ir
lo s n ú m ero s d e ta l m an e ra q u e to d o s te n g a n el m ism o v a lo r en el ex p o n e n te co m o
el d e m a y o r exponente; a co n tin u ac ió n , realice el cálculo. A l m u ltip licar núm eros
ex p resad o s en notac ió n científica, sum e lo s ex p o n e n tes. A l d iv id ir núm eros
ex p resad o s en n o tac ió n científica, re ste el e x p o n e n te d el d e n o m in ad o r d el ex p o
n e n te d el n u m era d o r p ara o b ten e r el v a lo r d el nu ev o exponente.
L o s n ú m ero s escritos e n n o tac ió n cie n tífic a tam b ién p u ed e n se r expresados
usan d o p refijos m étricos, lo q u e perm itirá ob ten e r el v a lo r co n el m e n o r núm ero
d e dígitos significativos.
Capítulo
Soluciones, mezclas y medios
L a m ay o ría d e las actividades b io ló g ic as, tan to si se trata d e u n org a n ism o co m o de
u n a enzim a, tien en su ó p tim o d e ac tiv id a d sólo d en tro d e u n estrech o rango de
co n d ic io n e s am bientales. D e sd e células en cultivo p asa n d o p o r la secuenciación
d e u n frag m en to d e A D N clo n a d o o h a sta e n sa y ar la actividad d e u n a enzim a, el
éxito o el fracaso de u n ex p erim en to pu ed e dep e n d er d e h a b e r te n id o en cu e n ta los
co m ponentes d e u n a re acc ió n co n su m a ate n ció n . E sta sec ció n d esc rib e las
m atem áticas in v o lu cra d as en la p re paración d e soluciones.
2.1 C A L C U L A N D O D I L U C IO N E S :
U N A A P R O X IM A C IÓ N G E N E R A L
S e defin e co n cen tración co m o la ca n tid a d d e u n a d ete rm in a d a su stan cia en u n
vo lu m en dado:
cantidad
co n c en tra ció n — — ---------
v olum en
L a m ay o ría de lo s lab o ra to rio s preparan soluciones co n c en tra d as (sto ck ) de los

re activ o s d e u s o general q u e son co m p o n e n te s d e u n a gra n v arie d ad d e tam p o n es o
m ezclas de reacción. E stas solu cio n es sto ck p u ed e n se r desde T ris 1 M ( m o l/L ) pH
8,0, ác id o etilendiam inotetraacético (E D T A ) 5 0 0 m M, dodec ilsu lfa to sódico
(S D S ) al 2 0 % , M g C b 1 M, h a s ta u n s in fín d e m u chas m ás. Se p u ed e a ñ a d ir a
u n tam p ó n o a u n a m ez cla d e reactiv o s u n v o lu m en específico d e u n a solución
s to ck p a ra q u e co n te n g a el co m p o n e n te a u n a cie rta co n c en tra ció n m e n o r q u e la de
stock. P o r ejem plo, u n a so lu ció n d e s to ck d e etanol al 9 5 % se p u ed e u tiliz ar para
p re p ara r u n a so lu ció n d e eta n o l al 70% . P o r tan to , c u a n d o s e u tiliz a u n a solución
d e u n tan to p o r cie n to m ás ele v ad o (m ás con c en tra d a) p a ra p re p ara r u n a so lu ció n a
u n p o rc en taje m ás bajo (m en o s co ncentrada), estam os re alizan d o u n a d ilu ción de
la so lu ció n stock.
H a y vario s m étodos q u e p u ed e n utilizarse p a ra ca lcu lar la c o n c en tra ció n d e un
reactivo diluido. N in g ú n m éto d o es n ecesariam ente m ás v álid o q u e otro. En
general, el m éto d o elegido p o r u n a p erso n a tien e m ás q u e v e r co n la fo rm a en
16 CAPÍTULO 2 Soluciones, mezclas y medios
que su ce reb ro se ac erc a a los p roblem as m atem á tico s q u e c o n la leg itim id ad del
p ro ced im ien to . U n a ap ro x im a ció n es u s a r la ecu ac ió n C¡V¡ = C 2 V2 , d o n d e C¡ es
la co n c en tra ció n in icial d e la so lu ció n stock, V¡ es la ca n tid a d d e so lu ció n stock
p a ra re alizar la d ilución, C2 es la co n c en tra ció n d e la m u estra d ilu id a y V2 es el
v o lu m en to tal final d e la m u estra diluida.
P o r ejem plo, si le p re g u n ta n cuántos (xL d e a z ú ca r al 20 % se deben utiliz a r para
h a c e r 2 m L d e u n a so lu ció n al 5 % d e sacarosa, se p u ed e u tiliz ar la ecuación
C¡ V\ = C2 P2. S in em b a rg o , p ara u tiliz ar esta apro x im a ció n to d as las unidades
d eben se r las m ism as. P o r lo tan to , p rim ero es n ecesario c o n v e rtir lo s 2 m L a |iL .
E sto se h ac e d e la sig u ien te form a:
1.000 ixL _____ __

2 m L x —-— -— — 2 .0 0 0 [iL
do n d e C i es igual a 2 0 % , V¡ es el v o lu m en q u e se qu iere calcular, C2 e s 5% y V2 es

2 .0 0 0 |iL . E l cálcu lo se re aliza d e la sig u ien te m anera:
C \V \ = C 2 V 2
(20% ) V , = (5% ) (2 .0 0 0 pL )
R eso lv ien d o p a ra V¡ ob ten e m o s el sig u ien te resultado:
^ < M M ) . 500llL
L o s p o rc en tajes se sim plifican y a q u e se en c u en tra n tan to e n el n u m era d o r

co m o en el d e n o m in ad o r d e la ec u ac ió n , qu ed a n d o los |iL co m o ú n ic a un id ad . P or
lo tan to , se n ec esitan 500 jxL d e sac aro sa a l 2 0 % m ás 1.500 (iL d e a g u a
(2 .0 0 0 ji,L — 5 0 0 |xL = 1.500 [aL), p a ra o b ten e r u n a so lu ció n d e sac aro sa al 5%
a p a rtir d e u n a so lu ció n d e sac aro sa a l 2 0 %.
E l a n á lis is d im e n s io n a l es o tra apro x im a ció n p a ra s o lu cio n ar p ro b lem a s de
concentración. E n este m éto d o , la ecu ac ió n está p la n tea d a d e tal fo rm a q u e la
co n c en tra ció n s to ck co n o c id a y to d as las re laciones d e v o lu m en apa rec en en el
lad o izquierdo d e la ecu ac ió n y la co n c en tra ció n final d ese ad a se co lo c a en el lado
derecho. L o s fa cto re s d e c o n v e rsió n son realm ente p arte d e la ecuación. L os
térm inos se estab le cen co m o v alo res del n u m era d o r o d el d e n o m in ad o r d e m odo
q u e to d o s lo s térm in o s se sim p lific an a ex c ep c ió n d e la co n c en tra ció n deseada.
U n a ecu ac ió n d e an á lisis dim en sio n al se co n fig u ra d e la sig u ien te m anera.
., , ., _ , ., v o lu m en desco n o cid o
co n c en tra ció n de p artid a x ta c to r de co n v e rsio n x --------- ---------- -— -------
v o lu m en final
= co n c en tra ció n d ese ad a
2.2 Concentraciones por un factor X 17
U tiliz an d o el en fo q u e d el an á lisis d im en sio n al, el p ro b lem a d e desc u b rir

cu ántos m icro litro s d e sac aro sa al 2 0 % se n ec esitan p ara h a c e r 2 m L d e sacarosa
al 5% se escribe d e la s ig u ie n te m anera:
. X »L -W .
l.OOOpL 2m L
T en g a en c u e n ta q u e to d o s lo s térm inos en el lado izquierdo d e la ecu ac ió n se

sim plificarán a ex c ep c ió n d e lo s ex p resad o s en po rcentaje. D e sp ejan d o x (xL d a el
s ig u ie n te resultado:
(20%)x
= ( W 00) = 500
20%
P uesto q u e x es la ca n tid a d d e (xL, se n ec esitan 500 jíL de sac aro sa al 2 0 % en un

v o lu m en final d e 2 m L p a ra h a c e r sac aro sa al 5% . O b se rv e q u e la sim ilitu d d e la
ú ltim a fa se d e la so lu ció n a esta ecu ac ió n es el últim o p aso d e la ecuación
utiliz an d o e l m éto d o d e C¡ Vi = C2P2.
H acien d o fo rm a r parte d e la ecu ac ió n al fa cto r d e co n v e rsió n se o b v ia la
nec esid ad d e re alizar d os cálculos p o r sep a rad o , tal co m o h ac e fa lta utiliz an d o
la ap ro x im a ció n C¡ V¡ = C 2 P2. P o r esta razón, el m éto d o d e análisis d im ensional
es el m éto d o utilizado p a ra la re so lu c ió n d e p ro b lem a s en este libro.
2.2 C O N C E N T R A C IO N E S P O R UN F A C T O R X
L a co n c en tra ció n d e u n a so lu ció n p u ed e s e r ex p resad a co m o u n m últiplo d e su
co n c en tra ció n de trabajo estándar. P o r eje m p lo , tam p o n es u tiliz ad o s p a ra g eles de
electroforesis d e a g a ro sa o d e ac rilam id a se p re p ara n co m o solu cio n es 10 v ec es
o (10X ) m ás co n c en tra d as q u e su co n c en tra ció n n o rm al d e u s o (I X ). E n u n tam p ó n
■8 10X , ca d a co m p o n e n te d e ese tam p ó n es 10 v eces m ás co n centrado q u e en la
« so lu ció n IX . P a ra p re p ara r u n tam p ó n d e trabajo IX , h a y q u e h a c e r u n a dilución
.§ d e la so lu ció n m ás co n c en tra d a s to ck 10X en ag u a p a ra a lc an za r el v o lu m en
| d eseado. P a ra p re p ara r 1.000 m L (1 L ) d e T ris-borato-E D T A (T B E ) IX , u n
■5 tam p ó n d e trabajo p a ra g ele s a p artir d e u n T B E 10X , p o r ejem plo, h a y que
•| a ñ a d ir 100 m L d e la so lu ció n 10X a 9 0 0 m L d e ag u a destilada. E sto se pu ed e
•5. ca lcu lar d e la sig u ie n te m anera:
8
1? 1n v * i n mL 1v * - n m L d el tam p ó n 10X se dilu y en
10X tam p ó n x _____ ____= I X tam p o n J
gj 1.000 m L e n u n v o lu m en to tal d e 1.000 m L
gj p a ra o b ten e r u n a co ncentración
w IX . R eso lv er p ara n.
10 Xn S e m u ltip lican los v alo re s del

-------- = 1>
1.000 num erador.
U tiliz an d o la p ro p ied a d d e la
( 1 .0 0 0 ) x - = I X (1 .0 0 0 )
ig u ald ad p a ra la m ultiplicación
(véase el p ró x im o re cu ad ro ), se
m u ltip lica ca d a lad o d e la ecuación
p o r 1 .0 0 0 . E sta op eració n sim plifica
el 1.000 en el d e n o m in ad o r d el lado
izquierdo d el sig n o igual.
lO X rt - 1 .0 0 0 X
lO X n l.O O O X D iv id ir c a d a lad o de la ecu ac ió n entre

10X “ 10X 1 0 X . (D e nu ev o se u tiliz a la
p ro p ied a d d e la igualdad p a ra la
m ultiplicación.)
n — 1 00 L o s térm in o s X s e sim plifican y a q u e
se enc u en tra n tan to en el n u m era d o r
co m o en el denom inador. E sto
re su elv e n igual a 100.
P o r lo tan to , p a ra h a c e r 1 .0 0 0 m L d e tam p ó n I X , h a y q u e a ñ a d ir 100 m L de la

so lu ció n sto ck 1 0 X a 9 0 0 m L d e ag u a d estilad a (1 .0 0 0 m L — 100 m L ap o rtad o s
p o r el tam p ó n s to ck 10 X = 9 0 0 m L).
P ro p ie d a d d e la ig u a ld a d p a ra la m u ltip lica ció n
Am bos lados de una ecuación se pueden multiplicar por un mism o número

diferente a cero para dar lugar a una ecuación equivalente. Esta propiedad tam
bién se aplica a la división: am bos lados d e una ecuación pueden ser divididas entre
un mism o número diferente a cero para dar lugar a una ecuación equivalente.
P ro b le m a 2.1 ¿Cómo se preparan 640 mL de tampón 0,5X a partir de un

stock 8X?
S o lu c ió n 2.1
Comenzamos con el tampón stock 8X. Nosotros queremos averiguar cuántos
mL del tampón 8X deben haber en un volumen final de 640 mL para obtener un
tampón 0,5X. Esta relación puede ser expresada matemáticamente de la
siguiente forma:
8Xtam pón x = 0,5Xtampón Resolver para n.

2.3 Preparando soluciones en porcentaje 19
Multiplicar los valores del

numerador en el lado izquierdo
de la ecuación. Dado que los
términos m L aparecen tanto en el
numerador como en el denominador,
se anulan.
8Xn = 320X Multiplicar cada lado de la ecuación
por 640.
320X Dividir cada lado de la ecuación entre

n = = 40
8X 8X. Los términos X, como aparecen en
el numerador y en el denominador, se
anulan.
Por lo tanto, añadir 40 mL del stock 8X a 600 mL de agua destilada para preparar
un total of 640 mL de tampón 0,5X (640 mL del volumen final —40 mL del stock
8X = 600 mL de volumen de agua que hay que utilizar).
2.3 P R E P A R A N D O S O L U C IO N E S EN P O R C E N T A J E
M uchos reactiv o s s e p re p ara n co m o u n po rc en taje d e u n so lu to (c o m o la sal, el
cloruro d e cesio o e l h id ró x id o d e sodio) disu elto en u n a so lu ció n . P o rce n ta je, p o r
definición, sig n ifica « p o r 100». P o r tan to , 12% sig n ifica 12 p o r 100 o 12 d e cada
100. 12% pu ed e s e r escrito en fo rm a dec im a l co m o 0,1 2 (q u e d e riv a d e la relación
2 /1 0 0 = 0 , 12).
D e p en d ien d o d el estado físico inicial d el so lu to , su co n c en tra ció n p u ed e ser
e x p resad a com o u n p eso p o r cie n to en v o lu m en (% p /v ) o u n vo lu m en p o r ciento
en v o lu m en (% v /v ). U n p o rc en taje en p eso p o r v o lu m en s e refiere al p eso de
soluto (en gram os) en u n to ta l d e 100 m L de solución. U n po rc en taje en v o lu m en
p o r v o lu m en se re fiere a la ca n tid a d de líq u id o so lu to (en m L ) en u n vo lu m en final
d e 100 m L d e solución.
L a m ay o ría d e lo s laboratorios d e m icro b io lo g ía tien en u n a so lu ció n stock de
g lu c o sa al 20% (p/v), p a ra su u so co m o fu e n te de ca rbono en los m ed io s d e cultivo
b acteriano. P ara p re p a ra r 100 m L de g lu co sa al 20 % (p/v), se disu elv en 2 0 gram os
(g) d e g lu c o sa e n su ficie n te ag u a destilad a p ara q u e el v o lu m en final d e la
solución, co n la g lu co sa d isu elta p o r co m p leto , se a d e 100 m L.
P ro b le m a 2.2 ¿Cómo se pueden preparar las siguientes soluciones?

a) 100 mL de polietilenglicol (PEG) 8000 al 40% (p/v)
b) 47 mL de una solución de cloruro sódico (NaCI) al 7% (p/v)
c) 200 mL de una solución de etanol al 95% (v/v)
S o lu c ió n 2.2
a) Pesar 40 g de PEG 8000 y se disuelven en agua destilada para que el
volumen final de la solución, con el PEG 8000 disuelto por completo, sea
de 100 mL. La forma más adecuada para hacerlo es disolver el PEG 8000 en
aproximadamente 60 mL de agua destilada. Cuando los gránulos se disuel
ven, verter la solución en una probeta de 100 m L y enrasar con agua desti
lada hasta la marca de 100 mL.
b) Primero hay que calcular el 7% de 47. Esto se hace multiplicando 47 por 0,07
(la forma decimal de 7%; 7/100 = 0,07):
0,07 x 47 = 3,29
Por lo tanto, para preparar 47 mL de NaCI al 7% hay que pesar 3,29 g de NaCI
y disolver los cristales en un cierto volumen de agua destilada inferior a
47 mL de forma que, cuando los 3,29 g de NaCI se añadan, no se superen los
47 mL. Cuando el NaCI se disuelva por completo, hay que colocar la solución
en una probeta de 50 mL y se enrasa con agua destilada hasta los 47 mL.
c) Para calcular el 95% of 200 mL se multiplica 0,95 (la forma decimal de 95%)
por 200:
0,95 x 200 = 190
Por lo tanto, para preparar 200 mL de etanol al 95%, se miden 190 mL de

etanol al 100% (utilizar una probeta de 200 mL) y se añaden 10 mL de agua
destilada para obtener un volumen final de 200 mL.
2.4 D IL U Y E N D O S O L U C IO N E S EN P O R C E N T A J E
A l ap ro x im a rse a u n p ro b lem a d e dilu ció n q u e im p lic a p o rcen tajes, h a y que
ex p resar las soluciones en p o rc en taje co m o fracciones d e 100. E l p ro b lem a se
p u e d e esc rib ir co m o u n a ecu ac ió n en la q u e se co lo c a la co n c en tra ció n d e la
so lu ció n stock (« lo q u e se tien e» ) en el lad o izquierdo d e la ecu ac ió n y la
co n c en tra ció n final d ese ad a («lo q u e se qu iere» ) en el lado d erech o d e la
ecuación. E l v o lu m en desc o n o cid o (x) d e la so lu ció n s to ck q u e h a y q u e añ a d ir
al v o lu m en de la m ez cla final tam b ién deb e s e r ex p resado co m o u n a fracción (con
jc co m o u n n u m era d o r y el v o lu m en final d eseado co m o u n d enom inador). E sta
p arte d e la ecuación tam b ién se d eb e c o lo c ar en el lado izquierdo d el signo igual.
P o r ejem plo, si h a y que p re p ara r 30 m L d e eta n o l al 7 0 % a p a rtir de u n a solución
stock d e eta n o l al 95% , se p u e d e esc rib ir la sig u ien te ecuación:
95 xm L 70
100 X 30 m L ~ TOO
2 .4 Diluyendo soluciones en porcentaje 21
A con tin u ac ió n se p u e d e re so lv e r p a ra x.
M u ltip liq u e los nu m era d o re s entre sí y

lo s den o m in ad o res entre sí. D a d o que
lo s térm in o s m L están p re sen tes tanto
en el n u m era d o r co m o en el
d en om inador, se anulan.
3.0 0 0 95 jc 70 3.0 0 0 M u ltip liq u e am b o s lad o s d e la

1 X 3 .0 0 0 “ 1 0 0 x 1 ecu ac ió n p o r 3.000.
210.000 Sim plifique la ecuación.

95*^— ióo-
95 x = 2.1 0 0
95 * _ 2.1 0 0 D iv id a ca d a lad o d e la ecuación

"95" “ 95 en tre 95.
x = 22 R ed o n d ea r a dos d íg ito s significativos.
P o r lo tan to , p ara p re p ara r 30 m L d e eta n o l al 70% u tiliz an d o u n a solución

s to ck d e eta n o l al 9 5 % , h a y q u e m ez clar 2 2 m L d e etanol sto ck al 95% co n 8 m L
d e ag u a destilada.
P ro b le m a 2.3 Si 25 g de NaCI se disuelven en un volumen final de 500 mL,

¿cuál es el porcentaje (p/v) de la concentración de NaCI en la solución?
S o lu c ió n 2.3
La concentración de NaCI es de 25 g/500 mL (p/v). Para determinar el porcen
taje (p/v) de la solución, necesitamos saber cuántos gramos de NaCI hay en
100 mL. Podemos plantear una ecuación de dos relaciones en la cual x repre
senta la cantidad de gramos que desconocemos. Esta relación se lee «x g es a
100 mL como 25 g es a 500 mL»:
x g _ 25 g
100 mL _ 500 mL
Resolviendo para x se obtiene el siguiente resultado:
_ (25 g)(100 m L) _ 2.500 g

= 5g
500 mL
Por lo tanto, hay 5 g de NaCI en 100 m L (5 g/100 mL), que es equivalente a una
solución al 5%.
P ro b le m a 2 .4 Si se añaden 8 mL de agua destilada a 2 mL de etanol al 95%,

¿cuál es la concentración de la solución diluida de etanol?
S o lu c ió n 2.4
El volumen total de la solución es 8 mL + 2 mL = 10 mL. Este volumen debería
aparecer como un denominador en el lado izquierdo de la ecuación. Esta
dilución es la misma que si se añadieran 2 mL de etanol al 95% a 8 mL de agua.
De cualquier forma, es una cantidad del stock de etanol al 95% la que se utiliza
para hacer la dilución. Los «2 m b , por lo tanto, deberían estar como el nume
rador en la expresión del volumen en el lado izquierdo de la ecuación:
95 2 mL _ x
100 X 10 mL “ 100
190 _ x Los mL se anulan. Multiplicar los valores del

1.000 100 numerador y del denominador a la izquierda
de la ecuación.
q 19 _ x Simplifique la ecuación.
100
19 = x Multiplique ambos lados de la ecuación por
100 .
Si en la ecuación original x es sustituida por 19, se ve que la nueva concentración

de etanol en la muestra diluida es de 19/100, o del 19%.
P ro b le m a 2.5 ¿Cuántos microlitros de SDS al 20% se necesitan para obtener

1,5 mL de SDS al 0,5%?
S o lu c ió n 2.5
En los ejemplos anteriores, no había control sobre la cantidad de agua que
podríamos añadir durante la preparación de la dilución para llevar la muestra a la
concentración deseada. En este ejemplo, sin embargo, un volumen fijo (1,5 mL)
se utiliza como muestra de partida y se debe llevar hasta la concentración
deseada. La solución de este problema requerirá el uso de la propiedad de la
igualdad para la suma (véase el siguiente cuadro).
Propiedad de la igualdad para la suma

Se puede sum ar (o restar) la m ism a cantidad a (o de) am bos lados d e una
ecuació n para dar lugar a una ecuación equivalente. Para cualquier núm ero real a,
b y c , s \ a = b, lu e g o a + c - b + c , y a - c - b - c .
2 .4 Diluyendo soluciones en porcentaje 23
D ado q u e la co n c en tra ció n , p o r defin ic ió n , es la ca n tid a d de u n co m p o n e n te en

co n c reto en u n v o lu m en específico, m ed ian te la a d ic ió n d e u n a ca n tid a d d e u n a
so lu ció n stock a u n v o lu m en fijo, el vo lu m en final se ca m b ia p o r e s a cantidad y la
co n c en tra ció n se c a m b ia en co n se cu en c ia. L a cantidad d e so lu ció n sto ck (x m L )
aña d id o en el pro c eso d e la d ilu ció n tam b ién d eb e estar p resen te en el v o lum en
final, d e la sig u ien te m anera.
20 x mL 0,5
100 l,5 m L + i m L : Tóo
20 x 0,5 M ultip liq u e

1 5 0 + 100.x " 100 nu m era d o re s y
d en o m in ad o res. L o s m L
se anulan.
1 5 0 + 100.x 20.x 0,5 1 5 0 + 100* M u ltip liq u e am bos

— i— >1 5 0 + 100x“ 100 > i lad o s d e la ec u ac ió n p o r
150 + 100.x.
S im plifique la ecuación.
100 75 + 50.x 100 M u ltip liq u e am bos

— x20x = - m W> lad o s d e la ecuación
p o r 100.
2 .000.x = S im plifique.
1.950* = R este 50x d e am bos
lad o s d e la ecuación
(p ropiedad d e la
ig u ald ad p a ra la sum a).
D iv id a am b o s lad o s de
la ec u ac ió n entre 1.950.
1.000 liL C o n v ie rta m L a |iL y

0 ,0 3 8 4 6 m L x --------- = 38,5 pL
re d o n d ee a la d ere c h a de
la c o m a co n u n dígito
significativo.
P o r lo tan to , si se añ a d en 38,5 |iL d e SD S al 2 0 % a 1,5 m L , la co n c en tra ció n de

S D S d e la m u estra será d el 0 ,5 % en u n v o lu m en final d e 1,5385 m L . Si h u b iera
alg ú n o tro co m p o n e n te en lo s 1,5 m L in iciales, la co n c en tra ció n d e ese co m p o
n en te p o d ría c a m b ia r p o r la a d ic ió n d el S D S . P o r eje m p lo , si estu v iera p re sen te
N aC l en u n a co n c en tra ció n d el 0 ,2 % , su co n c en tra ció n p o d ría c a m b ia r p o r la
adición d e m ás líq u id o . L a so lu ció n inicial d e 1,5 m L co n tien en la sig u ien te

cantidad d e N aCI:
0,2 g
TÚ& x l.5 m L = 0,003 g
A sí, 1,5 m L d e N a C I al 0 ,2 % co n tien e 0,003 g d e N aC I.

E n u n vo lu m en d e 1,5385 m L (v o lu m en o btenido tras la ad ic ió n de la solución
d e S D S), 0,003 g d e N a C I es eq u iv a le n te a u n a so lu ció n 0,1 9 5 % N aC I, tal co m o se
m uestra:
^ xl00= 0 -195%
2.5 M O L E S Y P E S O M O L E C U L A R : D E F IN IC IO N E S
U n m ol es equ iv a le n te a 6,023 x 1023 m oléculas. E stas m oléculas p u ed e n se r
sencillam ente áto m o s o u n a m o lécu la fo rm a d a p o r u n a in m ensidad de átom os. P or
ejem plo, u n m ol d e h id ró g en o eq u iv a le a 6,023 x 1023 m oléculas d e h idrógeno.
U n m ol d e g lu c o sa (C 6H 120 6) eq u iv a le a 6,023 x 1023 m oléculas d e g lucosa. El
v a lo r 6 ,0 2 3 x 1023 se co n o c e c o m o el n ú m ero d e A vogad ro.
E l p eso m o lec u la r (M W , d el inglés M olecular Weight) es u n térm ino p o p u lar
p a ra referirse a la m a sa m olecular. E l p eso m o lecu la r de u n a sustan cia es e q u iv a
len te a la su m a d e sus p eso s atóm icos. P o r ejem plo, el p eso m o lecu la r del N aC I es
5 8 ,4 4 g: el p eso atóm ico del N a (2 2,99 g ) m ás el p eso atóm ico d el clo ro (35,45 g).
L o s p eso s ató m ico s se pu ed e n en c o n trar en la tab la p erió d ic a de lo s elem entos. El
p eso m o lecu la r de u n co m p u e sto , o b ten id o d e fo rm a co m e rcial, lo su ele su m in is
tra r el fa b rica n te y se en c u en tra im preso en la e tiq u eta d el envase. E n la m ay o ría de
las etiq u eta s d e reactiv o s se p u ed e o b serv ar el p eso fórm u la (FW , del inglés
Formula Weight). P ara la m ay o ría de lo s u so s en b io lo g ía m olecular, este v a lo r se
u tiliz a d e fo rm a in d istin ta co n el peso m olecular.
P ro b le m a 2 .6 ¿Cuál es el peso molecular del hidróxido sódico (NaOH)?
S o lu c ió n 2.6
Peso atómico del Na 22,99

Peso atómico del O 16,00
Peso atómico del H +1,01
Peso molecular del NaOH 40,00

2.5 Moles y peso molecular: definiciones 25
P ro b le m a 2.7 ¿Cuál es el peso molecular de la glucosa (C6H120 6)?
S o lu c ió n 2.7
El peso atómico de cada uno de los elementos de este compuesto ha de
multiplicarse por el número de veces que cada elemento se halla en la molécula:
Peso atómico del C = 12,01

1 2 ,0 1 x 6 = 72,06
Peso atómico del H = 1,01
1 ,0 1 x 1 2 = 12,12
Peso atómico del O = 16,00
16x6= + 96,00
Peso molecular de CeH120 6 180,18
Por tanto, el peso molecular de la glucosa es 180,18 g/mol.
2.5.1 M o larid a d
U n a so lu ció n 1 m o lar (1 M ) co n tien e el p eso m o lecu la r d e u n a su stan cia (en
g ra m o s) p o r 1 L d e solución. P o r ejem plo, el p eso m o lecu la r d el N aC I is 58,44.
U n a so lu ció n 1 A id e N aC I, p o r tan to , co n tien e 58 ,4 4 g d e N aC I d isu elto s en u n
vo lu m en final d e 1.000 m L (1 L) d e agua. U n a so lu ció n 2 M d e N aC I co n tien e el
do b le d e e s a ca n tid a d (116,88 g ) d e N aC I disuelto en u n v o lu m en final d e hasta
1.000 m L d e agua.
N ota: M u ch o s pro to co lo s dan la instru cc ió n « A g u a q.s. o A g u a c.s.p.». Esto
sig n ifica añ a d ir a g u a h a sta a lc an za r el v o lu m en d eseado (h a b itu a lm e n te esta
op eració n se h a c e co n u n a p ro b e ta o co n alg ú n o tro m ateria l d e lab o ra to rio para
m ed ir vo lúm enes). Q .s. sig n ifica quantum sufficit. C .s.p. sig n ifica cantidad sufi
cie n te para.
P ro b le m a 2.8 ¿Cómo se preparan 200 mL de NaCI 0,3 M?
S o lu c ió n 2.8
El peso molecular del NaCI es 58,44. El primer paso para resolver este problema
es calcular cuántos gramos se necesitan para obtener 1 L de una solución 0,3 M.
Esto se puede hacer mediante la regla de tres: «58,44 g es a 1 M como x g es a
0,3 M». Esta relación, expresada matemáticamente, se puede escribir de la
siguiente forma. A continuación, resolveremos para x.
58,44 g _ x g
1 M _ 0,3 M
Como las unidades en ambos lados de la ecuación son equivalentes (si

tuviéramos que multiplicar un lado por otro, todos los términos se anularían),
no nos afectarán al cálculo. Multiplicando ambos lados de la ecuación por 0,3
obtendremos,
Por lo tanto, para preparar 1 L de NaCI 0,3 M, se requieren 17,53 g de NaCI.
Se puede establecer otra regla de tres para calcular cuántos gramos de NaCI se
necesitan para preparar 200 mL de una solución de NaCI 0,3 M. Se puede
expresar como «17,53 g es a 1.000 m L como x g es a 200 m b , o expresado
en términos matemáticos:
17,53 g x g
1.000 mL “ 200 mL
Multiplique ambos lados de la

ecuación por 200 para simplificar el
denominador de la derecha y de este
modo se despeja x.
3.506 Simplifique la ecuación.
------ — x — 3,51
1.000
Por tanto, para preparar 200 mL de una solución de NaCI 0,3 M, se han de
disolver 3,51 g de NaCI en un volumen final de 200 mL de agua destilada.
P ro b le m a 2.9 ¿Cómo se preparan 50 mL de hidróxido sódico (NaOH)

20 milimolar (m/W)?
S o lu c ió n 2.9
Primero, como es mejor expresar los términos en molaridad (M), convertiremos
el valor 20 m/W en M:
1M
A continuación, plantearemos la regla de tres para calcular la cantidad de NaOH

(peso molecular 40,0 g) que se necesita para preparar 1 L de NaOH 0,02 M. Use
la expresión «40,0 g es a 1 M como x g es a 0,02 M». Resolveremos para x.
40,0 g xg
1M 0,02 M
(40,0) (0,02) Multiplique ambos lados de la ecuación por 0,02.
Por lo tanto, para preparar 1 L de NaOH 0,02 M, añadir 0,8 g de NaOH al agua
hasta un volumen final de 1.000 mL.
Ahora, plantearemos la regla de tres para averiguar qué cantidad es necesaria
para preparar 50 mL y resolveremos para x. (La relación se propondrá de la
siguiente forma: 0,8 g es a 1.000 mL como x g es a 50 mL.)
0,8 g *9
50 mL
(0 ,8 )(5 0) (x )(5 0 ) Multiplique ambos lados de la ecuación por 50.

1 .000 — 50 Esto anulará el 50 del denominador del lado
derecho de la ecuación.
----- - — x — 0,04
1.000
Por lo tanto, para preparar 50 mL de NaOH 20 m/W, hay que disolver 0,04 g de
NaOH hasta un volumen final de 50 mL de agua destilada.
P ro b le m a 2 .1 0 ¿Cuántos moles de NaCI hay en 50 mL de una solución al

0,15 M?
S o lu c ió n 2 .1 0
Una solución de NaCI 0,15 M contiene 0,15 moles de NaCI por litro. Como
nosotros queremos averiguar cuántos moles hay en 50 mL, necesitamos utilizar
un factor de conversión para pasar los litros a mililitros. La ecuación se puede
escribir de la siguiente manera:
1L 0,15 mol
x mol = 50 mL x -
' 1.000 mL >
Tenga en cuenta que los términos de la derecha de la ecuación se anulan a

excepción de los moles. Multiplicando el numerador y el denominador el resul
tado nos da
, (50) x (1) x (0,15) mol 7,5 mol

x mol - -— -— — — — — ------= -- ------ = 0,0075 mol
1.000 1.000
Por lo tanto, 50 mL de NaCI 0,15 M contienen 0,0075 moles de NaCI.

i 500 g 3646-01
A t S odium C itra te,
^ D ihydrate, G ra n u la r NajHPCVTHjO.wi™
BAKER AN ALYZE D'® 1A.C .S . R ea ge nt [

Sodium
H O C (C O O N a )(C H 2C O O N a )2 • 2 H *0
Phosphate
Dibasic
AC TU AL A N A L Y S IS , LO T H 35 72 8
Meets A C S Specifications TAflOPt»; Heptahydrate
CA S NO
ü ■ insoluole Matter ................
J ■ CH of 5% Solution at 25°C .
0.002
8.1
MADE Hi
■ A Chloride (C l)................ 0002

Sulfate (SO.)....................
Ammonia (as NHJ ...........
■ Calcium (Ca)......................
Trace Impurities (in ppm)
■ H.a^Met.Ma.Pb, .
■ FIGURA 2-1 El citrato

sódico y el fosfato sódico
pueden presentarse en forma
hidratada.
7914
2.5.2 P re p a ra n d o so lu cio n e s m o lare s en ag u a

con co m p u e sto s h id ra ta d o s
M u c h o s co m p u e sto s q u e se utiliz an en el laboratorio, pese a e s ta r sec o s y en form a
cristalina, están «hidratados». E sto s ig n ifica q u e los com p u e sto s tien en m oléculas
d e ag u a u n id o s a ellos. E jem plos d e ello son el citrato só d ico dih id ratad o (c o n dos
m oléculas d e ag u a ) y el fosfato só d ico dib ásico hep ta h id ratad o (c o n siete
m oléculas d e ag u a ) (F ig u ra 2-1). U sted p o d rá e n c o n trar en la etiq u eta d el envase
el p eso m o lecu la r d el co m p u e sto b ajo la n o tac ió n F W (del inglés Formula
Weight). E n el ca so d e lo s co m puestos h id rata d o s, F W incluye el p eso co n el
q u e c o n trib u y e el p eso d el ag u a (18,015 g/m ol). P o r lo tan to , estas m o lécu la s de
ag u a form arán tam b ién p arte d el ag u a q u e se utilice p a ra d iso lv e r el com puesto.
E sto su p o n e q u e estas m o lécu la s d e ag u a h ay q u e tenerlas en c u e n ta p ara q u e la
so lu ció n final n o esté a u n a co n c en tra ció n m ás d ilu id a q u e la q u e se desea. E l
sig u ien te p ro b lem a le m ostrará có m o se re aliza este cálculo.
P ro b le m a 2.11 Usted quiere preparar 500 mL de una solución de fosfato

sódico dibásico heptahidratado (Na2H P04 H20 ; FW 268,07) 250 mM. ¿Qué
cantidad de compuesto y qué cantidad de agua se deben mezclar?
S o lu c ió n 2.11
Primero calcularemos qué cantidad del compuesto Na2HP04 se debe añadir
para obtener 500 mL (volumen final) de solución 250 m/W.
250 m/W equivale a 0,25 M, como se puede ver:
250 m/W >

_
1.000 m/W
Ahora calcularemos qué cantidad equivale a 0,25 /W:
0,25 M 268,07 g _ 67,02 g

litro mol litro
Por lo tanto, si nosotros estamos preparando un litro (1.000 mL) de solución,

necesitamos 67,02 g de Na2HP04. Sin embargo, sólo necesitamos preparar
500 mL. Planteamos la relación:
67,02 g *9
1.000 mL ' 500 mL
Resolviendo para x, obtenemos
_ (67,02
— ga a)(5
—0 0------
m L))_ _ 3 3 51
1.000 mL M
Por lo tanto, necesitamos 33,51 g de Na2H P 04 en un volumen final de 500 mL

para obtener una solución 0,25 M. Ahora calcularemos cuántos moles suponen
33,51 g. Utilizando el FW de 268,07 g/mol, tenemos
1 mol
33,51 g > = 0,125 mol
268,07 g
De modo que disolveremos 0,125 moles de fosfato sódico dibásico heptahidra-

tado en un volumen final de 500 mL. Sin embargo, como el agua es parte del
compuesto (y parte de su FW), también estaremos añadiendo 0,875 moles de
agua durante este proceso:
7 mol de agua
0,125 mol de compuesto > = 0,875 mol de agua
1 mol de compuesto
Dado que el peso molecular del agua es 18,015 g/mol y un gramo de agua
equivale a 1 m L de agua, cuando añadimos los 33,51 g de fosfato sódico
dibásico heptahidratado también estamos añadiendo el equivalente a 15,76 mL

de agua:
, 18,015 mL
0,875 mol x — ----- -— = 15,76 mL
mol
Por lo tanto, para obtener 500 mL de fosfato sódico dibásico heptahidratado

250 mM, debe disolver 33,51 g del compuesto en 484,24 mL (500 mL —
15,76 mL) de agua.
Una relación que incluye el cálculo de la cantidad de agua que aporta el

compuesto hidratado de este ejemplo sería
0,25 mol 7 mol de agua 18,015 mL de agua

0,5 litros x - í - ------ x ------ —-------------- x — --------- ----- -—
litro 1 mol de compuesto mol
- 15,76 mL
La anterior relación se puede utilizar, como método general para calcular la

cantidad de agua aportada por un compuesto hidratado, de la siguiente forma:
V x M x moléculas de agua x 18,015 mL de agua
= mL de agua del compuesto hidratado
donde V es el volumen final en litros, M es la molaridad deseada (en mol/litro), y

«moléculas de agua» es el número de moléculas de agua unidas al compuesto.
N ota: Este cálculo no es necesariamente tan largo y puede simplificarse

pesando la cantidad deseada del compuesto que se necesita para obtener la
molaridad correcta y llevando el volumen (c.s.p.) hasta la cantidad deseada en
una probeta.
2.5.3 D ilu y e n d o so lu cio n e s m o la re s

L a dilu ció n d e soluciones sto ck p reparadas a u n a co n c en tra ció n m o lar p a ra la
ob ten c ió n d e so lu cio n es d e m e n o r m o laridad se re aliza tal co m o se d escrib e en la
S ecc ió n 2.1.
P ro b le m a 2 .1 2 A partir de una solución de Tris 1 M, ¿cómo se preparan

400 mL de Tris 0,2 M?
S o lu c ió n 2 .12
La siguiente ecuación se utiliza para resolver x, la cantidad de Tris 1 M que se ha
añadido a 400 mL de una solución 0,2 M.
1M x X m L = 0,2 M
400 mL
Las unidades de mL se anulan ya

que aparecen tanto en el
numerador como en el
denominador del lado izquierdo
de la ecuación. Multiplique los
valores del numerador.
x = (0,2) (400) Multiplique ambos lados de la
ecuación por 400.
Por lo tanto, a 320 mL (400 mL — 80 mL = 320 mL) de agua destilada, añada

80 m L d e T risI M, pH 8,0, para obtener una solución 0,2 M y un volumen final de
400 mL.
P ro b le m a 2.13 ¿Cómo se preparan 4 mL de una solución de NaCI 50 mM a

partir de un stock de NaCI 2 M ?
S o lu c ió n 2.13
En este ejemplo, hay que incluir en la ecuación un factor de conversión para que
la molaridad (M) se pueda convertir en milimolaridad.
1.000 m/W x mL
Multiplique los numeradores. (En

el lado izquierdo de la ecuación las
unidades M y mL se pueden anular
ya que aparecen tanto en el
numerador como en el
denominador.)
2.000x m/W = 200 m/W Multiplique ambos lados de la
ecuación por 4.
200 m/W Divida cada lado de la ecuación
entre 2.000 m/W.
De este modo, se añaden 0,1 mL de NaCI 2 M de la solución stock a 3,9 mL de

agua destilada para dar lugar a un volumen final de 4 mL de NaCI 50 m/W.
2.5.4 C o n v irtie n d o m o la rid a d en p o rce n ta je

C o m o la m o laridad es u n a co n c en tra ció n e x p resad a en g ram o s p o r 1.000 m L,
co n v e rtirla a u n v a lo r en p o rc en taje es re lativam ente fácil b asá n d o se en la
ex presión d e cantidad d e g ram os en 100 m L. E ste tipo d e cá lcu lo se m u estra en
el sig u ien te problem a.
P ro b le m a 2 .1 4 Exprese una solución de NaCI 2,5 M en un porcentaje.
El peso molecular en gramos del NaCI es 58,44. El primer paso para solucionar el
problema es determinar cuántos gramos de NaCI hay en una solución de NaCI
2,5 M . Esto se puede llevar a cabo utilizando una regla de tres: «58,44 g es a 1 M
como x g es a 2,5 M». La expresión matemática de esta relación es la siguiente:
58,44 g xg
1M = 2,5 M
Resolver para x.
(58,44) (2,5) Multiplique ambos lados de la

ecuación por 2,5.
146,1 = x Simplifique la ecuación.
Por lo tanto, para preparar una solución de NaCI 2,5 M, se disuelven 146,1 g de
NaCI hasta un volumen final de 1 L.
El porcentaje es una expresión de una concentración de partes por 100. Para
determinar la relación entre número de gramos de NaCI presentes en una
solución de NaCI 2,5 M y el equivalente en una concentración en porcentaje,
las relaciones se pueden plantear de la siguiente forma: «146,1 g es a 1.000 mL
como x g es a 100 m b .
146,1 g x g
1.000 mL 100 mL
Resolver para x.
(146,1)(100) Multiplique ambos lados de la

1.000 ecuación por 100 (el denominador del
lado derecho de la ecuación).
Simplifique la ecuación.
Por lo tanto, una solución de NaCI 2,5 M contiene 14,6 g de NaCI en 100 mL, que
es equivalente a una solución de NaCI al 14,6%.
2.5.5 C o n v irtie n d o p o rce n ta je en m o la rid a d

P ara co n v e rtir u n a so lu ció n e x p resad a co m o p o rc en taje a u n a so lu ció n ex p resad a
en m o larid ad , s e tra ta d e ca m b ia r u n a ca n tid a d p o r 100 m L a u n a cantidad
eq uivalente p o r litro (1 .000 m L ), ta l co m o se m u estra en el s ig u ie n te problem a.
P ro b le m a 2 .1 5 ¿Cuál es la concentración molar de una solución de NaCI al

10%?
S o lu c ió n 2.15
Una solución de NaCI al 10%, por definición, contiene 10 g de NaCI en 100 mL
de solución. El primer paso para resolver el problema es calcular la cantidad de
NaCI en 1.000 mL de la solución al 10%. Esto se consigue mediante la ecuación
de relaciones siguiente:
10g xg
100 m L _ 1.000 mL
Resolver para x.
(1 0 )(1 .000) _ ^ Multiplique ambos lados de la

100 — ecuación por 1.000 (el denominador
del lado derecho de la ecuación).
— -— = x = 100
100
Por lo tanto, 1.000 mL de una solución de NaCI al 10% contiene 100 g de NaCI.
Utilizando el peso molecular en gramos del NaCI (58,44), se puede establecer
una ecuación de relaciones para obtener la molaridad. En la siguiente ecuación,
determinamos la molaridad (M) equivalente a 100 g:
x M 1M
100 g _ 58,44 g
Resolviendo para x.
^_ 100 _ ^ Multiplique ambos lados de la ecuación por 100

58,44 ' y divida entre 58,44.
Por lo tanto, una solución de NaCI al 10% es equivalente a una de 1,71 M.

2.6 N O R M A L ID A D
U n a so lu ció n 1 n o rm al (1 N ) es eq u iv a le n te al p eso m o lecu la r en g ra m o s d e u n
co m puesto d iv id id o en tre el n ú m ero d e iones d e h id ró g en o p re sen tes en la
so lu ció n (e s decir, disu elto en u n litro d e agua). P o r ejem plo, e l p eso m olecular
en g ra m o s del ác id o clo rh íd ric o (HC1) es 36,46. C o m o en u n a so lu ció n de HC1, u n
ion d e H p u ed e co m b in arse co n C l- p a ra fo rm a r HC1, u n a so lu ció n d e HC1 1 N
c o n tien e 36,46/1 = 36 ,4 6 g d e HC1 e n 1 L. P o r lo tan to , u n a so lu ció n d e H C 1 1 N
e s equ iv a le n te a u n a so lu ció n d e HC1 1 M . E n el sig u ien te ejem plo, el p eso
m o lecu la r en g ra m o s d el ác id o sulfúrico (H 2S O 4) es 98,0. C o m o en u n a
so lu ció n d e H 2SO 4, se p u ed e n co m b in ar dos iones d e H + con u n o d e S 0 42 - p ara
d a r lu g a r a H 2S O 4, u n a so lu ció n de H 2SO 4 1 N co n tien e 98 ,0 /2 = 49 ,0 g de H 2S O 4
en 1 L . C o m o se u tiliz a la m itad d e H 2S O 4 p a ra p re p ara r u n a so lu ció n d e H 2S O 4
1 N, u n a so lu ció n d e H 2S 0 4 1 N eq u iv a le a u n a so lu ció n d e H 2S 0 4 al 0,5 M .
N o rm a lid a d y m o laridad están relacio n ad as p o r la ecuación
N = nM
d o n d e n es igual al n ú m ero d e H + reem p laza b les (o N a+) o iones O H por

m olécula.
P ro b le m a 2 .1 6 ¿Cuál es la molaridad de una solución de carbonato sódico

(Na2C 0 3) a 1 NI
El carbonato sódico tiene dos iones de Na+ reemplazables. La relación entre
normalidad y la molaridad es
N = nM
Resolviendo para M se obtiene el siguiente resultado:
Divida ambos lados de la ecuación entre n

(número de iones de Na+ reemplazables).
En este problema, el número de iones +

reemplazable, n, es 2. La normalidad, N, es 1.
0,5 = M
Por lo tanto, una solución de carbonato sódico 1 N es equivalente a una solución

de carbonato sódico 0,5 M.
2 .7 pH 35
2.7 p H
L a m ay o ría d e n o so tro s, la p rim era fo rm u la q u ím ic a q u e ap ren d em o s, p o r lo
g en e ral en la infancia, es la del ag u a, H 20 . U n a m o lécu la de ag u a está co m p u e sta
p o r d os áto m o s d e h id ró g en o y p o r u n á to m o de oxígeno. S in em bargo, lo s átom os
d el ag u a están aso c ia d o s sólo tran sito riam e n te d e esta form a. E n u n m om ento
d ad o , u n d ete rm in a d o nú m ero d e m o lécu la s d e a g u a s e d iso ciarán en protones
(H ^) e h id ro x ilo (O H - ). E sto s iones se re aso cia rán en u n plaz o d e tiem p o m u y
corto p a ra fo rm a r d e nu ev o u n a m o lécu la H20 d e agua. L a diso ciac ió n y
re aso cia ció n d e estos áto m o s d e ag u a se p u ed e re p rese n ta r d e la sig u ie n te form a:
H20 ^ H + + OH-
E l m o d elo actual p lan tea q u e el pro tó n es ce d id o a o tra m o lécu la d e ag u a para

fo rm a r el ion hid ro n io (H 3O ). P o r lo tan to , u n a rep resen tació n m ás aju stad a de la
d iso ciac ió n d e a g u a sería la siguiente:
H20 + H20 ^ H30 + + OH-
S in em bargo, p a ra m u ch o s cálculos en quím ica, es m ás sen c illo y ad ecuado

co n sid erar al p ro tó n H ^ co m o el pro d u c to d e la diso ciac ió n d el H 20 (antes que
parte d el ion h id ro n io H 3O ).
L a m e d id a d e la co n c en tra ció n de p ro to n es ( t L ) en u n a so lu ció n vien e d ad a p o r
el v a lo r d e su p H E l p H d e u n a so lu ció n se defin e co m o el lo g aritm o neg a tiv o en
b a s e 10 d e su co n c en tra ció n d e protones:
p H = —log[H + ]
E n esta no m en c la tu ra, lo s corchetes sig n ifican concentración. U n lo g a ritm o

(log) es u n ex p o n en te, u n n úm ero, d e m e n o r tam añ o , escrito en la parte su p erio r
d ere c h a d e o tro , llam ado b a s e , al cual la b a s e d eb ería s e r elevada. P o r ejem plo,
p ara 102, el 2 es el e x p o n e n te y el 10 es la b ase . E n 102, la b ase , 10, d e b e se r
ele v ad a a la seg u n d a po ten c ia , q u e q u iere d e c ir q u e 10 d eb e se r m u ltip licad o p o r sí
m ism o d os v eces. E sto d ará u n re su lta d o d e 100, ta l co m o se m u estra aquí:
102 = 10 x 10 = 100
E l log aritm o d e 100 es 2, y a q u e es el ex p o n e n te al q u e h a y q u e ele v ar a 10 para

o b te n e r 100. E l lo g aritm o d e 1.000 es 3 , y a q u e 103 = 1.000:
103 = 10 x 10 x 10 = 1.000
E l lo g aritm o de u n n ú m ero s e p u e d e e n c o n trar en la m ay o ría d e las calculadoras

intro d u cien d o el nú m ero y lu eg o p re sio n a n d o la tec la d e log.
E n el ag u a p ura, la co n c en tra ció n d e H + ([H +]) es igual a 10- 7 M . E n o tras

p alabras, en 1 L d e ag u a , la co n c en tra ció n d e p ro to n es es 0,0000001 M . P o r lo
tan to , el p H d el ag u a se ca lcu la d e la sig u ie n te form a:
p H = —l o g ( l x 1 (T 7) = - ( - 7 ) = 7
E s decir, el ag u a p u ra tien e u n p H d e 7,0.

D e fo rm a p arecid a , la co n c en tra ció n d el ion h id ro x ilo (O H - ) en el ag u a es
eq u iv a le n te a la co n c en tra ció n d e p ro to n es (H ^). L a co n c en tra ció n d e O H -
tam b ién es 1 x 10- 7 M
E l ra n g o del v a lo r d el p H o scila d e 0 a 14. L as soluciones co n u n p H in ferio r a 7
s o n ácidas. L as so lu cio n es co n u n pH su p erio r a 7 son alcalinas o básicas. E l agua,
co n u n p H d e 7 , se c o n sid era u n a so lu ció n neutra.
D eta lla n d o u n po co m ás, u n ácid o se d efin e co m o la sustan cia q u e cede un
pro tó n (o ion hid ró g en o ). C u an d o se añ a d e u n ácido a ag u a p u ra , la co ncentración
d e iones d e h id ró g en o au m e n ta p o r en c im a d e 1 x 10~7 M. L a m o lécu la que
re cib e el p ro tó n se d en o m in a b a se con ju gad a. C u an d o u n ác id o p ierd e un
protón, éste se io n iz a (tien e carga). L a p érd id a d e u n p ro tó n h ac e q u e la
m o lécu la d e ácido pase a te n e r u n a c a rg a negativa. C u an d o n os re ferim o s a u n a
su stan cia co m o u n ác id o « fuerte», indicam os q u e prá cticam e n te la totalidad del
ác id o está ionizado (su ion H + e s tá d iso ciad o casi en su totalidad). P o r ejem plo, el
HC1, u n ác id o fuerte, se d iso c ia d e la s ig u ie n te form a:
HC1 ^ H + + C l-
E1 ion h id ró g en o d e u n ácido «d éb il» se diso cia en m e n o r m edida.

U n a b a se e s u n a su stan cia q u e ac ep ta u n p rotón. U n a b a s e «fu erte» es aq u e lla
en la q u e la m ay o ría se io n iza en ag u a p ara d a r iones O H - . E l h id ró x id o sódico,
p o r eje m p lo , es u n a b a s e fu e rte y se d iso cia en ag u a d e la sig u ien te form a:
NaO H ^ N a+ + O H -
C u an d o se añ a d e u n a b a s e a ag u a p u ra , el io n O H - se d iso cia d e la base. Este

io n h id ro x ilo p u ed e asociarse c o n p ro to n es p re sen tes en e l ag u a p ara form ar
m oléculas d e H2O , red u cien d o la co n c en tra ció n d e p ro to n es e n la so lu ció n e
increm entan do el p H d e la solución.
E l ag u a es u n a m o lécu la ún ica. D a d o q u e se p u ed e d iso ciar en iones H com o
O H - , ac tú a tan to com o u n ác id o y com o u n a b ase. P o d em o s d efin ir la disociación
d e los dos tip o s de iones en el ag u a com o u n a co n stan te d e n o m in ad a K w. D ado que
tan to lo s iones H* co m o O H - en el ag u a tien en la co n c en tra ció n de 1 x 10 - 7 M, la
co n stan te d e diso ciac ió n d el a g u a es igual a 1 x 10-14.
[H+ ][O H - ] = [1 x 10- 7 ][1 x 10- 7 ] = 1 x 10-14

P o r tan to , ten e m o s
K w = [H+][O H - ]
P o d em o s a ju star la ecu ac ió n d e tal fo rm a que
'H+' = i á n
Si el ag u a tien e u n pH , tien e p o r tan to u n p O H , q u e se defin e co m o el logaritm o

neg a tiv o d e la co n c en tra ció n d e O H - .
p O H = - l o g [OH]
pH + pO H - 14
o, re o rdenando
pO H = 14 - pH
P o r lo tan to , si se co n o c e el v a lo r del p H o d el p O H , se pu ed e c a lcu lar el va lo r

d e su contrario.
P ro b le m a 2.17 Una solución de un ácido fuerte tiene una concentración de

protones de 1 x 10-5 M. ¿Cuál es el pH de la solución?
S o lu c ió n 2.17
El pH es el logaritmo negativo de 1 x 10~5.
pH - —lo g [H+] - —log(1 x 1 (T S) = - ( - 5 ) = 5
Por lo tanto, el pH de la solución es 5. Es ácido.

P ro b le m a 2 .1 8 La concentración de protones de una solución de un ácido

fuerte es 2,5 x 10~4 M. ¿Cuál es el pH de la solución?
La le y d el p ro d u cto d e lo g a ritm o s establece que, para cualquier número
positivo M, N y a (donde a es diferente a 1), el logaritmo de un producto es la
suma de los logaritmos de los factores:
loga MN = loga M + loga N
Como estamos trabajando en base 10, a es igual a 10.
Utilizaremos la ley del producto de logaritmos para resolver el problema.
pH = —log(2,5 x 10~8)
- —(log2,5 + loglO-5)
- - [0 ,4 0 + (- 5 )]
- - ( 0 ,4 0 - 5 )
= - ( -4 ,6 )
- 4,6
Así, la solución tiene un pH de 4,6. Aunque las matemáticas nos muestran un

concepto fundamental de los logaritmos, como pone de manifiesto la ley del
producto y, por lo tanto, tiene valor en cualquier expresión en matemáticas, la
respuesta puede recibir una respuesta inmediata averiguando el logaritmo del
valor 2,5 x 10-8 en una calculadora.
P ro b le m a 2 .1 9 El pH de una solución de un ácido fuerte es 3,75. ¿Cuál es la

concentración de protones en la solución?
Para calcular la concentración de protones en este problema necesitaremos
averiguar el an tilo g del pH. Un antilog se calcula realizando el proceso contrario
al realizado para averiguar el logaritmo. El log de 100 es 2. El antilog de 2 es 100.
El log de 1.000 es 3. El antilog de 3 es 1.000. En aquellas calculadoras que no
tengan una tecla para el cálculo del antilog, esta operación se puede realizar
entrando el valor, presionando la tecla 10x y presionando el signo =.
(Dependiendo del tipo de calculadora que se utilice, se puede necesitar presio
nar la tecla SH IF T para poder acceder a la función 10x.)
pH = —log[H+] Ecuación para calcular el pH.
-lo g [H +] = 3,75 El pH es igual a 3,75.
log[H+] = —3,75 Multiplique cada lado de la ecuación por —1.
[H+] = 1,8 x 10-4 Calcule el antilog de cada lado de la ecuación.
N o ta: Al realizar el antilog del log de un número,
como se tratan de operaciones opuestas, se
anulan entre sí. Por tanto, equivale a no hacer
nada sobre el número. Por ejemplo, el antilog del
log de 100 es 100.
Por lo tanto, la concentración de protones es de 1,8 x 10-4 M.
P ro b le m a 2 .2 0 Una solución tiene un pH de 4,5. ¿Cuál es el pOH de la

solución?
El pOH se obtiene restando el pH de 14.
pOH = 1 4 - pH
pOH = 1 4 - 4 ,5 = 9,5
Por lo tanto, el pOH de la solución es de 9,5.
P ro b le m a 2.21 ¿Cuál es la concentración de OH y el pH de una solución de

HCI 0,01 M?
S o lu c ió n 2.21
Dado que el HCI es un ácido fuerte todos los átomos de hidrógeno estarán
disociados en forma de protones H+. La concentración de ion H+ será, por tanto,
equivalente a la concentración molar; es decir, 1 x 10-2 M. Nosotros podemos
utilizar la siguiente relación para determinar la concentración del ion OH- .
Por lo tanto, una solución de HCI 0,01 M tiene una concentración de OH de

1 x 10-12 M. Su pH se calcula como
pH = -lo g [H +] = —lo g (l x 10“ 2) = - ( - 2 ) = 2
O se puede calcular por otra vía
pOH = —log[OhT] = —log[l x 1012] = 12
y como el pH = 14 — pOH, obtenemos
pH = 1 4 - 12 = 2
La solución tiene un pH de 2,0.
P ro b le m a 2.22 ¿Cuál es el pH de una solución de hidróxido sódico (NaOH)

0,02 M?
El hidróxido sódico es una base fuerte y, por tanto, está esencialmente ionizado
en Na+ y OH- por completo en una solución diluida. Por lo tanto, la
concentración de OH- es 0,02 M, la misma que la concentración de NaOH.
Como base fuerte, la contribución de los protones del agua es negligible y no
se tendrán en cuenta. El primer paso para resolver el problema es determinar el
pOH. El valor del pOH se deberá restar de 14 para obtener el pH.
pOH ■- log(0,02)
= - ( - 1 ,7 ) = 1,7
pH = 1 4 - 1,7 = 12,3
De este modo, el pH de la solución de NaOH 0,02 M, es 12,3.
2.8 p/ca Y L A E C U A C IÓ N
DE H E N D E R S O N -H A S S E LB A LC H
S egún la te o ría d e lo s ácidos y las b ase s d e B ronsted, u n ácid o se defin e co m o u n a
sustan cia q u e d o n a u n p ro tó n (un ion h id rógeno). U n a b ase es u n a sustan cia que
acepta. C u an d o u n ácido d e B ro n sted p ierd e u n ion h id ró g en o se tran sfo rm a en
u n a b a s e de B ronsted. E l ác id o orig in al se defin e co m o ácid o co n ju gad o. L a base
2.8 pKa y la ecuación de Henderson-Hasselbalch 41
q u e se cre a a p a rtir d el ác id o p o r la p érd id a d e u n ion h id ró g en o se den o m in a b ase

con ju gad a.
L a d iso ciac ió n d e u n ác id o en ag u a s ig u e la fó rm u la g eneral
H A + H 20 ^ H 30 + + A -
d o n d e H A es el ác id o co n ju g a d o , H 2O es la b a s e co n ju g a d a, H3O es el ácido
co n ju g a d o y A - es la b a s e conjugada.
L a io nización de u n ácido se pu ed e esc rib ir co m o u n a sim ple diso ciació n , de tal
fo rm a que:
HA ^ H+ + A -
L a diso ciac ió n d el ácido H A se p ro d u c irá a u n a d ete rm in a d a ta s a q u e dep e n d e

d el tip o d e ácido e n particular. S in em b a rg o , h a y q u e o b serv ar q u e la direc ció n de
las flechas v a en lo s d os sentidos. E l ác id o se d iso cia en lo s iones q u e los
co m p o n e n , p ero los iones v u elv e n a u n irse de nu ev o p a ra fo rm a r el ác id o original.
C u an d o la ta sa d e diso ciac ió n en su s iones es igual a la ta sa d e reaso ciació n de
iones, s e dice q u e el siste m a está en eq u ilib rio. U n ác id o fuerte alc an za rá el punto
d e equilibrio c u a n d o esté to talm en te disociado. U n ác id o débil ten d rá u n po rc en
taje m e n o r d e m o lécu la s en estado d e d iso ciac ió n y alc an za rá el equilibrio en un
p u n to in ferio r al 100% d e ionización. L a co n c en tra ció n d e ácido a la cual se
a lc an za el e q u ilib ro se llam a con sta n te d e d isociación d e los ácid os y se d esigna
co n el sím bolo K a. E sta co n stan te está re p rese n ta d a p o r la sig u ie n te ecuación:
„ [H + ][A -]
**- - P aT
U n a m ed id a d e Ka p a ra u n ácido d éb il v ien e d a d a p o r su p Ka, q u e eq u iv a le al
logaritm o n e g a tiv o d e Ka:
p K a = —lo g Ka
E l p H está re la cio n ad o con el p K a p o r m edio d e la ecu ación d e H e n d e r s o n -

H asselb alch :
„ „ . , [base conjugada]
= P** + los---- ----------
, [A "l
= P* “ + [HA]
L a ecu ac ió n d e H e n d erso n -H asselb alc h se p u ed e u tiliz ar p ara c a lcu lar la

ca n tid a d d e ác id o y d e b a s e c o n ju g a d a q u e se h an d e co m b in ar p ara p re p ara r la
so lu ció n d e u n tam p ó n a u n determ in ad o p H , c o m o se p u ed e v e r en el siguiente
problem a.
P ro b le m a 2 .2 3 Usted desea preparar 2 L de tampón fosfato sódico 1 M a pH

8,0. Tiene una solución stock de fosfato sódico monobásico (NaH2P 0 4) 1 M y una
solución de fosfato sódico dibásico (Na2HP04) 1 M. ¿Qué cantidad de cada una de
las soluciones stock se necesitan mezclar para obtener el tampón deseado?
El fosfato sódico monobásico (NaH2P 0 4) se disocia en agua como Na+y H2P 0 4_ . El
ion H2P 0 4_ (ácido fosfórico, el ácido conjugado) se disocia posteriormente a
HP042- (la base conjugada) + H+ y tiene un pKa de 6,82 a 25 °C. (Los valores
de pKc se pueden hallar en el catálogo de productos químicos de Sigma [Sigma,
St. Louis, MO] o en el libro The CRC Handbook o f Chemistry and Physics, David P.
Lide, Editor-Jefe, 87.a Edición, 2006, CRC Press, Boca Raton, Florida, USA.) Los
valores de pH y pKa se han de introducir en la ecuación de Henderson-
Hasselbalch para obtener la relación de la base y el ácido conjugado que se
han de mezclar para obtener un pH de 8,0. Tenga en cuenta que ambas soluciones
stock están a una concentración de 1 M. No es importante en qué relación se
mezclen ambas soluciones, siempre lo harán de forma que habrá un mol de
moléculas de fosfato por litro.
[A- ] Introduzca los valores del pH y del

P — P o + °® ] h a ] pKa en la ecuación de Henderson-
Hasselbalch.
, [HPOM
lo9M
[HPO¿ 1 Reste el valor 6,82 de ambos lados de
1 ,1 8 — og j-|_j2pQ—j la ecuación.
[HP04~1 Calcule el antilog de cada uno de los

antilog 1,18 = ^ p Q - j = 15,14 |ac|os |a ecuac¡6n
Por lo tanto, la relación de HP04 respecto a H2P 0 4_ es igual a 15,14. Para

obtener el tampón de fosfato sódico 1 M, se han de mezclar 15,14 partes de
Na2HP04 con una parte de N a ^ P O * 15,14 partes de Na2HP04 más una parte de
NaH2P04 es un total de 16,14 partes. La cantidad de cada solución stock que hay
que mezclar para obtener 2 L del tampón se calcula de la siguiente forma:
Para Na2HP04, la cantidad es igual a
15.14
— 1— x 2 L = 1,876 L
16.14
Para NaH2P 0 4, la cantidad es igual a
— — x 2 L — 0,124 L
16.14
Cuando se mezclan estos dos volúmenes, se obtendrá un tampón fosfato sódico

1 M con un pH de 8,0.
U n a co n c en tra ció n se defin e co m o la ca n tid a d de u n a d ete rm in a d a su stan cia en u n
vo lu m en determ inado:
cantidad
co n c en tra ció n = — ---------
v olum en
L as d ilu cio n es se p u ed e n ca lcu lar u tiliz an d o la ecu ac ió n CyVi = C2V2 o

m ediante el m éto d o d e an álisis d im en sion al. El p eso m o lecu la r d e u n com puesto
se ca lcu la c o m o la su m a d e lo s p eso s atóm icos q u e co m p o n e n la m o lécu la d e dicha
sustancia. U n a so lu ció n 1 m olar (1 M ) de u n p ro d u c to qu ím ic o co n tien e el peso
m o lecu la r d e d ich a sustan cia disu elto en u n v o lu m en to tal d e 1 L.
U n m éto d o g eneral p ara ca lcu lar la cantidad d e ag u a q u e ap o rta u n com puesto
h id rata d o cu an d o se p re p ara n solu cio n es m o lare s a p artir d e co m p u e sto s h id rata
dos, v ie n e d a d a p o r la relación
V x M x m o lécu la s d e ag u a x 18,015 m L de ag u a
= m L de ag u a del co m p u e sto hidratado
do n d e V e s el v o lu m en final en litros, M es la m o laridad d ese ad a (en m ol/litro), y

« m o lécu las d e a g u a » es el n ú m ero d e m o lécu la s d e ag u a u n id as al com puesto.
U n a so lu ció n 1 n orm al (1 N ) d e u n p ro d u c to quím ic o eq u iv a le a s u peso
m o lecu la r ex p resad o en g ram os divid id o en tre el n ú m ero d e iones h id rógeno
p re sen tes en la solución. E l p H es la m ed id a d e la co n c en tra ció n d e iones
h id ró g en o en u n a solución y se ca lcu la p o r m edio d el logaritm o neg a tiv o d e la
co n c en tra ció n d e iones h id ró g en o en la solución.
p H = -lo g [H + ]
E l p K a d e u n ác id o es equ iv a le n te al lo g aritm o neg a tiv o d e su co n stan te de

d iso ciac ió n (su K a), q u e se ca lcu la com o
Esta página se dejó intencionalm ente en blanco
Capítulo
Crecimiento celular
3.1 L A C U R V A D E C R E C IM IE N T O B A C T E R IA N O
C u an d o h ab la m o s d e crecim ien to c e lu la r en re feren cia a la s b ac terias o a otros
o rganism os u n icelu lares, n o s re ferim o s a la d iv isió n ce lu la r y al increm ento del
n ú m ero d e células, p ero n o al tam añ o d e u n a c é lu la en concreto. E s u n tem a de
n ú m ero s. L a ta sa a la cual la s bac terias se div id en en u n cultivo vien e d eterm inada
p o r d iv erso s factores q u e in clu y en la disp o n ib ilid ad de n u trien tes, la tem p eratu ra a
l a cual se re aliza la in cu b a ció n y la in ten sid ad d e aireación. D iv ersas cepas
b ac terian a s seg ú n su gen o tip o p u e d e n te n e r tasas d e crecim iento diferen tes d ep e n
dien d o d e u n m ed io d e c u ltiv o en concreto.
C o n o cer las características d el crecim iento ce lu la r es decisiv o p ara p o d e r
ap lica r d ete rm in a d as téc n ic as en b io lo g ía m o lecu la r y en biotecnología:
■ P a ra o b te n e r tran sfo rm ac io n e s co n plásm id o s en Escherichia coli d e fo rm a m ás

e fic ien te y re p ro d u cib le es m u y im p o rtan te q u e las células se ob ten g a n y
p reparen cu an d o se h a lle n en u n p u n to en co n c reto d e crecim iento y a u n a
co n c en tra ció n ce lu la r determ inada.
■ L a b a c te ria E. coli es m ás re cep tiv a a la in fec ció n co n b ac terió fa g o s d u ra n te un
d eterm in ad o p erío d o d e crecim iento.
■ L a m ejo r p ro d u c ció n de pro teín a s celulares o re co m b in an tes se o b tien e durante
u n a v e n ta n a d e tiem p o m u y d ete rm in a d a d el crecim iento celular.
P a ra d e te rm in a r la ta s a d e crec im ie n to c e lu la r e n u n cu ltiv o , h ab itu alm en te

s e c o m ie n z a c o n u n v o lu m e n g ra n d e (d e 50 a 100 m L ) d e l m ed io en el q u e se
in o c u la u n p e q u e ñ o c u ltiv o líq u id o d e cé lu la s (1 m L ) p re v ia m e n te crecid a s
d u ra n te la n o c h e anterior. E l m o m en to en q u e se re a liz a el in o cu lo e n e l c u ltiv o
d e g ra n v o lu m e n s e co n s id e ra el tie m p o ce ro . T ra s e l in o cu lo , el c u ltiv o se
in c u b a a la te m p e ra tu ra ap ro p ia d a (3 7 °C c o n a ire a c ió n p a ra la m a y o ría d e las
ce p as d e lab o ra to rio ). S e to m a u n a m u e s tra d e l cu ltiv o a d iv e rso s tie m p o s y se
m id e su d e n sid a d ó p tic a (D O ) o ab so rb an cia . D e s p u é s la m u e s tra s e d ilu y e a
u n a co n c e n tra c ió n d e te rm in a d a q u e p e rm ita c o n ta r p o s te rio rm e n te c o lo n ias
fá c ilm e n te y s e e x tie n d e en u n a p la c a d e P etri c o n te n ie n d o m ed io d e c u ltiv o
e n a g a r só lid o . L as p la c a s s e in cu b a n d u ra n te u n a n o ch e , tra s lo cu a l s e cu e n tan
46 CAPÍTULO 3 Crecimiento celular
la s co lo n ias. Si las co lo n ia s se h a lla n b ie n s ep a rad a s, se p u e d e a s u m ir q u e

ca d a c o lo n ia d e riv a d e u n a s o la c é lu la in d iv id u a l. L a D O d e la s m u estra s
o b te n id a s a d ife re n te s tie m p o s s e p u e d e c o rre la c io n a r co n el n ú m e ro d e
cé lu la s y, p o r ta n to , s e p u e d e o b te n e r la ta s a d e crecim ien to . P a ra ex p e rim e n to s
p o ste rio re s, si to d a s las c o n d ic io n e s d e c u ltiv o s o n las m ism a s q u e en la
m ed ició n , se p u e d e e x tra p o la r el n ú m e ro d e cé lu la s a p a r tir d e la m e d id a d e
la D O d e l cultivo.
C o m o ejem plo d e los tip o s d e cálcu lo q u e so n n ecesarios en este tip o de
proc ed im ie n to s, p o d em o s im ag in ar u n ex p e rim en to d e crecim iento tal com o se
h a descrito an terio rm en te en el q u e se h a in oculado u n v o lu m en d e 100 m L de
m edio d e cultivo c o n trip to n a co n 0,5 m L d e u n cultivo d e E. coli re alizad o la
n o c h e anterior. E n el m om ento d e la ino cu lac ió n se to m a u n a m u estra de 0,75 m L
y se m id e su D O a 55 0 nm (D O 550)- (P ara m u ch o s esp e ctro fo tó m etro s valores
su p erio res a 1,5 d e la D O 550 no sup o n en u n increm ento lin eal d e la D O resp ecto a
la den sid ad celular. P o r lo tan to , en cu ltiv o s ex tre m ad am e n te d en so s se d eben
re alizar dilu cio n es p a ra q u e la lec tu ra de la ab so rb an cia a 55 0 n m entre en valores
in feriores a 1,5.)
T ras la lec tu ra d e la absorbancia, h ay q u e h a c e r u n a d ilu ció n seriad a d e la
m u estra tran sfirien d o 0,1 m L de lo s 0,75 m L d e la m u estra a 9,9 m L de m edio de
cultivo. L a m u estra d ilu id a se m ez cla c o n el agitador, tras lo cual se to m an 0,2 m L
y se dilu y en en u n s eg u n d o tu b o d e en sayo q u e co n tien e 9,8 m L d e m edio de
cultivo. L a seg u n d a dilu ció n se v u elv e a a g itar p a ra ase g u rarse u n a correcta
m ez cla y se to m an 0,1 m L q u e se ex tienden so b re u n a p la c a d e agar. T ras u n a
n o ch e d e in cu b a ció n d e la p lac a se cu e n tan 4 2 0 colonias.
P ro b le m a 3.1 ¿Cuál es la dilución de células del segundo tubo de ensayo del

ejemplo descrito anteriormente?
S o lu c ió n 3.1
La dilución se puede expresar como un quebrado. Una alícuota de 0,1 mL
diluida en 9,9 m L se puede escribir como el quebrado o-1/ |o, donde el numerador
es el volumen transferido de la muestra (0,1 mL) y el denominador es igual al
volumen final de la dilución (0,1 m L + 9,9 mL = 10,0 mL). Múltiples diluciones
se multiplican juntas para dar la dilución final. Esta aproximación puede sim
plificarse si los quebrados se expresan a notación científica (véase el Capítulo 1
de cómo transformar un quebrado a notación científica):
0,1 m i 0 ,2 m i .
— --------r X — --------r = (1 X 10_2)(2 X 10-2)
10 mi 10 mi v 'v '
3.1 La curva de crecimiento bacteriano 47
Por lo tanto, la muestra en el segundo tubo de ensayo ha sido diluida hasta

2 x 10-4 (véase la Figura 3-1).
■ FIGURA 3-1 La dilución seriada

descrita en el Problema 3.1 en que 0,1 m i
de los 100 m L de cultivo se diluyen hasta
un volum en final de 10 m L y se to m an
9,8 mL 0,2 m L de la dilución y se diluyen en un
0,2 mL volum en final de hasta 10 mL. Estas

diluciones, expresadas en notación
10 mL
científica, muestran que se hizo una
100 mL
(1 x 1 0"2) x (2 x 10"2) = (2 x 1 0"4) dilució n total de 2 x 10- 4 .
P ro b le m a 3.2 ¿Cuál es la dilución de las células extendidas sobre la placa de

agar?
S o lu c ió n 3.2
Sobre la placa se extienden 0,1 mL de la dilución. Esto supone
0 ,1 m ) x 0 , 2 m l x 0 ,1 m i = (1 x 1 0 - 2 ) ( 2 x 1 0 ~ 2 ) ( 1 x 1 0 ~ 1 m i)
10 mi 10 ml ’
Por lo tanto, sobre la placa se extiende una dilución de 2 x 10 m L (Figura 3-2).

Hay que señalar que esta cantidad equivale a extender en la placa de agar
0,1 mL
100 mL 10 mL 10 mL
■ FIGURA 3 -2 El protocolo de dilución
(1 x 10-2) x (2 x 10-2) x (1 x10 “ 1) = 2 x 10-5 y siembra del Problema 3.2.
0,00002 mL (20 nL) directamente del cultivo de 100 mL. Realizar diluciones
permite al experimentador trabajar con volúmenes manejables, que en realidad
representan una parte muy pequeña de la muestra inicial.
P ro b le m a 3.3 ¿Cuál es la concentración de células viables en los 100 mL

del cultivo tras la inoculación?
S o lu c ió n 3.3
Cada colonia que se obtiene en la placa sobre la que se ha hecho la extensión
se puede asumir que proviene de una célula viable. Para averiguar el número
de células viable en los 100 mL de cultivo, hay que dividir el número de
colonias, contadas sobre la placa tras una noche de incubación, entre la
dilución realizada:
42 0 células 4,2 x 102 células 7 ,, . . ,

--------- c---- -- —----------f-------= 2,1 x 107 celulas/m L
2 x 10 m L 2 x 10 mL
Por lo tanto, hay 2,1 x 107 células/mL en los 100 mL de cultivo tras la inocu
lación.
P ro b le m a 3 .4 ¿Cuántas células viables hay en los 100 mL de cultivo?
S o lu c ió n 3.4
Multiplique la concentración de células por el volumen del cultivo:
2,1 x 10 células , q ,, ,
— x 100 mL = 2,1 x 10 células totales
mL
Por lo tanto, hay 2,1 x 10 células viables en los 100 mL de cultivo.
P ro b le m a 3.5 ¿Cuál es la concentración de células en el cultivo de una noche

del cual se tomaron 0,5 mL de muestra para inocular los 100 mL de medio
de cultivo? (Este problema se puede solucionar de dos formas, que se muestran
a continuación en 3.5(a) y en 3.5(b).)
3.1 La curva de crecimiento bacteriano 49
S o lu c ió n 3.5(a)
En el Problema 3.4, se averiguó que los 100 mL de cultivo, a tiempo cero,
contenían 2,1 x 109 células. Estas células provienen de los 0,5 mL del cultivo
utilizado para el inóculo, o
2,1 x 109 células 2,1 x 109 células Q „ , . ,

--- -------------------- --------------= ----- ------------------- =--------------= 4,2 x 109 células/mL
0,5 mL 5 x 10 mL
S o lu c ió n 3.5(b)
Se puede plantear una ecuación que describe la dilución del cultivo de
inoculación (0,5 mL de células de una concentración desconocida [x células/
mL] inoculados a 100 mL de medio de cultivo de triptona a una concentración
2,1 x 107 células/mL):
x células 0,5 mL 2,1 x 107 células

mL 100 mL mL
Ahora hay que despejar x. En la relación 0,5 mL/100 mL, la unidad de mL se

puede eliminar ya que está presente tanto en el numerador como en el deno
minador. Multiplicando los numeradores del lado izquierdo de la ecuación y
multiplicando ambos lados de la ecuación por 100 (expresado en notación
científica como 1 x 102) se obtiene
0,5x células _ (2,1 x 107 células)(1 x 102) _ 2,1 x 109 células

mL — mL mL
Dividiendo cada lado de la ecuación entre 0,5 (expresado en notación científica

como 5 x 10_1) se obtiene la siguiente ecuación:
x células _ 2,1 x 109 células _ 0,42 x lO9-^ 1' células _ 4,2 x 109 células
mL 5 x 10_1 mL mL mL
Por lo tanto, el cultivo de una noche tiene una concentración de

4,2 x 109 células/mL.
3.1.1 D a to s de las m u estras

S ig u ie n d o el ejem plo anterior, c a d a h o ra se to m an 0,75 m L d e m uestra, se valo ra
l a D O y c a d a m u estra se dilu y e y ex tien d e en p lacas d e a g a r p ara c a lcu lar el
n ú m ero d e células. E l c o n ju n to d e datos q u e se o b tien e están en la T abla 3-1.
Tabla 3-1 Datos de la m uestra para los Problem as 3.6 a 3.15
Horas tra s la DOsso C élulas/mL

inoculación
0 0,008 2,1 x 107

1 0,020 4,5 x 107
2 0,052 1,0 x 108
3 0,135 2,6 x 108
4 0,200 4,0 x 108
5 0,282 5,8 x 108
6 0,447 9,6 x 108
7 0,661 1,5 x 109
8 1,122
X
o
3.2 A J U S T A N D O L A C O N C E N T R A C IO N D E C E L U L A S
L o s sig u ie n tes p ro b lem a s m u estra n c ó m o se p u ed e n aju s ta r los c u ltiv o s celulares
m ediante diluciones.
P ro b le m a 3.6 A f = 3 horas (h), se determina que la densidad celular es

2,6 x 108 células/mL. Si en ese momento se toman 3,5 mL del cultivo, se
centrifugan hasta sedimentar las células y ese sedimento es resuspendido en
7 mL de medio de cultivo, ¿cuál es la nueva concentración de células?
S o lu c ió n 3.6
Primero es necesario averiguar el número de células en la alícuota de 3,5 mL.
Esto se consigue multiplicando la concentración celular (2,6 x 108 células/mL)
por el volumen de la muestra (3,5 mL). Para resolver x, el número de células en
3,5 mL, se utiliza la siguiente ecuación:
2,6 x 108 células

------------------------ x 3,5 m L = x células
mL
Resolviendo para x obtenemos
(2,6 x 108 células) x (3,5 mL)

mL
9,1 x 108 células = x células
3.2 Ajustando la concentración de células 51
Por lo tanto, hay 9,1 x 108 células en la alícuota de 3,5 mL. Cuando se resus-
penden las 9,1 x 108 células en los 7 mL, la nueva concentración puede calcu
larse de la siguiente manera:
x células _ 9,1 x 108 células _ 1,3 x 108 células

mL 7 mL mL
De este modo, las células resuspendidas en los 7 mL de medio de cultivo están a

una concentración de 1,3 x 108 células/mL.
P ro b le m a 3.7 En el problema 3.6, se sedimentan 2,6 x 10 células/mL a

partir de 3,5 mL de cultivo. ¿En qué volumen hay que resuspender el sedimento
para obtener una concentración de 4,0 x 109 células/mL?
S o lu c ió n 3.7
En el problema 3.6, se determinó que había un total de 9,1 x 108 células en una
muestra de 3,5 mL de cultivo que equivalía a una concentración de
2,6 x 108 células/mL. La siguiente ecuación se pude utilizar para averiguar el
volumen que es necesario para resuspender el sedimento de la centrifugación y
obtener una concentración de 4,0 x 109 células/mL:
9,1 x 108 células _ 4,0 x 109 células

x mL mL
Ahora despejaremos x. Multiplique ambos lados de la ecuación por x:
mL
Divida cada lado de la ecuación entre 4,0 x 109 células:
9,1 x 108 células

--------- q „ , = x = 0,23
4,0 x 109 células
Por lo tanto, para obtener una concentración de 4,0 x 10 células/mL, el sedi

mento de células se debe resuspender en 0,23 mL de medio de cultivo.
P ro b le m a 3.8 A las seis horas de la inoculación, la concentración celular es de

9,6 x 108 células/m L Si se toma una muestra a ese tiempo, ¿qué dilución
hay que hacer para obtener 300 colonias sobre la placa de agar donde se ha
hecho la extensión?
S o lu c ió n 3.8
Dado que cada colonia de la placa se asume que proviene de una célula
individual, el primer paso que hay que hacer para resolver el problema es
averiguar cuántos mililitros de cultivo contienen 300 células. La siguiente
ecuación nos dará la respuesta. La ecuación está expresada de forma que las
unidades de mL se anulen.
9,6 x 108 células , „ ,

-------------------- ------------------x x mL = 300 células
mL
Resolviendo para x, obtenemos
3 X 10* células = 7
9,6 x 108 células
Por lo tanto, en 3,1 x 10-7 mL de cultivo hay 300 células a t = 6 h. Asumimos

que se extendieron en la placa 0,1 mL de la serie de dilución. Para hacer una
dilución equivalente a 2,1 x 10-7 mL, hay que hacer la siguiente dilución
seriada.
(1 x 10~2)(1 x 10~2)(1 x 10_1)(3,1 x 10 _1 )(1 x 10_1) = 3,1 x 10~7
Esto es equivalente a realizar la siguiente dilución seriada y extender en la placa

de agar 0,1 mL (véase la Figura 3-3):
0,1 mL 0,1 m L 1,0 mL ^3,1 m L ^ ^ ^

10 m L X 10 mL X 10 mL X 10 m L X ' m
0,1 mL 0,1 mL 1,0 mL 3,1 mL 0.1 mL
9,9 mL 9,9 mL 9,0 mL 6,9 mL

0,1 mL .. 0,1 mL v 1.0 mL , 3,1 mL x 0,1 mL
10 mL 10 mL 10 mL 10 mL
(1 x 10-2) x (1 x 10-2) x (1 x 10-1) x (3,1 x 10-1) x (1 x 10~1) = 3,1 x 10~7
■ FIGURA 3 -3 Las diluciones seriadas descritas en el Problema 3.8.

3.3 Representando la D0550 frente al tiempo en un gráfico lineal 53
N ota: Para realizar una dilución seriada que permita obtener una dilución
determinada no existe una sola forma de hacerla. Los volúmenes que se utilizan
para las diluciones dependen de varios parámetros, que incluyen la cantidad de
tampón disponible, la precisión de las pipetas y la capacidad de los tubos de
ensayo.
3.3 R E P R E S E N T A N D O L A D O 550 F R E N T E A L T IE M P O
EN UN G R Á F IC O L IN E A L
L a re p rese n ta ció n en u n g rá fico lin eal d e lo s datos d e la T ab la 3 -1 , d o n d e repre
sen tam o s la D O 550 en el eje d e ord e n ad as (y ) y el tiem po en el eje d e ab sc isa s (pe),
d a rá lu g a r a la cu rv a q u e se p u e d e v e r en la F ig u ra 3-4.
C u an d o se in o cu lan las cé lu la s de m i cultivo d e u n a no ch e en u n m edio nuevo,
tal y co m o se d escrib e en este capítulo, éstas sufren u n p erío d o d e aclim a ta ció n al
n u ev o m edio. D u ran te este p e río d o la d iv isió n ce lu la r es m u y lenta. E ste período
se llam a fa se d e retard o, q u e p u ed e se r d e m inutos h a s ta ho ras, y d ep e n d e d e la
c e p a y de la riq u e z a d el m edio. T ras ese p erío d o el cu ltiv o en tra en un o en e l q u e la
d iv isió n ce lu la r es m u y rápida. D urante este p e río d o ca d a c é lu la d a lu g a r a dos
células hijas. E stas dos células h ija s d an lu g a r a cuatro células, y las cu a tro a o cho,
etc. D e b id o a esta c o n tin u a du p licac ió n d el n ú m ero d e células, a este perío d o d e
crecim iento se le d en o m in a ex p o n en cia l o fa se logarítm ica (log). C o m o los
nu trien tes se a g o ta n y se ac u m u la n p ro d u c to s in h ib id o res d e d esecho, el ritm o
d e d iv isió n ce lu la r se enlentece. E n e s e m om ento, el cultivo en tra e n la fase
■
T ie m p o (h o r a s ) tiem po de los datos de la Tabla 3-1.
esta cio n a r ia , du ra n te la cual la m u erte y el crecim iento ce lu la r su ce d en a u n a tasa

equivalente. D urante este p erío d o el n ú m ero d e células v iab le perm a n ec e cons
tante. (L o s datos rep rese n ta d o s del ex perim ento an te rio r d en o ta n la entrada en ese
perío d o .) E l p o sterio r ago ta m ie n to d e nutrientes su p o n e u n increm ento d e la
m u erte celular. C o m o m u ere n m ás células d e las q u e se div id en , el cultivo entra
en la fa se d e m u erte. M u ch a s ce p as en tra n en la fase d e m u erte a las 2 4 h.
L as fa ses d e l cre c im ie n to c e lu la r n o se d is tin g u e n b ie n en el g rá fic o d e la
F ig u ra 3-4 . E stas s e a p re c ia n m e jo r en el g rá fic o d e e s c a la lo g a rítm ic a (v é a se la
S e c c ió n 3 .5).
3.4 R E P R E S E N T A N D O E L L O G A R IT M O D E L A D O 550
F R E N T E A L T IE M P O EN UN G R Á F IC O L IN E A L
3.4.1 Lo g a ritm o s
U n ex p o n en te es u n nú m ero escrito sobre o tro (llam ado b ase) y a su dere c h a (y de
m en o r tam añ o ) d e m o d o q u e in d ica la p o ten c ia a la cual la b a s e h a d e se r elevada.
U n logaritm o (log) es u n ex p o n en te. E n la m ay o ría d e lo s cá lcu lo s m atem áticos en
b io lo g ía m o lecu la r y en la m ay o ría d e las ciencias b ásica s s e llev an a ca b o en base
10, el siste m a dec im a l p ara n o m b rar a lo s n ú m ero s (d e 0 a 9 ) en las p osiciones
a lre d ed o r d e la com a. D ado q u e éste es el siste m a m ás frecuente, los lo g aritm o s en
b a s e d e 10 se d en o m in an log a ritm o s com u n es, y si n o se e sp e cifica otra c o s a se
asum e q u e la b a s e d el logaritm o es 10. E l log (en b a s e 10) d e u n n ú m ero n es el
ex p o n e n te al cual h a d e se r lev a d o 10 p ara o b ten e r n. P o r ejem plo, 102 = 100.
A q u í, el e x p o n e n te es 2 y la b a s e 10. E l lo g d e 100, p o r lo tan to , es igual al
ex p o n e n te 2 . E l log d e 1.000 es 3, y a q u e 103 = 1.000. E l lo g d e 10 es 1, y a que
101 = 10. E l log d e 2 0 es 1,3, dad o q u e 101,3 = 20. L o s v alo res d e lo s logaritm os
se pu ed en h a lla r en la tab la d e lo g aritm o s o, en u n a ca lcu lad o ra , en trando el v a lo r n
y pre sio n a n d o la te c la log. R ep re sen tan d o el lo g aritm o d e la D O 550 de las lecturas
del cultivo b ac terian o frente al tiem po se o b tien e u n a re p rese n ta ció n lin eal del
gráfico d u ra n te la fase lo g arítm ica d el crecim ien to celular.
3.4.2 La DO550 d e las m u e stra s co n v e rtid a a va lo re s

lo g a rítm ico s
A p a rtir d e lo s d atos d e las m uestras (T abla 3-1), en la T abla 3 -2 se m u estra n los
valo re s d el lo g d e la D O 550.
3.4.3 R e p re se n ta n d o el lo g a ritm o de la D O 550 fre n te

al tie m p o
C u an d o se re p rese n ta la D O 550 d e la s lecturas fren te al tiem p o , se o btiene el
gráfico d e la F ig u ra 3-5.
3.4 Representando el logaritmo de la D0550 frente al tiempo en un gráfico lineal 55
T a b la 3 -2 Valores de los logaritmos de las lecturas de DO550 de la Tabla 3-1
Horas tras la inoculación DO 550 Log de la D O 550
0 0,008 -2,10
1 0,020 -1,70
2 0,052 -1,28
3 0,135 -0,87
4 0,200 -0,70
5 0,282 -0,55
6 0,447 -0,35
7 0,661 -0,18
8 1,122 0,05
| ■ FIGURA 3-5 Gráfico del logaritm o de la D0550 frente al tiem po de incubación de los datos de la muestra.
1
s
c E n la F ig u ra 3-5, el gráfico es lin eal desd e el tiem po ce ro h a s ta tres h o ra s tras la
.<3 inoculación. E ste p e río d o es la fase ex p onencial. E n tre la terc era y cu a rta h o ra h ay
8 u n p u n to d e inflexión. E ste p u n to re p rese n ta el final d e la fase ex p o n e n cial de
£ crecim iento y el prin cip io d e la fase estacionaria. E ste tip o d e gráfico perm ite
w o b ten e r u n a m ejo r re p rese n ta ció n v isu al de la d u ra ció n de la fase ex p o n e n cial y el
« p u n to en el cual el crecim iento en tra en la fase estac io n aria q u e la pro p o rcio n ad a
© p o r el gráfico d e la D O 550 frente al tiem po co m o se v e en la F ig u ra 3-1.
56 CAPITULO 3 Crecimiento celular
3.5 R E P R E S E N T A N D O E L L O G A R IT M O D E L A
C O N C E N T R A C IÓ N C E L U L A R F R E N T E A L T IE M P O
R epresentando el log d e la concentración celular frente al tiem po debería obtenerse
u n gráfico sim ilar al obtenido representando el lo g d e la D O 550 frente al tiem po.
3.5.1 C á lcu lo d el lo g a ritm o d e los v a lo re s

E l logaritm o d e lo s v alo res se pu ed e obtener entrando los núm eros en u n a calcu
ladora y lu eg o presionando la tec la log. E n la T abla 3-3 se pu ed e n v e r los valores del
logaritm o d e la concentración celular a los diversos tiem p o s tras la inoculación.
C u an d o se re p rese n ta el lo g aritm o d e la co n c en tra ció n ce lu la r fren te a las horas
tras la inoculación se g en e ra u n gráfico co m o el q u e se m u estra e n la F ig u ra 3-6.
Tabla 3-3 Logaritmos de la concentración celular de los datos de la Tabla 3-1
Horas tras la Células/m L Logaritm o de la

inoculación concentración celular
0 2,1 x 107 7,32

1 4,5 x 107 7,65
2 1,0 x 108 8,00
3 2,6 x 108 8,41
4 4,0 x 108 8,60
5 5,8 x 108 8,76
6 9,6 x 108 8,98
7 1,5 x 109 9,18
8 2,0 x 109 9,30
9,5
3
8 9
c
c
1 8,5
c
c
8 ^
jü
■o 7,5
3
7
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Horas tras la inoculación
■ FIGURA 3-6 Datos de la Tabla 3-3 representados en un gráfico lineal.

3.6 Calculando el tiempo de generación 57
3.6 C A L C U L A N D O E L T IE M P O D E G E N E R A C IÓ N
3.6.1 La p e n d ie n te y la co n sta n te d e cre cim ie n to
E l tiem po d e gen eración de las células en u n cultivo se defin e com o el tiem p o que
se re q u ie re p a ra q u e se do b le el n ú m ero d e células. C u an d o se re p rese n ta el
lo g aritm o d e la co n c en tra ció n ce lu la r frente al tiem p o en u n g rá fico lineal, se
g e n e ra u n a re cta desd e la izq u ierd a h a c ia la derecha. L a re la ció n entre el v a lo r de
ascenso en el eje y y el co rresp o n d ien te al eje h o rizo n ta l jc es la p en d ien te d e la
recta. L a p en d ie n te de la re cta durante la fase exp o n e n cial del crecim iento re cib e el
n o m b re co n stan te d e crecim iento, K.
E l increm ento d el n ú m ero d e células (N ) p o r un id ad d e tiem po (t) e s p ro p o r
cional al n ú m ero d e células p re sen tes en el c u ltiv o al p rincipio d el intervalo de
tiem p o (TVq). E s ta relación se ex p resa p o r m edio d e la ecuación
log(A 0 = log (N o) + K t
R estan d o el log(JVo) d e am b o s lados d e la ecu ac ió n y divid ien d o am b o s lados

d e la ecu ac ió n entre t o b ten e m o s la p en d ie n te d e la recta, K :
log(N ) ~ lo g (iV o ), | K
t
P ro b le m a 3.9 ¿Cuál es la pendiente (valor de K) de los datos de la

Tabla 3-1?
S o lu c ió n 3.9
Utilizaremos la ecuación anterior. En el numerador, está la diferencia entre
el logaritmo de la concentración final y el logaritmo de la concentración inicial.
Hay que utilizar el intervalo de tiempo de la fase exponencial de crecimiento. Por
ejemplo, como el crecimiento exponencial sucede desde el tiempo cero hasta
las tres horas tras el inóculo, se pueden utilizar los valores de tiempo de los
intervalos f - 0 a f = 1 o d e f - 1 a f = 2 o d e f = 2 a f = 3 . El valor más cercano
al actual valor de K se puede obtener utilizando los valores calculados para los
tiempos í = 0 y í = 3 (un total de 180 minutos [min]):
log (A/) - log(A/0) _ K

t
La concentración de células a f = 3 h (180 min) es de 2,6 x 108 células/mL. La

concentración de células a f = 0 es de 2,1 x 107 células/mL. Estos valores se
introducen en la ecuación para calcular K.
log(2,6 x 108) - log(2,1 x 107) _

180 min
Sustituimos en la ecuación los valores de los logaritmos de N y N0.
8,41 - 7,32 _
180 min
Simplificamos la ecuación.
1,09 0,0061
180 min min
Por lo tanto, el valor de K para estos datos es de 0,0061/min.
8,41 — 7,32 _ ^ Sustituya en la ecuación los valores de los

180 min logaritmos de N y N0.
1/09 _ ^ _ 0,0061 Simplifique la ecuación.

180 min min
3.6.2 T ie m p o d e g e n e ra c ió n
C o m o se h a v isto antes, la ecu ac ió n q u e d escrib e el crecim iento ce lu la r es la
sig u ien te fó rm u la
lo g (JV) = lo g (N o ) + K t
E l tie m p o d e g e n e ra c ió n d e u n a c e p a b a c te ria n a en c o n c re to b a jo u n as
c o n d ic io n e s d e fin id a s es el tie m p o q u e se re q u ie re p a ra q u e el n ú m e ro de
cé lu la s se d o b le. E n este ca so , N s e r á ig u al a 2 y iVo s e rá ig u al a l (o N = 4,
No = 2 ,o c u a lq u ie r o tro v a lo r q u e re p re se n te u n v a lo r d e l d o b le). L a fó rm u la se
co n v ie rte en
lo g (2 ) = l o g ( l ) + K t
R eso lv ien d o lo s logaritm os:
0,301 = 0 + K t
D ividiendo cada lado de la ecuación entre K se obtiene el tiem po de generación t:
t _ 0,301
3.6 Calculando el tiempo de generación 59
P ro b le m a 3 .1 0 ¿Cuál es el tiempo de generación para el cultivo del ejemplo?
S o lu c ió n 3.10
A partir del problema 3.9, la constante de crecimiento, K, obtenida es de 0,0061/
min. Colocando este valor en la ecuación para calcular el tiempo de generación,
tenemos
0,301 0,301
tiempo de generación = t = — —— = -------- ----- = 49,3 min
K K 0,0061 /m in
Por lo tanto, el tiempo de generación para las células de estos datos es de

49,3 min.
P ro b le m a 3.11 Tras la inoculación, ¿cuál es la concentración de células a los

150 min?
S o lu c ió n 3.11
En el problema 3.9, se obtuvo una constante de crecimiento, K, de 0,0061/min. La
concentración inicial de células, 2,1 x 107 células/mL, la tenemos en la Tabla 3-3.
Estos valores se pueden introducir en la ecuación que describe el crecimiento
celular para averiguar la concentración celular a los 150 min.
log (A/) = log(A/0) + K t
Los valores para K, la concentración celular inicial, y para f se sustituyen en la

ecuación:
. 7, /0 ,0061V . Los valores para K, la

log(N) = log(2,1 x 107) + (150 m,n) concentracioPn celular
inicial, y para t se
sustituyen en la ecuación,
log(/V) = 7,32 + 0,92 = 8,24 Simplifique la ecuación.
\og(N) = log(2,1 x 107) + / 0,0061 j ( i 5q m¡n)
Simplificando la ecuación, obtenemos
log (A/) = 7,32 + 0,92 = 8,24
Para averiguar el número de células, primero hay que resolver qué número
convertido a logaritmo es igual a 8,24. Este número es el inverso de la función
del logaritmo y recibe el nombre de antilogaritmo (antilog) o inverso del

logaritmo. El antilogaritmo de un número x (antilog x) es igual a 10*.
Muchas calculadoras no tienen una tecla marcada como «antilog». Para resolver
un antilog, se debe utilizar la tecla 10X. Si esta tecla no existe, es necesario elevar
a 10 a la potencia de x utilizando la tecla xy. En algunas calculadoras, la tecla log
se puede utilizar como tecla l e t r a s presionar la tecla shift o inverse.
Para hallar el antilogaritmo de 8,24 en una calculadora, teclearemos 8, „ 2, 4,

sh ifty 10x. O introduciremos 1,0, xy, 8, „ 2 ,4 e = . Sea de una forma u otra, y una
vez redondeado, debemos obtener el resultado de 1,7 x 108 células/mL.
Por lo tanto, tras 150 min desde la inoculación, el cultivo tendrá una con
centración de 1,7 x 108 células/mL.
3.7 R E P R E S E N T A N D O L O S D A T O S D E L C R E C IM IE N T O
C E L U L A R EN UN G R Á F IC O S E M IL O G A R ÍT M IC O
E l p a p e l p ara g ráficos sem ilogarítm icos u tiliza u n a esc ala lo g arítm ica en el eje
d e ord e n ad as y (vertical). E l eje y está estru c tu rad o en « ciclos». C a d a cic lo está
m arcado d e 1 h a s ta 9 y co rresp o n d e a u n a p o ten c ia d e 10. L a esc ala entre 1 y 2 está
m ás ex p a n d id a c o m p a rad a co n la d e 2 a 3. L a esc ala entre 2 y 3 está m ás exp a n d id a
com p a rad a co n la de 3 a 4. L as d iv isio n e s a lo larg o del eje y so n progresivam ente
ca d a v e z m en o re s h a c ia 9; cu an d o se lleg a a 1 c o m ien z a u n n u ev o ciclo. E l papel
p a ra g rá fico s sem ilogarítm icos q u e se p u e d e c o m p ra r tien e h a sta seis ciclos. E l uso
d e pap e l d e g ráficos sem ilo g arítm ic o s p a ra re p rese n ta r lo s datos d e crecim iento, es
u n a fo rm a rá p id a p a ra a v e rig u ar la co n c en tra ció n ce lu la r en c u a lq u ie r p u n to o
tiem p o y la estim ación d el tiem po d e gen e rac ió n sin nec esid ad d e re alizar los
cálculos d el lo g aritm o y d el antilogaritm o. E n lo s m éto d o s g ráficos q u e se d es
criben aquí se utilizarán lo s datos d e la T abla 1-3.
3.7.1 R e p re se n ta n d o la D O 550 fre n te al tiem p o

en un g rá fic o se m ilo g a rítm ico
U n a fo rm a d e re p rese n ta r los d atos es c o lo c ar la DO550, e n el eje de ord e n ad as (y),
frente a las ho ra s tras la in o culación, en el eje de ab sc isa s (x). C o m o lo s valo res de
la DO550 ab a rca n cuatro d ec im a les en to rn o a la co m a, n ec esitare m o s u tiliz a r un
pap e l sem ilo g arítm ico co n cuatro cic lo s (F ig u ra 3-7).
D e p en d ien d o d e cuánto tiem p o desp u é s d e la inoculación se to m en las m u es
tras, la cu rv a p u ed e c o m e n zar a estab iliza rse (m eseta) en lo s tiem p o s finales a
m e d id a q u e la DO550 se ap roxim e a 1,5. E sto p u ed e se r el re su lta d o d e q u e el
cu ltiv o está alc an za n d o su n iv el d e m áx im a absorbancia. P ese a q u e las células
p u ed e n se g u ir creciendo, el esp e ctro fo tó m etro no es ca p az de m ed ir u n cam bio en
el cultivo.
3.7 Representando los datos del crecimiento celular en un gráfico semilogarítmico 61
■ FIGURA 3 -7 Gráfico de la D055O frente al tiem po en un gráfico semilogarítm ico.
3.7.2 C a lcu la n d o el tie m p o d e g e n e ra c ió n a p a rtir de un

g rá fic o se m ilo g a rítm ico d e la D O 550 fre n te al tie m p o
E l tiem p o d e g en e rac ió n tam b ién se co n o c e co m o tiem p o d e d u p licación . Tal
co m o se o b serv a en el P ro b lem a 3.12, el tiem p o d e gen e rac ió n se p u ed e ob ten e r
d irectam ente a p a rtir d e u n gráfico sem ilogarítm ico, ca lculando el tiem p o q u e se
re q u ie re p ara q u e el v a lo r d e la D O 550 d el eje y se duplique.
P ro b le m a 3 .1 2 Utilizando un gráfico de la DO550 frente al tiempo, calcular

qué tiempo de generación tienen las células del conjunto de datos.
S o lu c ió n 3.12
Escoja un punto en el eje de ordenadas y (DO550) en el intervalo que corres
ponda a la fase de crecimiento exponencial. Por ejemplo, se puede escoger un
valor de DO550 de 0,03. El doble de este valor es 0,06. Trace una línea horizontal a
partir de cada una de estas dos posiciones hasta la curva, y luego trace líneas
verticales hasta cruzar el eje de abscisas x (Figura 3-8).
La diferencia entre los puntos que cruzan esas líneas con el eje de abscisas x
es aproximadamente de 0,8 h. Como 0,8 h equivalen a 48 min (0,8 h x
60 min/h = 48 min), el tiempo de generación es aproximadamente de 48 min.
■ FIGURA 3-8 Cálculo del tiem po de generación del Problema 3.12.
■ FIGURA 3-9 Gráfico sem ilogarítm ico de la concentración celular frente al tiem po de los datos de la muestra. La
notación 1,0E +07 en eje de ord en ad as/ es la forma breve de 1,0 x 107. La E en esta notación significa «exponente».
3.8 R E P R E S E N T A N D O L A C O N C E N T R A C IÓ N
C E L U L A R F R E N T E A L T IE M P O
EN UN G R Á F IC O S E M IL O G A R ÍT M IC O
C u an d o se re p rese n ta la co n c en tra ció n ce lu la r fren te al tiem po (el nú m ero de horas
tras la ino cu lació n ) en u n gráfico sem ilo g arítm ico se p ro d u c e el g rá fico d e la
F ig u ra 3-9. (C o m o la co n c en tra ció n ce lu la r tien e u n ra n g o de e x p o n e n te entre siete
3.9 Cómo se obtiene el tiempo de generación directamente de un gráfico semilogarítmico 63
y n u ev e [que ab a rca tres v alo re s d e ex p onentes], se u tiliz a u n pap e l p a ra gráficos

sem ilogarítm icos d e tres ciclos.)
P ro b le m a 3.13 Asumiendo que un cultivo de células crece bajo las mismas

condiciones que las utilizadas en los datos de la Tabla 3-1, ¿en qué momento
el cultivo tendrá una concentración de 2 x 108 células/mL?
S o lu c ió n 3.13
Trazando una línea horizontal desde el punto de 2 x 108 células/mL del eje de
ordenadas y hasta la curva del gráfico y desde ese punto en vertical hasta el eje
de abscisas x se obtiene el valor de 2,7 h (véase la Figura 3-10). Como 0,7 h es
equivalente a 42 min (0,7 h x 60 min/h = 42 min), el cultivo alcanzará la
concentración de 2 x 108 células/mL en 2 h 42 min.
1.0E+10 p----------------------------------------------------------------
1.0E+09
1.0E+08
2 3 4 5 6 7
I FIGURA 3-10 Gráfico del Problema 3.13.
3.9 C O M O S E O B T IE N E E L T IE M P O D E G E N E R A C IO N
D IR E C T A M E N T E D E UN G R Á F IC O
S E M IL O G A R ÍT M IC O D E L A C O N C E N T R A C IÓ N
C E L U L A R F R E N T E A L T IE M P O
E l tiem p o d e gen e rac ió n d e u n a d ete rm in a d a ce p a b a c terian a en c u ltiv o s e pu ed e
a v e rig u ar direc tam en te a p a rtir d el gráfico sem ilo g arítm ico d e la co ncentración
ce lu la r fren te al tiem p o d e u n a fo rm a p arecid a a la desc rita en e l P ro b lem a 3.13.
P ro b le m a 3 .1 4 Utilizando un gráfico de la DO550 frente al tiempo, calcule el

tiempo de generación para las células que se representan en los datos de la
Tabla 3-1.
Escoja un punto del eje de ordenadas y (células/mL), en la región que corres
ponde a la fase exponencial de crecimiento. Por ejemplo, se puede escoger una
concentración celular de 1 x 108 células/mL. El doble de este valor es
2 x 108 células/mL. Trace una línea horizontal desde estas posiciones en el
eje de ordenadas y hasta la línea del gráfico (véase la Figura 3-11). Desde estos
puntos de intersección en la curva, trace las líneas verticales hasta el eje de
abscisas x. La diferencia entre las posiciones donde las líneas encuentran al eje
de abscisas x es aproximadamente de 0,7 h. Como 0,7 h es equivalente a 42 min
(0,7 h x 60 min/h = 42 min), el tiempo de generación es aproximadamente de
42 min.
1.0E+10
1.0E+09
E
is
° 1.0E+08
3.10 R E P R E S E N T A N D O L A D E N S ID A D C E L U L A R
F R E N T E A L A D O 5 5 0 EN UN G R Á F IC O
S E M IL O G A R IT M IC O
L a re p rese n ta ció n d e la den sid ad ce lu la r fren te a la D O 550 en u n gráfico
sem ilogarítm ico p erm ite al in v estig ad o r ca lcu lar d e fo rm a m u y rá p id a la
co n c en tra ció n ce lu la r p ara c u a lq u ie r v a lo r d e la DOsso- E n la F ig u ra 3 -12 se pu ed e
o b serv ar la rep resen tació n d e lo s datos d e la T abla 3-1.
3.10 Representando la densidad celular frente a la D0550 en un gráfico semilogarítmico 65
■ FIGURA 3-12 Gráfico semilogarítm ico

de la concentración celular frente a la D055O
de la muestra.
P ro b le m a 3 .1 5 Se crece un cultivo bajo las mismas condiciones que el

utilizado para obtener los datos. Si se toma una muestra y se determina que su
DO550 es de 0,31, ¿cuál es su concentración celular aproximada?
S o lu c ió n 3.15
Para averiguar la concentración celular que corresponde a una DO550 de 0,31,
trace una línea vertical desde la posición 0,31 del eje de abscisas x hasta la curva
del gráfico (Figura 3-13). Trace una línea horizontal desde esa posición en la
curva hasta el eje de ordenadas y.

Este punto en el eje y corresponde a 6 x 108 células/mL. Por lo tanto, un

cultivo con una DO550 de 0,31 tendrá una concentración celular de
6 x 108 células/mL.
3.11 P R U E B A D E F L U C T U A C IÓ N
L o s b a c te r ió fa g o s (o fa g o s) s o n v iru s q u e in fe c ta n a las b ac terias. A la
b a c te ria E. coli la in fe c ta n d iv e rso s tip o s d e b ac terió fa g o . L a m a y o ría d e los
b a c te rió fa g o s m e jo r ca rac teriza d o s, c u a n d o in fe c ta n a s u h u é s p e d , co m ien z an
u n cic lo lític o d e in fec ció n , en e l cu a l la p a rtíc u la fá g ic a s e u n e a la p ared d e la
c é lu la h u é s p e d y p o s te rio rm e n te in y e c ta su g e n o m a e n el cito p la s m a d e la
bac te ria , d o n d e se re p lic a rá y ex p re s a rá lo s gen e s n ec esario s p a r a e l d e sa rro llo
d e la p ro g e n ie d e fag o s. D u ra n te e l p ro c e s o d e in fec ció n , la p ro g e n ie d e l fago
se ac u m u la e n el in te rio r d e la bac te ria . F in a lm e n te , la b a c te ria m u e re (se lisa),
lib e ra n d o n u ev a s p a rtíc u la s d e fa g o s al m ed io e x te rn o , q u e p o d rá n in fe c ta r a
o tras b ac terias.
Si el b ac terió fa g o se c rece en u n cultivo líq u id o , la infección y la m ultiplicación
d e los fa g o s p ro v o c an u n descen so d e la tu rb id ez del cultivo d e fo rm a m ás intensa
cu an d o las bac terias su cu m b en a la in fec ció n y se lisan. S i los bac terió fa g o s se
ex tienden ju n to a las bac terias en u n a p la c a d e P etri, la in fec ció n d e u n a sola
b ac teria p o r u n solo fago p ro d u c e u n h alo c irc u lar d e lisis (llam ad o h alo d e lisis o
calva) d en tro d el tap iz d e bacterias.
E l b ac terió fa g o T I sigue u n cic lo d e in fec ció n c o m o e l q u e se h a descrito. T I
in icia la in fec ció n p o r m ed io d e su u n ió n a u n co m p lejo p roteico, d enom inado
re cep to r d el fa g o T I , so b re la p ared d e la bacteria. U n a v e z se h a un id o , la
in fec ció n c o n d u c e a la ev e n tu al d estrucción d e la b ac teria atacada. S in em bargo,
n o to d as las células d e u n a po b lac ió n d e E. coli s o n su sce p tib les a s e r infectadas.
D entro d e la po b lac ió n de b acterias, ex iste la p o sib ilid ad d e q u e alg ú n ind iv id u o de
la p o b lac ió n p o s e a u n a m u tació n q u e altere al re cep to r del fa g o T I . E stas bacterias
son resistentes a la infección p o r T I . U n a b ac teria resistente a T I tran sm itirá esta
ca racterística a sus células h ijas d e fo rm a perm anente.
A co m ien z o d e la d éc ad a de 1940, se caracterizaron m uchas m u tacio n e s tanto
en o rg a n ism o s pro c ario tas co m o eucariotas, p ero q u ed a b a u n a c u e stió n esencial
sin responder: ¿cuál era el origen d e esas m u tacio n e s? E x istía n d os posibilidades:
las m u tacio n es se ind u ce n co m o re sp u esta al m ed io am biente o apa rec en d e form a
espontánea; p re ex isten en la p o b lac ió n y sim p le m e n te el m edio am b ien te las
selec cio n a p a ra su supervivencia.
E n 1943, M ax D e lb rü ck y S alv ad o r L u ria diseñ aro n u n ex p erim en to den o m i
nad o p ru eb a d e flu ctu ación q u e u tiliz ab a m u tan tes E. coli resistentes a T I para
a v e rig u ar q u é hip ó tesis era correcta. E l ex p erim en to estab a diseñ ad o p ara m irar el
n ú m ero de b ac terias resistentes a T I en u n a serie de cu ltiv o s idénticos en paralelo.
3.11 Prueba de fluctuación 67
S egún la prim era hip ó tesis, la d e la m u tació n in d u cid a, las v ariantes resistentes a
T I sólo ap arecerían tras la ex p o sició n al b ac terió fa g o T I . T odas las bacterias
tien en la m ism a pro b a b ilid ad (a u n q u e peq u e ñ a) d e ad q u irir la re sisten c ia tras la
ex p o sició n a T I . U n a v e z ad q u irid a , la ad a p tació n p a sa rá a su s d escendientes. E sta
h ip ó tesis p re d ic e q u e el n ú m ero d e células resistentes a T I no d ep e n d e del
m om ento d el crecim iento ce lu la r n i d eb e ca m b ia r en tre u n a serie d e cu ltiv o s o
entre u n a serie d e m u estra s to m ad as d e u n m ism o cultivo.
S eg ú n la seg u n d a hipótesis, la de la m u tació n espontánea, la ad q u isició n d e la
re sisten c ia a T I p u ed e o cu rrir en cu a lq u ie r m om ento du ra n te el cultivo an te s de la
ex p o sició n a T I . E l n ú m ero d e bac terias resistentes a T I en u n a po b lac ió n
b a c terian a d e p e n d erá d e c u a n d o se llev e a ca b o la m u tación, y a se a al principio
o al final del crecim iento de u n cultivo. E s ta te o ría p re d ic e q u e h a d e h ab e r grandes
v aria cio n es en el n ú m ero d e bac terias resistentes a T I entre d iv ersa s series de
c u ltiv o s en paralelo m ás q u e entre series de m uestras to m ad as a p a rtir d e u n cultivo
determ inado.
3.11.1 E je m p lo d e la p ru e b a de flu ctu a ció n

S e in o cu lan u n a serie de 10 tu b o s q u e co n tien e n 0,2 m L de m ed io d e cu ltiv o y u n
frasco d e 125 m L q u e co n tien e 10 m L d e m edio d e cu ltiv o , c o n E. coli a u n a
co n c en tra ció n d e 5 0 0 células/m L . L as bac terias se incu b a n a 37 °C h a sta q u e los
cu ltiv o s alcanzan la fase estac io n aria de crecim iento. S e to m a 0,1 m L d e m u estra
d e c a d a u n o d e lo s peq u e ñ o s cu ltiv o s y diez m uestras d e 0,1 m L del cultivo d e
10 m L . L as m u estra s se ex tien d e n sobre p lac as d e a g a r satu ra d as con el fa g o T I.
L as p lac es se incu b a n u n a n o ch e y se cu e n ta el nú m ero d e co lo n ias d e c a d a placa.
S e o b tien en lo s resultados q u e se m u estra n en la T abla 3-4.
Tabla 3-4 Datos de las muestras para los problemas de la prueba

de fluctuación
Colonias resistentes a T I de los Colonias resistentes a T I del

cultivos p equeños cultivo grande
1 24
0 20
0 16
5 25
124 18
0 21
0 18
0 17
71 22
0 19
Interpretación de los resultados

A n a liz an d o lo s dato s, h a y d iferen c ia s m u y claras entre el n ú m ero d e co lo n ias
resistentes a T I entre los d iferentes cultivos. C o m o pre d ecía la te o ría d e la
m u tació n esp o n tán e a, h a y gra n d es d iferen c ia s en tre los n ú m ero s d e colonias
resistentes a T I d erivados d e u n a serie de peq u e ñ o s cu ltiv o s en paralelo, m ientras
q u e el n ú m ero d e c o lo n ias resistentes a T I p o r p lac a q u e se ob tien en d e las
diversas m u estra s d el cultivo ú n ico tien en p eq u e ñ as v ariaciones. P ara analizar
m atem á tica m en te estos resultados, p rim ero es n ecesario sab e r el v a lo r m ed io de
ca d a u n o d e lo s g ru p o s d e cultivos. L a m ed ia (tam bién d e n o m in ad a p rom edio)
re p rese n ta u n v a lo r entre u n rango d e u n co n ju n to d e n ú m eros. E ste v a lo r se
e n c u en tra en tre los d os v alo re s ex tre m o s del co n ju n to d e nú m ero s y sirv e de va lo r
rep rese n ta tiv o p ara u n g ru p o d e m ediciones. S u cálcu lo re su lta d e la su m a de
m ed id as en u n a d istrib u ció n d iv id id a entre el n ú m ero d e m edidas.
E l v a lo r m edio se re p rese n ta p o r el sím bolo x c o n u n a lín ea so b re ella:
media — x
P ro b le m a 3 .1 6 ¿Cuáles son los valores medios de cada grupo de datos?
S o lu c ió n 3.16
Para las series en paralelo de los pequeños cultivos, la suma del número de
colonias T1 resistentes es:
1 + 0 + 0 + 5 + 1 2 4 + 0 + 0 + 0 + 7 1 + 0 = 201
El valor medio se calcula como la suma dividida entre el número de medidas

tomadas:
201 colonias resistentes a T1 , „ ,

---------------------------------- = 20,1 colonias resistentes a T I /muestra
10 muestras
Para las muestras tomadas de los 10 ml_ de cultivo, la suma de colonias T1

resistentes es de
24 + 20 + 16 + 25 + 18 + 21 + 18 + 17 + 22 + 19 = 200
El valor medio se calcula como la suma dividida entre el número de muestras

tomadas:
200 colonias resistentes a T1 __ , . .

---------------------------------- = 20,0 colonias resistentes a T I /muestra
10 muestras
3.11 Prueba de fluctuación 69
3.11.2 V a ria n z a
L a h ip ó tesis d e la m u tació n esp o n tán e a p re d ic e q u e h a y u n a gra n fluctuación
a lre d ed o r d el v a lo r m ed io d e las m u estra s to m ad as de ca d a un o d e lo s cultivos. L a
fluctuación, d entro d e u n co n ju n to d e datos, alre d ed o r d el v a lo r m ed io d el con
ju n to d e d atos se d en o m in a v a rian za. A u n q u e los v alo res m ed io s d e las co lo n ias
resistentes a T I e n tre los dos gru p o s d e datos d eb e n se r m u y sim ilares, co m o pu ed e
se r p re d ic h o p o r c u a lq u ie ra d e las h ipótesis, p a ra satisfac er la h ip ó tesis d e u n a
m u tació n esp ontánea, la v aria n za entre lo s d os c o n ju n to s d e m u estra s d eb e ser
grande.
L a v aria n za se ca lcu la p o r m edio d e la fórm ula
E (* - * ) 3
v aria n za = ------------—
rt — 1
P o r m e d io d e esta fó rm u la , e l térm in o (x — x)2 re q u ie re q u e el v a lo r m ed io

d e c a d a g ru p o d e d ato s s e a re sta d o d e c a d a u n o d e lo s v a lo re s in d iv id u a les d e
c a d a co n ju n to d e dato s. L a d ife re n c ia s e e le v a al c u a d rad o . (E le v a r al cu a
d ra d o u n n ú m e ro s ig n ific a m u ltip lic a r ese n ú m e ro o ca n tid a d p o r sí m ism o . S e
re p re s e n ta p o r e l ex p o n e n te 2 . S e p u e d e o b te n e r e n la c a lc u la d o ra en tra n d o el
v a lo r a e le v a r a l cu a d rad o y a p re ta n d o la te c la x2.) E l sím b o lo S (letra g rieg a
sig m a ) su p o n e q u e to d o s lo s v a lo re s d e la se rie se h a n d e sum ar. E n este caso
la s serie s so n lo s v a lo re s (x — x) o b te n id o s p a ra c a d a dato. E l n ú m e ro n es
ig u al al n ú m e ro d e m ed icio n e s.
P ro b le m a 3 .1 7 ¿Cuál es la varianza de cada conjunto de datos?
S o lu c ió n 3.17
El cálculo de la suma de los cuadrados de los conjuntos de datos de los
pequeños cultivos se puede ver en la Tabla 3-5.
La suma de los valores en la columna (x —x )2 = (x ~ * )2 = 16.403.

Como hay 10 muestras en este conjunto de datos, n = 10. Colocando estos
valores en la fórmula para calcular las varianzas se obtiene
E íx - x )2 16.403 16.403
varianza = = — — - = — - — = 1.823
n —1 10-1 9
El cálculo de la suma de los cuadrados del conjunto de datos del cultivo de

10 mL se puede ver en la Tabla 3-6.
La suma de los valores en la columna (x —x )2 = ^ (x ~ * )2 = 80.

Como hay 10 muestras en el conjunto de datos, n = 10.
T a b la 3-5 Cálculo de la sum a de los cuadrados de la diferencia entre el

valo r de los datos de cada cultivo pequeño y la media del Problema 3.17
Colonias resistentes a T I (x -x ) (x -x )2
1 1 - 20 = -1 9 361
0 0 - 20 = -2 0 400
0 0 - 20 = -2 0 400
5 5 - 20 = -1 5 225
124 124 - 20 = 104 10.816
0 0 - 20 = -2 0 400
0 0 - 20 = -2 0 400
0 0 - 20 = -2 0 400
71 71 - 20 = 51 2.601
0 0 - 20 = -2 0 400
sum a 16.403
T a b la 3 -6 Cálculo de la sum a de los cuadrados de la diferencia entre el

valo r de los datos del cultivo grande y la m edia del Problem a 3.17
Colonias resistentes a T I (x -x ) ( x - x )2
24 24 — 20 = 4 16
20 20 - 20 = 0 0
16 16 - 20 = - 4 16
25 25 - 20 = 5 25
18 18 - 20 = - 2 4
21 21 - 20 = 1 1
18 18 - 20 = - 2 4
17 17 - 20 = - 3 9
22 22 - 20 = 2 4
19 19 - 20 = -1 1
sum a 80
Colocando estos valores en la fórmula para calcular las varianzas se obtiene
J 2 (x - x ) 2 _ an an
varianza = -
A diferencia de los valores medios de los dos conjuntos de datos, los valores de
la varianza son drásticamente diferentes y apoyan la hipótesis de la mutación
espontánea.
3.12 Cálculo de la tasa de mutación 71
3.12 C Á L C U L O D E L A T A S A D E M U T A C IÓ N
L u n a y D e lb rü ck d em ostraron q u e lo s datos d e u n a p ru e b a d e fluctuación se
p u ed e n utilizar, p o r m ed io d e d os m éto d o s diferentes, p ara c a lcu lar la ta sa de
m u tació n espontánea. U n o d e estos m éto d o s u tiliz a la ley d e pro b a b ilid ad e s tal
co m o d escrib e el m o d elo d e d istrib u ció n d e P oisson. E l otro u tiliz a u n a
apro x im a ció n gráfica, ten ien d o en c u e n ta la frecu e n cia d e la d istrib u ció n de
b ac terias m u tan tes en las series e n p aralelo d e lo s peq u e ñ o s cultivos.
3.12.1 El m o d elo d e d istrib u ció n d e Poisson

E l m od elo d e d istrib u ción d e P oisson se u tiliz a p a ra d esc rib ir la distrib u ció n de
h ec h o s p o co frecuentes e n u n a p o b lac ió n gra n d e. P o r ejem plo, en u n determ inado
m om ento ex iste la p ro b a b ilid ad d e que dentro d e u n a gra n po b lac ió n u n a b ac teria
individual p u e d a ad q u irir u n a m u tación. L a ad q u isició n d e u n a m u tació n es u n
h ec h o p o co frecuente. S i u n a gra n po b lac ió n d e bac terias se d ivide en peq u e ñ o s
cu ltiv o s, ta l co m o se h a c e en la p ru e b a d e flu ctu a ció n , el m o d elo de d istrib u ció n de
P o isso n se p u e d e u tiliz a r p a ra c a lcu lar la pro b a b ilid ad d e q u e u n determ inado
peq u e ñ o cultivo p u e d a c o n te n er u n a b ac teria m utada.
E l cálculo d e la pro b a b ilid ad d e u n a d istrib u ció n de P o isso n re q u ie re el uso del
n ú m ero e, que se d esc rib e e n el sig u ien te recuadro.
El n ú m e ro e
En biología m olecular, estadística, física e ingeniería, m ucho s cálculos utilizan los

logaritm os q ue pueden estar en base 10 o base e. El núm ero e es la base de los
logaritmos naturales, y designan com o In. Por ejem plo , el In 2 es equivalente al
loge 2 . El valor d e e es aproxim adam ente igual a 2 ,7 1 8 2 8 1 8 . A e se le denom ina
núm ero irracional porque su parte decim al es infinita y no se repite. A este
respecto, es com o el núm ero pi (p) (la relación entre la circunferencia d e un
círculo y su diám etro). D e hecho, pi y e están relacionados por la expresión ép - 1,
d o n de / es igual a la raíz cuadrada d e —1.
M uchas calculadoras tien en la tecla In para calcular logaritm os naturales. M uchas
calculadoras tam bién tienen la tecla e*, q u e se utiliza para calcular el antilogaritm o
en base e.
E l m o d elo d e d istrib u ció n d e P o isso n m atem á tica m en te se e x p resa com o
e~mmr
~ r!
do n d e P es el q u eb rad o d e las m uestras q u e c o n tien e n r ob jeto s ca d a u n o , si el

pro m ed io d e m ob jeto s p o r m u estra se d istrib u y e al az a r en tre u n g ru p o de
m uestras. (E l co m p o n e n te m se d en o m in a c o n frecu e n cia e xp ectación .) E l ele
m en to e es la b a s e d el siste m a d e lo g aritm o s n a tu ra les (véase e l apartado
anterior). E l sig n o ex clam ativo ! es el s ím b o lo p a ra fa ctorial. E l factorial de u n

n ú m ero es el pro d u c to d e este n ú m ero específico y de ca d a entero p o sitiv o m enor
q u e él h a s ta in clu ir a 1. P o r eje m p lo , 5! (léase «5 factorial») es igual a
5 x 4 x 3 x 2 x l = 120. 0! es igual a 1.
3.12.2 C á lcu lo d e la ta sa d e m u ta c ió n m e d ia n te
el m o d elo de d istrib u ció n d e Poisson
P ara u tiliz ar la pru e b a de flu ctu a ció n p a ra av e rig u ar la ta s a de m u tació n m ediante
la d istrib u ció n d e P o isso n , lo s peq u e ñ o s c u ltiv o s se h a n d e p re p ara r con inóculos
suficientem ente peq u e ñ o s p a ra q u e, tras la incubación, alg u n o s d e ellos no tengan
m utantes. A d e m á s, es im portante a n a liz ar la to talid ad d e las bac terias p o r cultivo
en el m om ento d e ex te n d erlo s en las p lac as d e selección.
L a ta s a d e m u tació n se ca lcu la utiliz an d o u n a p arte d e lo s peq u e ñ o s cu ltiv o s en
paralelo q u e no co n tien e m utantes. P a ra re so lv e r la d istrib u ció n d e P o isso n en el
caso d e c e ro m utantes, la ecu ac ió n es
e~mm°
E n n u estro ejem plo, seis d e los diez peq u e ñ o s cu ltiv o s no co n ten ían bacterias
m u tan tes resistentes a T I . P 0, la p arte d e c u ltiv o s q u e no co n te n ía n m u tan tes, es
p o r lo tan to 6/1 0 = 0,6. L a ecu ac ió n d e la distrib u ció n d e P o isso n a h o ra se pu ed e
ex p resar com o
6 e~mm°
10= ’ 0!
E l co m p o n e n te m° es eq uivalente a 1. (C u alq u ier n ú m ero ele v ad o al exp o n e n te

0 es igual a l . ) D e fo rm a p arecid a , 0! es igual a 1. L a ecu ac ió n q u ed a re d u cid a a
0,6 — e~m
R eso lv em o s p a ra m utiliz an d o la siguiente relación:
x — ey es equ iv a le n te a y = ln x
y
x = e~y e s equ iv a le n te a y — —ln x
m — —ln 0,6
P ara c a lcu lar el lo g aritm o n atural d e 0 ,6 en la calculadora, pre sio n a m o s , , 6 e

ln . E sto n os d a u n v alor, tras re d o n d earlo , d e —0,51.
m - ( -0 ,5 1 )
E l neg a tiv o d e u n n ú m ero neg a tiv o es su v a lo r po sitiv o . P o r lo tanto,
m — 0,51
E s decir, m, el pro m ed io del n ú m ero d e b ac terias m u tan tes en u n a serie de

cu ltiv o s q u e re p rese n ta n a to d a u n a p o b lac ió n , es eq u iv a le n te a 0,51 m utantes p o r
ca d a p eq u e ñ o cultivo.
P ara c a lcu lar la ta s a d e m utació n /cé lu la /d iv isió n celular, h a y que d iv id ir el
nú m ero d e m u tan tes p o r ca d a peq u e ñ o cultivo (en n uestro ejem plo, 0 ,5 1 ) entre el
nú m ero d e b ac terias p o r c a d a d ivisión celular. P ara c a lcu lar este v a lo r se pu ed e
u tiliz ar la s ig u ie n te relación.
Cálculo del incremento de bacterias de una generación a otra generación

El núm ero prom edio de bacterias en la siguiente generación se calcula dividiendo
el núm ero d e bacterias al principio d e una generación entre el logaritm o natural
d e 2.
P o r lo tan to , si h u b ie ra 2,6 x 108 bac terias en c a d a peq u e ñ o cultivo (c o m o se

e n sa y ó en el m o m en to en q u e se ex te n d ie ro n lo s cu ltiv o s so b re la p lac as de
selección q u e co n te n ía n el b ac terió fa g o T I ) , el n ú m ero d e bac terias p o r división
ce lu la r es igual a
2 ,6 x 108/ l n 2 = 2 ,6 x 108/ 0 ,6 9
- 3,8 x 108
L a ta s a d e m u tació n s e ca lcu la com o
0 ,5 1 /( 3 ,8 x 108) = 1,3 x 10-9 m u ta c io n e s/c é lu la /d iv is ió n ce lu la r
3.12.3 A p ro x im a ció n g rá fic a al cá lcu lo de la tasa

d e m u tació n a p a rtir d e los d ato s de la p ru eb a
d e flu ctu a c ió n
U tiliz an d o el m éto d o d e la d istrib u ció n d e P o isso n p a ra c a lcu lar la ta sa de
m u tació n n o se em p lea to d a la in form ación d isp o n ib le d e la p ru e b a de
fluctuación, n o se u s a la frecu e n cia d e d istrib u ció n d e lo s cu ltiv o s que co n tien en
b ac terias m u tan tes (resistentes a T I) . U n a seg u n d a ap ro x im a ció n desa rro llad a p o r
L u ria y D e lb rü ck se b a s a en el supuesto d e q u e, u n a v e z q u e u n a p o b lac ió n de
b ac terias alc an za cierto tam añ o , al m en o s u n a b ac teria ad q u irirá la m u tación. E n la
sig u ien te gen e rac ió n , com o el n ú m ero d e células se d u p lica (y asu m ien d o u n a
frecu e n cia d e m u tació n constante), d os bac terias deb e rían nu ev a m en te ad q u irir las
m utacion es. E n la sig u ien te g en eración, tras o tra d u p licación, cuatro células
d eb e rían n u ev a m en te ad q u irir las m u tacio n es. S e su p o n e q u e la ad q u isició n de

m u tacio n es d e p arte d e las b ac terias es co nstante a lo largo d el tiem po. D e form a
sencilla, si de u n a po b lac ió n d e cuatro bac terias u n a de ellas ad q u ie re la m utación,
sig n ifica q u e V4 d e las b ac terias h an ad q u irid o la m u tación. E n la sig u ien te
gen e rac ió n , u n a v e z las b ac terias se h a n d u p licad o , d os d e och o bac terias (V4)
se esp e ra q u e ad q u ie ran las m utaciones. E n la sig u ien te d u p licación, cuatro d e las
d iec isé is bac terias h ijas (V4) s e esp e ra q u e ad q u ie ran las m utaciones. A u n q u e la
ta sa d e m u tació n perm a n ez ca co n stan te , la p ro p o rció n g lobal d e bac terias m utan-
tes en la p o b lac ió n a u m e n ta rá a m e d id a q u e estas bac terias m u tad as pase n estos
n u e v o s caracteres a s u s bac terias h ija s en las g en e rac io n es posteriores.
L a ecu ac ió n desa rro llad a p o r L u ria y D e lbrück, q u e tien e en cu e n ta este
esc en ario y ca lcu la el tiem po en el cual ex iste la p ro b a b ilid ad d e q u e h a y a un
solo m utante en alg ú n lu g a r de la serie d e p eq u e ñ o s cultivos, es
r — a N t \n(aNtC)
do n d e r es el n ú m ero pro m ed io d e m u tan tes p o r p eq u e ñ o cultivo, C es el núm ero

d e p eq u e ñ o s cu ltiv o s u tiliz ad o s p a ra la p ru e b a d e fluctuación, a es la ta sa de
m u tació n y Nt es el nú m ero to tal d e bac terias en c a d a p eq u e ñ o cultivo.
E n el ejem plo d e este tex to , r = 2 0 , C = 10 y Nt = 2 ,6 x 108.
E l v a lo r d e aNt en la ecu ac ió n se pu ed e re so lv e r p o r la interp o lació n a través de
la su stitu c ió n sistem ática d e v alo res arbitrarios d e a y d e Nt. S e u tiliz a u n g rá fico de
r fren te a aNt cu a n d o C es igual a 10 p a ra re so lv e r a, la actual ta s a d e m u tación. L as
tasas d e m u tació n (a) típ ic am en te v aría n de 1 x 10_ 8 a l x 10 -12. E l n ú m ero de
b ac terias (N¡) e n lo s peq u e ñ o s cultivos, d ep e n d ien d o d e la ce p a y el m edio, pu ed e
v aria r d e 5 x 107 a 5 x 1010. P ara re alizar el g rá fico d e r fren te a aN„ se
m u ltip lican d iv erso s v alo res d e a p o r v ario s v alo re s d e N„ tal co m o se ob serv a
e n las T ablas 3 -7 a 3-11. U n a v e z se h a ca lcu lad o aNt, se p u ed e re so lv e r r p o r
m edio d e la ecu ac ió n de la ta s a d e m utación. P o r eje m p lo , cu a n d o a = 5 x 1 0 - 7 y
N t = 5 x 107, en to n c es aNt = 25. U tilizando la ecu ac ió n d e la ta sa d e m utación,
r — a N , \n(aNtC)
T a b la 3-7 r para varios valores de a cuando Nt = 5 x 107 y C = 1 0
a N, aNt r
5 x 10-7 5 x 107 25,0 138,0

5 x 10“ 8 5 x 107 2,5 8,0
2 x 10-8 5 x 107 1,0 2,3
1 x 10-8 5 x 107 0,5 0,8
5 x 10-9 5 x 107 0,25 0,23
Tabla 3-8 r para varios valores de a cuando Nt = X 108 y C = 10
a N, aN, r
5 x 10-7 1 x 108 50,0 310,0

5 x ic r 8 1 x 108 5,0 19,6
1 x 108 2,0 6,0
x
o
1 x 10-8 1 x 108 1,0 2,3

5 x 1 (T 9 1 x 108 0,5 0,8
1 x 10-9 1 x 108 0,1 0,0
Tabla 3-9 r para varios valores de a cuando Nt = 2 x 108 y C = 1 0
a Nt aN, r
5 x 10-7 2 x 108 100,0 691,0

5 x 10“ 8 2 x 108 10,0 46,1
2 x 10-8 2 x 108 4,0 14,8
1 x 10-8 2 x 108 2,0 6,0
5 x 10“ 9 2 x 108 1,0 2,3
1 x 10-9 2 x 108 0,2 0,14
5 x 10-10 2 x 108 0,1 0,0
Tabla 3-10 r para varios valores de a cuando Nt = 5 x 108 y C = 10
a N, aNt r
5 x 10-7 5 x 108 250,0 1.956,0

5 x 10“ 8 5 x 108 25,0 138,0
5 x 108 10,0 46,1
x
o
1 x 10-8 5 x 108 5,0 19,6

5 x 10“ 9 5 x 108 2,5 8,0
1 x 10“ 9 5 x 108 0,5 0,8
5 x 10-10 5 x 108 0,25 0,23
CAPÍTULO 3 Crecimiento celular
Tabla 3-11 r para varios valores de a cuando Nt e s 1 x 109 y C = 10
a Nt aNt r
5 x 10-7 1 X 109 500,0 4.259,0

5 x 10-8 1 X 109 50,0 311,0
2 x 10-8 1 X 109 20,0 106,1
1 x 10-8 1 X 109 10,0 46,1
5 x 10-9 1 X 109 5,0 19,6
1 x 10-9 1 X 109 1,0 2,3
5 x 10-10 1 X 109 0,5 0,8
1 x 10-10 1 X 109 0,1 0,0
■ FIGURA 3-14 Gráfico de r frente a aNr para C = 10.
S ustitu y en d o lo s v alo re s co n o c id o s, o b tenem os
r — 25 ln (2 5 x 10) = 25 ln 2 5 0 = (2 5 )(5 ,5 ) = 138
L as T ablas 3-7 a 3-11 m u estra n los v alo re s d e r o b ten id o s c u a n d o se utilizan

d iv erso s v alo res p a ra a y N t.
R epresentando r frente a aNt p ara C = lO s e o b tie n e el gráfico de la F ig u ra 3 -1 4 .
■ FIGURA 3-15 Cálculo de aN, cuando r - 20.
D e la F ig u ra 3-15 se p u ed e v e r q u e c u a n d o r = 20, aNt = 5.

P o r lo ta n to , u tiliz an d o la ecu ac ió n r = aNt ln ( aNtC ), d o n d e r = 20,
N t = 2 ,6 x 108, C = 10 y aN¡ es equ iv a le n te a 5, ten e m o s que
2 0 = a ( 2 ,6 x 108) ln (5 x 10)
2 0 = a( 2 ,6 x 108) ln (50)
2 0 = a( 2 ,6 x 108)(3 ,9 )
D e sp ejan d o a, la ta s a d e m u tación, ob ten e m o s el sig u ie n te resultado:
20 20 „ %
a - --------------o~r~/-----r = ---------------- o = 2 x 1 0
(2 ,6 x 10 ) (3 ,9 ) 1,014 x 109
E sta ta s a de m u tació n ( 2 x 1 0 - 8 ) es ligeram ente su p erio r a la ca lcu lad a p o r el

m éto d o d e la d istrib u ció n d e P oisson. E sto se deb e a q u e este m éto d o es sen sib le a
la ap a rició n d e tu b o s d e la « su erte » , en lo s cu a les ocurren m u tacio n es m u y al inicio
tras la ino cu lac ió n d e m o d o q u e u n gra n n ú m ero d e células m u tan tes aparecen en
la p o b lac ió n final. L o s tu b o s d e la su erte d an c o m o resultado v alo re s ex c esiv a
m en te g randes d e r y u n a sob re stim ac ió n d e la ca n tid a d re al d e bac terias m utantes
q u e s u rg e n durante u n perío d o d e tiem po preciso.
3.12.4 T asa d e m u ta ció n ca lcu la d a m e d ia n te

la e x te n sió n en p lacas
L o s m u tan tes resistentes a T I p u e d e n s e r d ete ctad o s p o r m ed io d e la ex te n sió n de
las b ac terias sobre la p la c a d e agar, cub rie n d o c o n u n aero so l d e bac terió fa g o s la
plac a, y lu eg o p erm itien d o u n tiem p o d e incu b a ció n p ara que ap a rec iera n las
co lo n ias resistentes a T I . S e p u e d e utiliz ar este enfoque, co n lig era s m odificacio
n es, p a ra la d ete cció n d e la frecu e n cia de m utación. P o r ejem plo, se p o d ría realizar
el sig u ien te pro to co lo p ara lle g a r a este resultado.
1 . C o m ie n ce co n u n cultivo d e bac terias d e E. coli a u n a co n c en tra ció n de

2 x 105 células/m L .
2. C o n u n asa d e siem b ra estéril e x te n d er 0,1 m L (2 x 10 4 células) so b re cada
u n a d e las 2 4 p lacas d e m ed io y so b re 20 p lacas a las cuales an te s se les h a
ex te n d id o el bac terió fa g o T I . E sta ú ltim a serie d e p lac as se u tiliz a p a ra av e
rig u ar el n ú m ero d e bac terias resistentes a T I en el cultivo inicial.
3. In c u b ar las p lac as sem bradas d u ra n te 6 h . (A su m ien d o q u e el tiem po de
gen e rac ió n es d e 4 0 m in, s e p ro d u c irán n u ev e du p licac io n es [360 m in -j-
4 0 m in = 9].)
4. A las 6 h , con u n spray se rocía u n aerosol d e bacteriófago T I en 2 0 d e las 24
placas q u e no h an sido tratadas con T I anteriorm ente, y s e incuban esas placas
durante 12 h p ara p erm itir el crecim iento d e las colonias resistentes. U tilizar las
cuatro placas restantes no tratadas para re co g er y v alo ra r el núm ero d e bacterias.
E ste ex p e rim en to p o d ría d a r lo s sig u ie n tes resultados. E l n ú m ero inicial de

bac terias resistentes a T I (calculado p o r el nú m ero de co lo n ias q u e apa rec en en las
2 0 p lac as ro ciad as co n el fa g o T I ) = 0.
N ú m ero inicial d e b ac terias =
2 x 105 c é lu la s 0,1 m L
—-------
x — ------ x 2 0 p lac as = 4 x 105 células
mL placa
D e sp u és d e seis h o ra s d e crecim iento, las cu a tro p lac as no tratadas d an u n

re su lta d o d e 1 x 107 células/placa. P o r lo tan to , en las 2 0 p lac as tratadas con el
aero so l d e T I , h a y u n to tal d e 2 x 108 células:
2 x 108 células totales
S iguiendo la in cu b a ció n d e las 2 0 p lac as co n aerosol, se o b tien en cinco

c o lo n ias bacterianas.
L a ta sa d e m u tació n se p u e d e c a lcu lar u tiliz an d o la s ig u ie n te fórm ula:
cam bio en el n ú m ero d e colonias
ta s a d e m u tació n ca m b io en el nú m ero to ta l d e células

ln 2
3.13 Cálculo de la concentración celular con un hemocitómetro 79
E n n u estro e je m p lo el cam b io en el n ú m ero d e co lo n ias resistentes a T I es
5 -0 = 5
E l cam bio e n el n ú m ero to ta l d e b ac terias es
2 x 108 cé lu la s — 4 x 105 c é lu la s = 2 x 108 células
(R estando 4 x 105 d e 2 x 108 ob ten e m o s 2 x 108 cu a n d o se tien en en cu en ta

las cifras significativas.)
U tilizando la fó rm u la an te rio r p a ra la ta sa d e m u tació n o b tenem os
5 / 2 x 108
ta s a d e m u tació n =
ln 2
2,5 x 10-8
0,693
: 3 ,6 x 10-8
P o r lo tan to , la ta sa d e m u tació n es 3 ,6 x 10 m u taciones/bacteria/división

celular.
3.13 C A L C U L O D E L A C O N C E N T R A C IO N C E L U L A R
C O N UN H E M O C IT Ó M E T R O
U n hem o c itó m etro es u n po rtao b je to s so b re el q u e está g ra b ad a u n a re jilla de
1 m m x 1 m m . S o b re la re jilla d esc an sa u n cu b reo b jeto s so b re u n o s s o p o rtes de
0,1 m m d e ta l m an e ra q u e se form an u n as cá m ara s d e 0,1 m m 3 so b re la re jilla de
1 m m x 1 m m cu a d rad o s y e l espacio d e 0,1 m m entre el po rtao b je to s y el
cu b reobjetos. S e in tro d u ce u n a g o ta d e la s u sp en sió n ce lu la r en la cá m ara p o r
d eb a jo d el cu b reo b jeto s y luego se ex a m in a el po rtao b je to s al m icro sc o p io . El
o b serv ad o r cu e n ta el n ú m ero de células en d iv erso s cu a d rad o s de 1 m m x 1 m m .
(P ara u n a m a y o r pre cisió n , se d eb e n c o n ta r u n to tal d e m ás d e 2 0 0 cé lu la s.) Tal
co m o se p u e d e v e r en el sig u ien te pro b lem a el nú m ero d e células se tran sfo rm a en
u n a concentración.
P ro b le m a 3 .1 8 Una suspensión de células de un hibridoma se diluye a

1 mL/10 mL y una alícuota de la dilución se cuenta en un hemocitómetro. En
un total de 10 cuadros de la rejilla se cuentan 320 células. ¿Cuál es la
concentración de células de la suspensión?
S o lu c ió n 3.18
Para averiguar la concentración celular hay que realizar la conversión de capa
cidad (mm3) a volumen. Un mililitro de un líquido es igual a 1 cm3 (un
centímetro cúbico). Un cm3 = 1.000 mm3. En un milímetro cúbico hay diez

0,1 mm3. Para determinar la concentración celular hay que utilizar estos factores
de conversión y el factor de dilución, tal como se observa en la siguiente
ecuación:
320 células 100,1 — mm3 cuadrados 1.000 mm3 1 cm3 10 mL

100,1 - mm3 cuadrados mm3 cm3 mL 1 mL
3,2 x 106 células

mL
Por lo tanto, la suspensión celular tiene una concentración de 3,2 x 106 células/mL.
L a co n c en tra ció n ce lu la r se a v e rig u a re alizan d o u n a serie de d ilu cio n es del cultivo
b ac terian o y exte n d ie n d o alícu o ta s d e las d ilu cio n es en placas d e P etri p a ra crece r
las co lo n ias individuales y c a lcu lar el n ú m ero de b ac terias p o r v o lu m en del cultivo
in icial sin diluir. E l au m e n to del nú m ero d e células (TV) p o r u n id ad d e tiem po (/) es
pro p o rcio n al al n ú m ero d e células al c o m ien z o d el intervalo d e tiem p o (N¿) y se
ex p resa m ediante la relación
lo g (TV) = log(TVo) + K t
do n d e K es la co n stan te d e crecim iento ca lcu lad a co m o la p en d ie n te d e la re cta que

re su lta d e re p rese n ta r el lo g aritm o d e la co n c en tra ció n ce lu la r frente al tiem po.
E l tiem p o d e gen eración d e las células e n cultivo es el tiem p o q u e se requiere
p ara q u e el n ú m ero d e células se duplique. E ste se e x p re s a p o r m edio d e la
ecuación
_ 0,301
“ K
E l tiem po d e gen e rac ió n tam b ién se p u ed e ca lcu lar a partir d e u n gráfico d e la

D O d el c u ltiv o ce lu la r fren te al tiem po tras la in o cu lac ió n o d e la co ncentración
ce lu la r frente al tiem po tras la inoculación.
L a p ru eb a d e flu ctu ación , u n ex p erim en to q u e m id e la varia b ilid a d d e la
ap a rició n d e u n a b ac teria m u ían te entre u n solo cultivo y u n gru p o d e p equeños
cu ltiv o s individuales, se p u e d e u tiliz ar p a ra sab e r si lo s m u tan tes pre ex isten en u n a
po b lac ió n o s u rg e n esp o n tán e am en te co m o resultado d e la ex p o sició n a un
Resumen del capítulo 81
am biente d eterm inado. L a varia b ilid a d de u n v a lo r m edio se m id e p o r la varianza,

q u e v ien e d a d a p o r la ecuación
E (* -
v aria n za = ------------—
n —1
S i h a y u n a gra n varia n za entre el n ú m ero d e m u tan tes d en tro d el g ru p o de

peq u e ñ o s cu ltiv o s in dividuales s ig n ifica que, estos m u tan tes es m ás p ro b a b le que
p re ex istan en la po b lac ió n . L a p ru e b a d e flu ctu a ció n tam b ién s e p u e d e u tiliz ar p ara
estim ar la ta sa de m u tació n u tiliz an d o la distribución d e P o isso n p ara el ca so cero
(e v alu an d o el n ú m ero de peq u e ñ o s cu ltiv o s individuales q u e n o tien en m u tan tes y
reso lv ie n d o p a ra m, la m ed ia d el n ú m ero d e bac terias m u tan tes p o r peq u e ñ o
cu ltiv o ), utilizan d o la fórm ula
Po = -
L a ta sa d e m u tació n se ca lcu la com o
ta sa d e m u tació n
n ú m ero d e células p o r p eq u e ñ o c u ltiv o /ln 2
L a ta s a d e m u tació n tam b ién se p u ed e m ed ir p o r m ed io d e la utiliz ació n de

siem bras so b re p lac as utiliz an d o la ecuación
ca m b io en el n ú m ero d e co lo n ias resistentes

ca m b io en el nú m ero to ta l d e células
ta s a d e m u tació n =
L a co n c en tra ció n d e células eu cariotas en u n a s u sp en sió n se p u ed e av eriguar

utiliz an d o u n hem ocitóm etro.
B IB L IO G R A F ÍA
L u r ia , S .E ., a n d M . D e lb rü c k ( 1 9 4 3 ). M u ta tio n s o f b a c te ria f ro m v ir u s se n sitiv ity to v iru s
re sista n c e . G e n e ric s 2 8 :4 9 1 - 5 1 1 .
Trabajando con bacteriófagos
U n b a cte rió fa g o (fago) es u n v iru s q u e in fec ta a bacterias. E s p o co m ás q u e u n
ácido n ucleico ro deado p o r u n a cu b ie rta proteica. P a ra infectar a u n a bac teria, u n
b ac terió fa g o se u n e a u n re cep to r en la p ared de las b ac terias. T ras la un ió n , el fago
in y ec ta su A D N en el cito p lasm a de la b ac teria, d o n d e se replica. L o s genes d e los
fagos ex p resan pro teín a s d e la cu b ie rta q u e se en sam b lan enc ap su lan d o el A D N
rep lic ad o d el fago. C u an d o se h a en sa m b la d o u n nú m ero crítico d e p artículas del
v iru s, se p ro d u c e la lisis d e la b ac teria h u ésp e d y lo s fa g o s re cién en sa m b la d o s se
lib era n al m ed io am biente, do n d e pu ed e n in fec tar a n u ev a s b ac terias h u ésp e d . Sus
sim ples requisitos p ara la propagación, s u corto tiem po d e generación y su estruc
tu ra gen é tic a relativam ente sim ple h an hecho d e lo s bacteriófagos un o s organism os
ideales d e estudio para dilucidar lo s m ecanism os b ásicos d e la transcripción, la
replicación del A D N y la expresión génica. D iversos bacteriófagos h a n sido am plia
m ente caracterizados. A lg u n o s, co m o los bacteriófagos X y M 1 3 , h an sido
genéticam ente m odificados para u tilizarlos com o vectores para la clonación de
m aterial genético exógeno.
4.1 M U L T IP L IC ID A D D E IN F E C C IÓ N (M O I)
U n ex p e rim en to co n b ac terió fa g o s g en e ralm en te c o m ien z a co n u n p erío d o in icial
d u ra n te el cual se p erm ite q u e el v iru s se ad so rb a a las bac terias h u ésp ed es. Es
im portante co n o c er la re la ció n entre el n ú m ero d e b ac terió fa g o s re sp ecto al
n ú m ero d e bac terias en e s ta e ta p a d el pro c eso d e infección. D em asiados
b ac terió fa g o s u n id o s a u n a so la b ac teria p u ed e n c a u sa r la lisis celular, incluso
antes d e que el p ro c eso d e infección p u e d a p ro d u c ir partíc u la s d e la p ro g e n ie de
v iru s («lisis d esd e fuera»). S i se utiliz an p o co s b ac terió fa g o s p a ra la infección,
p u e d e se r difícil d ete ctar o m ed ir la re sp u esta q u e se está pro b a n d o . L a relación de
b ac terió fa g o s re sp ecto a las bac terias s e llam a m u ltip licid ad de in fección (m oi,
del inglés multiplicity o f infection).
P ro b le m a 4.1 Una alícuota de 0,1 mL de un stock de bacteriófagos, que

tiene una concentración de 4 x 109 fagos/mL, se añade a 0,5 mL de bacterias
£ coli con una concentración de 2 x 108 bacterias/mL. ¿Cuál es la moi?
84 CAPÍTULO 4 Trabajando con bacteriófagos
S o lu c ió n 4.1
Primero, calcule el número total de bacteriófagos y el número total de bacterias.
Número total de bacteriófagos:
4 x 109 fagos 8, ,,
0,1 mL x ---------------- = 4 x 108 bacteriófagos
mL
Número total de bacterias:
mL
Se calcula la moi como bacteriófagos por bacteria:
_ 4 x 108 fagos
= 4 fagos/bacteria
1 x 108 bacterias
Por lo tanto, la moi es de 4 fagos/bacteria.
P ro b le m a 4 .2 Una alícuota de 0,25 mL de un cultivo de E. coli, que tiene

una concentración de 8 x 108 bacterias/mL, se coloca en un tubo de ensayo.
¿Qué volumen del stock de bacteriófagos que tiene una concentración de
2 x 109 fagos/mL se debe añadir a una muestra de bacterias para tener una
moi de 0,5?
S o lu c ió n 4.2
Primero, calcule el número de bacterias en la alícuota de 0,25 mL:
8 x 108 bacterias 8,
0,25 mL x ---------------------= 2 x 10 bacterias
Después, calcule cuántas partículas de bacteriófagos son necesarias para tener

una moi de 0,5 cuando se utilizan 2 x 1 0 ® bacterias.
x fagos _ 0,5 fagos

2 x 108 bacterias bacterias
Despeje x:
x = (2 x 108 bacterias) = 1 x 108 fagos

4.2 Probabilidades y multiplicidad de infección (moi) 85
Finalmente, calcule el volumen del stock de bacteriófagos que contendrán

1 x 108 fagos:
2 x 109 fagos . ,
---------------- x x mL = 1 x 10 fagos
mL
v 1 x 108 fagos
±____ — n mz rw
2 x 109 fagos/m L
Por lo tanto, hay que añadir 0,05 mL del stock de fagos a la alícuota de bacterias
para tener una moi de 0,5.
4.2 P R O B A B IL I D A D E S Y M U L T IP L IC ID A D
D E IN F E C C IÓ N (M O I)
E n el capítulo anterior, la pro b a b ilid ad se u tiliz ó p ara c a lcu lar el nú m ero de
b ac terias co n u n a m u tació n d entro d e u n cultivo. L a pro b a b ilid ad tam b ién se
p u e d e em p lea r p a ra an a liz ar la infección al n iv el d e u n a so la b ac teria p a ra estim ar
la distrib u ció n d e las bac terias in fectadas en u n cultivo. E sto s m éto d o s se m uestran
en lo s sig u ien tes problem as.
P ro b le m a 4 .3 Un cultivo de bacterias es infectado con bacteriófagos a

una moi de 0,2. ¿Cuál es la probabilidad de que una bacteria resulte infectada
por dos fagos?
S o lu c ió n 4.3
Cuando una moi es inferior a 1, los cálculos necesarios para averiguar la
probabilidad de que una bacteria sea infectada son parecidos a predecir el
resultado del lanzamiento de una moneda. La probabilidad de que cualquier
bacteria sea infectada por una sola particular vírica es igual a la moi (en este
caso 0,2). Esto también significa que el 20% de las bacterias serán infectadas
(100 x 0,2 = 20%) o que cada bacteria tiene el 20% de oportunidades para
ser infectada. Este valor también se puede expresar como «1 en» el número
tomado por su recíproco:
1
— = 5
0,2
Por lo tanto, una de cada cinco bacterias podrá ser infectada.

Si asumimos que la unión de un fago no influye en la unión de otro fago, la unión

de un segundo fago tendrá la misma probabilidad de unión que el primero. Las
probabilidades de ambos sucesos se deberán multiplicar.
La probabilidad de que una bacteria sea infectada por dos fagos, por lo tanto, es
el producto de las probabilidades de cada suceso de forma independiente:
0,2 x 0,2 = 0,04
Esto se puede expresar de diferentes maneras:
a) el 4% de las bacterias tendrán dos partículas de fagos unidas (0,04 x 100 - 4%),
b) una bacteria tiene el 4% de oportunidades de ser infectada por dos
partículas de fago, o
c) una de cada 25 bacterias será infectada por dos partículas de fago (el
recíproco de 0,04 = 1/0,04 = 25).
P ro b le m a 4 .4 Un cultivo de bacterias es infectado por el bacteriófago X a una

moi de 5. ¿Cuál es la probabilidad de que una bacteria en particular no sea
infectada durante el período de adsorción del fago?
S o lu c ió n 4.4
En el capítulo anterior, la distribución de Poisson se utilizó para averiguar el
número de mutantes que se pueden esperar en una población de bacterias. Esta
distribución se representa por la ecuación
donde P es la probabilidad, r es el número de sucesos (en este ejemplo, una

bacteria con cero fagos unidos es el «suceso»), m es el número promedio de
fagos/bacteria (la moi; en este ejemplo 5) y e es la base de los logaritmos
naturales.
Para el caso cero, la ecuación se transforma en
Resolviendo para el caso cero, se hallan las siguientes dos propiedades.

■ Cualquier número elevado a 0 es igual a 1.
■ El símbolo de exclamación (!) designa el factorial de un número, que es el
producto de todos los enteros desde el número hasta 1. Por ejemplo, 4!
(léase como «4 factorial» o «factorial 4») es igual a 4 x 3 x 2 x 1 = 24.
0! es igual a 1.
La distribución de Poisson para cero queda en
e 5 es igual a 0,0067 (en una calculadora: 5, +/— y luego ex).
Por lo tanto, a una moi de 5, la probabilidad de que una bacteria no sea infectada
es de 0,0067. Esto es equivalente a decir que el 0,67% del cultivo no será
infectado (100 x 0,0067 = 0,67%) o que 1 de cada 149 bacterias no será infec
tada (1/0,0067 = 149).
P ro b le m a 4 .5 Un cultivo de bacterias es infectado con un bacteriófago a

una moi de 0,2. Se toman veinte alícuotas del cultivo infectado. ¿Cuántas
bacterias infectadas por fagos se deberán encontrar en cada alícuota?
S o lu c ió n 4.5
El número de bacterias infectadas por fagos deberá ser igual a la moi multipli
cada por el número de bacterias en la muestra. El producto representa el
promedio de bacterias infectadas por alícuota:
0,2 fagos infectivos

------ ¡-------;--------x 20 bacterias = 4 bacterias infectadas
bacteria
Así, en cada una de las 20 alícuotas, debe haber un promedio de cuatro bacterias
infectadas.
P ro b le m a 4 .6 En una de las 20 alícuotas de bacterias de los cultivos

infectados a una moi de 0,2, ¿cuál es la probabilidad de que no haya bacterias
infectadas en la alícuota?
S o lu c ió n 4.6
Como se ha visto en el Problema 4.5, debe haber, en promedio, cuatro bacterias
infectadas en una de las 20 alícuotas. Utilizando la distribución de Poisson para
el caso cero, donde re s igual al número de sucesos (en este caso, el suceso son 0
bacterias infectadas) y m es igual al número promedio de bacterias infectadas
por una de las 20 alícuotas (cuatro), la distribución de Poisson se transforma en
e -4 ° e - (1 ) 4
0! ( 1)
Para hallar a e 4 en la calculadora, introduciremos 4, +/— y luego ex. Esto da

como resultado el valor de 0,018.
Por lo tanto, la probabilidad de encontrar una bacteria no infectada en una de las

20 alícuotas tomadas del cultivo infectado a una moi de 0,2 es de 0,018. Esta
probabilidad también se puede expresar como «1 en» y el número tomado por
su recíproco:
O, hay 1-en-55,6 oportunidades de que una de las 20 alícuotas pueda contener

bacterias no infectadas.
P ro b le m a 4 .7 ¿Cuál es la probabilidad de encontrar 12 bacterias infectadas

en una de las 20 alícuotas tomadas de un cultivo infectado a una moi de 0,2?
S o lu c ió n 4.7
Se puede usar la ecuación de la distribución de Poisson. En el Problema 4.5, se ha
visto que el número promedio de bacterias infectadas en una de las 20 alícuotas
tomadas del cultivo es de cuatro y que este valor representa el factor m de la
distribución de Poisson. El factor r para este problema, el número de sucesos, es
de 12. La distribución de Poisson se puede escribir
En la calculadora, e_ 4 se resuelve entrando 4, +/—y al final e * . Esto da un valor de

0,018. El valor de 412 se resuelve introduciendo en la calculadora 4, xy, 1, 2 y
luego =. Esto da un valor de 16.777.216. Doce factorial (12!) es igual al producto
de todos los enteros entre 1 y 12:
(121 = 1 2 x 1 1 x 1 0 x 9 x 8 x 7 x 6 x 5 x 4 x 3 x 2 x 1 )
En la calculadora este número se calcula introduciendo 1, 2 y al final x !. Esto da

un valor para 12! de 479.001.600. Sustituyendo estos valores en la ecuación de la
distribución de Poisson, obtenemos
e“ 44 12 (0,018) (16.777.216) 301.990 ,

P12 = -----r - = — ---- —-------------- = -------------- = 6,3 x 10~4
12! 479.001.600 479.001.600
Por lo tanto, la probabilidad de encontrar 12 bacterias infectadas en una de las

20 alícuotas tomadas del cultivo infectado a una moi de 0,2 es de 0,00063. Este
valor se puede expresar como «1 en» tomando su número recíproco:
1
-----------j = 1.587,3
6,3 x 10~4
Hay una posibilidad 1-en-1.587,3 de encontrar 12 bacterias infectadas en una de

las 20 alícuotas.
P ro b le m a 4 .8 ¿Cuál es la probabilidad de que una muestra de 20 bacterias

tomadas de un cultivo infectado a una moi de 0,2 tenga cuatro o más bacterias
infectadas?
S o lu c ió n 4.8
El primer paso es calcular las probabilidades para un suceso no incluido en el
caso (la probabilidad de encontrar cero, una, dos o tres bacterias infectadas
para una de las 20 alícuotas). La probabilidad de todos los posibles tipos de
infecciones (es decir, la probabilidad de no tener bacterias infectadas, de una
bacteria infectada, de dos, de tres, de cuatro, de cinco, etc.) ha de ser igual
a 1. Si las probabilidades de obtener cero, una, dos y tres bacterias infectadas
se resta de 1,0, entonces el resto será equivalente a la probabilidad de
obtener cuatro o más bacterias infectadas. Como se puede ver en el
Problema 4.5, m, el promedio de bacterias infectadas en una de las 20
alícuotas que provienen de un cultivo infectado con una moi de 0,2, es de
4. La probabilidad para el caso de no encontrar bacterias no infectadas se
calculó en el Problema 4.6 y fue de 0,018.
La probabilidad de encontrar una bacteria infectada en una de las 20 alícuotas es
e-44 1 (0,018) (4)

Pt - — — - ^ ---- !±-L = 0,072
1 1! 1
La probabilidad de encontrar dos bacterias infectadas en una de las 20 alícuotas es
e-442 (0,018) (16) 0,288

P2= ^ r = 2xi =— = ai44
La probabilidad de encontrar tres bacterias infectadas en una de las 20
alícuotas es
e“ 443 (0,018) (64) 1,152

P3 = — — = — ---- - — —----= 0,192
3 3 3x2x1 6
La probabilidad de encontrar cuatro o más bacterias infectadas en una de las

20 alícuotas es
1 - P0 - P\ - P i - ñ¡ = 1 - 0,018 - 0,072 - 0,144 - 0,192 = 0,574
Por lo tanto, el 57,4% (0,574 x 100 = 57,4%) de las veces, una de las 20 alícuotas
obtenidas de un cultivo infectado con una moi de 0,2 contendrá cuatro o más
bacterias infectadas. Expresado como «1 en», 1 de cada 1,7 de las 20 alícuotas
(el recíproco de 0,574 = 1,7) contendrá cuatro o más bacterias infectadas.
P ro b le m a 4.9 ¿Cuál es la probabilidad de que, en una de las 20 alícuotas del

cultivo infectado con una moi de 0,2, encontremos ninguna o una bacteria
infectada?
S o lu c ió n 4.9
Como hemos visto en el Problema 4.8, bajo estas condiciones experimentales, la
probabilidad (P) de encontrar ninguna bacteria infectada (P0) es igual a 0,018 y la
probabilidad de encontrar una bacteria infectada (P-,) es igual a 0,072. La pro
babilidad de encontrar ninguna o una bacteria infectada en una de las 20
alícuotas es la suma de las dos probabilidades:
0,018 + 0,072 = 0,090
Por lo tanto, el 9% de las veces (100 x 0,090 = 9%), encontraremos ninguna o

una bacteria infectada. O, expresado en términos como «1 en», 1 entre 11 de las
20 alícuotas contendrá ninguna o una bacteria infectada (el recíproco de 0,090
es igual a 11).
P ro b le m a 4 .1 0 Transcurrido el período de adsorción de los fagos, se

extienden muestras del cultivo bacteriano para medir el número de bacterias
infectadas. Se encuentra que el 60% de las bacterias del cultivo infectado no
producen fagos activamente; es decir, ellas no fueron infectadas. ¿Cuál es la moi
(promedio de bacterias infectadas por los fagos) de este cultivo?
Para este problema, hay que resolver m a partir de la ecuación de la distribución
de Poisson. Dado que el problema describe el caso cero, la distribución de
Poisson,
Pr = -
4.3 Medida del título de fagos 91
se convierte en
e~mm°
0,6 — ----------—
0!
Como m° y O! son ambos igual a 1, la ecuación queda como
e-m(1) m
0,6 = ---- — = e~m
1
Para resolver m, hay que utilizar la siguiente ecuación: P = e~m, que es equiva
lente a m = —In P. Despejando m, obtenemos
m = —ln 0,6
Para calcular el logaritmo natural de 0,6 en la calculadora, entramos „ 6 y luego

ln. Esto da un valor, una vez redondeado, de —0,51. Por lo tanto,
m = - ( - 0 ,5 1 )
Como el negativo de un negativo es un valor positivo, m = 0,51.
Por lo tanto, la moi del cultivo es de 0,51.
4.3 M E D ID A D E L T ÍT U L O D E F A G O S
L a ú ltim a e ta p a d el desa rro llo d e lo s b a c terió fa g o s im p lic a la lib era ció n d e la
p ro g e n ie d e p artícu las d e fagos d esd e la bacteria. D iversos b ac terió fa g o s realizan
este p aso de diferentes m aneras. A l final de la infección, el b ac terió fa g o X codifica
u n a p roteína, la en d o lisin a, q u e d ig iere la p ared bacteriana. C u an d o la p ared
b a c terian a está su m am en te debilitada, la b ac teria estalla, liberando entre 50 y
2 0 0 partíc u la s virales prod u c id a s du ra n te la infección. L a b ac teria infectada m u ere
en este p ro c eso . D esp u és de la re plicación del gen o m a del fago M 1 3 , en el interior
d e u n a b ac teria infectada, éste se em p a q u eta en u n a c u b ie rta d e p ro teín a q u e p a s a a
trav é s d e la m em b ra n a cito p lasm ática en su cam ino h a c ia fu e ra d e la b ac teria. L as
p artícu las m ad u ra s del fago M 13 salen de fo rm a in d iv id u a l d e la ce ld a en lu g a r de
h ac erlo d e fo rm a m asiva. A u n q u e el fa g o M l 3 no lisa a las b ac terias infectadas, las
b ac terias q u e alb e rg an el M 13 crece n m ás len tam e n te q u e las no infectadas.
C u an d o se siem bran bac terió fa g o s, so b re u n a m o n o ca p a d e bac terias suscepti
b les a s e r infectadas, u n b ac terió fa g o fo rm a rá u n área c irc u lar d e tu rb id ez re d u cid a
llam ad o h a lo d e lisis o c a lv a . D e p en d ien d o d e los bac terió fa g o s, u n a ca lv a pu ed e
se r cla ra (c o m o la q u e fo rm a el fa g o T I o lo s m utantes claros d e X) o u n a calva
p u e d e se r u n área q u e co n tien e las bac terias d e crecim iento lento (com o las
fo rm a d as p o r la in fec ció n d e M 13).
C u an d o se d ilu y e u n s to ck d e fa g o s y se siem b ra so b re b ac terias susceptibles de

tal m an e ra q u e las calvas in dividuales se p u ed e n ap recia r c o n claridad so b re la
m o n o ca p a b ac terian a , es po sib le d ete rm in a r la co n c en tra ció n d e partículas víricas
d en tro d el stock. Si el stock d e fa g o s se d ilu y e a u n nivel adecuado, p ara que
ap a rez ca n calvas in dividuales y b ie n aislad a s so b re la m o n o ca p a d e b ac terias, se
asu m e q u e ca d a u n a d e las calvas resu lta n te s está orig in ad a p o r u n a so la b ac teria
infectada. E l pro c eso p ara d ete rm in a r la co n c en tra ció n d e fagos p o r m edio de
dilu ció n y siem b ra so b re bac terias su sce p tib les se llam a titu lación o en sa y o de
form ación d e calvas. E ste m éto d o p erm ite d ete rm in a r el n ú m ero d e partícu las de
fa g o s viab les en u n a su sp en sió n stock. U n b ac terió fa g o c a p az d e p ro v o c ar u n a
infección p ro d u c tiv a se d en o m in a u n a u n id ad fo rm ad ora d e ca lv a (P F U del
inglés plaque-forming unit).
L o s sig u ie n tes p roblem as m u estra n cóm o se re aliza el cálculo d el título de
fa g o s y có m o se llev an a ca b o las d ilu cio n es d e los s to ck s d e fagos.
P ro b le m a 4.11 Un stock de bacteriófagos se diluye de la siguiente forma:

0,1 mL del stock de fagos se diluye en 9,9 mL de tampón de dilución
(obteniéndose un volumen total de 10,0 mL en el primer tubo de dilución). A
partir de este primer tubo de dilución, se toman 0,1 m L y se diluyen en un
segundo tubo que contiene 9,9 mL. Del segundo tubo de dilución se toman
0,1 mL y se diluyen en un tercer tubo que contiene 9,9 mL de tampón de
dilución. Del tercer tubo, se toman 1,0 m L y se añaden a un cuarto tubo de
dilución que contiene 9,0 mL. Finalmente, se toman 0,1 mL del cuarto tubo y se
siembran con 0,2 mL de bacterias susceptibles a la infección en agar
semifundido. Tras incubar la placa durante una noche, se pueden contar 180
calvas. ¿Cuál es el título del stock de bacteriófagos?
S o lu c ió n 4.11
La dilución seriada que se describe en este problema se puede expresar de
forma que cada paso de dilución esté representado por un quebrado. Para
obtener el factor de dilución total, hay que multiplicar todos los quebrados.
0,1 mL 0,1 m L 0,1 mL 1,0 mL ^

10 m L X 10 mL X 10 mL X 10 m L X ' m
Transformando esta serie de quebrados en notación científica obtenemos la

siguiente dilución final (véase la Figura 4-1):
(1 x 10“ 2) x (1 x 10~2) x (1 x 10-2) x (1 x 10_1) x (1 x 10~1 mL)

— i x 10“ 8 mL
4 .4 Dilución de bacteriófagos 93
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 1,0 mL 0,1 mL
I í
9,9 mL 9,9 mL 9,9 mL 9,0 mL
0,1 mL .. 0,1 mL .. 0,1 mL .. 1,0 mL
: 0,1 mL
10 mL X 10 mL X 10mL X 10mL
“ (1 x 10-2) x (1 x 10"2) x (1 x 10"2) x (1 x 10“ 1) x (1 x 10-1) = 1x10-®
I FIGURA 4-1 Dilución seriada del Problema 4.11. Con una dilución de 1 x 10-8 se obtienen 180 calvas.
Para obtener la concentración de fagos en la suspensión stock, hay que dividir el

número de calvas halladas en la placa entre el factor de dilución.
180 PgU = 1,8 x 1010 PFU/m L

1 x 10-8 mL
Por lo tanto, el stock de bacteriófagos tiene un título de 1,8 x 10 PFU/mL.
4.4 D IL U C IÓ N D E B A C T E R IÓ F A G O S
F rec u en tem en te es n ecesario d ilu ir el sto ck d e b ac terió fa g o s p ara o b ten e r la
cantidad a d e cu a d a (y el vo lu m en co n v e n ien te) d e v iru s p a ra añ a d irla a u n cultivo.
C u an d o se p lan ifica u n e sq u e m a d e dilu ció n se d eb e n te n e r e n cu e n ta diversas
2 consideraciones.
= « E s co n v e n ien te to m ar u n a a lícu o ta d e 0,1 m L a p a rtir d el últim o tu b o de

c dilu ció n p ara sem b ra rla en la p la c a co n las bac terias su sce p tib les a la
| infección. E ste p aso su p o n d rá u n 1 x 10 _1 d el fa cto r d e dilu ció n de 2 x 10- 7 .
| « E s co n v e n ien te to m a r u n a alícu o ta d e 0,1 m L d el s to ck d e fagos p a ra añ a d ir al
c p rim er tu b o d e d ilución. S i el p rim e r tu b o d e dilu ció n co n tien e 9,9 m L de
M tam p ó n , este p aso su p o n d rá u n 1 x 10- 2 d el fa cto r d e dilu ció n d e 2 x 10~7.
8 ■ C o m o el díg ito sig n ificativ o d el fa cto r d e d ilu ció n es 2 (el 2 d e 2 x 10 - 7 ), este
2 nú m ero d eb e p o n erse en la serie d e d ilución. E sto se cum ple realizando una
yÜ dilu ció n d e 0,2 m L /1 0 m L (q u e eq u iv a le a u n fa cto r d e dilu ció n d e 2 x 1 0-2 ).
v) P o r lo tan to , se pu ed e n añ a d ir 0 ,2 m L de la p rim era dilu ció n a u n seg u n d o tubo
© d e dilu ció n q u e c o n te n g a 9,8 m L d e tam pón.
P ro b le m a 4 .1 2 Un stock de fagos tiene una concentración de 2,5 x 109

PFU/mL. ¿Qué cantidad del stock hay que diluir y sembrar para obtener 500
calvas en una placa?
Este problema se puede resolver de la forma inversa a la utilizada para el
Problema 4.11. Si x representa el factor de dilución que es necesario para
obtener 500 calvas por placa de un stock de fagos que contiene
2,5 x 109 PFU/mL, podemos plantear la siguiente ecuación:
500 PFU _ 2,5 x 109 PFU

x mL mL
Despejando para x tenemos
„m (2,5 x 109 P F U )(x m L)

500 PFU = — -------------- - -----
mL
500 PFU 7
--------- ------ = x = 2 x 10
2,5 x 109 PFU
Por lo tanto, el stock de fagos hay que diluirlo 2 x 10-7 veces.
Los fagos hay que diluirlos de la siguiente forma:
(1 X 10- 2 ) x (2 X 1(T 2) x (1 x K T 1 mL) = 2 X 1CTS mL
El resto de factor de dilución a tenerse en cuenta es
(2 x 10~s) x (x ) = 2 x 10~7
2 x 10_:
- = i x 10“
La última dilución restante debe ser una en la cual se tomen 0,1 mL y se añadan
a 9,9 mL de tampón. Por lo tanto, si el stock de fago a la concentración de
2,5 x 109 PFU/mL se diluye como sigue:
0,1 mL 0,2 mL 0,1 mL

------ - x ------ - x ------ - x 0,1 mL en placa
10 m L 10 mL 10m L M
deben aparecer 500 calvas en la capa de bacterias de la placa (véase la Figura

4-2).
4.5 Midiendo el tamaño de explosión 95
0,1 mL 0,2 mL 0,1 mL 0,1 mL
9,9 mL 9,8 mL 9,9 mL

0,1 mL 0,2 mL 0,1 mL
x0,1 mL
^ o
10 mL 10 mL 10mL
T I (Q
C O
3 (1 x 10"2) x (2 x 10"2) x (1 x 10"2) x (1 x 10"1) = 2 x 10"7
■ FIGURA 4-2 La dilución seriada y siembra en placa de fagos del Problema 4.12 muestra que el stock de fagos se
diluye 2 x 10- 7 veces y que esa dilución genera la producción de 500 calvas.
4.5 M ID IE N D O E L T A M A Ñ O D E E X P L O S IÓ N
L a m utación del genom a d e u n a bacteria o de un fago y los cam bios en las condi
ciones b ajo las cuales se llev a a cabo la infección pueden alterar la interacción fago/
h uésped y la eficiencia con la cual los fagos llevan a cabo la replicación. L a form a
m ás sencilla para evaluar la expresión génica global del fago infectivo es m ed ir el
n úm ero d e partículas d e bacteriófago de la progenie producidas dentro d e la bacteria
infectada y liberadas posteriorm ente. A l núm ero d e partículas víricas m aduras libe
radas a partir de u n a bacteria infectada se denom ina ta m a ñ o d e explosión.
P ara realizar un experim ento que m ida el tam año de la explosión, p o r ejem plo, se
añaden fagos a bacterias susceptibles a la infección a u n a m oi de 0,1 y se dejan que
se adsorban durante 10 a 30 m in en hielo. L a suspensión d e bac terias/fago se diluye
en u n gran volum en d e m edio d e cultivo frío y se centrifuga p ara sedim entar las
bacterias. E l sobrenadante se d ese ch a p ara elim inar los fagos Ubres. E l sedim ento de
b acterias se re suspende en m edio frío y luego se dilu y e en u n frasco d e crecim iento
que contiene el m edio d e cultivo atem perado. Inm ediatam ente después se to m a u n a
m uestra y se valo ra la cantidad d e P F U presentes. E l núm ero d e calvas d e esta
valoración representa el núm ero d e bacterias infectadas (denom inado c e n tro s infec
tivos [CI]); c a d a bacteria infectada d a co m o resultado u n a calva. T ras u n período de
tiem po adecuado para que se lleve a cabo la lisis de las bacterias, se valo ra d e nuevo
el título de fagos p o r m edio de PFU . E l tam año de explosión se calcula p o r m edio de
la relación entre el núm ero d e P F U liberadas y el núm ero d e C I (PFU /C I).
P ro b le m a 4 .1 3 En el experimento de tamaño de explosión, los fagos se

añaden a 2 x 108 bacterias a una moi de 0,1 y se dejan adsorber durante 20
minutos. Se lleva a cabo la dilución y centrifugación para eliminar los fagos no
adsorbidos. Las bacterias sedimentadas se resuspenden en 10 mL de medio

de cultivo. En este momento, se calcula el Cl mediante la dilución de una alícuota
de las bacterias infectadas siguiendo el esquema que sigue (véase la Figura 4-3):
0,1 mL 0,1 mL
<0,1 mL en placa
10 mL X 10 mL
Las bacterias infectadas resuspendidas se cultivan a 37 °C durante 90 min. El
ensayo para determinar las PFU se realiza por medio de la dilución de una
alícuota como sigue:
0,1 mL 0,1 m L 1 mL 0,5 mL

0,1 mL en placa
10 mL X 10 mL X 10 mL X 10 mL >
A partir del ensayo de Cl, se cuentan 200 calvas sobre la monocapa de bacterias. A
partir del ensayo de PFU tras los 90 min de incubación, se cuentan 150 calvas de la
muestra diluida (Figura 4-4). ¿Cuál es el tamaño de explosión, expresado en PFU/CI?
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL
jig» 9,9 mL 9,9 mL
f Í. 0,1 mL 0,1 mL
x 0,1 mL
gj » 10 mL 10 mL
(1 x 10-2) x (1 x 10-2) x (1 x 10-1) = 1 x 10"5
I FIGURA 4-3 La dilució n seriada descrita en el Problema 4.13 genera 200 calvas.
0,1 mL 0,1 mL 1,0 mL 0,5 mL 0,1 mL
1
X ^ Z Z Z Z Z Z S 9,9m L 9,9 mL 9,0 mL 9,5 mL
0,1 mL 0,1 mL 1 mL 0,5 mL
x0,1 mL
10 mL 10 mL 10mL 10mL
(1 x 10-2) x (1 x 10-2) x (1 x 10-1) x (5 x 10-2) x (1 x 10~1) = 5 x lO"8
I FIGURA 4-4 La dilución seriada descrita en el Problema 4.13 (una dilució n de 5 x 1 0 ~ 8) genera 150 calvas.
4.5 Midiendo el tamaño de explosión 97
S o lu c ió n 4.13
El número de Cl se calcula dividiendo el número de calvas obtenidas tras la
dilución entre el factor de dilución aplicado. El esquema de dilución para obte
ner los Cl es
0,1 ml_ 0,1 mL

------------ -- x ------------ -- x 0,1 mL en placa
10 mL 10 mL K
Esto equivale a la expresión
(1 x 10~2)(1 x 10“ 2)(1 x 10“ 1 m L) = 1 x 10~5 mL
Por lo tanto, el número de Cl es igual a
200 PFU
= 2 x 107 PFU/m L = 2 x 107 CI/m L
1 x 10-5 mL
El número de PFU, tras los 90 min de incubación, se obtiene realizando una

dilución de la muestra de la siguiente forma:
0,1 mL 0,1 mL 1 mL 0,5 mL

------------ -- x ------------ -- x -------------- x ------------ -- x 0,1 m L en placa
10 mL 10 mL 10m L 10m L K
Esto es equivalente a 5 x 10 8, tal como se muestra a continuación.
(1 x 10~2)(1 x 10_2)(1 x 10“ 1)(5 x 10~2)(1 x 10~1 m L) = 5 x 10-8 mL
Como se han obtenido 150 calvas a partir de la dilución, la concentración de

fagos en el cultivo tras los 90 min es de
15017
c ^ i r » - 8 i-vi i
—3 x 109 PFU/mL
1
El tamaño de explosión se expresa como la concentración de fagos tras los

90 min de incubación dividido entre la concentración de Cl:
3 x 109 PFU/m L _ 3 x 109 PFU mL

2 x 107 CI/m L _ mL X 2 x 107 CI
3 x 1 0 9 PFU
- =—- = 150 PFU/CI
2 x 10 C '
N o t a : Para realizar estos cálculos, el quebrado (3 x 109 PFU/mL) se divide entre

el quebrado (2 x 107 CI/mL). Se pueden utilizar las ecuaciones que se describen
a continuación para este tipo de cálculo.
Dividir un quebrado entre otro es lo mismo que multiplicar el numerador del

quebrado por el recíproco del denominador de la fracción. Una frase que se
utiliza con frecuencia para describir este tipo de operación es «invertir y
multiplicar». Por lo tanto,
1 a
a 1 b b J a l a
T- a XT- o y 6_ TXd_ b
b i
L a re la ció n entre fa g o s infectivos fren te a b ac terias h u ésp e d es se den o m in a
m ultiplicidad d e in fec ció n (m oi). L a pro b a b ilid ad d e q u e c u a lq u ie r b ac teria sea
o no infectada, c u a n d o u n c u ltiv o d e esta b ac teria se ex p o n e a u n determ inado
n ú m ero d e p artículas v írica s, p u ed e calcularse u tiliz an d o la d istrib u ció n de
P o isso n
P r _ e~mm'
r r\
d o n d e P es la probabilidad, r es el n ú m ero d e sucesos, m es el pro m edio d e fagos/

b ac teria (o bacteria infectada) y e es la base del logaritm o natural. L a concentración
d e bacteriófago p o r unidad d e v o lum en se d enom ina título del fago y se calcula
averiguando el núm ero d e P F U d e u n a dilución de u n stock de fagos. E l tam año de
explosión es el núm ero d e fagos viables liberados p o r u n a bacteria infectada tras la
re plicación del virus.
Cuantificación de ácidos nucleicos
5.1 C U A N T IF IC A C IÓ N D E Á C ID O S N U C L E IC O S
P O R E S P E C T R O S C O P IA D E U L T R A V I O L E T A
C u alq u ier ex p erim en to q u e re q u ie re la m an ip u lac ió n d e u n ácido nu cle ic o m u y
p ro b a b le m en te tam b ién re q u ie re su cua n tific ac ió n p re cisa p ara g aran tizar resul
tad o s ó p tim o s y reproducibles. L as b a se s nitro g en a d as, colo c ad as a lo largo d e la
h e b ra d e u n ác id o nu cle ic o , ab so rb en la ra d ia ció n u ltrav io leta (U V ) a u n a lon g itu d
d e o n d a d e 2 6 0 nm ; en esta lo n g itu d de o n d a, la ab so rció n de la lu z es proporcional
a la co n c en tra ció n d e ácidos n ucleicos. E sta relación está ta n b ien caracterizada
que la ab so rció n d e U V se u tiliz a p a ra d ete rm in a r con p re cisió n la co ncentración
de ác id o s nucleicos en u n a solución. L a relación entre la co n c en tra ció n del A D N y
la ab so rció n es lin eal ha sta u n a ab sorción a 26 0 n m (A 260) d e 2 (F ig u ra 5-1). P ara
m ed ir la ab so rció n d e u n a so lu ció n d e ác id o nu cle ic o en u n esp e ctro fo tó m etro , la
m ay o ría d e lo s lab o ra to rio s d e b io lo g ía m o lecu la r u tiliz an cu b e tas d e cuarzo con
u n a a n c h u ra d e p aso del h a z de lu z de 1 cm . P o r lo tan to , en to d o s los ap a rtad o s de
este ca p ítu lo se asu m e u n paso d e lu z d e 1 cm .
(ig de ADN en 1 mL
■ FIGURA 5-1 La concentración de ADN y la absorbancia a 260 nm tienen una relación lineal hasta un valor de la
A26o de aproximadamente 2.
100 CAPITULO 5 Cuantificación de ácidos nucleicos
5.2 D E T E R M IN A N D O LA C O N C E N TR A C IÓ N D E ADN
D E C A D EN A D O B LE
L o s p ro to co lo s d e u tiliz ació n d e p lásm id o s, v iru s o g en o m a s requieren la
cuan tific ac ió n d el A D N d e d o b le c a d en a (A D N cd o A D N . S i n o se in d ica n ad a
se sobre n tie n d e en g en e ral que la ab rev iac ió n A D N se re fiere al A D N d e do b le
cadena). L a cu a n tific ac ió n se re aliza n o rm alm en te m ed ian te la cua n tific ac ió n de la
abso rb an cia a 2 6 0 ,2 8 0 y 32 0 nm . L a a b so rb an cia a 2 6 0 n m se u tiliz a p a ra detectar
específicam ente el co m p o n e n te de ác id o nu cle ic o d e u n a solución. L a ab sorbancia
a 28 0 n m se u tiliz a para d ete ctar la p re sen cia de p ro teín a s (y a q u e lo s re sid u o s de
trip tó fan o [Trp] ab so rb en a esta lon g itu d d e onda). L a a b so rb an cia a 32 0 n m se
u tiliz a p a ra d ete ctar c u a lq u ie r c o m p o n e n te insoluble q u e disp erse la luz. U n
espectrofotóm etro c a p az d e p ro p o rcio n ar u n b arrid o d e 2 0 0 a 3 2 0 n m d ará la
m áx im a in fo rm a ció n relevante (F ig u ra 5-2).
E l cálculo d e la relación entre las lec tu ras ob ten id as a 2 6 0 y 28 0 n m nos pu ed e
d a r u n a estim ació n d e la co n ta m in a ció n p o r pro teín a s d e lo s ácidos nu cle ic o s que
h an sido p u rific ad o s a p artir d e u n o rig en bio ló g ic o (e n co m p a rac ió n a aquellos
sintetizados artificialm ente). U n A D N p u ro , lib re d e p ro teín a contam inante,
ten d rá u n a re la ció n d e ^ 260^280 c e rca n a a 1,8. S i en la p re p ara ció n d e A D N
h a y fenol o p ro teín a co n tam inante, la re la ció n A 260^280 será m e n o r d e 1,8. Si e n la
pre p ara ció n d e A D N h a y A R N pre sen te, la re la ció n A 2ao/A2so p u e d e se r m a y o r a
1,8. L as prep aracio n es pu ra s d e A R N tien en u n a re la ció n A260IA29>qc e rca n a al 2,0.
A 26 0 nm , concentraciones d e A D N tan b aja s com o 2 pg/m L son detectables.
U n a solución d e A D N a u n a concentración d e 50 jxg/mL tendrá u n a absorbancia, a
26 0 nm , igual a 1,0. E sta relación expresada com o u n a ecuación q u ed a d e esta form a
1 unidad de A 260 d e A D N cd = 50 |i g de A D N /m L
L o n g itu d d e o n d a (n m )
■ FIGURA 5-2 Un típico barrido espectrofotométrico de un ADN de cadena doble (ADNcd). El máximo de
absorbancia es a 260 nm . La absorbancia a 230 nm indica la presencia de sal en la muestra. Si la muestra es
ópticam ente transparente, se debe obtener una lectura m uy baja a 320 nm , ya que es una longitud d e onda del espectro
que se encuentra en la región del visible.
5.2 Determinando la concentración de ADN de cadena doble 101
L a a b s o r b a n c ia y la d e n s id a d ó p tic a (D O ) son térm in o s fá cilm e n te inter

cam biables. L a ecu ac ió n an te rio r tam b ién se p u e d e e x p resar co m o u n fa cto r de
conversión:
50 p,g d e A D N /m L
1,0 D O
L o s siguientes p ro b lem a s utiliz an esta ecuación.
P ro b le m a 5.1 Usted ha purificado el ADN de un plásmido recombinante a

partir de un pequeño cultivo. El ADN lo ha resuspendido en un volumen de
50 (iL. Ha diluido 20 ^xL de la muestra del ADN purificado en un volumen total
final de 1.000 ^.L de agua destilada. A continuación ha medido la absorbancia de
la muestra diluida a 260 y 280 nm y ha obtenido las siguientes lecturas:
¿260 = 0,550; ¿ 280 = 0,324.
a) ¿Cuál es la concentración de ADN en los 50 (xL de la preparación del
plásmido?
b) ¿Qué cantidad total de ADN se purificó por medio del protocolo de preparación
de plásmidos?
c) ¿Cuál es la relación A260/A28o del ADN purificado?
Este problema se puede solucionar planteando la siguiente relación:
xp,g de ADN/m L 50 jxg de ADN/mL

0,550 DO “ 1,0 DO
, (°<550 DO)(50 jxg de ADN/mL)
x ixg de ADN/mL = — ---------—— -------- ------
' 1,0 DO
x — 27,5 (ig de ADN/mL
Esta cantidad representa el valor de la concentración de la solución diluida de

ADN utilizado en el espectrofotómetro. Para calcular la concentración de ADN
en la muestra original de 50 |xL de la preparación del plásmido, hay que dividir
este valor entre el factor de dilución. 20 (xL de muestra de la preparación de ADN
plasmídico se diluyeron en un volumen final de 1.000 (xL.
27,5 ixg de ADN/mL , , 1.000

------ ----- = 27,5 jxg de A D N /m Lx
1.000
27.500 ixg de ADN/mL , .
= ---------------------- -----= 1.375 jxg de ADN/mL
102 CAPÍTULOS Cuantificación de ácidos nucleicos
Por lo tanto, en los 50 ^.L ¡nidales de plásmido hay una concentración de

1.375 [jg de ADN/mL. Para pasar este valor a la cantidad de ADN por (xL, se
ha de multiplicar por el factor de conversión, 1 m171.000 jaL:
1.375 u,g de ADN 1 mL ,

--------- ---------------- x ------------ - x 51,35 ug de A D N/ laL
mL 1.000 [aL ^ p
De este modo, los 50 |xL de preparación de plásmido tienen una concentración

de 1,35 jig de ADN/mL.
La cantidad total de ADN obtenida en la purificación del plásmido se puede
calcular multiplicando la concentración de ADN obtenida anteriormente por el
volumen total en que está disuelto el ADN:
1.375 ug de ADN 1 mL . (1.375)(50)

------- — ---------- x ---------- - x 50 ixL = i ------ = 68,75 ug de ADN
mL 1.000 nL r 1.000
Por lo tanto, la preparación de plásmido inicial de 50 pL contiene un total de

68,75 p,g de ADN. Sin embargo, como se utilizaron 20 jxL para la dilución y la
lectura en el espectrofotómetro, sólo nos quedan 30 |j,L de muestra. Así, pode
mos calcular la cantidad de ADN restante multiplicando el volumen que nos
queda por la concentración:
1,35 ug de ADN _
30 ii,L x ----- -------------= 40,5 Lig de ADN
(xL
Por lo tanto, aunque se obtuvieron 68,75 jig de ADN de la preparación del

plásmido, usted utilizó una cantidad para el espectrofotómetro y ahora le
quedan los 40,5 pg de ADN restantes.
S o lu c ió n 5.1(c)
La relación A 26o/A280 es
0,550
—---- = 1,703
0,323
5.2.1 U tiliza ció n d e la a b s o rb a n cia y del c o e fic ie n te

de e x tin ció n para c a lc u la r la co n ce n tra ció n d e ADN
de ca d e n a d o b le
U n a so lu ció n d e A D N , a u n p H n eu tro y asu m ien d o u n co n te n id o del 50 % de G 1C
en el A D N , a u n a co n c en tra ció n d e 1 m g/m L ten d rá u n v a lo r d e ab so rció n a
2 6 0 n m (A26Q), co n u n p aso d e lu z d e 1 cm , d e 20. P a ra m u ch a s ap lica cio n es en
b io lo g ía m olecular, c u a n d o se cu a n tific a A D N d e elevado p eso m o lecu la r n o es

nec esario te n e r en cu en ta el co n te n id o en G 1C , a no s e r q u e esté m u y sesgado. A l
v a lo r d e ab so rció n d e 20 p ara u n a so lu ció n d e 1 m g d e A D N /m L se den o m in a
coeficien te d e extin ción d el A D N . E stá represe n ta d o p o r el sím bolo E o e. El
co n cep to de coeficien te d e extin ción se u tiliz a d e fo rm a in d istin ta co n el de
con stan te d e ab sorción o coeficien te d e ab sorción . L a fó rm u la q u e d esc rib e
la relación en tre la ab so rció n a 2 6 0 n m (A26o), la co n c en tra ció n (c) (e n m g/m L ), el
a n c h o d e p aso de lu z (l) d e la c u b e ta (en centím etros) y el coe ficien te d e e x tin ció n a
2 6 0 n m (£”200) p ara u n p aso d e lu z d e 1 cm es
A-260 — E 26 qI c
E sta ecu ac ió n s e d en o m in a ley d e B eer. C o m o el p aso d e luz, /, es 1, la

ecu ac ió n se co n v ie rte en
A26O —E260C
R e o rd e n a n d o la ec u a c ió n , la co n c e n tra c ió n d el ác id o n u c le ic o , c, q u e d a
co m o
c _ -¿260
E26o
P ro b le m a 5.2 Una solución de ADN tiene un valor de A 260 de 0,5. ¿Cuál es la

concentración de ADN en pg de ADN/mL?
S o lu c ió n 5.2
La respuesta se puede obtener utilizando la ecuación para la ley de Beer.
_ ^260
E260
c=^ = 0,025 mg de ADN/mL
1.000 u,q
0,025 mg de ADN/m L x — — — = 25 (ig de ADN/mL
Por lo tanto, la muestra tiene una concentración de 25 jxg de ADN/mL.

P ro b le m a 5.3 Una solución de ADN tiene un valor de A26o de 1,0. ¿Cuál es la

concentración de ADN en p,g de ADN/mL?
S o lu c ió n 5.3
La respuesta se puede obtener utilizando la ecuación para la ley de Beer.
c _ ¿260
¿2 6 0
1,0
c — — = 0,05 mg de ADN/mL
0,05 mg de ADN/mL x 1 000 ^9 _ 5q ¿g /\DN/m[_
Por lo tanto, la solución tiene una concentración de 50 |jg de ADN/mL. Observe

que este valor es el descrito anteriormente.
1 /l26o unidad de ADNcd = 50 ^g de ADN/mL
5.2.2 C a lcu la r la co n ce n tra ció n d e ADN co m o u n a ca n tid a d

m ilim o la r (m/W)
E l co e ficien te d e ex tin ció n (E 260) p a ra u n a so lu ció n de A D N cd 1 vaM es 6,7. E ste
v a lo r se p u ed e u tiliz a r para ca lcu lar la m o larid ad d e u n a so lu ció n d e A D N .
P ro b le m a 5 .4 Una solución de ADN tiene una absorbancia a 260 nm de

0,212. ¿Cuál es la concentración de la solución de ADN expresado como
milimolaridad?
S o lu c ió n 5.4
Este problema se puede resolver mediante el establecimiento de una relación de
proporciones como la que se lee «1 mM es a 6,7 DO como x m/W es a 0,212 DO».
1 m/W x m/W
6,7 DO _ 0,212 DO
(1 m/W) (0,212 DO)
--------/v _ _ ------ - = x m/W
6,7 DO
0,03 m/W - x
Por lo tanto, una solución de ADN con una ^26o de 0,212 tiene una concentración
de 0,03 m/W.
P ro b le m a 5.5 Una solución de ADN tiene una absorbancia a 260 nm de 1,00.

¿Cuál es su concentración expresada en milimolaridad?
S o lu c ió n 5.5
Este problema puede resolverse utilizando relaciones, una de ellas la que rela
ciona una solución de ADNcd 1 mM al coeficiente de extinción 6,7.
x m/W 1 mM
1,00 DO “ 6,7 DO
(1 m/W) (1,00 DO)
x m/W = ------ ' ----- - = 0,15 m/W
6,7 DO
Por lo tanto, una solución de ADNcd con una A2eo de 1,00 tiene una
concentración de 0,15 m/W. Esta relación,
1,0 ¿ 26o de ADNcd = 0,15 m/W
se utiliza con frecuencia en el laboratorio.
P ro b le m a 5.6 Una solución de ADN tiene una concentración de 0,03 m/W.

¿Cuál es la concentración expresada como pmol/(xL?
S o lu c ió n 5.6
Una solución 0,03 m/W por definición tiene una concentración de 0,03 milimol
por litro. Mediante la utilización de una serie de factores de conversión se
cambian las unidades y se transforma la concentración expresada como mili
molaridad a una expresada en pmol/p,L:
0,03 mmol 1L 1 x 109 pmol

------- :--------x ---------- — x -------------- ¡----- = 30 pm ol/iiL
L 1 x 106 p,L mmol
Por lo tanto, una solución de ADN a 0,03 m/W tiene una concentración
de 30 pmol ADN/jiL.
5.2.3 D e te rm in a ció n d e la co n ce n tra ció n d e ADN

u tiliz a n d o PicoG reen®
D e te rm in ar la co n c en tra ció n d e A D N m ed ian te la m ed ició n d e la ab sorbancia
d e u n a m u estra a 26 0 nm , au n q u e es u n a p rá ctica h ab itu al y, d u ra n te m u ch o s años,
el están d a r o ro de lo s m éto d o s p a ra la cua n tific ac ió n d e A D N , p u ed e su frir errores
d erivados d e la co n trib u c ió n a l v a lo r de a b so rb an cia q u e lo s co n ta m in a n te s, tales
co m o sal, pro teín a s, n ucleótidos (n t) y A R N , aportan. A d e m á s, u n a solución
d e A D N q u e tien e u n a co n c en tra ció n in ferio r a 2 îg/m L n o se p u ed e c u a n tific ar de

fo rm a fiable m ed ian te la m ed ició n d e su abso rb an cia a 2 6 0 nm . M ás reciente
m ente, sin em bargo, se h an utiliz ad o pro d u c to s d e tin ció n fluorescentes co m o u n a
h erram ien ta p ara la cua n tific ac ió n d e ác id o s nucleicos; el m ejo r e je m p lo d e este
tip o es PicoG reen® d e L ife T echnologies. P ic o G re en o frece la v en ta ja d e q u e es
específico p a ra el A D N cd , sólo em ite flu o re scen c ia cu an d o se u n e a A D N cd y
pu ed e d ete ctar el A D N cd en co n c en tra cio n es d e tan sólo 25 pg/m L .
L a cuan tific ac ió n d e A D N cd utilizan d o P ic o G re en re q u ie re re alizar u n a recta
e stán d a r d e co n c en tra cio n es c o n o c id as v a lo ra d a co n los m ism os reactiv o s u tili
z a d o s en la m u estra a valorar. E l A D N u tiliz ad o p a ra la re cta e stán d a r suele
p re p ara rse a p a rtir d el b ac terió fa g o X o d e tim o d e tern e ra y se d ilu y e (en T E )
en u n ra n g o d e co n c en tra cio n es d e 1 n g /m L a 1.000 ng/m L . L as d ilu cio n es de
A D N se m ezclan c o n el re activ o P icoG reen, se d e ja in cu b a r d u ra n te varios
m inutos a tem p eratu ra am biente, y desp u é s se v alo ra en u n espectrofluorím etro
q u e e x c ita la m u estra a u n a lo n g itu d d e o n d a d e 48 0 n m y ca p ta la in ten sid ad de
em isió n a 52 0 nm . E n u n a re cta están d a r se re p rese n ta la flu o re scen c ia d e las
m uestras (en el eje d e ord e n ad as _y) fren te a la co n c en tra ció n d e A D N (eje de
abscisas x). L a re cta se re p rese n ta p o r u n a ecu ac ió n q u e p u ed e utiliz arse para
ca lcu lar la co n c en tra ció n d e A D N d e u n a m u estra d esc o n o cid a a p a rtir d e su
fluorescencia, co m o se ap recia en el sig u ien te problem a.
P ro b le m a 5.7 Se valora el contenido de ADN con PicoGreen de una dilución

seriada de ADN de timo de ternera. Se obtienen los siguientes resultados. (Estos
valores representan las concentraciones de ADN en el tubo de ensayo.)
C o n c e n tra c ió n d e ADN F lu o re s ce n cia

(ng/m L)
1 5.572
2,5 6.945
5 9.245
10 13.820
25 27.585
50 50.520
100 99.710
250 234.952
500 450.210
750 700.025
1.000 920.110
Una muestra de ADN humano valorada con PicoGreen genera una fluorescencia
de 28.795 unidades. ¿Cuál es su concentración?
S o lu c ió n 5.7
Crearemos una recta estándar utilizando Microsoft Excel, determinaremos la
ecuación que mejor se ajuste (la recta de regresión) y luego usaremos esa
ecuación para calcular la concentración de ADN humano de la muestra desco
nocida. Las instrucciones para utilizar la herramienta de Excel para gráficos se
pueden encontrar en el Apéndice A.
En la hoja de cálculo Excel, escriba en el cuadro de la columna A, fila 1 «ng/mL
(x)» y en el cuadro de la columna B, fila 1 «Fluorescencia (y)». Llene los datos de
ambas columnas. La hoja de cálculo debe ser similar a la Figura 5-3.
Representaremos los datos anteriores con el tipo de gráfico «XY (Dispersión)».
Cuando se agrega una línea de tendencia de acuerdo con las instrucciones
del Apéndice A, la tabla aparecerá en la hoja de cálculo como se muestra en
la Figura 5-4.
I A I B | C | D
S ta n d a rd C urve
n g /m L (x ) F luo resc en c e fy)

i! 5,572
2.5 6,945
i 9 ,2 4 5
10 1 3 ,8 2 0
25 2 7 ,5 8 5
50 5 0 ,5 2 0
■ FIGURA 5 -3 Los valores de fluorescencia
100 9 9 ,7 1 0
250 2 3 4 ,9 5 2 de cada muestra diluida de ADN de tim o de
500 4 5 0 ,2 1 0 ternera utilizada para el ensayo de recta
750 7 0 0 ,0 2 5 estándar del Problema 5.7, ta l com o se ve en
1000 9 2 0 ,1 1 0
una hoja de cálculo de Excel.
R e c ta e s tá n d a r y = 9 1 6 ,1 x + 4 .6 5 2 ,3
■ FIGURA 5 -4 La regresión lineal y la

ecuación de los datos del Problema 5.7, tal
n g /m L com o lo calcula Microsoft Excel.
Por lo tanto, la ecuación de regresión para esta recta es y = 916,1x + 4.652,3.

Ahora calcularemos la concentración de la muestra desconocida con esta
ecuación. La muestra desconocida generó un valor de fluorescencia de
28.795. Este valor es y en la ecuación. A continuación, despejaremos x para
obtener la concentración de ADN en ng/mL:
y = 916,1x + 4.652,3
28.795 = 916,1x + 4.652,3
916,1x = 28.795 - 4.652,3
916,1x - 24.142,7
24.142,7
x - = 26,35
916,1
Por lo tanto, la concentración de la muestra desconocida en el tubo de ensayo es

de 26,35 ng/mL.
N ota: Si el valor de fluorescencia de una muestra desconocida se halla fuera del

rango que abarca la recta estándar y fuera del rango lineal de detección, la
muestra hay que diluirla si está demasiado concentrada o concentrarla si está
demasiado diluida para poder obtener una medida fiable.
5.3 D E T E R M IN A C IÓ N D E L A C O N C E N T R A C IÓ N
D E M O L É C U L A S D E A D N D E C A D E N A S E N C IL L A
5.3.1 La co n ce n tra ció n d e ADN de c a d e n a se n c illa
e x p re sa d a en |ig/m L
P ara d ete rm in a r la co n c en tra ció n d e A D N d e ca d en a sen c illa (A D N cs) co m o u n a
cantidad en îg/m L, h a y q u e u tiliz ar el s ig u ie n te fa cto r d e conversión:
1 D O d e A D N cs - 33 [xg/m L
P ro b le m a 5.8 10 ^L de un ADNcs aislado de M13mp18, un derivado del

bacteriófago M I 3 que se utiliza en los protocolos de clonación y secuenciación
de ADN, se diluye en un volumen final de 1.000 jaL de agua destilada. La
absorbancia de esta muestra diluida se cuantifica a 260 nm y se obtiene un valor
de A26o de 0,325. ¿Cuál es su concentración en jig/mL?
5.3 Determinación de la concentración de moléculas de ADN de cadena sencilla 109
S o lu c ió n 5.8
Este p ro b le m a se p u e d e re so lv e r p la n te a n d o u n a relación, d o n d e la variable
x re p re s e n te la c o n c e n tra c ió n e n (xg/mL d e la m u e s tra diluida. La ec u a c ió n se
p u e d e p la n te a r c o m o «x (xg/mL e s a 0,125 DO co m o 33 (xg/mL es a 1 DO».
Una v e z d e s p e ja d a x, la c o n c e n tra c ió n d el s to ck d e ADN s e p u e d e calcular
m u ltip lican d o la c o n c e n tra c ió n d e la m u e s tra dilu id a p o r el fa c to r d e
dilución.
x jxg/m L 33 (xg/mL
0,125 DO _ 1 DO
x jxg/m L = 0,125 x 33 jxg/mL
= 4,125 |xg/m L
Por lo ta n to , la c o n c en tra ció n d e la m u estra diluida e s d e 4,125 p,g/mL. Para

calcular la c o n c en tra ció n d e la solución stock d e ADN d e M 13m p18, hay q u e
m ultiplicar e s te valor p o r el fa cto r d e dilución:
I.OOOuL 4.125 ixg/mL

4,125 ixg/m L x -------- = -------------- ^ -----
I O jxL 10
- 412,5 jxg/mL
Por lo ta n to , el sto ck d e ADN d e M 13m p18 tie n e u n a c o n c e n tra c ió n d e

412,5 (xg/mL.
5.3.2 D e te rm in a c ió n d e la c o n c e n tra c ió n d e ADN

d e ca d e n a se n c illa d e e le v a d o p eso m o le c u la r
en pm ol/|xL
L a co n c en tra ció n d e A D N cs d e elevado p eso m o lecu la r se p u ed e ex p resar co m o
u n a ca n tid a d en p m o l/p L , dete rm in a n d o en p rim e r lu g a r cuántos m icro g ram o s de
A D N cs so n eq u iv alen tes a u n pm ol. P a ra ello, se u tiliz a el p eso m o lecu la r m ed io
d e u n deso x in u cle ó tid o en u n a c a d e n a d e A D N . P a ra el A D N cs, se asu m e u n v a lo r
d e 33 0 daltons. E ste va lo r se u tiliz a co m o u n fa cto r d e con v e rsió n p a ra ca m b ia r la
co n c en tra ció n d e A D N cs ex p resad a en ^xg/mL a u n a co n c en tra ció n ex p resad a en
pmol/[xL.
La unidad dalton equivale a la duodécim a parte de la masa del átom o de

carbono-12. Se usa in distintam ente com o «peso molecular», una cantidad expre
sada en gram os/m ol. Es decir, hay 330 g d e nt por m ol d e nt.
P ro b le m a 5.9 Un stock d e ADN d e M 13m p18 tie n e u n a c o n c en tra ció n d e

412,5 ng/m L. ¿Cuál es su c o n c en tra ció n ex p resad a en pmol/(iL?
S o lu c ió n 5.9
El v ec to r d e clonación MI 3 m p 1 8 tie n e un ta m a ñ o d e 7.250 n t d e longitud. Para
expresarlo co m o (xg/pmol, se p lan tea la sig u ie n te relación, en la q u e se utilizan
u n a serie d e fa cto re s d e conversión para c a m b ia r las unidades:
1 x 106 ng m ol __ .
<------------— x --------- ^ --------- = 2,39 p g /p rn o l
g 1 x 1012 pm ol
Así, 2,39 ng d e u n a m olécula ADNcs d e 7.250 n t d e longitud equivale a 1 pm ol.

Ahora e s te valor se p u e d e utilizar para co n v ertir los (xg/mL a pmol/(xL:
412,5 ug 1 pm ol 1 mL
----- x — ----------------------x ------------- = 0,17 pm ol/ixL
mL 2,39 (ig 1.000p,L K /r
De esta form a, el stock d e ADN d e M 13m p18 tie n e una c o n c en tra ció n d e
0,17 pmol/(iL.
5.3.3 C o n ce n tra ció n d e ADN d e c a d e n a se n c illa

e x p re sa d a co m o m ilim o la r (m/W)
E l coeficiente d e ex tin ció n (E26o) p a ra u n a so lu ció n d e A D N cs 1 m t í es 8,5. E ste
v a lo r se p u ed e u tiliz ar p a ra c a lcu lar la co n c en tra ció n m ilim o lar d e c u a lq u ie r
so lu ció n d e A D N cs a p a rtir d e su absorbancia.
P ro b le m a 5 .1 0 Una m u estra d e 1 mL d e ADNcs tie n e u n a abso rb an cia d e

0,285. ¿Cuál es su c o n c en tra ció n mM?
S o lu c ió n 5.10
La m ilim olaridad se p u e d e calcular p o r m ed io d e la s ig u ie n te relación.
x m/W 1 m/W
0,285 DO _ 8,5 DO
(1 m/W) (0,285 DO)
x m M = - -------- = 0,03 m/W
8,5 DO
Por lo ta n to , una solución d e ADNcs co n u n a a b so rb an cia d e 0,285 tie n e una

c o n c en tra ció n d e 0,03 m/W.
5.4 Cuantificación de oiigonucleótidos 111
5.4 C U A N T IF IC A C IÓ N D E O L IG O N U C L E Ó T ID O S
5.4.1 U n id a d e s de d e n sid a d ó p tica
M u c h o s laboratorios ex p resan u n a cantidad d e olig o n u cleó tid o en térm inos
d e u n id ad es d e d en sid a d óp tica (D O ). U n a u n id ad d e D O es la cantidad de
o lig o n u cleó tid o d isu elto s en 1,0 m L q u e su p o n e u n a A 2so d e 1,00 en u n a cu b eta
co n u n a n c h o d e p aso d e lu z d e 1 cm . S e ca lcu la p o r m edio d e la ecu ac ió n
u n id ad e s d e D O = (A26o) x (v o lu m en d e olig o n u cleó tid o )

x (facto r d e d ilución)
P ro b le m a 5.11 Tras su síntesis, un olig o n u cleó tid o se disuelve en 1,5 mL d e

a g u a d estilad a. U sted diluye 50 jxL del olig o n u cleó tid o en un v olum en final to tal
d e 1.000 jiL y lee la abso rb an cia d e la m u estra diluida a 260 nm . El re su lta d o a
¿ 2 6 0 e s d e 0,264. ¿C uántas u n id ad e s d e DO hay e n 1,5 mL del stock d e
oligonucleótido?
S o lu c ió n 5.11
U tilizando la fórm ula q u e a c ab a m o s d e ver, el n ú m ero d e u n id a d e s d e DO es
, , 1.000 liL
u n id ad e s d e DO = 0,264 x 1 ,5 mL x ----------—
50 |_lL
396
= ----- = 7,92 u n id a d e s d e DO
50
Por lo ta n to , los 1,5 mL d e solución c o n tie n e n 7,92 u n id ad e s d e DO del

oligonucleótido.
1
| 5.4.2 E x p re sa n d o la co n ce n tra ció n d e un o lig o n u cle ó tid o
| en |ig/m L
n U n a lec tu ra A 26q p u ed e se r c o n v e rtid a a u n a co n c en tra ció n e x p resad a en p,g/mL
" u tiliz an d o el coe ficien te d e ex tin ció n p a ra el A D N cs d e 1 m L /33 p,g para u n paso
§• d e lu z de 1 cm . E n otras palabras, u n a so lu ció n de A D N cs co n u n v a lo r d e A260 de
i 1,0 (1 ,0 u n id ad D O ) co n tien e 33 |xg d e A D N cs p o r m ililitro. E scrita c o m o una
c¿ ec u ac ió n , esta re la ció n es
i 1 u n id ad e s d e D O = 33 |xg d e A D N c s /m L
P ro b le m a 5 .1 2 En el P ro b lem a 5.11, un o lig o n u c le ó tid o diluido te n ía una

lectura a A26o d e 0,264. ¿Cuál es la c o n c e n tra c ió n d el o lig o n u c le ó tid o e n |xg
d e ADN/mL?
S o lu c ió n 5.12
Este p ro b lem a se p u e d e resolver utilizando la sig u ie n te relación.
x p,g d e ADN cs/m L 33 (xg d e ADN cs/m L

0,264 DO _ 1 DO
. (0,264 DO)(33 ixg d e ADNcs/m L)
x ixg d e ADNcs = — ----------- —----
^ 1 DO
x = 8,712 ^xg d e ADN cs/m L
Este valor re p re se n ta la c o n c en tra ció n del olig o n u cleó tid o e n la m u estra diluida
utilizada e n el esp e ctro fo tó m etro . La c o n c en tra ció n d e olig o n u cleó tid o e n la
solución stock se o b tie n e m ultiplicando e s te valor p o r el fa cto r d e dilución
(el inverso d e la dilución):
8,712 (ig d e ADN cs/m L x 1 = 174,24 |xg d e ADN cs/m L
Por lo ta n to , la c o n c en tra ció n d e o ligonucleótido d e la solución stock es

174,24 (xg d e ADNcs/mL.
5.4.3 La co n ce n tra ció n d e un o lig o n u cle ó tid o e x p re sa d a

en pm ol/|iL
M u c h o s m étodos e n bio lo g ía m o lecu la r re q u ie re n utiliz ar en las reacciones canti
dades d e pico m o les (pm ol) d e olig o n u cleó tid o s. U n ejem plo d e esto es el ca so de
la secuenciación d el A D N fluorescente, d o n d e p a ra alg u n o s pro to co lo s se re q u ie
re n 3,2 pm o l de o lig o n u cleó tid o co m o ce b ad o r en la reacción de secuenciación. L a
co n c en tra ció n d e u n o lig o n u cleó tid o se p u e d e c a lcu lar d el v a lo r d e A 260 utiliz an d o
la fó rm u la
-¿260 x 100
(1 ,5 4 x « A ) + (0,75 x n C ) + (1,17 x nG ) + (0,92 x hT)
x fa cto r d e dilución
E n esta fórm ula, la co n c en tra ció n , C , se ca lcu la co m o pico m o les p o r m icrolitro

(pm ol/jxL). E l d e n o m in ad o r co n siste en la su m a d e lo s coeficientes d e extinción
p ara c a d a b a s e m u ltip licad o p o r el n ú m ero d e v eces q u e c a d a b a se ap a rec e en el
oligonucleótido.
5.4 Cuantificación de oiigonucleótidos 113
Los c o e fic ie n te s d e e x tin c ió n d e las b a s e s d e l ADN

Los coeficientes d e extinción d e las bases habitualm ente se expresan en litro por
mol o co m o la absorbancia d e una solución 1 M a la longitud d e on d a d o n d e la
b ase tien e su m áxim o d e absorbancia. De las d os form as el valor absoluto es el
m ism o. El coeficiente d e extinción del dATP, por ejem plo, es 15.400 L/mol, o una
solución 1 M (a pH 7) d e dATP ten d rá una absorbancia d e 15.400 a una longitud
d e on d a d o n d e tien e su m áxim o d e absorbancia. La cantidad d e 15.400 L7mol es
equivalente a 0,0154 jxL/pmol, tal co m o se p u ed e ver en la siguiente conversión:
15.400 L 1x106pl 1M _ 0,0154 jaL

m ol 1L 1 x 1 0 12pm ol pmol
La fórmula anterior para calcular la concentración d e oligonudeótido utiliza el valor

1,54 com o coeficiente d e extinción del dATP. Este valor se obtiene multiplicando la
expresión por 100/100 (que es lo m ism o q u e multiplicar por 1). Esta operación deja
un «100» en el num erador y hace q u e la ecuación sea m ás manejable.
P ro b le m a 5.13 Un oligonudeótido con la secuencia

GAACTACGTTCGATCAAT se disuelve en 750 p,L de agua. Una alícuota de 20 (xL
se diluye en un volumen total final de 1.000 (xL con agua, y se mide la
absorbancia a 260 nm de la muestra diluida. El resultado es una DO de 0,242.
¿Cuál es la concentración de la solución stock del oligonudeótido en pmol/jxL?
S o lu c ió n 5.13
El oligonudeótido contiene seis residuos A, cuatro residuos C, tres residuos G y
cinco residuos T. Sustituyendo estos valores en la ecuación descrita antes se
obtiene el siguiente resultado:
£ _ _________________________ ¿260 x 100_________________________

_ (1,54 x nA) + (0,75 x nC) + (1,17 x nG) + (0,92 x nT)
x factor de dilución
0,242 x 100 1.000 (xL

pmol/ixL -
(1,54 x 6) + (0,75 x 4) + (1,17 x 3) + (0,92 x 5) X 20 jxL
24,2 1.000
pmol/ixL -
9,24 + 3,00 + 3,51 + 4,60 20
24,2 1.000 24.200
pmol/ixL -
Por lo tanto, la solución stock del oligonudeótido tiene una concentración de

59,46 pmol/(xL.
P ro b le m a 5 .1 4 Un stock de un oligonucleótido tiene una concentración de

60 pmol/(iL. Usted necesita, en una reacción de secuenciación de ADN, 3,2 pmol
del oligonucleótido como cebador. ¿Cuántos microlitros del stock de
oligonucleótido necesitará para tener 3,2 pmol?
S o lu c ió n 5.14
La respuesta se puede obtener de la siguiente forma:
60 pmol ,
----------¡-------- x x (xL = 3,2 pmol
Planteando la ecuación de este modo se pueden anular las unidades que

provienen del número de picomoles. Resolviendo para x, obtenemos
= 0,05 (xL
60 pmol/(xL
Por lo tanto, para añadir 3,2 pmol de oligonucleótido cebador a la reacción, se

necesitará tomar una alícuota de 0,05 jxL del stock de oligonucleótido a
60 pmol/(xL. Sin embargo, coger un volumen tan pequeño, utilizando las micro-
pipetas habituales en un laboratorio, no es ni práctico ni preciso. Es mejor diluir
la muestra hasta una concentración tal que la cantidad que se quiera coger de
ADN esté contenida en un volumen que pueda ser medido con precisión por
nuestras pipetas. Por ejemplo, queremos tomar 3,2 pmol de un oligonucleótido
en un volumen de 2 pL. Primero nos hemos de preguntar, «si yo cojo un
volumen determinado y adecuado de la solución stock del oligonucleótido,
digamos 5 jiL, ¿en qué volumen de agua (o tampón de dilución TE) necesito
diluir estos 5 p,L para obtener una concentración tal que 2 pL contengan
3,2 pmol del oligonucleótido?» Este problema se puede plantear de la siguiente
forma:
60 pmol 5 p,L 3,2 pmol

[xL x |_lL 2 p,L
300 pmol _ 3,2 pmol
x |xL 2 p,L
3,2x pmol
300 pmol
2
600 pmol = 3,2x pmol
600 pmol
3,2 pmol
187,5
5.6 Peso molecular, molaridad y tamaño del ácido nucleico 115
Por lo tanto, si tomamos 5 ^xL de una solución stock de oligonucleótido a

60 pmol/|xL y los diluimos hasta un volumen final de 187,5 p,L, tendremos que
2 p,L de la muestra diluida contendrán 3,2 pmol del oligonucleótido.
5.5 C A L C U L O D E L A C O N C E N T R A C IO N D E AR N
P ara c u a n tific ar el A R N se u tiliz a la sig u ien te relación:
1 u n id ad A 260 d e A R N = 4 0 jxg/m L
P ro b le m a 5.1 5 Cuarenta microlitros de una solución stock de ARN se diluyen

en agua hasta obtener un volumen final de 1.000 p,L. La muestra diluida tiene
una absorbancia a 260 nm de 0,142. ¿Cuál es la concentración de la solución
stock de ARN en jxg/mL?
S o lu c ió n 5.15
La relación se puede expresar como «x (xg de ARN/mL es a 0,142 DO como 40 p,g
de ARN/mL es a 1,0 DO».
x^ g de ARN/mL 40 p,g de ARN/mL

0,142 DO _ 1 DO
x „ de ARN/mL = DO)(40 . 9 de ARN/mL)
— 5,7 jxg de ARN/mL
Este valor representa la concentración de la muestra diluida. Para obtener la

concentración de ARN de la solución stock, hemos de multiplicar por el factor de
dilución:
1.000 lxL
5 ,7 jig de ARN/mL x —— —— = 1 4 2 ,5 (xg de ARN/mL
Por lo tanto, la concentración de ARN en la solución stock es de 142,5 |xg de ARN/mL.
5.6 P E S O M O L E C U L A R , M O L A R ID A D Y T A M A Ñ O
D E L Á C ID O N U C L E IC O
E l p eso m o lecu la r (P M ) pro m ed io d e u n a b a s e d e l A D N es ap ro x im a d am en te de
33 0 d a lto n s (o 33 0 gra m o s/m o l [g !mol\). E l p eso m o lecu la r pro m ed io d e u n p a r
d e b ase s del A D N es ap ro x im a d am en te d e 6 6 0 dalto n s (o 66 0 g /mol). Estos

v alo re s se p u ed e n u tiliz ar p a ra ca lcu lar cuánto A D N h a y p re sen te en cu a lq u ie r
m u estra d e o rig en b iológico.
P ara peq u e ñ as m oléculas d e A D N cs, c o m o u n olig o n u cleó tid o sintético, se
pu ed e su m ar el P M d e ca d a n u cle ó tid o , d e ac u erd o co n la sig u ien te fórm ula, para
ca lcu lar el P M to tal d e la cadena:
P M = (« a x 3 3 5 ,2 ) + («c x 3 1 1 ,2 ) + («G x 3 5 1 ,2 ) + (« T x 3 2 6 ,2 ) + P
d o n d e rix es el nú m ero d e n t d e A , C , G o T en el olig o n u cleó tid o y P es igual a

—101,0 p ara o lig o n u cleó tid o s d esfosforilados (carecen d el gru p o fosfato final) o
4 0 ,0 p a ra los olig o n u cleó tid o s fosforilados.
L o s sig u ie n tes p ro b lem a s p o n en d e relieve q u é relación h a y entre el P M , la
m o laridad y la lo n g itu d d e u n ác id o nu cle ic o co n la cantidad d e A D N .
P ro b le m a 5 .1 6 ¿Cuánto ADN genómico hay en el interior de una sola célula

humana diploide nucleada? Exprese la respuesta en picogramos.
S o lu c ió n 5.16
El primer paso para resolver este problema es calcular el peso, en gramos,
de un par de bases (pb). Este valor deberá ser multiplicado por el número
de pb de una sola célula diploide. El primer cálculo utiliza el número de
Avogadro:
^ x ------ 1 m ° ' — 1t1 X 1CT21 g/pb

mol 6,023 x 1023 pb M/K
Por lo tanto, un pb pesa 1,1 x 10 g.
En una célula humana diploide nucleada hay aproximadamente 6 x 109 pb.

Este valor se puede convertir a una cantidad en picogramos utilizando el factor
de conversión de 1 x 1012 picogramos/gramo, como se ve en la siguiente
ecuación:
q , 1,1 x 10-21 g 1 x 1012 pg

6 x 109 pb x — ----------- ¡------------- x --------------------- — = 7 pg
Pb g
Por lo tanto, una sola célula humana diploide contiene 7 pg de ADN genó
mico.
P ro b le m a 5 .1 7 Usted tiene 5 mL de un stock de bacteriófago \ con una

concentración de 2,5 x 1011 fagos/mL. Usted purifica el ADN de X a partir de
todo el stock. Asumiendo que hay una recuperación del 80%, ¿cuántos
microgramos de ADN de X obtendrá?
S o lu c ió n 5.17
Primero, calcule el número total de partículas de fago multiplicando la
concentración del stock por su volumen:
2,5 x 1011 fagos , ,

--------------- — x 5 mL = 1,25 x 1012 fagos
mL
En el problema anterior, hemos averiguado que el peso de un pb es

1,1 x 10221 g. El ADN del bacteriófago X tiene una longitud de 48.502 pb.
Con estos valores, podemos calcular el contenido de ADN en un stock de
5 mL de fago X:
r 48. 502 pb 1,1 10“- g 1x10 jig

1,25 x 1012 fagos x — ; ----- — x —
fagos pb
= 66,7 jig de ADN
Así, se puede obtener un total de 66,7 pg de ADN a partir de 12,5 x 10 fagos.

Asumiendo un 80% de recuperación, hemos de multiplicar ese valor por 0,8:
66,7 ng de ADN x 0,8 = 53,4 pg de ADN
Por lo tanto, asumiendo el 80% de recuperación, obtendremos 53,4 jig de ADN a

partir de los 5 mL del stock de fagos.
P ro b le m a 5 .1 8 Se obtiene el ADN de X de los 5 mL del stock de fagos

descrito en el Problema 5.16. Supongamos que purificamos 48,5 (xg de ADN.
¿Cuál es el porcentaje de recuperación?
S o lu c ió n 5.18
% de recuperación = (cantidad obtenida/cantidad esperada) >
48,5 (ig
1 00 = 72,7% recuperación
66,7 p,g
P ro b le m a 5 .1 9 El ADN de X tiene una longitud de 48.502 pb. ¿Cuál es su PM?
S o lu c ió n 5.19
Como el genoma de X es ADNcd, hay que utilizar el factor de conversión de
660 daltons/pb.
660 daltons 7
48.502 pb x -------¡------ = 3,2 x 107 daltons
pb
P ro b le m a 5 .2 0 Un vector plasmídico de clonación tiene una longitud de

3.250 pb.
a) ¿Cuántos picomoles de vector hay en un 1 pg de ADN purificado?
b) ¿Cuántas moléculas de vector habrá en 1 jxg ?
El primer paso es calcular el PM del vector:
660 g/mol
PM = 3.250 pb x ---- ^ ---- = 2,1 x 106 g/mol
Este valor se puede utilizar para calcular cuántos picomoles de vector hay en
1 (jg de ADN.
1 mol 1 x 1012 pmol 1g 1 x 1012 pmol

1 Lig de vector x --------- *— x ----------- ¡-----x -------- *---- = ------------ —
2,1 x 10 g 1 mol 1 x 106 |ig 2,1 x 1012
= 0,48 pmol
Por lo tanto, 1 jig de un vector de 3.250 pb es equivalente a 0,48 pmol.
Para calcular el número de moléculas de vector en 1 ^g, necesitamos utilizar el
factor de conversión que calculamos en el Problema 5.15, que relaciona los pb
con los gramos. El problema se plantea de la siguiente forma:
1 molécula 1 pb 1g 1 molécula
M'9 X 3.250 pb X 1,1 x 10-21 g X 1 x 106 ng _ 3,6 x 10-12
= 2,8 x 10 11 moléculas
Por lo tanto, en 1 (ig del vector plasmídico de 3.250 pb, hay 2,8 x 1011
moléculas.
Para calcular cantidades del orden picomolar o el número de moléculas de

ADNcs, se hace una aproximación similar a la realizada en el problema anterior.
Sin embargo, se debe utilizar el factor de conversión 330 g/mol para el ADNcs en
lugar del de 660 g/mol que era del ADNcd.
P ro b le m a 5.21 El vector de ADNcs M13mp18 tiene un tamaño de 7.250

bases. ¿Cuántos microgramos de ADN hay en 1 pmol del vector?
S o lu c ió n 5.21
Primero, calcule el peso molecular del vector:
330 g/mol
7.250 bases x — -----= 2,4 x 106 g/mol
Este valor puede ser utilizado como factor de conversión para pasar de pico-
moles a microgramos:
. 2,4 x 106 g 1 x 106 Lig 1 mol 2,4 x 1012 ug

1 p m o l X ---------------- :-------- X ------------------------- X ----------------yy-------------¡ = ---------------------T j —
K mol g 1 x 1012 pmol 1 x 1012
= 2,4 (xg
Por lo tanto, 1 pmol de M13mp18 es equivalente a 2,4 |ig de ADN.
P ro b le m a 5.22 ¿Cuál es el peso molecular de un oligonucleótido

desfosforilado que tiene la secuencia S'-GGACTTAGCCTTAGTATTGCCG-S'?
S o lu c ió n 5.22
El oligonucleótido tiene cuatro A, cinco C, seis G y siete T. Estos valores se
sustituyen en la fórmula para calcular el PM del oligonucleótido. Como el
oligonucleótido está desfosforilado, en la ecuación P es igual a —101,0.
PM = (nA x 335,2) + (nc x 311,2) + (nG x 351,2) + (nT x 326,2) + P

PM = (4 x 335,2) + (5 x 311,2) + (6 x 351,2) + (7 x 326,2) + (-1 0 1 ,0 )
PM = (1.340,8) + (1.556) + (2.107,2) + (2.283,4) - 101,0
PM = 7.186,4 daltons
Por lo tanto, el oligonucleótido tiene un PM de 7.186,4 daltons.

120 CAPITULO 5 Cuantificación de ácidos nucleicos
5.7 C Á L C U L O D E L A C O N C E N T R A C IÓ N D E A D N
A P A R T IR D E UN G E L T E Ñ ID O C O N B R O M U R O
D E E T ID IO
L a electroforesis en geles d e ag a ro sa es u n m éto d o h ab itu al p ara sep a rar frag m en
to s d e A D N tras u n a dig estió n co n en z im a s d e restricción o u n a am p lifica ció n p o r
m edio d e P C R . L o s frag m en to s se d etectan p o r m edio d e la tin ció n d el g el c o n el
ag e n te in terc alan te b ro m u ro d e etidio y po sterio rm e n te la v isu alizac ió n /fo to g rafía
del gel ex p u e sto a la lu z UV. E l b ro m u ro d e etidio tiñ e el A D N pro porcionalm ente
a la co n c en tra ció n , d e tal fo rm a q u e cuanto m ás A D N h ay en u n a b a n d a del gel,
ésta se tiñ e m ás intensam ente. E s ta relación h ac e po sib le q u e se p u e d a ca lcu lar la
cantidad de A D N p re sen te en u n a b a n d a si la p o d em o s co m p a rar co n otra b a n d a de
A D N cu y a co n c en tra ció n es conocida. S i las in ten sid ad es d e las d os b an d a s son
sim ilares, las d os d eb e n c o n te n er can tid a d es p arecidas d e A D N . E l b ro m u ro de
etidio tiñ e el A D N cs y el A R N con m u y p o c a eficiencia. E stas form as d e ácido
n u cle ic o s no se p u ed e n c u a n tific ar d e fo rm a fiable p o r m ed io d e u n g el de
electroforesis.
P ro b le m a 5.23 Quinientos nanogramos (0,5 jxg) de ADN de X ADN digerido

con la enzima de restricción H/'ndlll se cargan en un gel de agarosa como patrón
de PM. Una banda de ADN resultante de un experimento de amplificación tiene
la misma intensidad tras la tinción con bromuro de etidio que un fragmento de
564 pb de la digestión de X con Hind\\\. ¿Cuál es la cantidad aproximada de ADN
del fragmento amplificado?
S o lu c ió n 5.23
Este problema se resuelve calculando qué cantidad de ADN hay en el fragmento
de 564 pb. Como el fragmento de ADN amplificado tiene la misma intensidad,
tras la tinción, que la banda de 564 pb, ambas bandas contienen una cantidad
de ADN equivalente.
El fago X tiene 48.502 pb de longitud. El fragmento de 564 pb Hind\\\ representa
la longitud total del genoma del fago como su cantidad (en ng) a la cantidad
total de patrón de fago X Hind\\\ cargado en el gel (500 ng). Esto permite
establecer la siguiente relación:
x ng 564 pb
500 ng 48.502 pb
(500 ng)(564 p b ) _ 5
x ng
48.502 pb ' 9
Por lo tanto, en el fragmento de ADN amplificado hay aproximadamente 5,8 ng

de ADN.
L o s ácidos n ucleicos tien en u n m áx im o de ab so rció n de lu z LTV ap roxim adam ente
a 2 6 0 nm . E l A D N d e ca d en a d o b le (A D N cd ) con u n a co n c en tra ció n de 50 p,g/mL
ten d rá u n a abso rb an cia a 26 0 nm (u n a A 260) d e 1,0. E sta relación se u tiliz a para
ca lcu lar la co n c en tra ció n d e A D N d e u n a m u estra d e la cual se d esc o n o ce el
contenido d e A D N . L as proteínas absorben la lu z UV, aproxim adam ente, a
2 8 0 nm . L a relación 2 6 0 n m /280 nm d e u n a m u estra d e A D N nos in d ica su pureza.
U n A D N cd co n u n a concentración d e 1 m g/m L tien e u n coeficiente d e extinción
(E) a 2 6 0 n m d e 20. E ste valor, ju n to c o n la abso rb an cia m ed id a a 26 0 n m de u n a
m u estra d e A D N , se p u ed e n u tiliz ar p a ra ca lcu lar la concentración d e A D N , usando
la relación
c _ -¿260
£260
U n a so lu ció n 1 vaM d e A D N cd tien e u n coe ficien te d e ex tin ció n a 2 6 0 n m de

6,7. E l A D N cd q u e tien e u n a a b so rb an cia a 26 0 n m d e 1,0 tien e u n a co ncentración
d e 0,15 m M. L a co n c en tra ció n d e A D N tam b ién se p u ed e ca lcu lar utiliz an d o u n a
re cta están d a r g en e rad a a p a rtir de la tin ció n d e cantidades co n o c id as d e u n A D N
c o n tro l c o n u n pro d u c to q u e tiñ e el A D N co m o el P icoG reen. L a lín ea d e regresión
q u e d esc rib e la re cta p atró n se p u ed e u tiliz ar p a ra ca lcu lar la co n c en tra ció n de
A D N d e u n a m u estra desconocida.
U n A D N d e ca d en a sencilla (A D N cs) q u e ten g a u n a concentración d e 33 [ig/m L
tendrá u n a absorbancia a 26 0 n m d e 1,0. E l prom edio d el p eso m olecular d e u n
nucleótido en el A D N cs es de 330 g/m ol. E l prom edio del peso m olecular d e u n pb
es 660 g/m ol. U n a solución 1 m M de A D N cs tien e u n coeficiente de extinción a
26 0 n m d e 8,5. U n a solución d e A D N cs con u n a A 260 d e 1,0 tiene una
concentración d e 33 p,g/mL.
L a co n c en tra ció n d e u n o lig o n u d e ó tid o se e x p resa n o rm alm en te en unidades
d e D O , q u e se ca lcu la utiliz an d o la ecuación
u n id ad e s d e D O — ( ^ 260) x (v o lu m en d e o lig o n u d e ó tid o )

x (facto r d e d ilución)
L a co n c en tra ció n de lo s o lig o n u cleó tid o s tam b ién se pu ed e ca lcu lar utiliz an d o
la su m a d e lo s coeficientes d e ex tin ció n d e c a d a un o d e sus nu cle ó tid o s, tal co m o
se p lan tea en la sig u ien te relación:
A 26O x 100
(1 ,5 4 x nA ) + (0,75 x wC) + (1 ,1 7 x n G ) + (0,92 x nT )
x fa cto r d e dilución
U n a m u estra d e A R N c o n u n a a b so rb an cia a 2 6 0 n m d e 1,0 tien e u n a

co n c en tra ció n d e 4 0 |o.g/mL.
E l p eso m o lecu la r d e u n A D N se p u ed e c a lcu lar p o r m ed io d e la su m a d e los

p eso s m oleculares d e las b a se s q u e lo fo rm an u tiliz an d o la sig u ien te ecuación
PM - (n A x 3 3 5 ,2 ) + («c x 3 1 1 ,2 ) + (nG x 3 5 1 ,2 ) + (« T x 3 2 6 ,2 ) + P
d o n d e n x es el nú m ero d e nu cle ó tid o s d e A , C , G o T en el olig o n u cleó tid o y P es

igual a —101,0 p ara u n olig o n u cleó tid o d esfosforilado (q u e carece d e u n g ru p o
fosfato) o 4 0,0 p ara los fosforilados. U n solo p b p e sa aproxim adam ente 1,1 x
í o - 21 g.
L a co n c en tra ció n de A D N de u n a b a n d a en u n g el te ñ id o co n b ro m u ro de etidio
se p u ed e c a lcu lar co m p a ran d o su in ten sid ad co n frag m en to s d e lo n g itu d y canti
d ad conocida.
Mareaje de ácidos nucleicos
con radioisótopos
L a sec u en cia ció n d el A D N , la cu a n tific ac ió n d e la ex p resió n d e genes, la
dete cció n d e gen e s o clo n e s re co m b in an tes p o r h ib rid ac ió n c o n u n a so nda, el
control d e la re plicación celular, la m ed ició n d e la ta s a d e sín te sis d el A D N ...
existen nu m ero so s m o tiv o s p o r lo s cuales lo s in v estig ad o re s tien en q u e m arc ar los
ácidos n ucleicos. L o s ra d io isó to p o s h an enc o n trad o am plio u s o co m o m arcadores
d e ác id o s nu cle ic o s, deb id o a varia s características únicas. E stán disp o n ib le s en el
m ercado, ev itan d o a los investigadores te n e r q u e re alizar u n a gra n ca n tid a d de
m o d ificaciones quím icas. S e p u e d e m arc ar u n solo n t y po sterio rm e n te in co rp o
ra rlo al A D N o al A R N a través d e la ac ció n enzim ática. L o s ácidos n ucleicos
m arcados c o n isó to p o s ra d ia ctiv o s p u ed e n se r d ete ctad o s p o r vario s m étodos,
inclu y en d o el re cu en to p o r centelleo líq u id o (q u e pro p o rcio n a in form ación sobre
l a ca n tid a d d e ác id o s nu cle ic o s) y la ex p o sició n a p elícu la s d e ra y o s X (que
p ro p o rcio n a inform ación so b re el tam año d e u n ác id o n ucleico o la u b ica ció n
d e u n clon). E s ta sec ció n trata so b re lo s cálculos in v o lu cra d o s e n el u s o de
ra d io isó to p o s en la investigación d e ác id o s nucleicos.
6.1 U N ID A D E S D E R A D I A C T IV ID A D : E L C U R IO (C i)
L a un id ad b á s ic a q u e ca racteriza a la desin teg ració n ra d ia ctiv a es el cu rio (C i).
E sta un id ad s e d efin e co m o la ca n tid a d d e m aterial radiactivo q u e tien e u n a tasa
d e desin teg ració n d e 3,7 x 1 0 10 desintegraciones p o r seg u n d o (2 ,2 2 x 1 0 12 d esin
tegracion es p o r m in u to [dpm ]). L a m ay o ría d e los instrum entos q u e se utilizan
p a ra d ete ctar la d esintegración ra d ia ctiv a no alcanzan u n a eficiencia del 100% .
E n consecuencia, el nú m ero d e cu rio s defin id o d e u n a d ete rm in a d a sustancia
ra d ia ctiv a d ará lu g a r a u n nú m ero m e n o r d e cu e n tas re sp ecto a lo teóricam ente
esperado.
L as desin teg racio n es ac tu alm en te d ete ctad as p o r u n instrum ento, co m o en un
co n ta d o r d e cen telleo líq u id o , se defin e n co m o cu en tas p o r m in u to (cpm ).
124 CAPÍTULO 6 Mareaje de ácidos nucleicos con radioisótopos
P ro b le m a 6.1 ¿Cuántas dpm están asociadas a 1 pCi de material

radiactivo?
S o lu c ió n 6.1
La respuesta se obtiene utilizando factores de conversión para el cambio de
unidades, tal como se puede ver en la siguiente ecuación:
1 Ci 2,22 x 1012 dpm 6 ,

1 uCi x ------- s---- x —------- ------ — = 2,22 x 106 dpm
r 1 x 10 |j£ i Ci
Por lo tanto, 1 |xCi es equivalente a 2,22 x 106 dpm.
P ro b le m a 6.2 Si un instrumento, utilizado como contador de material

radiactivo, tiene una eficiencia de un 25% en la detección de desintegraciones,
¿cuántas cpm se obtienen de 1 p,Ci?
S o lu c ió n 6.2
En el Problema 6.1, se estableció que 1 |xCi es equivalente a 2,22 x 106 dpm.
Para calcular las cpm para 1 p,Ci, el valor de dpm se debe multiplicar por 0,25
(eficiencia de detección del 25%):
2,22 x 106 dpm x 0,25 = 5,55 x 105 cpm
Así, un instrumento de recuento de desintegración radiactiva con un 25% de

eficiencia debería detectar 5,55 x 105 cpm para una muestra de 1 |xC¡.
6.2 C Á L C U L O D E L N Ú M E R O D E C O P IA S
D E UN P L Á S M ID O
D entro d e u n a c é lu la p u e d e h a b e r d e u n a a vario s cie n to s d e copias de u n plásm ido,
elem ento d e A D N c irc u lar u tiliz ad o p a ra la clo n a ció n d e g en e s recom binantes
y con cap ac id a d d e re plicación autónom a. E n u n a téc n ic a p ara dete rm in a r cuántas
co p ia s d e u n p lásm id o h a y en u n a s o la célula, se cu ltiv a u n a ce p a bac terian a
p o rtad o ra d e u n plásm id o en p re sen cia d e [3H ]-tim in a o [3H ]-tim id in a (d e p en
dien d o d e las n ecesidades d e la cepa). T ra s cre c e r h a s ta la fase d e crecim iento
ex p o n e n c ia l lo g a rítm ic a , la s b a c te ria s se re c o g e n , s e lisa n y s e a ís la el A D N
to tal. U n a m u e s tra d e l A D N se c e n trifu g a e n u n g ra d ie n te d e b ro m u ro de
6.2 Cálculo del número de copias de un plásmido 125
■ FIGURA 6-1 Fracciones recogidas a partir de un gradiente de brom uro de e tidio-doruro de cesio para la separación
de un plásm ido del ADN cromosómico. Las bacterias se crecen en presencia de tim in a o tim idina radiactiva de forma que
el ADN en replicación incorpore el isótopo de tritio . El ADN plasmídico superenrollado, centrado en la fracción 12,
sedimenta a alta densidad comparado con el ADN cromosómico fragm entado, centrado en la fracción 26.
etid io -clo ru ro d e c e sio p a r a s e p a ra r el A D N p lasm íd ic o d e l cro m o só m ico . T ras

l a c e n trifu g a c ió n , e l tu b o d e c e n trifu g a c ió n se p e rfo ra p o r su b a s e , se re co g en
la s fracc io n es en d isco s d e filtro s y el A D N d e lo s filtro s se p re c ip ita co n ácido
tricloroacético (T C A ) y etanol. L os filtros se sec an y se cuentan en un
espectróm etro d e centelleo. E n la F ig u ra 6-1 se p u ed e v e r u n gráfico donde se
representa el nú m ero d e fracción frente al núm ero d e cpm . E l pico m enor,
centrado en la fracción 12, representa el A D N plasm ídico, q u e e n la fo rm a
superenrollada es m ás denso q u e el A D N crom osóm ico fragm entado centrado
en la fracción n ú m ero 26.
E l n ú m ero d e copias se ca lcu la u tiliz an d o la sig u ien te ecuación:
, . , , ,, ., cp m d el p ico del plásm ido

n u m ero d e copias d el plásm id o = --------——:----- —------------------
cp m del p ico del cro m o so m a
P M del cro m o so m a
P M d el plásm ido
P ro b le m a 6.3 Tal como se ha descrito anteriormente se realiza un

experimento para determinar el número de copias de un plásmido de 6.000 pb
en E. coli. La fracción que contiene la mayoría del plásmido tiene un valor de
25.000 cpm. La fracción del pico que contiene el ADN cromosómico tiene
220.000 cpm. ¿Cuál es el número de copias del plásmido?
S o lu c ió n 6.3
El primer paso para resolver este problema es calcular el peso molecular del
plásmido y del cromosoma de E. coli. El plásmido tiene 6.000 pb. El cromosoma
de E. coli tiene un tamaño aproximado de 4,6 millones de pb. Sus pesos mole
culares se calculan utilizando el factor de conversión de 660 daltons/pb.
El peso molecular del plásmido es
660daltons , ,
6.000 pb x -------;------= 3.960.000 daltons
pb
El peso molecular del cromosoma de E. coli es
4.600.000 pb x 660 daltons _ ^ 1q9 c|a |tons

pb
Estos valores hay que sustituirlos en la ecuación (planteada en el párrafo ante

rior) para calcular el número de copias:
25.000 cpm 3,0 x 109 daltons 7,5 x 10 13 . , , „

x ----------------------z —— ---------- = ------------------- ^ = 86 copias del plásmido
220.000 cpm 3,96 x 106 daltons 8,7 x 1011
6.3 M A R C A J E D E L A D N P O R T R A S L A C IÓ N D E M E L L A S
L a tra s la c ió n d e m e lla s (en inglés nick translation) es u n a téc n ic a d e m areaje
rad ia ctiv o d e A D N cd , p a ra o b ten e r so n d as d e h ib rid ac ió n p a ra la dete cció n de
secu en cias gen ó m ica s específicas. S e u tiliz a la en d o n u c leasa A D N a sa I para
g en e rar m ellas en el A D N d e la sonda. T ras el trata m ie n to co n A D N a sa I, se
u tiliz a la A D N p o lim e rasa I p ara añ a d ir resid u o s d e n t en el ex tre m o s 3 '-h id ro x ilo
lib res q u e se g en e ran p o r la ac ció n d e m ella d e la A D N asa I. C o m o la A D N
p o lim e rasa I p ro lo n g a lo s extrem os 3', la actividad exo n u c leasa de la en z im a de 5'
a 3 ' elim in a la s b ase s del extrem o 5 '-fo sfo rilo de la m ella. L a adición secuencial de
b a se s al ex tre m o 3' y la elim inación sim u ltán e a d e b ase s d el ex tre m o 5 ' de la h eb ra
en sentido op u esto d an co m o re su lta d o la trasla ció n d e la m ella a lo larg o d e la
m o lécu la d e A D N . C u an d o se llev a a cabo esta reacción en p re sen cia d e u n
deso x in u cle ó sid o trifo sfa to rad ia ctiv o (com o el [ a - 32P ]dC T P ), se obtiene la n u ev a
ca d en a s in te tiz ad a m arcada.
C u an d o se m ide las cp m p o r cen telleo líq u id o , se d eb e m ed ir u n a m uestra
control q u e sólo co n tien e el líq u id o d e centello y u n filtro (si se h a u sad o u n filtro
p ara d ete ctar y co n ta r la reacción d e m areaje). E sta m u estra co n tro l se u tiliz a para
6.3 Mareaje del ADN por traslación de mellas 127
d ete ctar el fo n d o d e cp m in h ere n te al líq u id o d e centelleo, al filtro y al am biente.

L as cp m d ete ctad as d e este c o n tro l se d eben re sta r d e c u a lq u ie r m u estra ob ten id a
del ex p e rim en to d e m areaje.
6.3.1 C á lcu lo d el p o rce n ta je d e in co rp o ra ció n d e m arca

ra d ia ctiv a en una tra s la ció n de m ella
P ara d ete rm in a r el p o rc en taje d e m arc ad o r radiactivo inco rp o rad o al A D N p o r
trasla ció n d e m ella, se to m a u n a m u estra en alg ú n m om ento desp u é s d e la ad ició n
d e lo s d N T P radiactivos, p ero an te s d e la a d ic ió n d e la A D N p o lim e rasa I. E sta
m u estra re p rese n ta el to ta l d e cp m en la reacción. D esp u és d e la re acc ió n de
trasla ció n d e m ella, se o b tien e o tra m uestra. A m b as m u estra s s e co lo c an sobre
d isco s d e filtro. E l d isco q u e co n tien e la m u estra q u e re p rese n ta la reacción
desp u é s d e la trasla ció n d e m ella se tra ta con T C A p a ra p re cip ita r los fragm entos
d e A D N . E l trata m ie n to co n T C A p re cip ita lo s po lin u cleó tid o s en el disco d e filtro,
p ero p erm ite q u e lo s d N T P ra d ia ctiv o s no in co rp o rad o s p ase n a través. E l p o r
centaje d e in co rp o rac ió n se ca lc u la m ed ian te la ecuación
cp m de la m u estra p re cip ita d a c o n T C A .

------------------ -—— ----------------- —----------- x 100 = p o rc en taje de m corporacion
cpm añ a d id as a la reacción
P ro b le m a 6 .4 Se utiliza 1 ng de ADN del bacteriófago X ADN para una

reacción de traslación de mella. Se utilizan 25 [iCi de [a-32P]dCTP en una
reacción de 50 [xL. Tras el tratamiento con ADN polimerasa I, se saca 1 jxL de
muestra y se diluye en un volumen total de 100 (xL con tampón TE. Se depositan
5 nJ de esta dilución en un filtro de fibra de vidrio para calcular el total
de cpm en la reacción. Otros 5 p,L se precipitan con TCA para determinar la
cantidad de radioisótopo incorporado. La muestra precipitada con TCA se
deposita en un filtro de fibra de vidrio y se lava con TCA y etanol. Ambos filtros se
secan y se cuentan por centelleo líquido. El valor del disco que tiene el total de
cpm es 19.000 cpm. La muestra precipitada con TCA, 11.600 cpm. ¿Cuál es el
porcentaje de incorporación?
S o lu c ió n 6.4
El porcentaje de incorporación se calcula utilizando la fórmula descrita ante
riormente. El cálculo se realiza como sigue:
1,16 x 104 cpm

---------- 7------ x 100 = 61% de mcorporacion
1,9 x 10 cpm
6.3.2 C á lcu lo d e la ra d ia ctiv id a d e sp e cífica d e l p ro d u cto

de la reacció n d e tra s la ció n de m ella
L a rad iactivid ad específica (o activid ad esp ecífica) de u n p roducto m arcado es la
cantidad d e isótopo incorporado, m edido en cpm , p o r cantidad d e ácido nucleico.
L a incorporación del isótopo se pu ed e calcular p o r m edio del m étodo d e precipitación
con T C A descrito anteriorm ente. U tilizando la precipitación con T C A para m edir la
incorporación, la radiactividad específica se calcula utilizando la siguiente fórm ula:
. , cpm en el precipitado con TCA

cp m /p g de A D N = — ----------——------------------- —— -----------—— x factor de dilución
volum en de la m uestra precipitada con TCA
volum en total de la reacción
pg totales de ADN en la reacción
P ro b le m a 6.5 En el Problema 6.4, obtuvimos 1,16 x 104 cpm del precipitado

de TCA de una muestra de 5 pL, tomada de una dilución 1/100 de una reacción
de traslación de mella de 50 pL de 1 pg de ADN de X. ¿Cuál es la actividad
específica del producto marcado?
S o lu c ió n 6.5
La radiactividad incorporada viene representada por las cpm de material pre-
cipitable con TCA. La reacción se diluyó 1/100 para obtener una muestra (5 pL)
que se precipita con TCA. El factor de dilución es el inverso de la dilución.
Sustituyendo estos valores en la ecuación anterior, obtenemos
1,16 x 104 cpm 100 pL 5 0p L _ 5 , 8 x 1 0 7 cpm

5 pL 1 pL 1 pg ADN 5 pg
= 1,16 x 107 cpm/pg
Por lo tanto, el producto de la reacción de traslación de mella tiene una actividad

específica de 1,16 x 107 cpm/pg.
6.4 M A R CA JE D E ADN M ED IA N TE C EB A D O R E S A LEA T O R IO S

U n o lig o n u d e ó tid o d e seis b a se s d e lo n g itu d s e d en o m in a h exám ero o
h exa n u c le ó tid o . Si lle v a a ca b o la síntesis d e u n hex á m ero d e fo rm a q u e los nt
A , C , G y T tien en la m ism a pro b a b ilid ad d e añ ad irse en ca d a p aso de reacción, el
pro d u c to q u e se o btiene será u n a m ez cla d e o lig o n u cleó tid o s q u e tien en m u chas
secu en cias aleatorias diferentes. P o r tan to , este o lig o n u d e ó tid o se den o m in a
h exám ero aleatorio. P o r ca d a 6 n t co ntiguos en el A D N d e u n a m u estra de
origen bio ló g ic o , d e b e h a b e r u n hex á m ero entre el co n ju n to d e hex á m ero s alea
to rio s q u e será co m plem entario. E n con d ic io n e s ap ropiadas d e tem p eratu ra y
co n c en tra ció n d e sales, el hex á m ero hib rid ad o p o d rá s e rv ir co m o c e b a d o r para
6.4 Mareaje de ADN mediante cebadores aleatorios 129
la síntesis d e A D N in vitro. S i en la re acc ió n d e síntesis d e A D N u tiliz am o s u n

dN T P m arc ad o rad ia ctiv am en te (com o el [ a - 32P ]dC T P ), ob ten d re m o s u n p ro
du cto d e síntesis m arc ad o radiactivam ente. E l A D N m arc ad o se p u ed e u tiliz ar
co m o so n d a p a ra id en tifica r secu en cias en u n o d e lo s m u ch o s p ro to co lo s p ara la
dete cció n d e gen e s q u e utiliz an la hibridación.
E n las sig u ie n tes sec cio n es se desc rib en los div erso s cá lcu lo s m atem áticos que
s on n ecesarios re alizar p a ra valo ra r la calid ad d e la reacción.
6.4.1 M areaje m e d ia n te ce b a d o re s a le a to rio s : p o rce n ta je

d e in co rp o ra ció n
E l po rc en taje d e inco rp o ració n en u n ex p erim en to d e m are aje m ed ian te ce b ad o re s
aleatorios se ca lcu la d e la m ism a fo rm a q u e el u tiliz ad o en e l d e trasla ció n de
m ella. Se ca lcu la d iv id ie n d o las cp m in corporadas al A D N (com o cp m d e m aterial
p re cip ita b le co n T C A ) en tre el to tal d e la cp m q u e h a y en la re acc ió n y finalm ente
m ultip lican d o es e v a lo r p o r 100:
cp m in co rp o rad a s al A D N „ .
--------------------- -----------------------------— — x 100 = % de m corporacion
cp m to tales en la reacion
P ro b le m a 6 .6 En un experimento de mareaje mediante cebadores aleatorios, se

incuban: los hexámeros aleatorios, 90 ng de ADN molde desnaturalizado, el
fragmento Klenow de la enzima ADN polimerasa, el tampón para la enzima,
100 (xCi de [a-32P]dCTP (2.000 Ci/m/W) y una mezcla de los otros tres dNTP no
marcados isotópicamente (en un exceso molar respecto al dCTP marcado) en un
volumen final de reacción de 70 (¿L, a temperatura ambiente y durante 75 minutos,
para permitir la síntesis de ADN a partir de la extensión de los cebadores hibridados.
La reacción se detiene mediante calentamiento. Se diluye una alícuota de 1 jiL de la
reacción en 99 (í L de tampón TE. Se depositan 5 p,L de la dilución en un disco de
filtro, se seca el filtro y se miden el total de cpm en la reacción por centelleo líquido.
5 p,L de la dilución 1/100 se tratan por el método de precipitación con TCA para
medir la cantidad de mareaje que se ha incorporado a los polinucleótidos. El filtro
utilizado para medir el total de cpm tiene 6,2 x 104 cpm. La muestra precipitada
con TCA tiene 5,1 x 104 cpm. ¿Cuál es el porcentaje de incorporación?
S o lu c ió n 6.6
La solución se obtiene utilizando la fórmula descrita anteriormente para calcular
la incorporación:
5,1 x 10 cpm x iq q _ g2 % ¿g incorporación

6 , 2 x 1 04 cpm
Por lo tanto, la reacción alcanza un 82% de incorporación de bases marcadas.

6.4.2 M areaje m e d ia n te ce b a d o re s a le a to rio s : cá lcu lo

del re n d im ie n to te ó rico
L a traslación de m ella reem p laza el A D N existente p o r cadenas m arcadas radiacti
v am e n te sin u n a gan a n cia n eta d e u n a cantidad d e A D N . P o r el contrario, el m areaje
m ediante cebadores aleato rio s tien e co m o resultado la pro d u c ció n d e cadenas
com pletam ente n u evas d e A D N . P a ra ca lcu lar el rendim iento teórico, se asum e
que la reacción alc an za u n 100% d e incorporación d e dN T P m arcados. E n un
experim ento d e m areaje m ediante cebadores aleatorios, lo s d N T P no m arcados
se añaden en u n exceso m olar. L o s d N T P no m arc ad o s p u ed e n estar a u n a
concentración de 10 a 100 vec es m a y o r q u e la d el dN T P m arc ad o radiactivam ente.
E l ren d im ien to teórico se ca lcu la u tiliz an d o la sig u ie n te fórm ula:
3 3 0 e /m o l
|xCi de dN T P añ a d id o s a la re acc ió n x 4 dN T P x -
g ra m o s d e A D N = dN T P
actividad esp e cífica d e lo s dN T P e n (xCi/ m ol
E n esta fórm ula, s e asu m e q u e lo s cuatro dN T P tien en la m ism a co ncentración

q u e el d N T P m arcado, dad o q u e el dN T P m arc ad o se e n c u en tra en u n a cantidad
lim itante.
E n u n ex p erim en to típ ic o d e m are aje m ed ian te ce b ad o re s aleatorios s e sinte
tizan cantidades d el ord e n de nan o g ram o s d e A D N . L a ecu ac ió n an te rio r se p u ed e
tran sfo rm ar p a ra ob ten e r c o n m ás facilidad el re su lta d o en nan o g ram o s d e A D N .
E l p eso m o lecu la r pro m ed io de u n nu cle ó tid o es d e 3 3 0 g/m ol. E sto es eq uivalente
a 3 3 0 n g /n m o l, ta l co m o se p u ed e v e r en la sig u ien te ecuación:
330 g 1 x 109 n g 1 m ol 3 3 0 ng
m ol g 1 x 109 n m o l nm ol
L a actividad esp e cífica d e u n dN T P ra diactivo, co m o el [ a - 32P]dC T P, de

m u ch o s pro v e ed o re s, s e e x p re sa en un id ad e s d e C i/m m ol. E sta u n id ad es e q u i
v ale n te a p,Ci/nmol:
Ci 1 x 106 |iC i m m ol p,Ci

m m ol Ci 1 x 106 n m o l nm ol
S u stitu y en d o estos n u ev o s fa cto re s d e co n v e rsió n e n la ec u ac ió n p a ra calcular

el ren d im ien to teórico, o b tenem os
_. , 3 3 0 n g /n m o l
u C i de dN T P añ a d id o s x 4 dN T P x -------------------
n g d e A D N ==_ _____________________________________ dN T P
actividad esp e cífica de los nN T P en p,Ci/ nm ol
6.4 Mareaje de ADN mediante cebadores aleatorios 131
P ro b le m a 6.7 En el Problema 6.6, se utilizaron 100 pCi de [a-32P]dCTP con

una actividad específica de 2.000 Ci/mmol en un experimento de mareaje
mediante cebadores aleatorios. Asumiendo una eficiencia del 100% en la
extensión de los cebadores, ¿cuál es el rendimiento teórico?
S o lu c ió n 6.7
Tal como se ha visto antes, la actividad específica de un dNTP de 2.000 Ci/mmol
es equivalente a 2.000 pCi/nmol. La ecuación para calcular el rendimiento queda
de la siguiente forma:
330ng/nm ol
100 p,Ci x 4 dNTP x ---------------
ng de ADN - --------------, dNT: ------------------
2.000 |xCi de dNTP/nmol
— 132.000 ng _ renc|¡m¡ento teórico de 66 ng de ADN

2.000 *
Por lo tanto, en el experimento de mareaje mediante cebadores aleatorios

descrito en el Problema 6.6, se deberían sintetizar 66 ng de ADN si la reacción
tuviera una eficiencia del 100%.

del re n d im ie n to real
E l ren d im ien to re al del A D N sin tetizad o en el m areaje m ed ian te ce b ad o re s alea
to rio s se ca lcu la m u ltip lican d o el ren d im ien to teórico p o r el p o rc en taje de
inco rp o ració n (ex p resa d o co m o decim al):
ren d im ien to te ó ric o x % d e inco rp o ració n = n g de A D N sintetizado
P ro b le m a 6 .8 En el Problema 6.6, se calculó que la reacción descrita alcanzó

un 82% de incorporación de dNTP marcados. En el Problema 6.7, se calculó que
el experimento de mareaje mediante cebadores aleatorios descrito en el
Problema 6.6 tendría un rendimiento teórico de 66 ng de ADN sintetizado de
nuevo. ¿Cuál es el rendimiento real?
S o lu c ió n 6.8
El rendimiento real se obtiene al multiplicar el porcentaje de incorporación por
el rendimiento teórico. Expresado en forma decimal el 82% (el porcentaje de
incorporación) es el 0,82. Utilizando este valor para calcular el rendimiento real
obtenemos la siguiente ecuación:
0,82 x 66 ng de ADN = 54,1 ng de ADN

Por lo tanto, bajo las condiciones del experimento de mareaje mediante ceba
dores aleatorios descritas en el Problema 6.6, se obtiene un rendimiento real de
54,1 ng de nuevo ADN sintetizado.

de la a c tiv id a d e sp e cífica del p ro d u cto
L a ac tiv id a d e sp e cífica d el A D N p ro d u c id o p o r m are aje m ed ian te ce b ad o re s
aleatorios se ex p resa en cpm /p,g A D N . S e ca lcu la utilizan d o la sig u ie n te fórm ula:
cpm incorporadas ,( factor î / volum en \

m L utilizados para m edir la incorporación 'y de dilución y' y de reacción J
(rendim iento real de ng de A D N + A D N aportado en ng) x ^
P ro b le m a 6 .9 El Problema 6.6 describe un experimento de mareaje mediante

cebadores aleatorios en el cual se utilizan 90 ng de ADN molde desnaturalizado
en 70 (iL de reacción. Para medir la incorporación de dNTP marcados se toman
5 p,Lde una dilución 1/100 de la reacción de 70 jiL y se someten a la precipitación
con TCA sobre un filtro. Esta muestra de 5 (íL tiene 5,1 x 104 cpm. En el Problema
6.8, el cálculo del rendimiento real, para el experimento de mareaje, era de
54,1 ng de ADN. ¿Cuál es la actividad específica del ADN sintetizado?
S o lu c ió n 6.9
Sustituyendo los valores obtenidos en la ecuación anterior obtenemos el
siguiente resultado. Observe el uso del factor de dilución en el cálculo de las
cpm incorporadas.
5,1 x 104 cpm 100 p,L

5 |iL 1 |iL * 70 M____________7,1 x 107 cpm
(54,1 ng de ADN 4- 90 ng de ADN x 0 ,0 0 1 w 0 ,1 4 4 ||L

ng
= 4,9 x 108 cpm/îg de ADN
Por lo tanto, el nuevo ADN sintetizado en este experimento de mareaje mediante

cebadores aleatorios tiene una actividad específica de 4,9 x 108 cpm/(xg.
6.5 Mareaje del extremo S' con la transferasa terminal 133
6.5 M A R C A J E D E L E X T R E M O 3 ' C O N L A T R A N S F E R A S A
T E R M IN A L
L a en z im a d eso x in u cleo tid il tr a n sfera sa term in al añ a d e m o n o n u cleó tid o s al
extrem o 3 ' hid ro x ilo term in al tan to d el A D N cs co m o d el A D N cd. L o s m o n o
nu cle ó tid o s so n ap o rtad o s p o r los dNTP. L a a d ic ió n d e c a d a m ono n u cleó tid o
lib era fosfato inorgánico. L a tran sfera sa term in al, en u n pro c eso den o m in ad o
co m o a d ición d e colas h om o p o lim é rica s (en inglés hom opolim eric tailing),
se u tiliz a p ara a ñ a d ir u n a serie d e b ase s al ex tre m o 31 d e u n frag m en to d e A D N .
L a re acc ió n tam b ién se p u ed e c o n tro la r d e fo rm a q u e se añ a d a u n solo m on o n u
cleótido al ex tre m o 3 '. E sto se co n sig u e añ a d ien d o a la re acc ió n co m o n ucleótido
m arc ad o tanto did eo x in u cle ó sid o 5 '-trifo sfato (d d N T P ) co m o co rd ic ep in a-5 '-
trifosfato. A m b o s s o n an á lo g o s q u e ca rec en d e u n gru p o 3 'hidroxilo. U n a v e z se
añ a d e u n re sid u o , la p olim erización se detiene, dad o q u e la b a s e añ a d id a carece del
gru p o 31 hid ro x ilo q u e se n ec esita p ara la adición d el sig u ien te m ononucleótido.
D e u n m o d o u o tro, si se u tiliz a u n d N T P m arc ad o se tien e otro m étodo p ara p re
p a ra r u n a so n d a m arc ad a a d e cu a d a p a ra su u s o en en sa y o s d e hib rid ac ió n p ara la
dete cció n d e genes.
6.5.1 M areaje del e x tre m o 3' con la tra n sfe ra sa te rm in a l:

p o rce n ta je d e in co rp o ra ció n
C o m o en los o tro s m éto d o s d e m areaje d esc rito s en este capítulo, la pre cip ita ció n
con T C A (descrito en la S ecc ió n 6 .3 .1 ) s e p u ed e u tiliz ar p ara m ed ir la
inco rp o ració n d e u n d N T P m arcad o. E l p o rc en taje d e inco rp o ració n se calcula
u tiliz an d o la sig u ien te ecuación:
fo d e incorporación
cp m totales
P ro b le m a 6 .1 0 En un experimento de mareaje del extremo 3'se mezclan en

50 |iL de reacción: 60 ng de un fragmento de ADN, transferasa terminal, tampón
de reacción y 100 |xCi de [a-32P] cordicepina-5'-trifosfato (2.000 Ci/mmol). La
mezcla se incuba a 37 °C durante 20 min y se detiene calentándola a 72 °C
durante 10 min. Un jxL de la reacción se diluye en 99 (iL de tampón TE. Cinco ^L
de esta dilución se depositan en un filtro, se seca el filtro y se valora en un
contador de centelleo líquido. Esta muestra, que representa el total de cpm,
tiene 90.000 cpm. Otros 5 jxL de la dilución 1/100 se tratan con TCA para medir la
cantidad de mareaje incorporado al ADN. El filtro del procedimiento con TCA
posee 76.500 cpm. ¿Cuál es el porcentaje de incorporación?
Las cpm totales fueron 90.000. La precipitación con TCA indicó que se incorpo
raron al ADN 76.500 cpm. Utilizando estos valores y la ecuación anterior, los
cálculos son los siguientes:
76.500 cpm
---------------------------x 100 = 85% de incorporacion
90.000 cpm
Por lo tanto, en este experimento de mareaje del extremo 3', se incorpora al ADN
el 85% del mareaje.
6 .5 .2 M areaje d el e x tre m o 3 ' con la tra n sfe ra sa te rm in a l:

a c tiv id a d esp e cífica d e l p ro d u cto
L a actividad e sp e cífica del pro d u c to d e u n m areaje d el ex tre m o 31, ex p resado
c o m o cpm /jxg d e A D N , se ca lcu la c o n la ecuación
.. , . / factor \ / volum en \
o/ i •, cpm totales \ / \
% de incorporación x —7— — —— ------ r - x de x I de
/ |i L utilizados \ I d ilu c ió n í l reacción /
I para m edir I
\ las cpm totales /
c p m /|jg =
(xg del fram ento de A D N en la reacción
P ro b le m a 6.11 En el Problema 6.10, se describe una reacción de mareaje del

extremo 3', en la que se marcan 60 jxg de un fragmento de ADN con [a-32P]
cordicepina-5'-trifosfato en una reacción de 50 p,L. Una alícuota de 1 îL de la
reacción se diluye 1 p.L/100 ^.L y se miden 5 [xL, obteniéndose 90.000 cpm. En el
Problema 6.10, se mostró que el mareaje radiactivo se incorporó al ADN en un
85%. ¿Cuál es la actividad específica del producto?
S o lu c ió n 6.11
Utilizando la ecuación anterior, obtenemos
90.000 cpm 100^xL

< 5 |xL X 1 [xL X 501 _ 7,65 x 107 cpm
60 (xg de ADN 60 p,g de ADN
= 1,3 x 106 cpm/îg de ADN
Por lo tanto, el producto del experimento de mareaje del extremo 3' tiene una
actividad específica de 1,3 x 106 cprn/pg.
6 .6 Síntesis del ADN complementario (ADNc) 135
6.6 S ÍN T E S I S D E L A D N C O M P L E M E N T A R IO (A D N c )
E l A R N es u n a m o lécu la frágil y se d eg rad a fácilm ente c u a n d o se ex tra e d e u n a
c é lu la en u n pro to co lo de pu rificación. E ste h e c h o p u ed e h a c e r q u e el estu d io de la
ex presión g én ic a s e a u n a tare a difícil. U n m éto d o p a ra h a c e r el estu d io d el A R N
m ás ac ce sib le es c o p ia r el A R N en A D N . E l A D N d e ca d en a do b le es m u ch o m ás
estab le y su sce p tib le a la m an ip u lac ió n p o r parte d e técnicas d e A D N recom bi-
n an te q u e el A R N .
L a en z im a re tro v iral tra n sc rip ta sa re v er sa tien e la sin g u la r h a b ilid ad de
sin te tiz ar u n a ca d en a d e A D N c o m p lem e n ta ria a p a rtir d e u n A R N m olde. El
A D N o b ten id o d e este m o d o se d en o m in a A D N c (A D N co m plem entario). U n a
v e z hec h o , la en z im a A D N p o lim e rasa se p u e d e utiliz ar en u n s eg u n d o p aso para
sin te tiz ar u n a m o lécu la de A D N c d e ca d en a do b le co m p leta , utiliz an d o el p rim er
A D N c co m o m olde. L a clo n ació n y sec u en cia ció n d e los A D N c h an p ro p o rcio
nad o a lo s b ió lo g o s m oleculares u n a v alio sa in form ación so b re la estru c tu ra d e los
g en e s y su función.
6.6.1 S ín te sis d e la p rim e ra ca d e n a d e A D N c

D a d o q u e m u ch o s A R N m eucariotas se p u ed e n ais la r co n su co la p o li (A ) intacta,
se pu ed e u tiliz ar u n c e b ad o r oligo(dT ) p a ra h ib rid a r c o n las colas hom o p o lím e ras
p a ra in iciar la síntesis d e la p rim era ca d en a del A D N c. C u an d o se h a de re alizar la
tran sc rip ció n re v ersa d e m oléculas d e A R N d e gra n longitud, es m ejo r u tiliz ar
h ex a n u cleó tid o s aleatorios co m o ce badores. O tro s co m p o n e n te s d e la reacción
in clu y en la tran sc rip tasa reversa, u n in h ib id o r de ribonucleasas, los cu a tro dN TP,
ditiotreitol (un ag e n te re d u cto r) y el tam p ó n d e reacción. E l A R N no rm alm en te se
añ a d e a la re acc ió n a u n a co n c en tra ció n ap ro x im a d a de 0,1 p g /p L . C u an d o to d o s
lo s co m ponentes se h an m ezclado, se tran sfie re u n a p e q u e ñ a a lícu o ta a u n tu b o de
en sayo q u e co n tien e u n a p eq u e ñ a ca n tid a d d e [ a - 32P ]dC T P p ara c o n tro la r la
síntesis d e la p rim era cadena. E l re sto d e la re acc ió n (sin ra d io isó to p o ) se utiliza
po sterio rm e n te p ara la síntesis d e la seg u n d a cadena.
L a incorporación d el m areaje en los polinucleótidos se pu ed e valorar m ediante la
precipitación con T C A , tal com o se h a descrito para las o tras reacciones de
m areaje (véase la S ección 6.3.1). E l cálculo del porcentaje d e incorporación
d e m areaje se re aliza tal co m o se h a descrito anteriorm ente en este capítulo. El
objetivo d e valorar la reacción d e síntesis d e la prim era ca d en a del A D N c es
d eterm inar la cantidad d e A D N c sintetizado y la eficiencia con la cual el A R N m
se convierte e n A D N c. E stos cálculos requieren los siguientes datos:
a) L o s m o les d e dN T P p o r re acc ió n , q u e se ob tien en p o r la ecuación
m oles d e dN T P / re acc ió n =
b ) E l p o rc en taje d e inco rp o ració n d e d N T P m arcados, q u e se o b tien en p o r la

ecuación
n/ . cp m del pre cip ita d o co n T C A

% d e m co rp o racio n = ------------------------------------------- x 100
cp m totales
c) L o s m o les d e d N T P in co rp o rad o s al p o lin u cleó tid o , q u e se ob tien en p o r la

ecu ac ió n
^ m oles d el dN T P / v o lu m en \ % de incorporación
dddN TPH = — ¡¡i— x d e k .. x ----------- m -----------
\ m eorporados ) \ re acc ió n J
d ) L o s g ra m o s de la p rim era ca d en a d e A D N c sintetizados, q u e se o b tien en p o r la

ecuación
330 g
g de A D N c sintetizado = m oles de dN T P in co rp o rad o s x -
m oles d e dN T P
e) E l n ú m ero d e g ram os d e la p rim era ca d en a d e A D N c q u e se utiliz an p a ra la

síntesis d e la seg u n d a cadena, q u e se o b tien en p o r la ecuación
/ v o lu m en d e la re acc ió n \
\ , \ I tras sac ar la m u estra 1
/ g d e A D N c d isp o n ib le \ / g de la p rim era \ \ J
I p ara la síntesis d e la I= I ca d en a de ) x — --------- ---------- . . . ----- —
\ j j / \ a rvxi / v o lu m en uncial
\ s e g u n d a ca d en a / \A D N c / , , .,
d e la reacción
P ro b le m a 6 .1 2 Se lleva a cabo un experimento de síntesis de la primera

cadena de ADNc con 5 de poli (A) ARNm, la transcriptasa reversa, 2 m/W de
cada dNTP y todo el resto de reactivos necesarios en un volumen total de 55 p,L.
Tras mezclar todos los componentes, se toman 5 jxL de la reacción y se
transfieren a un tubo de ensayo donde hay 0,5 (xL de [a-32P]dCTP (1.000 Ci/m/W;
10 (xCi/jxL). En esta pequeña reacción en paralelo con el trazador de [a-32P]dCTP,
se miden las cpm totales y la incorporación del mareaje mediante la técnica de
precipitación con TCA de la siguiente forma: se toman 2 p,L de la reacción en
paralelo y se diluyen hasta 100 (xL en tampón TE. Cinco jxL de esta dilución se
depositan en un filtro y se valora (para medir las cpm totales). Otros 5 p,L de la
dilución 2/100 se precipitan con TCA y se miden las cpm. La muestra preparada
para medir las cpm totales tiene un total de 220.000 cpm. La muestra
precipitada con TCA tiene 2.000 cpm.
a) ¿Qué cantidad de ADNc se ha sintetizado en esta reacción?
b) ¿Qué cantidad del ARNm inicial se ha convertido en ADNc?
6.6 Síntesis del ADN complementario (ADNc) 137
S o lu c ió n 6 .12(a)
Este problema se puede resolver utilizando las ecuaciones que se han visto
anteriormente. La primera etapa es calcular la concentración de dNTP (expre
sada en nmol/p,L). La reacción contiene 2 m/W dATP, 2 m/W dCTP, 2 m/W dGTP y
2 m/W dTTP, o la concentración total de dNTP es de 8 m/W. Una concentración de
8 m/W dNTP es equivalente a 8 mmol/L. Ésta puede ser transformada a nmol/|iL
utilizando la siguiente relación:
8m m o ld ed N TP 1L 1 x 106 nmol _ 8 nmol de dNTP

L 1 x 106 p,L mmol (iL
El porcentaje de incorporación de [a-32P]dCTP se puede calcular utilizando los

datos del problema:
2.000 cpm incorporadas

---------------------------------------------¡--------- x 100 = 0,9% de incorporacion
220.000 cpm totales
Ahora se puede calcular el número de nanomoles de dNTP incorporados en el

ADNc. Para llevar a cabo este paso, es necesario multiplicar la concentración de
dNTP en la reacción (expresado en nmol dNTP/(iL), el volumen total de la
reacción antes de sacar la alícuota para la reacción de control y el porcentaje
de incorporación (expresado en forma decimal), tal como sigue:
8 nmol de dNTP , ,
------------------ ------------------x 55 liL x 0,009 = 4 nmol de dNTP incorporados
\iL
Utilizando el número de nanomoles de dNTP incorporados al ácido nucleico y el

peso molecular promedio de un dNTP (330 g/mol), se puede calcular la cantidad
de ADNc sintetizado multiplicando ambos valores. Hay que aplicar unos factores
de conversión a estos cálculos, dado que hemos calculado la incorporación de
dNTP en nanomoles y el peso molecular de un dNTP viene dado en gramos/mol.
El cálculo es como sigue:
---- -=1.320 ng de ADNc
Por lo tanto, en esta reacción se sintetizan 1.320 ng de ADNc.
S o lu c ió n 6 .12(b )
El porcentaje de ARNm convertido a ADNc se calcula dividiendo la cantidad de
ADNc sintetizado entre la cantidad de ARNm añadido a la reacción. El cociente se
multiplica por 100 para obtener el valor en porcentaje. En este ejemplo, se sinte
tizaron 1.320 ng de ADNc. Se añadieron 5 |jg de ARNm a la reacción. Como las
cantidades de estos ácidos nucleicos están expresadas en unidades diferentes,
primero hay que convertirlas en unidades equivalentes. La conversión de (ig

de ARNm a ng de ARNm se lleva cabo de la siguiente forma:
1.000 nq
5 ng de ARNm x ------------ = 5.000 ng de ARNm
jig
Ahora se puede calcular el porcentaje de ARNm convertido en ADNc:
1.320 ng de ADNc sintetizado ,

------------7—----------- ---------- — x 100 = 26,4% de ARNm convertido a ADNc
5.000 ng de ARNm en la reacción
Por lo tanto, el 26,4% del ARNm añadido a la reacción se ha convertido en ADNc.
P ro b le m a 6 .1 3 ¿Qué cantidad del ADNc, sintetizado en el Problema 6.12, se

utilizará en la reacción de síntesis de la segunda cadena?
En el Problema 6.12, se extrajeron 5 jiL de los 55 jxL de la reacción para controlar
la incorporación de [a-32P]dCTP. Por lo tanto, en la reacción quedan 50 jiL de los
55 p,L iniciales. Multiplicando esta relación por la cantidad de ADNc sintetizado
(1.320 ng) obtenemos el siguiente resultado:
1.320 ng 1.200 ng de ADNc utilizados en la síntesis de la segunda cadena

55 (í L
P ro b le m a 6 .1 4 ¿Qué cantidad de nanomoles de dNTP se han incorporado al

ADNc sintetizado en la reacción descrita en el Problema 6.12?
En el Problema 6.12, se incorporaron un total de 4 nmol de dNTP a los ácidos
nucleicos. Multiplicando esta cantidad por el volumen que queda en el grueso
de la reacción obtendremos el número de nanomoles de dNTP incorporados al
ADNc que se utilizará en la reacción de síntesis de la segunda cadena:
4 nmol de dNTP incorporados x = 3(6 nmol de dNTP incorporados

55 (iL
Por lo tanto, se incorporaron 3,6 nmol de dNTP al ADNc en la reacción principal.

6 .6 Síntesis del ADN complementario (ADNc) 139
6.6.2 S ín te sis d e la se g u n d a ca d e n a de AD N c
L a síntesis de la segunda cadena d e A D N c se puede lograr m ediante diferentes
m étodos. E n prim er lugar, el A R N presente en el híbrido A R N -A D N c, que se ha
form ado durante la síntesis de la prim era cadena, puede elim inarse m ediante un
tratam iento con A R N asa A. El cebado d e la síntesis d e la segunda cadena se puede
realizar m ediante el u so de cebadores aleatorios, con un cebador específico para un gen
o aprovechando la estructura del lazo d e la horquilla que norm alm ente se encuentra
en el extrem o 3 ' d e la prim era cadena del A D N c. P or otra parte, se puede utilizar
la A R N asa H para generar m ellas en la cadena de la m olécula híbrida A R N -A D N c. L a
A D N polim erasa utiliza el A R N m ellado com o cebador para sustituir la cadena de
A R N d e u n a form a parecida a lo que sucede en la reacción d e traslación d e mella.
P ara llev ar a ca b o la síntesis d e la seg u n d a ca d en a d e A D N c, se d iluye la
re acc ió n d e la p rim era ca d en a en u n a n u ev a m ez cla q u e co n tien e to d o s los
co m p o n e n te s n ecesarios p a ra re p lic ar c o n éxito el A D N . P o r lo gen e ral, n o se
añ a d en n u ev o s dN TP. E sto s p ro v ien e n d e la re acc ió n d e la p rim era cadena. A l
igual q u e en la síntesis d e la p rim era ca d en a d e A D N c, se p u ed e re alizar en
p aralelo u n a reacción d e seguim iento q u e in co rp o ra [a -32P ]d C T P p a ra controlar
la inco rp o ració n d e d N T P y la fo rm a ció n d e la seg u n d a ca d en a d e A D N .
Se utiliz an div erso s cá lcu lo s p a ra v alo ra r la calidad d e la síntesis de la seg u n d a
cadena:
a) E l p o rc en taje d e inco rp o ració n d e m are aje en la seg u n d a ca d en a se calcula
utiliz an d o la siguiente fórm ula:
cp m pre cip ita d as co n T C A

- x 100 = % d e inco rp o ració n a la seg u n d a ca d en a
cp m totales
b) L o s nan o m o les de d N T P incorporados al A D N c vien e n dad o s p o r la siguiente

ecuación:
/n m o l de dN TP \ _
y incorporado J
( nm ol de d N T P \
incorporados
/ nm ol de \ í volum en \
en la prim era o de incorporación
y d N T P /m L ) ^ d e reacción J
cadena del
\A D N c
(E n esta ec u ac ió n , el po rc en taje d e inco rp o ració n se d eb e ex p resar co m o u n

n ú m ero decim al.)
c) L a ca n tid a d d e s e g u n d a ca d en a d e A D N c s in te tiz ad a (en n g ) se calcula
m ediante la sig u ien te fórm ula:
n g de la seg u n d a ca d en a del A D N c = n m ol d e dN T P incorporados

3 3 0 n g de dN T P
d ) E l p o rc en taje d el A D N c d e la prim era ca d en a q u e se h a con v ertid o en A D N c

d e ca d en a do b le se re su elv e co n la siguiente ecuación:
/ % d e co n v e rsió n a A D N c \ _ n g de la seg u n d a c a d en a del A D N c x jq q

y d e ca d en a d o b le J n g d e la p rim era c a d e n a d el A D N c
P ro b le m a 6 .1 5 Los 50 p l de la síntesis de la primera cadena de ADNc,

descrita en el Problema 6.12, se diluyen en 250 jxL de una reacción para la
síntesis de la segunda cadena que contiene todos los reactivos necesarios. Para
preparar la reacción de seguimiento, se toman 10 (iL de los 250 p,L iniciales y se
transfieren a un tubo de ensayo que contiene 5 |xCi [a-32P]dCTP. Tras la
incubación de las reacciones, se añaden 90 (xL de una solución de EDTA a la
reacción de seguimiento. Para parar la reacción se realiza un paso de
calentamiento de las muestras. Se depositan 2 [xL de los 100 ^L de la reacción
de seguimiento en un filtro y se valora. Esta muestra tiene una lectura de
90.000 cpm. Otros 2 p,L de la muestra diluida de seguimiento se tratan con TCA
para medir la incorporación de [a-32P]dCTP. Esta muestra tiene un valor de
720 cpm.
a) ¿Cuántos nanogramos de la segunda cadena de ADNc se han sintetizado?
b) ¿Cuál es el porcentaje de la primera cadena que se ha convertido en la
segunda cadena de ADNc?
El primer paso para resolver este problema es calcular el porcentaje de
incorporación de [a-32P]dCTP:
720 cpm precipitadas con TCA

--------------------------;---------x 100 = 0,8% de incorporacion
90.000 cpm totales
Ahora podemos calcular los nanomoles de dNTP que se han incorporado. La

reacción de síntesis de la primera cadena de ADNc tiene una concentración de
dNTP de 8 nmol/jiL (véase la Solución 6.12a). Los 50 ^.L de la reacción de la
primera cadena se diluyen en un volumen total de 250 ^L. Asumiendo que no
hubiera habido incorporación en la reacción de la primera cadena, la nueva
concentración de dNTP en la reacción de la segunda cadena es:
8 nmol de dNTP 50jxL _ 1,6 nmol de dNTP

p.L 250 |xL |i,L
El ADNc de la primera cadena incorporó 3,6 nmol de dNTP en la reacción inicial

(Problema 6.14). Como esta cantidad de dNTP ya no está disponible en la
reacción de síntesis de la segunda cadena para su incorporación en el ácido
nucleico, debe ser restada de la concentración total de dNTP. Utilizando el
6.7 Adición de colas homopoliméricas 141
porcentaje de incorporación calculado anteriormente, la cantidad de dNTP

incorporado se puede calcular a partir de la siguiente ecuación:
x /3,6 nmol de dNTP Y

''1,6 nmol _ /3 ,2 nmol de dNTP\
<250 |xL ) — I incorporados en la I
v M'l- "încorporados J
' \primera cadena /
Por lo tanto, se incorporaron 3,2 nmol de dNTP al ADNc durante la síntesis de la

segunda cadena.
La cantidad de ADNc que se ha producido durante la síntesis de la segunda
cadena se puede calcular multiplicando los nanomoles de dNTP incorporados
por el peso molecular promedio de un dNTP (330 ng/nmol):
330 ng
3,2 nmol de dNTP x ------ r = 1.056 ng de la segunda cadena del ADNc
nmol
Por lo tanto, se sintetizaron 1.056 ng de ADNc en la reacción de síntesis de la

segunda cadena del ADNc.
S o lu c ió n 6 .15(b )
En el Problema 6.13, se calculó que se habían utilizado 1.200 ng de ADNc,
sintetizados en la reacción de síntesis de la primera cadena, en la reacción de
la síntesis de la segunda cadena de ADNc. El porcentaje de conversión del ácido
nucleico utilizado para la segunda cadena de ADNc se calcula dividiendo la
cantidad de segunda cadena de ADNc sintetizada entre la cantidad de ADNc con
primera cadena aportado y multiplicando este valor por 100:
1.056 ng de la segunda cadena del ADNc ^ ^

1.200 ng de la primera cadena del ADNc
_ / 88% de conversión \ / cadena \
— y a doble cadena ) y de ADNc y
Por lo tanto, el 88% del ADNc de la primera cadena aportado se convirtió en

ADNc de doble cadena en la reacción de síntesis de la segunda cadena.
6.7 A D IC IÓ N D E C O L A S H O M O P O L IM É R IC A S
L a ad ición d e colas h om op olim éricas (o sim p le m e n te a d ición d e colas [en
inglés tailing ]) es el pro c eso p o r el cual se u tiliz a la en z im a tr a n sfera sa term in al
p a ra a ñ a d ir u n a serie d e resid u o s (to d o s d e la m ism a base ) a u n extrem o 3 ' d e un
A D N cd . E ste pro c eso tien e u n esp e cial interés y a q u e fa cilita la clonación
d e A D N c en v ec to res p lasm íd ic o s d e clonación. E n esta técnica, a u n fragm ento
d e A D N c d e do b le ca d en a se le añ a d e u n a co la c o n u n a serie d e re sid u o s que

p u ed e n se r tan to dC co m o d G en los d o s ex tre m o s 3 '. A l v e c to r en el cual se v a a
c lo n a r el fragm ento d e A D N c se le añ a d en colas con la b a s e co m p lem e n ta ria (d C si
se h a u tiliz ad o d G en las colas d el A D N c o d G si se h a utiliz ad o dC en el A D N c).
A ñ a d ie n d o co la s al A D N c y al v e c to r co n b ase s com plem entarias, se fa cilita la
h ib rid ac ió n entre los d os A D N . D e este m o d o la ligación entre el fragm ento de
A D N c y el v e c to r es m u ch o m ás eficiente.
E s po sib le c a lcu lar el n ú m ero d e re sid u o s q u e la tran sfera sa term in al h a
añ a d id o a u n ex tre m o 3 ' ca lcu lan d o el nú m ero d e p ico m o les d e extrem os 3'
asequibles com o sustrato y la co n c en tra ció n (en p ico m o les) d e d G (o d C ) in co r
p o ra d o s al A D N . E l p rim e r p aso es ca lcu lar el n ú m ero d e p ico m o les d e extrem os 3'
u tiliz an d o el tam añ o d el A D N su strato en la sig u ien te fórm ula:
p,g d e A D N sustrato x
1 x 106 p,g 1 x 10l 2 pm o l
pm o l d e extrem os 3 -
n ú m ero de p b 66 0 g / m o l m ol
m o lécu la pb
nú m ero d e ex tre m o s 3
P ro b le m a 6 .1 6 Si 2,5 ug de un vector plasmídico de clonación de 3.200 pb se

corta una vez con una enzima de restricción, ¿cuántos picomoles de extremos 3'
son asequibles como sustrato para transferasa terminal?
Un plásmido es una molécula circular de ADNcd. Si se corta con una enzima de
restricción una vez, el vector se convertirá en lineal. Como molécula lineal,
tendrá dos extremos 3'. La ecuación para calcular el número de extremos 3'
(véase anteriormente) se convierte en
2,5 iig de ADN X ------- ^ — „

, l x 1 0 6 u.q 1 x l0 12pmol 2 extremos 3
pmol de extremos 3 = — _ ---- ¡-^ x --------- ------ x ------- ¡---- ¡—
3.200 bp 660 g/m ol mol molécula
molécula pb
>x 106 pmol de extremos 3'

= 2,4 pmol de extremos 3
Por lo tanto, 2,5 p,g de un fragmento de ADN lineal de 3.200 pb de longitud es

equivalente a 2,4 pmol de extremos 3'.
Para calcular el número de residuos dG añadidos al extremo 3' del fragmento de

ADN, es necesario tener una molécula radiactiva en la reacción que pueda ser
detectada y cuantificada. La molécula utilizada para controlar el progreso de la
reacción debe ser un sustrato de la enzima. Por lo tanto, en un protocolo de colas
dG puede servir para este propósito el dGTP tritiado (3H-dGTP). El siguiente
paso para hallar la cantidad de residuos añadidos a un extremo 3' es calcular la
actividad específica de los dNTP. La actividad específica se puede expresar como
cpm/pmol de dNTP. La fórmula general para calcular la actividad específica de
un ADN con colas es
. . cpm totales de la muestra valorada

cpm/pmol de dNTP = ----------------- —— ——-----------
K pmol de dNTP
Para realizar este cálculo se debe averiguar el número de picomoles de dNTP en

la reacción. Supondremos que la concentración de partida de los dNTP, tal como
la suministra el proveedor, está expresada en unidades micromolar ((i/W). La
concentración micromolar de dNTP en la mezcla de reacción de adición de
colas por la transferasa terminal se calcula con la siguiente fórmula:
dNTP (concentración en \tM del stock de dNTP) x(volumen de dNTP añadido)

volumen total de la reacción
P ro b le m a 6 .1 7 A un vector de 3.200 pb se le añaden colas con residuos de

dG utilizando dGTP y la transferasa terminal. La solución de dGTP que se ha
utilizado como sustrato tiene una concentración de 200 \iM. Se añaden 4 p,L de
la solución stock a 100 (iL de reacción (volumen final). ¿Cuál es la concentración
micromolar de dGTP en la reacción?
S o lu c ió n 6.17
Mediante la ecuación antes descrita obtenemos la siguiente relación:
|lA1dedGTP=m ^100Wp,L l i t i = 8HÂ<

^
Por lo tanto, en la mezcla de reacción, el dGTP está a una concentración de 8 [>M.

La cantidad de dGTP en la reacción normalmente está a una concentración
molar muy superior respecto al 3H-dGTP añadido. Por lo tanto, el 3H-dGTP
añadido no contribuye de forma significativa respecto a la concentración total

de dGTP. Cuando se añade una alícuota de dGTP radiactivo a la reacción de
adición de colas por la transferasa terminal, la cantidad total de cpm se puede
valorar depositando una pequeña cantidad de la mezcla de reacción en un filtro,
dejando secar el filtro y valorando las cpm por centelleo líquido. El número de
picomoles de dGTP depositados en el filtro se puede calcular mediante la
siguiente ecuación:
pmol de dNTP—mm° ' dedNTP * L x 1 x 1 ° 6 P mo1 x depositadosA

L 1 x 106 |xL prnol \er\ el filtro J
Hay que recordar que la unidad \iM es equivalente a micromoles/litro (véase el

Capítulo 2). Esto nos da el primer término de la ecuación. Por ejemplo, una
solución 8 [iM de dGTP es equivalente a 8 juno! dGTP/L.
P ro b le m a 6 .1 8 La reacción de adición de colas por la transferasa terminal

descrita en el problema anterior tiene una concentración de dGTP de 8 [>M.
Se añaden 5 jxCi de 3H-dGTP a la reacción como molécula indicadora de la
reacción. Se depositan 2 p,L de la mezcla de reacción en un filtro y se valora por
centelleo líquido para calcular el total de cpm en la reacción. ¿Qué cantidad
de picomoles de dGTP hay en el filtro?
La cantidad de 3H-dGTP añadido a la reacción se encuentra en una cantidad
molar tan pequeña que no afecta de forma significativa a la concentración total
de dGTP de 8 \iM. La anterior ecuación genera la siguiente relación:
. . 8jxmol L 1 x 1 0 6 pmol
pmol de dGTP — — ¡— x ---------------^ — x --------------------¡--------- x 2 u,L
L I x I OVL nmol r
— 16 pmol de dGTP
Por lo tanto, los 2 p,L de la reacción depositados en el filtro para medir el total de
cpm contienen 16 pmol de dGTP.
L a ac tiv id a d esp e cífica se pu ed e c a lcu lar m id ie n d o las cp m del m aterial d ep o

sitado y utiliz an d o la sig u ien te fórm ula:
. . cpm dep o sitad a s en el filtro

ac tiv id a d esp e cifica (en e m p /p m o l) = ------ — — , ,--------- — -------:— —
p m o l de dN T P del m ateria l depositado
P ro b le m a 6 .1 9 Los 2 |iL de la muestra depositados en el filtro (explicado en el

Problema 6.18) se valoraron por centelleo líquido y su resultado fue de 90.000 cpm.
¿Cuál es la actividad específica en cpm/pmol dNTP de la muestra depositada?
S o lu c ió n 6.19
En el Problema 6.18, se calculó que la muestra de 2 p l de la reacción de adición
de colas contiene 16 pmol de dGTP. Colocando este valor en la ecuación ante
rior obtenemos la siguiente relación:
90.000 cpm
actividad específica = — ------ . = 5625 cpm/pmol de dGTP
K 16 pmol dGTP K /K
Por lo tanto, la reacción de adición de colas tiene una actividad específica de

5.625 cpm/pmol de dGTP.
La incorporación de mareaje a la cadena del ADN se puede valorar por
precipitación con TCA. Conocer la actividad específica de los dNTP añadidos
permite calcular el número total de pmoles de bases incorporados en la cola
homopolimérica. Este cálculo se realiza utilizando la siguiente fórmula:
cpm precipitados con TCA ,

/ pmol de dNTP' —— —— ¡-------- ;-------—— —-------—— x u,L totales en la reacción
p,L utilizados para la precipitación con TCA
I totales
actividad específica de los dNTP (en cpm/pmol de dNTP)
\incorporados
P ro b le m a 6 .2 0 Tras la incubación con la transferasa terminal, se toman 5 p,L

de la mezcla de reacción para tratarlos con TCA y etanol para medir la
incorporación de dGTP al polinucleótido. El filtro de este ensayo valorado por
centelleo líquido tiene 14.175 cpm. ¿Cuántos picomoles de dGTP se incorporan
a las colas homopoliméricas?
En el Problema 6.19 se calculó que la cantidad de dGTP en la reacción de adición
de colas tiene una actividad específica de 5.625 cpm/pmol. El volumen final de
reacción es de 100 (iL. Sustituyendo estos valores en la ecuación anterior obte
nemos la siguiente ecuación:
14.175 cpm del precipitado con TCA

--------- ------- w K--------------- x 100 [iL
pmol de dGTP incorporados totales= --------------------— :----- —— ¡——----------
5.625 cpm/pmol de dGTP
= 50,4 pmol de dGTP
Por lo tanto, en esta reacción se incorporaron un total de 50,4 picomoles de

dGTP a las colas homopoliméricas.
El número de residuos añadidos a cada extremo 3' se puede calcular utilizando

la siguiente fórmula:
, , , , / pmol de dNTP incorporado

residuo de nucleotido/extremo 3 = ---------------------------7—
pmol de extremos 3
Hay que recordar que el término «picomoles» representa un número, una

cantidad. Los picomoles de diversas moléculas están relacionados con el
número de Avogadro (véase el Capítulo 2). Un mol de cualquier cosa es equi
valente a 6,023 x 1023 unidades. Por lo tanto, un picomol de cualquier cosa
equivale a 6,023 x 1011 unidades, tal como se puede ver aquí:
6,023 x 1023 moléculas mol _ 6,023 x 1011 moléculas

mol 1 x 1 0 12pmol pmol
Supongamos que hemos incorporado 20 pmol de dGTP a los polinucleótidos en

una reacción de adición de colas por la transferasa terminal. Supongamos,
también, que tenemos 2 pmol de extremos 3' a los que hay que añadir las colas.
Veinte picomoles de dGTP equivalen a 1,2 x 1013 moléculas de dGTP, como se
puede ver en esta ecuación:
6,023 x 1011 moléculas de dGTP , , . ..

---------------- —— —— ---------- x 20 pmol de dGTP
pmol de dGTP
= 1,2 x 1013 moléculas de dGTP
Dos picomoles de extremos 3' equivalen a 1,2 x 1012 extremos 3':
6,023 x 10 11 extremos 3* , , > ,, >

-------------------------------------------------- ¡— x 2 pmol de extremos 3 = "[.l x "W * extremos 3
pmol de extremos 3
Si calculamos el número de residuos añadidos por extremos 3' libres en pico-

moles o en relación al número de moléculas, la relación siempre es la misma, en
este caso 10:
2 pmol de extremos i
1,2 x 1013 moléculas de dGTP incorporadas

residuos dG añadidos = ---------------------- —------------- ;------------ = 10
1,2 x 1012 extremos 3
Si expresamos las cantidades en picomoles nos ahorramos un paso.

6.8 Transcripción in vitro 147
P ro b le m a 6.21 Para el experimento de adición de colas descrito en esta

sección, ¿qué longitud tienen las colas de dG?
S o lu c ió n 6.21
En el Problema 6.20, calculamos que se habían incorporado a las colas 50,4 pmol
de dGTP. En el Problema 6.16, calculamos que la reacción contenía 2,4 pmol de
extremos 3'. Sustituyendo estos valores en la ecuación para calcular la longitud
de las colas obtenemos la siguiente relación:
, , 50,4 pmol de dGTP incorporados

numero de dG de la cola = -------------------------------- 7-----= 21 residuos
2,4 pmol de extremos 3
Por lo tanto, se han añadido 21 residuos de dG a cada extremo 3'.
6.8 T R A N S C R IP C IO N I N V IT R O
L a síntesis in vitro d e tran sc rito s d e A R N se u tiliz a p ara g en e rar so n d as de
h ib rid ac ió n , p ara o b ten e r u n sustrato p ara u n a trad u c ció n in vitro y com o
m éto d o p ara o b ten e r ca d en a s an tisen tid o p ara in h ib ir la ex p resió n d e u n gen.
P ara c o n tro la r la efic ien cia d e la síntesis d e A R N , se p u ed e a ñ a d ir a la reacción
C T P o U T P m arcado. L a inco rp o ració n d e n t m arc ad o s a las ca d en a s d e A R N se
v a lo ra p o r m edio d el p ro c ed im ie n to g en e ral d e p re cip ita ció n co n T C A , tal co m o se
h a desc rito en la S ecc ió n 6 .3 .1 . E l p o rc en taje d e inco rp o ració n se p u ed e ca lcu lar
p o r m ed io d e la siguiente fórm ula:
M c p m d el pre cip ita d o co n T C A

yo d e m co rp o racio n = ------------------— --------------------- x 100
to tal d e cpm
L o s o tro s cálculos p a ra v alo ra r la cantidad d e A R N sintetizado y la actividad

esp e cífica del A R N p ro d u c id o son parecid o s a lo s d esc rito s pre v ia m en te en esta
sec ció n y se h a n p u esto d e re lie v e en lo s sig u ie n tes problem as.
P ro b le m a 6.22 Se añaden 500 jxCi de [a-35S]UTP (1.500 Ci/m/W) a una

reacción de transcripción de 20 jxL que contienen 500 (i,M de ATP, GTP y CTP,
20 unidades de T7 ARN polimerasa y 1 |og de ADN. Tras la incubación de la
reacción, 1 |xL se diluye en un volumen total de 100 (xL de tampón TE. Se
depositan 5 p,L de esta dilución sobre un filtro y se valora el total de cpm. Otros
5 |_lL de muestra de la dilución se precipitan con TCA y se valora la incorporación
de mareaje. La muestra preparada para valorar las cpm totales tiene un valor
de 1,1 x 106 cpm. La muestra precipitada con TCA tiene 7,7 x 105 cpm. Antes
de utilizarse el ARN sintetizado en esta reacción se purifica para dejarlo libre de

mareaje no incorporado.
a) ¿Cuánto ARN se ha sintetizado?
b) ¿Cuál es la actividad específica?
El primer paso para resolver este problema es calcular el porcentaje de nt
marcados incorporados. Esto se realiza de la siguiente manera:
7,7 x 105 cpm del precipitado con TCA

x 100 = 70% del mareaje incorporado
1,1 x 106 cpm totales
Por lo tanto, el 70% del [a- S]UTP se ha incorporado al ARN.

La reacción contiene 500 jxCi de [a-35S]UTP con una actividad específica de
1.500 Ci/mmol. Esta información se puede utilizar para calcular el número
de nanomoles de [a-35S]UTP añadidos a la reacción, de la siguiente forma:
, ........ mmol Ci 1 x 106 nmol

500 nC\ a - 35S UTP x ---------- x ------- , ---- x ------------ -----
^ 1 J 1.500 Ci 1 x 1 0 [iCi mmol
- 0,3 nmol de UTP
Por lo tanto, la reacción contiene 0,3 nmol de UTP.

Como el 70% del UTP se ha incorporado al ARN, el número de nanomoles de UTP
que se han incorporado al ARN viene dado por la siguiente ecuación:
0,3 nmol de UTP x 0,7 = 0,2 nmol de UTP incorporado
De este modo, al ARN se han incorporado 0,2 nmol de UTP.

Asumiendo que hay el mismo número de A, C, G y U en un transcrito de ARN, los
0,2 nmol (tal como se ha calculado) representan el 25% de las bases incorpo
radas. Por lo tanto, para calcular el número total de nanomoles de NTP incorpo
rados, los 0,2 nmol se deben multiplicar por 4.
0,2 nM x 4 nucleótidos = 0,8 n/W de nucleótido incorporado
Utilizando el peso molecular medio de un nucleótido (330 ng/nmol), la cantidad

de ARN sintetizada se puede calcular de la siguiente forma:
330 nq
0,8 nmol de NTP x ----- —— — = 246 ng de ARN sintetizado
nmol de NTP
Por lo tanto, se han sintetizado 264 ng de ARN en la reacción de transcripción

in vitro.
S o lu c ió n 6 .22(b )
La actividad específica se expresa en cpm/^g ARN. En el apartado (a) de este
problema se calculó que se sintetizaron un total de 264 ng de ARN. Para
calcular la actividad específica, debemos calcular primero el total de las cpm
incorporadas en la reacción. Se toma 1 |xL de muestra de la reacción y se diluye
1 p,L/100 (iL, y 5 pL de esta dilución se utilizan para medir las cpm precipi-
tables por TCA. La muestra del precipitado con TCA tiene 7,7 x 105 cpm.
Para calcular las cpm incorporadas a la reacción, hay que multiplicar las
7,7 x 105 cpm por los dos factores de dilución (100 |xL/1 pL) y por el volumen
de reacción:
7,7 x 105 cpm 100 pL . -

5 ,.L x — X 20 ,,L — 3,1 x 10 cpm
Por lo tanto, se ha incorporado un total de 3,1 x 108 cpm a la reacción de

transcripción in vitro. Dividiendo este valor entre el total del ARN sintetizado y
multiplicando por el factor de conversión para pasar ng a ng obtenemos la
3,1 x 108 cpm 1.000 ng _ 1,2 x 109 cpm

264 ng de ARN pg pg de ARN
De esta forma, el ARN sintetizado en esta reacción tiene una actividad específica
de 1,2 x 109 cpm/(xg ARN.
L o s ác id o s nu cle ic o s se p u ed e n m arc ar co n ra d ioisótopos co m o u n a herram ien ta
p a ra c o n tro la r su síntesis, loca liz ació n y ca n tid a d relativa. L a un id ad b á s ic a de
desin teg ració n ra d ia ctiv a es el cu rio (C i), defin id o co m o la cantidad d e m aterial
rad ia ctiv o q u e g e n e ra 2,2 2 x 1 0 12 d esin tegracion es p o r m in u to (d p m ). Las
desin teg racio n es d el m aterial rad ia ctiv o d ete ctad as p o r u n instrum ento se den o
m inan cu en tas p o r m in u to (cpm ).
E l n ú m ero d e co p ia s d e u n p lásm id o se pu ed e c a lcu lar h ac ien d o c rece r la ce p a
b a c terian a p o rtad o ra d el plásm id o en p re sen cia d e u n n t m arc ad o c o n [3H]. El
A D N plasm íd ic o se sep a ra d el A D N cro m o só m ico b ac terian o en p re sen cia de
b ro m u ro d e etidio. E l n ú m ero d e co p ia s d el p lásm id o se p u ed e c a lcu lar com o
, , cpm del pico plásm ido PM del crom osom a

num ero de copias del plásm ido = ------- ——:---- — -----------------x ----------———— ——
cpm del pico del crom osom a PM del plásm ido
E n cu a lq u ie r tip o d e re acc ió n de síntesis d e A D N , d o n d e los n t se in co rp o ran a

u n a ca d en a , y a se a p o r traslación d e m ella, m are aje co n ce b ad o re s aleato rio s o
m are aje d e ex tre m o s p o r la tran sfera sa term inal, las cp m in co rp o rad a s a las
ca d en a s d el A D N se p u ed e n v alo ra r ca p tu ran d o en u n filtro d e v id rio el m aterial
pre cip ita d o c o n T C A y com p a rán d o lo co n el to tal de cp m (u n a m uestra, d ep o sitad a
en u n filtro, q u e n o h a sido p re cip ita d a con T C A ). E l po rc en taje d e m areaje
in co rp o rad o al A D N se ca lcu la com o
% d e inco rp o ració n =
cp m to tales e n la reacción
L a rad ia ctiv id ad esp e cífica (las cp m p o r p eso d e ácido nucle ic o ) d e u n producto

de traslación d e m ella se ca lcu la co m o
, , cpm en el precipitado con TC A

cpm /ixg de A D N = — ---------- ——-------------------- —— ----------- ——x factor de dilución
volum en de la m uestra precipitada con TCA
fxg totales de A D N en la reacción
E l A D N p u ed e se r m arc ad o rad ia ctiv am en te m ed ian te la e x te n sió n co n A D N

p o lim e rasa d e o lig o n u cleó tid o s cortos d e sec u en cia aleatoria. E l rendim iento
teórico d e u n ex p erim en to d e m are aje c o n c e b ad o re s aleatorios se ca lcu la com o
3 3 0 g /m o l
|xCi de dN T P añ a d id o s a la re acc ió n x 4 dN T P x — ------------------
g ra m o s de A D N = ----------------. ---------—-----— -----———-------——— dN T P —
ac tiv id a d esp e cifica d e los dN T P en p C i/ m ol
E l ren d im ien to re al d e u n ex p erim en to d e m are aje c o n ce b ad o re s aleatorios se

ca lcu la com o
n g d e A D N sintetizado = re n d im ien to teórico x % d e inco rp o ració n
L a ra d ia ctiv id ad esp e cífica d e u n pro d u c to m arcado m ed ian te ce b ad o re s ale a

to rio s se ca lcu la com o
/ factor \ / volum en \
cpm incorporadas
de I x de
m L utilizados para m edir la in<
V dilución / \ reacción )
cpm/pg =
(rendim iento real de ng d e A D N + A D N aportado en ng) x ^
ng
E l A D N se p u ed e m arc ar p o r lo s extrem os 3' utiliz an d o la en z im a tran sferasa

term inal. L a ra d ia ctiv id ad esp e cífica d el p ro d u c to m arc ad o en el extrem o 3 ' se
p u ed e c a lcu lar d e la sig u ien te fo rm a
/ factor \ 1/ v o lu m en \
. . . . ., cpm totales
,
% de m corporacion x —f— -rp—
pL utilizados para m edir
las cpm totales
cpm /u,g = ------------------------------------------- —---------------------
> de
\ dilución )
M
¡ de
y reacción )
p,g del fragm ento de A D N en la reacción
L a síntesis d e A D N c se p u ed e co n tro la r re alizan d o reacc io n es paralelas que

tien en to d o s lo s co m p o n e n te s d e la re acc ió n prin cip a l d e A D N c p ero tienen
aña d id o u n elem ento traz ad o r ra diactivo. E l n ú m ero d e m oles d e dN T P in co rp o
ra d o s a la p rim era c a d e n a del A D N c se p u e d e c a lcu lar d e la sig u ie n te form a
, „ , m o les de dN T P / '« - l u m e n \
m oles d e dN T P in co rp o rad o s = ----------------------x de
uL
1 V reacción
% de incorporación
100
L a cantidad d e p rim era ca d en a d el A D N c sin te tiz ad a se p u e d e c a lcu lar d e la
s ig u ie n te fo rm a
330 g
g de A D N c sintetizado — m o le s de dN T P incorporados x -
m o les de dN T P
L a cantidad d e A D N c co n p rim era ca d en a q u e se añ a d e a la re acc ió n p ara la
síntesis d e la seg u n d a ca d en a se p u e d e ca lcu lar com o
/ g de A D N c disponibles \
I para la síntesis de la 1 = g de la prim era cadena de ADN c
\se g u n d a cadena /
volum en de la reacción tras sacar la m uestra para m areaje
volum en inicial de la reacción
L a efic ien cia d e la síntesis d e la re acc ió n d e la seg u n d a c a d en a d el A D N c se

p u ed e ev a lu a r a d iferentes niveles. L a ca n tid a d d e dN T P in co rp o rad o s al A D N c
se ca lcu la co m o
/n m o l \ , . , \ , . \ / nm ol de dN TP incorporados
/ nm ol de \ / volum en \ ,
( d e dN TP 1=
( d N T P /n L ) X ( d e re a c c ió n ] “ I m la pnm era Cadena
încorporado J \ de ADN c
o de incorporación
L a cantidad d e seg u n d a ca d en a del A D N c s in te tiz ad a se o b tien e m ediante 1;

ecuación
n g de la seg u n d a ca d en a de A D N c = nm o l de dN T P incorporados
33 0 n g de dN T P
L a ca n tid a d d e A D N c c o n p rim era ca d en a q u e h a sido transform ado en A D N

de ca d en a d o b le se p u e d e c a lcu lar d e la s ig u ie n te form a
% d e co n v e rsió n a A D N c d e ca d en a d oble
n g d e la p rim era ca d en a d el A D N c
L a tran sfera sa term in al se pu ed e u tiliz ar p a ra a ñ a d ir u n a ca d en a d e u n solo tipo

de n t a lo s extrem os 3' d e u n frag m en to d e A D N (e n u n pro c eso den o m in ad o
ad ición d e colas). E l nú m ero de pico m o les de ex tre m o s 3' disp o n ib le s para añadir
co la s se o b tien e p o r m ed io d e la ecuación
1 g
[xg de A D N sustrato x ------ — r— , ,
,, 4 v l x 10 iig l x I 0 l2 pm o l
pm o l d e ex tre m o s 3 = -------;--------- 3 x ------------ --------
nu m ero d e p b 66U g / m o l m ol
m o lécu la pb
n ú m ero de extrem os 3
m o lécu la
L a actividad esp e cífica d el A D N co n colas se ca lcu la d e la sig u ien te fo rm a
cp m to tales de la m u estra valo ra d a

c p m /p m o l d e dN T P =
pm o l d e dN T P
L a concentración d e dN T P presente en la reacción d e adición d e colas (dato

necesario p ara calcular la actividad específica) se determ ina p o r m edio de la ecuación
M d dNTP (concentración \¡M del stock de dN TP) x (volum en de dNTP añadido)

E l co n tro l d e la re acc ió n d e adición d e colas re q u ie re co n o c er el n ú m ero de

pico m o les d e deso x in u cle ó tid o dep o sitad o en el filtro u tilizado p ara ob ten e r las
cp m in corporadas. E sto se ca lcu la com o
, i m m o ld e d N T P L 1 x 106 pm o l
pm o l d e dN T P = ---------------------- x ----------- — x ---------------------
L 1 x 106 pL pm o l
/ p L dep o sitad o s \
X \ en el filtro )
L a actividad e sp e cífica d e la c o la añ a d id a es
cp m dep o sitad o s en el filtro

actividad esp e cífica (e n cp m /p m o l) =
pm o l d e dN T P d el m aterial depositado
L a ca n tid a d d e m are aje in co rp o rad o en la re acc ió n d e adición d e co la s se
ca lcu la d e la sig u ien te fo rm a
cp m pre cip ita d o co n T C A

— =— -777— ------- x llL
|aLtototales
talesen
enlalareacción
reacción
(xL utiliz a d o s p a r a la
pre cip ita ció n co n T C A
actividad esp e cífica de los dN T P (e n cp m /p m o l d e dN T P )
E l n ú m ero d e resid u o s d e n t q u e se h a n inco rp o rad o a la co la en la reacción de

tran sfera sa term in al se ca lcu la co m o
., , . . i p m o l de dN T P incorporado
re sid u o de n u c le o tid o /e x tre m o 3 = --------------------------------- ------
p m ol d e extrem os 3
E l m are aje rad iactiv o tam b ién se p u ed e utiliz ar p a ra co n tro la r la transcripción

in vitro. C o n o cien d o la cantidad d e m ateria l rad ia ctiv o q u e se añ a d e a la reacción
(c o m o b a se s para el m areaje d e A R N ) y con o c ien d o la ac tiv id a d esp e cífica d e este
m aterial (en C i/m m ol) se p u ed e ca lcu lar la ca n tid a d d e A R N sintetizado p o r las
cp m d e la m u estra p re cip ita d a co n T C A .
Capítulo
Síntesis de oligonucleótidos
L o s o lig o n u cleó tid o s, ác id o s nu cle ic o s d e peq u e ñ o tam añ o y de u n a so la cadena,
se utiliz an para nu m ero sa s técnicas en bio lo g ía m o lecu la r y en bio tecn o lo g ía. L o s
o lig o n u cleó tid o s se utiliz an co m o ce b ad o re s p a ra la sec u en cia ció n del A D N y la
té c n ic a d e P C R , co m o so n d as p a ra en sa y o s de h ib rid ac ió n en la dete cció n d e genes
y c o m o m oléculas antisentido p a ra el co n tro l de la ex p resió n génica. C o n u n papel
ta n im p o rtan te en estas ap lica cio n es, así co m o en m uchas otras, es co m p re n sib le
q u e m u ch o s laboratorios h ay a n ad q u irid o los instrum entos y la cap ac id a d para
sin te tiz ar o lig o n u cleó tid o s p a ra sus p ro p io s fines. T am bién es co m p re n sib le que
h a y a flo recid o to d a u n a in d u stria ce n trad a e n p ro p o rcio n ar o lig o n u cleó tid o s p o r
en c arg o a la com u n id ad ac ad é m ica y a la industria biotecnológica.
S e h a n desc rito div erso s m éto d o s p ara la síntesis q u ím ic a de ác id o s nucleicos.
S in em bargo, casi to d o s los in stru m en to s p a ra la síntesis de A D N disp o n ib le s en el
m ercado están diseñ ad o s seg ú n el m éto d o d e la fosforam idita. E n este p ro c eso
q u ím ico, u n a fo sfo ram id ita (u n n u cle ó sid o co n lo s g ru p o s laterales pro teg id o s
p a ra co n se rv ar la in teg rid ad del azúcar, e l en la ce fo sfo d ié ste r y la b a se du ra n te las
etapas d e ex te n sió n d e la ca d en a ) se ac o p la a trav é s de su gru p o reactivo fosfato 3'
al g ru p o hid ro x ilo 5 ' d e u n n u cle ó sid o inm o v ilizad o a u n so p o rte só lid o en u n a
co lum na. L a síntesis d e o lig o n u cleó tid o s in clu y e d iv erso s p asos: 1) L a
d estritilación , en el cual el g ru p o dim eto x itritilo (D M T o «tritil») en el hidroxilo
5' del n u cle ó sid o d e re cep to r es elim in ad o p o r m ed io d e u n tratam iento co n T C A .
2 ) E n la fa s e d e a co p la m ien to , u n a fosforam idita, a c tiv a d a co n tetra zo l (u n ácido
d ébil), se u n e a la ú ltim a b a s e añ a d id a al so p o rte só lid o de la colum na. 3 ) E n la fase
d e b loq u eo, cu a lq u ie r gru p o h id ro x ilo 5 ' libre d e lo s n t d e la c o lu m n a q u e n o h a
re acc io n ad o es acetilad o p o r m ed io d e u n trata m ie n to c o n acético an hidro y
jV -m etilim idazol. 4 ) E n la fa se final, d e n o m in ad a d e oxid a ció n , el enlace fosfito
in tem u cleo síd ico in estab le entre la b a se a n te rio r u n id a y la b a s e añ a d id a m ás
re cien te es o x id ad o p o r m ed io d e u n trata m ie n to co n io d o y ag u a a u n enlace
fo sfo trié ste r m ás estable. T ras la u n ió n d e to d as las b ase s d e la sec u en cia del
o lig o n u cleó tid o , la ca d en a co m p leta d el ácido n ucleico s e esc in d e d e la co lu m n a
156 CAPÍTULO 7 Síntesis de oligonudeótidos
p o r m ed io d e u n trata m ie n to co n h id ró x id o d e am o n io , y lo s gru p o s de pro tec ció n

d e la b a s e so n elim inados p o r ca len tam ien to en la so lu ció n de h id ró x id o am ónico.
7.1 R E N D IM IE N T O D E L A S ÍN T E S IS
L as co lu m n as d e síntesis de ácido nu cle ic o están d iseñadas a div ersa s escalas, que
están en fun c ió n d e la cantidad d e n u cle ó sid o s 3 ' u n id o s al soporte sólido. L a
esc ala d e co lu m n a m ás h ab itu al o scila d e 4 0 nm o l a 10 nm ol. L o s so p o rtes sólidos
m ás hab itu ale s in clu y en v id rio d e p oro con tro lad o (C P G , d el inglés controlled-
pore glass ) y p oliestireno. N o rm a lm e n te , las co lu m n as d e C P G com ercializadas
tien en u n o s tam añ o s d e p o ro d e 5 0 0 o 1.000 Á . L a esc ala de la co lu m n a u tiliz ad a
p a ra la síntesis dep e n d e tan to d e la ca n tid a d co m o d e la lo n g itu d d e los
o lig o n u d e ó tid o s deseados. C u an to m a y o r es la ca n tid a d d e n u cle ó sid o 3 ' u n id o
al s o p o rte sólido m ay o r es e l re n d im ien to d e o lig o n u d e ó tid o . P ara la síntesis
d e o lig o n u d e ó tid o s d e m ás d e 50 b ase s d e lo n g itu d se aco n sejan co lu m n as de
po liestiren o o C P G d e p o ro grande.
U n a co lu m n a d e C P G d e 0,2 nm ol contiene 0,2 n m ol d e bases 3' p ara el inicio
d e la síntesis. Si en la síntesis, la segunda b a s e se ac o p la con u n 100% de eficiencia,
tendrem os 0,2 nm o l d e seg u n d a base con capacidad p ara acoplar, del total de
0,4 nm ol d e b ase s presentes en la co lu m n a (0,2 nm o l d e b ase s 3 ' + 0,2 nm ol
d e b ase s acopladas = 0 ,4 nm o l d e bases). P o r lo tanto, se pu ed e ca lcu lar el núm ero
d e m icrom oles d e o lig o n u d eó tid o sintetizados en u n a colum na, m ultiplicando la
longitud del o lig o n u d e ó tid o p o r la escala d e la colum na.
P ro b le m a 7.1 Se sintetiza, en una columna de 0,2 nmol, un oligo de 22 nt

de longitud (un 22 mer). Asumiendo una eficiencia de la síntesis del 100%,
¿cuántos micromoles de oligo se sintetizan?
S o lu c ió n 7.1
Multiplicando la escala de la columna por la longitud del oligo, obtenemos la
. . 0,2 nmol
22 bases añadidas x ———— ¡—¡---- = 4,4 nmol
adición de base
Por lo tanto, asumiendo un 100% de eficiencia en el acoplamiento, se han

sintetizado 4,4 nmol de oligo.
Si la eficiencia del acoplamiento de bases ha sido del 100%, se puede calcular el
rendimiento teórico de la síntesis utilizando la siguiente relación: 1 nmol de
ADN de oligonudeótido contiene alrededor de 10 DO por base. (Una unidad
D O es la cantidad de oligonudeótido disuelto en 1,0 mL, que tiene una A 26o
de 1,00 en una cubeta de 1 cm de paso de luz.) El rendimiento teórico de
oligonudeótido se calcula multiplicando la escala de síntesis por la longitud
del oligonudeótido y finalmente este producto por 10, tal como se puede ver en
el siguiente problema.
7.1 Rendimiento de la síntesis 157
P ro b le m a 7.2 Se sintetiza un oligo de 22 mer en una columna de

escala de 0,2 (¿mol. ¿Cuál es el rendimiento máximo teórico de oligo en
unidades DO?
S o lu c ió n 7.2
El rendimiento máximo teórico de oligo se obtiene por la siguiente ecuación:
_, , 0,2 iim ol de base 10 unidades DO ,

22 bases añadidas x —¡------- -— —— x ------ — —;------= 44 unidades DO
, _
base añadida îmol de base
Por lo tanto, se sintetizarán 44 unidades DO de oligonucleótido.
Sin embargo, las reacciones químicas para la síntesis de ácido nucleico no tienen
una eficiencia del 100%. Ningún instrumento, por muy bien diseñado que esté o
por la pureza de los reactivos que utilice, puede alcanzar el rendimiento teórico
en la síntesis de oligonucleótidos. El rendimiento real de los productos de
síntesis será menor del esperado. La Tabla 7-1 muestra el rendimiento
de oligonucleótido que se puede esperar a partir de diferentes columnas una
vez se haya optimizado el proceso de síntesis.
Tabla 7-1 El rendim iento aproxim ado, en unidades DO, de

oligonucleótido por base para cada una de las escalas de síntesis
habituales
Escala de sín tesis U nidades DO/Base
40 nmol 0,25-0,5
0,2 nmol 1,0-1,5
1 nm oi 5
10 (imol 40
P ro b le m a 7.3 En una columna de una escala de 0,2 ^mol, se sintetiza un

oligonucleótido de 22 mer. Asumiendo que el proceso de síntesis se ha
optimizado, ¿cuántas unidades DO se pueden esperar?
S o lu c ió n 7.3
Utilizando el valor de unidades DO/base de la Tabla 7-1 para una columna de
una escala de 0,2 (jrnol obtenemos las siguientes ecuaciones:
1 unidad DO . . . __
22 bases x -----¡--------- = 22 unidades DO
base
158 CAPÍTULO 7 Síntesis de oligonucleótidos
1,5 unidades DO , ________

22 bases x ------- ¡------------= 33 unidades DO
base
Por lo tanto, esta síntesis produce entre 22 y 33 unidades de DO de

oligonucleótido.
7.2 C Á L C U L O D E L R E N D IM IE N T O G R A D U A L
Y G L O B A L P O R M E D IO D E L E N S A Y O D E L C A T IÓ N
D I M E T O X I T R IT IL O (D M T )
E l r en d im ien to glo b a l e s la ca n tid a d d e pro d u c to co m p leto sintetizado. P o r el
contrario, el ren d im ien to g ra d u a l es la m e d id a d el p o rc en taje d e m oléculas
d e ác id o nu cle ic o en la c o lu m n a d e síntesis q u e se acoplan en ca d a p aso de
adición d e u n a b ase. S i los reactiv o s y el s in te tiz ad o r d e AJDN están aju stad o s
d e fo rm a ó p tim a ca b e esp e rar u n ren d im ien to d el 9 8% en c a d a paso . E n este tipo
d e síntesis, el 2 % d e las m o lécu la s q u e no p artic ip a n en la reacción d e ac o p la
m iento d eben s e r b lo q u ea d as y no d eb e n e s ta r d isp o n ib le s p ara los siguientes
cic lo s d e reacción. C o m o en ca d a ciclo h a y u n 2 % m en o s d e m oléculas q u e pu ed e n
re acc io n ar co n la fo sforam idita, el re n d im ien to es ca d a v e z m en o r cuanto m a y o r es
la long itu d d el olig o sintetizado.
E l g ru p o tritilo p ro teg e al g ru p o h id ro x ilo 5' del a z ú ca r rib o sa d e la
b a s e añ a d id a m ás recien tem e n te , ev itan d o q u e particip en en reacciones sec u n
darias no deseadas. A n tes d e la a d ic ió n d e la sig u ien te base, el g ru p o tritilo se
elim in a p o r m edio d e u n trata m ie n to co n T C A . L a d estritilació n d e ja el
gru p o h id ro x ilo 5' d isp o n ib le p a ra la re acc ió n c o n la fo sfo ram id ita siguiente.
C u an d o se elim in a en co n d ic io n e s ácidas, el g ru p o tritilo tien e u n característico
c o lo r n aran ja brillante. Se p u ed e a d a p tar u n co le cto r d e fracciones al sintetizador
p a ra re co lec ta r c a d a fracción d e tritilo , y a q u e s e lava, d e la c o lu m n a d e síntesis,
e n ca d a p aso d e destritilación. L as fracc io n es re co g id as se p u ed e n diluir
c o n ácido p -m e tilb en c en su lfó n ico m o n o h id rato en ac eto n itrilo y se v alo ra la
a b so rb an cia a 49 8 nm . (P ara u n a m a y o r pre cisió n , p u e d e n se r necesarias p o ste
riores d ilu cio n es p a ra m an ten e r las lec tu ras entre 0,1 y 1,0, d en tro d el rango de
ab so rció n lineal.)
P ara los sig u ien tes cá lcu lo s, la p rim era fracc ió n d e tritilo, q u e se h a gen e rad o a
p a rtir de la co lu m n a d e b ase s 3 ', n o se d eb e utilizar, y a q u e p u ed e d a r u n a lectura
varia b le en fu n c ió n d e la integridad d el g ru p o tritilo so b re la b a s e d e soporte.
P u ed e s u ce d er u n a destritilación esp o n tán e a d e la b a se d e la c o lu m n a antes de
la síntesis, d an d o co m o resultado u n a b a ja ab so rció n d e la p rim era fracción. L a
in clu sió n d e esta fracc ió n en el cálcu lo d el ren d im ien to glo b al d aría lu g a r a u n a
sob re stim ac ió n del ren d im ien to d el producto.
7.2 Cálculo del rendimiento gradual y global por medio del ensayo del catión dimetoxitritilo (DMT) 159
7.2.1 R e n d im ie n to g lo b al
E l ren d im ien to g lo b al, la m e d id a del pro d u c to to tal sintetizado, v ien e dad o p o r la
fórm ula
. a b so rb an cia del tritilo d e la últim a b a s e añ a d id a

ren d im ien to g lo b al — —----- ------- :— —— — — -—------- ;-------- ----------, x 100
a b so rb an cia del tn tilo d e la p rim era b a s e añ a d id a
P ro b le m a 7 .4 Se sintetiza un oligo de 18 mer en una columna de 0,2 |xmol.

El ensayo de las fracciones de tritilo dan los siguientes valores de absorbancia a
498 nm. ¿Cuál es el rendimiento global?
Número Base Absorbancia
1 Columna C 0,524
2 G 0,558
3 T 0,541
4 A 0,538
5 A 0,527
6 C 0,515
7 T 0,505
8 G 0,493
9 G 0,485
10 C 0,474
11 A 0,468
12 T 0,461
13 T 0,452
14 T 0,439
15 C 0,427
16 G 0,412
17 A 0,392
18 A 0,379
S o lu c ió n 7.4
Utilizando la ecuación para el rendimiento global, obtenemos
0,379
rendimiento global = ------ x 100 = 68%
a 0,558
Por lo tanto, el 68% de las bases iniciales de la columna tienen el producto

completo; el rendimiento global es del 68%.
160 CAPÍTULO 7 Síntesis de oligonucleótidos
7.2.2 R e n d im ie n to g ra d u a l
E l ren d im ien to g radual, el p o rc en taje d e m o lécu la s aco p lad as en c a d a cic lo de
adición d e u n a b ase , se ca lcu la p o r m ed io d e la fórm ula
ren d im ien to gra d u al — (rendim iento g lo b al) lâcoplamientos
E l nú m ero d e ac o p lam ien to s está represe n ta d o p o r el nú m ero d e fracciones

tritilo n ec esarias p a ra c a lcu lar el ren d im ien to glo b al m en o s u n a. (S e re s ta u n a
po rq u e la fracc ió n d e tritilo d e la p rim era b a se ac o p lad a a la b a s e d e la co lu m n a
pu ed e se r u n in d icad o r p o co fiable de la efic ac ia d e ac o p lam ien to re al en e s e paso.)
U n a síntesis eficiente ten d rá u n ren d im ien to gra d u al d e 98 ± 0,5% .
U n re n d im ie n to g ra d u al b a jo p u e d e in d ic a r p ro b le m a s d e re activ o s, y a
s e a p o r su c a lid a d o p o r su p re se n ta c ió n . S in em b a rg o , in clu so si s e o b tien e
u n re n d im ie n to g ra d u al e le v ad o , el p ro d u c to p u e d e n o s e r d e la c a lid a d d e s e a d a
d e b id o a q u e alg u n o s fa llo s d e sín te sis n o s o n d e te c ta b le s m ed ian te el e n sa y o
d e tritilo.
P ro b le m a 7.5 ¿Cuál es el rendimiento gradual en la síntesis descrita en el

Problema 7.4?
S o lu c ió n 7.5
En el Problema 7.4, se obtiene un rendimiento global del 68%. Se han
utilizado los valores de absorbancia de 17 fracciones de tritilo para calcular
el rendim iento global. Utilizando la ecuación para el rendimiento gradual, se
obtiene
rendimiento gradual = 0,681/17_1 = 0,681/16 = 0,68006 = 0,98
(Se calcula 0,68°'°6 tecleando en una calculadora „ 6, 8, xy, „ 0, 6 e =.) El

rendimiento gradual habitualmente se expresa como un valor en porcentaje:
0,98 x 100 = 98%
Por lo tanto, el rendimiento gradual es del 98%.

Asumiendo un rendimiento gradual del 98%, es posible calcular el rendimiento
global para cualquier longitud del oligonucleótido utilizando la fórmula
rendimiento global = o ,9 8 (número de bases_1) x 100

7.3 Cálculo de los micromoles de nucleósido acoplado en cada ciclo de adición de una base 161
P ro b le m a 7 .6 Se utilizan reactivos nuevos para sintetizar un oligonucleótido

de 25 mer. Asumiendo un rendimiento gradual del 98%, ¿qué rendimiento
global podemos suponer?
S o lu c ió n 7.6
La fórmula anterior da lugar a la siguiente ecuación:
rendimiento global = 0,98(25-1) x 100 =0,9824 x 100 = 0,62 x 100 = 62%
(Se calcula 0,9824 tecleando en una calculadora , (coma de decimales), 9, 8, x y,

2, 4 e =.)
Por lo tanto, podemos esperar un rendimiento global del 62%.
P ro b le m a 7.7 Asumiendo un rendimiento gradual del 95%, ¿cuál es el

rendimiento global esperado en una síntesis de un oligonucleótido de 25 mer?
S o lu c ió n 7.7
Utilizando la misma fórmula, obtenemos
rendimiento global = 0,95(2S~1) x 100 = 0,9524 x 100 = 0,29 x 100 = 29%
Por lo tanto, se puede esperar un rendimiento global del 29% para un

oligonucleótido de 25 mer cuando el rendimiento gradual es del 95%.
(Hay que prestar atención a que una bajada del rendimiento gradual del
98% [Problema 7.6] al 95% [Problema 7.7] supone un descenso muy acusado
del rendimiento total del 62 al 29%. Para obtener una óptima síntesis de pro
ducto son esenciales un instrumento y unos reactivos de la máxima calidad.)
7.3 C Á L C U L O D E L O S M IC R O M O L E S
D E N U C L E Ó S ID O A C O P L A D O EN C A D A C IC L O
D E A D IC IÓ N D E U N A B A S E
L o s e n sa y o s tritilo d e c a d a fra c c ió n se p u e d e n u tiliz a r n o sólo p a ra estim ar
lo s re n d im ie n to s g ra d u a le s y g lo b ales, sin o tam b ié n p a ra d e te rm in a r el nú m ero
d e m icro m o les d e n u c le ó sid o a ñ a d id o a la c a d e n a d e o lig o n u c le ó tid o s en
c u a lq u ie r e ta p a d e ac o p lam ien to . E l n ú m e ro d e m ic ro m o le s d el ca tió n
D M T liberados y el nú m ero d e m icrom oles d e n u cleósidos añadido son eq u iv a
lentes. L o s m icrom oles d e D M T s e pu ed en ca lcu lar divid ien d o la ab sorbancia
162 CAPÍTULO 7 Síntesis de oligonudeótidos
a 49 8 d e u n a fracción d e tritilo entre el coeficiente d e extinción d el D M T de

acuerdo c o n la fórm ula
A aos x v olum en x fa cto r d e dilución

n m o l d e D M T = ------------------------------------------------------
e
do n d e A49%es la a b so rb an cia d e la fracc ió n d e tritilo a 49 8 nm , el v o lu m en es el

v o lu m en final d el D M T d ilu id o u tilizado p a ra la lec tu ra a A49S, el fa cto r de
dilu ció n es el inverso d e la dilu ció n (si se h a re alizad o ) d e la fracc ió n d e tritilo
en u n s eg u n d o tu b o d e 0,1 M d e ác id o to lu en o su lfó n ico en ac eto n itrilo y
e = 7 0 m L /p m o l, el coe ficien te d e ex tin ció n d el ca tió n D M T a 49 8 nm .
P ro b le m a 7.8 Una fracción de tritilo de una síntesis 0,2 nmol se diluye hasta
los 10 mL con ácido tolueno sulfónico monohidrato 0,1 M en acetonitrilo y se
valora su absorbancia a 498 nm. Se obtiene un valor de 0,45. ¿Cuántos
micromoles de nucleósido se acoplan en cada ciclo?
S o lu c ió n 7.8
La fracción de tritilo se diluye hasta un volumen de 10 mL y esta muestra es
valorada para medir la absorbancia. No se realiza una segunda dilución.
Utilizando la fórmula anterior, obtenemos
, ^ 0,45 x 10 mL
iim ol de DMT = ------ —----- - = 0,06
70 mL/nmol
Por lo tanto, como los micromoles de DMT son equivalentes a los micromoles
de nucleósido añadidos, en cada ciclo de acoplamiento se añaden 0,06 nmol de
nucleósido representado por esta fracción de tritilo.
L os olig o n u d eó tid o s son pequeñas m oléculas sintéticas d e A D N cs utilizadas com o
sondas, cebadores o co m o elem entos base p ara cadenas d e A D N m ás largas. L a
reacción quím ica m ás habitual para la síntesis d e olig o n u d eó tid o s utiliza el m étodo
d e la fosforam idita, en el que la construcción d e la ca d en a d e n t se inicia en una
colum na q u e llev a la p rim era base 3 '. S uponiendo u n a eficiencia d e síntesis del
100% , la cantidad d e o lig o n u d eó tid o sintetizado en u n a co lu m n a está re lacionada
con la cantidad d e b ase s 3' cargadas o riginalm ente en la co lu m n a y co n la longitud
del o lig o n u d eó tid o que se sintetiza. E sta cantidad se calcula m ediante la expresión
escala d e la co lu m n a (en nm ol)

nm ol d e o h g o = b ase s añadidas x ----------- — —— -—------------------
ad ició n d e b ase
E l ren d im ien to teórico m áx im o d e o lig o n u cleó tid o (en u n id ad e s D O ), su p o

nien d o u n 100% d e efic ien cia en e l ac o p lam ien to d e ca d a base , se o b tien e p o r la
sig u ien te expresión:
esc ala d e la c o lu m n a (e n nm ol)

un id ad e s D O — b ase s añadidas x -------------- ——— -—-------------------
a d ic ió n d e base
10 u n id ad e s D O
n m o l d e base
L a síntesis g lo b al se ca lcu la com o
. abso rb an cia d el tritilo d e la ú ltim a b a s e añ a d id a

ren d im ien to g lobal — —----- ------- ;— — — — — -—------- :-------- ----------„ x 100
abso rb an cia d el tn tilo d e la p rim era b a s e añadida
E l ren d im ien to g radual, el po rc en taje d e m o lécu la s aco p lad as a ca d a cic lo de

a d ic ió n d e b ases, se ca lcu la d e la sig u ien te fo rm a
ren d im ien to gra d u al — (ren d im ie n to g lo b a l) 1/ acoplamientos
C u an d o el ren d im ien to gra d u al es in ferio r al 100% , el ren d im ien to to tal se

p u ed e ca lcu lar co m o
ren d im ien to g lobal = re n d im ien to g ra d u al11'*®"'* dcl “"s”- 1’ x 100
E l n ú m ero d e \xM d e n t añ a d id o s en ca d a ciclo d e ac o p lam ien to se ca lcu la de la

sig u ien te fo rm a
^498 x v o lu m en x fa cto r d e dilu ció n

n m o l d e D M T — -------------------------------------------------------
e
do n d e ^498 es la a b so rb an cia d e la fracc ió n d e tritilo a 49 8 nm , el v o lu m en es el

v o lu m en final d el D M T d ilu id o u tiliz ad o p a ra la lec tu ra a A 49%, el fa cto r de
dilu ció n es el in v erso d e la dilu ció n (si se h a re alizad o ) d e la fracc ió n d e tritilo
en u n seg u n d o tu b o d e 0,1 M d e ácido to lu en o su lfó n ico en acetonitrilo, y
e = 7 0 m L /n m o l, el coe ficien te d e ex tin ció n d el ca tió n D M T a 49 8 nm .
Capítulo
Reacción en cadena
de la polimerasa (PCR)
L a reacción en cad en a d e la polim erasa (P C R ) es u n m étodo p ara la am plifica
ción d e u n segm ento específico d e ácido nucleico. U n a P C R típ ic a contiene u n ácido
n ucleico m olde (A D N o A R N ), u n a polim erasa d e A D N co n estabilidad térm ica,
lo s cuatro deoxinucleósidos trifosfato (dN T P), m agnesio, oligonucleótidos ceba
dores y u n tam pón. E l p roceso d e am plificación im plica tres p asos: 1) E n u n p aso
d e desn atu ralización , el ácido nucleico m olde pasa a se r d e u n a so la ca d en a
m ediante la exposición a u n a tem peratura ele v ad a (92-98 °C ). 2 ) L a tem peratura
d e la reacción se b a ja a entre 65 y 7 2 °C en u n p aso conocido com o hibrid ación ,
m ediante el cual los d os cebadores se un en a las cadenas opuestas d el m olde
d esnaturalizado d e m anera que sus extrem os 3' qu ed a n dirigidos un o h ac ia el otro.
3 ) E n el p aso final, d enom inado exten sión , u n a polim erasa co n estabilidad térm ica
añade dN T P a los extrem os 3 ' d e los d os cebadores hibridados d e m an era q u e se
p roduce u n a re plicación d e la ca d en a a lo largo d e la región com prendida entre los
p untos de hibridación d e los cebadores, incluyendo a éstos. E stos pasos constituyen
u n ciclo y son repetidos u n a y otra v e z de 25 a 4 0 veces, dependiendo d e la aplica
ción específica.
L a P C R es u n a téc n ic a m u y p o ten te y es u tiliz ad a p a ra u n am plio rango de
aplicaciones. P o r c ita r sólo u n as cu a n tas, se u s a p ara e x a m in a r evidencias b io
ló g icas en casos forenses, p ara identificar m icro o rg an ism o s co n tam in an tes en
alim entos, p a ra d ia g n o sticar en ferm ed ad es genéticas y p a ra s itu a r g en e s en seg
m en to s cro m o só m ico s específicos.
8.1 M O L D E Y A M P L IF IC A C IÓ N
U n o d e los m otivos p o r lo s cu a les se u tiliz a la téc n ic a de P C R d e fo rm a ta n am plia
es el h e c h o d e q u e se requiere sólo u n p o co d e m o ld e d e A D N inicial p ara la
am plificación. E n aplicaciones forenses, p o r ejem plo, se p u ed e n o b ten e r resulta
d os a p a rtir d el A D N re cu p erad o d e u n ún ico pelo o d e saliv a resid u a l p re sen te en
u n so b re d e co rrespondencia. L as P C R típ ic as q u e se llev an a ca b o en el análisis
forense u tiliz an sólo d e 0,5 a 10 n g d e A D N .
166 CAPÍTULO 8 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
P ro b le m a 8.1 Veinte nanogramos de ADN genómico humano son

necesarios para una PCR. La solución stock del molde se encuentra a una
concentración de 0,2 mg ADN/mL. ¿Cuántos microlitros de la solución stock
deberían utilizarse?
S o lu c ió n 8.1
Se utilizan factores de conversión para llevar cantidades de mg y mL a cantida
des de ng y |xL, respectivamente. La ecuación puede ser representada de
la siguiente manera:
0,2 mg de ADN 1 mL 1 x 1 0 6 ng
—----- - x --------- =— x ------------- - x x u,L = 20 ng de ADN
mL 1 x 103 m,L mg
Escribiendo la ecuación de esta forma, algunos términos se cancelan unos a

otros de modo que la ecuación se reduce a ng = ng. La multiplicación y la
resolución de la x dan lugar a la siguiente relación:
(2 x 105 ng de ADN) (x ) Los valores del numerador

1 x 1q3 — 20 ng de ADN SQn mu|t¡p|¡Cados entre sí,
al igual que ocurre con los
valores del denominador.
(2 x 10s ng de ADN) (x ) = 2 x 104 ng de ADN Multiplicar ambos lados de

la ecuación por 1 x 103.
Dividir ambos lados de la

c 105 ng de ADN ' ecuación entre 2 x 1 0
ng = ADN.
Por lo tanto, 0,1 jxL del ADN genómico humano a una concentración de
0,2 mg/mL contendrán 20 ng de ADN. A menudo ocurre que un cálculo como
éste da como resultado una cantidad que no puede ser medida adecuadamente
con el equipamiento convencional de laboratorio. La mayor parte de las pipetas
de laboratorio no pueden dispensar 0,1 j i l con una precisión aceptable. Por este
motivo, debería hacerse una dilución del stock para adaptarla a los límites
de precisión de las pipetas disponibles. La mayoría de laboratorios disponen de
pipetas que pueden dispensar 2 |iL con precisión. Podemos hacer la pregunta,
«¿en qué volumen podemos diluir 2 |xL de la solución stock para que 2 (xL de la
nueva dilución contengan 20 ng de ADN?» La ecuación para este cálculo se
representa de la siguiente manera:
0,2 mg de ADN 1 mL 1 x 106 ng 2 u,L , , _ ,

— ------------v v ~ —— x 2 nL = 20 ng de ADN
mL 1 x 103 |xL rng *
8.2 Amplificación exponencial 167
8 x 105 ng de ADN
= 20 ng de ADN Eliminar términos y multiplicar los
(1 x 103)(x)
valores del numerador y
denominador.
ecuación por x y despejar la x.
800 ng de ADN = (20 ng de ADN)x Simplificar la ecuación.
800 ng de ADN
— — = x = 40 Dividir cada lado de la ecuación entre
20 ng de ADN
3 90 nn H e AHN
Por tanto, si se diluyen 2 p,L de ADN stock en un volumen total de 40 (iL

(2 p,L stock ADN + 38 jd- agua), entonces 2 n,L de esta dilución contendrán
20 ng de ADN molde.
8.2 A M P L IF IC A C IÓ N E X P O N E N C IA L
D urante el pro c eso d e P C R , el p ro d u c to d e u n cic lo sirv e co m o m olde p ara el
sig u ien te ciclo. E s ta ca rac terística p ro p o rcio n a a la P C R la cap ac id a d de am plificar
u n a ú n ic a m o lécu la en m illones d e copias. L a P C R es u n pro c eso q u e tien e lu g a r
d e fo rm a ex p o n en cial. L a am plificación del m o ld e p ro g resa a ra zó n d e 2", d o n d e n
es igual al nú m ero d e ciclos. L o s pro d u c to s de P C R se den o m in an am p licon es. El
seg m en to am plificado d e A D N se llam a d ian a.
P ro b le m a 8.2 Una única molécula de ADN es amplificada por PCR durante

25 ciclos. Teóricamente, ¿cuántas moléculas de amplicón se generarán?
S o lu c ió n 8.2
Considerando que la amplificación total es igual a 2n, donde, en este caso, n es
25, se obtiene el siguiente resultado:
amplificación total = 225 = 33.554.432
Así, pues, se generarán más de 33 millones de amplicones.

P ro b le m a 8.3 Partiendo de 600 moléculas de ADN molde, ¿cuántos

amplicones se generarán después de 25 ciclos de PCR?
S o lu c ió n 8.3
Dado que cada molde puede estar sujeto al proceso de amplificación por PCR, se
debería multiplicar 225 por 600:
amplificación total = 600 x 225 = 2 x 1010 moléculas
Por lo tanto, la amplificación de 600 moléculas diana en una PCR de 25 ciclos

debería producir, teóricamente, 2 x 1010 moléculas de producto amplificado.
P ro b le m a 8 .4 Si la PCR mencionada en el Problema 8.2 se lleva a cabo en una

reacción de 100 (d., ¿cuántas moléculas de producto amplificado estarán
presentes en 0,001 [xL?
S o lu c ió n 8.4
Se puede establecer una relación que diga que «2 x 1010 amplicones son a
100 jíL lo mismo que x amplicones a 0,001 |j,L».
2 x 1010 amplicones x amplicones

100 (íL - 0,001 |xL
2 x 1010 amplicones (0,001 li L)
----------- -— ---------- - = x amplicones
100 |_lL k
x = 2 x 105 amplicones
Así, 2 x 105 amplicones están presentes en 0,001 ^L.
N ota sobre el control de contam inación: Tal com o se m uestra en el P roblem a 8.4,
vo lú m en es m u y peq u e ñ o s d e u n a P C R p u ed e n co n te n e r gra n d es cantidades de
pro d u c to . P o r este m o tiv o , lo s laboratorios q u e utiliz an la P C R d eb e n to m ar
pre cau c io n es p a ra e v itar la co n ta m in a ció n d e u n a reacción n u ev a c o n p roducto
de u n a reacción anterior. Incluso can tid a d es d e pro d u c to d e P C R p re sen tes en un
ae ro so l form ado d u ra n te la ab e rtu ra d e u n tu b o d e re acc ió n s o n su ficie n te s p ara
co la p sa r u n a n u e v a reacción. L a co n ta m in a ció n d el lu g a r d e trabajo co n p roducto
am p lifica d o es p articularm ente p re o cu p an te en instalaciones q u e am p lifican el
m ism o locus (o loci ) u n a y o tra v ez , co m o es el ca so d e laboratorios d e análisis
fo ren ses y d e paternidad.
8.2 Amplificación exponencial 169
P ro b le m a 8.5 Cien nanogramos de un fragmento de 242 pb es generado por

PCR. Dos nanogramos de ADN genómico humano son utilizados como molde
inicial. ¿Qué cantidad de amplificación tiene lugar?
S o lu c ió n 8.5
El primer paso en la resolución de este problema es determinar cuántas copias
representa una cantidad particular de ADN (en este caso, 2 ng de ADN genómico
humano). Asume que la secuencia diana está presente en forma de una sola
copia en el genoma. Aunque hubiera dos copias de la secuencia diana en todas
las células humanas (exceptuando óvulos, espermatozoides y glóbulos rojos),
existiría una copia en el genoma humano haploide. El genoma humano
haploide consiste en aproximadamente 3 x 109 pb. Por lo tanto, existe una
copia de la secuencia diana por 3 x 109 pb. El peso molecular de un pb
(660 g/M) y el número de Avogadro pueden ser utilizados para convertir este
valor en una cantidad de ADN por copia génica. Dado que esta cantidad será
bastante pequeña, la respuesta puede ser expresada en picogramos por
conveniencia:
3 x 109 pb 660 g 1 mol pb 1 x 1012 pg _ 3,3 pg

copia mol pb 6,023 x 1023 pb g copia
Así pues, 3,3 pg de ADN genómico humano contienen una copia de la secuencia
diana.
El número de copias de la secuencia diana presentes en 2 ng de ADN genómico
humano puede ser ahora determinado:
1 x 103 pg 1 copia
2 ng x --------------- x --------- = 600 copias
ng 3,3 pg
Por tanto, 2 ng de ADN genómico humano molde contienen 600 copias de

la secuencia diana.
Mediante un método similar, el peso de una copia de producto de 242 pb puede
ser determinado de la siguiente manera:
242 pb 660 g 1 mol pb 1 x 1012 pg _ 2,7 x 1027 pg

copia mol pb 6,023 x 1023 pb g copia
Así pues, un fragmento de 242 pb (que representa una copia de producto de

PCR) tiene un peso de 2,7 x 10-7 pg.
El número de copias de un fragmento de 242 pb representado por 100 ng de

dicho fragmento puede ser determinado a continuación:
1 x 1 0 3 pg copia ,,
100 ng x --------- — x ------- — = 3,7 x 1011 copias
ng 2,7 x 10 pg
Así, hay 3,7 x 1011 copias del producto de PCR de 242 pb en 100 ng.
Se puede calcular ahora la cantidad de amplificación dividiendo el número de
copias de la secuencia diana al final de la PCR entre el número de copias de la
diana presentes en la muestra molde inicial de ADN:
3,7 x 1011 copias

--------------- -— = 6,2 X 10a
600 copias
Es decir, la PCR genera un aumento de 6,2 x 108 veces en la cantidad de

fragmento de ADN amplificado.
8.3 E F IC I E N C IA D E L A R E A C C IÓ N EN C A D E N A
D E L A P O L IM E R A S A (P C R )
L a fó rm u la 2" u tiliz ad a p a ra ca lcu lar la am p lifica ció n p o r P C R pu ed e usarse para
d esc rib ir cu a lq u ie r siste m a q u e tien e lu g a r a trav é s d e su cesos d e d u p licac ió n , en
lo s cuales 1 d a lu g a r a 2 , 2 d a lu g a r a 4 , 4 a 8, 8 a 16, 1 6 a 3 2 , etc. E sta relación
d escrib e a la P C R si la reacción es efic ien te a l 100% . N in g u n a re acc ió n d esarro
llad a en u n tu b o d e análisis ten d rá u n a efic ien cia del 100% . P a ra re p rese n ta r la
re alid ad d e fo rm a m ás ap ro p ia d a, la relación d eb e r se r m o d ificad a te n ien d o en
cu e n ta la efic ien cia re al d e la reacción. A sí, la ecu ac ió n q u e d a co n v e rtid a en
Y = (l+ E )n
do n d e Y es el grado d e am p lificació n , n e s e l n ú m ero d e cic lo s y E es la efic ien cia

m ed ia d e am p lifica ció n en c a d a ciclo; el p o rc en taje d e pro d u c to d e u n cic lo que
sirv e co m o m o ld e p a ra el s ig u ie n te ciclo.
L a pérdida d e eficiencia d e am plificación pu ed e ocurrir p o r diferentes m otivos,
incluyendo la pérd id a de actividad d e la enzim a A D N polim erasa, la depleción de
reactivos y la desnaturalización incom pleta del m olde, tal co m o ocurre cuando la
cantidad d e p roducto aum enta en los ciclos m ás tardíos. L a eficiencia d e am pli
ficación puede se r determ inada experim entalm ente tom ando u n a peq u eñ a alícuota
d e la P C R al principio y al final d e cada ciclo (a partir del tercer ciclo) y som etiéndola
8.3 Eficiencia de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 171
a electroforesis en u n gel. E n otros carriles d e ese gel se corren m uestras estándar que
contienen núm eros conocidos d e m oléculas. L as intensidades d e las b andas (deter
m inadas m ediante tinción o densitom etría) son com paradas p ara su cuantificación.
L a eficiencia, expresada co m o decim al, es el núm ero d e copias al final d e u n ciclo
dividido entre el núm ero de copias al principio d e dicho ciclo.
P ara ten e r en consideración el m olde d e p artid a en u n a P C R (representado p o r .Y),
la ecuación se transform a en
Y = X ( 1 + E )n
E l u s o de esta relación re q u ie re la co m p re n sió n de lo g aritm o s y antilogaritm os.

U n logaritm o com ú n , co m o el q u e será u tiliz ad o aq u í, se d efin e c o m o el ex p o
n en te q u e in d ic a la s v ec es a las q u e 10 d e b e se r elevado p a ra pro d u c ir u n núm ero
d eterm inado. U n an tilo g a ritm o se co n sig u e inv irtie n d o el pro c eso u sad o p ara
ca lcu lar el logaritm o de u n núm ero; p o r ejem plo, s i j ' = lo g x, entonces x = antilogy.
A n tes d e q u e esta ecuación p u e d a se r convertida a u n a fo rm a m ás útil, se deben
m encionar dos leyes sobre lo s logaritm os: la regla del p rod ucto p ara logaritm os
y la regla d e la p oten cia p ara logaritm os. (E n e l C apítulo 3 se pu ed e encontrar
m ás inform ación sobre logaritm os.)
Regla del producto para logaritmos: Para núm eros positivos M ,N ya (d o nde o
no es igual a uno), el logaritm o d e un producto es la sum a d e los logaritmos d e los
factores.
loga MN = logfl M + \oga N
Regla de la potencia para logaritmos: Para núm eros positivos M y a (donde a

no es igual a uno), el logaritm o d e una potencia de M es el expo nente m ulti
plicado por el logaritm o de M.
loga Mp = p log a M
L a ecu ac ió n Y = X ( 1 + E )n p u ed e ah o ra se r re p rese n ta d a d e fo rm a q u e perm itirá

cá lcu lo s m ás directos de asp e cto s im portantes en u n a P C R . A p lica n d o el logaritm o
co m ú n a am b o s lad o s d e la ecu ac ió n y u san d o las R eg las d el P roducto y d e la
P o te n cia p ara L ogaritm os ob ten em o s
lo g 7 = \o%X + n lo g (1 + E)
E sta es la v ersió n d e la ecu ac ió n q u e p u e d e se r u tiliz ad a p a ra ca lcu lar el

ren d im ien to d e p ro d u c to o el n ú m ero d e cic lo s q u e s e n ec esitan p ara generar
cie rta ca n tid a d d e p ro d u c to a p artir d e u n a co n c en tra ció n d e m o ld e inicial.
P ro b le m a 8.6 Se somete a PCR una alícuota de ADN molde que contiene

3 x 105 copias de un gen diana. La reacción tiene una eficiencia media del 85%.
¿Cuántos ciclos se requieren para generar 2 x 1010 copias?
S o lu c ió n 8.6
Para la ecuación Y = X(1 + E )n,Y = 2 x 1010 copias, X = 3 x 105 copias y E = 0,85.
Colocando estos valores en la ecuación se obtiene la siguiente relación:
2 x 1010 = (3 x 105)(1 + 0,85)"
c 1010 „ Dividir cada lado de la ecuación entre

r = 1,85" 3 x 105.
3 x 105
6.7 x 104 = 1,85" Simplificar el lado izquierdo de la ecuación.
log 6,7 x 104 = log 1,85" Aplicar el logaritmo común sobre ambos
lados de la ecuación.
log 6,7 x 104 = nlog 1,85 Utilizar la regla de la potencia para

logaritmos.
log 6,7 x 104 Dividir ambos lados de la ecuación entre

log 1,85 = n logaritmo 1,85.
4.8 _ n _ ^^ g Sustituir los valores logaritmo en

0,27 ' el denominador y numerador. (Para obtener
el logaritmo de un número con una
calculadora, introducir ese número
y presionar la tecla log.)
Así, se necesitarán 18 ciclos para producir 2 x 1 0 copias de amplicón par

tiendo de 3 x 105 copias de molde.
P ro b le m a 8.7 Una amplificación por PCR se lleva a cabo durante 25 ciclos.

3 x 105 copias de la secuencia diana inicial estaban presentes en la reacción. Al
final de los 25 ciclos, se han generado 4 x 1012 copias. ¿Cuál es la eficiencia (E)
de la reacción?
S o lu c ió n 8.7
Utilizando la ecuación / = X(1 + £ )”, / = 4 x 1012 copias, X = 3 x 105 copias
y n = 25, la ecuación se transforma en
4 x 101! = (3 x 10s) ( l + E ) 25
8.4 Cálculo de la Tm de la secuencia diana 173
1,3 x i o 7 = ( i + E)25 Dividir c a d a lado d e la ecu ac ió n e n tre

3 x 105 y simplificar.
log 1,3 x 107 = log(1 + £ ) 25 Aplicar el logaritm o a a m b o s lados d e
la ecuación.
log 1,3 x 107 = 25 log(1 + E) Usar la regla d e la p o ten c ia para
logaritm os.
7,1 = 25 log(1 + E) Sustituir el logaritm o d e 1,3 x 10 7

en la ec u ac ió n . (El logaritm o
d e 1,3 x 10 7 se o b tie n e co n una
ca lculadora in tro d u cien d o
1, „ 3, EXP, 7, log.)
^ = log (1 + E) Dividir ca d a lado d e la ecuación e n tre

25 y sim plificar el lado izquierdo
d e la ecuación.
0,28 = log(1 + E)
a ntilog 0,28 = antilog [log(1 + £)] O b te n e r el an tilo g aritm o d e cada

lado d e la ecuación.
a ntilog 0,28 = 1 + E
1.91 = 1 + £ Para o b te n e r el an tilo g aritm o d e
0,28 co n la calculadora, introducir
10,xy, 0,28 e =.
1.91 - 1 = E Restar 1 a am b o s lados d e la ecuación.
0,91 - E
Por lo ta n to , la PCR tie n e una eficiencia del 91% (0,91 x 100 = 91%).
8.4 C Á L C U L O D E L A T m D E L A S E C U E N C IA D IA N A
L a T m ( t e m p e r a t u r a d e fu s ió n ) del A D N cd es la tem p eratu ra a la cual la m itad de
la m o lécu la se en c u en tra en u n a co n fo rm ac ió n d e ca d en a d o b le y la o tra m itad
en fo rm a d e ca d e n a sencilla. Se re co m ien d a co n o c er la tem p eratu ra d e fu sió n del
am p licó n p ara p o d e r esc o g er u n a tem p eratu ra d e d esn a tu ralizac ió n a d e cu a d a que
asegure u n a re acc ió n d e am p lifica ció n óptim a.
E l A D N se considera u n p o lia n ió n dado que p o see m últiples cargas negativas a
lo largo d e s u esqueleto carbohidrato-fosfato. L as dos cadenas del A D N , dad o que
contienen cargas sim ilares, m uestran u n a tendencia natural a repelerse m utuam ente.
E l A D N se d esnaturalizará fácilm ente en u n entorno ac uoso libre d e iones. L o s iones
d e sal co m o el sodio (N a+) y el m agnesio (M g+2), sin em bargo, pu ed e n form ar
com plejos co n las cargas negativas de los grupos fosfato del A D N y contrarrestar la
tendencia d e repulsión m u tu a d e las d os cadenas. D e hec h o , en condiciones de
ele v ad a concentración salina, pu ed e p rovocarse la hibridación entre d os cadenas
de A D N incluso si existen varias b ase s n o com plem entarias entre ellas.
L a m ay o ría de P C R co n tien e n alg u n a sal. E l clo ru ro d e po tasio (KC1) se añade
frecu e n tem en te a u n a P C R p ara au m e n ta r la actividad d e la polim erasa. E l m ag
nesio es u n co facto r d e la en z im a A D N polim erasa. E n u n a P C R , v ien e p ro p o r
cio n a d o p o r el clo ru ro d e m ag n e sio (M g C ^ ). L a p re sen cia d e iones po tasio y
m ag n e sio afecta rá a la tem p eratu ra d e fu sió n d el ácido nu cle ic o d e d o b le ca d en a
y d e b e ría se r tenido en co n sid erac ió n cu an d o se ca lc u la la Tm.
O tros fa cto re s afectan la Tm d el dú p lex d e A D N . L as m oléculas m ás largas, con
m ás p b q u e las m antienen un idas, re q u ie re n m ás en e rg ía p ara se r desnaturalizadas.
D el m ism o m o d o , la Tm se v e afecta d a p o r el co n te n id o d e G + C d el A D N . D ado
q u e las G y C fo rm an tres p u en te s d e h id ró g en o entre ellas (en co m paración con
lo s d o s p u en te s d e hid ró g en o q u e se form an e n tre A y T ), las m o lécu la s d e A D N
co n u n co n te n id o m a y o r d e G + C re q u ie re n m ás e n e rg ía (u n a tem p eratu ra m ás
ele v ad a) p a ra se r desnaturalizadas.
E n la fó rm u la desc rita p o r W etm ur y S n in sk y (19 9 5 ) p ara c a lcu lar la tem p e
ra tu ra d e fu sió n d e d ú p lex d e A D N d e gra n tam añ o se tien en e n cu e n ta dichas
consideraciones:
r . = 81,5 + 16,6 lo g [ 1 „ ] S0^ AL1] + 0,41 (% G + C ) - ^
d o n d e L = el tam añ o d el am p licó n en pb. E l % G + C se ca lcu la u san d o la fó rm u la
_ _ _ b a se s G + C en el am p licó n
% G + C = —-------- ------------ -------- — — x 100
nu m ero to tal d e bases en el am plicón
[SAL] = [K+] + 4[M g 3+]0'5
E n e s ta ú ltim a ec u ac ió n , cu a lq u ie r otro ca tió n m o n o v alen te , tal com o N a , si se

e n c u en tra en la P C R , p u ed e se r sustituido p o r K+.
E n el p ro g ram a d e am p lificació n , la tem p eratu ra d e d esn a tu ralizac ió n d eb ería
se r e sc o g id a 3-4 °C p o r en c im a de la Tm ca lcu lad a para ase g u rar así u n a ad e cu a d a
sep aració n d e las d os ca d en a s d el am plicón.
8.4 Cálculo de la Tmde la secuencia diana 175
P ro b le m a 8.8 Un p ro d u c to d e PCR d e 800 p b q u e tie n e un co n te n id o d e

G + C del 55% es sin te tiz ad o en una reacción q u e co n tie n e 50 m/W KCI y 2,5 m/W
MgCI2. ¿Cuál e s la Tm del am plicón?
S o lu c ió n 8.8
Prim ero se calcula la c o n c en tra ció n salina [SAL]. La fórm ula q u e d isp o n em o s
para ello re q u ie re q u e las co n c en tra cio n es d e K+ y Mg+2 sea n ex p resad a s en M
e n vez d e m/W. Para el KCI, e s to se calcula d e la sig u ie n te m anera:
1M
50 m/W d e KCI x ------------- - = 0,05 M d e KCI
1.000 m/W
Así, la c o n c en tra ció n d e KCI es 0,05 M.

La c o n c en tra ció n M d e MgCI2 se calcula d e la s ig u ie n te form a:
1 M
2,5 m/W d e M gCh x ------------— = 0,0025 M d e M gCh
a 1.000 m/W y
En co n se cu en c ia, la c o n c en tra ció n d e MgCI2 es 0,0025 /W.

C olocando esto s valores e n la ecuación q u e nos p erm ite calcular la concentración
salina se o b tie n e la siguiente relación:
[SAL] = [0,05] + 4 [ 0 ,0025]0,5
En la calculadora, [0,0025]0,5 se o b tie n e in tro d u cien d o 0,0025, p re sio n a n d o la

tecla xy, in tro d u cien d o 0,5 y p re sio n a n d o la tecla =.
[SAL] = 0,05 + 4(0,05)
La resolución d e e s ta ecu ac ió n n os d a el s ig u ie n te resultado:
[SAL] = 0,05 + 0,2 = 0,25
C olocando e s te valor en la ecu ac ió n d e la Tm o b te n e m o s la s ig u ie n te ecuación:
, í [0,25] 1 , . 500
Tm = 81,5 + 16,6 o g ------ L-í—¿----- r + 0 ,4 1 ( 5 5 ) --------
y L1'0 + °,7[0,25]J v ’ 800
La ecuación es sim plificada para o b te n e r la sig u ie n te relación:
Tm = 81,5 + 16,6 lo g [0,213] + 0,41 (55) - 0,63

El cálculo del logaritm o d e 0,213 (introducir 0,213 en la ca lculadora y

p re sio n a r la tec la lo g ) y la sim plificación d e la ecu ac ió n d an el sig u ien te
resultado:
Tm = 81,5 + 16,6(—0,672) + 22,55 - 0,63
Tm ~ 81,5 + (-1 1 ,1 5 5 ) + 22,55 - 0,63 = 92,3
Por ta n to , la te m p e r a tu ra d e fusión d el am p licó n d e 8 0 0 p b e s 92,3 °C.

La p ro g ram ac ió n del te rm o c ic la d o r p ara u n a te m p e r a tu ra d e d e s n a tu r a
lización d e 96 °C d e b e ría a s e g u ra r u n a d esn a tu ralizac ió n co rrec ta e n cada
ciclo.
8.5 C E B A D O R E S
L o s ce b ad o re s p a ra la P C R s e u s a n e n co n c e n tra c io n e s q u e v an d e s d e 0 ,05 a
2 | x M.
P ro b le m a 8.9 Un stock d e ce b a d o re s q u e co n siste e n d o s ce b ad o re s

necesarios para una PCR tie n e una c o n c en tra ció n d e 25 (x/W. ¿Q ué volum en
del stock d e ce b a d o re s d e b e ría se r a ñ a d id o a 100 jxL d e reacción p ara q u e
la c o n c en tra ció n d e c e b a d o re s en la reacción sea d e 0,4 jxM?
S o lu c ió n 8.9
El cálculo se d ete rm in a d e la s ig u ie n te m anera:
25 uM d e ce b a d o r x = 0,4 u,M d e c e b a d o r
^ 100 [iL r
A con tin u ac ió n se d esp e ja la x e n la ecuación.
(25 \iM)x
= 0,4 [íM
100
(25 \iM)x = 40 [iM
_ 40 [\M _
x
~ 25 [iM ~ 1'
Así, 1,6 [xL del stock d e c e b a d o re s a 25 \iM de b e ría ser a ñ a d id o a 100 [xL d e PCR
para o b te n e r u n a c o n c en tra ció n final d e ce b a d o re s d e 0,4 (x/W.
8.5 Cebadores 177
P ro b le m a 8 .1 0 Una PCR de 100 (xL contiene cebadores a una concentración

de 0,4 [iM . ¿Cuántos picomoles de cebadores hay en la reacción?
Recuerde, 0,4 \iMes equivalente a 0,4 nmol/L. Una serie de factores de conversión
se utiliza para convertir una concentración molar en una cantidad de moles:
0,4 nmol de cebador 1L 1 x 106 pmol

100 [xL
L 1 x 106hL (imol
= 40 pmol de cebador
De esta manera, existen 40 pmol de cebadores en la reacción.
P ro b le m a 8.11 Una PCR de 100 nL ha sido diseñada para producir un

fragmento de 500 pb. La reacción contiene 0,2 \iMde cebador. Asumiendo que
la reacción tiene una eficiencia del 100% y que el resto de componentes de la
reacción no son limitantes, ¿cuál es, en teoría, la máxima cantidad de producto
(en (ig) que se puede generar?
S o lu c ió n 8.11
El primer paso es calcular cuántos micromoles de cebador tenemos en la
reacción. (0,2 \iMes equivalente a 0,2 nmol/L.)
0,2 ^mol de cebador 1L

; 100 nL = 2 x 10 nmol de cebador
Por tanto, la reacción contiene 2 x 10-5 nmol de cebador. Asumiendo una

reacción con una eficiencia del 100%, cada cebador será extendido hasta formar
una cadena de ADN completa. Así, 2 x 1 0 ~ s nmol de cebador generará
2 x 10-5 p,mol de productos extendidos. Dado que en este caso el producto
tiene un tamaño de 500 pb, su peso molecular debe formar parte de la ecuación
que se utiliza para calcular la cantidad de producto total generada:
660 g/mol 1 mol : i o 6 ng

500 pb 2 x 10 5 nmol
pb < 106 nm ol
6,6 ng
En consecuencia, 6,6 ng de producto de PCR de 500 pb pueden ser sintetizados

en esta reacción.
P ro b le m a 8 .1 2 Veinte pg de un plásmido recombinante de 8.000 pb son

utilizados en una PCR de 50 (iL en los cuales, tras 25 ciclos, se genera 1 ng de un
fragmento de PCR de 400 pb. La reacción contiene 0,2 \lMcebador.
a) ¿Cuánto cebador es consumido durante la síntesis del producto?
b) ¿Cuánto cebador queda restante tras 25 ciclos?
c) ¿Cuántos ciclos serían necesarios para consumir completamente toda
la provisión de cebadores en la reacción?
Dado que los fragmentos de PCR contienen cebadores incorporados en cada
cadena a razón de un cebador por cadena de ADN, la concentración picomolar
del fragmento de PCR será equivalente a la concentración picomolar de los
cebadores. El primer paso consiste en calcular el peso molecular del fragmento
de PCR de 40 0 pb. Esto se consigue multiplicando el tamaño del fragmento por
el peso molecular de un pb:
660 g/mol 2,64 x 105 g

400 pb x -----^ ------ ------------- 2
pb mol
En consecuencia, el fragmento de PCR de 400 pb tiene un peso molecular

de 2,64 x 105 g/mol. Este valor puede ser usado a continuación en una
ecuación para convertir la cantidad producida de fragmento de 4 00 pb en
picomoles:
1g 1 mol 1 x 1012 pmol

1 ng x --------*— x —---------=— x ---------- ------- = 3,8 pmol
1 x 1 0 6 ng 2,64 x 105 g mol K
Así, 3,8 pmol de fragmento de 400 pb fueron sintetizados en la PCR. Si 3,8 pmol
de fragmento se producen, entonces 3,8 pmol de cada cebador son consumi
dos por incorporación en el producto.
S o lu c ió n 8 .12(b )
Para calcular cuánto cebador queda restante después de 25 ciclos, debemos
calcular primero con cuánto cebador iniciamos el proceso. Cada cebador se
encontraba en la reacción a una concentración de 0,2 \iM . Podemos calcular
ahora cuántos picomoles de cebador están representados en 0,2 \¡Mcebador de
la siguiente forma (recuerda que 0,2 \iMde cebador es equivalente a 0,2 nmol
cebador/L):
0,2 nmol de cebador ^ 1 x 106 pmol ^ 1L x 50 l

L X nmol x 1 x 106 nLx ^
= 10 pmol de cebador
Así pues, la reacción partió de 10 pmol de cebador. Sabemos que 3,8 pmol de
cebador son consumidos para la producción del fragmento de PCR (Solución 8.12a).
Esta cantidad se resta de los 10 pmol de cebador presentes inicialmente en la
reacción:
10 pmol - 3,8 pmol = 6,2 pmol
De esta manera, 6,2 pmol de cebador quedan sin ser incorporados tras
25 ciclos.
La solución a este problema requiere el uso de la ecuación general Y=X(1 + E)n.
Resolveremos la n, es decir, el exponente. Tal como pasaba con el resto de
componentes, a partir de la información proporcionada tenemos que determi
nar Y, el número final de copias de fragmento; X, el número inicial de moléculas
diana, y E,la eficiencia global de la reacción. El número de partida de moléculas
con secuencia diana se calcula determinando primero el peso de una copia del
plásmido recombinante de 8.000 pb:
8.000 pb 660 g 1 mol de pb _ 8 ,8 x 1 0 ~ 1sg

copia m oldepb 6,023 x 1023 pb copia
Así, cada copia del plásmido recombinante de 8.000 pb tiene un peso de

8,8 x 10-18 g. Este valor puede ser utilizado como factor de conversión para
determinar cuántas copias del plásmido recombinante están representadas en
20 pg, la cantidad inicial de molde:
g copia
20 pg x ------ — — x ------- K 1g = 2,3 x 106 copias
1 x 1012 pg 8,8 x 10 g
De esta manera, existen 2,3 x 106 copias de molde de partida.

Tras 25 ciclos, se genera 1 pg de producto de 400 pb. Para determinar cuántas
copias esto representa, el peso de una copia debe ser calculado:
400 pb 660g 1 mol de pb _ 4 ,4 x 1 0 -19g

copia m oldepb 6,023 x 1023 pb copia
En conclusión, cada fragmento de PCR de 400 pb pesa 4,4 x 10-19 g. Utilizando

este valor como factor de conversión, 1 ng de producto puede ser convertido en
número de copias de la siguiente manera:
g copia ,,
1 iig x ------^ — x -------- 1Q = 2,3 x 1012 copias
1 x 1 0 6 ng 4,4 x 10-19 g
Así, tras 25 ciclos, se generan 2,3 x 10 copias del fragmento de PCR de

400 pb.
Utilizando el número inicial de copias de molde y el número de copias de
fragmento de PCR generado tras 25 ciclos, ahora se puede calcular la eficiencia
(E)de la reacción.
2,3 x 1012 copias = 2,3 x 106 copias(1 +E)25
2.3 X 1Q162 - (1 + E)25
2.3 x 106 V '
1 x 106 = (1 + E) Dividir cada lado de la ecuación entre

2,3 x 106.
log 1 x 106 = 25 log(1 + E) Aplicar el logaritmo a ambos lados de
la ecuación y utilizar la regla de la
potencia para logaritmos.
Calcular el logaritmo de 1 x 106 (en
la calculadora, introducir 1, presionar
0,24 = log (1 +E) |a tec|a exp, introducir 6, presionar la
tecla log) y dividir cada lado de la
ecuación entre 25.
1,74 = 1 + E Aplicar el antilogaritmo a ambos
lados de la ecuación. Para calcular
el antilogaritmo de 0,24 en la
calculadora, introducir 0 ,2 4 y luego
presionar la tecla 10x.
1,74—1 = E Restar 1 a ambos lados de la ecuación
con el fin de determinar £.
Así, Etiene un valor de 0,74.

La reacción contiene 10 pmol de cebador. Diez picomoles de cebador supondrán
10 pmol de producto. El número de copias que esto representa se calcula de
la siguiente manera:
1 mol 6,023 x 1023 copias ,,

10 pmol x --------: x ---------------------- -------— = 6,023 x 10 copias
1 x 1012 pmol mol
En consecuencia, 10 pmol de cebador pueden generar 6,023 x 1012 copias de

fragmento de PCR.
Ahora disponemos de toda la información necesaria para calcular el número de
ciclos que se requieren para generar 6,023 x 1012 copias (10 pmol) de producto.
Para la siguiente ecuación, /, el número final de copias de producto,
es 6,023 x 1012 copias; X, el número inicial de copias de secuencia diana, es
8 .6 Tm del cebador 181
2,3 x 106 copias, y £, la eficiencia de la PCR, es 0,74. Resolvemos el exponente n,

el número de ciclos de PCR, de la siguiente manera:
6,023 x 1012 = (2,3 x 106)(1 + 0,74)"
Dividir cada lado de la ecuación entre 2,3 x 106

y simplificar el término en paréntesis.
2,62 x 106 = (1,74)"
log 2,62 x 106 = n log 1,74 Aplicar el logaritmo a ambos lados de la ecuación
y usar la Regla de la Potencia para Logaritmos.
log 2 ,6 2 x 1 06
Dividir cada lado de la ecuación entre logaritmo
log 1,74 _ n
1,74.
6,42
-í— = n = 26,75 Calcular el logaritmo de los valores en el lado
0,24
izquierdo de la ecuación y dividir estos valores
para obtener n.
Por tanto, tras 27 ciclos, los 110 pmol de cebador habrán sido convertidos en
10 pmol de fragmento de PCR. Muchos protocolos utilizan cantidades de ceba
dores tan pequeñas como 10 pmol. El hecho de utilizar una cantidad de cebador
relativamente pequeña puede aumentar la especificidad de la reacción. Para la
reacción mostrada en este ejemplo, la utilización de más de 27 ciclos no
supondría un beneficio añadido.
8.6 Tm D E L C E B A D O R
P ara u n a am plificación óptim a, lo s d os cebadores que se utilizan en u n a P C R
deberían te n e r tem peraturas d e fusión sim ilares. D e h ec h o , la tem peratura de
h ibridación ó p tim a p ara u n experim ento d e P C R pu ed e ser d e varios g rados p o r
encim a o p o r debajo d e la Tm d el ce b ad o r m en o s estable. L a m ejo r tem peratura de
hib rid ac ió n debería se r calculada em píricam ente. L a tem peratura d e hibridación
m ás elevada q u e pro d u z ca u n m ay o r rendim iento d e p roducto deseado y u n a m enor
cantidad d e am plificación contam inante d eb ería ser utiliz ad a p ara la am plificación
rutinaria d e u n fragm ento concreto. L as fórm ulas que se describen a continuación
pu ed en se r utilizadas p ara d a r al investigador u n a id ea d e p o r dó n d e em pezar.
En la bibliografía se pueden encontrar diferentes m étodos para calcular la Tm del
ce b ad o r y algunos de ellos se utilizan frecuentem ente. U n m étodo m u y rápido para
estim ar la Tm de u n cebador oligonucleótido es sum ar 2 0C p o r cada n t A o T presente
en el ce b ad o r y 4 °C p o r cada n t G o C. E n form a d e ecuación, esta relación es
T m = 2 ° (A + T ) + 4 ° (G + C )
N o ob stan te, este m éto d o p ara ca lcu lar la Tm sólo es v á lid o p a ra ce b ad o re s de

u n tam añ o co m p re n d id o en tre 14 y 2 0 nt.
P ro b le m a 8 .1 3 Un cebador con la secuencia ATCGGTAACGATTACATTC se va

a utilizar en una PCR. Utilizando la fórmula descrita anteriormente, ¿cuál es la Tm
de dicho oligonucleótido?
El oligo contiene 1 2 A y T y 7 G y C .
2o x 12 = 24° y 4o x 7 = 28°
Sumando estos dos valores se obtiene
24° + 28° = 52°
Por lo tanto, según este método de calcular la temperatura de fusión, el cebador

tiene una Tmde 52 °C.
8.6.1 C á lcu lo d e la Tm b a sa d o en la co n ce n tra ció n sa lin a ,

el co n te n id o G/C y el ta m a ñ o d el ADN
L a ec u ac ió n d esc rita an terio rm en te p ara ca lcu lar la Tm d e u n a sec u en cia d ian a
tam b ién p u ed e se r u tiliz ad a p ara d ete rm in a r la Tm d e u n cebador:
r . = 81,5 + 1 6 ,6 1 0 , [ 1 |0 ^ SAL1] + 0 , 4 1 ( % d e G + C )
d o n d e [SA L] es la co n c en tra ció n d el ca tió n m o n o v alen te en la P C R (típicam ente

KC1) y la co n c en tra ció n d e m ag n e sio ex p resad a en m o les p o r litro y dete rm in a d a
[SAL] = [K+] + 4[M g 3+]0'5
L es igual al n ú m ero d e nu cle ó tid o s en el cebador. Tal com o se h a rem arcado

anteriorm ente, el térm in o % G + C en esta ecuación no d eb e ría se r ex p resado com o
u n dec im a l (50% G + C , n o 0 ,50 G + C ). E sta fó rm u la tien e en co n sid eració n la
co ncentración d e sal, el tam añ o d el c e b ad o r y el co ntenido G + C.
P ro b le m a 8 .1 4 Un cebador con la secuencia ATCGGTAACGATTACATTC va a

ser utilizado en una PCR. La PCR contiene 0,05 MKCI y 2,5 m/W magnesio.
Usando la fórmula proporcionada en este apartado, ¿cuál es la Tmde este
oligonucleótido?
8 .6 Tm del cebador 183
Una solución de 0,05 MKCI es equivalente a 0,05 mol KCI/L. El cebador, un
19-mero, tiene 7 G y C. Tiene un contenido %G + C de 37%.
7 nucleótidos
—----- , x . , x 100 = 37%
19 nucleotidos
La concentración salina es
[SAL] = [0,05] + 4 [0,0025]0,5 = 0,25
La Tmdel cebador se calcula de la siguiente manera:
, T [0,25] 1 . . 500
Tm= 81,5° + 16,6 og ----- L- ^ -----T +0,41(37)-------
’ a Ll-0 + 0,7[0,25]J v ’ 19
Tm= 81,5° + 16,6 log [0,213] + 15,2 - 26,3
Tm= 81,5° + (-11,2) + 15,2 - 26,3 = 59,2°C
Así pues, por este método de cálculo, el cebador tiene una Tmde 59,2 °C.
(Comparar este resultado con el de 52 °C obtenido en el Problema 8.13 para
la misma secuencia de cebador.)
8.6.2 C á lcu lo de la Tm b a sa d o en in te ra c cio n e s en tre

n u cle ó tid o s a d y a ce n te s
W etm ur y Sninsky (1995) describieron u n a fórm ula p ara calcular la Tm de cebadores
que tien e en cu e n ta las interacciones entre n t adyacentes en u n olig o n u d eó tid o .
E xperim entos d e B reslauer e t al. (1986) dem ostraron que se trata d e la secuencia
d e bases, m ás q u e la com posición d e b ases, lo que determ ina la estabilidad y las
características d e fusión d e u n a m olécula d e A D N particular. P o r ejem plo, u n a
m olécula d e A D N co n la estructura
5' a t 3'
te n d rá diferentes p ro p ied a d es d e fu sió n y estab ilid ad q u e u n a m o lécu la d e A D N

con la estru c tu ra
s' t a 3’
au n q u e am bas ten g a n la m ism a co m p o sició n d e b ases. L a estabilidad d e u n a

m o lécu la d e A D N v ien e d ete rm in a d a p o r su e n e rg ía libre ( A G°). E l c o m p o rta
m iento d e fu sió n d e u n a m o lécu la d e A D N está d ictad o p o r su en ta lp ia (A H°).
L a en ergía lib re es u n a m ed id a d e la te n d e n cia d e u n siste m a qu ím ic o a
re acc io n ar o cam biar. S e e x p resa en kilo calo ría s p o r m ol (kcal/m ol). (U na
c a lo r ía es la cantidad d e c a lo r a la p re sió n d e u n a atm ó sfe ra n ec esaria p ara
a u m e n ta r 1 °C la tem p eratu ra d e u n g ra m o d e a g u a .) E n u n a re acc ió n quím ica,
la e n e rg ía lib era d a o ab so rb id a en d ic h a re acc ió n es la d iferen c ia (A ) entre la
e n e rg ía d e los p ro d u c to s d e la re acc ió n y la e n e rg ía d e los reactantes. E n co n d i
cio n e s d e tem p eratu ra y p re sió n co n stan te s, la d iferen c ia d e e n e rg ía se define
co m o A G (el cam b io d e en ergía lib re d e G ib b s). E l cam b io d e en er g ía libre
estánd ar, A G°, es e l cam bio d e en e rg ía libre q u e se pro d u c e cu a n d o u n m ol d e un
c o m p u e sto se fo rm a a 25 °C y u n a p re sió n atm osférica.
L a en ta lp ia es u n a m edida del contenido en calor d e u n sistem a quím ico o físico.
E l cam bio de entalp ia, A / / ° , es la cantidad d e calor liberada o absorbida a tem pe
ratura, presión y volum en constantes. E s igual a la entalpia d e los productos d e la
reacción m enos la entalpia d e los reactantes. S e expresa en unidades d e kcal/m ol.
L as Tablas 8-1 y 8-2 m u estra n la en ta lp ia y la en e rg ía libre co rresp o n d ien tes a
las in teracciones entre nu cle ó tid o s adyacentes.
T a b la 8-1 Valores de entalpia (A H °) para nucleótidos adyacentes

(en kcal/mol). Reproducido de Quartin y W etm ur (1989)
Prim er Seg un do nucleótido
dA dC dG dT
dA -9,1 - 6 ,5 -7 ,8 -8 ,6
dC - 5 ,8 -11,0 -11,9 -7 ,8
dG - 5 ,6 -11,1 -11,0 -6 ,5
dT - 6 ,0 - 5 ,6 -5 ,8 -9,1
T a b la 8 -2 Valores de energía libre (A G°

para nucleótidos adyacentes
(en kcal/m ol). Reproducido de Quartin y W etm ur (1989)
Prim er Seg un do nucleótido
dA dC dG dT
dA -1 ,5 5 -1 ,4 0 -1 ,4 5 -1 ,2 5
dC -1 ,1 5 - 2 ,3 0 -3 ,0 5 -1 ,4 5
dG -1 ,1 5 - 2 ,7 0 - 2 ,3 0 -1 ,4 0
dT -0 ,8 5 -1 ,1 5 -1 ,1 5 -1 ,5 5
8.6 Tm del cebador 185
L a en e rg ía libre y la en ta lp ia de las in teraccio n es entre nu cle ó tid o s adyacentes

s o n in corporadas en la sig u ien te ecu ac ió n p ara ca lcu lar la tem p eratu ra d e fusión
(W e tm u ry Sninsky, 1995):
T° A H ° T (S A L ) 1
r " _ A H ° - A G° + R T ln (C j + *6 ’6 *°g [ l ,0 + 0,7 (S A L )J ~~ 269,3
donde
(S A L ) = (K + ) + 4 ( M g + 2) 0’5
T° es la tem p eratu ra en g rados K e lv in (K ). E l estado e stán d a r (25 °C ) se asum e

p ara este cálculo. L o s in crem entos d e g ra d o s son eq u iv a le n tes entre K an d °C.
0 °C es equ iv a le n te a 2 7 3 ,2 K . T° en K , p o r tanto, es 25 + 27 3 ,2 = 2 9 8 ,2 K . R, la
co nstante m o lar d e u n g as, es 1,99 cal/m ol K . C es la c o n c en tra ció n m o lar de
cebador. A H° se ca lcu la co m o la su m a d e to d o s los v alo re s A H° pro v o c ad o s p o r la
interacción en tre nu cle ó tid o s ad y a ce n te s d el ce b ad o r m ás la e n ta lp ia c o n la que
contribuyen las interacciones de lo s «extrem os colgantes» (secuencia d el m olde
que se extiende m ás allá d e las b ase s com plem entarias a los extrem os 5 ' y 3' del
cebador). U n ce b ad o r ten d rá dos extrem os colgantes cuando se hibride con el m olde.
L a contribución d e entalpia (A H°e) d e un extrem o colgante es —5.000 cal/m ol.
A H° s e calcula según la siguiente fórm ula:
(E l subíndice «nn» d esig n a la interacción entre nucleótidos adyacentes. El subíndice

«e» d esig n a la interacción con extrem os colgantes.)
■ A G °, la e n e rg ía libre, se ca lcu la c o m o la su m a d e to d o s los v alo res A G°
i§ p ro v o c ad o s p o r los nu cle ó tid o s ady a ce n te s d el c e b a d o r m ás la e n e rg ía libre con
§ la q u e co n trib u y e la iniciación d e la fo rm a ció n d e pares d e b a se s (+ 2 .2 0 0 cal/m ol)
c m ás la A G° co n la q u e c o n trib u y e u n ex tre m o co lg a n te ( —1.000 cal/m ol). Se
| ca lcu la m ed ian te la sig u ien te fórm ula:
I AG° — ^ nn (c ad a A ( jnn) + AG°e + AG °
|
£ (E l subíndice «nn» d esigna la interacción entre nucleótidos adyacentes. L os
ffi subíndices «e» e «i» d esignan interacciones d e extrem os colgantes y la iniciación
w d e la form ación d e lo s p ares d e bases, respectivam ente.)
P ro b le m a 8.15 Un cebador con la secuencia ATCGGTAACGATTACATTC va a

ser utilizado en una PCR a una concentración de 0,4 |i/W. La PCR contiene 0,05 M
KCI y 2,5 m/W Mg2+. Asumir dos extremos colgantes. Utilizando la fórmula
proporcionada anteriormente, ¿cuál es la Tm del oligonucleótido?
Las concentraciones de sales (K+ y Mg2+) deben ser ambas expresadas como
concentraciones molares. 2,5 m/W Mg2+ es equivalente a 0,0025 M, tal como se
muestra aquí:
2,5 m/W de Mg2+ x ----1 ^ = 0,0025 M de Mg2+

3 1.000 m/W 3
La concentración de sal total es, por tanto,
(SAL) = (0,05) + 4(0,0025)°’5 = (0,05) + (0,2) = 0,25
Tal como se muestra en la siguiente tabla, la suma de A H° de interacciones entre

nucleótidos adyacentes es —142 kcal/mol.
Nucleótidos AH
adyacentes
AT - 8 ,6
TC - 5 ,6
CG - 1 1 ,9
GG - 1 1 ,0
GT -6 ,5
TA - 6 ,0
AA -9,1
AC -6 ,5
CG -1 1 ,9
GA - 5 ,6
AT - 8 ,6
TT -9,1
TA - 6 ,0
AC -6 ,5
CA - 5 ,8
AT - 8 ,6
TT -9,1
TC - 5 ,6
A H ° total -1 4 2 ,0
8.6 Tm del cebador 187
El valor A H°e se calcula de la siguiente manera:
—5.000 cal/mol , ,,
------------- r------ x 2 extremos colgantes = —10.000 cal/mol
extremo colgante
Esto es equivalente a —10 kcal/mol:
—10.000 cal/mol x — kcal/mol— _ _ i q kcal/mol

' 1.000 cal/mol 1
El A H° total se calcula así:
A H° = —142 kcal/mol + ( —10 kcal/ mol) = —152 kcal/ mol
Por tanto, la A H° para este cebador es —152 kcal/mol. Esto es equivalente a

-152.000 cal/mol:
1.000 cal/mol
—152 kcal/mol x — ¡— . . .— = —152.000 cal/mol
kcal/mol
Como se muestra en la siguiente tabla, la suma de A G° de interacciones de

nucleótidos adyacentes es —27,3 kcal/mol.
N u clé o tid o s A G°nn

a d y a c e n te s
AT -1 ,2 5
TC -1 ,1 5
CG -3 ,0 5
GG -2 ,3 0
GT -1 ,4 0
TA -0 ,8 5
AA -1 ,5 5
AC -1 ,4 0
CG -3 ,0 5
GA -1 ,1 5
AT -1 ,2 5
TT -1 ,5 5
TA -0 ,8 5
AC -1 ,4 0
CA -1 ,1 5
AT -1 ,2 5
TT -1 ,5 5
TC -1 ,1 5
A G° to tal - 2 7 ,3
La A G ° con la que contribuyen los extremos colgantes se determina así:
— 1.000 cal/mol kcal/mol

A G ° = 2 extremos colgantes >
extremo colgante 1.000 cal/ mol
— —2 kcal/mol
La A G ° es a continuación calculada sumando los valores determinados ante

riormente con los de A G° de la iniciación de la formación de pares de bases
(AG°,- = +2.200 cal/mol = 2,2 kcal/mol).
A G ° = —27,3 kcal/mol + ( —2 kcal/mol) + 2,2 kcal/mol = —27,1 kcal/mol
Así, la A G ° para este cebador es —27,1 kcal/mol, que es equivalente a

-27 .1 0 0 cal/mol:
1.000 cal/mol
-27,1 kcal/mol x — ¡— . = - 2 7 .1 0 0 cal/mol
kcal/mol
El cebador se encuentra a una concentración de 0,4 \iM. Esto se convierte a una

concentración molar (M) de la siguiente manera:
0,4 [iM x ---- ^ ----= 4 x 1 0 ~7 M

1 x 10 6
\iM
Colocando estos valores en la ecuación de Wetmur y Sninsky se obtiene la
siguiente relación:
(SAL)
-16,6 log
A H° - A G ° + RT° In (C ) ' a [ 1'° + 0,7(SAL)J
298,2 x (-1 5 2 .0 0 0 )
-1 5 2 .0 0 0 - (-2 7 .1 0 0 ) + 1,99(298,2)ln (4 x 10“ 7)
(0/25)
+ 16,6 log
1,0 + 0,7(0,25)J
Tm = ----------------------- :— 7“-----rr—;--------- + 16,6 log [0,211 - 269,3

-1 5 2 .0 0 0 + 27.100 + (5 9 3 ,4 ) In (4 x 10-7) 1 J
-45.326.400 ,
Tm ~ --------------- 7------ T7-------- - + (16,6) (- 0 ,6 8 ) - 269,3
-1 2 4 .9 0 0 + (5 9 3 ,4 ) (-1 4 ,7 3 ) v ’
-45.326.400
Tm - --------------- 7---------r + (- 1 1 ,3 ) - 269,3
-1 2 4 .9 0 0 + ( - 8 .7 4 1 ) v ’
Tm - 339,2 - 11,3 - 269,3 = 58,6°
Por lo tanto, con este método de cálculo, el cebador tiene una Tm de 58,6 °C.
8.7 Deoxinucleósidos trifosfato (dNTP) 189
8.7 D E O X IN U C L E Ó S ID O S T R I F O S F A T O (d N T P )
L o s d eo x in u c le ó s id o s trifo s fa to (dATP, dC TP, d G T P y d T T P ) son los ladrillos
del A D N . D eb en se r añ a d id o s en u n a P C R en can tid a d es eq uim olares y, d ep e n
dien d o d e la aplica ció n específica, c a d a u n o d e ello s se u tiliz a en co n centraciones
co m p re n d id as en tre 2 0 y 20 0 \xM. C u an d o se pre p ara u n a serie de P C R , lo s cuatro
dN T P pu ed en se r p re p ara d o s en fo rm a de m ezcla, u n a alícu o ta de la cual se añade
a ca d a PC R .
P ro b le m a 8 .1 6 Una mezcla de dNTP se prepara combinando 40 jxL de cada

stock 10 m/W dNTP. Cuatro p l de esta mezcla de dNTP se añaden a una PCR que
tiene un volumen final de 50 jxL.
a) ¿Cuál es la concentración de cada dNTP en la mezcla?
b) ¿Cuál es la concentración total de dNTP en la PCR? Expresar la concentración
en micromolaridad.
La mezcla de dNTP contiene 40 |xL de cada uno de los cuatro dNTP. El volumen
total de la mezcla de dNTP es, por tanto, 4 x 40 |xL = 160 jxL. Diluyendo cada
stock de dNTP en este volumen final se obtiene
160 [xL
Así, la mezcla contiene 2,5 m/W de cada dNTP.
S o lu c ió n 8 .16(b )
La concentración total de dNTP en la mezcla es 10 m/W (2,5 m/W dATP + 2,5 m/W
dCTP + 2,5 m/W dGTP + 2,5 m/W dTTP = 10 m/W dNTP total). La dilución de 4 |xL
de la mezcla de dNTP en una PCR de 50 |x,L genera la siguiente concentración:
10 m/W de dNTP total x x 1 x ^ ^ __ ggo mAÍ de dNTP total

50 jxL m/W
En consecuencia, 50 |xL de PCR contienen una concentración de dNTP total de

800 |x/W.
P ro b le m a 8 .1 7 Se diseña una PCR de 50 p,L para producir un producto

de amplificación de 300 pb. La reacción contiene 800 \lM dNTP total. Los
cebadores usados para la amplificación son un 18-mero y un 22-mero. Asumir
que ninguno de los cebadores o reactivos en la reacción son lim itantes y que la
reacción tiene una eficiencia del 100%.
a) Con una concentración de dNTP de 800 \iM, ¿cuánto ADN se puede producir
en esta reacción?
b) ¿Cuántas copias del fragmento de 300 pb podrían generarse teóricamente?
c) ¿Cuánto cebador se necesita para sintetizar el número de copias del frag
mento de 300 pb calculado?
El primer paso es calcular el número de micromoles de dNTP en la reacción.
(800 de dNTP es equivalente a 800 nmol de dNTP/L).
800 nmol de dNTP 1L , , , lir__

----------¡---------- x -------- — x 50 u l = 0,04 iim o de dNTP
L 1 x 106 m,L
De esta manera, la reacción contiene 0,04 nmol de dNTP.
Un dNTP es un trifosfato. Cuando se incorpora a una cadena de ADN en extensión

gracias a la acción de una ADN polimerasa, se libera un difosfato. El nt, tal como se
incorpora a la cadena de ADN, tiene un peso molecular de 330 g/mol. Por tanto,
el número de micromoles de dNTP es igual al número de micromoles de nt
incorporados al ADN. La cantidad de ADN que puede ser generada a partir de
0,04 (imol de nudeótido se calcula multiplicando esta cantidad por el peso
molecular de un nt. La multiplicación por un factor de conversión permite la
expresión del resultado en microgramos.
, , 330 g/mol 1 mol 1 x 106 ug

0,04 ixmol de nt x -----—---- x ------- -------- ¡ x --------- — = 13,2 ug
nt 1 x 106 jimol g
En conclusión, 0,04 nmol de dNTP pueden en teoría ser convertidos en 13,2 ng

de ADN.
S o lu c ió n 8 .17(b )
Un fragmento de PCR de 300 pb, dado que se trata de una cadena doble, está
formado por 600 nt. Cada fragmento de PCR se genera por extensión de
cebadores hibridados. Los cebadores usados en esta reacción tienen un
tamaño de 18 y 22 nt. Por lo tanto, 40 nt (18 nt + 22 nt = 40 nt) de cada
fragmento de PCR corresponden a cebadores. Otros 560 nt (600 nt — 40 nt
del cebador) de cada fragmento de PCR provienen del conjunto de dNTP. Los
560 nt representan una copia de la secuencia a amplificar. Su peso se calcula
de la siguiente manera:
560 nt 330 g 1 mol de nt 1 x 106 ng _ 3,1 x 10-13 ng

copia mol nt 6,023 x 1023 nt g copia
8.8 ADN polimerasa 191
Así, cada copia de fragmento de PCR contiene 3,1 x 10 ng de nt procedente del

conjunto de dNTP. Multiplicando este valor por la cantidad de ADN que se puede
generar a partir de los dNTP (13,2 ng, según el cálculo hecho en la Solución 8.17a),
se obtiene el siguiente resultado:
1 copia
---------Í-tó— x 13,2 ng = 4,3 x 1013 copias
3 ,1 x i 0 “ 13 ng
Por lo tanto, los dNTP en esta reacción permiten sintetizar 4,3 x 1013 copias del
fragmento de PCR de 300 pb.
Dado que los cebadores están incorporados en cada copia del producto de PCR,
el número de micromoles de cebadores necesarios para sintetizar 4,3 x 1013
copias es equivalente al número de micromoles de producto. Para resolver este
problema, primero se debe determinar el número de micromoles de producto
de 300 pb:
„ 1 mol 1 x 106 nmol

4,3 x 1013 copias x ------------ ==--------x ---------- -----
6,023 x 1023 copias mol
= 7,1 x 10-5 nmol de producto de 300 pb
Así pues, en la reacción de 50 nL se necesitan 7,1 x 10-5 nmol de cebadores.

Para convertir este valor en una concentración micromolar, la cantidad es
expresada como una cantidad por litro:
7,1 x 10-5 nmol de cebador 1 x 106 nL _ 1,4 nmol de cebador

50 nL X L _ L
— l,4 p A íd e cebador
De esta manera, cada cebador debe estar presente en la reacción a una

concentración de 1,4 pM para permitir la síntesis de 4,3 x 1013 copias de pro
ducto de PCR de 300 pb cuando la concentración total de dNTP es 800 \iM.
8.8 A D N P O L IM E R A S A
Varias A D N polim erasas obtenidas d e d iferentes bacterias term ófilas h an sido uti
lizadas con éxito p ara la am plificación p o r P C R . A u n q u e pu ed a n ten e r diferentes
características relacionadas co n s u actividad exonucleasa, procesividad, fidelidad
y actividad especifica, h an sido consideradas adecuadas para P C R po rq u e son térm i
cam ente estables; m antienen su actividad incluso después de repetidas exposiciones
a las elevadas tem peraturas u tilizadas p ara d esnaturalizar el ácido nucleico m olde.
P ro b le m a 8 .1 8 Dos unidades de ADN polimerasa Taq son añadidas a una PCR

de 100 jiL. La enzima tiene una actividad específica de 292.000 unidades/mg y
un peso molecular de 94 kilodaltons (kDa). ¿Cuántas moléculas de enzima están
presentes en la reacción?
La resolución de este problema requiere el uso del número de Avogadro
(6,023 x 1023 moléculas/mol). Un peso molecular de 94 kDa es equivalente a
94.000 g/mol. Estos valores son incorporados en la siguiente ecuación para
obtener el número de moléculas de enzima:
, , , mg g mol
2 unidades de enzima x ------------- ——¡----¡------ ;— x -----------x -----------
292.000 unidades de enzima 1.000 mg 94.000 g
6,023 x 1023 moléculas „ ,
x --------------- ------------ = x moléculas
mol
La simplificación de la ecuación da el siguiente resultado:
1,2 x 1024 moléculas 10 „ ,

---------------- —------ = 4,4 x 10 moléculas
2,7 x 1013
En consecuencia, la reacción contiene 4,4 x 1010 moléculas de ADN polimerasa

Taq.
8.8.1 C á lcu lo d e la ta sa de e rro r de la ADN p o lim e ra sa

T odas las A D N p o lim e rasa s, inclu y en d o aquellas utiliz ad as p a ra P C R , m uestran
cie rta ta sa de erro r d e m an e ra que p u ed e n in co rp o rar en el ex tre m o 3' d e la ca d en a
q u e se está ex te n d ie n d o u n a b a s e diferente a la c o m p lem e n ta ria del m olde. L a
m ay o ría d e A D N p o lim e rasa s tien en u n a ac tiv id a d ex o n u c leasa 3 ' a 5' co n función
«co m p ro b a d o ra » q u e elim in a las base s incorrectas d el extrem o 3r d e la ca d en a en
ex ten sió n . U n a v e z la b a s e in co rrec ta h a sido elim in ad a, la actividad d e la en z im a
p o lim e rasa añ a d e la b a s e co rrec ta y la ex te n sió n continúa.
H a y ash i (1994) d escrib e u n m éto d o p ara ca lcu lar la fracción d e fragm entos de
pro d u c to q u e tien en la sec u en cia co rrec ta desp u é s de u n a P C R . V iene dete rm in a d a
p o r la sig u ien te ecu ació n , la cu a l n os d a el po rc en taje d e frag m en to s d e P C R que
no co n tien en errores d e incorporación:
F( , ) = ^ Í X 100
(£ ■ + !)"
8.8 ADN polimerasa 193
d o n d e F(n) es la fracc ió n d e ca d en a s co n s ec u en cia co rrec ta tras n ciclos; E es la

efic ien cia d e am plificación; n es el n ú m ero d e cic lo s; y P es la p ro b a b ilid ad de
p ro d u c ir u n fragm ento d e P C R libre d e erro r en u n cic lo d e am p lifica ció n consi
d erando u n a d istrib u ció n d e P o isso n d e su cesos raros, d o n d e X en la ecu ac ió n de
P o isso n , P = é~ \ 7 r ! , es ig u al a la ta s a d e erro r d e la A D N p o lim e rasa m u ltipli
ca d a p o r el tam año d el a m p licó n en nt.
E l cálcu lo d e la pro b a b ilid ad seg ú n la distrib u ció n de P o isso n se h a descrito en
el C ap ítu lo 3 p a ra el an á lisis del te s t de fluctuación. S e b a s a en la fó rm u la gen eral
d o n d e e es la b a se d el lo g aritm o n atural y r re p rese n ta el n ú m ero d e «sucesos».

r\ (r fa ctorial) re p rese n ta el pro d u c to de ca d a n ú m ero entero po sitiv o d esd e r h asta
1 inclu y en d o este últim o. P a ra el ca so cero (« n in g ú n s u ce so » o n in g ú n error
in corporado), r = 0 y la ecu ac ió n d e P o isso n se c o n v ie rte en
C u an d o se re su elv e P p a ra el ca so de la a u se n cia d e sucesos, recordar, prim ero,

q ue 0! es igual a 1 y, seg u n d o , q u e c u a lq u ie r n ú m ero elevado al e x p o n e n te 0 es
igual a 1. A sí p u es, el caso d e a u se n cia d e su ce so s es
P ro b le m a 8 .1 9 Bajo unas condiciones de reacción definidas, la ADN

polimerasa Taq tiene una tasa de error de 2 x 10-5 errores por nt polimerizado.
Un amplicón de 500 pb es sintetizado en la reacción. La reacción tiene una
eficiencia de amplificación global de 0,85. Tras 25 ciclos, ¿qué porcentaje de los
fragmentos tendrá la misma secuencia que la del molde de partida (es decir, no
contendrá errores introducidos por la ADN polimerasa)?
S o lu c ió n 8.19
La probabilidad de la distribución de Poisson para el caso de ausencia de
sucesos está determinada por la siguiente ecuación:
Para este problema, X es igual a la tasa de error multiplicada por el tamaño del
amplicón, determinada mediante la siguiente ecuación:
X = (2 x 10- s )(500) = 0,01
La sustitución de este valor X en la ecuación de Poisson da la siguiente

relación:
P = e-0’01 - 0,99
(Para calcular e-0,tn con una calculadora, introducir 0,01, cambiar el signo
presionando la tecla +/— y presionar luego la tecla ex [en algunas calculadoras
puede ser necesario presionar primero la tecla S H IF T para tener acceso a la
función e*J)
La introducción del valor P en la ecuación para calcular el porcentaje de frag
mentos de PCR sin errores da lugar a la siguiente ecuación:
' , [1 + 0 ,8 5 (0,99)125
F in ) = 1 ^ ■x 100
(0,85 + 1) 25
La simplificación de la ecuación genera la siguiente relación:
F (n )= i^ 84£ x l 0 0
(1,85)
Ambos, el numerador y el denominador, deben ser elevados a la potencia 25.

Para determinar [1,84]25 con una calculadora, introducir 1,84, presionar la tecla
x y, introducir 25 y a continuación presionar la tecla =.
La ecuación ahora da el siguiente resultado:
F (n ) =
4,78 x 106
Así pues, el 87,2% de los amplicones tendrán la secuencia correcta tras

25 ciclos.
8 .9 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa 195
8.9 R E A C C IÓ N EN C A D E N A D E L A P O L IM E R A S A (P C R )
C U A N T IT A T IV A
L a h a b ilid ad d e m ed ir cantidades m u y p eq u e ñ as d e u n ác id o n ucleico específico
p u e d e se r crucial p ara lleg ar a u n a co m p re n sió n m eticu lo sa d e los p rocesos
in volucrados en la ex p resió n g én ic a y la infección. D a d a su sen sib ilid a d ú n ic a y
su cap ac id a d d e a m p lifica r m ás d e u n m illó n d e v ec es u n as po ca s m oléculas, la
P C R h a sido e x p lo tad a p a ra la cua n tific ac ió n d e ác id o s n ucleicos. N in g u n a o tra
té c n ic a p u ed e s e r u tiliz ad a de fo rm a tan efic ien te o rá p id a p ara d ete ctar cantidades
d e dian a tan peq ueñas. P ese a q u e vario s m éto d o s diferentes h an sido ideados para
u tiliz a r la P C R co m o h erram ien ta cua n tita tiv a, la té c n ic a d e n o m in ad a P C R co m
p e titiv a h a em ergido co m o la apro x im a ció n m ás fiable.
E n u n en sa y o d e P C R com petitiva, se p re p ara u n a serie d e tu b o s ré p lic a en los
cuales d o s m o ld es son am plificados sim ultáneam ente. U n m o ld e, la sec u en cia
d ian a q u e se qu iere c u a n tific ar (su ca n tid a d es d esc o n o cid a), es aña d id o com o
extracto en vo lú m en es idénticos en ca d a tubo. D e p en d ien d o d e la ap licació n , este
m olde d ia n a p u ed e se r A R N tran sc rito a A D N a p a rtir d e u n g en d e interés
inducido o d e u n A R N p resen te en u n tejido bio ló g ic o . E l o tro m olde es u n
c o m p e tid o r d el cual se co n o c e la co n c en tra ció n y se añ a d e a la P C R en form a
d e dilu cio n es seriadas. C o n el fin d e ase g u rar q u e serán am plificados co n la m ism a
eficiencia, lo s dos m o ld es, el dian a y el co m p etid o r, tien en tam añ o s p arecid o s pero
diferenciables, secu en cias sim ilares, y las m ism as secu en cias d e h ib rid ac ió n a
cebadores. Si el ác id o n ucleico a c u a n tific ar es A R N , el m olde com p e tid o r
tam b ién d eb e se r A R N . L o s A R N d eb e n s e r p rim ero con v e rtid o s a A D N c
m ediante tran sc rip ció n re v ersa antes d e p ro c ed er a la am p lifica ció n p o r P C R .
(L a téc n ic a u tiliz ad a p ara pre p ara r A D N c a partir d e A R N seg u id a de
am plificación p o r P C R se d enom ina R T -P C R .) D urante la transcripción reversa
y la P C R , el m olde com petidor com pite co n la secuencia d ian a p ara los cebadores y
lo s com ponentes d e la reacción.
T ras la am plificación, los pro d u c to s d e la re acc ió n s o n separados p o r electro-
foresis en g el. L a ca n tid a d d e p ro d u c to en ca d a b a n d a p u e d e se r d ete rm in a d a p o r
v ario s m éto d o s diferentes. Si se incluye en la P C R u n d N T P m arc ad o co n radiac
tiv id a d , se p u e d e u tiliz ar u n a au to rrad io g ra fía o la esp e ctro m etría en líquido de
cen telleo p a ra d ete ctar las can tid a d es relativas d e pro d u c to . L a tin ció n c o n b ro
m uro d e etid io y la fo to g ra fía d e l g el p u ed e n u sarse ju n to co n u n análisis
den sito m étrico p ara cu a n tific ar pro d u c to s. Si se u san ce b ad o re s ac o p lad o s a u n
m arc ad o r fluorescente, lo s pro d u c to s p u ed e n se r cu a n tific ad o s c o n u n secuencia-
d o r d e A D N autom ático.
Si la cuantificación se realiza p o r análisis d e la incorporación d e u n radioisótopo
o p o r análisis d e fluorescencia/den sitom etría d e u n gel teñ id o con brom uro de
etidio, las cantidades obtenidas p ara los fragm entos m ás p equeños d eben ser
corregidas p ara reflejar cantidades m olares reales. P o r ejem plo, fragm entos de
A D N m ás peq u e ñ o s incorporarán m enos bro m u ro d e etidio que fragm entos m ás

grandes, au n q u e el nú m ero d e m oléculas sea equivalente entre ellos. L o s fragm en
to s m ás pequeños, p o r tanto, em itirán fluorescencia con m en o r intensidad. P ara
p o d e r co m parar sus cantidades directam ente, la cantidad del fragm ento m ás
pequeño d eb e se r m ultiplicada p o r la proporción pb del fragm ento d e m ayor
tam año entre p b del fragm ento d e m en o r tam año.
E n cu a lq u ie r P C R , la cantidad de fragm ento d e P C R p ro d u c id o es proporcional
a la cantidad d e m olde de partida. L a pro p o rció n de pro d u c to s de P C R en la técnica
d e P C R co m p e titiv a re fleja la ca n tid a d d e c a d a m o ld e inicialm ente p resen te e n la
reacción. S in em bargo, la ca n tid a d to tal d e pro d u c to de P C R n o pu ed e ex c ed e r u n
v a lo r m áx im o q u e v ien e delim ita d o p o r las can tid a d es d e dN T P o d e po lim e rasa
Taq activa. A m ed id a que la ca n tid a d d e m o ld e co m p e tid o r v a au m e n ta n d o en la
serie d e reacciones, la ca n tid a d de pro d u c to gen e rad o a p a rtir d el m olde d ian a que
se p re te n d e cu a n tific ar d ism in u y e dad o q u e el co m p e tid o r com pite efectivam ente
p o r los co m p o n e n te s d e la reacción. E n aq u e lla re acc ió n e n la q u e las cantidades
iniciales d e m olde d ia n a y co m p e tid o r sea n eq uivalentes, se ac u m u la rán ca n tid a
des iguales d e sus pro d u c to s. P o r lo tan to , e n el p u n to en el q u e la cantidad de
pro d u c to d erivado d el m olde d ia n a y la ca n tid a d del pro d u c to d eriv a d o del m o ld e
c o m p e tid o r son iguales (el p u n to d e e q u iv a le n c ia ), la co n c en tra ció n d e la diana
antes d e la R T -P C R es igual a la cantidad co n o c id a d el m o ld e c o m p e tid o r c o n la
q u e se p artía en es a reacción.
E s po co p ro b a b le q u e c u a lq u ie r reacción d e la serie p ro d u z ca ex a ctam en te
cantidades eq uivalentes d e pro d u c to p o r azar. E l p u n to de equivalencia, p o r tanto,
d eb e s e r determ in ad o m ed ian te la ela b o rac ió n d e u n gráfico q u e re p rese n te el
lo g aritm o d e la p ro p o rció n d e la cantidad d e pro d u c to d e P C R d erivado del
com p e tid o r/c an tid ad d e p ro d u c to d e P C R d eriv a d o d e la d ia n a y el logaritm o
d e la cantidad d e m olde co m p e tid o r inicial. A u n q u e tal gráfico p u e d a su g erir u n a
lín ea recta, se d eb e d esa rro llar el an á lisis d e re g resió n p a ra estim ar la re cta que
m ejo r se aju sta a lo s datos. E l p u n to d e e q u iv a le n cia en la re cta d e re g resió n es
igual a 0 en el eje y. (E n el p u n to d e eq u iv a le n cia, la p ro p o rció n d e com p e tid o r/
d ian a es igual a 1. E l lo g aritm o d e 1 es 0 .) L a re g resió n será d esc rita co n m ayor
d etalle en el sig u ien te problem a.
P ro b le m a 8 .2 0 Se preparan 10 tubos de reacción para la cuantificación de

un ARN presente en un extracto de células infectadas con un virus. Se añaden
10 (iL de extracto a cada uno de los 10 tubos. Se añade un ARN competidor a
los tubos de reacción, el cual posee los mismos sitios de hibridación para
cebadores y una secuencia de bases similar que el ARN diana. Se añaden las
siguientes cantidades del molde competidor a los 10 tubos: 0 ,2 ,1 0 ,2 0 ,5 0 ,1 0 0 ,
250, 500,1.000 y 5.000 copias. Cada reacción es incubada con transcriptasa
reversa para generar ADNc. A continuación, las reacciones son amplificadas por
PCR. La RT-PCR del ARN diana genera un fragmento de un tamaño de 250 pb,
mientras que la del molde competidor produce un fragmento de 200 pb.
Tras la amplificación, los productos son sometidos a electroforesis en un gel de

agarosa al 2% en presencia de 0,5 ng/mL de bromuro de etidio. Se toma una
fotografía del gel bajo luz UV y se cuantifica la intensidad de fluorescencia de
cada banda mediante análisis densitométrico. Se obtienen los resultados
mostrados en la Figura 8-1. El análisis de densitometría genera los valores
presentados en la Tabla 8-3.
Reacción
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
250 pb
200 pb
0 2 10 20 50 100 250 500 1.000 5.000
Copias de molde competidor
■ FIGURA 8-1 Gel de agarosa correspondiente a un ensayo com petitivo de reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). La diana genera un producto de 250 pb. El m olde com petitivo genera un producto de 200 pb.
T a b la 8-3 Datos de densitom etría del gel m ostrado en la fotografía de

la Figura 8-1
Tubo de Co p ias de Densitom etría del D ensitom etría del

reacción com petido r producto de RT-PCR producto de RT-PCR
añ ad idas d erivad o del derivad o de la diana
com petidor
1 0 0 24.822
2 2 3.298 28.437
3 10 8.686 18.218
4 20 7.761 16.872
5 50 14.590 13.520
6 100 16.477 11.212
7 250 21.994 7.115
8 500 25.050 5.173
9 1.000 26.598 5.091
10 5.000 31.141 1.951
S o l u c ió n 8 .2 0
El producto de PCR generado a partir del ARN competidor es más pequeño que
el generado a partir del ARN diana. Cuando son separados en un gel de agarosa
y teñidos con bromuro de etidio, los fragmentos más pequeños se teñirán con
menor intensidad que los fragmentos más grandes, incluso si sus cantidades
molares son equivalentes, porque las moléculas más pequeñas unen menos
T a b la 8 -4 Valores de densitom etría corregidos correspondientes

al producto de 200 pb obtenido mediante reacción en cadena de
la polim erasa (PCR) a partir del ARN com petidor descrito en el
Problema 8.20. Cada valo r es m ultiplicado por 250/200 (tam año en pb
del producto de PCR derivado de la diana/ tam año en pb del producto de
PCR derivado del ARN com petidor). Por ejem plo, para la reacción dos,
3.298 x 250/200 = 4.123
Tubo de reacción Copias de Densitom etría del Densitom etría

com petidor p roducto de RT- corregida del
añadidas PCR derivad o del producto de RT-
com petidor PCR derivad o del
com petidor
1 0 0 0
2 2 3.298 4.123
3 10 8.686 10.858
4 20 7.761 9.701
5 50 14.590 18.238
6 100 16.477 20.596
7 250 21.994 27.492
8 500 25.050 31.312
9 1.000 26.598 33.247
10 5.000 31.141 38.926
bromuro de etidio. Para poder comparar directamente la cantidad de producto

de PCR competidor con la del producto derivado de la diana, los valores de
densitometría del competidor deben ser corregidos mediante la multiplicación
de los mismos por la relación que existe entre el tamaño del fragmento más
grande y el del fragmento más pequeño. Para este experimento, el producto
generado por el ARN diana tiene 250 pb. El generado por el ARN competidor
tiene 200 pb. Por tanto, los valores de densitometría de cada producto competidor
deberían ser multiplicados por 250/200. Estos valores aparecen en la Tabla 8-4.
El eje y de nuestro gráfico representará el logaritmo de la relación valor de den
sitometría del producto de PCR competidor corregido/valor de densitometría
del producto de PCR diana. La Tabla 8-5 muestra estos valores. El eje x representa
el logaritmo del número de copias de ARN competidor añadido a cada PCR del
ensayo. La Tabla 8-6 proporciona estos valores. Un gráfico puede ser generado
ahora usando el logaritmo de las copias del ARN competidor en el eje x y el
logaritmo competidor/diana en el eje y (Figura 8-2).
Los puntos en el gráfico de la Figura 8-2 sugieren una relación de línea recta,
pero no todos los puntos caen exactamente en una línea recta. Este tipo de
gráfico se denomina g rá fico d e d is p e rs ió n porque los puntos están dispersos a
lo largo de la cuadrícula. El objetivo pasa a ser dibujar una recta a través del
gráfico de dispersión que mejor se ajuste a los datos. Tal recta de mejor ajuste
8.9 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa 199
T a b la 8-5 En la cuarta colum na se m uestra la densitom etría del

producto de reacción en cadena de la polim erasa (PCR) derivado
del com petidor dividido entre la densitom etría del producto de PCR
derivado de la diana. El logaritmo de estos valores (valores del eje y) se
m uestran en la quinta colum na
Tubo de Densitom etría Densitom etría Com petidor Logaritm o de

reacción corregida del del producto dividid o entre la relación
producto de de RT-PCR de la diana com petidor
PCR del la diana dividid o entre
com petidor la diana
1 0 24.822 - -
2 4.123 28.437 0,145 -0,839
3 10.858 18.218 0,596 -0,225
4 9.701 16.872 0,575 -0,240
5 18.238 13.520 1,349 0,130
6 20.596 11.212 1,837 0,264
7 27.492 7.115 3,864 0,587
8 31.312 5.173 6,053 0,782
9 33.247 5.091 6,531 0,815
10 38.926 1.951 19,953 1,300
T a b la 8-6 Valores logaritmo del núm ero de copias de ARN com petidor
añadido a cada tubo del ensayo de PCR cuantitativo descrito en el
Problema 8.0. Por ejem plo, para la reacción dos, en la cual dos copias
del m olde de ARN com petitivo son añadidas a la reacción, el logaritmo de
2 es 0,3
Tubo de reacción Copias de com petidor Logaritm o de las copias

añadidas de com petidor
1 0
2 2 0,3
3 10 1,0
4 20 1,3
5 50 1,7
6 100 2,0
7 250 2,4
8 500 2,7
9 1.000 3,0
10 5.000 3,7
1 .5
I 1
ío
1 °-5
3 - 0 ,5
-1
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Log copias de ARN competidor
■ FIGURA 8 -2 Gráfico de dispersión del logaritmo competidor/diana frente a logaritmo copias de ARN competidor.
puede ser calculada mediante una técnica conocida como a n á lis is d e re g re sió n
(también denominada re g re sió n lin ea l o m é to d o d e los m ín im o s cu ad rad o s).
Los valores en el eje x se denominan v a ria b le s in d e p e n d ie n te s o p re d icto ra s.
Son elegidas por el experimentador y, por tanto, no son aleatorias. (En este
ejemplo, el logaritmo del número de copias de ARN competidor añadido a la
serie de PCR competitivas es la variable independiente.) Los valores en el eje y
son las v a ria b le s d e p e n d ie n te s o re sp u e s ta s . (En este ejemplo, el logaritmo
de la fluorescencia corregida de la banda del gel correspondiente al producto de
PCR del competidor dividido entre la fluorescencia de la banda del producto
de PCR de la diana es la variable dependiente.) El análisis de regresión crea la
línea recta que mejor se ajusta y que minimiza la distancia de todos los datos a
la misma. La recta de regresión que mejor se ajusta al gráfico de distribución
sigue la fórmula
y = mx + b
Esta ecuación, de hecho, describe cualquier línea recta en un espacio bidimen-

sional. El término y es la variable en el eje vertical, m es la pendiente de la recta, x
es la variable en el eje horizontal, y b es el valor d e y allí donde la línea recta cruza
el eje vertical (denominado el p u n to d e corte).
Para la recta de regresión que mejor se ajusta,
b = y — mx
donde y (con marca) es la media de los valores y, x (con marca) es la media de los
valores x, y
¿ ( x , - x ) (y, - y )
m = '~1 n---------------
T a b la 8 -7 Cálculo de la sum a de todos los valores x e y
Reacción X¡ (logaritm o copias de Y¡ (logaritm o de com petidor

co m petido r añ ad idas dividid o entre diana
[véase Tabla 8-6]) [véase Tab la 8-5])
2 0,3 -0,839
3 1,0 -0,225
4 1,3 -0,240
5 1,7 0,130
6 2,0 0,264
7 2,4 0,587
8 2,7 0,782
9 3,0 0,815
10 3,7 1,300
Total 18,1 2,574
donde n representa el número de reacciones (el número de puntos experimen

tales), i hace referencia a una PCR específica en la serie de reacciones compe
titivas (/ = 1 a n) y se utiliza como una notación de suma para indicar la suma
de todos los términos en la serie para cada valor de /'.
Ahora podemos usar nuestros datos para determinar la recta de regresión. El
primer paso es calcular los valores medios para x¡ e y¡. Esto se lleva a cabo
sumando todos los valores de x¡ e y, (Tabla 8-7) y a continuación dividiendo
cada suma entre el número total de muestras usado para obtener dicha suma.
(Los valores para la reacción uno, en la cual no se añadió ningún molde compe
tidor, no serán utilizados para estos cálculos porque esta reacción no propor
ciona información útil más allá de la tranquilidad de saber que un producto de
200 pb no será producido en ausencia de molde competidor.)
El valor medio de x se calcula de la siguiente manera:
El valor medio de y se calcula así:
Los valores de m y b necesarios para la ecuación de la recta de regresión pueden

ser calculados ahora. La Tabla 8-8 refleja los valores necesarios para estos
cálculos.
Ta b la 8-8 Cálculo de los valores necesarios para determ inar m y b

en la recta de regresión que m ejor se ajusta a los datos
x¡ y¡ (x, - ) ( y ,- ) (xf - )2 (y / - )2 ( x ,- )
x (y, - )
0,3 -0,839 -1 ,7 -1,125 2,89 1,266 1,913

1,0 -0,225 -1 ,0 -0,511 1,00 0,261 0,511
1,3 -0,240 -0 ,7 -0,526 0,49 0,277 0,368
1,7 0,130 -0,3 -0,156 0,09 0,024 0,047
2,0 0,264 0,0 -0,022 0,00 0,000 0,000
2,4 0,587 0,4 0,301 0,16 0,091 0,120
2,7 0,782 0,7 0,496 0,49 0,246 0,347
3,0 0,815 1,0 0,529 1,00 0,280 0,529
3,7 1,300 1,7 1,014 2,89 1,028 1,724
18,1 2,574 9,01 3,473 5,559
Según la Tabla 8-8, tenemos los siguientes valores:
¿ ( x, - x)2 = 9,01
9
= 5,559
Con estos valores, podemos calcular m:
Conociendo el valor de m, el valor de b puede ser calculado:
b = y — rrix
= 0,286 - 0,617(2,0)
- 0,286 - 1,234 = -0,948
Así, la sustitución de los valores m y b en la ecuación de la línea recta da lugar a
y = 0,617 x + (-0 ,9 4 8 )
Ahora se puede representar una recta de regresión. Dado que una línea recta
está definida por dos puntos, necesitamos determinar dos valores de la
ecuación y = m x + b . La recta de regresión siempre pasa por la coordenada
(x [con marca], y [con marca]), en este ejemplo (2,0, 0,286). Para obtener un
segundo punto, definiremos x igual a 3,5. (Esta elección es arbitraria; cualquier
valor x dentro del rango experimental servirá.) El despeje y resolución de y
usando la ecuación de nuestra recta de regresión da lugar a
y = 0,617(3.5) + (-0 ,9 4 8 )
y = 2 ,1 6 0 -0 ,9 4 8
y = 1 ,2 1 2
Al graficar estos puntos (2,0,0,286) y (3,5,1,212) y dibujar una línea recta entre
ellos obtenemos la recta que mejor se ajusta al experimento (Figura 8-3).
El punto de equivalencia puede ser calculado utilizando nuestra ecuación para la
recta de regresión y estableciendo y igual a 0, tal como se muestra en
la siguiente ecuación:
y = 0,617x + (-0 ,9 4 8 )
0 - 0,617 x - 0,948
0,948 = 0,617x
0,948 _
0,617 _ X
x ~ 1,536
Dado que este número representa el valor log10 de las copias del competidor,
debemos calcular su antilogaritmo. Con una calculadora, esto se consigue intro
duciendo 1,536 y presionando a continuación la tecla 10x.
antilog101,536 = 34
Log copias de competidor
■ FIGURA 8 -3 Recta que m ejor se ajusta a los datos obtenida m ediante la ecuación de regresión y = 0,617x
+ ( - 0 ,9 4 8 ) .
■ FIGURA 8 -4 Error es la cantidad que y¡ se desvía de y ¡ .
Por lo tanto, la alícuota de extracto celular contiene 34 copias de ARNm molde.

Lo bien que la recta de regresión se ajusta a los datos (o lo bien que los datos se
aproximan a nuestra recta de regresión) puede ser determinado calculando la
su m a d e lo s e rro re s cu a d ra d o s. Una medida de la dispersión total de los
valores y de la recta de regresión. Para hacer esto, definiremos y, como el valor
de y, que se encuentra en la recta de regresión para cada valor de x
y ¡ = a + bxj
El e rro r se define como la cantidad que y, se desvía de y, y se representa por ia

distancia vertical de cada punto a la recta de regresión (Figura 8-4). La re g re sió n
mide la diferencia entre el valor y , y la media de y (y).
La medida de lo adecuado que es el ajuste de la recta de regresión al gráfico
viene dada por la co rre la ció n c u a d ra d a , R2. Se trata de la proporción del total
de valores (y —y ) 2 asumidos en la regresión, o una medida de cuántos valores y¡
caen directamente en la recta de regresión que mejor se ajusta. Viene determi
nada por la siguiente ecuación, la cual utiliza el cuadrado de los valores de
regresión para cada punto:
¿ (y ,-y )2
R2 = —----------
E (y,— y)2
R2 también puede ser calculada utilizando los valores de error de cada punto.
Se obtiene usando la siguiente fórmula:
E (y ,-y )2
R2 = 1 - í= ! ----------
E (y,- - y)2
T a b la 8-9 Valores para calcular R2
x¡
0,3
■1
-0,839 -0,763
Regresión
-1,049 1,100 -0,076

Error
0,006
1,0 -0,225 -0,331 -0,617 0,381 0,106 0,011
1,3 -0,240 -0,146 -0,432 0,187 -0,094 0,009
1,7 0,130 0,101 -0,185 0,034 0,029 0,001
2,0 0,264 0,286 0,000 0,000 -0,022 0,000
2,4 0,587 0,533 0,247 0,061 0,054 0,003
2,7 0,782 0,718 0,432 0,187 0,064 0,004
3,0 0,815 0,903 0,617 0,381 -0,088 0,008
3,7 1,300 1,335 1,049 1,100 -0,035 0,001
Totales 3,431 0,043
La Tabla 8-9 proporciona los valores necesarios para calcular R2 por cualquiera
de estos métodos. Previamente, habíamos calculado que la media de x es
2,0 y la media de y es 0,286. Los valores para y¡ se calculan utilizando la
ecuación
y¡ — mx¡ + b
donde b es igual a —0,948 y m es igual a 0,617 (según los cálculos previos).

A partir de la Tabla 8-9, se derivan los siguientes valores:
¿ ( y , - y ) 2 ~ 3,43i
9
= 0,043
La suma de (y, —y ) fue calculada en la Tabla 8-8 y determinada como

3,473. Utilizando la primera ecuación para calcular R2 se obtiene el siguiente
resultado:
£ (y ,- y )2
R2 = -----
£ (y ,-y )2
3,431
R2 = —---- = 0,988
3,473
El mismo resultado se obtiene utilizando el método alternativo:
R2 =
¿ ( y ,-y )2
0,043
R2 =
~ 3,473
1 - 0,012 = 0,988
Por lo tanto, la recta de regresión representada tiene un valor R2 de 0,988.

Cuanto más se aproxime el valor R2 a 1,0, mejor es el ajuste de la recta de
regresión. Un valor R2 de 1,0 corresponde a un ajuste perfecto; todos los valores
y se encuentran en la recta de regresión. En la experimentación real, R2 será
inferiora 1,0.R2 será igual a cero siX/ey,so n completamente independientes;es
decir, pese a conocer un valor para x¡, no tendrá ninguna manera de predecir el
valor correspondiente para y¡. Podemos esperar un valor R2 de 0 si el gráfico de
dispersión es completamente aleatorio; es decir, si hay puntos distribuidos por
todo el gráfico, sin ninguna relación entre x e y.
Una medida alternativa del ajuste de la recta de regresión con el gráfico de datos
experimentales viene determinada por el coeficiente de correlación, r, repre
sentado por la ecuación
r = (signo de m ) V ^
donde re s un valor positivo si la recta de regresión sube hacia la derecha (tiene

una pendiente positiva) y negativo si la recta baja hacia la derecha (tiene una
pendiente negativa). Si existe una relación tal que un valor (x) cambia y a
continuación otro valor (y) también cambia de forma relacionada, se dice que
los dos valores están correlacionados. El valor de r varía de —1 a 1, considerando
que 1 indica una relación lineal perfecta entre x e y, así como una pendiente
positiva, mientras que —1 indica una relación lineal perfecta con pendiente
negativa. Cero indica que no existe relación lineal.
Para este ejemplo, m es un valor positivo (+0,617) y la ecuación para re s
r = V r2
= V 0 9 8 8 = 0,994
Por lo tanto, la recta de regresión tiene un coeficiente de correlación, r, de 0,994.

■ R E S U M E N D E L C A P IT U L O
L a re acc ió n en ca d en a d e la p o lim e rasa (P C R ) se u tiliz a p ara a m p lifica r u n
seg m en to específico d e A D N y tien e ap lica cio n es en la clo n a ció n d e g en e s, la
sec u en cia ció n de A D N , la detección d e m u tacio n e s y análisis forenses. E l p roceso
d e P C R g e n e ra c a d en a s d e A D N re plicadas (asu m ie n d o u n a efic ien cia perfecta) a
u n a ta sa d e 2", do n d e n es igual al n ú m ero d e cic lo s d e desnaturalización,
hib rid ac ió n y ex ten sió n . D a d o q u e las P C R n o tien en u n a efic ien cia d el 100% ,
la am p lifica ció n es m ás ad e cu a d am en te e x p resad a com o
Y = (1 + E ) n
donde Y es el grado d e am plificación, n representa e l nú m ero d e ciclos d e P C R y

E es la eficiencia m edia de am plificación. E l núm ero de copias d e m olde de partida,
X , pu ed e se r incorporado en la ecuación d e am plificación d e la siguiente m anera:
Y = X ( 1 + E )n
L a tem p eratu ra d e fu sió n ( Tm) d e la ca d en a d ia n a p u e d e se r ca lcu lad a com o
f. = . l j + l^ +^ J + 0 ,4 1 (% G + C ) - ^
do n d e L = el tam año del am plicón en pb. % G + C se calcula usan d o las fórm ulas
% d e G + C — ____ bases G + C en el am plicón x 10Q

nú m ero total de b ase s en el am plicón
[SAL] = [K+] + 4[M g2+]°'5
E n esta ú ltim a ec u ac ió n , cu a lq u ie r o tro ca tió n m o n o v alen te q u e se e n c u en tre en

la P C R , com o N a , p u ed e se r sustitu id o p o r K .
E x isten v ario s m éto d o s p ara c a lcu lar la Tm d e lo s ce b ad o re s d e la P C R . P ara
ce b ad o re s cortos (e n tre 14 y 20 n t d e tam año), se p u ed e re alizar u n cálcu lo rápido
d e la Tm del ce b ad o r u tiliz an d o la ecu ac ió n sencilla
T m = 2 ° ( A + T ) + 4 ° (G + C )
la cual tien e en co n sid erac ió n el n ú m ero d e v ec es q u e c a d a residuo n t ap arece en

el olig o n u cleó tid o . O tra fó rm u la frecuentem ente u s a d a p a ra ca lcu lar la Tm es la
siguiente:
Tm = 81,5° + 1 6 ,6 (lo g [M + ]) + 0,41 (% G + C ) - ( 5 0 0 / # )

d o n d e [M^] es la c o n c en tra ció n d e ca tió n m o n o v alen te en la P C R (p a ra la m ayoría

d e P C R , éste sería KC1) e x p resad a en m oles p o r litro y N es igual al nú m ero d e nt
en el cebador. E l térm in o % G + C en esta ecu ac ió n no d eb e se r ex presado com o
decim al (5 0 % G + C , n o 0 ,50 G + C ). E sta fó rm u la to m a en co n sid eració n la
co n c en tra ció n d e sal, el tam añ o d el c e b a d o r y el co n te n id o d e G + C . P u ed e ser
utiliz a d a p ara ce b ad o re s co n u n tam añ o d e 14-70 n t. E l m éto d o m ás rig u ro so para
c a lcu lar la Tm d e ce b ad o re s tien e en c u e n ta las interacciones entre n u cleótidos
adyacentes:
r " ~ A H ° - A G ° + R T ° ln (C ) + 16,6 *0g [ l ,0 + 0 ,7 (S A L )] ~~ 269,3
en la que
(S A L ) = (K + ) + 4 ( M g + 2 )0'5
y 3”° es la tem p eratu ra (e n gra d o s K elvin), A H ° es el cam bio d e entalpia, A G° es

el ca m b io e stán d a r d e e n e rg ía libre, R es la co n stan te m o lar d e u n gas y C es la
co n c en tra ció n m o lar d el cebador.
L as co n c en tra cio n es de ce bador, dN TP, m ag n esio , m olde, A D N p o lim e rasa y todo
el re sto d e co m p o n e n te s pu ed e n se r d eterm inadas m ediante an á lisis dim ensional
estándar.
L a ta sa de erro r de u n a A D N p o lim e rasa du ra n te la am p lifica ció n p o r P C R pu ed e
se r ca lcu lad a co m o
d o n d e F(n) es la fracc ió n d e ca d en a s co n s ec u en cia co rrec ta tras n ciclos, E es la

efic ien cia d e am plificación, n es e l nú m ero d e cic lo s y P es la pro b a b ilid ad d e que
se p ro d u z ca u n frag m en to d e P C R sin errores en u n cic lo d e am plificación
co n sid eran d o u n a d istrib u ció n d e P o isso n d e su cesos raros. E l cálcu lo d e la
pro b a b ilid ad m ed ian te la d istrib u ció n d e P o isso n u tiliz a la fó rm u la general.
d o n d e e es la b a s e d el siste m a logarítm ico n atural y r re p rese n ta el n ú m ero de

« su ce so s» . r\ (r factorial) re p rese n ta el p ro d u c to d e ca d a en te ro p o sitiv o d esd e r
h a s ta 1, in cluyendo a este ú ltim o. E n la ecu ac ió n d e P o isso n P = e~ \ 7 r ! , X es
igual a la ta sa d e erro r d e la A D N p o lim e rasa m u ltip licad a p o r el tam añ o del
am p licó n en nt. P ara el ca so cero (« sin su ce so s» o n o in co rp o rac ió n d e errores),

r = 0 y la ec u ac ió n d e P o isso n se c o n v ie rte en
L a reacción en ca d en a d e la p o lim e rasa p u e d e se r u tiliz ad a p a ra cu a n tific ar

ácidos nucleicos m ed ian te u n a re acc ió n co m p e titiv a entre u n m o ld e desc o n o cid o y
u n a serie d e d ilu cio n es d e u n m o ld e co n o c id o y calibrado. L a re g resió n lin eal se
u tiliz a p a ra d ete rm in a r la ecu ac ió n d e la re cta q u e m ejo r se aju sta a los d ato s y a
con tin u ac ió n p u e d e se r u s a d a para ca lcu lar el p u n to d e equivalencia, en el cual la
co n c en tra ció n in icial d e d ia n a antes d e la P C R c o m p e titiv a es igual a la cantidad
inicial c o n o c id a d el m olde com petidor. E n el p u n to d e eq u iv a le n cia, el v a lo r de y
e n la ecu ac ió n d e la re cta (y = mx + b) se establece c o m o cero. E l cálculo de m y b a
p a rtir d e la re cta d e re g resió n nos p erm ite d e te rm in a ra cu a n d o y es igual a cero. El
antilogaritm o d e x g en e ra el n ú m ero d e copias d e m o ld e inicial.
B re sla u e r, K .J ., R . F ra n k , H . B lo c k e r, a n d L .A . M a rk y ( 1 9 8 6 ). P r e d ic tin g D N A d u p le x sta b ility
fro m th e b a s e se q u e n c e . Proc Natl Acad Sci USA 8 3 :3 7 4 6 - 3 7 5 0 .
W e tm u r, J.G ., a n d J J . S n in s k y ( 1 9 9 5 ). N u c le ic a c id h y b r id iz a tio n a n d u n c o n v e n tio n a l b a se s. I n
PCR Strategies (M .A . I n n is , D .H . G e lfa n d , a n d J J . S n in sk y , e d s .). A c a d e m ic P re ss, S a n
D ie g o , C A , p p . 6 9 - 8 3 .
LEC T U R A S REC O M EN D A D A S
G illila n d , G ., S . P e r rin , K . B la n c h a r d , a n d H .F . B u n n ( 1 9 9 0 ). A n a ly s is o f c y to k in e m R N A a n d
D N A : d e te c tio n a n d q u a n tita tio n b y c o m p e titiv e p o ly m e r a s e c h a in r e a c tio n . Proc Natl Acad
Sci USA 8 7 :2 7 2 5 - 2 7 2 9 .
H a y a s h i, K . ( 1 9 9 4 ). M a n ip u la tio n o f D N A b y P C R . I n The Polymerase Chain Reaction
(K . M u llís , F. F e r ré , a n d R .A . G ib b s , e d s .). B irk h á u se r, B o s to n , p p . 3 - 1 3 .
P ia ta k Jr., M ., K .-C . L u k , B . W illia m s , a n d J .D . L if s o n ( 1 9 9 3 ). Q u a n tita tiv e c o m p e titiv e p o ly
m e ra se c h a in r e a c tio n f o r a c c u ra te q u a n tita tio n o f H IV D N A a n d R N A s p e c ie s. BioTechniques
1 4 :7 0 - 8 0 .
Q u a rtin , R .S ., a n d J .G . W e tm u r (1 9 8 9 ). E f fe c t o f io n ic stre n g th o n th e h y b rid iz a tio n o f o lig o -
de o x y n u c le o tid e s w ith re d u c e d c h a rg e d u e to m e th y lp h o sp h o n a te lin k a g e s to u n m o d ifie d o li-
go d e o x y n u c le o tid e s c o n ta in in g th e c o m p le m e n ta ry se q u en c e. Biochemistry 2 8 : 1 0 4 0 -1 0 4 7 .
Capítulo
La reacción en cadena de la
polimerasa a tiem po real (RT-PCR)
D esde su in tro d u cc ió n en 1983, la P C R se h a u s a d a d e fo rm a ex te n sa p ara u n
am plio ab a n ico d e ap lica cio n es inclu y en d o la clo n ació n d e g en e s, la cartografía
g en é tic a, la dete cció n de m u tacio n es, la sec u en cia ció n d e A D N y la identificación
d e individuos. Tal com o se h a discu tid o en el capítulo anterior, la P C R es adem ás
u n a h erram ien ta v a lio sa p a ra m ed ir la ex presión g énica, y u n a v ariante d e esta
té c n ic a co n o c id a c o m o P C R co m p e titiv a s e m u estra com o u n o de lo s m éto d o s que
se p u ed e n u tiliz a r p ara c a lcu lar la ca n tid a d d e A R N m g en e rad a d u ra n te la
tran sc rip ció n d e u n g en específico. D ado q u e los pro d u c to s d e P C R q u e se
sintetizan en d ich o pro to co lo son sep a rad o s y cu a n tific ad o s p o r electroforesis
en gel, el m éto d o es u n en sayo d e p u n to final. E sto s ig n ifica q u e los pro d u c to s
son ana liz ad o s desp u é s d e q u e la re acc ió n q u e lo s g en e ra h a y a finalizado.
In n o v a cio n es en la in strum entación y en la q u ím ic a d e m arcadores fluorescentes
h an perm itid o el desa rro llo rá p id o d e m éto d o s q u e p u ed e n d ete ctar pro d u c to s de
P C R a medida que se sintetizan, es decir, a tiem po real.
S e h a n descrito v ario s m éto d o s d e P C R a tiem p o real, p ero d o s d e ello s h an
re su lta d o se r los m ás p opulares. U no d e ellos u tiliz a u n a m o lécu la q u e se u n e al
A D N d e n o m in ad a S Y B R ® green. S e trata d e u n m arc ad o r q u e se u n e a A D N cd ,
p ero n o a A D N cs y, cu an d o se p ro d u c e tal un ió n , em ite fluorescencia. D u ran te la
re acc ió n d e am plificación, la m u estra p ro d u c irá u n a ca n tid a d c a d a v e z m ay o r de
señal flu o rescen te a m ed id a q u e se g en ere m ás y m ás pro d u c to d e ca d en a do b le al
cual el m arc ad o r S Y B R g re en se p u e d a unir. L a cantidad d e flu o re scen c ia en
la re acc ió n en u n m o m en to determ in ad o está, p o r tan to , d irectam ente re lacionada
co n el nú m ero d e m oléculas d e A D N cd p re sen tes en la reacción. S in em b a rg o , la
d e sv e n ta ja d el S Y B R gre en es q u e em itirá flu o re scen c ia cu a n d o se u n a a cua lq u ie r
pro d u c to de do b le c a d e n a p resen te en la re acc ió n , in d ep endientem ente de q u e sean
pro d u c to s específicos, no específicos, d ím ero s d e ce b ad o re s u o tro s artefactos de
am plificación.
E l o tro m éto d o d e P C R a tiem p o re al se co n o c e co m o T aqM an® o en sa y o d e la
n u cleasa 5'. U tiliz a u n a so n d a m arcad a con un flu o ró fo r o que s e híb rid a a u n a
d e las ca d en a s d el m olde en u n a po sició n c e rca n a y p o r detrás d e u n o d e lo s dos
212 CAPÍTULO 9 La reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real (RT-PCR)
ce b ad o re s d e la P C R . E l flu o ró fo ro , d en o m in ad o rep ortero, se en g a n ch a al

extrem o 5' d e la sonda. E n e l ex tre m o 3 ' d e la so n d a se e n c u en tra o tra
m olécula, d e n o m in ad a in h ibid or, la cual ab so rb e la en erg ía d e la fu e n te
lu m ín ic a u tiliz ad a p ara ex c ita r el m arc ad o r reportero. C u an d o el reportero y el
in h ib id o r están co n e ctad o s un o al o tro a trav é s d e la so nda, el in h ib id o r reduce la
señ a l fluorescente d el flu o ró fo ro reportero. S in em bargo, durante la P C R , la A D N
p o lim e rasa T aq, a m ed id a que ex tien d e el c e b ad o r hib rid ad o a la ca d en a m o ld e
co m p lem e n ta ria a la so nda, d esp laz a y d eg rad a la so n d a h ib rid ad a g ra cias a su
actividad e x o n u c leasa d e 5' a 3 '. E l fluoróforo reportero es enton ces sep a rad o de
su co n e x ió n m o lecu la r al in h ib id o r y em ite fluorescencia. C u an to m ás p ro d u c to de
P C R se g en e re, m ás so n d a s e p u ed e u n ir a ese pro d u c to . C u an ta m ás so n d a esté
u n id a, m ás m arc ad o r reportero será liberado d u ra n te el pro c eso de am p lifica ció n y
m ás señal se generará. L a señal fluorescente, p o r tan to , está d irectam ente re la cio
n ad a co n la cantidad d e m o ld e inicial.
T anto en el ca so d e la utiliz ació n d e S Y B R gre en com o en el d e sondas
T aq M a n ® , la relación entre la intensidad d e señal y la ca n tid a d d e m o ld e en
u n a P C R a tiem p o real p ro p o rcio n a u n m o d o fiable de cu a n tific ar ácidos nucleicos
y d e co m p ro b a r la pre sen cia o a u se n cia d e sec u en cia s esp e cífica s en genes.
9.1 L A S F A S E S D E L A P C R A T IE M P O R E A L
E n u n a P C R , la s ec u en cia d e A D N d ian a es am p lifica d a d e fo rm a exp o n e n cial: u n
m olde es rep lic ad o en d os pro d u c to s, d os e n cuatro, cuatro en o cho, etc. C om o
p rim era ap ro x im ació n , esta afirm ación es suficientem ente correcta. S in em bargo,
la am p lifica ció n e x p o n e n cial n o p u ed e se r m an ten id a p o r tiem po indefinido.
N o rm a lm e n te la re acc ió n h a dism in u id o su v elo c id a d h a c ia el cic lo 35 (d e p en
dien d o d e u n a serie d e factores). L o s ce b ad o re s y dN T P y a n o s o n ab undantes
en ex c eso , la A D N p o lim e rasa h a p erd id o u n a p arte d e s u actividad, la des
natu ra liz ac ió n co m p leta se v u elv e m en o s efic ien te y los p ro d u c to s son degradados
deb id o a la ac tiv id a d n u cle asa d e la p o lim erasa. A m ed id a q u e esto s su cesos tien en
lu g ar, la re acc ió n entra en u n a fa se lin eal (F ig u ra 9-1), en la cual el m o ld e d eja de
d u p licarse co m pletam ente. L le g a u n m o m en to en q u e la re acc ió n e n tra en u n a fase
plateau h a c ia el cic lo 4 0 , en la cual la am p lifica ció n y a h a cesado.
L a P C R a tiem po real se b a sa en la cap ac id a d del instrum ento d e d ete ctar aquel
cic lo d e am p lifica ció n en el cual se h a a c u m u la d o su ficie n te p ro d u c to d e P C R
co m o p a ra g en e rar u n a señ a l flu o re scen te p o r en c im a d el ruido de fon d o (señal en
el lím ite d e d ete cció n d el in stru m en to q u e flu ctú a du ra n te lo s p rim ero s cic lo s de
am plificación). E l nú m ero d e ciclo d e P C R e n el cual la señal se p u e d e distin g u ir
del ruido d e fo n d o se d en o m in a ciclo u m b ral o, abreviado, v a lo r Cx* E n la P C R se
co n sid era com o ax io m a que, sien d o to d o s lo s parám etro s iguales (sin inhibición o
anom alías d el ap arato), cuanto m a y o r es la ca n tid a d d e ác id o n ucleico inicial que
se u s a co m o m olde, m a y o r es la ca n tid a d d e pro d u c to q u e se p u e d e gen e rar y m ás
■ FIGURA 9-1 Las tres fases de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiem po real. La fase exponencial ya empieza en el tercer ciclo. Sin embargo, el
instrum ento n o puede detectar los productos generados en los primeros ciclos. El gráfico muestra el núm ero de ciclo de PCR en el eje x y la señal reportera normalizada
(R J en el eje y . Rn es la relación entre la intensidad de la señal fluorescente del marcador reportero y la intensidad de la señal fluorescente de un marcador de referencia
pasivo (normalm ente el fluoróforo rojo ROX) presente en todas las reacciones.
tem p ra n o p u ed e éste se r detectado. A sí pu es, en la P C R a tiem po real: cuanto

m ay o r es la ca n tid a d d e m o ld e inicial, el cic lo u m b ral se alc an za m ás tem prano y el
v a lo r C t es m ás b ajo . E sto c o n stitu y e la b a s e d e la cua n tific ac ió n d e A D N . P ara
u n a P C R a tiem p o real c o n u n a efic ien cia d el 100% , la ca n tid a d d e p ro d u c to se
d o b la en ca d a ciclo. U n a m o lécu la se co n v ie rte en dos, d o s en cuatro, cu a tro en
o cho, och o en diec isé is, etc. D e l m ism o m o d o , u n cam bio d e u n v a lo r C T (d e un
v a lo r m ás alto a u n o m ás b a jo ) re p rese n ta u n a dup licac ió n d e la m o lécu la diana.
U n cam bio de dos valo re s C t re p rese n ta u n aum e n to de c u a tro v ec es de la cantidad
d e dian a. U n cam bio d e tres valo res C t re p rese n ta u n au m e n to d e och o v ec es de la
d ia n a am plificada, etc. M atem á tic am en te, u n ca m b io d e u n a v e z en el v a lo r C t
(A C t ) eq u iv a le a 2 -ACT (A C t = 2 -ACT v ec es d e diferencia).
E l v a lo r C t es au to m ática m e n te determ in ad o p o r el p ro g ram a inform ático del
eq u ip o d e P C R a tiem po real, p ero tam b ién pu ed e se r determ in ad o m anualm ente,
en cu y o ca so el o p erad o r establece u n a lín ea u m b r a l. L a lín ea um b ral, tan to si es
d ete rm in a d a a u to m ática co m o m anualm ente, defin e el v a lo r C t p o r el p u n to donde
la m ism a co rta a la cu rv a de am plificación. E l cic lo um b ral d ebería se r designado
d en tro del áre a ex p o n e n cial d e la cu rv a d e am p lificació n , d o n d e lo s co m p o n en tes
d e la re acc ió n están en ca n tid a d ab u n d a n te y n o lim itante. E n lo s ap arato s d e P C R

a tiem p o re al co n stru id o s p o r Applied Biosystems, el u m b ral q u e d a configurado
p o r d efecto a d ie z desv iac io n es están d a r p o r en c im a d e la lín ea b a s e m ed ia d e señal
fluorescente g en e ra d a d u ra n te los p rim ero s cic lo s d e am p lifica ció n (típicam ente
entre el te rc e r y quinto ciclo).
P ro b le m a 9.1 Dos muestras de ADN, A y B, son sujetas a un experimento de

PCR a tiempo real en el cual se analiza el gen ¡3-actina. La muestra A produce
un valor CT de 21,8. La muestra B produce un valor C t de 23,2. ¿Cuántas veces está
la cantidad de diana en la muestra A aumentada sobre la de la muestra 6?
S o lu c ió n 9.1
Las veces de aumento están determinadas por
veces de aumento = 2 ~ACj
La A C t, la diferencia entre dos valores CT, es
A C j = 21,8 - 23,2 = - 1 ,4
Y las veces de aumento son
2 - a c t = 2-1-1.41 = 21'4 = 2,64
Por este motivo, hay una diferencia de 2,64 veces en la cantidad de producto
amplificado en la muestra A en comparación con la muestra B.
Si la A C t es un número positivo — si hubiéramos restado 21,8 de 23,2 para

obtener 1,4— el exponente sería negativo y esto nos daría una fracción:
2- a ct = 2 -1’4 = 0,379
Dado que existe una relación inversa entre el valor Ct y la cantidad de

molde — cuanto más bajo es el valor CT, mayor es la cantidad de molde
que se puede am plificar presente en la muestra— necesitaríamos obtener el
recíproco del valor calculado (dividir 1 entre el valor) para determinar las
veces de aumento entre dos muestras:
1/0,379 = 2,64
Y, de nuevo, obtenemos un aumento de 2,64 veces en la muestra A respecto a la

muestra B.
9.2 Controles 215
9.2 C O N T R O L E S
U n ex p erim en to d e P C R a tiem po real típ ic o in clu irá v ario s controles. U n con trol
sin m old e (C S M ) es u n a re acc ió n q u e contiene to d o s lo s reactivos, ce b ad o re s y
so n d as necesarios p ara u n a P C R a tiem p o re al excepto el A D N m olde. E l C S M se
u tiliz a p a ra v e r si la señal se p u e d e g en e rar en au se n cia d e u n ác id o nucleico diana.
P u ed e d ete ctar co n ta m in a cio n es y cu a lq u ie r tip o d e interacciones en tre ce b ad o re s
o s o n d a que co n d u z ca n a señ a le s flu o rescen tes q u e p u ed a n co n fu n d ir los resul
tados.
U n con trol ex ó g e n o es u n ác id o nu cle ic o b ien caracterizado o u n a
c o n stru c ció n sin te tiz ad a d e A R N o A D N in tro d u cid a en c a d a re acc ió n a u n a
co n c en tra ció n conocida. P u e d e serv ir c o m o con trol p ositiv o in tern o (C P I, en
inglés internal positive control [IPC ]) p a ra d iferen c ia r e n tre u n a in h ib ic ió n d e la
P C R y u n a re acc ió n n eg a tiv a real. T am bién se u tiliz a p a ra e x p lica r pro b lem a s de
in co n sisten cia que pu ed a n ocu rrir cu an d o se p re p ara la M ez cla M áster. U n con trol
en d ógen o e s u n ácido nu cle ic o p re sen te en la pre p ara ció n d el g e n d ian a qu e, con
lo s ce b ad o re s y so n d a ap ropiados, tam b ién p u e d e s e r dete ctad o en las P C R a
tiem p o real. P u e d e s e rv ir com o re feren cia a c tiv a p a ra n o rm aliza r las d iferen c ia s en
la cantidad d e A R N m to tal d e d ia n a aña d id o a la P C R a tiem po real.
L a in ten sid ad d e señ a l de las P C R a tiem p o re al tam b ién d eb e se r n orm alizada.
L a n o rm a liza c ió n , la co rrec ció n d e las flu ctu a cio n es d e in ten sid ad d e señal entre
lo q u e d eb e rían se r m u estra s idénticas, s e llev a a cabo a d o s niveles: u n o para
co rreg ir las varia cio n es en la co n c en tra ció n d e reactiv o s d e P C R y el otro
p a ra co m p e n sa r p o r las diferencias en las ca n tid a d d e A R N aislado d e diferentes
m uestras d e tejid o s (c u an d o se u s a la P C R a tiem p o real p ara m ed ir ex p resió n
g énica). M u ch o s ex p e rim en to s de P C R a tiem p o re al s e llev an a cabo en p lac as que
tien en entre 4 8 y 3 8 4 p o cilio s, y ca d a u n o d e ello s co n tien e u n a m u estra y reactivos
p a ra la am plificación. E l h e c h o d e d isp en sar c o n p ip eta tan to s co m p o n e n te s en
p aralelo p u ed e in tro d u cir v aria cio n es entre m u estra s — alg u n o s po cilio s pu ed e n
re cib ir m ás o m en o s reactiv o s q u e o tro s— . L as diferencias de co n c en tra ció n d e los
co m ponentes en tre m u estra s paralelas p u ed e n d a r lu g a r a varia b ilid a d en
lo s niveles calcu lad o s d e lo s genes o bjeto d e estudio. E s ta varia b ilid a d pu ed e
se r co rreg id a m ed ian te la inclusión d e u n a referen cia p a siv a d en tro d e la m ezcla
d e P C R co n la cual se c o m p a ra la señ a l g en e rad a du ra n te la am plificación. E n las
m ezclas p ro p o rcio n ad a s p o r Life Technologies, esta re feren cia p a siv a es el
fluoróforo R O X (ro jo p a ra lo s d etectores d e los instrum entos A B I). S e den o m in a
re feren cia p a siv a p o rq u e ni p artic ip a co m o u n co m p o n e n te n ecesario d e la
am plificación n i la inhibe. S im plem ente em ite flu o re scen c ia roja.
Im ag in e q u e está llev an d o a ca b o u n ex p e rim en to d e an á lisis d e ex p resió n
g én ic a m ed ian te u n a P C R a tiem po real y en u n p o cilio de la p la c a ac cid en talm en te
co lo c a 2 0 0 n g d e A R N m to ta l aislado d e células hep á tic as y en o tro c o lo c a sólo
100 n g de A R N m to tal aislado de células m usculares. Incluso si en re alid ad el gen
d ian a se e x p resa a niv eles eq u iv alen tes en am b o s tipos ce lu la res, parece ría q u e el
g en se e x p re sa dos v ec es m ás en células h ep á tic as q u e en células m usculares. L a

no rm aliza ció n , m ed ian te la cual la in ten sid ad de señal del flu o ró fo ro d e referencia
se d iv id e entre la in ten sid ad d e señal d el flu o ró fo ro d e re feren cia p asiv a, p u ed e
co rreg ir tal discrepancia. E ste pro c eso g e n e ra u n v a lo r den o m in ad o R n, en v irtu d a
rep ortero n orm a liza d o (v é ase la F ig u ra 9-1).
9.3 C U A N T IF IC A C IÓ N A B S O L U T A M E D IA N T E
EL EN SA YO TAQ M AN
E l ob jetiv o d e la cu an tificación ab solu ta es d ete rm in a r la co n c en tra ció n re al de
u n ác id o n ucleico en u n a m uestra. D ic h a co n c en tra ció n p u ed e s e r e x p resad a en
fo rm a de p eso o d e n ú m ero d e co p ia s, p ero, d e cu a lq u ie r m anera, requiere q u e se
g en e re u n a cu rv a e stán d a r a p a rtir d e u n a serie d e dilu cio n es d e u n a m u estra de
A D N c o n u n a co n c en tra ció n ca lcu lad a p o r m étodos in dependientes. S i se pre p a
ra n ad e cu a d am en te, lo s e stán d a r d iluidos gen e rarán u n a lín ea re cta cu a n d o se
g ra fiq u en s u s v alo res CT enfrentados al log d e la co n c en tra ció n d e A D N en cada
dilución. P a ra la m ay o ría d e ap lica cio n es, la d ian a p re sen te en el e stán d a r es un
g en d e co p ia ú n ic a — es decir, u n g en p re sen te sólo u n a v e z en u n g en o m a
hap lo id e— . U n a m u estra d e A D N desc o n o cid a, an a liz ad a c o n lo s m ism os ceba
dores de am p lifica ció n y so n d a T aqM an q u e lo s q u e se utiliz an p a ra el estándar, es
cu a n tific ad a en fu n c ió n de su va lo r C t com p a rad o co n el de la c u rv a estándar. P ara
re su lta d o s m ás correctos, la co n c en tra ció n d e la m u estra d esc o n o cid a d eb ería
qu ed a r c o m p re n d id a d entro d e los lím ites d e las co n c en tra cio n es representadas
en el estándar.
9.3.1 P re p a ra ció n de las d ilu cio n e s e stá n d a r

D ado q u e lo s instrum entos q u e se u san p a ra re co g er datos son cap ac es d e detectar
tal am plio ab a n ico d e señ ales fluorescentes, el A D N e stán d a r p u e d e se r diluido
vario s ó rdenes d e m agnitud. E l sig u ien te p ro b lem a dem o stra rá có m o se p reparan
estas diluciones.
P ro b le m a 9 .2 El kit de cuantificación de ADN humano «Quantifiler™ Human

DNA Quantification Kit» comercializado por Life Technologies para la
cuantificación de muestras de ADN forenses contiene un ADN humano estándar
con una concentración de 200 ng/[xL. El protocolo requiere que haga una serie
de ocho diluciones del estándar en tampón TE (Tris/EDTA). Las muestras diluidas
tendrán concentraciones de ADN de 50, 16,7, 5,56, 1,85, 0,62, 0,21, 0,068 y
0,023 ng/pl. Para cada muestra, prepara las diluciones dispensando 10 jxL de un
tubo en el siguiente.
a) ¿Cuál es el factor de dilución necesario para preparar el primer tubo con ADN
a una concentración de 50 ng/[xL?
b) ¿Cuál es el factor de dilución del segundo tubo con ADN a una concentración
de 16,7 ng/pL?
9.3 Cuantificación absoluta mediante el ensayo TaqMan 217
c) ¿En qué volumen de tampón TE deberían ser dispensados 10 [j,L de la solución

de ADN humano stock (a 200 ng/pL) para generar el primer estándar con
una concentración de ADN de 50 ng/p,L?
d) ¿En qué volumen de tampón TE deberían ser dispensados 10 (xL de la dilución
a 50 ng/p,L para preparar el segundo tubo con dilución estándar de
manera que su concentración sea de 16,7 ng/(iL?
e) ¿Cuáles son las diluciones que necesita hacer para preparar toda la serie
de diluciones?
La solución stock de ADN humano tiene una concentración de 200 ng/jiL. Una
alícuota de 10 [xL del stock se utiliza para preparar una dilución con una
concentración final de 50 ng/jiL. Para determinar el factor de dilución, estable
ceremos una regla de tres. Queremos el número uno como el numerador de
nuestro factor de dilución expresado como fracción (en vez de decimal).
Preparamos la ecuación de manera que se pueda afirmar que «50 ng/|xL es a
200 ng/jiL lo mismo que 1 es a x» A continuación despejamos y resolvemos la x:
50 n g /p i _ 1
200 ng/(iL x
Las unidades ng/|xL se anulan. Utilizando el álgebra para resolver la x obtene

mos:
50x
- 1
200
50x - 200
_ 200 _
x
_ ~50~ _
La relación entonces es
50 ng/jxL _ 1
200 ng/(iL 4
Por lo tanto, usamos un factor de dilución de ’/4 para generar el primer estándar
con una concentración de 50 ng/^L.
La dilución también puede ser expresada como valor de «número de veces». En
este caso, dividimos la concentración inicial entre la concentración del estándar
diluido:
200 ng/|xL _
50 ng/p,L
Así, estamos diluyendo la solución stock cuatro veces. También podemos afir
mar que estamos haciendo una dilución «4X» del stock.
S o lu c ió n 9.2(b )
El factor de dilución usado para preparar una concentración de 16,7 ng/pl a
partir de una alícuota de 10 ^.L obtenida de la primera dilución (a 50 ng/|xL) se
calcula resolviendo la x en la siguiente ecuación.
16,7 ng/|xL _ 1
50 ng/^L x
16,7x
50 “ 1
16,7x = 50
50
X
_ 16,7 ~
A continuación obtenemos
16,7 ng/jiL _ 1
50 ng/p,L 3
Por tanto, usamos un factor de dilución de V3 para preparar el estándar a

16,7 ng/jiL a partir de una alícuota de estándar a 50 ng/p,L.
Vamos a tomar 10 (xL de la solución de ADN stock con una concentración de
200 ng/jxL y diluirlos en un volumen de tampón TE para generar un estándar con
una concentración de 50 ng/(j,L. En la Solución 9.1(a) calculamos que vamos a
hacer una dilución V4. Podemos calcular el volumen de TE necesario para
nuestro segundo tubo de dilución mediante una regla de tres que afirme que
«1 es a 4 lo mismo que 10 jiL es a x p,L». Entonces resolvemos la x:
1 _ 10 nL
4 x jaL
x = 10 x 4 = 40
Así, 10 (xL de la solución stock de ADN a 200 ng/(iL deberían ser dispensados en
un volumen total de 40 jxL. El primer tubo de dilución debería contener 30 de
TE y 10 ^lL del estándar de ADN a 200 ng/(xL para así generar un estándar con
una concentración de 50 ng/p,L.
Podríamos haber resuelto este problema también utilizando la fórmula más

general
200 ng/(xL x 12-!^ = 5 0 ng/p,L
y a continuación despejando la x:
2.000 ng/(iL
— 50 ng/p,L
2.000 ng/p,L = (50ng/p,L)x

2.000
Ambos métodos nos dicen que la primera dilución de nuestro estándar debe
tener un volumen final de 40 di
so lu c ió n 9.2(d)
Vamos a dispensar 10 |j,L de la primera dilución con una concentración de
50 ng/p,L en un volumen de TE tal que la concentración de ADN en este segundo
tubo estándar sea de 16,7 ng/^L. Ya hemos determinado en la Solución 9.2(b)
que necesitamos diluir el primer estándar V3. Para determinar qué volumen de
TE debería dispensarse en el segundo tubo de dilución, podemos establecer una
regla de tres como hicimos en la Solución 9.2(c):
10 p,L
x (xL
x = 10 x 3 = 30
Así, pues, el volumen final de la segunda dilución con una concentración de ADN
de 16,7 ng/|iL debería ser 30 |_lL. Tendremos que poner 20 p,L de TE en el
segundo tubo y añadir 10 jiL del primer estándar para obtener un volumen
final de 30 |xL.
S o lu c ió n 9.2(e)
Tenemos que preparar una serie estándar con concentraciones de ADN de 50,
16,7, 5,56, 1,85, 0,62, 0,21, 0,068 y 0,023 ng/(xL. En los pasos descritos ante
riormente hemos determinado que los dos primeros estándar de la serie se
preparan dispensando 10 p,L de la solución de ADN stock (a 200 ng ADN/jiL) en
30 jxL TE y luego tomando una alícuota de 10 p,L del primer estándar y
diluyéndola en 20 (xL de TE para generar el segundo estándar. Dividiendo la
concentración de cada estándar entre la concentración del siguiente estándar
más alto, observamos que cada estándar a partir del segundo requiere una
dilución 3X:
16,7 _ 5,56 _ 1,85 _ 0,62 _ 0,21 _ 0,068 _

5^56 L8 5 _ 062 _ 0 2 Í_ 0,068 _ 0,023 _
Por tanto, dado que cada estándar a partir del segundo (e incluyendo a éste)
requiere una dilución V3 y dado que estamos transfiriendo 10 jiL entre cada uno,
nuestra serie de diluciones será:
200 n L x 1 0 |l L x 10 M,L x 10|J'L x 10 M’L x 10 ^ x 10 x 1 0 |lL x 10m,L

n9' 1
^ X 40 (íL X 30 |xL X 30 [xL X 30 \ il X 30 jxL X 30 jxL X 30 \l L X 30 jiL
ng/jxL : 50 16,7 5,56 1,85 0,62 0,21 0,068 0,023
9.3.2 P re p a ra ció n de u na cu rv a e stá n d a r p a ra la re acció n

en ca d e n a de la p o lim e ra sa c u a n tita tiv a (qPCR)
b a sa d a en el n ú m ero d e co p ias
A lg u n o s ex p e rim en to s cuan tita tiv o s d e P C R a tiem p o re al se llev an a cabo para
d ete rm in a r cu á n tas copias d e u n g en específico están p re sen tes en u n a m uestra
desconocida. E ste tip o d e cuan tific ac ió n re q u ie re la creac ió n d e u n a cu rv a están d a r
b asa d a en el n ú m ero d e co p ia s d e u n gen. E l n ú m ero d e copias d e u n g en en u n a
m u estra d esc o n o cid a v ie n e determ in ad o p o r s u v a lo r C T y la extra p o lació n del
m ism o en u n a cu rv a e stán d a r de C t frente al n ú m ero d e co p ia s del gen. E l g en que
se u s a p ara la cuan tific ac ió n de la m u estra d e A D N están d a r d e b e ría e s ta r p re sen te
sólo u n a v e z (en fo rm a d e u n a so la copia) p o r g e n o m a h aploide. E n el ca so del
A D N hu m an o , cu a lq u ie r nú m ero d e gen e s d e co p ia ú n ic a p u ed e se r u tiliz ad o para
este o b jetivo, in clu y en d o ARNsaP, F a c to r IX , in h ib id o r de tipo a del a c tiv a d o r de
plasm in ó g en o , A D N to p o iso m e rasa I y dih id ro fo lato reductasa, en tre otros. L a
creación d e u n a c u rv a están d a r re q u ie re q u e co n o z ca m o s e l tam añ o , en p ares
d e b a se s (p b ), d el g e n o m a q u e e stam o s u tiliz a n d o c o m o están d a r. (L o s ta m a ñ o s
d e lo s g e n o m a s p u e d e n s e r co n s u lta d o s en la p á g in a w e b c b s .d tu .d k /d a ta b a s e s /
D O G S /in d ex .h tm l, g e s tio n a d a p o r el Center f o r Biological Sequence Analysis.)
P ro b le m a 9 .3 Generaremos una curva estándar de ADN humano en la cual

las muestras contendrán 500.000,50.000,5.000,500,50 y 5 copias de ARNsaP, un
gen de copia única. ¿Qué cantidad de ADN humano, por peso, debería ser
dispensado en una serie de tubos separados para que cada uno contenga el
número de copias deseado del gen?
S o lu c ió n 9.3
Dado que el ADN del gen de copia única es parte de un genoma humano y
considerando que la manera más fácil de calcular un genoma es por su peso,
necesitaremos determinar cuánto pesa el genoma humano. En primer lugar,
calcularemos el peso de un pb utilizando el número de Avogadro y el peso
molecular de un pb, el cual consideramos que es 660 g/mol:
660 g/m ol 1 mol _ 1,096 x 10~21 g

P X pb X 6,023 x 1023 p b _ pb
Así, pues, un pb pesa 1,096 x 10~21 g. Ahora podemos calcular el peso del
genoma humano, el cual consideramos que contiene 3 x 109 pb:
g , 1,096 x 10-21 g
3 x 109 pb x —------- ;-------- = 3,3 x 10“ 12 g
pb
Por lo tanto, el genoma humano, con un tamaño de 3 x 109 pb, pesa

3,3 x 10“ 12 gramos (g). De la siguiente manera podemos convertir este valor
en pg (1 x 10-12 g), una unidad más conveniente para trabajar con cantidades
tan pequeñas:
1 x 1012 pg
3,3 x 10-12 g x ---------- - = 3,3 pg
De esta forma, el genoma humano tiene un peso de 3,3 pg. Este valor representa
el peso del genoma haploide — el genoma compuesto por 23 cromosomas y
que se encuentra en los espermatozoides u óvulos— . Un gen de copia única
estaría presente sólo una vez en un genoma haploide y dos veces en un genoma
diploide, como el que se encuentra en todo el resto de células nucleadas del
cuerpo humano. Para la curva estándar, 3,3 pg de ADN humano es equivalente a
una copia de un gen de copia única.
Ahora podemos calcular cuántos pg de ADN humano necesitaremos para cada
muestra de nuestra curva estándar:
. . 3,3 pg de ADN 6
500.000 copias del gen x ---------—------= 1,65 x 10 pg de ADN
copia del gen
. . 3,3 pg de ADN s
50.000 copias del gen x ---------—----- = 1,65 x 10 pg de ADN
copia del gen
. . 3,3 pg de ADN 4
5.000 copias del gen x -------- —------= 1,65 x 10 pg de ADN
copia del gen
3,3 pg de ADN
500 copias del gen x = 1.650 pg de ADN
copia del gen
3,3 pg de ADN
50 copias del gen x = 165 pg de ADN
copia del gen
3,3 pg de ADN
5 copias del gen x = 16,5 pg de ADN
copia del gen
Así, el tubo para 500.000 copias de ARNsaP debería recibir 1,65 x 106 pg de ADN
humano, el tubo para 50.000 copias de ARNsaP debería recibir 1,65 x 105 pg de
ADN humano y así sucesivamente, tal como se muestra en los cálculos
anteriores.
P ro b le m a 9.4 Continuando con el experimento descrito en el Problema 9.3,

dispensaremos 10 jxL de cada estándar diluido en una PCR a tiempo real.
a) ¿Cuáles serán las concentraciones de ADN humano en la serie de diluciones
que hagamos dispensando el número deseado de copias de ARNsaP en cada
reacción?
b) ¿La solución stock de ADN humano está a una concentración de 2 |¿g/|iL.
¿Cómo debería diluirse la solución stock para que cada dilución, una vez
preparada, tenga un volumen final de 200 jxL?
En la Solución 9.3, calculamos el peso del ADN humano equivalente a cada
número de copias estándar de ARNsaP, desde 500.000 hasta 5 copias.
Generaremos una serie de diluciones que cubra estas cantidades y a partir de
esos tubos dispensaremos 10 ^L de cada uno en 50 p,L de PCR a tiempo real.
Para calcular la concentración de cada tubo de dilución tal que 10 (iL contenga
el número de copias deseado, dividimos cada peso calculado en la Solución 9.3
entre 10:
Para 500.000 copias tenemos
1,65 x 105 pg
= 16.500 pg/p,L
10 p,L
1,65 x 104 pg
= 1.650 pg/|xL
10 nL
Para 500 copias tenemos
1.650 pg
= 165 pg/\\L
IO jí L
165 pg
= 16,5 pg/(xL
IOjaL
16,5 pg
= 1,65 pg/jiL
I O jxL
Así, la serie de diluciones debe tener las concentraciones mostradas anterior

mente para que cuando dispensemos 10 jxL de cada una ese volumen contenga
el número deseado de copias, desde 500.000 a 5.
S o lu c ió n 9.4(b )
La solución stock de ADN humano está a una concentración de 2 ng/jiL. Primero
necesitamos convertir las unidades de concentración a pg/(iL para coincidir con
las unidades que hemos calculado para nuestra serie de diluciones:
2 ng 1 x 106 pg : 106 pg
^l ng \±
Así, 2 ng/(iL es equivalente a 2 x 10 pg/^L.

Dado que cada dilución, pasar de 165.000 a 16.500 pg/[iL, de 16.500 a 1.650 pg/jiL,
y así continuando hacia abajo hasta 1,65 pg/jiL, representa una dilución 10X
(un factor de dilución y 10), deberíamos dispensar 20 jiL de la dilución inmediata
mente anterior en un volumen total de 200 jiL de agua para preparar dichas
diluciones (tal como se muestra en la siguiente regla de tres):
1 _ x
10 _ 200
200 _
x = -
10
Por lo tanto, cada dilución (exceptuando la primera) se prepara dispensando

20 [xL de la dilución anterior en un volumen total de 200 (xL de agua (o tampón).
Ahora necesitamos calcular cuánta solución stock de ADN a 2 |xg/p,L debería ser
dispensada en un volumen total de 200 pL para generar una concentración de
ADN de 165.000 pg/jiL para la primera dilución.
2 x 106 pg xja L _ 1,65 x 105 pg

[i L 200 (iL |xL
La resolución de la x nos proporciona la cantidad que debe diluirse en un

volumen final de 200 |i,L:
(2 x 106 p g )(x ) _ (1,65 x 105 pg)(200)

(i.L (i,L
3,3 x 107
Por tanto, para preparar la primera dilución, dispensamos 16,5 |xL de solución
stock de ADN con una concentración de 2 pg/^L en 183,5 pL de agua para
obtener un volumen final de 200 |xL y una concentración de 1,65 x 105 pg/pL.
Hacemos diluciones de 10 veces para cada uno de los estándar restantes tal
como se indica a continuación (las concentraciones en pg/(iL aparecen debajo
de cada dilución):
2 L x 16,5 nJ-x 2 0 jiL 20|aL 2 0 |iL ^ 2 0 |iL ^ 2 0 jiL

X 200 \¡L X 200 |aL X 200 p l X 200 \¡L X 200 (iL X 200 p i.
stock 1,65 x 105 1,65 x 104 1.650 165 16,5 1,65
La adición de 10 pL de cada dilución a una PCR a tiempo real proporcionará el

número deseado de copias calculado anteriormente. A continuación se
demuestra esta afirmación para una alícuota de 10 p,L tomada a partir de la
primera dilución:
1,65 x 105 pg 1 copia del gen , 1,65 x 106 copias del gen
-------- -------- x ------------------- x 10 llL = --------------------------------
\ il 3,3 pg r 3,3
■500.000 copias del gen
9.3.3 La cu rva e stá n d a r

L a ap lica ció n in fo rm á tic a del instrum ento de P C R a tiem po re al p u e d e p re sen tar el
análisis d e la cu rv a e stán d a r en diferentes form atos. L a F ig u ra 9 -2 m u estra las
curvas d e am p lifica ció n p ara la serie d e dilu cio n es d e A D N h u m an o u tiliz ad as en
S> 7500 System SDS Sotlwaie •[CASE?3(980708 sds IStandaid ,*C Elj
Q 6le ¿cvv Jooü instrument Qpatyui tfjndov# Heip
Flj af h im a Bi W s □« ?
■ FIGURA 9 -2 Gráfico de amplificación donde se representa Rn (ejey ) frente al número de ciclo (eje x) para el k it de cuantificación Quantifiler™ de ADN humano.
Se muestra la relación entre la cantidad de ADN y la fluorescencia; las concentraciones de ADN más elevadas suponen una emisión de señal fluorescente más temprano.
El grupo de curvas suaves en la esquina inferior derecha del gráfico se debe al control positivo interno (CPI) analizado utilizando su propio conjunto de cebadores y
sonda.
el k it «Quantifiler ™ Human DNA Quantification Kit» d e Life Technologies. P ara

ca d a d ilución, las P C R a tiem po re al fu e ro n llev ad a s a cabo en duplicado. L a cu rv a
situ a d a m ás a la izq u ierd a re p rese n ta la cin é tic a d e am p lifica ció n d el ensayo
T aqM an p ara la d ilu ció n d e 50 ng/p,L y la c u rv a m ás a la derech a p ara la de
0,023 ng/jxL. L as cu rv as p a ra las dilu cio n es 16,7, 5 ,5 6 , 0 ,6 2 , 0,21 y 0,0 6 8 ng/(xL
se en c u en tra n e n tre ellas. E stas cu rv as m uestran la relación en tre la ca n tid a d de
A D N m olde y el v a lo r C ií cu a n to m a y o r es la co n c en tra ció n d e A D N , m ás
tem p ra n o se p u ed e d ete ctar es a señ a l y m ás b ajo es el v a lo r C p L a lín ea h o rizo n ta l
es el v a lo r u m b ral d ete rm in a d o p o r e l p ro g ram a info rm á tic o del eq u ip o . E l v a lo r
C t p a ra c a d a dilu ció n es el n ú m ero de cic lo fracciona! d o n d e el gráfico de D e lta Rn
■ FIGURA 9-3 Un gráfico de Delta R„ frente al número de ciclo para los estándar del kit de detección de ADN humano
ABIQuantifiler™HumanDNADetectionKitanalizados con el equipo de PCR a tiempo real AppliedBiosystems7500Real-
timePCRSystem.Delta Rn es el cambio de señal reportera normalizada (Rn menos la línea base).
(el cam bio en señal d e reportero n o rm alizad a) en el eje y versus el n ú m ero de

cic lo s e n el eje x co rta al um bral. E l u m b ral y, p o r tan to , el v a lo r C t deberían
siem p re ca e r d en tro d e la fase ex p o n e n cial d e la re acc ió n d e am plificación. U n a
lín ea d e fo n d o se d ete rm in a en la fase tem p ra n a de la re acc ió n , no rm alm en te entre
el te rc e r y dec im ocuarto ciclo, cu an d o h a y p o co s cam b io s en la señal fluorescente.
L a F ig u ra 9 -2 tam b ién m u estra u n gru p o d e cu rv as d e m e n o r m ag n itu d (en la
e sq u in a in ferio r d ere c h a d el gráfico) q u e cortan a varias de las curvas d el estándar.
E stas están ca u sad as p o r u n C P I aña d id o a ca d a en sayo d e P C R a tiem p o real con
la fin alid ad d e d ete ctar la e x isten c ia d e ag e n tes inhibitorios d e la reacción que
p u ed a n h a b e r sido arrastrados com o co n tam in an tes d e la p re p ara ció n d el A D N
m olde.
L a F ig u ra 9-3 m u estra los m ism o s d atos en fo rm a d e g rá fico c o n el d elta Rn
(el reportero no rm alizad o m en o s la lín ea d e fo n d o d e flu o re scen c ia en el eje j')
frente al el n ú m ero d e cic lo s (en el eje *). L a lín ea h o rizo n ta l en este gráfico re
pre se n ta el u m b ral estab le cid o au tom áticam ente p o r el p ro g ram a inform ático — en
u n p u n to q u e se en c u en tra p o r en c im a de la lín ea de fo n d o p ero q u e es su ficie n te
m ente b a jo e n la cu rv a d e am p lifica ció n co m o p ara en c o n trarse d en tro d e la
Plateau [
L ineal [
Umbral
E xp o n en cial
R uido
d e fo n d o
L ín ea base
■ FIGURA 9-4 Gráfico de amplificación para la batería de diluciones del estándar de ADN humano de Quantifiler™. Los cebadores y la sonda de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) están diseñados para reconocer el gen telomerasa. Se muestran las fases de la PCR (exponencial, lineal y plateau), la señal fluorescente
de fondo, la línea base y el umbral, dentro de la fase exponencial de amplificación, por encima de los cuales se puede distinguir la señal fluorescente del ruido de fondo.
fase ex p o n e n cial d e am plificación— . L a in terse cció n d e la lín ea u m b ral co n la

c u rv a d e am p lifica ció n d efin e el C t - L a F ig u ra 9-4 m u estra las características de
este últim o gráfico d e am p lifica ció n descrito.
9.3.4 D e svia ció n e stá n d a r

L a d esviación está n d a r (a b rev ia d a co m o 5) es el p arám etro m ás frecuentem ente
utiliz ad o co m o in d icad o r d e p re cisió n — có m o d e p ró x im o s se enc u en tra n los
valo re s ex p e rim en tales entre ellos— . P a ra u n a serie d e d atos experim entales,
re p rese n ta u n a in dicación d e la varia b ilid a d d e dich o gru p o d e d ato s en relación
al v a lo r m ed io (prom edio). U n a desv iac ió n e stán d a r p e q u e ñ a in d ica q u e los
valo re s están to d o s cerca d e la m edia. U n a desv iació n e stán d a r gra n d e indica
que m u ch o s d e los datos están lejo s d el v a lo r pro m ed io . S i se p re p ara n m últiples
ré p lic as d e u n a ú n ic a m uestra, el v a lo r d e desv iació n está n d a r p u ed e d a r u n a
in dicación de có m o de cu id a d o so es co n su té c n ic a experim ental. U n v a lo r elevado
p u e d e re flejar errores d e disp en sac ió n e n tre m uestras.
L a d esv iac ió n e stán d a r se ca lcu la u san d o la ecuación
en la q u e x es el v a lo r m ed io (p ro m e d io ), x e s el v a lo r d e u n a m uestra, E den o ta
su m a y n es el n ú m ero d e réplicas.
C o m o re g la p rá ctica, alre d ed o r d el 6 8% d e lo s v alo re s d e las ré p lic as caerán
d en tro d e u n a desv iació n e stán d a r d e la m ed ia d el g ru p o d e dato s, a lre d ed o r del
95 % ca erá n d en tro d e d os desv iac io n es e stán d a r d e la m ed ia y ce rca d el 99,7%
ca erá n d en tro d e tres d esv iac io n es estándar.
P ro b le m a 9.5 La Fig ura 9-5 m u estra un in fo rm e gene ra d o po r el pro gram a

Sequence Detection System (SD S) d e l sistem a Ufe Technologies 7500 para PCR a
tie m p o real. El in fo rm e m u estra los v a lo res CT d ete rm in a d o s para cad a dilu ció n
d e l está n d a r d e AD N h u m a n o y la d esv ia ció n está n d a r d e e so s v a lo re s CT para
cad a c o n c e n tra ció n d e está n d a r. U tiliza r lo s v a lo res para el e stá n d a r d e 50 ng/^L
para m o strar q u e e l e rro r e stá n d a r d e 0 ,0 39 7 c alc u la d o po r el pro g ram a es
co rrecto .
S o lu c ió n 9.5
El e stá n d a r a 50 ng/p,L («std 1» e n la Fig ura 9-5) fu e so m etid o a reacció n en
d u p lica d o . El p ro gram a d e te rm in ó q u e esa s do s m u estra s g en e ra ro n v a lo res C T
d e 2 2,88 y 2 2,93 c iclo s. El v a lo r m ed io para e stas do s m u estra s es
2 2,87 8 4 + 2 2,9345
x = ---------------------------
2
4 5,81 2 9
_ 2
= 2 2 ,9 0 6 4 5
Aho ra c alc u la re m o s la su m a d e cu ad ra d o s d e cad a v a lo r m eno s la m ed ia,

d iv id id o to d o en tre n — 1 (e ste v a lo r ta m b ié n se c o n o ce c o m o varianza):
(x - x )2 _ (2 2 ,8 7 8 4 - 2 2 ,9 0 6 4 5 )2 + (2 2 ,9 3 4 5 - 2 2 ,9 0 6 4 5 )2
^ n - 1 “ 2 -^ 1
(0 ,0 2 8 0 5 )2 + (0 ,0 2 8 0 5 )2
_ i
= 0 ,0 00 7 86 8 + 0 ,0 00 7 86 8 = 0,00157361
La in tro d u cció n d e este va lo r en nuestra e c u a ció n para la d esv ia ció n está n d a r da

lu g a r a
s - V O ,00157361 = 0 ,0 39 7
Este v a lo r d e d esv ia ció n está n d a r c o in cid e c o n el d e la ta b la d e la Fig ura 9-5 para

«std 1». Este v a lo r se e xp resa e n u n id a d e s d e ciclo s.
■ FIGURA 9-5 Informe de resultados de CT para diluciones duplicadas de ADN humano estándar con concentraciones de ADN desde 50 ng/jxL hasta 0,0023 ng/|xL.
La tabla muestra en qué posición de pocilio de una placa de 96 pocilios se colocó cada muestra, el nombre de la muestra (de std 1 a 50 ng/pi hasta std 8 a
0,0023 ng/|xL), el detector (la muestra analizada, ya sea «Q» para un estándar de Quantifilero «CPI» para un control positivo interno), la naturaleza de la muestra, el
valor CT, la desviación estándar de los valores CT para cada dilución («StdDev Ct») y la cantidad de ADN en ng/|xL.
9.3.5 Recta d e reg resió n y la cu rv a e stá n d a r

E n el C ap ítu lo 5 u tilizam os u n a cu rv a e stán d a r y u n an á lisis d e re cta d e re g resió n
p a ra c a lcu lar la co n c en tra ció n d e A D N teñ id a c o n P icoG reen. E n el ejem plo
p ro p o rcio n ad o , el análisis d e re g resió n fu e llev ad o a ca b o u san d o M icrosoft
E xcel. E l p ro g ram a d e P C R a tiem p o re al tam b ién desa rro lla an á lisis de
re g resió n cu a n d o se gra fica n el log d e la co n c en tra ció n d e A D N (en el eje .x)
frente al va lo r C t p a ra ca d a d ilu ció n (en el e j e j ) . L a re cta q u e m ejo r se aju sta a los
datos es d ete rm in a d a a p a rtir d e la ecu ac ió n g eneral y = m x + b. E l p ro g ram a de
a n á lisis p ro p o rcio n a el v a lo r R 2 d e la recta, así co m o su p en d ie n te (m) y su punto
d e corte d el eje y (b). L a F ig u ra 9-6 m u estra la c u rv a e stán d a r g e n e ra d a en un
ex p erim en to u sa n d o el en sayo Quantifiler® d e A pplied Biosystems, en el cual se
calcu ló u n a p en d ie n te d e —3,2 8 7 8 2 9 y u n p u n to d e co rte d el eje y d e 28 ,5 1 8 2 1 9 .
E l v a lo r R2, el coe ficien te d e correlación, es u n a m ed id a d e la p ro x im id ad con
la q u e los datos se en c u en tra n en relación a la re cta d e regresión. S i lo s datos se
h a lla n to d o s en la recta, el v a lo r R2 será ce rca n o a uno. C u an d o este es el caso, el
v a lo r C T (en el eje_y) p re d ic e con p re cisió n la co n c en tra ció n d e A D N (en el eje x).
Si el v a lo r R2 es ce ro , en to n c es u n v a lo r en u n eje n o p u ed e p re d ecir el va lo r en el
o tro. S i el v a lo r R2 es m a y o r q u e 0 ,9 9 p u ed e te n e r c o n fia n za en q u e el v a lo r C t
serv irá p ara p re d ecir co n ce rtez a la co n c en tra ció n d e A D N .
N o ta : L a efic ien cia de la P C R d eb e ría se r ev a lu ad a usan d o u n m ín im o d e tres
ré p lic as d e c a d a co n c en tra ció n d e e stán d a r diluido. P o r ra zo n es d e espacio, sólo
d os replicas h an sido utiliz ad as en este ejem plo.
P ro b le m a 9 .6 U tilizar los v a lo res d e la p e n d ie n te y el pu n to d e corte

m o stra d o s en la Figura 9-6 para d e m o stra r q u e la c o n c e n tra ció n d e ADN de
0,676031 n g /jiL calcu la d a po r el pro g ram a para la m uestra E vid en cia 1
(m o stra d o en la Fig ura 9-7) e s c o rrecto .
S o lu c ió n 9.6
La e c u a ció n g en e ra l para la recta d e regresió n d e los d ato s d e la cu rv a e stá n d a r
e s y = m x + b, e n la q u e y e s e l v a lo rC T d e una m u e s tr a ,m e s la p e n d ie n te , x es el
log d e la co n ce n tra ció n d e ADN y b e s el pu n to d e co rte del e je y . La p en d ien te,
m, para la c u rv a está n d a r m o strad a e n la Figura 9-6 e s —3 ,2 87 8 29 . El punto d e
co rte del eje y es 2 8,5 1 8 2 1 9 c iclo s. Ta l c o m o se ind ica e n la Fig ura 9-7, el
resu lta d o co rre sp o n d ie n te a E vid en cia 1 en e ste e n sa yo e s un va lo r CT de
29,07 7 3 c iclo s. La u tiliza ció n d e esto s va lo re s en la e c u a ció n d e la recta
d e regresió n d a lu g a r a
y = mx + b
2 9,07 7 3 = ( —3 ,2 8 7 8 2 9 )x + 2 8 ,51 8 21 9
■ FIGURA9-6 Curva estándar calculada para la batería de diluciones de ADN humano control del kit de cuantificación Q uantifier®HumanDNAQuantificationKitde
LifeTechnologies.El programa SequenceDetectionSystems(SDS) para el sistema 7500 de PCR a tiempo real genera una curva estándar a partir de la serie de diluciones
del ADN humano control y utiliza la regresión lineal para representar la recta que mejor se ajusta a los datos y calcular los valores de m(pendiente) y de b(punto de
corte del eje y) para dicha recta según la ecuación general y =m x+b.
El despeje y resolución de la x nos da
29,07 7 3 - 2 8,51 8 21 9
37829
0,559081
- 3 ,2 8 7 8 2 9 _ *
- - 0 ,1 7 0 0 4 6
» 7500 System SOS Software [CASE536980708 sds (Standard Curve)]

file S)ew lo o lí Instrument window üelp
■ FIGURA 9 -7 Concentraciones de muestras desconocidas calculadas usando los valores de la recta de regresión de la curva estándar mostrada en la Figura 9-6.
Dado que x es el log de la concentración de ADN, tendremos que calcular el

antilog de x para obtener la concentración real de ADN. (Un antilog puede
calcularse con una calculadora introduciendo el número y luego apretando la
tecla 10 x.)
antilog - 0,170046 = 0,676012
Por tanto, la muestra Evidencia 1 tiene una concentración de ADN de 0,676 ng/(iL.
(Una diferencia en este valor respecto al mostrado en la Figura 9-7 se debe al nivel
con el cual los valores han sido redondeados.)
9.4 E F IC I E N C IA D E A M P L IF IC A C IÓ N
L a efic ien cia d e am p lifica ció n en la P C R es u n a m e d id a d e cu á n to m o ld e es
con v ertid o a pro d u c to am p lifica d o du ra n te c a d a cic lo d e la fase e x p o n e n cial de
l a reacción. C u an d o la efic ien cia es d el 100% , la cantidad d e p ro d u c to exacta
m ente se d o b la en c a d a cic lo — ca d a m o lécu la de A D N cd pro d u c e d os m oléculas
d e A D N cd — ■.C ó m o m ejo r se m id e es sólo d u ra n te lo s p rim ero s estad io s de la fase
ex p onencial, y a q u e dec lin a rá d e fo rm a n atural h a s ta lleg ar a cero c u a n d o la
re acc ió n alc an ce la fase estac io n aria y lo s co m p o n e n te s estén ac ab á n d o se , los
ce b ad o re s co m p itan c o n el p ro d u c to en su u n ió n a las ca d en a s desnaturalizadas y
la en z im a p ierd a su actividad. S in em b a rg o , in clu so d u ra n te la fase ex p o n en cial, se
p ro d u c en d iv ersa s interferencias q u e im p id e n q u e la en z im a A D N polim erasa
9.4 Eficiencia de amplificación 233
fab riq u e m oléculas d u p licad a s a ese ritm o. L a re acc ió n p u ed e co n v e rtirse en

s u b ó p tim a d eb id o a la p re sen cia d e inhibidores, o tras en z im a s arrastrad as d esde
reacc io n es p reparativas anteriores y v a rio s co n ta m in a n te s q u e co p u rifican c o n el
m olde.
L a am p lifica ció n p o r P C R , tal co m o v im o s e n el c a p ítu lo anterior, v ien e
defin id a p o r la ecuación
Y = X ( 1 + E )n
en la q u e 7 e s la ca n tid a d de pro d u c to de P C R , X es el nú m ero in icial de m oléculas

d e m o ld e, E es la efic ien cia d e am p lifica ció n y n es igual al nú m ero d e cic lo s de
P C R . E n la P C R a tiem p o real q u e u tiliz a u n a so n d a TaqM an® , Y, la cantidad de
pro d u c to gen e rad o du ra n te la am p lificació n , es pro p o rcio n al a la cantidad de señal
fluorescente. P o d em o s p o r ello co n sid erar q u e la am p lifica ció n p o r P C R a tiem po
re al p ro c ed e acorde a la ecu ac ió n
Rf = R i { 1 + E ) n
en la q u e R f es equ iv a le n te a la señ a l d e flu o re scen c ia final d el flu o ró fo ro repor

tero, R¡ es equ iv a le n te a la señal d e flu o re scen c ia inicial del flu o ró fo ro reportero, E
es la e fic ien cia d e am plificación y n es el n ú m ero d e ciclos.
L a efic ien cia d e am p lifica ció n ( E) se d ete rm in a a p a rtir de u n a c u rv a están d ar
u sa n d o la s ig u ie n te fórm ula:
A M P L IF IC A C IÓ N E X P O N E N C IA L =
E F IC IE N C IA = (10(-■ //»«*«*) - l ) x 100
U n a re acc ió n co n efic ien cia d el 100% te n d rá u n a p en d ie n te de —3,32. D ich o de

o tra m anera, du ra n te la am p lifica ció n ex p o n en cial, u n a re acc ió n co n efic ien cia del
| 100% do b lará en c a d a cic lo y p ro d u c irá u n aum e n to d e 10 v ec es d el pro d u c to de
§ P C R c a d a 3 ,3 2 ciclos. M atem á tic am en te, esto s e d efin e co m o
! log2 10 = 3 ,3219
1 o
| 23,3219 = 10
|
^ U n a p en d ie n te co n u n v a lo r m ás n e g a tiv o (—3,85, p o r ejem plo) re presentará
|jj u n a P C R c o n u n a efic ien cia inferior al 100% y co n nec esid ad d e optim ización.
2 U n a p en d ie n te con u n v a lo r m ás p ositivo ( —2,8 , p o r eje m p lo ) in d ica posibles
© errores d e d isp en sac ió n o p roblem as co n el m o ld e (d e g rad a ció n o inhibición).
N o ta : D e safo rtu n a d am en te, la efic ien cia d e am p lifica ció n se d efin e d e dos
form as d iferentes en la b ibliografía. E n alg u n a s pu b licac io n es, se defin e com o
I q( - i/pemüente)^ ¿ o n d e «p en d ie n te » s e refiere a la p en d ie n te d e la re cta g en e rad a a
trav é s d e u n gráfico d e lo g co n c en tra ció n d e A D N (en el eje_y) frente a v alo res C t
(en el eje x ) p a ra u n a serie d e d ilu cio n es d e u n m o ld e estándar. P ara u n a reacción
con p erfec ta eficiencia, la p en d ie n te es —3,32. S egún esta defin ic ió n , ten em o s
P o r supuesto, esto n o s ig n ifica q u e la reacción te n g a u n a efic ien cia d el 200%

(2 x 10 = 200% ). L a o tra interpretación d e la efic ien cia d e am p lifica ció n utiliz a
la ecu ac ió n m o strad a an teriorm ente, en la q u e a 1 se le re s ta io*-l/pendienle* y este
v a lo r es m u ltip licad o p o r 100 p ara d a r la fo rm a m ás co m ú n d e p o rcentaje. E sta
am b ig ü ed a d se ex p lica aquí p a ra avisarle d e q u e d e b e se r con sc ie n te d e la
d efinición q u e se esté ap licando en el p ro to co lo q u e utilice.
P ro b le m a 9.7 Se detecta una eficiencia del 90% para una PCR a tiempo real.
Partiendo de sólo una molécula de molde, tras 20 ciclos, ¿cuál es la cantidad de
producto generado en esta reacción con eficiencia del 90% en comparación con
la cantidad de producto que se generaría si la reacción tuviera una eficiencia del
100%?
S o lu c ió n 9.7
Utilizaremos la siguiente ecuación para encontrar la solución del problema:
Y = X { 1 + £)"
Para la reacción con eficiencia del 100%, E es equivalente a 1 y obtenemos
Y = 1(1 + i ) 20 = 220 = 1.048.576 copias
Para la reacción con eficiencia del 90%, E es equivalente a 0,9 y obtenemos
Y = 1(1 + 0,9)20 = L 9 20 = 375.900 copias
La división de la reacción con eficiencia del 90% entre la reacción con eficiencia
del 100% da lugar a
375.900 copias
1.048.576 copias
La multiplicación de este valor por 100 nos indica que, tras 20 ciclos, la
reacción con eficiencia del 90% sólo genera el 36% de lo que podría generar
si la reacción de amplificación tuviera una eficiencia del 100%.
9.4 Eficiencia de amplificación 235
P ro b le m a 9.8 Si empezamos con 8.000 moléculas diana en una PCR con una
eficiencia del 85%, ¿cuántas moléculas de producto se generarán tras 10 ciclos?
S o lu c ió n 9.8
Usaremos la siguiente relación:
Y = X { 1 + E )n
En esta ecuación, X es el número de moléculas iniciales. Por tanto, tenemos
Y = 8.000 x (1 + 0,85)10
= 8.000 x 1,8510
= 8.000 x 470
= 3.760.000 moléculas
Así, pues, una PCR con una eficiencia del 85% que parte de 8.000 moléculas de
molde generará 3.760.000 moléculas de producto en 10 ciclos.
P ro b le m a 9.9 En la Figura 9-6, se determinó que la recta de regresión de la

curva estándar tiene una pendiente de —3,287829. ¿Cuál es la eficiencia de
amplificación para estas reacciones?
S o lu c ió n 9.9
Utilizando la ecuación anterior, tenemos
E = ( 1 0 ( - V - 3 , 287829) _ ! ) x 100
- ( l o 0,304152 - 1) x 100
- (2,014429 - 1) x 100
- 1,014429 x 100
- 101,44%
De esta forma, las reacciones que generaron la curva estándar mostrada en la

Figura 9-6 tienen una eficiencia de amplificación de aproximadamente 101%.
Durante la fase exponencial de síntesis, el aumento de fluorescencia de ciclo a

ciclo es un reflejo de la eficiencia de amplificación. Aunque la eficiencia de la PCR
afecta al valor CT, las eficiencias de amplificación entre el 90 y el 110% son
generalmente consideradas de suficiente calidad como para generar datos
fiables de PCR a tiempo real. Las reacciones con menor eficiencia mostrarán
también menor sensibilidad.
P ro b le m a 9 .1 0 Para una PCR con eficiencia del 100%, ¿cuántos valores CT

debería haber entre las medias de dos muestras separadas por un factor de
dilución de tres veces?
La recta generada por la representación de los valores CT (en el ejey) frente al log
de la concentración de ADN (en el e je x) para una reacción con una eficiencia del
100% tiene una pendiente de —3,32. La pendiente de una recta es equivalente a
su «elevación por encima del recorrido horizontal»; es decir, la diferencia de y
dividida entre la diferencia de x. Podemos escoger cualesquiera números para el
eje x con el fin de representar dos muestras que difieran en un factor de dilución
de tres veces. Aquí escogeremos 16,7 ng/jiL y 50 ng/(iL.
elevación Ay Ay
pendiente = -------——¡— :------ ¡ = —— — — ------ —----------- — — —3,32
recorrido horizontal Ax 16,7 ng/(j,L — 50 ng/|xL
Dado que la escala del e je x es el log de la concentración de ADN, necesitaremos

calcular el log de los valores de esos dos números. Así pues, tenemos
Ay
!2 - 1,
Despejando y resolviendo A y nos da
Ay
•- -3 ,3 2
-0,48
-0,48
Ay - (- 3 ,3 2 ) x (- 0 ,4 8 ) = 1,60
Por lo tanto, hay 1,6 valores CT entre la media de dos muestras separadas por un
factor de dilución de tres veces.
9.5 M E D IC IÓ N D E L A E X P R E S IÓ N G É N IC A
L a cap ac id a d d e m ed ir c o n p re cisió n la ex presión g én ic a es c rítica p ara lo g rar
e n te n d er có m o las células c o n trib u y e n a pro c eso s d e en ferm edad y c ó m o pu ed e n
re s p o n d e r a la terapia. ¿Q ué ca m b io s a n iv el d e la tran sc rip ció n h ac en q u e u n a
c é lu la s e v u e lv a cancerosa? ¿Q u é gen e s se re p rim en y q u é genes se activ an en
re sp u esta a u n a m ed ica ció n que se está p ro b a n d o co m o tera p ia co n tra u n a en fer
m edad o en re sp u esta a u n a in fec ció n viral?
L a utilización de la P C R a tiem po real para la cuantificación d e la expresión génica
tiene varias características atractivas, a destacar entre ellas su sensibilidad — tiene la
capacidad d e detectar cantidades tan pequeñas com o u n a sim ple copia d e un
9.5 Medición de la expresión génica 237
tra n s c rito esp e cífico — . A d e m á s, la P C R a tie m p o re al tie n e la c a p a c id a d d e

g e n e ra r d ato s p re c is o s p o r e n c im a d e u n ra n g o d in á m ic o (e s c a p a z d e d e te c ta r
co n p re c is ió n ta n to u n a c a n tid a d p e q u e ñ a co m o u n a c a n tid a d g ra n d e d e tra n s
crito ), o fre c e la p o s ib ilid a d d e p ro c e sa m ie n to a g ra n e s c a la (m u c h a s m u estra s
p u e d e n s e r p ro c e s a d a s sim u ltán e am en te ), y p u e d e d is tin g u ir e n tre tran sc rito s
q u e tie n e n sec u en cia s sim ilares.
L as reacciones q u e m id en d iferen c ia s d e ex p resió n entre genes, en tre tipos
ce lu la res y entre trata m ie n to s, inhere n tem en te llev an co n sig o el po ten c ia l de
in tro d u cir u n elevado grado d e variabilidad. E sto p u ed e se r m o tiv a d o p o r errores
en la d isp en sac ió n o p o r v aria cio n es en la efic ien cia y a se a de la am p lifica ció n de
la P C R o d e la re acc ió n de tran sc rip ció n re v ersa u tiliz ad a p ara c o n v e rtir A R N m en
A D N c. L a varia b ilid a d se g e n e ra en e l in stru m en to q u e se u tiliz a p ara m ed ir los
cam b io s en in ten sid ad lu m ín ic a gen e rad o s p o r la P C R a tiem p o real. Se g en era
co m o re su lta d o d e la inestabilidad d e los reactiv o s u tiliz ad o s en el ensayo. P uede
te n e r m u ch o s oríg en e s diferentes. C o m o co n se cu en c ia, la P C R a tiem p o real co m o
té c n ic a p a ra m ed ir la ex p resió n g én ic a re q u ie re el u s o g en e ro so d e controles
desig n ad o s p a ra d eja r la co n c ien cia d el e x p e rim en tad o r tran q u ila y co n v e n ce rle
d e que lo s efectos so b re ex p resió n q u e tien e el p rivilegio d e v e r son, d e hecho,
reales.
U n a m e d id a d e se g u rid a d , ta l c o m o h e m o s d isc u tid o p re v ia m e n te , e s el
co n tro l e n d ó g e n o . S e u s a co m o re fe re n c ia a c tiv a p a ra n o rm a liz a r las d ife re n
cias en la c a n tid a d d e A R N to ta l a ñ a d id o a u n a P C R a tie m p o real.
L o s controles end ó g en o s m ás frecuentem ente u tilizados son los gen es de
m an ten im ien to — aquellos gen e s q u e están siem p re expresados a u n n iv el m ás
o m en o s co nstante y q u e son necesarios p ara q u e la célu la llev e a ca b o sus
funciones v itales b ásica s— . C o m o ejem plos d e genes d e m antenim iento tenem os
(3-actina, G A P D H (gliceraldehído 3-fosfato dehidrogenasa) y 18S A R N . U n gen
q u e sirv a co m o control en d ó g e n o d eb e ría estar p resen te en la m ism a m u estra de
ácido n ucleico que el g en d ia n a de interés. S in em bargo, p u ed e se r am plificado en
u n p ocilio separado en la m ism a p lac a q u e la d ian a o p u ed e se r am plificado ju n to
con la d ian a en el m ism o p ocilio gracias a u n a reacción m u ltip lex utilizando
sondas m arcadas con d iferentes fluoróforos.
L a dete rm in a ció n d e la ex p resió n g én ic a p o r P C R a tiem po re al es llev ad a a
cabo m ay o ritariam en te co m o u n en sayo relativo. E s decir, n o necesariam en te le
in tere sa sab e r cu á n tas m oléculas d e A R N m se g en e ran a p artir d e u n g e n parti
cular, sino q u é n iv el d e tran sc rip ció n se g en e ra en co m p a rac ió n (relativa) a la de
alg ú n otro gen. E sta d iferen c ia es n o rm alm en te e x p resad a co m o v ec es d e dife
rencia. L a cua n tific ac ió n relativa, p o r ejem plo, pu ed e se r u tiliz ad a p ara d eterm in ar
la d iferen c ia d e ex p resió n d e lo s genes de ch o q u e térm ico en células can ce ro sas en
co m paración c o n su ex p resió n en células n o rm ale s saludables. T am bién se utiliz a
p a ra c o m p a rar la ex p resió n d e u n g en específico en d o s tip o s celulares distintos,
p articularm ente cuando dichos tipos celulares h an sido som etidos a tratam iento con
u n fárm aco u otro agente. E l gen cu y a respuesta está siendo determ inada se den o
m ina d ian a. Su expresión es com parada con la d e u n g en d e re ferencia denom inado
calib rad or, q u e a m en u d o re p rese n ta el control n o tratado. L o s ex p e rim en to s de
cuan tific ac ió n re la tiv a tam b ié n in clu y en u n control en d ó g e n o — u n g en c o n u n
n iv el d e ex presión co nstante en todas las m u estra s experim entales— . E xisten
diversas m an eras d e d ete rm in a r la cua n tific ac ió n relativa.
9.6 C U A N T IF IC A C IÓ N R E L A T IV A : E L M É T O D O AACT
E l m éto d o A A C T, tam b ién den o m in ad o m étod o com p a r a tiv o C T, es u n m edio
p a ra llev ar a ca b o u n a cuan tific ac ió n re la tiv a y fu e inicialm ente desc rito p o r L ivak
y S ch m ittg en en 20 0 1 . D e te rm in a el ca m b io relativo d e ex presión g én ic a entre un
g en d ia n a o b jeto d e estu d io y el d el g en ca lib rad o r (referencia). P ese a q u e el
en sa y o está d esig n ad o p a ra m ed ir la cantidad d e transcrito (A R N ) p ro d u c id o en
u n a cé lu la particular, lo q u e se añ a d e a la P C R a tiem p o real es en realidad A D N c
gen e rad o p o r tran sc rip ció n re v ersa a p a rtir d e A R N to tal re cuperado d e las células
cu y a ex p resió n g é n ic a es ob jeto d e estudio. E l in v estig ad o r p u e d e estar interesado
en la re sp u esta d el g en d ian a a u n fá rm aco, a u n a infección, a u n pro c eso de
en ferm e d ad o a alg ú n o tro estím ulo. L a m a y o r p arte de veces, el control n o tratado
se u tiliz a co m o calibrador. U n co n tro l en d ó g e n o , c o n tro l interno — u n g en y a
presen te en la m u estra—- se incluye co n la fin alid ad d e n o rm aliza r cu a lesq u iera
diferen c ia s en la ca n tid a d d e A R N ce lu la r u tiliz ad o p ara las reacciones de
tran sc rip ció n re v ersa q u e g en e ran A D N c. L o s g en e s de m antenim iento — aquellos
gen e s q u e se ex p resan a u n n iv el constante, tales co m o G A P D H , A R N ribosom al,
A D N to p oisom erasa, ARNsaP, o (3-actina — son frecuentem ente u tiliz ad o s com o
co n tro le s endógenos.
L a d iferen c ia entre las C t d el g en d ia n a (C t , diana) y las C t d el control end ó g en o
(C t , ce) es la A C t d e la m uestra:
C t , diana — C t , ce — A C t
D el m ism o m o d o , la A C t d el ca lib rad o r es igual a las C t d el g en d ia n a en la

m u estra n o trata d a (calibrador) m en o s las C p d el c o n tro l en d ó g e n o en la m u estra
no trata d a (calibrador):
C t , diana en calibrador C t , ce en calibrador — A C t , calibrador
E l térm ino A A C t se ca lcu la co m o la A C t del g en d ia n a en la m u estra trata d a

m en o s la A C t d e la d ian a en la m u estra n o trata d a calibradora:
A A C t — A C t , diana en muestra tratada A C t , diana en muestra calibradora

9.6 Cuantificación relativa: el método A A CT 239
E l calibrador, dad o q u e n o está tratado, n o d eb e ría te n e r n in g ú n cam bio en su

v a lo r A A C t a lo larg o del experim ento. S u ca m b io , p o r tan to , es eq uivalente a
cero. D a d o q u e 2o es igual a u no, la ex p resió n del g en ca lib rad o r es la unidad.
D e este m o d o , cu a n d o e l m éto d o A A C t s e u tiliz a p a ra m ed ir la ex p resió n
g énica, los resultados se ex p resan co m o « veces» d e ca m b io en el n iv el de
ex p resió n d el g en d ia n a n o rm alizado c o n el co n tro l en d ó g e n o y rela tiv o al c a li
brador. V ien e d ete rm in a d o p o r la ecuación:
C an tid ad re la tiv a d e v ec es d e cam bio — 2 -AACt
9.6.1 El m éto d o 2 -AACt: la e le cció n d e un a re fe re n cia

endógena
L a utilización del m étodo 2 _AAC t p ara el análisis com parativo d e expresión gén ic a
requiere que la transcripción del gen control interno — el gen u sad o co m o referencia
endógena— n o esté afectado p o r el tratam iento experim ental. P ara pro b a r si es éste
el ca so o no, se llevan a ca b o reacciones que im itan las condiciones bajo las cuales
se realizará el estudio com parativo. Sin em bargo, sólo se necesita analizar el g en de
referencia p o r P C R a tiem po real en este experim ento inicial.
L a ev a lu ació n d e si u n trata m ie n to experim ental p u e d e afecta r a la ex presión
del g en d e re feren cia es u n a fo rm a d e p rob ar una h ip ótesis. E n este caso, estam os
ev a lu an d o lo q u e se d en o m in a la h ip ótesis n u la (d e sig n a d a co m o H 0). L a
h ip ó tesis n u la c la m a q u e lo s re su lta d o s q u e v em o s en este ex p erim en to son
la co n se cu en c ia d e p u ro a z a r y q u e el trata m ie n to ex p e rim en tal n o tien e efecto
so b re el v a lo r m ed io d e C t del g en de referencia. Si la h ip ó tesis n u la es v erd ad , el
v a lo r C T p ro m ed io p ara c a d a g ru p o d e m uestras d eb e ría se r el m ism o.
S i estu v iéram o s co m p a ran d o sólo d o s m edias deriv a d as d e d o s gru p o s,
po d ríam o s u tiliz ar u n a p ru e b a estad ística den o m in ad a prueba-?. N o o bstante,
p a ra este ex p e rim en to , estarem o s co m p a ran d o m ú ltip les v alo res m ed io s d e las
m u estra s y, p o r tan to , es m ás apro p ia d o u tiliz a r u n a apro x im a ció n estad ística
¿ d e n o m in ad a A N O VA u n id ireccion al (p a ra el an á lisis d e la v arian za). (O tra
§ ap ro x im a ció n estad ística c o n o c id a com o A N O V A m u ltifactorial d eb e ría ser
| u tiliz ad a cu an d o se an a liz a si d o s factores d iferen tes, en v e z d e u n o , afectan a
= u n resultado.)
§ L a va ria n za es u n a m e d id a d e varia b ilid a d y h a c e re feren cia a la disp ersió n de
§ v alo res alre d ed o r d e u n a m edia. S e ca lcu la co m o el cu a d rad o d e la desviación
.£ e stán d a r (5), la cu a l, co m o p o d rá re c o rd a r d e ap a rtad o s anteriores en este capítulo,
•j| se tra ta de la ra íz c u a d rad a d e la su m a de la d iferen c ia d e c a d a v a lo r resp ecto a la
§ m ed ia d iv id id a en tre el n ú m ero d e m u estra s m en o s uno:
¡8
L a varia n za es este v a lo r al cuadrado:
E (-1 - -—
varia n za = s 2 — ----------
n —1
E n el m éto d o estadístico d e A N O V A , ca lcu lam o s la v aria n za en tre g ru p o s de
m u estra s así co m o la v aria n za d e m u estra s dentro d e c a d a g ru p o individual. A
con tin u ac ió n co m p a ram o s dich o s valores. E l p rim e r p aso es c a lcu lar el pro m ed io
de la m u estra (v a lo r m ed io ) p a ra ca d a g rupo. V am os a d e c ir q u e ten e m o s los
gru p o s a, b y c. L a m e d ia p a ra ca d a g ru p o se ca lcu la así
a\ + «2 + •+ an
n
b\ + ¿>2 + ,+ b n
n
C l + C 2 + ■■■
■+ c„
n
d o n d e n es el n ú m ero d e m u estra s en ca d a grupo.

A con tin u ac ió n calculam os el p ro m ed io d e to d o s los prom edios. D e signarem os
este v a lo r co m o x. S e ca lcu la así
_ a + b + c + ...
x — ----------------------
m
d o n d e m es igual a l n ú m ero d e g ru p o s (p o r ejem plo, el n ú m ero d e p u n to s anali

za d o s d u ra n te u n estu d io a lo larg o d el tiem po).
C alcu lam o s en to n c es la v aria n za d e lo s p ro m ed io s d e la m uestra. E sto se
d en o m in a v a ria n za in tergru p o y la d esig n arem o s s*2. S e ca lcu la d el siguiente
m odo
2 _ (a — x ) 2 + (b — x f + ( c — x ) 2 + ...
S ~
T am bién calculam os la varia n za de la m u estra (s2) p a ra ca d a gru p o individual.

E sto se d en o m in a v a ria n za in tra g ru p o . S e ca lcu la así p ara el g ru p o a
2 _ (a i — a )1 + (ü 2 — a )2 + ... + (a „ — a )2
a n —1
y tam b ién p u ed e se r fo rm u la d a com o
s2 = £ (a - a )2
° n —1
L a varia n za d e ca d a g ru p o (a, b y c) se ca lcu la del m ism o m odo.

M ed ian te el u s o d e las varia n za s dentro d e g rupo, calculam os el pro m ed io de
todas las varia n za s d e la m uestra
s t + s t + s i + ..
A h o ra utilizam os esto s valo re s p a ra c a lcu lar el estad ístico F, la relación d e las

d os varia n za s — la v aria n za intergrupo en co m p a rac ió n co n las varia n za s intra-
grupo— •. S e u s a b ajo la asu n c ió n d e q u e lo s diferentes g ru p o s tien en desviaciones
e stán d a r sim ilares (tienen sim ilar varia b ilid a d a p a rtir d e sus v alo res m edios). El
estadístico i 7 n os dirá si las m edias d e la m u estra d e vario s gru p o s son iguales. Si lo
son, p o d em o s ac ep tar la h ip ó tesis n u la d e q u e e l trata m ie n to ex p e rim en tal no
e jerce n in g ú n efecto so b re la ex presión d el g en d e referencia. E l estadístico F se
ca lcu la así
■ FIGURA 9-8 Una curva de
distribución Fdescribe la probabilidad
de un estadístico Fen concreto a un nivel
de confianza definido (típicamente, 1,5
d o n d e n es el nú m ero de m ed id as en ca d a g ru p o individual. Si el v a lo r F e s grande, o 10%). La porción de la curva a la
l a varia b ilid a d entre g ru p o s (el nu m era d o r) d e b e r se r gra n d e e n co m p a rac ió n con izquierda del estadístico Fcrítico muestra
aquellos valores Fpara los cuales la
la varia b ilid a d dentro de c a d a g ru p o (e l den o m in ad o r). T endríam os q u e re ch az ar la
hipótesis nula debería ser aceptada. Si
h ip ó tesis n u la en este caso. S in em b a rg o , si el n u m era d o r (la v aria n za intergrupo)
el estadístico Fcalculado es mayor que
es igual a o m ás peq u e ñ o q u e el d e n o m in ad o r (la v aria n za intragrupo), el dicho valor crítico, la hipótesis nula
estadístico F te n d rá u n v a lo r m ás b ajo y d eberíam os se r capaces d e ac ep tar la debería ser rechazada.
h ip ó tesis n u la y co n c lu ir q u e n o h a y d iferen c ia en tre los grupos.
S in em b a rg o , ¿cuál es el v a lo r crítico p ara el estadístico
F, el p u n to lím ite, co n el cual p o d em o s to m ar c o n seguridad Rechazar
la hipótesis nula
la dete rm in a ció n d e ac ep tar o re ch az ar la h ip ó tesis nula?
E ste v a lo r n o s lo p ro p o rcio n a la d istrib u ción F, u n a
cu rv a asim étric a q u e d escrib e la pro b a b ilid ad d e en contrar
c u a lq u ie r estadístico F e n p a rtic u la r (F ig u ra 9-8). Si el
estadístico F e s m a y o r q u e el v a lo r crítico, re ch az am o s la
h ip ó tesis nula. Si el estad ístico F es m e n o r que el v alo r
crítico, ac ep tam o s la h ip ó tesis nula.
El v alo r crítico dentro d e la distribución F pu ed e ser
consultado en u n a tab la de distribu ción F (Tabla 9-1).
Varios recursos en Internet proporcionan tablas d e dis
tribución F a diferentes n iveles d e significancia (1, 5
y 10% ). U sarem os el nivel d e significancia 5% , que significa
que h ay un 5 % d e probabilidad d e que podam os equivocar
n os al rechazar la hipótesis nula cuando en realidad ésta es Valor crítico
de estadístico F
cierta.
T a b la 9-1 Tabla de distribución F q u e m uestra los valores críticos para el estadístico F a un nivel de
significancia del 5% . La tabla se interpreta mediante la intersección de una colum na correspondiente a los
grados de libertad del num erador del estadístico F ( d f j con una fila correspondiente a los grados de
libertad del denom inador del estadístico F ( d f j
d f.
2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 15 20 30
2 19,00 19,16 19,25 19,30 19,33 19,35 19,37 19,38 19,40 19,41 19,43 19,45 19,46
3 9,55 9,28 9,12 9,01 8,94 8,89 8,85 8,81 8,79 8,74 8,70 8,66 8,62
4 6,94 6,59 6,39 6,26 6,16 6,09 6,04 6,00 5,96 5,91 5,86 5,80 5,75
5 5,79 5,41 5,19 5,05 4,95 4,88 4,82 4,77 4,74 4,68 4,62 4,56 4,50
6 5,14 4,76 4,53 4,39 4,28 4,21 4,15 4,10 4,06 4,00 3,94 3,87 3,81
7 4,74 4,35 4,12 3,97 3,87 3,79 3,73 3,68 3,64 3,57 3,51 3,44 3,38
8 4,46 4,07 3,84 3,69 3,58 3,50 3,44 3,39 3,35 3,28 3,22 3,15 3,08
9 4,26 3,86 3,63 3,48 3,37 3,29 3,23 3,18 3,14 3,07 3,01 2,94 2,86
10 4,10 3,71 3,48 3,33 3,22 3,14 3,07 3,02 2,98 2,91 2,85 2,77 2,70
11 3,98 3,59 3,36 3,20 3,09 3,01 2,95 2,90 2,85 2,79 2,72 2,65 2,57
12 3,89 3,49 3,26 3,11 3,00 2,91 2,85 2,80 2,75 2,69 2,62 2,54 2,47
13 3,81 3,41 3,18 3,03 2,92 2,83 2,77 2,71 2,67 2,60 2,53 2,46 2,38
14 3,74 3,34 3,11 2,96 2,85 2,76 2,70 2,65 2,60 2,53 2,46 2,39 2,31
15 3,68 3,29 3,06 2,90 2,79 2,71 2,64 2,59 2,54 2,48 2,40 2,33 2,25
16 3,63 3,24 3,01 2,85 2,74 2,66 2,59 2,54 2,49 2,42 2,35 2,28 2,19
17 3,59 3,20 2,96 2,81 2,70 2,61 2,55 2,49 2,45 2,38 2,31 2,23 2,15
18 3,55 3,16 2,93 2,77 2,66 2,58 2,51 2,46 2,41 2,34 2,27 2,19 2,11
19 3,52 3,13 2,90 2,74 2,63 2,54 2,48 2,42 2,38 2,31 2,23 2,16 2,07
20 3,49 3,10 2,87 2,71 2,60 2,51 2,45 2,39 2,35 2,28 2,20 2,12 2,04
21 3,47 3,07 2,84 2,68 2,57 2,49 2,42 2,37 2,32 2,25 2,18 2,10 2,01
N o o b stan te, la lo ca liz ació n d el v a lo r lím ite p a ra el estadístico F en u n a tab la de

d istrib u ció n F re q u ie re q u e co n o z ca m o s los g ra d o s d e lib e r t a d co rresp o n d ien tes
al co n ju n to de datos p a rtic u la r q u e se u tiliz a p a ra e l cálculo. L o s grados de libertad
d esc rib en , en térm in o s sencillos, el nú m ero d e v alo re s en el cálcu lo final d e u n a
e stad ística que p u ed e n v aria r co n libertad. C u an to m ás elevado es el nú m ero de
d ato s in d ependientes q u e v an a fo rm a r p arte d e la estim ació n final d e u n a
p u n tu ac ió n estadística, m a y o r es el nú m ero d e g rados d e libertad. E n esta fo rm a
d e A N O V A , la estad ística final es F, con la cual estam os ob serv an d o la v aria b i
lid ad d e d o s g ru p o s po b lacio n ales, la varia b ilid a d entre g ru p o s (e l v a lo r del
n u m era d o r) y la varia b ilid a d d entro d e g ru p o s (el den o m in ad o r); estam os calcu
lan d o d o s estim aciones estad ísticas p a ra lle g a r al v a lo r F. L a d istrib u ció n F, p o r
tan to , u tiliz a d o s v alo re s p a ra lo s grados d e libertad, un o p a ra e l v a lo r d el n u m e
ra d o r y u n o p ara el v a lo r d el d enom inador, d o n d e ca d a com b in ac ió n tien e su
p ro p ia d istrib u ció n F característica. L o s g ra d o s d e lib ertad p a ra el n um e

d f n u m e ra to r =
ra d o r (df„) se calcu lan co m o m — 1. S us v alo res se re p rese n ta n en las
co lu m n as d e u n a tab la d e d istrib u ció n F. L o s g ra d o s d e lib ertad p ara el denominator = |
d e n o m in ad o r (dfj) se calcu lan co m o m(n — 1). S us v alo re s se re p rese n ta n | f = |p
en las filas d e u n a tab la d e distrib u ció n F.
Si e l v a lo r calculado d el estadístico F es in ferio r al v a lo r crítico o b te- J---------------------- !_____________
nid o a p a rtir d e la ta b la d e d istrib u ció n F, d eb e ría ac ep tar la h ip ó tesis n u la y .
co n c lu ir que, a ese n iv el d e significancia, n o h a y d iferen c ia e n tre las Compute [
m uestras. S i el estadístico F es su p erio r a l v a lo r crítico, la h ip ó tesis n u la _ r,r,,n. . . , . , , . . n
r r ■ FIGURA 9 -9 Calculadora de valores P para
d eb e ría se r re ch az ad a y p u ed e co n c lu ir q u e existe u n a d iferen c ia signifi- un f pal(cu|ar Para Q|aJ|ar „„
cante en tre las m uestras. E l trata m ie n to ex p e rim en tal, p o r tan to , es la c a u sa estadístico Fse introducen en los cuadros de
d e la d iferen c ia q u e está ob serv an d o . diálo go los grados de libertad y se determina
P odem os ir incluso u n p aso m ás allá e n la reafirm ación d e nuestra automáticam ente el valor P cuando se presiona el
convicción d e la veracidad de la hipótesis n u la ju zg a n d o si existe u n a botón (Calcular «Compute»), Esta calculadora se
relación «estadísticam ente signiflcante» entre el tratam iento experim ental encuent,a en * *lm la n tc o m /h y p e rs W F _ ta b le .
, i / - . j - t . ., . , , , html, pero también se pueden encontrar calculadoras
y los valores (_T prom edio. L a convicción viene proporcionada p o r el v a lo r .......................
., f , ,, en http://www.dam elsoper.com/statalc3/
P. E l v alo r P es u n a expresión de probabilidad - n : o m o de probable es que y stattrek.eom/rables/F.aspx.
pu ed a obtener u n resultado (un estadístico F) m ás extrem o q u e el que h a
obtenido si la hipótesis n u la fuera cierta— . O, en otras palabras, si calculara
cierto estadístico F, ¿cuál es la probabilidad d e obtener ese valor del estadístico F1 En
térm inos generales, cuanto m ás bajo es el valo r P, con m ás fu e rza se pu ed e rechazar
la hipótesis nula. U n v alo r P m ás grande sugiere que h ay m enos evidencia contra la
hipótesis nula. L a m ayor parte d e biólogos están satisfechos designando u n valor P
inferior a 0,05 (5% ) com o indicación d e significancia. A este nivel d e significancia, la
hipótesis n u la pu ed e ser rechazada si el v alo r P es inferior o igual a 0,05.
L o s v alo res P para u n estad ístico F p a rtic u la r p u ed e n se r co n su ltad o s en tab las
d e pro b a b ilid ad o m ed ian te la u tiliz ació n d e ap lica cio n es d isp o n ib le s gra tis en
Internet. E n tales sitios (u n ejem plo se m u estra en la F ig u ra 9-9), b ásica m en te
in tro d u ce su va lo r d e estadístico F y los grados de lib ertad y la aplicación ca lcu la el
v a lo r lím ite d e la d istrib u ció n i 7 y e l v a lo r P.
P ro b le m a 9 .1 1 Se lleva a cabo un experimento para ver qué gen de

mantenimiento, HSKG1 o HSKG2, servirá mejor como referencia en un estudio
comparativo de expresión génica. Este experimento imitará a dicho estudio. La
transcripción de un gen de choque térmico será monitorizada tras un cambio en
la temperatura de incubación desde 37 a 43 °C. El gen de mantenimiento
escogido como referencia no debería estar afectado por el cambio de
temperatura. Treinta cultivos de células hepáticas (cultivadas en placas de seis
pocilios) son sometidos al tratamiento de choque térmico. Se extrae el ARN total
de cinco cultivos paralelos de células hepáticas a tiempo cero (justo antes del
choque térmico) y a 1 y 2 h tras el cambio de temperatura. Doscientos
nanogramos de ARN total de cada cultivo en paralelo son convertidos a ADNc
con una transcriptasa reversa y colocados en tubos de PCR a tiempo real para
analizar la expresión génica de HSKG1 o HSKG2. Se obtienen los resultados
mostrados en las Tablas 9-2 y 9-3. Este experimento genera tres grupos de
T a b la 9 -2 Resultados del estudio de análisis de expresión génica de HSKG1

por reacción en cadena de la polim erasa (PCR) a tiem po real, tal com o se
describe en el Problema 9.11
Tiem p o (horas después Posición del pocilio CT

del choq ue térmico)
0 A1 27,3
B1 27,7
Cl 27,4
DI 27,2
El 27,5
1 F1 27,6
G1 27,8
H1 27,5
A2 27,4
B2 27,5
2 C2 27,2
D2 27,1
E2 27,6
F2 27,4
G2 27,3
T a b la 9 -3 Resultados del estudio de análisis de expresión génica de HSKG2

por reacción en cadena de la polim erasa (PCR) a tiem po real, tal com o se
describe en el Problema 9.11
Tiem p o (horas después Posición del pocilio CT

del choq ue térmico)
0 H2 29,3
A3 28,7
B3 29,5
C3 29,2
D3 29,7
1 E3 27,1
F3 27,3
G3 27,2
H3 26,8
A4 27,4
2 B4 26,5
C4 26,9
D4 25,8
E4 26,3
F4 26,1
valores CT (dado que hay tres medidas de tiempo) con cinco muestras en cada
grupo. Para que la hipótesis nula sea verdad, es decir, no se produce efecto del
tratamiento experimental sobre la expresión del gen de mantenimiento, la
media de los valores CT para los tres grupos debería ser igual. ¿Qué gen, HSKG1 o
HSKG2, supondría un mejor gen de referencia?
S o lu c ió n 9.11
Usaremos ANOVA unidireccional con el estadístico F para evaluar qué gen está
menos afectado por el tratamiento de choque térmico y utilizaremos ese gen
como referencia en nuestro subsiguiente experimento comparativo de
expresión génica. Con el uso de esta prueba estadística veremos si podemos
aceptar o rechazar la hipótesis nula. La interpretación es:
H0: no hay diferencia en la media de valores CT para muestras tomadas a 0,1 y 2 h
tras el cambio de temperatura. Cualquier diferencia que veamos es el resultado
del mero azar.
Escogeremos como referencia aquel gen para el cual podamos aceptar la
hipótesis nula.
Dado que los valores Ct crudos se calculan a partir de un gráfico donde se
representa el log-lineal de señal fluorescente frente al número de ciclos, la CT es
una función exponencial, no lineal. Si tuviéramos que calcular la varianza
basándonos en los números CT crudos, no estaríamos representando con
precisión la variación real. No obstante, los valores CT crudos pueden ser con
vertidos a valores lineales mediante el uso del término 2 -c r. Utilizaremos los
valores convertidos cuando calculemos la varianza para los dos genes de man
tenimiento, tal como se muestra en las Tablas 9-4 y 9-5.
Primero calcularemos el promedio de las medias (x) para cada gen en las tres
medidas de tiempo
a+ b+ c
x —
m
donde m es el número de grupos (los números son 10 9).

Para el gen HSKG1,
5,61 + 5,09 + 6,01

3
Para el gen HSKG2,
1,58 + 6 ,7 4 + 1 2 ,3 3 20,65
Ahora calculamos la varianza intergrupo (s*2) para cada gen
. „2 _ ( q - x )2 + ( ¡ > - x )2 + ( c - x ) 2
m- 1
T a b la 9-4 Cálculos de varianza de las tres m edidas de tiem po del experim ento de cam bio de
tem peratura en los que se analiza HSKG1 tal com o se describe en el Problema 9.11
H Pocilio CT 2 Ct x (x IO 9) (x - x ) (x - x )2 X ¡ ( x - x ) 2 (x IO -9)
( X I O 9) (x IO -9) S2 ~ n ~ 1X (x 1 ° 9)
0 Al 27,3 6,05 x 10“ 9 5,61 0,44 0,1936 2,1124 0,5281

B1 27,7 4,59 x 10“ 9 -1,02 1,0404
Cl 27,4 5,65 x 0“ 9 0,04 0,0016
D1 27,2 6,49 x 10“ 9 0,88 0,7744
E1 27,5 5,29 x 10-9 -0,32 0,1024
1 F1 27,6 4,92 x 10“ 9 5,09 -0,17 0,0289 1,0786 0,2697
G1 27,8 4,28 x 10“ 9 -0,81 0,6561
H1 27,5 5,29 x 10-9 0,20 0,0400
A2 27,4 5,65 x 10-9 0,56 0,3136
B2 27,5 5,29 x 10-9 0,20 0,0400
2 C2 27,2 6,49 x 10“ 9 6,01 0,48 0,2304 2,4333 0,6083
D2 27,1 6,95 x 10-9 0,94 0,8836
E2 27,6 4,92 x 10“ 9 -1,09 1,1881
F2 27,4 5,65 x 10“ 9 -0,36 0,1296
G2 27,3 6,05 x 10“ 9 0,04 0,0016
T a b la 9 -5 Cálculos de varianza de las tres m edidas de tiem po del experim ento de cam bio de
tem peratura en los que se analiza HSKG2 tal com o se describe en el Problema 9.11
H Pocilio CT 2 Ct x ( x 1 0 -9) (x - x ) (x - x ) 2 £ (x - x ) 2 ( x IO -9 ) ^ ( x - x ^ x i o - 9)
( x IO -9 ) ( x IO -9 )
0 H2 29,3 1,51 x 10-9 1,58 -0,07 0,0049 0,7631 0,1908

A3 28,7 2,29 x 10-9 0,71 0,5041
B3 29,5 1,32 x 10~9 -0,26 0,0676
C3 29,2 1,62 x 10-9 0,04 0,0016
D3 29,7 1,15 x 10-9 -0,43 0,1849
1 E3 27,1 6,95 x 10-9 6,74 0,21 0,0441 5,0832 1,2708
F3 27,3 6,05 x 10-9 -0,69 0,4761
G3 27,2 6,49 x 10-9 -0,25 0,0625
H3 26,8 8,56 x 10“ 9 1,82 3,3124
A4 27,4 5,65 x 10~9 -1,09 1,1881
2 B4 26,5 10,53 x 10-9 12,33 -1,80 3,2400 47,5375 11,8844
C4 26,9 7,99 x 10-9 -4,34 18,8356
D4 25,8 17,12 x 10-9 4,79 22,9441
E4 26,3 12,10 x 10“ 9 -0,23 0,0529
F4 26,1 13,90 x 10-9 1,57 2,4649
9.6 Cuantificación relativa: el método AACT 247
Para los datos de HSKG1, tenemos (los valores están a 10 )
.* 2 _ ( 5 ' 6 1 “ 5 ' 5 7 ) 2 + ( 5 <0 9 - 5>5 7 ) 2 + ( 6 <0 1 - 5>5 7 ) 2

3-1
(0,04)2 + ( —0,48)2 + (0,44)2
2
_ 0,0016 + 0,2304 + 0,1936
2
_ 0,4256
_ 2
= 0,2128
Para los datos de HSKG2, tenemos (los valores están a 10-9)
(1,58 - 6,88)2 + (6,74 - 6,88)2 + (12,33 - 6,88)2

S*2 - -
3- 1
( —5,30)2 + (- 0 ,1 4 )2 + (5,45)2
_ 2
28,0900 + 0,0196 + 29,7025
2
57,8121
_ 2
- 28,9061
A continuación calculamos el promedio de las varianzas de la muestra para cada

gen
s ;+ s ¿ + s ;+ ...
m
donde m es el número de grupos.
Para el gen HSKG1, tenemos (los valores están a 10-9)
, 0,5281 + 0 ,2697 + 0,6083 1,4061

s2 = —---------- ----------- ------ = —------ = 0,4687
3 3
Para el gen HSKG2, tenemos (los valores están a 10-9)
, 0,1908 + 1,2708 + 11,8844 13,346

3 3
Ahora estamos preparados para calcular el estadístico F

n s*2
donde n es el número de muestras dentro de cada grupo (los valores están a

Para el gen HSKG1,
=ü « « = 2,270,
0,4687
Para el gen HSKG2,
_ 5(28,9061) 144,5305
F = —— ------ - — ---- ------ — 32,4883
4,4487 4,4487
Para saber cuál es nuestro valor límite F en una tabla de distribución F,

necesitamos conocer los dos grados de libertad para nuestro estadístico F.
Para el numerador del estadístico F (la varianza intergrupo), los grados de
libertad ( d f j se calculan como m — 1, donde m es el número de grupos.
Tenemos tres grupos y, por tanto, dos grados de libertad. Usamos este valor
para saber en qué columna de una tabla de distribución F encontraremos el
valor límite. Para el denominador del estadístico F (la varianza intragrupo), los
grados de libertad ( d f j se calculan como m(n — 1) donde n es el número de
miembros de cada grupo. Dado que tenemos cinco muestras para cada uno
de los tres grupos, tenemos 3(5 — 1) = 12 grados de libertad. Usamos este
valor para saber en qué fila de una tabla de distribución F encontraremos
nuestro valor límite.
Para 2 y 12 grados de libertad, la distribución Fp ara un nivel de confianza del
5% muestra un valor crítico de 3,89 (Figura 9-10). Por lo tanto, a esos grados de
libertad, el estadístico F tiene una probabilidad del 95% de ser menor que 3,89
si la hipótesis nula es verdad. Dicho de otro modo, sólo el 5% de las veces el
estadístico F produciría un valor así de extremo si la hipótesis nula fuese
verdadera. Así, si el estadístico F que hemos calculado tiene un valor inferior
a 3,89, aceptamos la hipótesis nula y podemos concluir que el tratamiento
experimental no ejerce ningún efecto sobre el valor CT del gen. Si el estadístico
F es superior a este valor, entonces deberíamos rechazar la hipótesis nula y
concluir que el tratamiento experimental (el cambio a 43 °C) afecta a la
expresión del gen. El uso de tal gen como control endógeno no sería una
elección inteligente.
El estadístico F para el grupo de datos del gen HSKG1 es 2,2701, mientras que
para el gen HSKG2 es 32,4883. Dado que para HSKG1 un estadístico F de 2,2701
es inferior al valor crítico de 3,89, podemos aceptar la hipótesis nula de que
cambiar la temperatura a 43 °C no afecta a la expresión del gen HSKG1. Sin
embargo, dado que el estadístico F de 32,4883 correspondiente al grupo de
datos del gen HSKG2 es superior al valor límite de 3,89, la hipótesis nula no aplica
al gen HSKG2. Por lo tanto, utilizar HSKG1 como gen de referencia es la mejor
opción.
También podemos calcular el valor P para cada estadístico F mediante el uso de
una aplicación de Internet que permita calcular el valor P, tal como se muestra
en la Figura 9-11:
dfn
2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 15 20 30
2 19.00 19.16 19.25 19.30 19.33 19.35 19.37 19.38 19.40 19.41 19.43 19.45 19.46
9.55 9.28 9.12 9.01 8.94 8.89 8.85 8.81 8.79 8.74 8.70 8.66 8.62
3
4 6.94 6.59 6.39 6.26 6.16 6.09 6.04 6.00 5.96 5.91 5.86 5.80 5.75
5.79 5.41 5.19 5.05 4.95 4.88 4.82 4.77 4.74 4.68 4.62 4.56 4.50
5
5.14 4.76 4.53 4.39 4.28 4.21 4.15 4.10 4.06 4.00 3.94 3.87 3.81
6
4.74 4.35 4.12 3.97 3.87 3.79 3.73 3.68 3.64 3.57 3.51 3.44 3.38
7
4.46 4.07 3.84 3.69 3.58 3.50 3.44 3.39 3.35 3.28 32 2 3.15 3.08
8
4.26 3.86 3.63 3.48 3.37 3.29 3.23 3.18 3.14 3.07 3.01 2.94 2.86
9
10 4.10 3.71 3.48 3.33 3.22 3.14 3.07 3.02 2.98 2.91 2.85 2.77 2.70
3.59 3.36 3.20 3.09 3.01 2.95 2.90 2.85 2.79 2.72 2.65 2.57
(
11
3.89 > 4 9 3.26 3.11 3.00 2.91 2.85 2.80 2.75 2.69 2.62 2.54 2.47
12
*^3.41 3.18 3.03 2.92 2.83 2.77 2.71 2.67 2.60 2.53 2.46 2.38
13
14 3.74 3.34 3.11 2.96 2.85 2.76 2.70 2.65 2.60 2.53 2.46 2.39 2.31
15 3.68 3.29 3.06 2.90 2.79 2.71 2.64 2.59 2.54 2.48 2.40 2.33 2.25
16 3.63 3.24 3.01 2.85 2.74 2.66 2.59 2.54 2.49 2.42 2.35 2.28 2.19
3.59 3.20 2.96 2.81 2.70 2.61 2.55 2.49 2.45 2.38 2.31 2.23 2.15
17
18 3.55 3.16 2.93 2.77 2.66 2.58 2.51 2.46 2.41 2.34 121 2.19 2.11
19 3.52 3.13 2.90 2.74 2.63 2.54 2.48 2.42 2.38 2.31 2.23 2.16 2.07
20 3.49 3.10 2.87 2.71 2.60 2.51 2.45 2.39 2.35 2.28 2.20 2.12 2.04
3.47 3.07 2.84 2.68 2.57 2.49 2.42 2.37 2.32 2.25 2.18 2.10 2.01
21
■ FIGURA 9-10 La tabla de distribución F para un nivel de confianza del 5% con dos grados de libertad para el numerador del estadístico F (dQ y 12 grados de
libertad para el denominador del estadístico F (dfj muestra un valor de 3,89 (marcado con un círculo).
!
Se pueden usar diferentes
| d f n u m e ra to r = |[F ~ d f n u m e r a to r = pT ~
aplicaciones de Internet para
1 [d f d e n o m in a to r = |fiT" calcular valores P. Simplemente |d f d e n o m in a to r = [ ¡ T ^
1 F = ||2 .2 7 0 l|= introduzca los grados de libertad F = ||2.2701
P = |l y el estadístico F (izquierda), P = [ m ^583=

|
i
presione el botón Calcular
Compute | («Compute») y el valor P será C om pute~ ~¡
cc
calculado (derecha).
I
■ FIGURA 9-11 Una calculadora de valor P muestra que el estadístico F para el gen HSKG1 tiene un valor P de 0,1583.
El valor P nos dirá con qué probabilidad el muestreo al azar nos llevaría a una
diferencia entre medias de la muestra tan grande (o mayor) que la que
observamos. Dado que el estadístico F para el grupo de datos de HSKG1 tiene
un valor P de 0,14583 (el cual es mayor que el nivel de significancia 0,05)
(Figura 9-11), podemos concluir que el tratam iento experimental no tiene
efecto estadísticam ente significante sobre el promedio de valores CT que
observamos. Sin embargo, el estadístico F para el grupo de datos de HSKG2
muestra un valor P de 0,00001. En otras palabras, sólo hay una probabilidad
del 0,001 % de que tal experim ento genere un estadístico F de valor 32,4883 o
m ayor si realmente no tuviera efecto el cambio de temperatura sobre la media
de valores CT para cada grupo. Así, existe una relación estadísticamente
significante entre el tratamiento experimental y la expresión de HSKG2. De
nuevo, a partir de los análisis de valores P, deberíamos concluir que el uso de
HSKG1 como control endógeno es una idea mucho más buena que utilizar
HSKG2.
9 .6 .2 El m éto d o 2 AACt: e ficie n cia d e am p lifica c ió n

E l g en q u e esc o ja co m o co n tro l en d ó g e n o para u n ex p e rim en to q u e u se el m étodo
A A C t d eb e ría cu m p lir al m en o s d os requerim ientos: 1) no d eb e ría estar afectado
p o r el trata m ie n to an te el cu a l se v a a dete rm in a r u n a re sp u esta y 2 ) d eb e p oderse
am p lifica r con u n a efic ien cia igual a la del g en diana. Si la e fic ien cia de la dian a y
el control en d ógeno son ap ro x im a d am en te iguales, el A C T es p ro p o rcio n al a la
re la ció n entre los n ú m ero s d e copias iniciales d e lo s d os genes.
S e p u e d e d e te rm in a r la s im ilitu d e n tre la s efic ie n c ia s d e a m p lific a c ió n de
d is tin to s g e n e s m e d ia n te e l c á lc u lo d e la s d ife re n c ia s d e s u s v a lo re s p ro m e d io
d e A C t (C t diana — C T referencia) a lo la rg o d e las d ilu c io n e s d e l A D N c m o ld e.
C u a lq u ie r d ife re n c ia en lo s v a lo re s A C t p a r a ca n tid a d e s v a ria n te s d e A R N d e
p a r tid a p u e d e s e r v is u a liz a d a e n u n g rá fic o d e M ic ro s o ft E x c e l d o n d e se
enfrenten las A C t frente a la dilución d e A D N c. S i la re cta q u e m ejo r se ajusta
al gráfico (la re cta d e regresión) tien e u n a p en d ie n te c e rca n a a cero, en tonces
se p u ed e co n c lu ir q u e lo s d os g en e s tien en eficien cias d e am plificación
sim ilares y el m étodo A A C t es u n a ap ro x im a ció n v álid a p a ra m ed ir cam bios
en la ex p resió n d el g en d ia n a re la tiv o s a la ex presión d el g en d e referencia.
C o m o criterio g en e ral, si la p en d ie n te d e la re cta d e re g resió n es in ferio r a 0,1,
las eficiencias están suficientem ente ce rca u n a d e la o tra d e m an e ra q u e el u so
d e l m éto d o A A C t e s v álid o . V isto d e o tra m an e ra, n o im p o rta si lo s g en e s
tie n e n v a lo re s C t d rá s tic a m e n te d ife re n te s. L a c la v e es q u e si la re cta de
re g re s ió n d e c a d a g e n fu e se re p re s e n ta d a en el m ism o g rá fico , seg u iría n
u n a d ire c c ió n p a ra le la u n a a la o tra. S i lo h a c e n e s q u e tie n e n efic ien cia s
d e am p lific a c ió n sim ilares.
9.6 Cuantificación relativa: el método A A C t 251
P ro b le m a 9 .1 2 Se sospecha que el Gen A (la diana) tiene una función en la

respuesta del sistema inmunitario frente a la infección viral. En este
experimento, su nivel de expresión será determinado tras la infección de células
hepáticas en cultivo con el virus de la hepatitis C y su nivel de expresión será
comparado con el de (3-actina (el calibrador para este experimento) mediante el
uso del método 2-AACt (comparativo Ct). Dado que es necesario que Gen A
y (3-actina tengan eficiencias de amplificación similares, un experimento inicial
se lleva a cabo para ver si esto es cierto. Se puede saber si dos dianas tienen la
misma eficiencia de amplificación analizando si sus valores A C T varían en
función de la dilución del molde. Se aísla ARN de las células hepáticas en cultivo.
Cantidades que varían desde 0,01 a 1 ng de ARN son convertidas a ADNc con
una transcriptasa reversa. Muestras triplicadas de ADNc de Gen A y (3-actina son
amplificadas por PCR a tiempo real a partir de cada cantidad de ARN inicial. Se
obtienen los resultados de la Tabla 9-6. En el experimento descrito aquí, ¿Gen A
y (3-actina son amplificados con eficiencias similares?
T a b la 9-6 Conjunto de valores CT del experim ento descrito en el

Problem a 9.12
Cantidad C t de Gen A C t prom edio CT d e (3-actina C t prom edio

de ARN de de Gen A de (3-actina
p artida (ng)
1,000 28,71 28,71 26,60 26,59

1,000 28,72 26,55
1,000 28,70 26,62
0,500 29,62 29,63 27,55 27,57
0,500 29,64 27,57
0,500 29,63 27,60
0,250 30,65 30,62 28,57 28,60
0,250 30,63 28,63
0,250 30,57 28,60
0,100 31,82 31,82 29,75 29,76
0,100 31,85 29,80
0,100 31,80 29,73
0,050 32,82 32,82 30,80 30,78
0,050 32,84 30,78
0,050 32,79 30,75
0,025 33,75 33,76 31,78 31,75
0,025 33,78 31,75
0,025 33,74 31,72
0,010 35,02 35,01 33,05 33,01
0,010 35,05 32,89
0,010 34,96 33,10
No debería ser inesperado que, por diversas condiciones, una serie de cultivos
de células hepáticas diera lugar a un rango de valores CT diferentes cuando se
analizan sus niveles de expresión génica. Cuando se publican los promedios
para cualquier grupo de datos, no importa en qué campo, biología, química o
física, casi siempre verá el promedio escrito seguido de un signo « ± » adjunto a
una cantidad numérica. Dicho signo indica el margen de error de ese resultado.
Se trata de una indicación del grado de variación de los datos usados para
calcular el valor promedio respecto a ese promedio.
Sin embargo, ¿qué seguridad tiene de que un margen de error cubra toda la
variación posible dentro de un grupo de datos? Esta seguridad viene determi
nada por el error estándar — una medida derivada de la desviación estándar,
la cual, de forma similar a lo que pasaba con el margen de error, representa el
promedio de la distancia de los datos a la media— . Llegaremos al margen de
error a través de la desviación estándar.
La desviación estándar (s), tal como hemos visto, viene determinada por la
fórmula
donde el símbolo E representa la suma, x es una muestra, x es el promedio

(media) y n es el número de medidas en el conjunto de datos.
La desviación estándar se usa para calcular el error estándar según la siguiente
fórmula:
error estándar — —7=

~Jñ
en la que s es la desviación estándar y n es el tamaño de la muestra.

La mayoría de conjuntos de datos que forman parte de un análisis estadístico
de experimentos que tratan con causas y efectos reales están agrupados
simétricamente a ambos lados de la media. Si el tamaño de muestra es sufi
cientemente grande los puntos de datos deberían quedar distribuidos en
una curva con forma de campana donde el valor medio corta por la mitad a
dicha curva. Muchos puntos de datos tendrán valores cercanos al promedio. A
medida que se aleje de la media en las direcciones positiva y negativa,
encontrará menos puntos de datos. El 80% de los valores deberían caer dentro
del margen de 1,28 de error estándar de la media. El 95% de los datos deberían
caer dentro del 1,96 de error estándar de la media, y el 99% de los datos
deberían encontrarse dentro del margen de 2,58 de error estándar de la media.
Los valores de porcentaje mostrados aquí se denominan niveles de confianza.
A nivel de confianza 99%, por ejemplo, tiene confianza, por así decirlo, de que
tiene el 99% de todos los resultados posibles de su muestreo. El número de error
Tabla 9-7 Niveles de confianza y sus

correspondientes valores Z
Nivel de confianza Valor Z
80% 1,28
90% 1,64
95% 1,96
98% 2,33
99% 2,58
estándar que se tiene que añadir o sustraer de la media para darle el nivel de
confianza deseado se denomina valor Z. Los niveles de confianza y sus valores Z
correspondientes se muestran en la Tabla 9-7.
Ahora podemos calcular el margen de error del promedio de la muestra con un
grado definido de confianza. La fórmula general es
margen de error — Z x ~^=

Vn
en la que Z (el valor Z) es el número de errores estándar asociados a un nivel

particular de confianza, s es la desviación estándar, y n es el número de
m uestras en el conjunto de datos. Si queremos tener confianza de que nuestro
margen de error contiene el 99% de todos los resultados posibles, la ecuación
se convierte en
margen de error = 2,58 x -^=

Vn
Las desviaciones estándar (s) de los valores C rd e los ADNc de Gen A y (3-actina
para cada cantidad de ARN de partida son calculados en las Tablas 9-8 y 9-9.
Estos valores serán utilizados para determinar el margen de error para cada
cantidad de ARN inicial.
A continuación podemos calcular el margen de error para cada cantidad de ARN
inicial para Gen A (Tabla 9-10) y (3-actina (Tabla 9-11).
Ahora podemos determinar el grado en que difieren los valores promedio de CT
del Gen A y el de (3-actina para cada cantidad de ARN inicial sustrayendo uno del
otro (lo que nos da como resultado el ACt)- No obstante, cada valor promedio de
CT tiene asociado un error estándar. ¿Cómo hacemos constar estos valores de
error estándar cuando publicamos la diferencia entre dos números? El método
que utilizamos se denomina propagación de errores.
T a b la 9 -1 0 Cálculos de m argen de error de los valores CT de Gen A para

diferentes cantidades de ARN inicial con un nivel de confianza del 99%.
Los valores de desviación estándar (s) han sido calculados en la Tabla 9-8.
El tam año de la m uestra (n) para cada cantidad de ARN inicial es tres
ARN inicial (ng) s de Gen A s

2,58 X ~^=
y/Ü y/ñ
1,000 0,01 0,0058 0,01

0,500 0,01 0,0058 0,01
0,250 0,04 0,0231 0,06
0,100 0,03 0,0173 0,04
0,050 0,03 0,0173 0,04
0,025 0,02 0,0116 0,03
0,010 0,05 0,0289 0,07
T a b la 9 -1 1 Cálculos de m argen de error de los valores CT de (3-actina para

diferentes cantidades de ARN inicial con un nivel de confianza del 99%.
Los valores de desviación estándar (s) han sido calculados en la Tabla 9-9.
El tam año de la m uestra (n) para cada cantidad de ARN inicial es tres
ARN inicial (ng) s de (3-actina 5

2,58 X ~^=
/ñ Vñ
1,000 0,04 0,0231 0,06
0,500 0,03 0,0173 0,04
0,250 0,03 0,0173 0,04
0,100 0,04 0,0231 0,06
0,050 0,03 0,0173 0,04
0,025 0,04 0,0231 0,06
0,010 0,11 0,0636 0,16
Cuando los números con márgenes de error son o bien añadidos o sustraídos, el
nuevo margen de error se calcula como la raíz cuadrada de la suma al cuadrado
de cada margen de error:
margen de error de suma o resta =
y j (margen de erro ri)2 + (margen de error2 )2 + ... + (margen de error„)2

Cuando las cantidades con márgenes de error son multiplicadas o divididas, el

nuevo margen de error se calcula como la raíz cuadrada de la suma de
cuadrados del margen de error dividido entre la cantidad a la cual está
adjuntado:
margen de error de producto o cociente =
//m argen de errorA 2 /m argen de error2 \ 2 /m argen de error„\2

y V cantidad! J \ cantidad2 ) \ cantidad,, J
Para 1 ng de muestra de ARN inicial, sustraeremos el promedio de CTde (3-actina

(26,59 ± 0,06) al promedio de CTde Gen A (28,71 ± 0,01). Para calcular el error
propagado, tenemos
error propagado = yj~(0ÔI)2 + (0,06)2

= V0,0001 + 0,0036
= 0,06
Los márgenes de error para los valores ACt de las muestras restantes, los cuales
se muestran en la Tabla 9-12, son calculados de la misma manera.
Ahora podemos representar los valores ACT determinados en la Tabla 9-12
usando Microsoft Excel tal como se describe en el Apéndice A. No obstante,
Valores A C T para cada cantidad de ARN inicial. El valor CT

T a b la 9 -1 2
promedio de (3-actina es restado del valor CT promedio de Gen A. El margen
de error para cada A C T se calcula mediante la propagación de errores
(véase la explicación en el texto)
ARN inicial (ng) Prom edio CT Prom edio CT A C T (CT prom e

de GenA de 3-actina d io de GenA—CT
p rom edio de
3-actina)
1,000 28,71 0,01 26,59 0,06 2,12 0,06

0,500 29,63 0,01 27,57 0,04 2,06 0,04
0,250 30,62 0,06 28,60 0,04 2,02 0,07
0,100 31,82 0,04 29,76 0,06 2,06 0,07
0,050 32,82 0,04 30,78 0,04 2,04 0,06
0,025 33,76 0,03 31,75 0,06 2,01 0,07
0,010 33,01 0,07 33,01 0,16 2,00 0,17
F o r m a t D a ta S e r ie s jd x ]
Cancel
■ FIGURA 9-12 Las barras de error son añadidas a un gráfico generado con Microsoft Excel m ediante la utilización de la ventana de diálogo Formatear series de
datos (la cual se obtiene presionando sobre uno de los puntos de datos del gráfico).
debemos también incluir el margen de error para cada valor mediante el uso de
barras de error. Éstas pueden ser añadidas al gráfico siguiendo las instrucciones
de Excel mostradas en la Figura 9-12.
En la Figura 9-13 se representan con Microsoft Excel los valores A C T con sus
márgenes de error (calculados en la Tabla 9-12). Para este experimento, dado
que el valor absoluto de la pendiente de la recta que mejor se ajusta es cercano a
cero (0,0463), los genes diana (Gen A) y referencia ((3-actina) tienen eficiencias de
amplificación similares y pueden ser usados en un ensayo de expresión génica
utilizando el método 2-AAGt.
A B c D E F G H I J
1 ng Input log ng CT Yerr
2 1 0 2.12 0.06
3 0.5 -0.30103 2.06 0.04
4 0.25 -0.60206 2.02 0.07
5 0.1 -1 2.06 0.07
6 0.05 -1.30103 2.04 0.06
7 0.025 -1.60206 2.01 0.07
8 0.01 -2 2 0.17
11
12 E fic ie n c ia rela tiv a d e Gen A y de {3-activa
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32 L o g d e l A R N in ic ia l to ta l (n g)
33
34
3b
I FIGURA 9-13 El gráfico de los datos de la Tabla 9-12 muestra una pendiente de 0,0463.
9.6.3 El m éto d o 2 T: ¿está el g en de re fe re n cia

a fe cta d o p o r el tra ta m ie n to e x p e rim e n ta l?
P ro b le m a 9 .1 3 Se Incuba una serle de 10 muestras de cultivos hepáticos con

el virus de la hepatitis C. Como control, una segunda serie de 10 cultivos
hepáticos se dejan sin tratamiento. Las células no infectadas sirven como
calibrador. Dos horas después de la infección, se extrae ARN total de ambos
grupos de muestras, células hepáticas Infectadas y células hepáticas no
infectadas. El ARN total es convertido a ADNc utilizando transcriptasa reversa. La

cantidad de expresión de Gen A es analizada por PCR a tiempo real utilizando
cebadores y sonda específicos por Gen A. La expresión de (3-actina se usa como
control endógeno, el cual es amplificado y analizado utilizando su propio
conjunto de cebadores y sonda. Los ADNc de Gen A y (3-actina son amplificados y
analizados en tubos separados. Se obtienen los resultados de la Tabla 9-13.
Usando el método 2 _AACt, calcule el nivel de expresión relativa de Gen A en las
células infectadas con el virus de la hepatitis C.
Dado que Gen A y (3-actina son analizados en reacciones separadas, no
deberíamos emparejar ninguna reacción particular de Gen A con alguna
reacción particular de (3-actina. Calcularemos los valores promedio de CT de
los dos genes separadamente antes de calcular la A C T. El promedio, o media
(designado como x), se calcula como la suma de los datos divididos entre el
número de puntos de datos.
T a b la 9 -1 3 Valores CT del experim ento descrito en el Problem a 9.13
Células Posición del CT de Gen A Posición del CT de

pocilio pocilio (3-actina
Células Al 31,65 C2 24,32

hep áticas no B1 31,37 D2 24,35
infectadas CI 31,72 E2 24,45
DI 31,51 F2 24,28
El 31,80 G2 24,25
F1 31,68 H2 24,36
G1 31,47 A3 24,42
H1 31,59 B3 24,20
A2 31,78 C3 24,52
B2 31,55 D3 24,30
Células E3 23,15 G4 25,87
hepáticas F3 22,89 H4 25,93
infectad as por G3 22,58 A5 25,75
el virus de la
H3 23,05 B5 25,90
hep atitis C
A4 22,64 C5 25,72
B4 22,78 D5 25,81
C4 23,21 E5 26,03
D4 22,92 F5 25,85
E4 22,84 G5 25,87
F4 22,73 H5 25,95
La CT promedio de Gen A en células hepáticas no infectadas:
/ 31,65 + 31,37 + 31,72 + 31,51 + 31,80 + 31,68
\ +31,47 + 31,59 + 31,78 + 31,55
La CT promedio de (3-actina en células hepáticas no infectadas:
/ 24,32 + 24,35 + 24,45 + 24,28 + 24,25 + 24,36 \
l +24,42 + 24,20 + 24,52 + 24,30

= 24,35
10
La CT promedio de Gen A en células hepáticas infectadas con hepatitis C:
/ 23,15 + 22,89 + 22,58 + 23,05 + 22,64 + 22,78
V +23,21 + 22,92 + 22,84 + 22,73
La CT promedio de (3-actina en células hepáticas infectadas con hepatitis C:
/ 25,78 + 25,93 + 25,75 + 25,90 + 25,72 + 25,81
V +26,03 + 25,85 + 25,87 + 25,95
Tal como hicimos en el Problema 9.12, determinaremos el error estándar para

este conjunto de datos calculando primero la desviación estándar.
De nuevo, la desviación estándar (s) viene determinada por la fórmula
en la que el símbolo E representa la suma, x es una muestra, x es el promedio

(media) y n es el número de medidas en el conjunto de datos.
La desviación estándar se usa para calcular el error estándar según la siguiente
fórmula:
error estándar = ——
\fñ
en la que s es la desviación estándar y n es el tamaño de la muestra.

El margen de error del promedio de la muestra con un grado de confianza

definido se calcula usando la siguiente ecuación:
margen de error — Z x ~^=

Vn
en la que Z (el valor Z) es el número de errores estándar asociados con un nivel

de confianza particular, s es la desviación estándar y n es el número de muestras
en el conjunto de datos. Para un margen de error que contenga el 99% de todos
los posibles resultados, la ecuación queda
margen de error = ±2,58 x -^=

Vn
Para obtener el margen de error de cada conjunto de datos, calcularemos

primero sus desviaciones estándar. Las Tablas 9-14 a 9-17 muestran los compo
nentes involucrados en estos cálculos.
Ahora podemos calcular los valores de desviación estándar. Cada conjunto de
datos tiene un tamaño (n) de 10 muestras.
Ta b la 9-14 Componentes del cálculo de las desviaciones estándar de los

valores CT para Gen A obtenidos en células hepáticas no infectadas. El
valor medio para este conjunto de datos (calculado previam ente) es 31,61
CT de Gen A en célu las no ( x - x ) (x -x )2

infectadas (x)
31,65 0,04 0,0016

31,37 -0 ,2 4 0,0576
31,72 0,11 0,0121
31,51 -0 ,1 0 0,0100
31,80 0,19 0,0361
31,68 0,07 0,0049
31,47 -0 ,1 4 0,0196
31,59 -0 ,0 2 0,0004
31,78 0,17 0,0289
31,55 -0 ,0 6 0,0036
Total 0,1748
T a b la 9 -1 5 Com ponentes del cálculo de las desviaciones estándar de los

valores CT para (3-act¡na obtenidos en células hepáticas no infectadas. El
valo r m edio para este conjunto de datos (calculado previam ente) es 24,35
CT d e (3-actina en células (x -x ) (x -x )2
no infectadas (x)
24,32 -0,03 0,0009

24,35 0,00 0,0000
24,45 0,10 0,0100
24,28 -0,07 0,0049
24,25 -0,10 0,0100
24,36 0,01 0,0001
24,42 0,07 0,0049
24,20 -0,15 0,0225
24,52 0,17 0,0289
24,30 -0,05 0,0025
Total 0,0847
T a b la 9 -1 6 Com ponentes del cálculo de las desviaciones estándar de los

valores CT para Gen A obtenidos en células hepáticas infectadas con el virus
de la hepatitis C. El valo r medio para este conjunto de datos (calculado
previam ente) es 22,88
CT de Gen A en células (x -x ) (x -x )2
hep áticas infectadas por
el v iru s (x)
23,15 0,27 0,0729

22,89 0,01 0,0001
22,58 -0,30 0,0900
23,05 0,17 0,0289
22,64 -0,24 0,0576
22,78 -0,10 0,0100
23,21 0,33 0,1089
22,92 0,04 0,0016
22,84 -0,04 0,0016
22,73 -0,15 0,0225
Total 0,3941
T a b la 9 -1 7 C o m p o n e n te s d e l c á lc u lo d e las d e s v ia c io n e s e s t á n d a r d e los
v a lo re s CT p a ra (3-actina o b te n id o s e n cé lu la s h e p á tic a s in fe c ta d a s c o n el
v iru s d e la h e p a titis C. El v a lo r m e d io p a r a e s t e c o n ju n to d e d a to s (c alcu lad o
p re v ia m e n te ) e s 25,87
Ct de (3-actina en células (x -x ) (x -x )2
h ep áticas infectadas por
el v iru s (x)
25,87 0,00 0,0000

25,93 0,06 0,0036
25,75 -0 ,1 2 0,0144
25,90 0,03 0,0009
25,72 -0 ,1 5 0,0225
25,81 -0 ,0 6 0,0036
26,03 0,16 0,0256
25,85 -0 ,0 2 0,0004
25,87 0,00 0,0000
25,95 0,08 0,0064
Total 0,0774
Gen A en las células h ep á tic as no infectadas:
(3-actina e n las células h ep á tic as no infectadas:
Gen A en las células h ep á tic as in fectadas con virus:
(3-actina e n las células h ep á tic as in fectadas con virus:

Con los valores de desviación estándar disponibles, se puede calcular el margen

de errores. Usaremos un nivel de confianza del 99% (Z = 2,58). El tamaño de
muestra (n) para cada conjunto de datos es 10.
Gen A en las células hepáticas no infectadas:
s 0,14 0,14
margen de error = Z x —— = 2,58 x —— = 2,58 x -----= 0,11
y /ñ VTO 3,16
(3-actina en las células hepáticas no infectadas:
s 0,10 0,10
margen de error = Z x —- = 2,58 x —== = 2,58 x — - — 0,08
Vñ yftO 3,16
Gen A en las células hepáticas infectadas con el virus:
s 0,21 0,21
margen de error = Z x —- = 2,58 x —— = 2,58 x — - — 0,17
y/ñ ' y/ñ ' 3,16
(3-actina en las células hepáticas infectadas con el virus:
s 0,09 0,09
margen de error = Z x —= = 2,58 x —= = 2,58 x -----= 0,07
y /ñ V Í0 3,16
A continuación podemos adjuntar el valor de margen de error a los valores

promedio de CT para cada conjunto de datos:
Promedio de CT de Gen A en células hepáticas no infectadas = 31,61 ± 0,11.
Promedio de CT de (3-actina en células hepáticas no infectadas = 24,35 ± 0,08.
Promedio de C t de Gen A en células hepáticas infectadas con hepatitis
C = 22,88 ± 0 ,1 7 .
Promedio de CT de (3-actina en células hepáticas infectadas con hepatitis
C = 25,87 ± 0,07.
La A C t de la muestra calibradora se calcula como el promedio de CT de Gen A en
células hepáticas no infectadas menos el promedio de CT de (3-actina en células
hepáticas no infectadas. Primero calcularemos el margen de error para la A C T
del calibrador. El valor promedio de CT de Gen A en células hepáticas no
infectadas tiene un margen de error de ± 0,11. El promedio de CT de (3-actina
en las células hepáticas no infectadas tiene un margen de error de ± 0,08.
Usando la propagación de errores (véase el Problema 9.2), el margen de error
de la diferencia entre estos dos valores promedio de CT es
margen de error = ^/(0,11)2 + (0,08)2 — ^0,0121 + 0,0064
- V0/0185 - 0,14
Por tanto, adjuntaremos un margen de error de ±0,14 al valor A C T del calibra

dor. Se calcula así:
ACt, calibrador = 31,61 ± 0,11 —24,35 ± 0,08 = 7,26 ± 0,14

La A A C T de las células no infectadas (el calibrador) se calcula como el promedio

de AC t para este conjunto de datos menos el promedio de A C t de las células
no infectadas. Básicamente estamos restando este valor a sí mismo. El resultado
será cero por definición:
7,26 - 7,26 = 0,00
Sin embargo, realizamos este paso debido a los valores de margen de error
adjuntados a dichos números. A continuación calculamos el valor 2 “ AACr para el
calibrador; el margen de error propagado nos mostrará el rango de valores
normalizados. La A C T para las células no infectadas tiene un margen de error
de ±0,14. Para propagar el error, tenemos
yj(0,14 )2 + (0,14 )2 = \/0,0196 + 0,0196^0,0392 = 0,20

Por tanto, nuestro valor A A C t en las células no infectadas se expresa como
0,00 ± 0,20 .
Por definición, la cantidad de Gen A normalizada relativa a sí misma en células no
infectadas usando el método 2_AACt es la unidad (igual a 1,0):
2-(o,oo) _ 10
No obstante, podemos calcular un rango de valores normalizados utilizando el

error propagado de ±0,20. Calcularemos 2 elevado a —(—0,2) (derivado de
0,00 - 0,20 = -0 ,2 ) y 2 elevado a -(0 ,2 ) (derivado de 0,00 + 0,20 = 0,2).
Tenemos
2~aact — — 20,2 = 1,1
2 -AACt — 2- (0’2) — 0,9
Así pues, en células no infectadas, la cantidad normalizada de Gen A relativa a sí

misma tiene un rango de 0,9 a 1,1.
La A C t de la diana (Gen A) en células infectadas se calcula como el promedio de
CT de Gen A en células hepáticas infectadas con hepatitis C menos el promedio
de CT de (3-actina en células hepáticas infectadas con hepatitis C. El valor
promedio de CT de Gen A en células con infección vírica (22,88) tiene un margen
de error de ±0,17. El valor promedio de CT de (3-actina en células con infección
vírica (25,87) tiene un margen de error de ±0,07. El margen de error de la A C T
será
margen de error = ^ /(0 ,1 7 )2 + (0,07)2
= a/0 ,0 2 8 9 + 0,0049 = a/0 ,0 3 3 8 = 0,18

Por lo tanto, adjuntaremos un margen de error de ±0,18 al valor de ACT para el

gen diana. Se calcula así
ACTt diana = 22,88 ± 0,17 - 25,87 ± 0,07 = -2,99 ± 0,18
Ahora podemos calcular la A A C T como el promedio de A CT de la diana menos

el promedio de A C t del calibrador:
A A C t = -2 ,9 9 - 7,26 = -1 0 ,2 5
Propagamos el error de la siguiente manera:
margen de error = \ j (0,18 )2 + (0,14)2
- V 0 ,0 3 24 + 0,0196 = V 0,0520 = 0,23
Así pues, podemos escribir el valor A A C T como —10,25 ± 0,23.

Tomamos el cambio de expresión de Gen A en células no infectadas como 2o, el
cual es equivalente a 1. El cambio de expresión de nuestro gen diana en células
hepáticas infectadas con hepatitis C puede ahora ser calculado como 2_AACt
donde A A C T es —10,25.
2 ~a ac t — 2 - (-10’25) — 1.218
Por tanto, existe un cambio de 1.218 veces en la expresión de Gen A en células

hepáticas infectadas con hepatitis C en comparación con su nivel de expresión
en células hepáticas no infectadas. Sin embargo, todavía tenemos que tener en
cuenta el margen de error. Podemos usar el margen de error para determinar un
rango de valores para 2“ Ct. En este experimento, los valores A A C T, basados
en los cálculos del margen de error, variarán desde —10,48 (—10,25 menos el
margen de error de 0,23) hasta —10,02 (—10,25 más 0,23):
2 ~aact _ 2~(—10,48) _ ^ 428
2 ~a ac t _ 2 —(—10,02) _ 1 038
Así, podemos decir que Gen A se expresa 1.218 veces más en células hepáticas
infectadas con hepatitis C que en células no Infectadas con un rango de 1.038 a
1.428 veces de diferencia. Nótese, sin embargo, que este rango no es simétrico
alrededor del valor promedio de A A C T de 1.218 (1.428 se aleja 210 veces de
diferencia respecto a 1.218 mientras que 1.038 se aleja 180 veces de diferencia).
Dado que la C t se relaciona con un número de copias de forma exponencial, la
asimetría de rango es un artefacto que está causado por calcular una
comparación lineal de cantidades a partir de resultados derivados de un proceso
exponencial.
Nota: Si el valo rA A C T es positivo (+4, por ejemplo), entonces
2-a a c t _ 2 <4’0) — 0,0625
y podemos decir que la muestra tiene 0,0625, o 7 i6, la cantidad de ARN diana
como calibrador.
P ro b le m a 9 .1 4 Llevamos a cabo un experimento para medir la diferencia de

expresión de Gen A (el gen diana) en dos tipos de tejidos diferentes, hígado
y músculo. (3-actina servirá como gen de referencia y las células musculares
servirán como calibrador. Se obtiene ARN total de ambos tipos celulares y 2 (xg
de ARN total de cada tipo celular se convierten en ADNc con transcriptasa
reversa. Cinco pocilios, réplica de cada tipo celular, contienen ADNc derivado de
20 ng de ARN total. Una sonda para Gen A se marca con un fluoróforo FAM (azul)
y una sonda para (3-actina se marca con VIC (un fluoróforo verde). Dado que cada
gen puede ser analizado utilizando sus propios fluoróforos reporteros
distinguibles, Gen A y (3-actina son amplificados y analizados simultáneamente
en cada pocilio. Se obtienen los resultados mostrados en la Tabla 9-18. Calcule
las veces de diferencia en la expresión de Gen A en células hepáticas en
comparación con la expresión de Gen A en células musculares usando el método
2~ a a c t
T a b la 9-18 Valores CT para m uestras de ADNc generadas a partir de ARN

total obtenido de células de hígado y m úsculo. Gen A y (3-actina fueron
am plificados y analizados en el m ism o pocilio. Se analizaron cinco m uestras
replicadas de cada tipo de tejido
Tejido Posición del Ct de Gen A Ct de (3-actina

pocilio
Hígado A1 28,24 26,44

B1 28,32 26,37
Cl 28,28 26,56
DI 28,36 26,52
El 28,34 26,48
Músculo F1 34,81 25,48
G1 34,65 25,45
H1 34,72 25,62
A2 34,58 25,54
B2 34,84 25,56
En el Problema 9.13, réplicas del gen diana y del gen de referencia son ampli
ficadas y analizadas en diferentes pocilios de una placa. Por este motivo, saca
mos el promedio de los valores CT de la diana y de la referencia antes de calcular
la A C t . En este problema, sin embargo, la diana y la referencia son amplificadas y
analizadas en el mismo pocilio y en replicado. Dado que cada pocilio tiene la
misma cantidad de ADNc (generado a partir de 20 ng de ARN de partida por
pocilio), calcularemos la A C T para cada pocilio separadamente. A continuación
calcularemos el promedio de estos valores CT para determinar la A A C T y
consiguientemente el valor 2_AACt. También calcularemos el error estándar
de cada AC t promedio y del valor A A C t .
Los valores A C T se calculan como la CT de Gen A menos la CT de (3-actina para
cada pocilio. Estos resultados se muestran en la Tabla 9-19. Esta tabla también
muestra la A CT promedio para cada tipo celular.
Para determinar el margen de error para cada conjunto de datos, calcularemos
primero sus desviaciones estándar. Las Tablas 9-20 y 9-21 muestran los cálculos
del componente «(x —x)2» para las determinaciones de desviación estándar
mostradas en la Tabla 9-22.
Ahora podemos calcular las desviaciones estándar para los valores promedio de
A C T. Cada conjunto de datos tiene un tamaño de muestra (n) de 5. Con los
valores de desviación estándar disponibles, se pueden calcular los márgenes de
error. Usaremos un nivel de confianza del 99% (Z = 2,58). El tamaño de la
muestra (n) para cada conjunto de datos es 10 (Tabla 9-23).
T a b la 9 -1 9 Cálculos de A C T para los datos del Problem a 9.14. La A C T

promedio (media) se calcula com o la suma de los valores A C T individuales
dividida entre cinco (el núm ero de m uestras de cada tipo de tejido)
Tejido Posición del C t de Gen A C t d e (3-actina ACt

pocilio
Hígado A1 28,24 26,44 1,80

! B1 28,32 26,37 1,95
CI 28,28 26,56 1,72
DI 28,36 26,52 1,84
¡ El 28,34 26,48 1,86
1 Prom edio = 1,83
Músculo F1 34,81 25,48 9,33
|
i
G1
H1
34,65
34,72
25,45
25,62
9,20
9,10
cc A2 34,58 25,54 9,04
I B2 34,84 25,56 9,28
Prom edio = 9,19
T a b la 9 -2 0 Com ponentes del cálculo de la desviación estándar de los

valores A C T obtenidos en células hepáticas. El valor medio para este
conjunto de datos es 1,83 (calculado en la Tabla 9-19)
A C t de m u estras de (x -x ) (x -x )2
células hep áticas (x)
1,80 -0,03 0,0009

1,95 0,12 0,0144
1,72 -0,11 0,0121
1,84 0,01 0,0001
1,86 0,03 0,0009
Total 0,0284
T a b la 9-21 Com ponentes del cálculo de la desviación estándar de los

valores A C T obtenidos en células de m úsculo. El valo r m edio para este
conjunto de datos es 9,19 (calculado en la Tabla 9-19)
A C t de m uestras de (x -x ) (x -x )2
células m u sculares (x)
9,33 0,23 0,0529

9,20 0,01 0,0001
9,10 -0,09 0,0081
9,04 -0,15 0,0225
9,28 0,09 0,0081
Total 0,0917
Tabla 9-23 Cálculos para el m argen de error de los valores A C T asociados a

los dos tipos diferentes de tejido
A C t de células hepáticas: margen de error = Z x —-=

Vn
V5
0,08
=2,58 x -í— = 0,04
2,24
A C t de células de músculo: margen de error =

y/ñ
Vs
0,15
= 2,58 x = 0,07
2,24
A continuación podemos adjuntar los valores de margen de error a los valores

promedio de A C T para el conjunto de datos de cada tipo celular:
A CT promedio para las células hepáticas = 1,83 ± 0,04.
A C T promedio para las células musculares = 9,19 ± 0,07.
El valor A A C T puede ser ahora calculado sustrayendo la A C T promedio de las
reacciones de músculo (el calibrador) del valor A C T promedio asociado a cada
tipo de tejido. Para el hígado, tenemos
1,83 - 9,19 = - 7 ,3 6
y para el músculo tenemos
9,19 - 9,19 = 0,00
No obstante, dado que nuestros valores promedio de A C T llevan asociados

valores de margen de error, debemos propagar dichos valores e incluirlos en
la respuesta. Tal como se describe en el Problema 9.12, propagamos el error para
la A C T de hígado menos la A C T de músculo de la siguiente manera
margen de error = \ J (0,04)2 + (0,07)2
- V 0,0016 + 0,0049 = V 0,0065 = 0,08
El valor A A C T para células hepáticas es, por tanto, expresado así
- 7 ,3 6 ± 0,08
El margen de error asociado a la A A C T para la A C T de músculo menos la A C T de

músculo es
margen de error = \ j (0,07)2 + M 2
- a/0,0049 + 0,0049 = V0,0098 = 0,10
El valor A A C T de las células musculares se expresa como
0,00 ± 0 ,1 0
Ahora podemos calcular las cantidades normalizadas de Gen A relativas a su

nivel de expresión en músculo usando la ecuación 2~AACt. Para la expresión de
Gen A en células hepáticas, tenemos
2 -A A C t _ 2 - ( - 7 ,3 6 ) _ 2 7,36 _ ^ 43
Dado que hemos incluido la medida de margen de error (±0,08), determinare

mos el rango de veces de cambio vinculado a dicho margen de error elevando 2
al exponente —(—7,44) (dado que —(—7,36 — 0,08) = —(—7,44)) y 2 al expo
nente —(—7,28) (dado que —(—7,36 + 0,08) = —(—7,28)). Obtenemos
2 -A A C T = 2 ( 7,44) = 2 7,44 =
2 ~AACt — 2 —( —7,28) — 2 7,28 — 1 5 5 (4
Por lo tanto, Gen A se expresa unas 164,3 veces más en células hepáticas que en
células musculares y tiene un rango que va desde 155,4 a 173,6 veces de
aumento.
Por definición, la expresión de Gen A relativa a sí misma en células musculares (el
calibrador) tendrá un número de veces de cambio igual a la unidad (2o = 1,0).
No obstante, dado que existe un margen de error asociado a este valor, también
calcularemos su rango elevando 2 al exponente —(—0,1) (dado que
-(0 ,0 0 - 0,10) = - ( - 0 ,1 ) ) y 2 al exponente -(0 ,1 ) (dado que -(0 ,0 0 + 0,10)
= -(0 ,1 )):
2 - ( - 0 ,,l = 2 0., = 11
y
2-0,1 = 0,9
Así pues, la cantidad normalizada de Gen A en músculo relativa al músculo tiene

un rango de 0,9 a 1,1 veces de cambio.
P ro b le m a 9 .1 5 En un experimento similar al descrito en el Problema 9.14 se

determina la expresión de Gen A en células hepáticas en respuesta a la infección
por hepatitis C. (3-actina sirve como control endógeno con el cual se normaliza la
expresión de Gen A. Se recogen muestras de células hepáticas en triplicado a
tiempos 0,1 y 2 h después de la infección y se prepara ADNc a partir de ellas. El
Gen A se analiza mediante PCR a tiempo real utilizando una sonda marcada con
el fluoróforo FAM (azul). Mediante una reacción multiplex para cada muestra
(las reacciones para cada gen son llevadas a cabo en el mismo pocilio), (3-actina
se analiza por PCR a tiempo real usando una sonda marcada con VIC (verde). El
tiempo cero sirve como la muestra calibradora. Se recogen los datos de la
Tabla 9-24. ¿Cuántas son las veces de cambio en la expresión de Gen A
normalizada con la expresión de (3-actina y relativa a tiempo cero para los
tiempos de 1 y 2 h de exposición al virus de hepatitis C?
El calibrador para este experimento es la expresión de Gen A normalizada con la
de (3-actina a tiempo cero. Necesitamos, por tanto, calcular el valor medio de CT
para Gen A a tiempo cero y el valor medio de CT para (3-actina a tiempo cero.
Estos valores serán restados uno del otro para obtener la A C T del calibrador, la
cual será a continuación restada de la A C T de cada muestra para obtener la
A A C T.
El valor medio de 2~AACt calculado en la última columna de la Tabla 9-25
representa la media de veces de cambio de expresión génica. A 1 h, por tanto,
el Gen A se expresa 28,8 veces más en comparación con el tiempo cero. A 2 h, la
expresión de Gen A ha aumentado 2.719,7 veces.
T a b la 9-24 Datos recogidos de un experim ento de PCR a tiem po real

destinado a m edir el efecto de la infección por hepatitis C sobre la
expresión de Gen A en células hepáticas
Muestra Posición del Tiempo CT de Gen A CT de

!
pocilio (3-actina
1 Al 0 27,8 27,4
¡ 2 B1 0 28,2 27,2
1 3 CI 0 28,3 27,0
4 DI 1h 24,1 27,9
|
i
5
6
E1
F1
1h
1h
23,8
24,0
28,0
27,8
cc 7 G1 2 h 17,5 28,2
I 8 H1 2 h 17,6 27,9
9 A2 2 h 17,9 28,4
T a b la 9-25 La A C T de la diana a t = n se calcula com o (CT d e Gen A ) — (CT d e (3-actina) para cada
pocilio y m edida de tiem po. La A A C T se calcula com o ((CT d e Gen A ) — (CT d e (3-actina)Tiempo n) —
((CT prom edio de Gen A a tiem po 0) — (CT prom edio de (3-actina a tiem po 0))
M uestra Tiem po CT de CT pro CT de CT prom edio A C t de AA C t 2 -AACT 2 - aacj

Gen A medio 3-actina de 3-actina a la diana prom edio
de Gen t=0 a t =n
at =0
1 0 27,8 28,1 27,4 27,2 0,4 -0,5 1,41 1,03

2 0 28,2 28,1 27,2 27,2 1,0 0,1 0,93
3 0 28,3 28,1 27,0 27,2 1,3 0,4 0,76
4 1h 24,1 28,1 27,9 27,2 -3 ,8 -4 ,7 26,0 28,8
5 1h 23,8 28,1 28,0 27,2 -4 ,2 -5,1 34,3
6 1h 24,0 28,1 27,8 27,2 -3 ,8 -4 ,7 26,0
7 2 h 17,5 28,1 28,2 27,2 -10,7 -11,6 3.104,2 2.719,7
8 2 h 17,6 28,1 27,9 27,2 -10,3 -11,2 2.352,5
9 2 h 17,9 28,1 28,4 27,2 -10,5 -11,4 2.702,4
Para un cálculo más completo, determinaremos las desviaciones estándar y el

coeficiente de variación.
De nuevo, la desviación estándar (s) viene determinada por la fórmula
en la que el símbolo E representa la suma, x es una muestra, x es el promedio

(media) y n es el número de medidas en el conjunto de datos. Estas desviaciones
estándar del conjunto de datos son calculadas en la Tabla 9-26.
Así, las veces de aumento de expresión génica calculadas para el tiempo cero
tienen una desviación estándar (s) de 0,31. Los valores determinados para 1 y 2 h
tienen desviaciones estándar de 4,79 y 376,15, respectivamente.
El coeficiente de variación (cv) es una medida de la dispersión de los puntos de
datos alrededor de una media y está determinado por la ecuación
^ desviación estándar s
media x
El CV es un número sin dimensión en el sentido de que no tiene en cuenta las

unidades del conjunto de datos. Puede ser útil cuando se compara el grado de
variación entre dos conjuntos de datos en situaciones en las que dichos con
juntos de datos tienen unidades diferentes. También es útil cuando los distintos
conjuntos de datos tienen medias enormemente diferentes, como es este caso.
9.7 Cuantificación relativa: el método AACT 275
T a b la 9 -2 6 Cálculos de desviaciones estándar para el conjunto de datos del Problema 9.15. El valor
2 ~ aact pr0mecj¡0 para e | tiem po cero es 1,03, para 1 h es 28,8 y para 2 h es 2.719,7 (determ inado en la
Tabla 9-25)
Tiempo 2 aact
(x -x ) (x -x )2 £ (x -x )2 £ (x -x )2 /S (x -x )2
n -1 V n -1
0 1,41 0,38 0,1444 0,2273 0,1137 0,34
0,93 -0,01 0,0100
0,76 -0,27 0,0729
1h 26,0 -2 ,8 7,84 45,93 22,97 4,79
34,3 5,5 30,25
26,0 -2 ,8 7,84
2h 3.104,2 384,5 17.840 282.975 141.488 376,15
2.352,5 -367,2 134.836
2.702,4 -17,3 299
El CV se expresa a menudo como un porcentaje. Cuanto mayor es el valor CV,

mayor es la dispersión de datos alrededor de la media. Sin embargo, si una
media es cercana a cero, el valor CV puede verse afectado de forma no propor
cional por pequeños cambios en la media, y, en estas circunstancias, se con
vierte en una medida menos valiosa de la variación del conjunto de datos.
Los valores CV para este conjunto de datos son los siguientes. Para las veces de
cambio del tiempo cero, tenemos
0,34
CV = ^ x 100 = 33%
Para el valor obtenido a 1 h valor, tenemos
4,79
CV = —— x 100 = 17%
28,8
Para el valor obtenido a 2 h, tenemos
Así, estos conjuntos de datos tienen similares dispersiones alrededor de los

valores medios calculados para cada medida de tiempo: 0 ,1 y 2 h.
9.7 E L M É T O D O R E L A T IV O D E L A C U R V A E S T Á N D A R
9.7.1 M éto d o de la cu rva e stá n d a r p ara la cu a n tific a ció n
re la tiv a
E n el m éto d o d e la c u rv a estándar, el m éto d o m ás s im p le d e cuan tific ac ió n , se
ca lcu la p rim ero la cantidad d e tran sc rito de ca d a g en y en c a d a tipo ce lu la r u sando
u n a cu rv a e stán d a r a partir d e u n determ in ad o ácido nu cle ic o q u e se e n c u en tra en
co n centraciones co n ocidas. L as co n c en tra cio n es d e las m u estra s experim entales
son a con tin u ac ió n ex p resad a s co m o fracc io n es relativas al ú n ico ca librador
(norm alm ente el tran sc rito d e u n g en diferen te en a lg ú n otro tip o tisular). L a
co n c en tra ció n d el ca lib rad o r es arb itrariam e n te estab le cid a co m o u n o — la u n i
dad— . L as co n c en tra cio n es d e los transcritos d e d ian a son ex p resad o s com o
u n a d iferen c ia re sp ecto al ca lib rad o r — la ca n tid a d d e la d ian a div id id a entre la
cantidad del calibrador— . P o r ejem plo, se g e n e ra d o s v ec es m ás ca n tid a d de
transcrito del g en H G P R T q u e d el calibrador.
E n la sección anterior, vim o s q u e la cuan tific ac ió n a b so lu ta d e u n a m uestra
d esc o n o cid a es p o sib le a través d el u s o d e u n a cu rv a e stán d a r en la cu a l la con
cen trac ió n d e u n a m u estra d e A D N cu a n tific ad a y d ilu id a d e fo rm a seria d a es
re p rese n ta d a fren te a la C T d e ca d a dilu ció n d e la m uestra. E l v a lo r C t d e u n a
m u estra d esc o n o cid a p u ed e se r en to n c es u tiliz ad o p a ra d ete rm in a r la co n c en
tración d e d ic h a m u estra p o r extra p o lació n d e la cu rv a estándar.
U n a cu rv a están d a r p u ed e tam b ién se r u tiliz a d a p ara m ed ir la ex p resió n g é n ic a
cu an d o no se co n o c e la co n c en tra ció n ex a cta d el estándar. E n ese caso, la cu a n
tificac ió n d e la dian a se m id e re la tiv a a la d e la referencia. L a re feren cia p u ed e ser
u n ca lib rad o r tal com o el g en d e m antenim iento ((3-actina, G A P D H o u n g en que
c o d ific a p a ra A R N rib o so m al) o p u e d e se r el g e n d ian a ob jeto d e estu d io en
las células n o tratadas o a tiem p o cero. L a co n c en tra ció n d e la referencia, p o r
definición, es I X y to d as las can tid a d es d e d ian a en las m uestras tratadas se
ex p resan co m o n v ec es de d iferen c ia en relación a la referencia. S e pu ed e prep arar
u n a cu rv a está n d a r a p a rtir d e u n a serie d e d ilu cio n es d e c u a lq u ie r m uestra
in d ep e n d ie n te d e A R N o A D N q u e co n te n g a el g en o genes d ian a deseados. N o
se n ec esita c o n o c e r las co n c en tra cio n es (en ng/p,L) re ales d e lo s estándar, sólo sus
d ilu cio n es relativas.
L as cu rv as e stán d a r deb e rían se r p reparadas tanto p ara la d ia n a co m o p ara la
referencia. C a d a cu rv a e stán d a r se u tiliz a p ara d ete rm in a r las ca n tid a d es, respec
tiv am en te, d el gen d ia n a y d e referencia. P ara to d as las m u estra s experim entales,
la cantidad d e d ian a (d e te rm in ad a a p artir d e la cu rv a estándar) s e div id e entre la
ca n tid a d d e la re feren cia p a ra o b ten e r u n a m e d id a re la tiv a d e n v ec es d e diferencia.
L a cantidad d e nan o g ram o s re ales de pro d u c to g enerado a p artir de ca d a g en n o es
im portante. S e trata d e u n a co m p a rac ió n relativa.
E l m éto d o rela tiv o d e la cu rv a e stán d a r para el anáfisis d e la ex presión g é n ic a
re la tiv a es m ás s im p le d e d esa rro llar q u e el m éto d o 2 _AAC t p o rq u e requiere u n
9.7 El método relativo de la curva estándar 111
m en o r g ra d o d e op tim iz ació n y validación. L o s d o s m éto d o s, no o bstante, pu ed e n

d a r lu g a r a resultados m u y sim ilares.
P ro b le m a 9 .1 6 Deseamos determ inar la expresión relativa de Gen A en

varios tejidos diferentes. Usaremos el gen de m antenim iento H SKGa como
referencia. El Gen A y el gen HSKGa. serán am plificados en tubos
separados. Las diluciones de ADNc preparadas a partir de un stock de ARN
total (obtenido de una casa comercial) son utilizadas para generar curvas
estándar individuales para Gen A y HSKGa.. Cincuenta ng de ADNc
preparados a partir del stock de ARN son diluidos de forma seriada en
increm entos de dos veces. Las alícuotas de dichas diluciones son
distribuidas en triplicado en dos placas de 96 pocilios (placas A y B) de
manera que, en cada placa, tres pocilios reciben 2 ng de ADNc, tres
pocilios contienen 1 ng de ADNc, tres pocilios contienen 0,5 ng de ADNc,
etc., hasta 0,015 ng de ADNc por pocilio en tres pocilios. Las muestras de
ARN total son aisladas de células de cerebro, músculo e hígado. Dicho
ARN es convertido a ADNc por una transcriptasa reversa y alícuotas de
1 ng de ADNc son dispensadas en tres pocilios de las placas A y B. El
Gen A se am plifica en la placa A usando cebadores específicos y una
sonda marcada con FAM en un instrumento de PCR a tiempo real. El gen
HSKGa se amplifica y analiza en la placa B. Se obtienen los resultados mostrados
en las Tablas 9-27 y 9-28. Utilizando el método relativo de la curva estándar,
¿cuáles son los niveles relativos de expresión de Gen A en los tres tipos de
tejidos: cerebro, músculo e hígado?
Primero elaboraremos curvas estándar para el conjunto de datos de las placas
A y B. Usando la ecuación de la recta de regresión de la curva, calcularemos las
cantidades relativas de Gen A y HSKGa y las compararemos.
Si el programa informático del instrumento no puede generar una curva
estándar, se puede elaborar una utilizando Microsoft Excel según la siguiente
secuencia de pasos:
1. En una hoja de cálculo de Excel, añadir en las columnas la información de
«ng», «log ng», y «Ct », tal como se muestra en la Figura 9-14.
2. Resaltar una casilla en la columna «log ng» al lado de un valor en la columna
«ng». Calcular el log (en base 10) para dicho valor de ng mediante
a) Abrir el icono de la Función Pegar.
b) Marcar «Matemáticas y Trigonometría» en la ventana de diálogo que
aparece, escoger «LOGIO» en la Función y presionar el botón Aceptar.
c) Entrar el valor de ng en el campo Número de la ventana de diálogo de
LOG10 y presionar Aceptar. Este paso introducirá el valor log en la casilla
resaltada en la columna log ng.
T a b la 9-27 Datos de ciclos umbral para la placa A tal com o se describe en

el Problema 9.16
Placa A: curva estánd ar de Gen A y exp resión de Gen A en cerebro, m úsculo e
hígado
Muestra Pocilio CT
2 ng de ADNc (estándar) Al 25,43

2 ng de ADNc (estándar) Bl 25,56
2 ng de ADNc (estándar) CI 25,58
1 ng de ADNc (estándar) DI 26,52
1 ng de ADNc (estándar) El 26,59
1 ng de ADNc (estándar) Fl 26,44
0,5 ng de ADNc (estándar) Gl 27,38
0,5 ng de ADNc (estándar) HI 27,48
0,5 ng de ADNc (estándar) A2 27,50
0,25 ng de ADNc (estándar) B2 28,43
0,25 ng de ADNc (estándar) C2 28,34
0,25 ng de ADNc (estándar) D2 28,50
0,125 ng de ADNc (estándar) E2 29,36
0,125 ng de ADNc (estándar) F2 29,38
0,125 ng de ADNc (estándar) G2 29,43
0,06 ng de ADNc (estándar) H2 30,28
0,5 ng de ADNc de cerebro A4 25,78
0,5 ng de ADNc de cerebro B4 25,69
0,5 ng de ADNc de cerebro C4 25,84
0,5 ng de ADNc de músculo D4 30,74
0,5 ng de ADNc de músculo E4 30,68
0,5 ng de ADNc de músculo F4 31,02
0,5 ng de ADNc de hígado G4 24,98
0,5 ng de ADNc de hígado H4 25,12
0,5 ng de ADNc de hígado A5 25,26
T a b la 9-28 Datos de ciclos um bral para la placa B tal com o se describe en

el Problem a 9.16
Placa B: curva estánd ar de HSKGa y expresión de HSKGa en cerebro, m úsculo e
hígado
Muestra Pocilio CT
2 ng de ADNc (estándar) Al 23,98

2 ng de ADNc (estándar) Bl 24,04
2 ng de ADNc (estándar) Cl 24,02
1 ng de ADNc (estándar) DI 25,01
1 ng de ADNc (estándar) El 25,02
1 ng de ADNc (estándar) Fl 24,96
0,5 ng de ADNc (estándar) Gl 26,01
0,5 ng de ADNc (estándar) HI 26,04
0,5 ng de ADNc de cerebro A4 27,48
! 0,5 ng de ADNc de cerebro B4 27,02
0,5 ng de ADNc de cerebro C4 27,28
0,5 ng de ADNc de músculo D4 25,38
¡
0,5 ng de ADNc de músculo E4 25,27
1
0,5 ng de ADNc de músculo F4 25,41
0,5 ng de ADNc de hígado G4 31,48
|
i
0,5 ng de ADNc de hígado H4 31,55
0,5 ng de ADNc de hígado A5 31,61
cc
i
A B 3 . Seguir los siguientes pasos para construir una curva estándar:

1 Well log ng CT
a) Resaltar todos los valores listados en las columnas «ng» y «log ng»
A1 2 0.30103 25.43
3 B1 2 0.30103 25.56 (no incluir los encabezamientos).
4 C1 2 0 30103 25.58 b) Abrir el C re a d o r d e g rá fico s y seleccionar «XY (Dispersión)» en la
5 D1 1 0 26.52
E1 1 0 26 59
lista T ip o s d e g ráfico s.
6
/ F1 1 0 26.44 c) Presionar el botón S ig u ie n te a través de los campos para dar
8 G1 0.5 -0.30103 27.30 forma al gráfico según sus gustos. Cuando haya finalizado, pre
y H1 0.5 -0.30103 27.48
10 A2 0.5 -0.30103 27.5 sionar el botón A ca b a r. El gráfico de la curva estándar aparecerá
11 B2 0.25 -0.60206 28.43 en la hoja de cálculo.
12 C2 0.25 -0.60206 28.34
d) Presionar sobre el gráfico para asegurarse de que está seleccio
13 D2 0.25 -0.60206 28.5
14 E2 0.125 -0.90309 29.36 nado (se resaltará su contorno).
1b F2 0.125 -0.90309 29.38 e) En el menú desplegable de G ráfico en la barra de herramientas,
1b G2 0.125 -0.90309 29.43
17 H2 0.06 -1.22165 30.28 seleccionar «Añadir línea de tendencia». En la ventana de diálogo
1b A3 0.06 -1.22185 30.29 que aparece, seleccionar «Lineal» para el T ip o d e te n d e n cia /
19 B3 0.06 -1.22185 30.39
re g re sió n . En la ventana de O p cio n e s de la sección A ñ a d ir
C3 003 -1.52208 31.3
21 D3 003 -1.52200 31.32 lín e a d e te n d e n c ia , asegurarse de que están activadas las casillas
22 E3 003 -1.52208 31.27 «Mostrar la ecuación en el gráfico» y «Mostrar el valor R-cuadrado
23 F3 0016 -1.79500 32.21
24 G3 0 016 -1 79508 32.31
en el gráfico». Presionar el botón A ce p ta r. Esto añadirá la
2b H3 0.016 -1.79500 32.39 ecuación de la recta de regresión en el gráfico (Figura 9-15).
■ FIGURA 9-14 Datos de la curva estándar de Se repite este proceso para la placa B tal como se muestra en la
Gen A obtenidos a partir de la placa A, tal como Figura 9-16.
aparecen en una hoja de cálculo de Microsoft
Excel.
■ FIGURA 9-15 Recta de regresión y su ecuación para la curva estándar representada usando el conjunto de datos del Problema 9.16 y Microsoft Excel.
.. A ....... R c n I
1 W ell ng CT
2 A1 2 0.30103 23.98
3 B1 2 0.30103 24.04
4 CÍ 2 0.30103 24.02
5 D1 I 1 o 25.01
6 E1 1 0 25.02
7 F1 1 0 24.96
8 G1 05 -0.30103 26.01
9 H1 0.5 -0.30103 26.04
10 A2 0.5 -0.30103 25.92
11 B2 0.25 -0.60206 27.01
12 C2 0.25 -0.60206 27.05
13 D2 0.25 -0.60206 26.89
14 E2 0.125 -0.90309 28.02
15 F2 0.125 -0.90309 28.04
16 G2 0.125 -0.90309 27.92
17 H2 0.06 -1.22185 29.03
18 A3 0.06 -1.22185 29.05
19 B3 0.06 -1.22185 29.01
20 C3 0.03 -1.52288 30.03
21 D3 0.03 -1.52288 29.9
22 E3 0.03 -1.52288 30.02
23 F3 0.016 -1.79588 31.04
24 G3 0.016 -1.79588 31.07
25_ H3 0 016 -1.79588 31.09
■ FIGURA 9 -1 6 Valores de CT y curva estándar de HSKGa a partir del conjunto de datos de la placa B.
Ahora usamos las ecuaciones de las rectas de regresión de las curvas estándar
para calcular las cantidades iniciales de las muestras desconocidas. Las ecua
ciones siguen el formato general de una recta y = m x + b, donde y es el valor CT,
m es igual a la pendiente de la recta, x es el log de la cantidad inicial de ARN en
nanogramos, y b es el punto de corte del eje y cuando x es igual a 0. Se puede
despejar la x de la siguiente manera:
y = mx + b
„ - y - b
Conociendo el valor C t (y) podemos usar la ecuación de la recta de regresión

para calcular la cantidad de ARN de partida. Por ejemplo, la cantidad de ARN
inicial de Gen A correspondiente a la muestra en el pocilio A4 de la placa A (véase
la Tabla 9-26) es
Este valor, sin embargo, es el log de la cantidad de ng. Para convertirlo en ng,
debemos calcular su antilog. En una calculadora, dicho valor se obtiene usando
la función 10 x. En Microsoft Excel, el antilog se obtiene usando la F u n ció n P e g a r
y seleccionando «Matemáticas y Trigonometría» de la C a te g o ría d e la fu n c ió n y
«EXPONENTE» del N o m b re d e fu n c ió n . Tras presionar A ce p ta r, introducir «10»
en el campo del N ú m ero y el valor x en el campo Ex p o n e n te le dará el valor
antilog de x.
Antilog 0,223 = 1,67
Así, un valor CT de 25,78 corresponde a una cantidad inicial de ARN de 1,67 ng.
Este protocolo se utiliza para determinar la cantidad de ARN inicial para todas las
muestras desconocidas. Sin embargo, para las muestras donde se determina
HSKGa. el cálculo se realiza usando la ecuación de regresión de la curva estándar
generada a partir del conjunto de datos de la placa B. Estos cálculos rinden los
resultados mostrados en la Tabla 9-29.
T a b la 9 -2 9 Cálculos de resultados de las cantidades equivalentes de ARN

total determ inadas m ediante ecuaciones de regresión lineal a partir de las
curvas estándar de los genes Gen A y HSKGa.
Gen/tejido CT Log ng del ARN ng del ARN total

total
Gen A/cerebro 25,78 0,223 1,67

25,69 0,251 1,78
25,84 0,204 1,60
Gen A/músculo 30,74 -1,331 0,047
30,68 -1,313 0,049
31,02 -1,419 0,038
Gen A/hígado 24,98 0,474 2,98
25,12 0,430 2,69
25,26 0,386 2,43
HSKGot/cerebro 27,48 -0,748 0,179
27,02 -0,609 0,246
27,28 -0,712 0,194
HSKGot/músculo 25,38 -0,117 0,764
25,27 -0,108 0,780
25,41 -0,126 0,748
HSKGcx/hígado 31,48 -1,949 0,011
31,55 -1,970 0,011
31,61 -1,988 0,010
Ahora calcularemos la desviación estándar para cada cantidad en ng de cada

gen y tipo de tejido. La desviación estándar (s) viene definida por la ecuación
Al calcular la desviación estándar (véase la Tabla 9-30) deberíamos sacar el

promedio de las cantidades de G e n A y H SKG a. separadamente ya que, aunque
estemos midiendo los dos genes en los mismos tejidos, los hemos amplificado y
analizado en tubos separados.
Tabla 9-30 Cálculos de valores de desviación estándar de las cantidades de ARN total determ inadas a
partir de la curva estándar, tal com o se describe en el Problem a 9.16
Gen/tejido ng ARN total (x -x )2 £ (x -x )2 £ (x -x )2 / £ ( * - Jf)2

n -1 V n -1
G en A /c e re b ro 1,67 0,0001 0,0165 0,0083 0,091
1,78 0,0100
1,60 0,0064
Promedio 1,68
G en A /m ú s c u lo 0,047 0,000004 0,00007 0,00004 0,006
0,049 0,000016
0,038 0,000049
Promedio 0,045
G en A /h íg a d o 2,98 0,0784 0,1514 0,0757 0,275
2,69 0,0001
2,43 0,0729
Promedio 2,70
H S K G a/ce reb ro 0,179 0,00073 0,00247 0,00124 0,035
0,246 0,00160
0,194 0,00014
Promedio 0,206
H S K G a /m ú scu lo 0,764 0,00000 0,00052 0,0003 0,016
0,780 0,00026
0,748 0,00026
Promedio 0,764
H S K G a /h íg a d o 0,011 0,00000 0,00000 0,00000 0,000
0,011 0,00000
0010 0,00000
Promedio 0,011
Tabla 9-31 C antidades de ARN inicial de G e n A y H S K G a . con sus

desviaciones estándar en los diferentes tipos de tejidos descritos en el
Problema 9.16
Gen/tejido ng de ARN inicial
G en A /c e re b ro 1,68 ± 0,091
G en A /m ú s c u lo 0,045 ± 0,006
G en A /h íg a d o 2,70 ± 0,275
H SKG ot/cerebro 0,206 ± 0,035
H S K G a /m ú scu lo 0,764 ± 0,016
H S K G a /h íg a d o 0,011 ± 0,00
Estos valores de desviación estándar (Tabla 9-30) serán adjuntados como un «±»
número a cada promedio de la cantidad de ARN de partida calculada a partir de
los valores Ct (Tabla 9-31).
El promedio de la cantidad de G e n A se divide ahora entre el promedio de la
cantidad de H S K G a para obtener la cantidad de G e n A normalizada en cada tipo
de tejido. Dado que existen valores de desviación estándar asociados a cada
cantidad de ng de ARN inicial, necesitaremos propagar dicha desviación
estándar en nuestro cociente. Lo podemos hacer gracias al coeficiente de
variación (cv) — un valor sin unidades que representa una medida de la
variación (dispersión) de los puntos de datos en relación a la media— . El cv
es
un número útil cuando se está interesado en la magnitud de la dispersión en
relación al tamaño de la observación. Cuanto más elevado es el cv, mayor es la
dispersión. Sin embargo, el cves menos útil para un análisis estadístico cuando la
media se acerca a cero y el cv se convierte en más sensible a cambios pequeños
en la media. Viene determinado por la expresión
desviación estándar s
media x
El cvde un cociente (tal como se determinará en este problema) se calcula como
CV= \jcv*+cv\
Por ejemplo, G e n A en el cerebro es equivalente, en ng de ARN de partida, a
1,68 ± 0,091 y HSKG a. es equivalente a 0,206 ± 0,035 (véase la Tabla 9-31). Al
dividir 1,68 ± 0,091 entre 0,206 ± 0,035 para obtener la cantidad de G e n A
normalizada en cerebro, calcularíamos el cv
del cociente así
/ / 0 ,0 9 1 \ / 0 ,0 3 5 \ 2 ,---------------- -------
cv — \ \ —---- + —---- = V0,003 + 0,029 = V0,032 = 0,179
Y V
1,68 J \0 ,2 0 6 J
Tabla 9-32 Valores c v de Gen A norm alizados con HSKGa. en los tres tipos
diferentes de tejidos descritos en el Problem a 9.16. Los cálculos han sido
realizados com o está descrito en el texto
Gen A no rm alizado con HSKGa cv para cada tipo celular
Cerebro 0,179
Músculo 0,135
Hígado 0,102
Tabla 9-33 Valores de Gen A norm alizados con las cantidades de H S KG u en

los tres tipos celulares diferentes. La cantidad de Gen A se divide entre la
cantidad de H SKG a. Los errores han sido propagados com o se describe en
el texto
T ejido Gen A HSKGa Gen A norm ali

zado con HSKGa
Cerebro 1,68 ± 0,091 0,206 ± 0,035 8,16 ± 1,46

Músculo 0,045 ± 0,006 0,764 ± 0,016 0,06 ± 0,008
Hígado 2,70 ± 0,275 0,01 ± 10,00 245,45 ± 25
En la Tabla 9-32 se muestra un valor cv calculado de esta manera para cada

tejido.
Dado que el cv equivale a la desviación estándar dividida entre la media,
podemos despejar y resolver la s, la desviación estándar, de la siguiente manera
s
cv = -
x
s = (cv) (x)
La desviación estándar para el cociente de este ejemplo es
S = 0,179 x 8,16 = 1,46
donde el valor 8,16 en este cálculo corresponde a 1,68 (el promedio de ng de

ARN total de Gen A en cerebro; véase la Tabla 9-30) dividido entre 0,206 (el
promedio de ng de ARN total de HSKGa en cerebro; véase la Tabla 9-30). Así,
el cociente (8,16) tiene una desviación estándar de ±1,46. En la Tabla 9-33,
donde se muestran los valores normalizados de Gen A, las desviaciones
estándar de los cocientes han sido calculadas de esta manera.
La cantidad normalizada de Gen A no tiene unidades (las cantidades de ng se

anulan durante el paso de división que genera el valor normalizado). Cuando
comparamos los valores entre tipos celulares estamos analizándolos en el con
texto de n veces de diferencia. Para dar a los valores un poco más de significado,
podemos designar una de las muestras como calibrador — la muestra con la que
se compara el resto de muestras— . La mayor parte de veces, la decisión de qué
tipo celular debería ser el calibrador es arbitraria, dado que estamos exami
nando diferencias relativas entre los diferentes tipos celulares. Sin embargo,
aquí, dado que las células de músculo muestran el nivel de expresión más bajo
de Gen A, escogeremos dichas células como calibrador. Para obtener las n veces
de diferencia, dividiremos cada valor de Gen A entre el valor de Gen A en
músculo.
Dado que la designación del calibrador es arbitraria, los errores estándar no
deberían ser diferentes a los de los valores normalizados en cada tipo celular.
Simplemente multiplicamos cada uno por el nuevo valor normalizado. Por
ejemplo, la desviación estándar de la muestra de cerebro tiene una
desviación estándar de
136 x 0,179 = 24,34
Los valores normalizados para los cocientes mostrados en la Tabla 9-34 se

calculan de esta manera.
Así, estos resultados indican que las células de cerebro expresan aproximada
mente 136 veces más ARNm de Gen A que las células de músculo. Del mismo
modo, las células hepáticas tienen unas 4.091 veces más ARNm de Gen A que las
células de músculo.
Tabla 9-34 Cálculos de las cantidades de Gen A en cada tejido

norm alizadas con las cantidades de Gen A en células de m úsculo com o se
describe en el Problem a 9.16. Este proceso incluye un cálculo en el cual el
Gen A en el m úsculo es norm alizado consigo m ism o
Tejido G en A n o rm aliza d o rela tiv o al m úsculo
Cerebro
— = 136 ±24,34
0,06
Músculo 0,06
= 1,00 ±0,135
0,06
Hígado 245,45
-----— = 4.091 ±417
0,06
T a b la 9 -3 5 Resultados obtenidos en el experim ento descrito en el Problem a 9.17
M uestra Pocilio CT de Gen A (FAM) CT de HSKGa (VIC)
2 ng de ADNc (estándar) Al 24,38 23,57

2 ng de ADNc (estándar) Bl 24,65 23,44
2 ng de ADNc (estándar) Cl 24,67 23,68
1 ng de ADNc (estándar) DI 25,60 24,40
1 ng de ADNc (estándar) El 25,55 24,60
1 ng de ADNc (estándar) Fl 25,48 24,78
0,5 ng de ADNc (estándar) Gl 26,43 25,74
0,5 ng de ADNc (estándar) HI 26,52 25,64
0,5 ng de ADNc (estándar) A2 26,61 25,56
0,25 ng de ADNc (estándar) B2 27,54 26,49
0,25 ng de ADNc (estándar) C2 27,39 26,81
0,25 ng de ADNc (estándar) D2 27,62 26,68
0,125 ng de ADNc (estándar) E2 28,69 27,72
0,125 ng de ADNc (estándar) F2 28,43 27,68
0,125 ng de ADNc (estándar) G2 28,53 27,76
0,06 ng de ADNc (estándar) H2 29,62 28,71
0,06 ng de ADNc (estándar) A3 29,42 28,62
0,06 ng de ADNc (estándar) B3 29,42 28,83
0,03 ng de ADNc (estándar) C3 30,55 29,72
0,03 ng de ADNc (estándar) D3 30,42 29,78
0,03 ng de ADNc (estándar) E3 30,51 29,85
0,016 ng de ADNc (estándar) F3 31,52 30,84
0,016 ng de ADNc (estándar) G3 31,37 30,71
0,016 ng de ADNc (estándar) H3 31,65 30,98
0,5 ng de ADNc de pulmón A4 25,12 28,57
0,5 ng de ADNc de pulmón B4 24,89 28,69
0,5 ng de ADNc de pulmón C4 24,96 28,52
0,5 ng de ADNc de corazón D4 28,33 30,67
0,5 ng de ADNc de corazón E4 28,42 30,63
0,5 ng de ADNc de corazón F4 28,36 30,59
0,5 ng de ADNc de tejido adiposo G4 30,67 24,03
0,5 ng de ADNc de tejido adiposo H4 30,56 24,11
0,5 ng de ADNc de tejido adiposo A5 30,61 24,07
P ro b le m a 9 .1 7 Queremos medir la expresión relativa de Gen A en pulmón,

corazón y tejido adiposo. Usamos una sonda marcada con FAM (azul) para
analizar el Gen A mediante PCR a tiempo real. En los mismos pocilios de una
placa de 96 pocilios, analizamos el gen de mantenimiento HSKGa utilizando una

sonda marcada con VIC (verde). Preparamos una curva estándar tal como se
describe en el Problema 9.16; sin embargo, hacemos el ensayo para el Gen A y
HSKGa. simultáneamente en cada pocilio de la estándar diluida. ARN preparado
a partir de pulmón, corazón y tejido adiposo es convertido a ADNc por
transcripción reversa. Diez nanogramos de la muestra de ARN (convertida a
ADNc) es colocada en tres pocilios por tipo de tejido y analizada para ambos Gen
A y HSKGa. Se obtienen los resultados mostrados en la Tabla 9-35. ¿Cuál es la
expresión relativa de Gen A normalizada por el tejido adiposo?
Primero construiremos curvas estándar para Gen A basadas en la señal de FAM
(azul) y para HSKGa basadas en la señal de VIC (verde). Estas curvas estándar y las
ecuaciones de sus rectas de regresión (Figuras 9-17 y 9-18) son generadas con
Microsoft Excel tal como se describe en el Apéndice A y en el Problema 9.16.
Ahora usamos las ecuaciones de regresión lineal de las curvas estándar para
resolver los ng de ARN total equivalentes a las cantidades necesarias para
generar los valores CT obtenidos para Gen A y HSKGa en las muestras de los
diferentes tejidos. A partir de la curva estándar de Gen A (Figura 9-17), tenemos
la ecuación
y = -3 ,2 8 8 9 x + 25,542
en la que y es el valor CT y x es el log del total de nanogramos de ARN. Podemos

sustituir y por CT y despejar la x:
_ CT - 25,542
X ~ -3,2889
Colocando los valores CT obtenidos para Gen A en cada tejido y resolviendo la x

obtenemos el log del total de nanogramos de ARN. Para obtener valores de
nanogramos, calculamos el antilog de x tal como se describe en el Problema
9.16. Estos cálculos generan los resultados mostrados en la Tabla 9-35.
A partir de la curva estándar de HSKGa (Figura 9-18), tenemos la ecuación
y = —3,4378x + 24,593
La sustitución de y por CT y el despeje de x da lugar a
_ CT - 24,593
_ -3,4378
Esta ecuación es, a continuación, utilizada para calcular el log de las cantidades de
ng de ARN total equivalentes a las cantidades que generan el valor CT de HSKGa
■ FIGURA 9-17 Curva estándar para Gen A generada con M icrosoft Excel y el conjunto de datos del Problema 9.17.
A B c D
1 Well ng CT
A1 2 0.30103 23.57
3 B1 2 0.30103 23.44
4 C1 2 0.30103 23.68
5 D1 1 0 24.4
6 E1 1 0 24.6
7 F1 1 0 24.78
8 G1 0.5 -0 30103 2574
9 H1 0.5 -0.30103 25.64
10 A2 0.5 -0 30103 25 56
11 B2 0.25 -0.60206 26.49
! 12 C2 0.25 -0.60206 26.81
13 D2 0.25 -0.60206 26.68
14 E2 0.125 -0.90309 27.72
1b F2 0.125 -0.90309 27.68
¡ 1R G2 0.125 -0 90309 27.76
1 17 H2 0.06 -1.221B5 28.71
18 A3 006 -1 22185 28.62
19 B3 0.06 -1.22185 28.83
|
i
2U
21
22
C3
D3
E3
003
0.03
0.03
-1 52288
-1.52288
1.52288
29 72
29.78
29.85
73 F3 0.016 -1.79588 30.84
cc
24 G3 0.016 -1.79588 30.71
I 25 H3 0.016 -1.79588 30.98
■ FIGURA 9-18 Curva estándar para HSKGa generada con M icrosoft Excel y el conjunto de datos del Problema 9.17.
observado en las muestras de tejidos. El antilog de estos valores nos da las

cantidades de ng mostradas en la Tabla 9-36.
A continuación, normalizamos la cantidad de Gen A dividiendo su cantidad entre
la cantidad de HSKGa. (calculadas en las Tablas 9-36 y 9-37). Dado que ambos
Gen A y HSKGa son amplificados en el mismo pocilio, normalizamos los datos
dentro de pocilios, en vez de entre pocilios.
ng de Gen A
Gen A normalizado = ---- -¡—,
ng de HSKGa
Dado que las unidades de ng se anulan mutuamente, el Gen A normalizado no
tiene unidades. Los valores normalizados de Gen A s e muestran en la Tabla 9-38.
T a b la 9 -3 6 Nanogramos de ARN total de Gen A calculados com o se

describe en el texto del Problema 9.17
Tejido Pocilio CT de Gen A Log ng ng de ARN

total
Pulmón A4 25,12 0,128 1,344

B4 24,89 0,198 1,579
C4 24,96 0,177 1,503
Corazón D4 28,33 -0,848 0,142
E4 28,42 -0,875 0,133
F4 28,36 -0,857 0,139
Tejido adiposo G4 30,67 -1,559 0,028
H4 30,56 -1,526 0,030
A5 30,61 -1,541 0,029
T a b la 9 -3 7 Nanogramos de ARN total de H SKG a calculados con la

ecuación de la recta de regresión de la curva estándar. El antilog de x en
dicha ecuación es igual a la cantidad de ARN total. Los datos corresponden
al Problema 9.17
Tejido Pocilio C t de Gen A Log ng ng de ARN

total
Pulmón A4 28,57 -1,157 0,070

B4 28,69 -1,192 0,064
C4 28,52 -1,142 0,072
Corazón D4 30,67 -1,768 0,017
E4 30,63 -1,756 0,018
F4 30,59 -1,744 0,018
Tejido adiposo G4 24,03 0,164 1,458
H4 24,11 0,141 1,382
A5 24,07 0,152 1,419
T a b la 9-38 Gen A norm alizado con HSKGa.. Los valores norm alizados son
obtenidos dividiendo la cantidad de Gen A entre la cantidad de H SKG a para
cada tipo de tejido. Dado que las unidades de ng se anulan en este paso de
división, Gen A norm alizado es un v alo r sin unidades. Estos datos
corresponden al Problema 9.17
Tejido Pocilio ng de Gen A ng de HSKGa Gen A nor

malizado con
HSKGa
Pulmón A4 1,344 0,070 19,20

B4 1,579 0,064 24,67
C4 1,503 0,072 20,88
Corazón D4 0,142 0,017 8,35
E4 0,133 0,018 7,39
F4 0,139 0,018 7,72
Tejido adiposo G4 0,028 1,458 0,019
H4 0,030 1,382 0,022
A5 0,029 1,419 0,020
Ahora determinaremos el promedio del valor de Gen A normalizado para cada

tejido y asignaremos una desviación estándar (como «±» número) a cada uno de
esos valores. La desviación estándar nos viene determinada por la ecuación
V n —1
en la que n es el número de muestras usadas para obtener los datos de cada tipo
de tejido. Los promedios y desviaciones estándar para Gen A en los diferentes
tejidos se muestran en la Tabla 9-39.
Ahora disponemos de los valores promedio normalizados de Gen A con sus
desviaciones estándar para cada tejido:
Pulmón: 21,58 ± 2,80.

Corazón: 7,82 ± 0,48.
Tejido adiposo: 0,02 ± 0,00.
A continuación calcularemos los valores normalizados de Gen A relativos a un

calibrador. En este caso, designaremos la expresión de Gen A en tejido adi
poso como el calibrador con el cual se comparará la expresión de Gen A en
los otros tejidos (pulmón y corazón). Para obtener un valor relativo dividire
mos cada número entre el valor asociado al tejido adiposo. También adjun
taremos una desviación estándar a cada valor de expresión génica relativa. Tal
CAPÍTULO 9 La reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real (RT-PCR)
T a b la 9 -3 9 Valores m edios norm alizados de Gen A y cálculo de sus desviaciones estándar. Los datos
corresponden al Problema 9.17
Tejido Gen A (x -x ) (x -x )2 £ (x -x )2 £ (x -x )2 / S (* - 5 f)2

norm alizado n -1 V n -1
Pulmón 19,20 -2,38 5,66 15,70 7,85 2,80
24,67 3,09 9,55
20,ES -0,70 0,49
Promedio 21,58
Corazón 8,35 0,53 0,28 0,47 0,24 0,48
7,39 -0,43 0,18
7,72 -0,10 0,01
Promedio 7,82
Tejido adiposo 0,02 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
0,02 0,00 0,00
0,02 0,00 0,00
Promedio 0,02
como en el Problema 9.16, usaremos la siguiente relación de cv y desviación

estándar:
s
cv = -
X
Dado que la designación de qué muestra sirve como calibrador es una decisión
arbitraria y su valor, por tanto, es una constante arbitraria, usaremos la
desviación estándar de cada valor normalizado para cada tejido. El valor cv
que calculamos es a continuación multiplicado por cada valor relativo (por
ejemplo, Gen A normalizado en pulmón dividido entre Gen A normalizado en
tejido adiposo) para obtener su desviación estándar. En otras palabras, ya hemos
calculado las desviaciones estándar (arriba) pero dichos números son válidos
para sus medias específicas. Necesitamos conocer la desviación estándar para el
nuevo valor medio — el nivel de expresión relativa obtenido tras comparar cada
nivel de Gen A con el calibrador— .
Dado que cv es igual a la desviación estándar dividida entre la media, también es
verdad que, reorganizando la ecuación,
s = cv x x
La expresión relativa de Gen A en pulmón relativa a su expresión en tejido

adiposo es
21,58
Gen >Apu|m5 n relativo a Gen Atej¡do adiposo = = 1 079
Calculamos el cv normalizado de Gen A
2,80
La cantidad relativa de Gen A tiene una desviación estándar de
x x cv = s
1.079 x 0,13 = 140
Por tanto, el ARN de Gen A es 1.079 ± 140 veces más abundante en células de
pulmón que en células de tejido adiposo.
Del mismo modo, la cantidad de ARN de Gen A en células de corazón relativa a su
abundancia en tejido adiposo se calcula como
7,82
—— = 391
0,02
La desviación estándar de este valor se calcula a partir del cv
0,48
=
y la desviación estándar es, por tanto,
391 x 0,06 = 24
Según este experimento, el ARN de Gen A es 391 ± 24 veces más abundante en

células de corazón que en células de tejido adiposo.
Dado que Gen A en tejido adiposo es el calibrador, su cantidad relativa es uno
(unidad).
0,02
- í— - 1,0
0,02
Su desviación estándar es
La expresión de Gen A en tejido adiposo relativa a su expresión en tejido adiposo

es 1,0 ± 0,00.
294 CAPITULO 9 La reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real (RT-PCR)
9.8 C U A N T IF IC A C IÓ N R E L A T IV A S E G Ú N C IN É T IC A
D E L A R E A C C IÓ N
L a cua n tific ac ió n re la tiv a m ediante el m éto d o d e la cu rv a e stán d a r re q u ie re que
u n a serie d e po cilio s co n te n g an u n a b ate ría d e d ilu cio n es d e u n ác id o nucleico
cuantificado y pre p ara d o indep e n d ie n tem en te d el q u e se o b tien e d u ra n te el estudio
d e ex presión génica. A u n q u e no es n ec esariam en te difícil d e preparar, la cu rv a
e stán d a r o cu p a u n a b u e n a parte d e los po cilio s d e la plac a, im p lic a p aso s ad ic io
n ale s d e disp en sac ió n c o n p ip etas q u e p u ed e n in tro d u cir errores en el experi
m ento, y re q u ie re que se d e d iq u e m ás tiem po al desarrollo d el experim ento.
E l m éto d o A A C t re q u ie re m ás trabajo d e valid ac ió n p o r p arte del in v estig ad o r
p ara co n v e n ce rse d e q u e la apro x im a ció n no g en e ra re su lta d o s am biguos.
R equiere, p o r eje m p lo , q u e el g en d e re feren cia te n g a u n a efic ien cia de
am p lifica ció n igual a la d el g en d ian a y q u e am b a s eficien cias sea n ce rca n as al
100% . Si n o es así, el in v estig ad o r nec esita invertir esfuerzos en o p tim iz ar u n a o
am b a s reacciones. A d e m á s, se d eb e co m p ro b a r el efecto del trata m ie n to experi
m en tal so b re el g en d e re feren cia u tiliz ad o p ara la norm alización.
E n u n m éto d o desc rito p o r L iu y S aint (2002), se u tiliz a la cu rv a d e la cinética
d e am p lifica ció n p ara d ete rm in a r la efic ien cia d e am plificación, y d icho nú m ero
sirv e p a ra ca lcu lar la cantidad in icial d e transcrito p resen te en la reacción. D icho
v a lo r pu ed e se r no rm alizad o p o r el d e u n g en d e re feren cia y lo s n iv eles relativos
d e A R N (e x p resió n g én ica) p u ed e n se r ex trapolados. E n esta apro x im a ció n n o se
n ec esitan u n a cu rv a e stán d a r ni lo s ex p e rim en to s d e v alidación q u e pu ed e n
desa le n tar el u s o d el m étodo A A C t -
H e m o s visto q u e la am p lifica ció n ex p o n e n cial p o r P C R se d escrib e co n la
ecuación
X n = X o x (1 + E ) n
en la q u e X„ es el nú m ero d e m oléculas d e d ia n a en el cic lo n, X 0 es el núm ero

in icial d e m o lécu la s d e m olde, E es la efic ien cia d e am plificación d e la diana, y n
es e l n ú m ero d e ciclos.
L a b a s e d el en sayo d e P C R a tiem po re al es la asu n c ió n d e q u e X n es p ro p o r
cio n a l a la ca n tid a d d e flu o re scen c ia reportera, R. L a ecu ac ió n de la am plificación
e x p o n e n cial p u ed e se r re escrita así
Rn = R 0 x (1 + E ) h
d o n d e Rn es la cantidad de flu o re scen c ia re p o rtera en e l cic lo n, R 0 es la cantidad de

flu o re scen c ia re p o rtera inicial, E es la am plificación d e la diana, y n es el nú m ero
9.8 Cuantificación relativa según cinética de la reacción 295
d e ciclos. L a efic ien cia d e am p lificació n , E, es igual a u n o c u a n d o el pro d u c to se

d o b la en c a d a ciclo. Si no se g e n e ra p ro d u c to e n n in g ú n ciclo, la efic ien cia de
am plificación sería igual a cero.
Tal co m o h em o s visto an teriorm ente, au n q u e p o d am o s c a lcu lar u n a eficiencia
d e am plificación g lo b al p a ra las reacciones q u e g en e ran u n a cu rv a están d a r
b asá n d o n o s en la p en d ie n te d e la re cta d e re g resió n p a ra d ich a cu rv a (usa n d o la
ecu ac ió n E = io*-1/pend,ente* — 1), la efic ien cia d e am p lifica ció n n o es co n stan te a
lo largo d e to d o s lo s cic lo s d e la P C R . E n los estadios m ás tard ío s d e la reacción,
lo s co m p o n e n te s se v u elv e n lim itan tes y el crecim iento exp o n e n cial n o p u ed e ser
so sten id o du ra n te m ás tiem po. L a ta sa de síntesis d e p ro d u c to s nu ev o s, d e tam añ o
co m pleto, se en lentece y en alg ú n m o m en to se para. P o r lo tanto, las ecuaciones
m o strad a s an terio rm en te p ara X„ y R„ sólo p u ed e n ap lica rse a aq u ello s cic lo s que
ca en dentro d e la fa se ex p o n e n cial d e am plificación.
P o d em o s d e sp e ja r ii, la efic ien cia d e am p lificació n , m ed ian te la reorganización
d e la ecu ac ió n p ero d eberíam os c e n tram o s en la fase lo g arítm ica d e la reacción.
A rb itra riam en te asig n arem o s d os p u n to s, A y B, a la sec ció n ex p o n e n cial d e la
cu rv a d e am plificación. E, en to n c es, se ca lcu la com o
E c. 9.1
W J
d o n d e R„ a y Rn,B re p rese n ta n R„ (flu o resce n cia re p o rtera en el cic lo n) a um brales

arbitrarios A y B en la parte e x p o n e n cial d e la c u rv a d e am p lificació n , re sp ecti
vam e n te , y C T A y C TB son lo s ciclos a d ich o s u m b rale s arbitrarios.
P a ra la am p lifica ció n d e cu a lq u ie r gen , p o d em o s esc rib ir la ca n tid a d d e señal
re p o rtera a c u a lq u ie r ciclo n d e la sig u ien te m an era
Rn = R 0 x (1 + E ) n
P o d em o s u sa r esta ecu ac ió n p a ra n o rm aliza r la am plificación d e u n g en d ian a

co n u n g en d e re feren cia en u n ex p erim en to d e cua n tific ac ió n re la tiv a u san d o la
ecuación
•^0,Diana R n ,Diana X ( 1 + -^Referencia) n

------------ — ---------------- T\----------- \ñ
R o ,Referencia R n ,Referencia X ( 1 + ^ D ia n a )
D e l m ism o m o d o , dad o q u e la ca n tid a d d e señal re p o rtera a c u a lq u ie r ciclo

p u ed e se r d ete rm in a d a así
R„ = ü o x (1 + E f T
la norm aliza ció n d e u n g en co n otro, u n o d ian a c o n u n o d e referencia, p u e d e ser

e x p resad a así
■^0,Diana __ ( 1 “t" •^Referencia) ^>êêrenc'a ^ ^
^ 0 , Referencia ( 1 + -^Diana ) *'^ ,^ 'ana
E n el sig u ien te problem a, utiliz are m o s la E cu a ció n 1 y la E cu a ció n 3 p ara

c a lcu lar el nivel d e ex p resió n re la tiv a d e d os gen e s en células hepáticas.
P ro b le m a 9 .1 8 Deseamos conocer a qué nivel Gen A (la diana) se expresa en

relación al gen de mantenimiento HSKGa. (designado como referencia) en
células hepáticas. Se obtiene ARN total de una muestra celular, se somete a
transcripción reversa para generar ADNc y se dispensan alícuotas en seis pocilios
diferentes de una placa de 96 pozos. Cebadores y sondas específicos para Gen A
y HSKGa se añaden a los seis pocilios (y, por supuesto, a los controles usuales
[pocilios destinados a las muestras CSM y control positivo]). El Gen A se amplifica
usando una sonda marcada con un fluoróforo azul y HSKGa con una sonda
marcada con un fluoróforo verde. La placa se somete a PCR a tiempo real y se
obtienen los resultados mostrados en la Tabla 9-40. Usando el método de la
cinética de reacción para cuantificar la expresión génica, calcule el nivel de
expresión relativa de Gen A normalizado al de HSKGa.
Primero necesitamos calcular la eficiencia (E) de amplificación para las dos
reacciones. En este experimento, los seis pocilios generan curvas superpuestas
en el gráfico Rn frente al número de ciclo. Analizaremos la curva sólo en uno de
los pocilios (Figura 9-19) y a partir de ese gráfico obtendremos los valores
necesarios para calcular la eficiencia de amplificación para las reacciones de
Gen A y HSKGa utilizando la Ecuación 1.
T a b la 9-40 Datos de reacción en cadena de la polim erasa (PCR) a tiem po

real correspondientes al experim ento descrito en el Problema 9.18
Posición del pocilio CT de Gen A (azul) CTde HSKGa (verde)

Al 23,46 24,81
B1 23,39 24,79
Cl 23,42 24,72
DI 23,35 24,86
E1 23,38 24,81
F1 23,36 24,71
9.8 Cuantificación relativa según cinética de la reacción 297
i 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
■ FIGURA 9-19 Gráfico de amplificación

del pocilio C1 correspondiente al experimento
Nota: Los valores necesarios para calcular la eficiencia de amplificación con la descrito en el Problema 9.18. El gráfico
Ecuación 1 no están disponibles en el programa informático de la mayoría de muestra Rn (reportero normalizado) frente al
instrumentos de PCR a tiempo real. Por tanto, estos valores se obtienen del número de ciclo, con las curvas de Gen A y
gráfico de Rn frente al número de ciclo, tal como se muestra en la Figura 9-19, lo HSKGa representadas en el mismo gráfico.
que constituye una manera fácil de recuperar los datos analizados. Dos puntos, A y B, son elegidos
A partir del gráfico mostrado en la Figura 9-19 se obtienen los valores que arbitrariamente dentro de la fase exponencial
figuran en la Tabla 9-41. de amplificación de las curvas. T representa
Con los valores de la Tabla 9-41 podemos calcular la eficiencia de las reacciones «diana» y R representa «referencia». Los
para Gen A y HSKGa. usando la siguiente ecuación (Ecuación 1): valores de R„ y CT son obtenidos a partir del
gráfico de cada gen (líneas discontinuas).
La eficiencia de amplificación de la reacción para la diana, Gen A, es

T a b la 9-41 Valores de reportero norm alizado y CT de Gen A y HSKGa,

extrapolados de la Figura 9-19
Gen Rn,A Rn,B C t ,a C t,b
Gen A 1,3 2,4 24,0 27,0

HSKGa 1,3 2,4 25,3 28,3
La eficiencia de amplificación de la reacción para la referencia, HSKGa., es
/ 1 3\_____1____ J_
E - ( — )25,3-28,3 _ 1 - 0,54-3 - 1 - 0 ,5 4 -0,33 - 1 - 1,23 - 1 = 0,23
W )
A partir de estos cálculos, las eficiencias de amplificación de los dos genes, el

diana y el referencia, parecen ser iguales.
A continuación usaremos esta eficiencia de amplificación en la siguiente
ecuación (Ecuación 3) para determinar una diferencia relativa en la cantidad
de ARNm de los dos genes en las células objeto de estudio.
^0,Diana __ (1 ~t~ ¿Referencia) T’Referencia
Ro,Referencia (1 + ¿Diana ) CT,D'ana
Haremos este cálculo para cada pocilio y sacaremos el promedio de los resul
tados. Para el pocilio A l, como ejemplo, tenemos
Rp.GenA (1 + 0 .2 3 )24’81 170,04

(1 + 0,23)2 W 128,58 '
Por tanto, en el pocilio A l, el ARN de Gen A está presente en células hepáticas a

un nivel 1,32 veces más alto que el ARN de HSKGa. Los valores de veces de
diferencia para el resto de pocilios se calculan de la misma manera. Aparecen en
la Tabla 9-42.
Así, a partir de la Tabla 9-42 vemos que, en las células hepáticas analizadas, Gen A
se expresa a un nivel 1,33 veces más elevado que HSKGa. Sin embargo, también
deberíamos adjuntar una desviación estándar a este valor. Los cálculos de
desviación estándar para este problema se muestran en la Tabla 9-43.
Por lo tanto, a partir de la Tabla 9-43, podemos adjuntar una desviación estándar
de 0,02 al valor de 1,33 veces de diferencia. Podemos decir que la expresión del
ARN de Gen A es 1,33 ± 0,02 veces más elevada que la de HSKGa en las células
hepáticas analizadas.
9.9 El método R0 de cuantificación relativa 299
Gen A en
T a b la 9 -4 2 Cálculo de resultados de las veces de diferencia de
relación a HSKGa, determ inados con la Ecuación 3 y el conjunto de datos
del Problem a 9.18
Posición del CT de Gen A (diana) CT de HSKGa V e ce s de d iferen

pocilio (referencia) cia de Gen A
resp ecto a HSKGa
A1 23,46 24,81 1,32

B1 23,39 24,79 1,34
C1 23,42 24,72 1,31
DI 23,35 24,86 1,37
E1 23,38 24,81 1,34
F1 23,36 24,71 1.32
Promedio 1.33
T a b la 9 -4 3 D esviación estándar del prom edio de las veces de diferencia de la expresión de Gen A
respecto a HSKGa.. La m edia de 1,33 ha sido calculada en la Tabla 9-41. Los cálculos corresponden al
conjunto de datos del Problema 9.18
Pocilio Veces de
diferencia
(x -x ) (x -x )2 £ (x -x )2 £ (x -x )2
n -1
./ £ (* -
V n -1
12
A1 1,32 -0,01 0,0001 0,0024 0,00048 0,02
B1 1,34 0,01 0,0001
CI 1,31 -0,02 0,0004
DI 1,37 0,04 0,0016
El 1,34 0,01 0,0001
F1 1,32 -0,01 0,0001
N ota: La designación de los puntos A y B en el gráfico de amplificación tal como

se requiere para la determinación de una eficiencia de amplificación, pese a ser
arbitraria, debe ser realizada dentro de la sección exponencial del gráfico. Una
estimación a la baja de la eficiencia significará una estimación a la baja de la
diferencia relativa entre los genes diana y referencia.
9.9 E L M É T O D O R 0 D E C U A N T IF IC A C IÓ N R E L A T IV A
L a re acc ió n en ca d en a d e la p o lim e rasa a m p lifica A D N a u n a ta sa exponencial. En
u n a re acc ió n c o n efic ien cia d el 100% , el p ro d u c to s e d o b la en c a d a ciclo. E n la
PCR a tiem po real, el aumento de señal fluorescente durante la reacción de

am plificación es proporcional a la concentración de A D N . El término Ro se utiliza
para designar la cantidad teórica de fluorescencia inicial a tiem po cero. Puede ser
expresada m atemáticamente com o
S„=R„x 2~ Ct
donde C t es el cic lo umbral y R„ es la señal reportera a dicho cic lo umbral.

Pierson (2 0 0 6 ) describe el uso d e esta ecuación para medir la expresión génica
relativa. C on ociendo la cantidad inicial d e fluorescencia, es una tarea sim ple
normalizar una diana con una referencia tras dividir el valor Ro del gen diana
entre el valor Ro de su respectivo gen d e referencia. El desplazam iento manual del
valor umbral R„ dentro de la región exponencial de la curva d e am plificación
debería no cambiar el valor Ro dado que, si así fuera, se produciría un correspon
diente cam bio en la Ct -
U na eficien cia de am plificación (si s e con oce a partir de una curva estándar)
puede ser incorporada en la ecuación de la siguien te manera
Se =R, x (1 + £ T C'T
El m étodo Ro se puede utilizar de forma sim ilar al m étodo A A C t , según el cual

un gen diana, norm alizado a una referencia, puede ser com parado con una muestra
calibradora.
P ro b le m a 9 .1 9 Se obtiene ARN total de una muestra de células de pulmón y

se convierte a ADNc. Una alícuota de la reacción de ADNc se coloca en un pocilio
de una placa. En dicho pocilio se somete a análisis un gen diana, Gen A, y un gen
de referencia, HSKGa, utilizando sus propios cebadores y sondas únicas. Gen A se
detecta utilizando una sonda marcada con un fluoróforo azul y HSKGa. se
detecta con una sonda marcada con fluoróforo verde. Cuando finalice la
reacción se establece el umbral a 1,5 Rn. A este nivel de señal de fluorescencia,
Gen A tiene un valor CT de 25,0 y HSKGa. tiene un valor CT de 26,35 (Figura 9-20).
¿Cuántas veces de diferencia existen entre sus cantidades en dicho pocilio?
Usaremos la siguiente ecuación para determinar los valores R0 de los dos genes:
Ro = ft„ X 2 ~ Ct
9.9 El método R0 de cuantificación relativa 301
1 2 3 4 S 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Cycle Number
I FIGURA 9-20 Curva de amplificación para la expresión Gen A y HSKGa según el experimento de PCR a tiem po real descrito en el Problema 9.19.
Para Gen A, tenemos
fío = 1,5 x 2 -25

= 1,5 x (2,98 x 10-8)
- 4,5 X 10-8
Para HSKGa, tenemos
R0 = 1,5 x 2 -26,3 = 1,5 x (1,21 x 10-8) = 1,8 x 10-8
La división del valor R0 de Gen A entre el valor R0 de HSKGa nos da
Ro,GenA 4,5 X 10“ '

= 2,5
Ro,HSKGa 1,8 X 1O-8
Por tanto, en dicha muestra de ADNc, Gen A está unas 2,5 veces más represen
tado que HSKGa..
P ro b le m a 9 .2 0 Se lleva a cabo un experimento de un solo pocilio similar al

descrito en el Problema 9.19. Sin embargo, esta vez se genera una curva
estándar para Gen A y HSKGa utilizando una batería de diluciones de una
muestra de ADN independiente y cuantificada. La recta de regresión de la curva
estándar de Gen A da lugar a la siguiente ecuación:
y = —3,026349* + 28,535219
La recta de regresión de la curva estándar de la amplificación de HSKGa está

representada por la ecuación
y = —3,056389* + 27,387451
El establecimiento de la línea umbral a 1,5 Rn para el análisis de los datos da

lugar a una CT de 25,0 para Gen A y 26,35 para HSKGa. ¿Cuáles son las veces de
diferencia entre la cantidad de ADNc de Gen A y ADNc de HSKGa en dicho
pocilio?
Primero calcularemos la eficiencia de amplificación de cada gen. Las ecuaciones
de las rectas de regresión siguen la fórmula general d e y = m x + b donde m es la
pendiente de la recta. La eficiencia de amplificación se calcula usando la
£ — io < _ 1/pendiente) _ -j
Gen A es amplificado con una eficiencia de
£= 10 - 1= i o 0’3304 - 1 = 2,14 - 1 = 1,14
HSKGa es amplificado con una eficiencia de
£ = 10 - 1 = 1 0 0,3272 - 1 = 2 ,1 2 - 1 = 1,12
9.10 El modelo Pfaffí 303
Ahora usamos la siguiente ecuación para determinar R0 para cada gen:
R0 = R„ x (1 + E r CT
Para Gen A, tenemos
Ro = 1,5 x (1 + 1,14) 25
= 1,5 x (2,14)_25 = 1,5 x (5,49 x 10-9) = 8,24 x 10~9
y para HSKGa, tenemos
Ro = 1,5 x (1 + 1,12) 36 3
= 1,5 X (2,12)~26,3 = 1,5 X (2,61 X 10-’ ) = 3,92 x 10“ 9
La relación entre Gen A y HSKGa es
W j 8,24 x l Q - 9 ;i
Ro,HSKSo 3,92 X 10-9
Por tanto, el ADNc de Gen A es 2,1 veces más abundante en dicha muestra que el
ADNc de HSKGa.
9.10 E L M O D E L O P F A F F L
Pfaffl (2 0 0 1 ) d escrib e u n m éto d o p a ra m ed ir la ex p resió n g é n ic a relativa
b asá n d o se en los v alo res C t y las eficiencias d e am p lifica ció n d e los genes d ian a
y d e referencia. L a norm aliza ció n d e la d ia n a co n la re feren cia y la co n sid eració n
d e la ex isten c ia d e diferencias en sus eficiencias d e am p lifica ció n s o n in co rp o
radas en el cálcu lo d e la relación entre el cam bio d e ex p resió n d e la d ia n a y el
cam bio d e ex p resió n d e la referencia. E sta relación se ca lcu la así
, (i?d i„a)ACT' d,“ “

relación = ---------------- xñ ------------
(E„ f t o n c i ,) " 7' ” fc—
d o n d e E es la efic ien cia d e am plificación d e riv a d a d e la p en d ie n te d e u n a cu rv a

e stán d a r y se ca lcu la co m o E = 10<-1/pendienle) y A C t se ca lcu la co m o la C T d e la
m u estra n o trata d a m en o s la C t d e la m u estra tratada, y a se a p ara el g en d ia n a o

p ara el g en d e referencia.
L o s v a lo re s E p a ra lo s g e n e s d ia n a y re fe re n c ia so n u n a p a rte in te g ra l d el
c á lc u lo y, p o r ta n to , s u s efic ie n c ia s d e a m p lific a c ió n p o r P C R a tie m p o re al
d e b e ría n s e r b ie n c a ra c te riz a d a s . E ste m éto d o n o re q u ie re q u e se lle v e a ca b o
u n a c u rv a d e d ilu c ió n e s tá n d a r s im u ltá n e a m e n te y en la s m ism a s c o n d ic io n e s
d e re a c c ió n q u e la s u tiliz a d a s p a r a la a m p lific a c ió n d e la s m u e s tra s e x p e ri
m e n ta le s, p e ro d ad o q u e la e c u a c ió n tie n e c o m o ele m e n to c e n tra l la e fic ie n
c ia d e a m p lific a c ió n , la in c lu s ió n d e ta l c o n ju n to d e re a c c io n e s e n p ara le lo
d a ría m ás c o n fia n z a al in v estig ad o r. T am b ién d e b e ría re m a rc a rs e q u e la
e fic ie n c ia n o e s u n p o rc e n ta je . E n s u lu g ar, u n a re a c c ió n c o n e fic ie n c ia d el
9 9 % d e b e ría s e r e x p re s a d a co m o 1 ,99 p a ra e s te m é to d o (v é a se la n o ta en la
S e c c ió n 9.4).
P ro b le m a 9.21 Se lleva a cabo un experimento para conocer la expresión

relativa de Gen A (la diana) respecto al gen de mantenimiento HSKGa.
(la referencia) después de 2 h de tratamiento con choque térm ico (un cambio
de 37 a 44 °C). Se obtiene ARN total de células hepáticas incubadas a 37 °C
(f0 para las muestras no tratadas) y se somete a transcripción reversa para
generar ADNc. Diez nanogramos de la reacción de ADNc son añadidos a
pocilios replicados de una placa de 96 pocilios. Una muestra de células
hepáticas es incubada a 44 °C durante 2 h. Se obtiene ARN total de las células
sometidas a choque térmico, se convierte a ADNc y 10 ng de la reacción se
añaden a pocilios replicados de la placa. Se amplifican Gen A y HSKGa
simultáneamente en cada pocilio utilizando sus propios cebadores y sondas
marcadas. A partir de una curva de una dilución estándar se determina que Gen
A ha sido amplificado con una eficiencia de 1,97. HSKGa se determina haber
sido amplificado con una eficiencia de 1,99. La Figura 9-21 muestra las curvas
de amplificación de los genes Gen A y H SKGa en las muestras no tratadas
(37 °C a t0) y tratadas (Incubación a 44 °C durante 2 h) (un pocilio para cada
condición). Dos pocilios nos dan los resultados mostrados en la Tabla 9-43.
Utilizando el método Pfaffl, calcule la expresión génica relativa de Gen A en
comparación con la de HSKGa.
Nota: En cualquier experim ento de este tipo, es importante realizar repli
cados de cada m uestra. En este experim ento, se debería calcular el pro
medio de las muestras parecidas (promedio de todos los valores CT de Gen
A l no tratam iento, promedio de todos los valores CT de HSKGa/r\o trata
miento, etc.) y dichos promedios se deberían usar para calcular una tasa
de expresión relativa. Sin embargo, dado que esta aproxim ación ha sido
demostrada en problemas anteriores de esta sección, para este ejem plo y
para demostrar la parte matemática, sólo exam inarem os un único grupo
de valores CT.
9.10 El modelo Pfaffí 305
Rnre Crete
■ FIGURA 9-21 Curva de amplificación para las muestras descritas en el Problema 9.21. Rn representa la señal reportera normalizada. Nótese que la expresión del
gen de mantenimiento HSKGa cambia poco por el tratamiento de choque térmico, tal como es de desear para un gen de referencia de un estudio de expresión relativa.
S o lu c ió n 9.21
Primero calcularemos las veces de aumento de Gen A. Gen A en la muestra no
tratada (antes del choque térmico) da una CT de 32,54. Tras 2 h a 44 °C, Gen A da
una CT de 23,41. Con una eficiencia de amplificación de 1,97, las veces de
aumento son
aumento = (£ )Ct>notratada-cT, tratada
= ( 1,97)32,54-23’41
= (1,97)9,13 = 488 veces de aumento
HSKGa se amplifica con una eficiencia de 1,99. En la muestra no tratada, da lugar

a un valor CT de 27,72. En la muestra tratada (sometida a choque térmico),
genera un valor CT de 27,93. Las veces de aumento son
aumento = (i,9 9 )27’72-27’93 = (1 ,9 9)-0,21 = 0,87

Ta b la 9-44 Datos correspondientes al Problem a 9.21, en el cual la

expresión de Gen A y HSKGa. es determ inada en respuesta a un tratam iento
de choque térm ico
Posición del Gen Condición CT

pocilio experimental
Al Gen A No tratada (37 °C) 32,54

Al HSKGa No tratada (37 °C) 27,72
A6 Gen A Tratada (44 °C) 23,41
A6 HSKGa. Tratada (44 °C) 27,93
Nuestra relación es
cambio en la diana 488
relación = -------------- ----- --------- = ----- = 561
cambio en la referencia 0,87
Por tanto, la expresión de Gen A está 561 veces aumentada en relación a la de

HSKGa.
R E S U M E N D E L C A P IT U L O
L a P C R a tiem po re al tien e co m o fin alid ad la dete rm in a ció n d e la p re s e n c ia o
au se n cia d e ác id o s nu cle ic o s y /o la ca n tid a d d e lo s m ism o s y se b a s a en la
dete cció n d e u n aum e n to d e in ten sid ad d e u n a señal fluorescente g en e rad a p o r
u n flu o ró fo ro intercalado o p o r la deg rad ac ió n d e u n a so n d a m arc ad a con
fluoróforo d u ra n te la am p lifica ció n d e u n a sec u en cia diana. E l nú m ero d e ciclos
d e P C R a p a rtir d el cual la señal fluorescente se v u elv e d istinguible d el ru id o de
fo n d o se d en o m in a el va lo r C t - E n tre d o s m u estras, u n a d ism in u c ió n del v a lo r C T
(A C t ) d e u n cic lo re p rese n ta la e x isten c ia d el d o b le d e ca n tid a d d e diana. E sta
re la ció n se p u ed e e x p resar com o
V e ces d e aum e n to en la ca n tid a d d el pro d u c to am plificado = 2 -AC t
L a desv iac ió n estándar, u n a m ed id a d el g ra d o d e varia b ilid a d en u n co n ju n to de

dato s, se ca lcu la p ara dete rm in a r c o n qué grado los v alo re s C T d e réplicas d e P C R
a tiem p o re al v aría n resp ecto a la m edia. E s tá dete rm in a d a p o r la ecuación
E - -rT
n —1
L a cua n tific ac ió n de A D N p o r P C R a tiem p o real se llev a a cabo g en e ran d o u n a

cu rv a e stán d a r a p artir d e u n a b ate ría d e d ilu cio n es d e u n A D N d e referencia
ob ten id o d e fo rm a in d ep e n d ie n te y cua n tific ad o , gra fica n d o su s valo res C t frente
al log d e la co n c en tra ció n d e A D N y dete rm in a n d o la cantidad d e A D N existente

en la m u estra d esc o n o cid a a p artir d e la re cta d e re g resió n d el gráfico.
L a P C R a tiem po real y la gen e rac ió n d e señal flu o re scen te tien en lu g a r a u n
ritm o defin id o determ in ad o p o r la ecuación
R / = Ri( 1 + E ) n
en la q u e R j es equ iv a le n te a la señal flu o rescen te final d el m arc ad o r reportero, R¡

es equ iv a le n te a la señal flu o re scen te in icial d el m arc ad o r reportero, E es la
efic ien cia d e am p lifica ció n y n es e l n ú m ero d e ciclos. L a efic ien cia de
am plificación (E) se d ete rm in a a p a rtir d e u n a cu rv a e stán d a r u tiliz an d o la
sig u ien te fórm ula:
A M P L IF IC A C IÓ N E X P O N E N C IA L = 10
E F IC IE N C IA = - 1) x 100
en la q u e la p en d ie n te en esta ecu ac ió n es la d e la re cta d e re g resió n d e la cu rv a

estándar. U n a re acc ió n co n u n a efic ien cia d el 100% ten d rá u n a p en d ie n te de
—3,32. D u ran te la am p lifica ció n ex p o n e n cial, u n a re acc ió n co n u n a eficiencia
d el 100% d o b lará el pro d u c to d e P C R en ca d a cic lo y ca d a 3,3 2 cic lo s aum e n ta rá
el pro d u c to 10 v eces. E n térm in o s m atem áticos, esto significa
log2 10 = 3 ,3219
2 3,3219 = 10
U n a p en d ie n te c o n u n v a lo r m ás neg a tiv o re p rese n ta rá u n a P C R co n u n a

efic ien cia in ferio r al 100% y co n nec esid ad d e optim ización. U n a p en d ie n te con
u n v a lo r m ás p o sitiv o p u ed e in d icar p roblem as co n la reacción.
L a ex p resió n g é n ic a p u ed e se r an a liz ad a p o r P C R a tiem p o re al tras co n v e rtir el
A R N m de la c é lu la en A D N c. E ste m aterial se u s a co m o sustrato de la reacción. L a
m a y o r parte d e estu d io s d e ex presión g én ic a p o r P C R a tiem po re al im plican
la co m paración d e la ca n tid a d d e transcrito d e u n g en (diana) en u n a c é lu la co n la
ca n tid a d de tran sc rito de o tro g en (referencia o calibrador). L a ex p resió n d e u n gen
p u ed e se r c o m p a rad a entre tip o s d e tejidos y en re sp u esta a u n tratam iento
ex p erim en tal. S e h an desc rito v ario s m étodos p a ra e v a lu ar los datos d e P C R a
tiem p o real. U n o d e los p rim ero s m éto d o s s e co n o c e co m o el m éto d o A A C T o
m éto d o co m parativo C t - E l ca m b io en el va lo r C t d el g en d ia n a rela tiv o al cam b io
en el v a lo r C t del ca lib rad o r está determ in ad o p o r
ca n tid a d re la tiv a d e v ec es d e ca m b io = 2 -AACt

E n el m éto d o A A C t, A C t es equ iv a le n te al cam b io en la d ia n a rela tiv o al del

control e n d ó g e n o (referencia):
C-T, diana C t , referencia ACt
E l v a lo r A A C t se ca lcu la com o la A C t d e c a d a m u estra m en o s la A C t del

ca lib rad o r (la m u estra q u e re p rese n ta el tiem po cero o el co n tro l no tratado c o n el
cual se co m p a ran to d as las m uestras).
E l u so d el m éto d o co m p a rativ o C t re q u ie re q u e el g en d e re feren cia se am p li
fiq u e con u n a efic ien cia s im ilar a la d el g en d ia n a y q u e no esté drásticam ente
afectado p o r el trata m ie n to experim ental. U n gru p o inicial d e ex p e rim en to s debe
s e r llev ad o a cabo p a ra a n a liz ar si es éste el ca so o n o . S e p u ed e u s a r A N O VA
(an álisis d e varia n za ) para co m p a rar las diferencias en eficiencias de am plificación
e n tre genes. P u ed e d ete rm in a r la varia b ilid a d entre u n co n ju n to d e m uestras dentro
d e u n g ru p o individual y entre g ru p o s en tero s d e m uestras. L a v aria n za entre
m u estra s d en tro d e u n gru p o se ca lcu la u san d o la ecu ac ió n g eneral p a ra la
varianza:
varia n za = s 2 = —
X )-------
(* _ -—* )2
n —1
en la q u e x es el v a lo r C T d e u n a m u estra d el g ru p o , x es el va lo r C t p ro m ed io para
to d as las m u estra s dentro d e ese gru p o individual y n es e l nú m ero de m uestras. L a
v aria n za intergrupo s*2 se ca lcu la así
2 (a — x )2 + (b — x )2 + (c — x )2 + ...
S ~ m- 1
d o n d e a, b y c son los p ro m ed io s d e ca d a g ru p o diferente, x e s el pro m ed io de

to d o s lo s p ro m ed io s de ca d a gru p o y m es el nú m ero de grupos. E l p ro m ed io de las
v aria n za s d e to d as las m u estra s se ca lcu la así
i 4 + 4 + »? + ■
■■
E sto s v alo re s son u tiliz ad o s p a ra ca lcu lar u n estadístico F, la relación e n tre la

v aria n za intergrupo y la varia n za intragrupo:
d o n d e n es el n ú m ero d e m ed id as en ca d a gru p o individual. S i el v a lo r F es

elevado, la varia b ilid a d entre g ru p o s (el num erador) d eb e se r g ra n d e en
co m paración c o n la varia b ilid a d d en tro d e c a d a gru p o (el d enom inador). El

estadístico F s e u tiliz a p ara d ete rm in a r si las m ed ias d e las m u estra s d e varios
g ru p o s son iguales. Si lo son, la h ip ó tesis n u la, seg ú n la cual el tratam iento
experim ental no tien e efecto so b re la ex presión del g en d e referencia, p u ed e ser
aceptada. E l v a lo r lím ite q u e u sam o s p a ra d e c id ir si tal dete rm in a ció n se pu ed e
estab le cer lo en c o n tram o s en u n a tab la de distrib u ció n F. U n v a lo r P asociado con
el estad ístico F indicará cóm o d e p ro b a b le es q u e o b ten g a u n estad ístico F m ás
extrem o q u e el q u e h a determ in ad o si la h ip ó tesis n u la fu e ra cierta. C u an to m en o r
es el v a lo r P, m ás p ro b a b le es q u e la h ip ó tesis n u la p u e d a se r rechazada.
L a com p ro b a ció n d e si lo s gen e s d ia n a y d e re feren cia tien en eficiencias de
am plificación sim ilares y p u ed e n , p o r tan to , se r utiliz ad o s co n el m éto d o A A C t
im p lic a la pre p ara ció n d e cu rv as e stán d a r p a ra ca d a g en a p a rtir de u n a b ate ría de
d ilu cio n es d e A D N c. E l pro m ed io d e lo s v alo re s C T p a ra ca d a co ncentración
d ilu id a se o b tien e restando el g en d e re feren cia d el g en d ia n a y estos v alo re s C T
son rep rese n ta d o s en u n a g rá fica fren te al lo g d e la ca n tid a d d e A R N d e p artid a
u tiliz ad o p ara h a c e r el A D N c diluido de es a c u rv a estándar. Si la re cta d e re g resió n
d e ese gráfico tien e u n a p e n d ie n te in ferio r a 0,1 , entonces po d em o s asu m ir q u e los
d os genes tien en eficiencias de am p lifica ció n su ficie n te m en te sim ilares co m o para
p o d e r co m p a rarlo s en fo rm a d e d ia n a y referencia.
E l m éto d o d e la cu rv a están d a r m ide la ex presión g é n ic a re la tiv a b asá n d o se en
las ec u ac io n e s d e las re ctas d e re g resió n deriv a d as d e las cu rv as e stán d a r d e los
g en e s d ia n a y d e re feren cia y p erm ite c a lcu lar la cantidad d e transcrito d e u n gen
d ian a en u n a m u estra desc o n o cid a. L a ca n tid a d d e d ian a se n o rm aliza co n la del
g en de re feren cia y se c o m p a ra co n la cantidad de A R N re feren cia existente en u n a
m u estra calibradora.
L a cin é tic a de la P C R a tiem p o re al se p u e d e utiliz ar p a ra ca lcu lar u n a eficien
c ia de am p lifica ció n y, a p a rtir de ella, u n a ca n tid a d inicial d e diana. L a eficiencia
se ca lcu la a p artir d e la ecuación
1
£ _ C ta — C tb _ i
en la q u e R„ A y Rn B re p rese n ta n R„ (flu o resce n cia re p o rtera en el cic lo n ) a

u m b rale s arbitrarios A y B establecidos en la fase ex p o n e n cial d e la cu rv a de
am plificación, re spectivam ente, y C p a y C T b son l ° s cic lo s en d ich o s um brales
arbitrarios. E n la cuan tific ac ió n re la tiv a d e u n ex perim ento, u n g en p u e d e ser
no rm alizad o a u n a re feren cia m ediante la sig u ien te ecuación:
^ 0 , Diana __ ( 1 -^Referencia) T,Refen
^ 0 , Referencia ( 1 + ¿¿Diana ) CT,Dlana
en la q u e R q es la ca n tid a d in icial d e fluorescencia.

E n el m éto d o Ro p a ra m ed ir ex p resió n g én ic a relativa, la s ig u ie n te ecuación

p u ed e se r u tiliz ad a para dete rm in a r u n a ca n tid a d inicial d e flu o re scen c ia a tiem po
cero (antes d e ca m b ia r la tem p eratu ra, an te s d e in fec tar las células, antes d e tratar
las células c o n u n fárm aco, etc.):
«o = « „ x 2~t T
d o n d e C t e s el cic lo u m b ral y R„ es la señ a l re p o rtera a tal cic lo u m b ral. C uando

Ro se d ete rm in a p ara u n g en d ia n a y u n g en d e referencia, lo s d os p u ed e n ser
co m p a rad o s u n o co n el otro. Si u n a efic ien cia d e am p lifica ció n (E) es co nocida,
ese v a lo r p u e d e se r inco rp o rad o d e la sig u ie n te m anera:
5 o = í „ x ( i + ^ r Cr
E l m o d elo Pfaffl se u tiliz a p a ra m ed ir la ex p resió n gén ic a re la tiv a b asá n d o se en

valo re s C t y las eficiencias d e am p lifica ció n seg ú n la ecuación
,
re la ció n ------------------ -¡-y,------------
( r? \¿XC f referencia
(■^■referencia) ’
en la q u e E es la efic ien cia d e am p lifica ció n d eriv a d a de la p en d ie n te de u n a cu rv a

e stán d a r y ca lcu lad a co m o E = 10<_ 1/pend,ente) y A C T es ca lcu lad a co m o la C T d e la
m u estra no trata d a m en o s la C t d e la m u estra trata d a, tan to en el ca so del g en diana
co m o en el d el g en d e referencia.
L iu , W ., a n d D .A . S a in t ( 2 0 0 2 ). A n e w q u a n tita tiv e m e th o d o f re a l tim e r e v e rs e tra n s c rip tio n
p o ly m e r a s e c h a in r e a c tio n a s s a y b a s e d o n s im u la tio n o f p o ly m e r a s e c h a in r e a c tio n k in e tic s.
Anal. Biochem. 3 0 2 :5 2 —59 .
L iv a k , K .J ., a n d T .D . S c h m ittg e n ( 2 0 0 1 ). A n a ly s is o f r e la tiv e g e n e e x p re s s io n d a ta u s in g r e a l-tim e
q u a n tita tiv e P C R a n d th e 2 -A A C T m e th o d . Methods 2 5 :4 0 2 - 4 0 8 .
P fa ffl, M .W . ( 2 0 0 1 ). A n e w m a th e m a tic a l m o d e l f o r r e la tiv e q u a n tific a tio n in re a l- tim e R T -P C R .
Nucleic Acids Res. 2 9 :2 0 0 2 —2 0 0 7 .
P ie rso n , S .N . ( 2 0 0 6 ). Q u a n tita tiv e a n a ly s is o f o c u la r g e n e e x p re ssio n . I n Real-time PCR
(M . T e v f ik D o ra k e d .). T a y lo r & F r a n c is G ro u p , N e w Y o rk , N Y , p p . 107—126.
F r e e m a n , W .M ., S J . W a lk e r, a n d K .E . V ra n a ( 1 9 9 9 ). Q u a n tita tiv e R T -P C R : p itfa lls a n d p o te n tia l.
BioTechniques 2 6 :1 1 2 —1 2 5 .
O ’C o n n o r, W ., a n d E .A . R u n q u is t ( 2 0 0 8 ). E r ro r m in im iz a tio n a lg o rith m f o r c o m p a r a tiv e q u a n
tita tiv e P C R a n a ly sis: Q -A n a l. Anal. Biochem. 3 7 8 :9 6 - 9 8 .
P e ir s o n , S .N ., J .N . B u tle r, a n d R .G . F o s te r ( 2 0 0 3 ). E x p e r im e n ta l v a lid a tio n o f n o v e l a n d c o n
v e n tio n a l a p p ro a c h e s to q u a n tita tiv e re a l- tim e P C R d a ta a n a ly sis. Nucleic Acids Res. 3 1 (1 4 ):
e73.
Q iu , H ., K . D u ra n d , H . R a b in o v itc h - C h a b le , M . R ig a u d , V. G a z a ille , P. C la v e re , a n d F .G . S tu rtz
(2 0 0 7 ). G e n e e x p re s s io n o f HIF-lcx a n d XRCC4 m e a s u r e d in h u m a n sa m p le s b y re a l-tim e RT -
P C R u s in g th e s ig m o id a l c u rv e -f ittin g m e th o d . BioTechniques 4 2 :3 5 5 - 3 6 2 .
R u tle d g e , R .G . ( 2 0 0 4 ). S ig m o id a l c u rv e -f ittin g r e d e fin e s q u a n tita tiv e r e a l-tim e P C R w ith th e
p r o s p e c tiv e o f d e v e lo p in g a u to m a te d h ig h - th r o u g h p u t a p p lic a tio n s . Nucleic Acids Res. 32
( 2 2 ) : e l7 8 ( d o i:1 0 .1 0 9 3 /n a r/g n h l7 7 ) .
S c h m ittg e n , T .D ., a n d B .A . Z a h r a js e k ( 2 0 0 0 ). E f fe c t o f e x p e rim e n ta l tr e a tm e n t o n h o u s e k e e p in g
g e n e e x p re s s io n : v a lid a tio n b y re a l-tim e , q u a n tita tiv e R T -P C R . J. Biochem. Biophys. Methods
4 6 :6 9 - 8 1 .
U s e r B u lle tin # 2 : A B I P R IS M 7 7 0 0 S e q u e n c e D e te c tio n S y s te m . A p p lie d B io s y s te m s p u b lic a
tio n , 2 0 0 1 .
W o n g , M .L ., a n d J.F . M e d ra n o ( 2 0 0 5 ). R e a l-tim e P C R f o r m R N A q u a n tita tio n . BioTechniques
3 9 :7 5 - 8 5 .
Capítulo
m
ADN recombinante
E l desarrollo d e la tec n o lo g ía d el A D N recom b in an te (tam b ién d en o m in ad a
clon ación gén ica), m eto d o lo g ía u s a d a p ara u n ir A D N d e d iferentes fuentes
b io ló g ic as c o n e l fin d e d ete rm in a r su sec u en cia o m an ip u lar su expresión, dio
lu g a r a u n a era d e gra n d es desc u b rim ie n to s en el cam po d e la g en é tic a y p erm itió el
desarrollo industrial d e este sector. E n térm in o s sim ples, la clonación g é n ic a se
lle v a a cabo en cuatro p aso s fundam entales:
1. U n A D N p a rtic u la r es frag m en tad o en p iez as m ás pequeñas.

2. U n seg m en to específico d el A D N frag m en tad o es u n id o a otro A D N , den o m i
n ad o vector, que co n tien e elem entos gen é tic o s n ecesarios p ara la rep lic ació n
intracelular.
3. L a m o lécu la reco m b in an te es in tro d u cid a en u n a cé lu la h u ésp e d , d o n d e pu ed e
replicarse, p ro d u c ie n d o así m ú ltip les copias d el frag m en to d e A D N clonado.
4. L as células q u e c o n tien e n lo s clones re com binantes s o n identificadas y
propagadas.
10.1 E N D O N U C L E A S A S D E R E S T R IC C IÓ N
L as en d o n u clea sa s d e restricción s on enzim as q u e re co n o ce n u n a sec u en cia de
A D N específica, d e n o m in ad a sitio d e restricción , y cortan el A D N d en tro o al
lad o d e dich o sitio. P o r ejem plo, la en d o n u c leasa d e re stric ció n E coR I, o b ten id a
d e la b ac teria E. coli, re co n o ce la sig u ien te secuencia:
5' g aattc 3'
3, c t t a ag 5,
L as ca d en a s de A D N co rta d as re presentadas aquí d e b e rían alin ea rse de m anera

q u e las C y las G qu ed e n en frentadas ta l co m o se m u estra aquí:
5'---------- g 3' y 5 A A T T C --------- 3'
3, ---------- C T T A A y 3'G --------- y
314 CAPÍTULO 10 ADN recombinante
L o s ex tre m o s p ro d u c id o s p o r EcoR I, dad o q u e son com p lem e n ta rio s en sus

re g io n e s colgantes d e c a d e n a sencilla, se d en o m in an coh esivos.
S e h an aislado diferentes enzim as d e re stric ció n a p a rtir d e u n a v arie d ad de
fu e n te s m icrobianas. L o s sitios re co n o cid o s específicam ente p o r en z im a s varían
de tam año, d esd e 4 a 13 p b , y, p ara la m a y o r p arte de en z im a s de restricción q u e se
u san p a ra clo n a ció n g énica, se tra ta d e palín d ro m o s: secuencias q u e se leen en
direc ció n 5 'a 3' d e u n a ca d en a d e la m ism a m an e ra q u e en d irec ció n 5 'a 3' d e la
ca d en a o p uesta. L a ac tiv id a d d e u n a en z im a d e re stric ció n se ex p resa no rm alm en te
en térm in o s d e u n id ad e s, d e m an e ra q u e u n a un id ad es la ca n tid a d d e en z im a que
co rta rá to d o s lo s sitios esp e cífico s existentes en 1 jxg d e u n a m u estra d e A D N
p a rtic u la r (g e n era lm e n te A D N d e X ) en u n a h o ra a 37 °C .
P ro b le m a 10.1 Un stock de ADN genómico humano está a una

concentración de 275 p,g/mL. Desea cortar 5 (xg con 10 unidades de la
endonucleasa de restricción Hind III. La enzima Hind III está a una concentración
de 2.500 unidades/mL. ¿Qué volúmenes de ADN y enzima deberían ser
utilizados?
S o lu c ió n 10.1
Las digestiones por restricción se llevan a cabo normalmente en pequeños
volúmenes (20 a 100 p,L). Tales reacciones son preparadas con una micropipeta
capaz de dispensar cantidades de p,L. Las concentraciones de ambos stocks, el
ADN humano y la enzima, vienen dadas como cantidad por mL. Por este motivo,
se debe usar un factor de conversión para pasar de mL a p,L. Los volúmenes
necesarios para cada componente de la reacción se describen a continuación.
La cantidad de ADN inicial se calcula así:
275 ug de ADN 1 mL
--------- ¡--------x --------- - x x i i L = 5 iig de ADN
mL 1.000 \l L ^
Despejando y resolviendo la x nos da el siguiente resultado:
(275 ug de ADN)x , _ ,
i -----—---------- — = 5 ug de ADN
1.000 f*
(275 jxg de ADN)x = 5.000 ^g de ADN
5.000 [ig de ADN

275 (xg de ADN
Por lo tanto, 18,2 p,L del stock de ADN humano contienen 5 (ig de ADN.
10.1 Endonucleasas de restricción 315
La cantidad de enzima H ind III se calcula de la siguiente manera:
2.500 unidades 1 mL , . . .
---------------------- x ------------- x x ixL = 10 unidades
mL 1.000 \ i l
El despeje y resolución de la x nos da el siguiente resultado:
(2.500 unidades)x . , ,
------------------- — = 10 unidades
1.000
(2.500 unidades)x = 10.000 unidades
10.000 unidades
-= 4
2.500 unidades
Por lo tanto, 10 unidades corresponden a 4 ( i L del stock de enzima.
10.1.1 F re c u e n cia d e los sitio s d e co rte

d e las e n d o n u c le a sa s d e re stricció n
L a frecu e n cia d e re p rese n ta ció n d e u n s itio d e re stric ció n partic u la r e n cu a lq u ie r
A D N dep en d e d e su co m p o sició n en b a se s y su tam año. P o r ejem plo, en los
g en o m a s de m am íferos, u n a b a s e G sig u e a u n a C en u n a frecu e n cia m u ch o m en o r
q u e la q u e se p o d ría esp e rar p o r azar. P o r lo tan to , u n a en d o n u c leasa d e restricción
co m o Nru I, q u e re co n o ce la sec u en cia T C G C G A , co rta e l A D N de m am ífero s con
m en o r frecu e n cia q u e lo h ac e co n el A D N d e fu e n te s b ac terian a s, el cual tien e u n a
d istrib u ció n de b a se s m ás aleatoria. A d em ás, com o se p o d ría esperar, lo s sitios de
re stric ció n co n u n tam año d e 4 p b apa rec en m ás frecuentem ente q u e los sitios
d e restricción c o n u n tam añ o d e 6 p b . E l tam año m edio d e u n frag m en to de
re stric ció n p ro d u c id o p o r u n a en d o n u c leasa co n c reta a p artir d e u n a sec u en cia
ale ato ria p u ed e se r estim ado p o r el m éto d o ilustrado en el sig u ien te problem a.
P ro b le m a 1 0 .2 La endonucleasa de restricción Hind III reconoce la secuencia

AAGCTT. Si un ADN genómico de secuencia aleatoria es digerido con Hind III,
¿cuál será el tamaño medio de los fragmentos producidos?
S o lu c ió n 1 0 .2
La probabilidad de que cualquier base, A, C, G o T, aparezca en una posición
particular en el ADN de secuencia aleatoria es uno de cuatro. El número de sitios
de restricción en el ADN aleatorio puede ser estimado elevando V4 a la n ((Y*)"),
siendo el exponente n el número de pb de la secuencia de reconocimiento. Un
«cortador de seis», tal como la enzima de restricción Hind III, que reconoce una
secuencia de 6 pb, cortará con una frecuencia de (V 4)6:
4.096
Por lo tanto, en el ADN de secuencia aleatoria se podrá esperar un promedio de

un sitio para Hind III de cada 4.096 pb a lo largo de la molécula. (Este valor sólo
refleja una estimación, ya que los tamaños reales de los fragmentos de
restricción generados a partir de cualquier ADN pueden variar considerable
mente. Por ejemplo, el ADN del bacteriófago \, de 48.502 pb de tamaño, genera
fragmentos Hind III que varían de tamaño desde 125 hasta por encima de
23.000 pb.)
10.2 C Á L C U L O D E L A C A N T ID A D D E E X T R E M O S
DE FRA G M EN TO
E l A D N se d ig iere c o n en z im a s d e restricción p ara crear fragm entos p ara la
clonación, la ca rto g ra fía g é n ic a o la p ro d u c ció n de so n d as genéticas. P a ra algunas
aplicaciones, com o p o r ejem plo el m areaje d el ex tre m o d e u n frag m en to , es
im portante estim ar la ca n tid a d d e ex tre m o s de frag m en to d e A D N q u e se generan.
P ara u n a cantidad d ete rm in a d a d e u n fragm ento lin eal co n u n tam añ o co ncreto, los
m oles d e extrem o d e fragm ento v ien e n dete rm in a d o s p o r la sig u ien te ecuación:
2 x (g ram o s d e A D N )
m oles d e ex tre m o s d e A D N
(T enem os u n 2 en e l n u m era d o r d e esta ecu ac ió n p o rq u e u n fragm ento d e A D N

lin eal tien e d o s extrem os.)
P ro b le m a 1 0 .3 Tiene 4 p,g de un fragmento de 3.400 pb. ¿Cuántos

picomoles de extremos representa?
Primero, calcule los moles de extremos de ADN y luego convierta esta cantidad
en picomoles. La cantidad de fragmento se expresa en ng. El uso de la ecuación
anterior requiere que la cantidad de fragmento sea convertida a g. Esto se lleva a
cabo así:
10.2 Cálculo de la cantidad de extremos de fragmento 317
1g 6
4 u,g x --------^ — = 4 x 10 g
1 x 10 ng 3
La sustitución de estos valores en la ecuación del cálculo de moles de extremos

de ADN genera el siguiente resultado:
2 x (gramos de ADN)
moles de extremos de ADN = -
660 g/mol
(número de pb) >
pb
, 2 x (4 x 10~6 g) 8 x 10~6 g
moles de extremos de ADN = ----------- 1------------ ------- — —
/ 660 g/m ol\ 2,2 x 106 g/mol
(3.400 pb)
V Pb /
= 3,6 x 10-12 mol
Este valor es convertido a picomoles al multiplicar por el factor de conversión

1 x 1012 pmol/mol.
. 1 x ! 0 12 pmol
3,6 x 10 12 mol x ------------ ¡------- = 3,6 pmol
Por lo tanto, 4 p,g de un fragmento de 3.400 pb es equivalente a 3,6 pmol de

extremos de ADN.
10.2.1 C a n tid a d de e x tre m o s g e n e ra d o s p o r m ú ltip le s

co rtes
P o d em o s d ete rm in a r el n ú m ero d e m oles d e ex tre m o s gen e rad o s p o r la digestión
d e re stric ció n d e u n A D N q u e co n tien e m ú ltip les sitios de reco n o cim ien to . P ara u n
A D N c irc u lar (tal co m o u n plásm id o o có sm id o ), los m oles de extrem os generados
p o r u n a d ig estió n d e re stric ció n p u ed e n ca lcu larse m ed ian te la s ig u ie n te ecuación:
m o les d e extrem os = 2 x (m o les d e A D N )

x (n ú m ero d e sitios d e restricción)
o N e cesitam o s el fa cto r de m ultip licac ió n 2 al co m ien z o d e esta fó rm u la po rq u e

~ ca d a corte gen e rad o p o r u n a en z im a d e re stric ció n d a lu g a r a d os extrem os,
g L o s m oles d e extrem os creados p o r la dig estió n d e m ú ltip les sitios en u n a
ra m o lécu la d e A D N lineal v ien e n dete rm in a d o s p o r la s ig u ie n te expresión:
•j| m oles d e extrem os = [(2 x (m oles d e A D N ) x (n ú m ero d e sitios d e restricción)]

§ + [2 x (m o les d e A D N )]
í>
ir
g E n esta ec u ac ió n , la fu n c ió n e n g lo b a d a p o r corchetes, al final d e la segunda
3 p arte d e la ec u ac ió n , tien e en cu e n ta lo s d os extrem os y a p re sen tes en la m olécula
© lineal.
P ro b le m a 1 0 .4 Un plásmido de 4.200 pb contiene cinco sitios para la

endonucleasa de restricción EcoR II. Si se cortan 3 (xg con esta enzima de
restricción, ¿cuántos picomoles de extremos serán generados?
Dado que un plásmido circular está siendo digerido, usaremos la siguiente
ecuación:
moles de extremos = 2 x (m oles de ADN)

x (número de sitios de restricción)
Esta ecuación requiere que determinemos primero el número de moles de ADN

plasmídlco. Para determinar este valor, el peso molecular del plásmido deber ser
calculado. Se pueden calcular los moles de plásmido a partir de la cantidad de
ADN plasmídico a digerir (3 ng). El peso molecular del plásmido se calcula de la
siguiente manera:
660 g/m ol - ,
4.200 pb x ---- ^ ---- = 2,8 x 106 g/mol
El número de moles de plásmido presentes en 3 jxg se determina multiplicando

la cantidad de plásmido (convirtiendo ng a g) por el peso molecular del
plásmido:
1q 1 mol 3 mol ,,
3 ixq x ___ ____ ~
V ____________
, _ ___________ __ 1 1 NX If l-1*
1 x 1 0 6 ng 2,8 x 106 g
Por lo tanto, 3 ng de un plásmido de 4.200 pb son equivalentes a

1,1 x 10-12 moles. La utilización de este valor en la ecuación de los moles de
extremos generados por la digestión de una molécula circular da lugar al
siguiente resultado:
moles de extremos = 2 x (1,1 x 10-12 mol) x 5 = 1,1 x 10-11 mol
Por lo tanto, se generan 1,1 x 10-11 moles de extremos por la digestión del
plásmido de 4.200 pb con EcoR II. Este valor es equivalente a 11 picomoles de
extremos, tal como se muestra a continuación:
< 1012 pmol

1,1 x 10-11 mol > = 11 pmol
mol
P ro b le m a 1 0 .5 Cuatro microgramos de un fragmento de 6.000 pb de ADN
lineal purificado van a ser cortados con Alu I. Existen 12 sitios Alu I en este
fragmento. ¿Cuántos picomoles de extremos serán generados por digestión del
fragmento con esta enzima?
Este problema será tratado de la misma forma que el Problema 9.4. El peso
molecular del fragmento de 6.000 pb se calcula primero:
660 g/mol - ,
6.000 pb x ------------ = 4 x 106 g/mol
El número de moles de fragmento de 6.000 pb en 4 ng se determina a

continuación:
19
4 mcj---------^
1 x 106 ng 4 x 106 g 4
El uso de este valor en la ecuación para calcular moles de extremos creados por
digestión de una molécula lineal da lugar a la siguiente relación:
moles de extremos = [2 x (moles de ADN) x (número de sitios de restricción)]
+ [2 x (m oles de ADN)]
moles de extremos = [2 x (1 x 10-12 mol) x (12)] + [2 x (1 x 10-12 mol)]

= [2,4 x 10~11 mol] + [2 x 10~12 mol] = 2,6 x 10~11 mol
Este valor se convierte a picomoles de extremos de la siguiente manera:
,, , 1 x 1012 pmol
< 10“ 11 mol x ---------- i----- ---
— 26 pmol
mol
Por lo tanto, la digestión de 4 ng de fragmento de 6.000 pb con Alu I generará

26 pmol de extremos.
10.3 L IG A C IÓ N
U n a v e z ten em o s el A D N a c lo n a r en fo rm a d e frag m en to defin id o (denom inado
d ian a o in serto), éste p u e d e se r u n id o a u n v ec to r m ed ian te u n pro c eso llam ado
ligación . L a h erram ien ta u tiliz ad a p a ra este pro c eso es u n a A D N ligasa, u n a
en z im a q u e c a taliza la fo rm a ció n d e u n enlace fo sfo d ié ste r en tre los extrem os
y u x tap u e sto s S '-fo sfato y S '-h id ro x il en el A D N dúplex. E l pro d u c to d ese ad o en
u n a re acc ió n d e lig ació n es u n a m o lécu la h íb rid a fu n c io n a l q u e está fo rm a d a

exc lu siv a m e n te p o r el v e c to r m ás el inserto. S in em bargo, u n a serie d e su cesos
adicionales p u ed e n te n e r lu g a r en u n a re acc ió n d e ligación, inclu y en d o la
circularización d el frag m en to d ian a, la lig ació n d el v ec to r sin la inco rp o ració n
del inserto, la lig ació n d e u n a m o lécu la d ia n a a o tra m o lécu la d ia n a y otras
p o sib le s com binaciones.
D o s tip o s d e v ec to res se u san en la in v estig ació n c o n A D N recom binante:
m oléculas circulares, tales co m o p lásm id o s y có sm id o s, y v ec to res d e clo n ació n
lineales, co m o lo s q u e se deriv a n d el bac terió fa g o X. E n c u a lq u ie r caso, para
p o d erle u n ir u n fragm ento d e A D N d ian a, el v e c to r es p rim ero cortado c o n u n a
en z im a d e restricción q u e g en e ra extrem os co m p a tib les co n lo s d e la diana. L os
v ec to res circulares, p o r tan to , s o n con v e rtid o s a u n a fo rm a lin eal antes d e la
lig ació n c o n la diana. E l frag m en to inserto es a con tin u ac ió n lig ad o al v ec to r para
crear u n a m o lécu la re co m b in an te c a p az d e re p lic arse u n a v e z esté in tro d u cid a en
u n a c é lu la huésped.
D u g a ic zy k e t al. (19 7 5 ) d esc rib iero n los su ce so s q u e tien en lu g a r d u ra n te la
lig ació n d e frag m en to s co rta d o s co n Eco R I, observ acio n e s q u e p u ed e n ser
aplicadas a c u a lq u ie r re acc ió n d e ligación. Id entificaron lo s d os fa cto re s que
dese m p e ñ an u n pap e l m ás im portante en la dete rm in a ció n d el re su lta d o d e cual
q u ie r ligación. P rim ero, la cap ac id a d co n la q u e d o s m oléculas d e A D N se u n e n es
dep e n d ien te d e la co n c en tra ció n d e sus extrem os: c u a n to m a y o r se a la
co n c en tra ció n de ex tre m o s co m p a tib les (aquellos capaces d e se r u n id o s), m ás alta
es la p ro b a b ilid ad d e q u e d os ex tre m o s se en c u en tre n y sea n ligados. E ste
p arám etro se d e sig n a p o r el térm in o i y s e d efin e com o la co n c en tra ció n total
d e ex tre m o s com p lem e n ta rio s en la reacción d e ligación. S eg u n d o , la ca n tid a d de
circularización q u e tien e lu g a r en u n a re acc ió n d e lig ació n es dep e n d ien te del
p arám etro j, la co n c en tra ció n d e extrem os d e la m ism a m o lécu la en su ficie n te
m ente cercana, p ro x im id ad c o m o p a ra p o d e r en co n trarse e interaccionar. P ara
c u a lq u ie r fragm ento d e A D N , y es u n v a lo r co n stan te d ep e n d ien te d el tam año del
fragm ento, no d e su co n c en tra ció n en la reacción d e ligación.
P ara u n fragm ento lin eal d e A D N d e d o b le c a d en a co n extrem os autocom ple-
m entarios, coh e siv o s (tales co m o los q u e g e n e ra Eco R I ) , i v ien e determ inado p o r
l a fórm ula
i — 2N qM x 10-3 e x tre m o s /m L
en la q u e N q es el n ú m ero d e A vogadro (6,023 x 1023) y M es la co ncentración

m o lar d e A D N .
A lg u n o s frag m en to s d e A D N a u tiliz a r p ara la clo n a ció n s o n g en e rad o s p o r
d ig estió n d o b le co n , p o r ejem plo, Eco R I y Hind III en la m ism a reacción de
restricción. E n tal caso, u n extrem o d el fragm ento será co h e siv o con o tro s ex tre
m os g en erados p o r Eco R I , m ien tras q u e el otro extrem o d el frag m en to d e A D N
será co h e siv o co n otros extrem os cread o s p o r H ind III. P a ra frag m en to s d e A D N
con ex tre m o s no auto c o m p le m e n ta rio s, la co n c en tra ció n d e ca d a ex tre m o v ien e
d ad a p o r
i — N qM x 10-3 e x tre m o s /m L
D u g a ic zy k e t al. (1 9 7 5 ) dete rm in a ro n que el v a lo r de j, la co n c en tra ció n d e u n

extrem o d e u n a m o lécu la en la vec in d ad in m ed iata d e su o tro extrem o, p u ed e se r
d eterm in ad o co n la ecuación
J= ( ¿ ) extremos/mL
en la q u e / es el tam añ o d el fragm ento d e A D N , b es el tam año d e A D N m ínim o
p a ra p o d e r d o b larse y fo rm a r u n círculo y ir es el n ú m ero p i, la re la ció n entre la
circ u n fe ren c ia d e u n círculo y su diám etro (ap ro x im ad am en te 3,14, u n n ú m ero
q u e se v e a m en u d o cu an d o se d esarrollan cá lcu lo s q u e rela cio n an m ed id as del
á rea d e u n círculo). L o s au to res específicam ente d eterm inaron el va lo r de j p a ra el
A D N d el b ac terió fa g o X. E l A D N d e X tien e u n tam añ o d e 4 8 .5 0 2 pb y ellos
asignaron u n va lo r d e 13,2 x 10 _ cm a l. P a ra A D N X en u n tam p ó n de ligación,
asig n aro n u n va lo r de 7 ,7 x 10- 6 cm a b. C o n estos v alores, el v a lo r j p a ra X (fyj
p a s a a se r 3 ,22 x 1011 extrem os/m L .
E l va lo r j p ara cu a lq u ie r m o lécu la d e A D N p u ed e se r calcu lad o en relación a j \
u sa n d o la ecuación
/P M \V 5 / T
j - j\ I J e x tre m o s /m L
en la q u e j \ es ig u al a 3 ,2 2 x 1 0 11 ex tre m o s/m L y P M re p re s e n ta el p eso

m olecular. D a d o q u e e l g e n o m a d e X tie n e u n ta m a ñ o d e 4 8 .5 0 2 p b , s u p eso
m o le c u la r p u e d e s e r ca lc u la d o u s a n d o el fa c to r de c o n v e rs ió n 6 6 0 g /m o l/p b , tal
co m o s e m u e s tra e n la s ig u ie n te ecu ac ió n :
66 0 e / m o l n
4 8 .5 0 2 p b x ----------------= 3 ,2 x 10 g /m o l
pb
P o r lo tan to , el p eso m o lecu la r (P M ) d e lam b d a es 3,2 x 107 g/m ol.

B ajo circ u n stan cias en las q u e j es igual a i ( j = i, o j / i = 1), el ex tre m o de
c u a lq u ie r m o lécu la d e A D N en co n c reto tien e la m ism a pro b a b ilid ad d e u n irse a
o tra m o lécu la q u e d e in tera ccio n a r co n su p ro p io extrem o o p u esto . Si j es m ay o r
q u e i (j > i), lo s su ce so s de lig ació n in tram o lec u la r p re d o m in a n y lo s círc u lo s son
el pro d u c to principal. S i i es m a y o r q u e j (i > j), se v e n favorecidos lo s su ce so s de
ligación in term o lecu lar y las estructuras h íb rid as lineales predom inan.
10.3.1 Lig a ció n u sa n d o v e c to re s d e riv a d o s d e X

L o s v ec to res deriv ad o s d el fa g o X co n tien e n u n sitio d e c lo n a ció n d en tro d e su
g e n o m a lineal. U n co rte p ro v o c ad o p o r u n a en z im a de restricción a n iv el del sitio
d e clo n a ció n p ro d u c e d o s fragm entos, c a d a u n o c o n u n a sec u en cia term inal
co h e siv a X (eos) en u n extrem o y u n sitio d e restricción g en e rad o p o r u n a enzim a
d e restricción en el otro. L a ligación c o n éx ito d e la d ia n a co n el v ec to r X requiere
tres su cesos principales.
1. U n ió n d el seg m en to d ia n a a u n o d e lo s d os frag m en to s X.
2. L ig ac ió n del s eg u n d o frag m en to X co n el o tro ex tre m o d el fragm ento diana
p a ra crear u n eq u iv a le n te al g en o m a d e X d e tam añ o com pleto.
3. U n ió n d e los extrem os eos co n o tras m o lécu la s X d e tam añ o c o m p leto para
c rear u n concatém ero, u n a m o lécu la de A D N larg a en la cual vario s genom as
de X están im idos e n serie p o r su s extrem os. S o la m en te a p a rtir d e u n a
estru c tu ra co n c atem érica p u ed e n lo s g en o m a s d e X individuales se r eficiente
m en te em p a q u etad o s dentro d e u n a c u b ie rta p ro teic a que p erm ita la subsi
g u ien te in fec ció n y propagación.
D u ran te la ligación d e u n fragm ento a los b ra zo s d e u n v e c to r X, am bos

extrem os d el frag m en to serán co m p a tib les c o n el sitio d e c lo n a ció n de cua lq u ie ra
de los b ra zo s X, p ero c a d a b ra zo sólo tien e u n ex tre m o co m p a tib le co n el inserto.
P ara q u e la lig ació n se a m ás eficiente, la reacción d eb e ría co n te n e r cantidades
equim olares d e ex tre m o s g en e rad o s p o r a lg u n a en z im a d e re stric ció n p a ra cada
u n o d e lo s tres fragm entos: el b ra zo izquierdo X, el inserto y e l bra zo d erech o X.
S in em bargo, d ad o q u e ex isten d os frag m en to s d e X y u n o d e inserto p o r gen o m a
re co m b in an te, cu an d o se p re p ara la reacción d e lig ació n , la relación m o lar d e los
bra zo s re sp ecto al inserto d eb e ría se r 2:1 p ara q u e las tres m o lécu la s te n g a n u n a
re la ció n d e 2:1:2 (brazo izquierdo: inserto: b ra zo derecho). A d e m á s, dad o q u e los
pro d u c to s d e lig ació n lineales tien en q u e p redom inar, la co n c en tra ció n d e extre
m os (i) y el tam añ o de la m o lécu la (j) d eb e n se r m an ip u lad o s p a ra q u e j se a inferior
a i, favoreciendo la p ro d u c ció n d e m oléculas h íb rid as lineales en v e z de circulares.
P ro b le m a 1 0 .6 Se ha llevado a cabo una digestión parcial de ADN genómico

humano con Sau3A I y se han generado fragmentos con un tamaño medio de
20.000 pb. Construirá una librería genóm ica (una colección de clones
recombinantes que representan el contenido genético humano completo)
mediante la ligación de dichos fragmentos a un vector XEMBL3 digerido con
BamH I. (BamH I crea extremos compatibles con los generados por Sau3A I;
ambas enzimas producen una extensión GATC 5')- El vector XEMBL3 tiene un
tamaño aproximado de 42.360 pb. La eliminación de los 13.130 pb de
fragmento intermedio (el segmento comprendido entre los sitios BamH I que va
a ser sustituido por el inserto diana) deja dos brazos, los cuales, si se juntasen,
darían lugar a un genoma lineal de 29.230 pb.
a) Quiere preparar una reacción de ligación de 150 p,L. ¿Cuántos jxg de brazos
de inserto y vector deberían ser combinados para dar resultados óptimos?
b) ¿Cuántos microgramos de vector XEMBL3 deberían ser digeridos con BamH I
para dar lugar a la cantidad de brazos deseada?
Dado que queremos asegurar la formación de concatémeros lineales para
optimizar el paso de empaquetamiento/infección, j debería ser inferior a i. El
primer paso es calcular los valores j para los brazos \ (/brazos) e insertos (/insertos)*
La siguiente ecuación puede ser utilizada:
¡ = ( w ) extremos/m L
en la que yx es 3,22 x 1011 extremos/mL y, tal como se ha calculado anterior

mente, PMX = 3,2 x 107 g/mol.
El PM de los brazos de XEMBL3 unidos se calcula de la siguiente manera:
660 g/mol , ,
29.230 pb x ---- ------- = 1,93 x 107 g/mol
El valor/brazos puede ser calculado ahora mediante la sustitución de los valores

adecuados en la ecuación de determinación de j:
i7 g/m ol V ’5
/brazos = (3,22 x IQ11 extrem os/m L) (
1,93 x 107 g/m ol)
JhnmK — (3,22
Abrazos V
x 1011 extrem os/m
/
L) ( —-—----- ^ )
^ 8 /48x10 J 10
7brazos — (3,22 x 1011 extrem os/m L) (2,12)
/brazos — 6,83 x 1011 extremos/mL
Por lo tanto,y es igual a 6,83 x 1011 extremos/mL para los brazos unidos.
El PM de un inserto de 20.000 pb se calcula así:
660 g/mol 7 ,
20.000 pb x ---- ^ ---- = 1,3 x 107 g/mol
El valory¡nSertos puede ser calculado a continuación.
11 , A 2 x 107 g /m o lV ’5
Vinwtra = (3,22 x 10 extrem os/m L) --------- ^—-----
■
/,nsertos v ' \1,3 x 10 g/m oly
/insertos = (3,22 x 1011 extremos/mL)
./insertos = (3,22 x 1011 extrem os/m L) (3,8)
./¡nsertos = 1<22 x 1012 extremos/mL
Para que se pueda asegurar la producción de productos de ligación lineales, y

debe ser intencionalmente inferior a /. Maniatis et al. (1982) sugirieron que j
debería ser 10 veces inferior a /, de manera que
(/ = 1Q/)
Los valores de j para ambos brazos e inserto han sido calculados. Para asegu
rarnos más de que j será inferior a i, usaremos el mayor de los valores j , que en
este caso es ./¡nsertos- Si tenemos en cuenta que i = 10/, entonces tenemos
¡ = (10)(1,22 x 1012 extrem os/m L) = 1,22 x 1013 extremos/mL
Dado que / representa la suma de todos los extremos cohesivos en la reacción de

ligación (/' = /'insertos + brazos), la siguiente relación es cierta:
/ — (2A/0M¡nserto x 10-3 extrem os/m L) + (2A/0Mbrazos x 10-3 extremos/mL)
Tal como se ha discutido anteriormente, cuando se utiliza un vector derivado de

X, la concentración molar de brazos X debería ser el doble de la concentración
molar de inserto (/Wbrazos = 2Minseno). La ecuación anterior se convierte en
/' = (2A/oM¡nserto x 10 3 extrem os/m L) + (2No2Mmserto x 10-3 extremos/mL)
Esta ecuación puede ser reorganizada y simplificada para dar lugar a la siguiente
relación:
i = (2A/0Minserto + 2N02Mmseno) x 10~3 extremos/mL
i= (2/VoMinserto + 4A/0M¡nserto) x 10“ 3 extremos/mL
i —6A/oM¡nSerto x 10-3 extremos/mL

Se puede resolver M mseno dividiendo cada lado de la ecuación entre 6N0 x 10 -3
extremos/mL:
^ in s e r to = T 7 i . ; T
6No x 10 d extremos/mL
La utilización del valor que hemos calculado previamente para i (1,22 x
1013 extremos/mL) y del número de Avogadro para N0 nos da la siguiente
relación:
tt _ 1,22 x 1013 extremos/mL
inserto 6(6,023 x 1023) x (1 x 1 0 '3 extremos/mL)
1,22 x 1013 extremos/mL Q ..

“ ln s.n o = — ------T7 3 T-------------------- r ~ r = 3 . 4 X 1 < T 9 M
3,6 x 10 extremos/mL
Multiplicando la molaridad por el tamaño medio del inserto (20.000 pb) y el PM

promedio de un par de bases (660 g/mol/pb), obtenemos un valor de
concentración expresado en ng/mL. Los factores de conversión también son
utilizados para convertir litros en mililitros y g en ng. (Recordar también que la
molaridad [M ] es un término de concentración dado en moles/litro;
3,4 x 10- g M = 3,4 x 10“ 9 mol/L.)
, , 3,4 x 10_9moles 660 g/mol

x ng de inserto/mL = ------- ----------- x ------- ------x 20.000 pb
^ ' litro pb K
litro 1 x 106 ng de inserto
1.000 mL g
44.880 ng de inserto
x = ------------------------ = 44,9 ng de inserto/mL
1.000 mL '
La reacción de ligación, por tanto, debería contener inserto de ADN a una

concentración de 44,9 mg/mL. Para calcular la cantidad de inserto a añadir a
una reacción de 150 nU la siguiente relación puede ser utilizada. (Recordar que
1 m L e s equivalente a 1.000 nL.)
x ng de inserto 44,9 ng de inserto

150 nL - i .ooo nL
, . (44,9 ng de inserto) (150 nL) 6.735 ng de inserto

x ng de inserto - ^— —— --------------------— ---------— ------------
1.000 nL 1.000
= 6,74 ng de inserto
Por lo tanto, la adición de 6,74 ng de inserto de ADN a una reacción de 150 nL

dará lugar a una concentración de 44,9 ng inserto/mL.
Se ha determinado previamente que la molaridad de los brazos de vector \
debería ser equivalente a dos veces la molaridad de los insertos
(/Wbrazos = 2Minserto). La molaridad del fragmento inserto ha sido calculada como
3,4 x 10-9 M (tal como se ha determinado previamente). La molaridad de los
brazos, por tanto, es
M bnzos = (2) (3,4 X 1CT9 M) = 6,8 X 10~9 M

Así, los brazos de XEMBL3 deberían estar a una concentración de 6,8 x 10 -9 M.

Este valor es convertido a ng brazos/mL, tal como se muestra en el siguiente
cálculo. El término 29.230 pb representa el tamaño combinado de los dos
brazos X (véase el Problema 9.6):
, , , , 6,8 x 10-9 moles 660 g/mol

x ug de brazos/mL = -------- ------------ x ------^ -----x 29.230 pb
' litro pb K
litro 1 x 106 jig de brazos
1.000 mL g
, , 1,3 x 105 ug de brazos , ,

x jxg de brazos/mL = -------- 1 000 mL--------= ^ brazos/mL
Por lo tanto, los brazos X deberían estar a una concentración de 130 ng/mL. La
cantidad de brazos de XEMBL3 a añadir a una reacción de ligación de 150 nL
puede ser calculada mediante la siguiente relación:
x ng de brazos de XEMBL3 130 (xg de brazos de XEMBL3

150 (í L _ 1.000 jxL
. (130 ug de brazos de XEM BL3)(150 uL)

x u,g de brazos de XEMBL3 = ------ —------------------ --------- - -----—
py 1.000 \iL
= 19,5 ng de brazos de XEMBL3
Así pues, para obtener resultados óptimos, 19,5 ng de brazos de XEMBL3

deberían ser añadidos a 6,74 ng de inserto de ADN en la reacción de ligación
de 150 nL.
Ahora podemos calcular la cantidad de vector de ADN XEMBL3 necesaria para
obtener 19,5 ng de brazos de XEMBL3. Determinaremos primero el peso de un
genoma sencillo de X formado solamente por los dos brazos unidos. Después
calcularemos cuántos genomas están representados en 19,5 ng de brazos de
XEMBL3.
Tal como se menciona en el problema original, XEMBL3 menos el fragmento
intermedio mide 29.230 pb y esto representa un genoma. El peso de un genoma
de 29.230 pb se calcula así:
i 660 g/mol 1 x 1 0 6 ng
x ng/genoma = 29.230 pb x -----^ ----- x ---------- —
pb g
1 mol
6,023 x 1023 genomas
. 1 ,9 3 x 1 0 13n9 ,
x ng/genoma = -------------^------------= 3,2 x 10 " ng/genoma
p y/y 6,023 x 1023 genomas p y/y
Por lo tanto, cada genoma de 29.230 pb tiene un peso de 3,2 x 10 11 jxg.
El número de genomas representados en 19,5 (xg puede ser calculado ahora:
1 genoma „
19,5 ixg x ----------- r.i— = 6,1 x 1011 genomas
py 3,2 x 10 |xg y
Dado que un genoma de vector XEMBL3 dará lugar a un genoma de brazos X

con un tamaño de 29.230 pb, ahora necesitamos conocer cuántos microgramos
de ADN XEMBL3 no digerido son equivalentes a 6,1 x 1011 genomas. XEMBL3
tiene un tamaño de 42.360 pb. Podemos determinar qué peso tiene cada
genoma XEMBL3 según el siguiente cálculo:
660 g/mol 1 x 1 0 6 ixg

x p,g/genoma = 4 2 .3 6 0 pb x ---- ^ ---- x ------ ------
1 mol
2 , 8 x 1 0 13ng
x Lig/genoma = ------------ =------------= 4,6 x 10 - 1 1 ixg/genoma
p y/y 6,023 x 1023 genomas P y/y
Por lo tanto, cada genoma XEMBL3 tiene un peso de 4,6 x 10-11 (xg. La canti
dad de ADN XEMBL3 equivalente a 6,1 x 1011 genomas puede ser calculada
ahora:
4'^ X 1^-----— x 6,1 x 1011 genomas = 28,1 u,g de XEMBL3

genoma
Así, la digestión de 28,1 (xg de vector de ADN XEMBL3 generará 19,5 |xg de
brazos de vector.
10.3.2 E m p a q u e ta m ie n to d e g e n o m a s X re c o m b in a n te s
T ras la lig ació n d e u n inserto a los b ra zo s de u n v e c to r X y la concatem erizac ió n de
g en o m a s X re co m b in an tes, el A D N d eb e se r em p a q u etad o ju n to co n estructuras
p ro teic as del fa g o q u e h ac en d e ca b ez a y cola, co n v irtien d o al c o n ju n to en
u n id ad e s capaces d e in fec tar a células d e E. coli sensibles. E sto se co n sig u e
m ediante la a d ic ió n d el A D N X reco m b in an te a u n extracto pre p ara d o q u e con
tien e las p ro teín a s en zim áticas y estructurales necesarias p a ra el en sam blaje
co m p leto de partícu las víricas m aduras. L a m ez cla d e em p aquetam iento se in cu b a
a con tin u ac ió n c o n células h u ésp e d q u e perm iten la fo rm a ció n d e ca lv as e n u n a
p la c a d e a g a r (v é ase el C a p ítu lo 4 ). S e p u ed e an a liz ar la pre sen cia d e los clones
d esead o s en las calvas. L a m e d id a d e la efectividad d e estas reacc io n es se den o

m in a eficiencia de empaquetamiento y pu ed e se r ex p resad a co m o el nú m ero de
ca lv as gen e rad a s a p a rtir d e u n nú m ero determ in ad o d e g en o m a s d e fa g o (P F U ,
u n id ad e s fo rm a d o ras d e calvas) o b ie n co m o el nú m ero d e calvas p o r m icrogram o
d e A D N d e fago.
L o s ex tracto s d e em p a q u etam ien to o b ten id o s co m e rcialm en te p u ed e n ten e r
eficiencias d e em p a q u etam ien to p ara A D N X co n catem érico n o rm al (wild-type)
d e entre 1 x 107 y 2 x 109 PFU/fxg A D N .
E n el sig u ie n te p ro b lem a se ex p lica u n m éto d o p a ra c a lcu lar este valor.
P ro b le m a 1 0 .7 La reacción de ligación de 150 (xl descrita en el Problema 9.6

se añade a un extracto de empaquetamiento de 450 jil. Tras un período de
incubación que permita el empaquetamiento del genoma recombinante,
0,01 mL son retirados y diluidos en un volumen total de 1 mL de tampón de
dilución X. De ese tubo, 0,1 mL son retirados y diluidos en un volumen total
de 10 mL. Un mL es retirado de la última dilución y diluido en un volumen
total de 10 mL de tampón de dilución. Un décimo de mL de este último tubo es
sembrado en una placa junto a 0,4 mL de E. coli K-12 sensible a la infección por
X. Tras la incubación de la placa, se observan 813 calvas. ¿Cuál es la eficiencia de
empaquetamiento?
La reacción de empaquetamiento se diluye de la siguiente manera:
0,01 mL 0,1 m L 1 mL
------- -— x ------- - x ------- - x 0,1 mL sembrados
1 mL 10 mL 10m L
Al multiplicar todos los numeradores juntos y todos los denominadores juntos

se obtiene la dilución total:
0,01 x 0,1 x 1 x 0,1 1 x 10~4 mL 6 ,

- = 1 x 10~6 mL
1 x 10 x 10 100
La concentración de fago viable en la mezcla de empaquetamiento (expresada

como PFU/mL) se calcula como el recuento de calvas en la placa dividido entre la
dilución total:
813 PgU = 8,13 x 108 PFU/m L

1 x 10~6 mL '
Por lo tanto, la mezcla de empaquetamiento contiene 8,13 x 108 PFU/mL.

El número total de PFU en la mezcla de empaquetamiento se calcula multipli
cando la concentración anterior por el volumen de la reacción de empaqueta
miento (volumen de la mezcla de empaquetamiento = 150 |iL reacción de
ligación + 450 p,L extracto de empaquetamiento = 600 p l [equivalente a
0,6 mL]):
8,13 x 108 PFU

<0,6 mL = 4,88 x 108 PFU total
En el Problema 10.6, se determinó que 6,1 x 1011 genomas podían potencial

mente ser construidos a partir de los brazos de XEMBL3 añadidos a la reacción. El
porcentaje de estos potenciales genomas que realmente llegan a empaquetarse
en forma de viriones viables puede ser calculado dividiendo el título de la
mezcla de empaquetamiento entre el número de genomas potenciales y multi
plicando por 100:
4,88 x 108
—---------- r r x 100 = 0,08%
6,1 x 1011
Por lo tanto, 0,08% de los potenciales genomas X han sido empaquetados.

La eficiencia de empaquetamiento puede ser calculada como PFU por micro-
gramo de ADN X recombinante. El promedio de genoma de fago recombinante
debería corresponder al tamaño de los brazos de XEMBL3 (29.230 pb) + el
tamaño promedio del inserto (20.000 pb) = 49.230 pb. El peso de cada genoma
recombinante de 49.230 pb puede ser calculado multiplicando el tamaño del
genoma recombinante por el PM de cada pb y utilizando un factor de
conversión que incluye el número de Avogadro:
660 g/m ol 1 x 1 0 6 ug 1 mol

49.230 pb x ----- zL------x ------------- ™ x ------------ =-----------
pb g 6,023 x '\0¿ i genomas
3,25 x 1013 ug
= ------------ ^------------= 5,4 x 10 ug/genoma
Por lo tanto, cada genoma recombinante de 49.230 pb tiene un peso de

5,4 x 10-11 ^9- Si todos los 6,1 x 1011 posibles genomas capaces de ser cons
truidos a partir de los brazos de XEMBL3 acabaran siendo genomas de
49.230 pb, la cantidad total de genomas recombinantes (en ng) sería
n 5 ,4 x 1 0 -11ng
6,1 x 10 genomas x -----------------= 32,9 ug
genoma
Por lo tanto, si todos los posibles genomas son construidos y son híbridos
recombinantes con insertos de 20.000 pb, tendrían un peso total de 32,9 ng*
En la mezcla de empaquetamiento se generó un total de 4,88 x 108 virus
infectivos. La concentración en PFU/ng se obtiene dividiendo el número total
de fagos presente en la mezcla de empaquetamiento entre la cantidad total

teórica de ADN recombinante:
4,88 x 1 0 s PFU 7 r\i-i i

32,9 M — 1,5 x 10 PFU/ng
De este modo, la eficiencia de empaquetamiento de los genomas recombinan

tes es 1,5 x 107 PFU/jig.
Los extractos de empaquetamiento de fuentes comerciales pueden llegar a
tener eficiencias del orden de 2 x 109 PFU/jxg. Estas eficiencias son normal
mente determinadas usando un ADN X wild-type en forma de concatémeros, es
decir, el sustrato adecuado para el empaquetamiento. Existen numerosas razo
nes por las que un experimento de empaquetamiento que utilice ADN recom
binante obtenido a través de una reacción de ligación no sea tan eficiente.
Primero, la reacción de ligación puede no tener una eficiencia del 100% debido
al deterioro de los extremos cohesivos o a una actividad ligasa reducida.
Segundo, no todos los productos ligados pueden ser empaquetados; sólo los
genomas con un tamaño mayor del 78% o menor del 105% del tamaño de X
wild-type pueden ser empaquetados. Esto significa que XEMBL3 solamente
puede acomodar fragmentos de aproximadamente 8.600 a 21.700 pb.
Aunque la ligación de los brazos de XEMBL3 pueda producirse con fragmentos
de otros tamaños, éstos no serán empaquetados en partículas de fago comple
tas capaces de infectar a una célula.
10.3.3 Lig a ció n con p lásm id o s

L a ligación de insertos de A D N en u n vector d e clonación derivado de bacteriófago
X requiere la form ación d e concatém eros lineales form ados p o r bra zo izquierdo X :
inserto : bra zo derecho X : bra zo izquierdo X : inserto : bra zo derecho X : brazo
izquierdo X : inserto : bra zo derecho X, etc. P ara q u e esta reacción se v e a favore
cida, i tien e que se r m ucho m ay o r q u e j (i 3> j). E n contraste, para la ligación con un
p lásm ido se requieren d os tipos d e procesos. Prim ero, u n a m olécula h íb rid a lineal
debe se r g en e rad a p o r ligación d e u n extrem o d el fragm ento diana a u n extrem o
com plem entario del plásm ido linearizado. S egundo, el otro extrem o d el fragm ento
diana debe ser ligado a l otro extrem o del v ec to r p ara crear u n plásm ido recom bi
nante circular. E l p roceso d e circularización es esencial y a q u e solam ente las
m oléculas circulares p o drán transform ar a E. coli eficientem ente. L as condiciones
d e ligación d eben se r elegidas, p o r tanto, para q u e favorezcan procesos d e ligación
interm olecular seguidos d e p rocesos d e ligación intram olecular.
M aniatis e t al. (1 9 8 2 ) su g iriero n q u e los resultados ó p tim o s co n p lásm id o s se
o b tien en c u a n d o i es d e d o s a tres v ec es m a y o r q u e j . Tal relación fa v o rec erá la
lig ació n in term o lec u la r p ero d eja rá q u e s e p ro d u z ca la circ u lariza ció n de
la m o lécu la recom binante. A d em ás, M aniatis e t al. reco m en d a ro n q u e la con
cen trac ió n d e los extrem os d e inserto (¿inserto) fu e ra ap ro x im a d am en te el doble
d e la c o n c en tra ció n d e los ex tre m o s d e p lásm id o linearizado (¿inserto = 2¿vector)-
E l sig u ien te p ro b lem a ilustrará los cálculos in v o lu cra d o s en la dete rm in a ció n de
las co n c en tra cio n es óp tim a s de inserto y plásm id o nec esario s p a ra la construcción
d e clo n e s recom binantes.
P ro b le m a 1 0 .8 El plásmido de clonación pUC19 (2.686 pb) se va a cortar en

su único sitio fcoR I situado dentro de la región de clonación múltiple. Este corte
supondrá la linearización del vector. El inserto a clonar es un fragmento
generado por digestión con EcoR I que mide 4.250 pb. ¿Qué concentración de
vector e inserto debería usarse para obtener un rendimiento óptimo de
recombinantes?
Calcularemos primero los valores de j para ambos el vector y el vector + inserto.
Éstos se determinan mediante la siguiente ecuación:
7=Jx( w ) extremos/m L
Para usar esta ecuación para el vector, debemos calcular primero su PM. Esto
se consigue multiplicando su tamaño (en pb) por el factor de conversión
660 g/mol/pb, tal como se muestra en el siguiente cálculo:
660 g/m ol ,
2.686 pb x -----^ ---- = 1,77 x 106 g/mol
Por lo tanto, el vector pUC19 tiene un PM de 1,77 x 106 g/mol.

Anteriormente hemos determinado que yx tiene un valor de
3,22 x 1011 extremos/mL y que el PM de lambda es igual a 3,2 x 107 g/mol.
La utilización de estos valores en la ecuación que permite calcular j nos da el
J= ^ ( w ) extremos/m L
„n / . / 3 , 2 X 107 g/mol V '5

Jvortnr = 3,22 x 10" extremos/mL ----------- ^ ------)
-,vector ' \1,77 x 10 g/m oly
/vector = 3,22 x 1011 extrem os/m L (18,1)1,s

= 3,22 x 1011 extrem os/m L (77) = 2,5 x 1013 extremos/mL
De este modo, el valor de j para este vector es 2,5 x 10 13 extremos/mL. El valor j

para el intermediario lineal de ligación formado por la unión de un extremo del
inserto con un extremo del plásmido linearizado también puede ser calculado. El
PM del intermediario de ligación (vector + inserto) se calcula de la siguiente
forma:
(2.686 pb + 4.250 pb) x g6 0 9 / mo1 _ 4(58 x 106 g/ mo|
Se puede calcular el valor j para el producto de ligación intermedio usando su

PM:
, , / 3 , 2 X 107 g/m ol V ’5
= 3,22 x 1 0 " extrem o s/m L^ ^ ^ j
./'vector+inserto ~ 3,22 x 10 extremos/mL (6,99)

= 3,22 x 1011 extremos/mL (18,48) = 5,95 x 1012 extremos/mL
Así, el intermediario de ligación tiene un valor j de 5,95 x 1012 extremos/mL.

Nótese además que el valor j para el intermediario de ligación
(/' = 5,95 x 1012 extremos/mL) es inferior al del vector linearizado aislado
{¡ = 2,5 x 1013 extremos/mL); las moléculas más pequeñas tienen valores j
más grandes y pueden volverse circulares con más eficiencia que las molécula
de ADN de tamaño mayor.
Para obtener resultados óptimos, prepararemos una reacción tal que i es tres
veces mayor que j vect0r (/' = 3/vector). Hemos calculado que Rector
es 2,5 x 1013 extremos/mL. Por lo tanto, queremos que / sea igual a tres veces
la cantidad de 2,5 x 1013 extremos/mL:
i = 3 x (2,5 x 1013 extrem os/m L) = 7,5 x 1013 extremos/mL
Además, para favorecer la generación del recombinante deseado, /'inserto debería

ser igual a dos veces /vector (/inserto:í vector = 2, o iinseno = 2/vector). Dado que / es la
concentración total de extremos complementarios en la reacción de ligación,
/¡nserto + 'vector debe ser igual a 7,5 x 1013 extremos/mL. Dado que /¡nSerto =
2/'vector- tenemos
2/'vector + /vector = 7,5 x 1013 extremos/mL
que es equivalente a
3/'vector = 7,5 x 1013 extremos/mL

7,5 x 1013 extrem os/m L ,, . .
/vector = ------------- --------- ---- = 2,5 x 10 extremos/mL
10.3 Ligación 333
Por tanto, /vector es equivalente a 2,5 x 1013 extremos/mL. Dado que queremos
que /¡nserto sea dos veces mayor que /vector, tenemos
/’inserto = 2 x (2,5 x 1013 extrem os/m L) = 5,0 x 1013 extremos/mL
De este modo /¡nserto es equivalente a 5,0 x 1013 extremos/mL. Para calcular la

molaridad necesaria de moléculas de ADN en la reacción de ligación, usaremos
la ecuación
i = 2N0M x 10-3 extremos/mL
Esta expresión puede ser reorganizada para obtener la molaridad (M):
M = ------------ ^ ---------- -—
2N0 x 10 á extremos/mL
Para el vector, M se calcula así:
AA _ 2,5 x 1013 extremos/mL

vector “ 2(6,023 x 1023)(1 x 10 3 extremos/mL)
2,5 x 1013 8
or = TTlTío5T = x io_ m
Por lo tanto, la molaridad del vector en la reacción de ligación debería ser

2,1 x 10-8 M. La conversión de molaridad a moles/litro da lugar al siguiente
resultado:
2,1 x 10- 8 M = 2,1 x 10“ 8 m ol/L
Una cantidad de vector (en ng/mL) debe ser ahora calculada a partir de la
concentración en moles/litro.
, , 2 , 1 x 1 0 -8 mol 660 g/mol

x ng de vector/m L = -----------------x ----- ^ ---- x 2.686 pb
L 1 x 106 ^ 9 de vector
1.000 mL g
, . 3,7 x 104 ug de vector , , .

x ng de vector/m L = -------- 1 000 mL--------= ^ vector/m L
Por tanto, en la reacción de ligación, el vector debería estar a una concentración

de 37 ng/mL. La reacción de ligación va a tener un volumen final de 50 nL. Se
puede usar una regla de tres para determinar cuántos microgramos de vector
se deben añadir a la reacción de 50 nL.
x ng de vector _ 37 ng de vector
50 nL 1.ooo nL
(50 liL )(37 ixq de vector)

x = -— — — --------- - = 1,9 ng de vector
1.000 \iL
Así, se deberían añadir 1,9 n9 de vector digerido en un volumen total de 50 nL

de reacción de ligación.
Se ha calculado que /¡nserto debería estar a una concentración de
5,0 x 1013 extremos/mL. Esto se puede convertir a un valor de molaridad con
el mismo método que se utilizó para /vector, según la siguiente ecuación:
2/Vo x 10 3 extremos/mL
La sustitución en esta ecuación de los valores calculados da el siguiente resul

tado:
_ 5,0 x 1013 extremos/mL

2 x (6,023 x 1023) x (1 x 10-3 extremos/mL)
5,0 x 1013
r = 4 ,2 x 10~8 M
1,2 x 1021
Por lo tanto, el inserto debería tener una concentración de 4,2 x 10“ M. Estoes
equivalente a 4,2 x 10-8 moles de inserto/L. La conversión de moles de
inserto/L a ng inserto/mL se realiza de la siguiente forma:
/ . 4 , 2 x 1 0-8 mol 660 g/m ol ,

x ng de inserto/mL = ------ -----------x ----- — ---- x 4.250 pb
1L 1 x 106 ng de inserto
1.000 mL
1,2 x 105 |xg de inserto , , .

x ng de inserto/mL = -------- 1 000 mL-------- = ^ inserto/mL
Esto es equivalente a 120 ng de ¡nserto/1.000 nL. Podemos determinar la cantidad

de inserto a añadir a una reacción de 50 nL mediante la siguiente regla de tres:
x ng de inserto 120 ng de inserto

50 nL - i .ooo nL
(50 nL) x (120 ng de inserto)

x = -— — — --------------------- - = 6 ng de inserto
1.000 nL
Por lo tanto, 6 ng del fragmento de 4.250 pb deberían ser añadidos a 50 nL de

reacción de ligación.
10.3.4 Eficiencia de transformación
T ras la lig ació n d e u n fragm ento d e A D N a u n plásm id o , la m o lécu la re com binante
d eb e se r introducida, en u n pro c eso d en o m in ad o tr a n sfo rm a c ió n , en u n a b ac teria
h u ésp e d en la cu a l p u e d a replicarse. L o s p lásm id o s u tiliz ad o s p a ra la clo n ació n
co ntienen u n g en q u e p ro p o rcio n a resisten c ia a alg ú n antib ió tico q u e p erm ite la
selec ció n d e las células transform adas. L a eficien cia d e tran sform ación es u n a
m ed id a c u a n tita tiv a d el n ú m ero de células q u e inco rp o ran el plásm id o . Se ex p resa
co m o tran sfo rm an tes p o r ng de A D N de plásm ido. S u cá lcu lo vien e ilustrado en el
sig u ien te problem a.
P ro b le m a 1 0 .9 Una reacción de ligación de 25 |xL contiene 0,5 ng de ADN

de un plásmido con ApR (resistencia a la ampicilina). 2,5 nL de la reacción de
ligación son diluidos en agua estéril en un volumen total de 100 nL. Diez ni de la
dilución son añadidos a 200 nL de células competentes (células preparadas para
la transformación). La mezcla de transformación es expuesta brevemente a un
choque térmico para aumentar la incorporación de plásmido, y a continuación
1.300 nL de medio de crecimiento son añadidos. La mezcla se incuba durante
60 min para permitir la expresión fenotípica del gen de resistencia a la ampicilina.
Veinte nL son sembrados en una placa que contiene 50 ng/mL de ampicilina y la
placa es incubada durante 18 h a 37 °C. Al día siguiente, 220 colonias aparecen
en la placa. ¿Cuál es la eficiencia de transformación?
El primer paso en el cálculo de la eficiencia de transformación es determinar
cuántos microgramos de ADN de plásmido se encuentran en los 20 nL de
muestra sembrada en la placa de ampicilina. La reacción de ligación original
de 25 nL contenía 0,5 n9 de ADN de plásmido. Multiplicaremos esta
concentración por las diluciones y la cantidad sembrada para llegar a la cantidad
de ADN en los 20 nL utilizados para la siembra.
0,5 ng de ADN de plásmido 2,5 nL

x ng de ADN de plásmido =
25 nL 100 nL
250 ng de ADN de plásmido

x ng de ADN de plásmido =
3.750.000
= 6,7 x 10 5 ng de ADN de plásmido
Por lo tanto, los 20 nL de volumen sembrado en la placa de ampicilina contenían

6,7 x 10-5 ng de ADN plasmídico. La eficiencia de transformación es a
continuación calculada como el recuento de colonias dividido entre la cantidad

de ADN plasmídico presente en ese volumen de siembra:
220 transformantes
eficiencia de transformación =
6,7 x 10“ 5 ng de ADN
3,3 x 106 transformantes
ng de ADN
Así, la eficiencia de transformación es 3,3 x 106 transformantes/ng ADN.

Las células competentes preparadas para la transformación pueden ser com
pradas de casas comerciales y pueden mostrar eficiencias de transformación
mayores que 1 x 109 transformantes/ng ADN, medición hecha utilizando un
plásmido superenrollado. Cabe destacar que la adición de más de 10 ng de
plásmido a una alícuota de células competentes puede resultar en la saturación
y puede, de hecho, reducir la eficiencia de transformación.
10.4 L I B R E R ÍA S G E N Ó M IC A S : ¿ C U Á N T O S C L O N E S
S O N N E C E S A R IO S ?
E l g e n o m a h a p lo id e h u m an o tien e u n tam año apro x im a d o d e 3 x 109 p b , distri-
b u id o en 23 crom osom as. E l re to d e co n stru ir u n a lib rería reco m b in an te a p artir de
u n g e n o m a de este tam añ o ra d ic a en crear su ficie n te n ú m ero d e clo n e s com o para
q u e las ex p e ctativ as d e q u e la lib rería c o n te n g a el seg m en to d e A D N con el gen
p a rtic u la r d e interés sea n ra zonables. ¿C u án to s clones se n ec esitan crear p ara
s atisfac er esta ex p e ctativ a? L a re sp u esta d ep e n d e d e d os pro p ied a d es: 1) el
tam añ o d el g e n o m a q u e v a a se r fragm entado p ara la clo n a ció n y 2) el tam año
m ed io d e lo s fragm entos. C lark y C arb o n (19 7 6 ) se basa ro n en la d istrib u ció n de
P o isso n p a ra g en e rar u n a fó rm u la q u e p u ed e se r u tiliz ad a p a ra estim ar la p ro b a
b ilid a d d e en c o n trar u n c lo n p a rtic u la r d en tro d e u n a lib rería reco m b in an te g en e
ra d a aleatoriam ente. L a relación d escrib e el nú m ero d e clo n e s in dependientes, N,
n ecesarios p a ra ais la r u n seg m en to d e A D N específico co n pro b a b ilid ad P. L a
fó rm u la es la sig u ien te
In (1 - P)
N
d o n d e / es el tam añ o m edio d el inserto clonado, en p b , y G es el tam año del

g e n o m a diana, en pb.
10.5 Librerías de ADNc: ¿cuántos dones son suficientes? 337
P ro b le m a 1 0 .1 0 En el Problema 9.6, XEMBL3 se usó como vector para clonar

fragmentos de 20.000 pb generados a partir de una digestión parcial de
genoma humano con Sou3A1 (3 x 109 pb). Deseamos aislar un gen contenido
completamente en un fragmento de 20.000 pb. Para tener una probabilidad
del 99% de aislar este gen en la librería genómica recombinante llevada a
cabo en XEMBL3, ¿cuántos clones independientes deben ser analizados?
S o lu c ió n 1 0 .1 0
Para este problema, P = 0,99 (99% de probabilidad), I = 20.000 pb y G = 3 x
109 pb. Usando estos valores en la ecuación anterior obtenemos el siguiente
resultado:
ln (1 - 0,99)
(2 x 104 p t A l
I
; - l ^3 x lo 9 p b y j
ln (0,01) ln 0,01 -4,61

N = — ----- — — -----T- - -------- ------- -- -------------- t - 688.000
In (1 - 6,7 x 10"6) ln 0,9999933 - 6 ,7 x 10~6
Por lo tanto, existe una probabilidad del 99% de que el gen de interés pueda ser
encontrado entre los 688.000 fragmentos independientes de genoma humano
clonados en XEMBL3.
Esta estimación, por supuesto, es una simplificación. Asume que todos los clones
están representados de forma igual. Para que esto ocurra, el genoma debe ser
fragmentado aleatoriamente en segmentos de tamaños uniformes, todos los
segmentos deben poder ser ligados a vectores con igual probabilidad y todos
ellos deben poder ser introducidos de forma viable en células huésped. Cuando
se utilizan endonucleasas de restricción para generar los fragmentos inserto,
esto no siempre es posible; algunas regiones del ADN genómico pueden no
contener el sitio de reconocimiento de una enzima particular en muchos miles
de pb.
10.5 L I B R E R ÍA S D E A D N c : ¿ C U Á N T O S C L O N E S SO N
S U F IC I E N T E S ?
D iferentes tejid o s ex p resan diferente genes. E xisten m ás d e 500 .0 0 0 m oléculas de
A R N m en la m ay o r p arte d e células d e m am íferos, las cu a les re p rese n ta n la
ex presión d e tan to co m o 3 4.000 genes diferentes. L o s A R N m p re sen tes en u n
tejid o p a rtic u la r p u e d e n se r co n v e rtid o s a copias d e A D N c g ra cias a la ac ció n de
u n a tran sc rip tasa re v ersa (q u e c o n v ie rte A R N m en A D N cs) y a con tin u ac ió n u n a
A D N p o lim e rasa (q u e co n v ie rte el A D N cs en m oléculas d e c a d e n a doble). L a
p re p ara ció n d e u n a lib rería reco m b in an te a p a rtir d e u n a p re p ara ció n d e A D N c
p ro p o rcio n a al in v estig ad o r u n a sec ció n tran sv e rsal d e lo s gen e s q u e se expresan
en u n tejido específico.
A lg u n o s gen e s p u ed e n estar ex p resad o s a u n alto n iv el en u n a c é lu la y ser

re sp o n sab les d e tan to co m o el 9 0 % d el A R N m to tal en d ich a célula. P u ed e ser
b astan te fácil ais la r clo n e s de A D N c de los A R N m m ás ab u n d a n tes. H a sta u n 30%
d el A R N m d e alg u n a s células, n o ob stan te, p u ed e e s ta r co m p u e sto d e transcritos
g en e rad o s p o r gen e s q u e se ex p resan a m u y b a jo nivel, d e m an e ra q u e ca d a tip o de
transcrito pu ed e estar p re sen te en can tid a d es in feriores a 14 co p ia s p o r célula. U n a
lib rería d e A D N c no está co m p leta si no co n tien e su ficie n te s clones co m o p ara que
c a d a tip o d e A R N m en la c é lu la esté representado.
E l n ú m ero de clones q u e se nec esita ex a m in a r p a ra o b ten e r el reco m b in an te de
u n A R N m raro a cie rta pro b a b ilid ad v ien e dete rm in a d o p o r la ecuación
N =
en la q u e N es el n ú m ero d e clo n e s de A D N c en la librería, P es la p ro b a b ilid ad de

q u e ca d a tip o d e A R N m esté represe n ta d o en la lib rería al m en o s u n a v e z (P es
n o rm alm en te estab le cid a com o 0,99; u n a pro b a b ilid ad del 9 9 % d e e n c o n trar el
A R N m raro rep rese n ta d o en la lib rería d e A D N c), n es el n ú m ero de m oléculas del
A R N m m ás raro en u n a cé lu la y T es el n ú m ero to tal d e m oléculas d e A R N m en
u n a célula.
P ro b le m a 1 0 .11 El ARNm más raro en una célula de un tipo de tejido

particular tiene una concentración de cinco moléculas por célula. Cada célula
contiene 450.000 moléculas de ARNm. Se desarrolla una librería de ADNc a partir
de ARNm aislado de este tejido. ¿Cuántos clones se necesitará examinar para
tener el 99% de probabilidad de encontrar al menos un recombinante que
contenga una copia de ADNc del ARNm más raro?
S o lu c ió n 10.11
Para este problema, P = 0,99, n = 5 y T = 450.000. Colocando estos valores en la
ecuación anterior nos da
*)]
In (0,01) -4,61
N = — ----- — — ---- ¡r- ---------------- jr - 420.000
In (1 - 1,1 x 10~5) -1 ,1 x 10“ 5
Por lo tanto, en una librería de ADNc de 420.000 clones independientes, un clon

debería representar al ARNm más raro de dicho tipo celular.
10.6 Librerías de expresión 339
10.6 L I B R E R ÍA S D E E X P R E S IÓ N
D iferentes v ecto res d e clo n a ció n h an sido diseñ ad o s co n ele m e n to s gen é tic o s que
p erm iten la ex p resió n de genes exógenos. E sto s ele m e n to s no rm alm en te incluyen
las señ ales d e iniciación d e tran sc rip ció n y traducción. P ara m u ch o s v ecto res de
expresión, el sitio d e clo n a ció n se e n c u en tra e n p o sició n m ás 3 ’ q u e la señal
d e inicio ATG . P o r ejem plo, u n a v ersió n tru n c a d a d el g en q u e c o d ific a p a ra la
b eta -g alac to sid a sa d e E. coli se u tiliz a a m en u d o co m o fu e n te d e señales de
trad u c ció n . L a in serc ió n d e u n frag m en to d ia n a en la o rien ta ció n y p a u ta d e lectura
ad e cu a d as re su lta en la p ro d u c ció n d e u n a p ro teín a d e fu sió n d e lo s pro d u c to s
co dificad os p o r el g en tru n ca d o d el v e c to r y el g en ex ó g e n o insertado.
L as librerías de ex p resió n pu ed en s e r co n stru id as directam ente a p a rtir d e A D N
g en ó m ico b ac terian o d ad o q u e los genes m icro b ian o s se ca rac teriza n p o r no
d isp o n er d e intrones. L as librerías d e ex p resió n d e gen e s d e m am íferos, sin
em bargo, se con stru y e n m ejo r co n A D N c, el cu a l está libre d e secuencias
intrónicas p o r estar gen e rad o a p a rtir d e A R N m procesado.
L a ex p resió n no d ep e n d e d e la fu e n te d el frag m en to d ian a, sino d e q u e la
p o sició n del inserto esté en la o rien ta ció n y p a u ta d e lec tu ra co rrectas en relación a
lo s elem entos d e ex p resió n del vector. L a pro b a b ilid ad d e o b ten e r u n c lo n recom
b in an te con el inserto c o lo c ad o co rrec tam en te en el v ec to r d e ex presión v ien e
dete rm in a d a p o r la ecu ac ió n
p tam añ o d e la s ec u en cia co d ific an te (e n kb)

tam añ o del g en o m a (en k b ) x 6
E l denom inador en esta ecuación contiene el factor 6 dado que existen seis
posibles posiciones con las que el fragm ento diana pu ed e quedar insertado en
relación a la pauta d e lectura abierta del vector. E l fragm ento d ian a puede estar
insertado en orientación «sentido» o «antisentido» y en cualquiera d e las tres posibles
pautas d e lectura. U n a d e las seis posibles posiciones debería ser productiva.
L a pro p o rció n d e re com binantes p o sitiv o s q u e ex p resan el g e n e n el fragm ento
d ian a v ie n e dete rm in a d a p o r la ex p resió n \/P.
E sta ecuación es sólo u n a estim ación. P ara fragm entos obtenidos d e A D N
genóm ico roto aleatoriam ente, se obtienen resultados óptim os si el tam año d e los
fragm entos clonados es, d e form a som era, V2 d el tam año de la secuencia codificadora
del gen d e interés, porque es m enos probable que los fragm entos m ás pequeños
contengan señales de term inación en posición 5 ’ respecto a la secuencia codificadora.
P ara la clonación d e fragm entos d e grandes genom as que contienen m uchos intrones,
com o es el caso del g en o m a hum ano, se debe exam inar u n gra n núm ero de clones.
P ro b le m a 1 0 .1 2 Un gen de E. coli tiene una secuencia codificante que

ocupa 2.000 pb. Se pretende aislar a través de un experimento de clonación
en el que fragmentos de ADN genómico rotos aleatoriamente son insertados en
un vector de expresión. ¿Qué proporción de recombinantes se esperaría que
dieran lugar a una proteína de fusión con el vector?
Dos mil pb es equivalente a 2 kb:
1 kb
2.000 pb x -------- - = 2 kb
K 1.000 pb
El genoma de E. coli tiene un tamaño de 4.640.000 pb. Esto es equivalente a

4.640 kb. La colocación de estos valores en la ecuación nos da
2 kb 2 c
P = -------- — --- - = --------- z = 7,1 x 10-5
(4.640 kb) x 6 2 , 8 x 1 04
Al calcular el recíproco de este valor, obtenemos el siguiente resultado:
\ = ----- ----- s = M x 104

P 7,1 x 10-5
Por lo tanto, uno de aproximadamente cada 14.000 clones tendrá el inserto en la

orientación adecuada como para producir una proteína de fusión.
107 A N Á L IS IS D E L I B R E R ÍA S R E C O M B IN A N T E S
P O R H IB R ID A C IÓ N A S O N D A S D E A D N
Tanto las c a lv as en u n a ca p a d e crecim ien to b ac terian o co m o las co lo n ias d isp er
sas e n u n a p la c a d e ag a r p u ed e n s e r ex a m in a d as en b u s c a d e clo n e s q u e con te n g an
u n frag m en to d ian a d e interés m ed ian te la h ib rid ac ió n d e u n a so n d a d e A D N
m arcada. E n esta téc n ic a, las calvas o co lo n ias son transferidas a m em branas de
n itro ce lu lo sa o nailon. U n a v e z el A D N d e los clo n e s re co m b in an tes se fija a
la m em b ra n a (p o r la alta tem p eratu ra de u n h o m o o m ed ian te fijac ió n p o r U V ), la
m em b ra n a es in cu b ad a en u n a so lu ció n d e h ib rid ac ió n q u e co n tien e u n a so n d a de
A D N m arc ad a co n u n isótopo radiactivo. L a so n d a está d iseñ ad a p a ra hibridarse
específicam ente a la sec u en cia del frag m en to d ia n a de interés. T ras la incubación
con la so nda, se la v a la m em b ra n a p a ra elim in ar la so n d a u n id a d e form a
inesp ec ífica y se ex p o n e la m em b ra n a a u n a p e lícu la d e ra y o s X p a ra identificar
aq u ello s clo n e s h ib rid ad o s a la sonda.
L a h ib rid ac ió n d e la so n d a co n u n a sec u en cia co m p lem e n ta ria sigue u n a
cin é tic a d e aso c ia ció n /d iso ciació n y está in flu en c ia d a p o r el tam añ o d e la sonda,
el co n te n id o en G /C , la tem p eratu ra, la co n c en tra ció n d e sales y la ca n tid a d de
fo rm a m id a en la so lu ció n d e hib rid ació n . E sto s fa cto re s afecta n a la cap ac id a d
d e hibridación d e la siguiente m anera: u n m en o r contenido en G /C , u n m ayor
tam año d e la sonda, u n a m en o r tem peratura y m ayores concentraciones d e sales
favorecen la asociación entre la so n d a y la diana. L a form am ida se u sa en la solución
d e hibridación co m o solvente. A ctú a inhibiendo el apaream iento intracatenario.
10.7 Análisis de librerías recombinantes por hibridación a sondas de ADN 341
L a estabilidad d e la in tera cció n en tre u n a so n d a h ib rid ad a a u n a sec u en cia

d ian a, d ad o q u e está in flu en c ia d a p o r estas variables, se d ete rm in a p o r el efecto de
las m ism as so b re la tem p eratu ra d e fusión ( T ^ d e la so nda, la tem p eratu ra a la cual
la m ita d d e la so n d a se h a diso ciad o d e su s ec u en cia com plem entaria. L a
e stim ación d e la tem p eratu ra d e fu sió n d e la so n d a es im portante a la h o ra de
o p tim iz ar la reacción d e h ibridación. D a v is e t al. (19 8 6 ) reco m ien d an q u e la
tem p eratu ra a la cu a l se llev a a cabo la h ib rid ac ió n (T¡) d eb e ría e s ta r 15 °C p o r
d eb a jo d e la Tm:
T¡ = Tm - 15 °C
Tm se ca lcu la utiliz an d o la ecuación
Tm = 16,6 log [M\ + 0 ,4 1 [P Gc] + 81,5 - Pm - B /L - 0 ,65 [P/]
en la q u e M e s la co n c en tra ció n m o lar d e N a , ha sta u n m áx im o de 0,5 M ( I X SSC

co n tien e 0 ,1 6 5 M N a +); P qc es el p o rc en taje d e b ase s G y C en la so n d a (entre
el 30 y el 70% ); Pm es el p o rc en taje d e b a se s n o com plem entarias, si se conoce
(c ad a p o rc en taje d e fa lta d e com p lem e n ta ried a d d is m in u irá la Tm ap ro x im a d a
m en te 1 °C ); P f es el p o rc en taje d e form am ida; B es 675 (p a ra so n d as sintéticas
co n tam añ o d e h a s ta 100 nt), y L = tam añ o d e la so n d a en nt.
E n el ca so d e so n d as co n tam añ o su p erio r a 100 b ase s, la s ig u ie n te fórm ula
p u ed e se r u s a d a p a ra d ete rm in a r la Tm:
Tm = 81,5 °C + 16 ,6 (/o g [N a+ ]) + 0 ,4 1 (% G C )
—0 ,6 3 (% d e form am ida) — 6 0 0 ¡L
P a ra estas so n d as d e m a y o r tam añ o , la h ib rid ac ió n se llev a a ca b o a u n a

tem p eratu ra d e 10 a 15 °C p o r d eb a jo d e la Tm.
P ro b le m a 1 0 .1 3 Una sonda marcada tiene la siguiente secuencia:
5-GAGGCTTACGCGCATTGCCGCGATTTGCCC
ATCGCAAGTACGCAATTAGCAC-3'
Será usada para detectar un clon positivo a partir de placas con calvas de XEMBL3
recombinante transferidas a una membrana de nitrocelulosa. La hibridación
se llevará a cabo en 1X SSC (0,15 M NaCI, 0,015 M Na3Citrato*2H20 ) con un
50% de formamida. ¿A qué temperatura debería llevarse a cabo la hibridación?
(Asuma que no existe falta de complementariedad entre las secuencias de la
sonda y la diana.)
La sonda tiene un tamaño de 52 nt. Contiene un total de 29 residuos G y C. Su
valor PGC, por tanto, es
29 nucleótidos
Pqc - — ----- , x . . x 100 = 56%
52 nucleotidos
Ambos, el cloruro de sodio (0,15 M) y el cltrato de sodio (0,015 M), presentes en

el tampón de hibridación contribuyen a la concentración global de ion sodio. La
concentración total de Ion sodio es
0,15 M + 0,015 M = 0,165 M
Usando estos valores, la ecuación para la Tm de la sonda de 52 nt se resuelve así:
Tm = 16,6 log [0,165] + 0,41 [56] + 81,5° - 0 - 675/52 - 0,65 [50]
Tm = 16,6[-0,783] + 22,96 + 81,5° - 12,98 - 32,5
Tm = 46 °C
La temperatura de hibridación (T¡) se calcula así:
r,- = 4 6 ° C - 15 °C = 31 °C
Por tanto, la hibridación debería realizarse a 31 °C.
10.7.1 S o n d a s d e o lig o n u cle ó tid o s

Tanto olig o n u cleó tid o s sintéticos co m o fragm entos d e A D N am p lifica d o s pu ed e n
serv ir co m o sondas p a ra A D N pro c ed en te d e u n a lib rería re co m b in an te y fijado a
u n a m em brana. Si s e co n o c e la sec u en cia ex a cta d el fragm ento d ian a, se p u ed e
g en e rar u n olig o n u cleó tid o sintético q u e te n g a p erfec ta com p lem e n ta ried a d co n el
clon d e interés.
E l n ú m ero de sitios del g en o m a a lo s cuales se h ib rid ará u n a so n d a en fo rm a de
o lig o n u cleó tid o d ep e n d e d e la co m p lejid ad del g en o m a y d el n ú m ero d e errores
p o r fa lta d e com p lem e n ta ried a d entre la so n d a y la diana. U n erro r d e fa lta de
co m p lem en taried ad es u n a p o sició n dentro d el híb rid o s o n d a/d ian a ocu p a d o p o r
base s no co m plem entarias. L a co m p lejid ad (C) co rresp o n d e al tam añ o del g en o m a
(en p b ) represe n ta d o p o r u n a ú n ic a c o p ia d e su secuencia, inclu y en d o u n a ú n ica
c o p ia d e c a d a re g ió n con sec u en cia repetitiva. L o s g en o m a s d e la m ay o ría de
b ac terias y o rganism os unice lu la res no p o se e n m u chas sec u en cia s repetitivas. L a
co m p lejid ad d e tales organism os, p o r tan to , es eq uivalente al tam añ o d e su
genom a. S in em bargo, lo s gen o m a s d e m am íferos, d esd e ra to n e s a h u m anos,

co ntienen ab u n d a n tes secuencias repetitivas. A u n q u e la m a y o r p arte d e genom as
d e m am íferos tien e u n tam añ o ap ro x im a d o d e 3 x 109 p b , L aird (1 9 7 1 ) h a
estim ad o q u e su co m p lejid ad es apro x im a d am en te eq u iv a le n te a 1,8 x 109 pb.
E l n ú m ero d e p o sicio n es d el g en o m a c o n c ie rta c o m p lejid ad a las cuales se
p u ed e h ib rid a r u n a so n d a d e o lig o n u d e ó tid o v ien e determ in ad o p o r la ecuación
en la q u e P q es el n ú m ero d e b a se s co m plem entarias ind ep e n d ie n tes, L es el

tam añ o d e la so n d a d e o lig o n u d e ó tid o y C es la co m p lejid ad d el g e n o m a d ian a
(este v a lo r se m u ltip lica p o r d os p a ra re p rese n ta r las d o s ca d en a s d e A D N co m
p lem entarias, y a q u e la so n d a p o d ría h ib rid arse po ten c ia lm e n te a c u a lq u ie ra d e las
d o s) (M a n ia tis et al., 1982).
P ro b le m a 1 0 .1 4 Una sonda de oligonudeótido tiene un tamaño de 12 bases.

¿A cuántas posiciones del ADN genómico humano podría esta sonda hibridarse?
Mediante la ecuación anterior, L es igual a 12 y C es equivalente a 1,8 x 109.
Colocando estos valores en la ecuación obtenemos el siguiente resultado:
P0 = x 2(1,8 x 109) = (6 x 10“ 8) x (3,6 x 109) = 216
Por lo tanto, por azar, un oligonudeótido de 12 bases podría hibridarse a 216

lugares del genoma humano.
P ro b le m a 10.15 ¿Cuál es el tamaño mínimo de un oligonudeótido para que

pueda hibridarse a sólo un sitio del genoma humano?
En el Problema 10.14, se asumía que el término 2C para el genoma humano es
equivalente a 3,6 x 109. Nos interesa que P0 sea igual a 1. Nuestra ecuación
entonces se convierte en
,=G)l>
1 _ Convertir la fracción 1/4 en un decimal y

3,6 x 109 dividir cada lado de la ecuación entre
3,6 x 109.
2,8 x 10~10 = (0,25)¿
log 2,8 x 10-10 = log 0,25^ Calcular el logaritmo vulgar de ambos lados
de la ecuación.
log 2,8 x 10-10 = /.(log 0,25) Usar la regla de la potencia para logaritmos
(para cualesquiera números positivos M y a
[donde a no es igual a 1] y cualquier número
real p, el logaritmo de una potencia M es el
exponente multiplicado por el logaritmo de
M: logfl/Vf = p \ogJ\/¡).
log 2,8 x 10~10 Dividir cada lado de la ecuación entre el log
log 0,25 ~ L de 0,25.
—9,6 _ Calcular los valores logarítmicos.
Por lo tanto, se esperaría que un oligonucleótido de 16 bases se hibridara en una

sola posición al genoma humano.
10.7.2 C o n d ic io n e s d e h ib rid a c ió n
L a determ inación d e la tem peratura d e fusión (Tm) d e u n a so n d a d e oligonucleótido
pu ed e ay u d a r al investigador a dec id ir la tem peratura a la cual se v a a realizar el paso
d e hibridación. L a hibridación se llev a a cabo norm alm ente a 2-5 °C p o r debajo de
la Tm del oligonucleótido. N o obstante, la cantidad de tiem po que se d e ja h ib rid ar la
so n d a co n la secuencia diana es otro aspecto d e la reacción q u e debe considerarse.
P ara u n a so n d a d e oligonucleótido, el tiem po d e hibridación necesario p ara que
la reacción llegue a su punto interm edio d e ejecución viene determ inado p o r la
ecuación descrita p o r W allace y M iy ad a (1987):
ln 2
,1 / 2 = I c
en la q u e k re p rese n ta u n a co n stan te d e ta sa d e p rim e r o rd e n y C es la

co n c en tra ció n m o lar d e la so n d a d e olig o n u cleó tid o (en m oles d e n ucleótido
p o r litro). E s ta ecu ac ió n d eb e ría se r u tiliz ad a sólo co m o ap ro x im ació n . L a ta sa
real d e h ib rid ac ió n p u ed e se r tres o cu a tro v ec es m ás len ta q u e la ta sa ca lcu lad a
(W allace e t al., 1979).
L a co n stan te d e la tasa, k, re p rese n ta la ta sa d e h ib rid ac ió n d e u n a so n d a de
olig o n u cleó tid o a u n ác id o nu cle ic o d ia n a in m ovilizado en co n d ic io n e s d e 1 M
d e io n so d io . V iene d ete rm in a d a p o r la sig u ien te ecuación:
3 x 105 L °'5 L / m o l/ s
en la q u e k se ca lcu la en litro/m ol d e n t p o r segundo, L es el tam añ o de la so n d a de

o lig o n u cleó tid o en nu cle ó tid o s y N es la co m p lejid ad d e la sonda.
L a co m p lejid ad , dad o q u e en este ca so se re la cio n a co n u n olig o n u cleó tid o , se
ca lcu la c o m o el n ú m ero de po sib le s o lig o n u cleó tid o s diferen tes en u n a m ezcla. El
sig u ien te olig o n u cleó tid o , d e 18 n t, dad o q u e sólo tien e u n a s ec u en cia definida
(sin re d u n d an cia s), tien e u n a c o m p lejid ad d e uno:
5 -GGACCTATAGCCGTTGCG-S'
C u an d o se g en e ran o lig o n u cleó tid o s p o r trad u c ció n in v ersa d e u n a sec u en cia
proteica, tal c o m o p o d ría o cu rrir cu a n d o se in ten ta d ete ctar u n g en d el cual sólo
d isp o n em o s d e la inform ación d e su sec u en cia proteica, se d eb e sin te tiz ar un
olig o n u cleó tid o d egenerado q u e te n g a diferen tes sec u en cia s p o sib le s b asa d as en
ciertos cam b io s en la terc era b a s e d e ca d a triplete. P o r ejem plo, la traducción
in v ersa d e la sig u ien te sec u en cia p ro teic a re q u eriría la síntesis de olig onucleótidos
co n tres po sib le s secuencias:
MetTrpMetlleTrpTrp
ATGTGGATGATATGGTGG
C
T
M etio n in a (M et) y trip tó fan o (T rp) están codificados c a d a u n o p o r u n triplete
ú nico. Is o leu c in a (lie), sin em b a rg o , p u ed e estar c o d ific ad a p o r tres posibles
tripletes: ATA, A TC y ATT. E l olig o n u cleó tid o es sintetizado co m o u n a m ezcla
d e so n d as q u e co n tien e n u n a A , u n a C o u n a T en la 12.a p o sició n . D a d o que
ex isten tres p o sib le s secu en cias p a ra el olig o n u cleó tid o , el m ism o tien e u n a
co m p lejid ad d e 3.
C uando se diseña u n a so n d a basada en la secuencia proteica, el investigador
debería elegir u n a z o n a para la traducción inversa q u e ten g a la m enor cantidad
posible d e redundancia de codones. N o obstante, dado que la m ayor parte de
am inoácidos están codificados p o r dos o m ás tripletes (véase la T abla 10-1), la
m ayoría d e m ezclas d e sondas contendrán diversas redundancias. E l núm ero total
d e oligonucleótidos diferentes en u n a m ezcla (su com plejidad) se calcula m ultipli
cando el núm ero d e posibles n t en todas las posiciones. P or ejem plo, aquí tenem os
u n a secuencia p roteica y su traducción inversa utilizando todos los posibles codones:
ArgProLysPheTrpIleCysAla
AGACCAAAATTCTGGATATGCGCA
C C C G T C T C
G G T G
P ara d ete rm in a r cu á n tas secu en cias diferen tes so n p o sib le s en d ic h a m ezcla, se

m u ltip lica el n ú m ero d e n t po sib le s en c a d a po sició n . E n este eje m p lo , el núm ero
to tal d e diferentes sec u en cia s se ca lcu la así
2 x l x 4 x l x l x 4 x l x l x 2 x l x l x 2 x l x l
x l x l x l x 3 x l x l x 2 x l x l x 4 = 3 .0 7 2
P o r lo tan to , ex isten 3.0 7 2 diferentes o lig o n u d e ó tid o s p o sib le s en esta m ezcla.
Tabla 10-1 El código genético. Los codones se m uestran com o secuencias

de ADN en vez de secuencias de ARN (se utiliza T en v e z de U) para facilitar
su conversión a sonda sintética de oligonudeótidos
Am inoácido Abreviación Codones
Ácido aspártico Asp GAC GAT

Ácido glutámico Glu GAA GAG
Alanina Ala GCA GCC GCG GCT
Arginina Arg AGA AGG
CGA CGC CGG CGT
Asparagina Asn AAC AAT
Cisteína Cys TGC TGT
Fenilalanina Phe 7TCTTT
Glicina Gly CGA GGC GGG GGT
Glutamina Gln CAA CAG
Histidina His CAC CAT
Isoleucina lie ATA ATC ATT
Leucina Leu CTA CTC CTG CTT
TTATTG
Lisina Lys AAA AAG
Metionina Met ATG
Prolina Pro CCA CCC CCG CCT
Serina Ser TCA TCC TCG TCT
AGC AGT
Tirosina Tyr TAC TAT
Treonina Thr ACA ACC ACG ACT
Triptófano Trp TGG
Valina Val GTA GTC GTG GTT
TAA TAG TGA
10.7 Análisis de librerías recombinantes por hibridación a sondas de ADN 3 4 7
P ro b le m a 1 0 .1 6 Una sonda de oligonucleótido con un tamaño de 21 nt

se utiliza para la hibridación a una membrana con clones recombinantes. La
sonda de oligonucleótido híbrida perfectamente con el gen diana a identificar.
La hibridación se lleva a cabo en 1 M cloruro de sodio a una temperatura de
2 °C por debajo de la Tm de la sonda. La solución de hibridación contiene sonda
de oligonucleótido a una concentración de 0,02 (ig/mL.
a) ¿Cuándo habrá llegado la hibridación a su punto medio?
b) ¿Durante cuánto tiempo se debería dejar la hibridación funcionando?
Calcularemos primero el valor de k, la constante de la tasa, usando la siguiente
expresión:
_ 3 x 105 L0’5 L/m ol/s

Ñ
Para este problema, L, el tamaño del oligonucleótido, es 21. Dado que la sonda
es perfectamente complementaria con la secuencia diana, N, la complejidad del
oligonucleótido, es igual a 1. Utilizando estos valores en la ecuación de k, nos da
k _ (3 x 105)(2 1 )— L/m ol/s _ ^ ^ 10s^ 4 58^ = i #37 x -|06 L/m ol/s
Para que este valor k pueda ser usado en la ecuación del cálculo del tiempo
de incubación hasta llegar al punto intermedio de ejecución de la reacción de
hibridación, se debe determinar también el valor de C, la concentración molar
de la sonda de oligonucleótido. En este problema, la sonda tiene una
concentración de 0,02 (ig/rnL. Para convertir este valor a una concentración
molar (moles/litro), debemos determinar primero el PM (gramos/mol) de la
sonda. Dado que la sonda de oligonucleótido tiene un tamaño de 21 nt, pode
mos determinar su peso molecular multiplicando el tamaño en nt por el PM de
un nt:
330 g/mol
21 nt x -----—------= 6.930 g/m o
1 nt y/
Por lo tanto, el PM de una secuencia de 21 nt es aproximadamente 6.930 g/mol.

Este valor puede ahora ser usado para calcular la molaridad de la sonda en la
solución de hibridación gracias al uso de varios factores de conversión, tal como
se muestra en la siguiente ecuación.
0,02 ixg 1.000 mL 1 mol 1g

— C mol/L
mL L 6.930 g 1 x 106 ng
20 mol
----------- o— = C m ol/L
6,93 x 10 L '
C = 2,89 x 10-9 m ol/L
Los valores calculados para k y C pueden ser usados a continuación en la
expresión del tiempo de ejecución de la mitad de la hibridación:
ln 2
f' ' 2 = J c
ln 2
1/2 _ (1,37 x 106 L/m ol/s)(2,89 x 10“ 9 m ol/L)
0,693
fl/2 =
3,96 x 10“
Ts
Por lo tanto, se habrá completado la mitad de la reacción de hibridación en

175 segundos.
Dado que la tasa real de hibridación puede ser aproximadamente cuatro veces
más lenta que el valor calculado (Wallace et al., 1979), el valor determinado en la
Solución 10.16(a) debe ser multiplicado por cuatro:
175 s x 4 = 700 s
La conversión de este valor a minutos da lugar al siguiente resultado:
1 min
700 s x ------ = 11,7 min
6 0s
Por lo tanto, la reacción de hibridación descrita en este problema llegará a su

punto medio de ejecución en aproximadamente 11 min, 42 s y debería dejarse
que procediera durante 23 min, 21 s.
P ro b le m a 1 0 .1 7 Se purifica y secuencia una cantidad pequeña de una

proteína desconocida. Se escoge una región de la proteína a partir de la cual se
diseña una sonda de oligonucleótido. La secuencia de dicha región es la
siguiente:
TrpTyrMetHisGlnLysPheAsnTrp
La mezcla de sondas sintetizada a partir de esta secuencia proteica será añadida

a una concentración de 0,02 ng/mL a la solución de hibridación con 1 M cloruro
de sodio con la finalidad de identificar un clon recombinante en una librería. La
hibridación se llevará a cabo a una temperatura varios grados por debajo de
la Tm promedio de la mezcla de sondas. ¿Cuándo habrá llegado la hibridación
a la mitad de su compleción?
El primer paso en la resolución de este problema es determinar la complejidad,
N, de la mezcla de sondas obtenida por traducción inversa a partir de la secuen
cia de la proteína. Utilizando la Tabla 10-1, el fragmento de proteína se somete a
traducción inversa de la siguiente manera:
TrpTyrMetHisGlnLysPheAsnTrp
TGGTACAT GCACCAAAAATTCAACTGG
T T G G T T
El número de posibles oligonudeótidos en la mezcla de oligonudeótidos se

calcula multiplicando todos los posibles codones para cada aminoácido (inclui
remos aquí sólo aquellas posiciones de aminoácidos que tienen más de una
posibilidad). Obtenemos
Por lo tanto, la mezcla de oligonudeótidos sintetizados como sondas tiene una

complejidad, N, igual a 64. La sonda de oligonudeótido, sin tener en cuenta qué
base se encuentra en cada posición, tiene un tamaño, L, de 27 nt.
El valor de k, la tasa de hibridación, de este oligonudeótido se calcula así:
3 x 105 L0'5 L/m ol/s
La sustitución de los valores determinados para N y L en la ecuación nos da el

(3 x 105)(2 7 )° j L/m ol/s
i (3 x 105) (5,2) L/m ol/s 1,6 x 106 L/m ol/s , ,

k = i ----------- = 2,5 x 104 L/m ol/s
La sonda tiene un peso molecular que se calcula así:
, , , 330 g/mol
27 nucleotidos x ---- —f—¡— = 8.910 g/mol
nucleótidos
La molaridad de la sonda, a una concentración de 0,02 ng/mL en la solución de

hibridación, se calcula de la siguiente forma:
0,02 ng sonda 1.000 mL 1 mol 1g

------mL------ ^ X 8 ^ Í0 ÍX 1 x l0 V g = A
20 mol sonda
------------o— = C m ol/L
8,91 x 109 L '
C = 2,24 x 10-9 m ol/L
La utilización de los valores calculados para k y C en la ecuación del tiempo de

ejecución de la mitad de la hibridación da el siguiente resultado:
ln 2
1/2 ~ (2,5 x 10" L/m ol/s)(2,24 x l ( r 9 mol/L)
Dado que, tal como se ha discutido previamente, el tiempo real de la hibridación

puede ser hasta cuatro veces mayor que el valor calculado, para asegurar un
buen resultado dejaremos que la hibridación entre la sonda y la diana proceda
durante el tiempo que resulta de la multiplicación de nuestro valor por cuatro:
12.375 s x 4 = 49.500 s
La conversión de este valor en horas da lugar al siguiente resultado:
1 min 1h
49.500 s x ------ x -------— = 13,75 h
60 s 60 min
Por lo tanto, utilizando esta mezcla de sondas y la temperatura de hibridación

adecuada, la reacción de hibridación debería llegara la mitad de su ejecución en
13,75 h.
10.7.3 H ib rid a ció n con so n d a s d e ADN de c a d e n a d o b le

(AD N cd)
L a h ib rid ac ió n tam b ién p u ed e se r llev ad a a ca b o u san d o u n a so n d a d e A D N cd
p re p ara d a p o r el m éto d o d e trasla ció n de m ella. C u an d o se u s a u n a tem p eratu ra de
h ib rid ac ió n d e 68 °C en u n a so lu ció n ac u o sa o 4 2 °C en u n a so lu ció n c o n 50%
de fo rm a m id a , M aniatis et al. (1982) re co m ien d an el u s o d e la sig u ien te ecuación
10.8 Medición de fragmentos de ADN por electroforesis en gel 351
p a ra estim ar la ca n tid a d de tiem po necesario p a ra llegar, la m ita d d e eje cu ció n d e la

hibridación:
1 Y Z
‘^ = X X 5 X T 0 X2
d o n d e X e s la cantidad de so n d a añ a d id a a la re acc ió n d e h ib rid ac ió n (en pg); Yes la

co m p lejid ad d e la so nda, la cual p a ra la m ay o ría d e so n d as es pro p o rcio n al al
tam añ o d e la so n d a en k b , y Z es el vo lu m en de la re acc ió n de h ib rid ac ió n (en m L ).
L a h ib rid ac ió n casi co m p leta se co n sig u e d esp u é s d e tres v ec es el p eríodo tVl.
P ro b le m a 1 0 .1 8 Las membranas preparadas para la hibridación de calvas

son colocadas en una bolsa de plástico con 15 mL de un tampón de hibridación
acuoso y 0,5 pg de sonda de 7.500 pb obtenida por traslación de mella. Se
permite que la hibridación proceda a 68 °C. ¿Durante cuánto tiempo debería
mantenerse la reacción de hibridación para llegar a un estado de hibridación
casi completo de la sonda a la diana?
Utilizando la ecuación anterior, X e s 0,5 pq, Y es 7,5 kb (7.500 pb - 7,5 k b )y Z e s
15 mL. Con estos valores en la ecuación del tiempo de ejecución de la mitad de
la hibridación obtenemos
1 7,5 15 „ 225 „
fl/2 _ á 5 X T X TÓX ~ 25 ~
Por lo tanto, la reacción de hibridación llegará a la mitad de su ejecución en 9 h.

La reacción puede dejarse durante un tiempo tres veces más largo (27 h) para
asegurarnos de una hibridación casi completa.
10.8 M E D IC IÓ N D E F R A G M E N T O S D E A D N
P O R E L E C T R O F O R E S IS EN G E L
U n a v e z se h a identificado u n c lo n reco m b in an te c o m o candidato, y a se a p o r
h ib rid ac ió n d e c o lo n ias a u n a so n d a e sp e cífica d e ale lo o p o r ex presión d e u n a
pro teín a d e interés, el c lo n d eb e ría se r adecu a d am en te ca rac teriza d o p ara asegu
ra m o s d e q u e co n tien e el m aterial gen é tic o esp erad o . U n a de las caracterizaciones
m ás sim ples y esenciales d e u n ácido n ucleico es la dete rm in a ció n d e su tam año.
L a m ed ició n d el fragm ento n o rm alm en te se llev a a ca b o desp u é s d e u n a
am plificación p o r P C R o d u ra n te el análisis d e insertos q u e h an sido escindidos
d e sus v ec to res p o r d ig estió n d e restricción.
L a m ed ició n d el tam añ o del frag m en to se co n sig u e m ed ian te la electroforesis

de los frag m en to s d e A D N en u n g el d e a g a ro sa o p o liacrilam id a, en el cual un
carril se u tiliz a p a ra la sep aració n d e fragm entos d e A D N d e tam añ o conocido
(m arca d o res d e P M o tam añ o ). T ra s la tin ció n d el gel, se m ide la d ista n cia de
m ig rac ió n d e ca d a b a n d a q u e co n fo rm a el m arc ad o r de tam año. E stos v alo re s son
rep rese n ta d o s en u n gráfico sem ilogarítm ico. L a ta s a co n la q u e u n frag m en to de
A D N m ig ra du ra n te la electroforesis es inversam ente pro p o rcio n al al logio d e su
tam añ o en pb. E l gráfico gen e rad o p a ra lo s m arc ad o res d e tam añ o d eb e ría co n te
n e r u n a re g ió n re p rese n ta d a p o r u n a re cta d o n d e esta relación es m ás pronunciada.
L o s fragm entos de A D N m ás gra n d es se ciñ e n m en o s a esta relación, d ependiendo
d e la co n c en tra ció n d e la m atriz d el gel. L a a g a ro sa es u n a b u e n a m atriz d e gel para
la sep a rac ió n d e fragm entos d e A D N co n tam añ o s en tre 50 y 3 0 .0 0 0 pb. N o
o bstante, el in v estig ad o r d e b e u s a r u n p o rc en taje d e a g a ro sa ade cu a d o p ara los
frag m en to s a resolver. L o s frag m en to s d e b a jo p eso m o lecu la r d eben s e r so m eti
d os a electroforesis en g eles d e m a y o r p o rc en taje (1 a 4 % d e agarosa). L os
frag m en to s d e ele v ad o P M se re su elv en m ejo r en g ele s d e b a jo po rc en taje (0,3
a 1% de agarosa). L a m ejo r re so lu c ió n p a ra fragm entos d e b a jo P M se co n sig u e en
Fragmentos de restricción
Marcador de clones recombinantes
100 pb |----------------------------------------------------- 1
■ FIGURA 10-1 Representación de un gel de agarosa utilizado para medir el tamaño de fragmentos de inserto de
ADNc El ADN de clones de ADNc se digiere con endonucleasas de restricción en sitios únicos a ambos lados del inserto.
Las digestiones son resueltas por electroforesis para separar el fragmento del vector del fragmento correspondiente al
inserto. El marcador cargado en el carril 1 es un marcador de tamaños en el que cada fragmento difiere en 100 pb de la
banda situada a ambos lados del mismo. En este marcador, las bandas de 600 y 1.000 pb se tiñen con más intensidad
que el resto.
u n g el de poliacrilam ida. In d e p en d ien tem e n te d e la m atriz de g el q u e se utilice, el

m éto d o p a ra d ete rm in a r el tam añ o d el fragm ento es el m ism o.
L a F ig u ra 10-1 m u estra u n g el d e a g a ro sa so m etid o a electroforesis para
d ete rm in a r los tam añ o s d e frag m en to s d e A D N c insertados en un v ec to r
p lasm íd ic o . E n este g el, se u tiliz a en el p rim er carril u n m arc ad o r d e tam año
q u e co n tien e frag m en to s q u e distan 100 p b u n o s d e otros.
E n el P ro b lem a 10.19, el tam añ o d el frag m en to d e A D N c insertado será
determ in ad o p o r d os m éto d o s. E n la p rim era ap ro x im ació n , se u sará u n gráfico
sem ilo g y u n a cu rv a e stán d a r p a ra ex tra p o lar el tam añ o del fragm ento. E n la
seg u n d a ap ro x im ació n , s e llev ará a ca b o u n a re g resió n lineal co n M icrosoft
E xcel p a ra g en e rar la re cta q u e m ejo r se aju ste a lo s d ato s a p a rtir d e u n a cu rv a
e stán d a r y la ecu ac ió n de la re cta será u s a d a p ara c a lcu lar el tam añ o del fragm ento.
P ara d ete rm in a r los tam añ o s d e fragm entos en u n g el d e ag arosa, colocam os
u n a re g la so b re la fo to g ra fía d el gel a lo largo d e lo s m arc ad o res d e tam año de
m an e ra q u e la m a rc a d e 0 cm qu ed e alin ead a con el final del pocilio (F ig u ra 10-2).
L a dista n cia d esd e el final d el p o cilio h a sta el final de ca d a b a n d a se m id e y registra
(T abla 10-2). L a dista n cia d esd e el p o cilio a c a d a b a n d a se re p rese n ta en u n gráfico
sem ilo g y se d ib u ja u n a re cta so b re el gráfico q u e c o n e cte la m a y o r p arte de p u n to s
p o sib le s (F ig u ra 10-3).
de clones recombinantes
100 pb f
I FIGURA 10-2 Medición de la distancia de migración de cada banda del marcador de tamaños respecto al pocilio.
T a b la 10-2 Distancias de m igración de fragm entos del m arcador mostrado

en la Figura 10-2
B anda d e m arc ad o r d e ta m a ñ o (pb) D istancia del pocilio (cm)
1.500 2,3
1.400 2,35
1.300 2,45
1.200 2,55
1.100 2,7
1.000 2,85
900 3,0
800 3,2
700 3,5
600 3,9
500 4,15
400 4,55
300 5,1
200 5,85
100 7,0
Distancia con respecto al pocilio (cm)
■ FIGURA 10-3 Representación gráfica de la distancia recorrida por cada banda de marcador en un gráfico
semilogarítmico.
■ 10.8 Medición de fragmentos de ADN por electroforesis en gel 355
P ro b le m a 1 0.9 ¿Cuál es el tamaño del inserto mostrado en el carril cuatro

del gel de la Figura 10-1? Determinar el tamaño del fragmento
a) Usando un gráfico semilog.
b) Por regresión lineal con Microsoft Excel.
Coloque una regla sobre el carril cuatro de la fotografía y mida la distancia desde
el final del pocilio hasta el final de la banda que representa al fragmento inserto
(Figura 10-4).
La banda está a una distancia de 4,2 cm del pocilio. En el gráfico semilog de la
curva estándar (Figura 10-5), 4,2 cm en el eje x se corresponden con 470 pb en el
eje y.
El paquete informático Microsoft Office es una de las aplicaciones informáticas
más populares tanto para uso en casa como en negocios. Incluido en este
paquete se encuentra el programa Excel. Aunque está diseñado para mantener
inventarios y para crear hojas de cálculo que permitan hacer el seguimiento de
de clones recombinantes
100 pb |“
■ FIGURA 10-4 Medición de la distancia de migración de la banda de inserto del carril 4 respecto al pocilio.
Distancia con respecto al pocilio (cm)
■ FIGURA 10-5 Extrapolación del tamaño de fragmento de ADN del carril 4 de la Figura 10-1. Se dibuja una línea
vertical de 4,2 cm sobre el eje x de la curva y a continuación una línea horizontal sobre el eje y para determinar el
tamaño en pares de bases del fragmento. Una banda que ha migrado 4,2 cm desde el pocilio se corresponde con un
tamaño de aproximadamente 470 pb.
transacciones financieras, está equipado con funciones matemáticas útiles para

biólogos moleculares. En particular, puede desarrollar una regresión lineal, la
cual puede usarse para calcular tamaños de fragmentos.
La re g re s ió n lin eal es una técnica matemática que permite generar la recta que
mejor se ajusta a un grupo de datos, así como la ecuación que describe a dicha
recta. Los datos son puntos en un gráfico que muestra la relación entre dos
variables. La recta que mejor se ajusta, o re c ta d e re g re s ió n , es una línea recta
dibujada entre los puntos del gráfico de manera que pasa a través (o muy cerca)
de la mayor parte de puntos posibles. La regresión lineal, por tanto, se usa para
determinar si existe una relación directa y lineal entre dos variables. En este caso,
las dos variables son el tamaño de fragmento y la distancia que el fragmento ha
migrado desde el pocilio durante la electroforesis.
Los fragmentos de ADN migran a través de un gel de agarosa a una velocidad
que es inversamente proporcional al logaritmo (base 10) de su tamaño. Esto
significa, en términos prácticos, que existe una relación directa entre la dis
tancia recorrida por el fragmento en el gel y el log del tamaño del fragmento
(en pb). Esto puede ser observado gráficamente si representamos en un
gráfico semilog los datos de distancia de migración frente al tamaño en pb
(tal como se muestra en la Solución 10.19(a)) o si representamos en un gráfico
normal la distancia de migración frente al log del tamaño de fragmento.
Cualquiera que sea la técnica, una línea recta describe la relación entre estas
dos variables.
Una recta se define por la ecuación general
y = mx + b
Para poder usar esta ecuación para calcular tamaños de fragmentos por
regresión lineal, y es el log del tamaño de fragmento (representado en el eje
vertical [y]), m es la pendiente de la recta de regresión, x es la distancia (en cm)
desde el pocilio (representada en el eje horizontal [x]) y b es el punto por donde
la recta de regresión corta al eje y.
El coeficiente de correlación (representado por el símbolo R2) es una medida
de cómo de cerca de la recta de regresión se encuentran los puntos de un
gráfico. R2 tendrá un valor positivo si la pendiente de la recta de regresión es
positiva (es decir, aumenta de izquierda a derecha) y tendrá un valor negativo
si la pendiente de la recta de regresión es negativa (es decir, disminuye de
izquierda a derecha). El coeficiente de correlación siempre tendrá un valor
entre —1 y +1. Cuanto más cercano sea el valo r R2 a —1 o +1, mejor será la
correlación entre las dos variables gráficam ente comparadas. Si todos los
puntos del gráfico se encuentran exactam ente en una recta de regresión
con una pendiente positiva, R2 tendrá un valor de +1. Si todos los puntos
del gráfico se encuentran exactam ente en una recta de regresión con pen
diente negativa, R2 tendrá un valor de —1. Si no existe correlación entre las dos
variables (es decir, si los puntos del gráfico aparecen de forma aleatoria), R2
tendrá un valor cercano a 0.
En el siguiente protocolo, se utilizará Microsoft Excel para convertir los tamaños
de los fragmentos marcadores de tamaño en valores logarítmicos. Estos valores
serán representados en el eje y de un gráfico frente a sus valores de distancia de
migración en el e je x. Usando la regresión lineal, calcularemos la recta que mejor
se ajusta a estos puntos y la ecuación que describe a dicha recta. La distancia de
migración del fragmento desconocido será colocada en la ecuación de la recta
de regresión para determinar el valor log del tamaño del fragmento. El cálculo
del antilog de este valor nos dará el tamaño en pb del fragmento desconocido.
El protocolo que permite utilizar Microsoft Excel para representar los datos de
este problema se encuentra en el Apéndice A. Proporciona el resultado mos
trado en la Figura 10-6.
La ecuación de la recta de regresión es y = —0,2416x + 3,7009. La recta tiene un
valor R2 de 0,998. Todos los puntos del gráfico, por tanto, caen muy cerca o
exactamente sobre la recta de regresión; existe una fuerte relación lineal entre la
distancia migrada desde el pocilio y el log del tamaño del fragmento.
Se ha medido que el fragmento desconocido ha migrado 4,2 cm desde el
pocilio. Esto representa la variable x en la ecuación de la recta de regresión.
La ecuación para calcular y, el log del tamaño del fragmento, es entonces
r $ File Ed it V ie w In s e r t Fo rm a t Tools Data W in d o w Help________________
° q a b r a ¡8. y-m¡« <y ». ■a - * •* a or

□ W o rkb o o k!
B i C _ | _____ D_____ — Q —
E ----- ------ ----- ^
1 bp DisUnct (x) log bp (y) __
_5_ 14CO 2.33 3.14612804

1JCO 2 43 3 11394335
-5_ 1200 2.33 3.07918125
"7 lonn
900
?8S X
3 2.93424231
_2_ 800 3.2 2.90308999
ni 700 5.5 2 84509804
-12- 500 4.13 2.69897

_L5_ 400 4.55 2.60205999
3.1 2.47712123
200 5.85 2.39103
100
17
19
20
21
22
23
25
24 y = -0.2416x ♦ 3.7OTSC
25 2 R‘ ■0.998 I • S*r¡*s1
26 |---- L « t r (S*r»s1)|
1.3
28
40
05
32
0
ÍJ * 4
53 *
36
■ FIGURA 10-6 Recta de regresión para la Solución 10.19(b), determinada utilizando Microsoft Excel. La ecuación de
la recta de regresión es y = —0,2416x + 3,7009.
y = -0,2416(4,2) + 3,7009
y - 2,6862
Por tanto, el valo ry a partir de la ecuación de regresión es 2,6862. Este valor es el

logaritmo del tamaño del fragmento (log pb). El tamaño del fragmento desco
nocido en pb es igual al antilog de este valor.
antilog 2,6862 = 485,5
Así, pues, el fragmento tiene un tamaño de 485,5 pb. Nótese que la regresión
lineal nos ha dado un tamaño de 485,5 pb mientras que la representación en el
10.9 Generación de deleciones anidadas mediante la nucleasa BAL 31 359
gráfico semilog nos dio un tamaño de 470 pb. Dado que pueden existir errores
en la medición de las bandas en una fotografía, así como posibles anomalías de
migración debidas a la presencia de sales o a efectos derivados de la secuencia
de bases, ninguna de las dos respuestas es necesariamente más correcta que la
otra.
10.9 G E N E R A C IO N D E D E L E C IO N E S A N ID A D A S
M E D IA N T E L A N U C L E A S A B A L 31
U n a v e z se h a identificado u n clon reco m b in an te q u e co n tien e el g en b u sca d o , a
m en u d o es d ese ab le re alizar d ele cio n es d el inserto. E sto p u ed e fa cilita r al m en o s
tres objetivos:
1. L a creación d e u n a serie d e d eleciones d el inserto p u ed e ay u d a r a co n stru ir u n

m a p a d e restricción.
2. L a sec u en cia ció n d el A D N d el inserto entero p u ed e s e r llev ad a a ca b o tras
g en e rar u n a serie d e dele cio n es q u e se ex tien d e n m ás y m ás dentro d el inserto.
3. E l inicio d el g en insertado (si p artim os d e u n a fu e n te g enóm ica) p u ed e ser
acerc ad o h a c ia lo s elem entos d e c o n tro l d el vector.
B A L 31 es u n a e x o n u c leasa que d eg rad a extrem os tan to 3' co m o 5 ' d e u n

dú p lex d e A D N . L a en z im a tam b ién tien e ac tiv id a d en d o n u c leasa y d eg rad a a
p a rtir d e roturas peq u e ñ as y g ra n d es, así co m o a p a rtir d e sec cio n es d e ca d en a
s encilla d el dú p lex d e A D N o A R N . L a d ig estió n d e A D N lin eal co n B A L 31
p ro d u c e m oléculas tru n ca d as co n extrem os ro m o s o co n cortos extrem os colgantes
e n 5'.
E l m éto d o m ás usad o p a ra g en e rar m u tan tes p o r dele ció n c o n B A L 31 en un
p lásm id o reco m b in an te co n siste en re alizar p rim ero u n corte e n u n sitio de
restricción ú n ico y a con tin u ac ió n e lim in ar lo s n t d e lo s extrem os. L a actividad
en z im á tic a es dep e n d ien te d e la p re sen cia d e calcio. L a a d ic ió n d e ácido
tetraacético etilenglicol (E G T A ) h a rá d e q u ela n te del calcio y p arará la
reacción. E l g ra d o d e dig estió n , p o r tan to , p u ed e s e r con tro la d o m ediante
la a d ic ió n d e u n ag e n te q u ela n te desp u é s d e u n intervalo d e tiem po definido.
E l tiem po d e in cu b a ció n nec esario p a ra p ro d u c ir la deleción d ese ad a pu ed e
estim arse c o n la ecu ac ió n d e L eg e rsk y e t al. (1978):
2M nV maxt
M i — A I o — -------- . . .
{K„ + (S )0]
en la q u e M t es el P M d el d ú p lex d e A D N desp u é s d e t m in u to s d e incubación;

M 0 es el P M o rig in al d el d ú p lex d e A D N ; M„ es el P M pro m ed io d e un
m o n o n u cleó tid o (c o n sid e rad o co m o 3 3 0 D a); V máx es la v elo c id a d m áx im a de
re acc ió n (e n m oles d e n t elim inados/L /m in); t es e l p eríodo d e tiem po de

incu b a ció n , en m in; Km es la co n stan te d e M ich ae lis-M en ten (en m oles d e ex tre
m os d e A D N cd /L ), y S 0 es m oles d e ex tre m o s d e A D N cd /L a t = 0 m in.
M aniatis e t al. (1 9 8 2 ) re co m ien d an u sa r u n v a lo r d e Fm¿¡x d e 2 ,4 x 10~5 m oles
d e n t elim in ad o s/L /m in c u a n d o la re acc ió n co n tien e 4 0 u n id ad e s d e B A L 3 1 /m L
T am bién asu m en q u e e l v a lo r Vm¿x es pro p o rcio n al a la ca n tid a d d e en z im a en
la reacción. P o r ejem plo, si se u san 0 ,8 un id ad e s en 100 p L d e reacción, la
concentración, en u n id ad e s/m L , p a s a a ser
0,8 u n id ad e s 1.000 p L .
— ,^ -----x -------- ----- = 8 u m d a d e s/m L
100 p L mL
E l v a lo r Vm¿x es p ro p o rcio n al a esta cantidad:
8 u n id a d e s /m L x m o l/L /m in
4 0 u n id a d e s /m L 2 ,4 x 10-5 m o l /L / m i n
E l d esp e je y re so lu c ió n d e x da
(8 u n id a d e s/m L ) (2 ,4 x 10 -5 m o l/L /m in )
4 0 u n id a d e s /m L
1,92 x 10-4 m o l /L / m i n
— x — 4 ,8 x 10 m o l/L /m in
40
P o r lo tan to , si se u s a u n a co n c en tra ció n d e B A L 31 d e 8 u n id ad e s/m L en la

reacción, el nu ev o v a lo r Vm¿x q u e se d e b e ría co n sid erar es 4 ,8 x 10 - 6 m ol/L /m in.
M aniatis e t al. (1 9 8 2 ) tam b ién re co m ien d an la utiliz ació n d e u n v a lo r K m de
4,9 x 10- 9 m oles d e extrem os d e A D N cd/L .
P ro b le m a 1 0 .2 0 Ha colocado 1 unidad de nucleasa BAL 31 y 5 (xg de un

fragmento de ADN de 15.000 pb en una reacción de 100 pL. Quiere digerir
5.000 pb a partir de sus extremos. ¿Cuántos minutos debe dejar que tenga lugar
la reacción antes de pararla con EGTA?
S o lu c ió n 1 0 .2 0
Necesitamos determinar los valores de M 0 (el PM inicial del fragmento de
15.000 pb), M t (el PM del fragmento de 10.000 pb generado tras eliminar
5.000 pb del fragmento original de 15.000 pb), l/máx (el nuevo valor para esta
concentración de enzima) y So (el número de extremos de doble cadena pre
sentes en 5 pg de fragmento de 15.000 pb).
10.9 Generación de deleciones anidadas mediante la nucleasa BAL 31 361
El PM de un fragmento de ADN dúplex de 15.000 pb puede ser calculado de la

siguiente manera (asumiendo un peso molecular promedio de 660 g/mol/pb):
660 g/m ol - ,
15.000 pb x ---- ------- = 9,9 x 106 g/mol
Por lo tanto, un fragmento de 15.000 pb tiene un peso molecular de

9,9 x 106 g/mol. Esto es equivalente a 9,9 x 106 Da. Éste es el valor M0.
El valor M t, el PM del producto de 10.000 pb deseado, es entonces
660 g/mol ,
10.000 pb x ---- ^ ---- = 6,6 x 106 g/mol
Así, el producto de 10.000 pb deseado tiene un PM de 6,6 x 106 g/mol, que es

equivalente a 6,6 x 106 Da.
Para calcular el nuevo valor Vmáx para la cantidad de enzima utilizada en este
problema, tenemos que determinar primero la concentración de BAL 31 en la
reacción en unidades/mL. Tenemos 1 unidad en 100 nL de reacción. Esto se
convierte a unidades/mL de la siguiente forma:
1 unidad 1 .0 0 0 p ,L _ 10 unidades
100 jxL mL mL
El nuevo valor l/máx puede ser calculado ahora por regla de tres:
10 unidades/mL x m ol/L/m in
40 unidades/mL 2,4 x 10-5 m ol/L/m in
La resolución de la x nos da
.... . (10 unidades/m L)(2,4 x 10-5 m ol/L/m in)

x m ol/L/m in — --------------- ----- .— ------ ---------— ----- -
40 unidades/mL
= 6 x 10~6 m ol/L/m in
Por lo tanto, el valor l/máx para este problema es 6 x 10-6 mol/L/min.

El valor S0 (el número de extremos de doble cadena presentes en 5 ng de un
fragmento de 15.000 pb) se calcula en varios pasos. Hemos determinado que un
fragmento de 15.000 pb tiene un PM de 9,9 x 106 g/mol. Ahora podemos
determinar cuántos moles de este fragmento de 15.000 pb se corresponden
con 5 (ig (la cantidad de ADN añadida a nuestra reacción):
1g 1 mol 5 mol ,,
5ngy - v ----- — -ci
' 1 x 106 ng 9,9 x 106 g 9,9 x 1012
Dado que estamos usando un fragmento lineal de 15.000 pb, existen dos
extremos por fragmento, o 1 x 10-12 mol de extremos de ADNcd:
2 x (5,1 x 10-13 mol) = 1 x 10-12 mol extremos

Para obtener el valor de S0, tenemos que determinar cuántos moles de extremos
hay en un litro. Dado que nuestra reacción tiene un volumen de 100 |j,L, se
calculan los moles por litro así:
1 x 10~12 mol extremos 1 x 106 p,L _ 1 x 10-8 mol extremos

100 [ú. X L _ L
Por lo tanto, el valor S0 es 1 x 10 -8 moles de extremos/L. Ahora disponemos de

todos los valores necesarios para la ecuación. La expresión original es
„ „ 2MnVmáxt
La sustitución de los valores determinados o calculados nos da la siguiente

ecuación:
6,6 x 106 Da = 9,9 x 106 Da
,9 : 1 0 3 mol extremos \ (\ x 10 8 mol extremo*

(4 + 1
{ L J V L !)
La simplificación de la ecuación da lugar al siguiente resultado:
^ £ (3,96 x 10“ 3 Da)f

6.6 x 106 Da = 9,9 x 106 Da - — -------------
1,49 x 10-8
6.6 x 106 Da = 9,9 x 106 Da - (2,66 x 105 D a)í
Sustrayendo 9,9 x 106 de cada lado de la ecuación obtenemos
- 3 ,3 x 106 Da = (- 2 ,6 6 x 105 D a)f
La división de cada lado de la ecuación entre —2,66 x 105 da el siguiente

resultado:
- 3 ,3 x 106 Da _
- 2 ,6 6 x 105 Da
t — 12,4 min
Por lo tanto, para eliminar 5.000 pb de un fragmento lineal de 15.000 pb en una

reacción de 100 p l que contiene 1 unidad de BAL 31 y 5 (ig de fragmento de
15.000 pb, debemos dejar que la reacción proceda durante 12,4 min antes
de añadir EGTA.
E l A D N re com binante co n stitu y e el m éto d o de u n ir dos o m ás m o lécu la s d e A D N
p a ra g en e rar u n h íb rid o . L a tec n o lo g ía es p o sib le g ra cias a d o s tipos d e enzim as:
en d o n u c leasa s d e re stric ció n y lig asas. U n a en d o n u c leasa d e restricción re co n o ce
u n a s ec u en cia d e A D N e sp e cífica y la c o rta dentro, o m u y cerca, d e dicha
secuencia. P o r azar, la sec u en cia d e re co n o cim ien to d e u n a en z im a de
re stric ció n e stará p resen te en c a d a (V4)n b ase s a lo larg o d e u n a ca d en a d e A D N
aleatoria.
L a ca n tid a d de ex tre m o s de fragm ento (en m o les) g en e rad o s tras co rta r el A D N
co n u n a en z im a d e re stric ció n v ien e dete rm in a d a p o r la ecu ac ió n
2 x (gram os
m oles ex tre m o s d e A D N = ---------------------------
(n ú m ero d e p b ) x
L a ca n tid a d d e ex tre m o s g en e rad o s p o r u n a en z im a d e restricción q u e digiere

A D N c irc u lar v ien e d ete rm in a d a p o r la ecuación
m oles d e ex tre m o s = 2 x (m oles d e A D N )

x (n ú m ero d e sitios d e restricción)
C u an d o se d ig iere u n a m o lécu la lineal co n u n a en d o n u c leasa d e restricción, la

ca n tid a d d e ex tre m o s g en erados se ca lcu la co n la sig u ien te ecuación.
m oles d e extrem os = [2 x (m o les d e A D N ) x (n ú m ero d e sitios d e restricción)]
+ [2 x (m o les d e A D N )]
L o s frag m en to s d e A D N gen e rad o s p o r d ig estió n c o n u n a en d o n u c leasa de

re stric ció n p u ed e n se r u n id o s d e nu ev o p o r la en z im a ligasa. L a p robabilidad
d e que dos m oléculas d e A D N sean ligadas u n a a la otra dep en d e d e la concentración
d e sus extrem os: cuanto m ás alta se a la concentración d e extrem os com patibles,
m ay o r será la probabilidad d e que d os extrem os se encuentren y sean ligados. Este
parám etro se designa p o r el térm ino i y se define co m o la concentración total de
extrem os com plem entarios en la reacción d e ligación. P ara u n fragm ento d e A D N
dúplex lineal c o n extrem os cohesivos, i viene determ inada p o r la fórm ula
i — 2N qM x 10-3 ex tre m o s/m L
en la q u e JVo es el n ú m ero d e A vogadro (6,023 x 10 23) y M es la co ncentración

m o lar d e A D N .
L a ligación d e m oléculas d e A D N pu ed e resultar en su circularización. L a
cantidad d e circularización depende d el parám etro j, la concentración d e extrem os
d e la m ism a m olécula en suficiente proxim idad co m o p ara q u e pu ed a n interaccionar
entre ellos. P ara cualquier fragm ento d e A D N ,y es u n v alo r constante dependiente

del tam año del fragm ento. P uede se r calculado com o
3 \ 3/2
j = ex tre m o s/m L
d o n d e l es el tam añ o d el fragm ento d e A D N , b es el tam añ o m ín im o d e A D N que

se p u e d e do b la r so b re sí m ism o p a ra fo rm a r u n círculo y ir es el n ú m ero pi. P a ra el
A D N del bac terió fa g o \ , j tien e u n v a lo r de 3 ,22 x 1 0 11 extrem os/m L . E l v a lo r j
p a ra c u a lq u ie r m o lécu la d e A D N p u e d e se r calculado en re la ció n a j \ p o r la
ecuación
en la q u e j \ es igual a 3 ,22 x 10u ex tre m o s/m L y P M re p rese n ta el p eso m o lec

ular. B ajo circ u n stan cias en las q u e j es igual a i (j = i o j / i = 1), el ex tre m o de
c u a lq u ie r m o lécu la d e A D N tien e la m ism a p ro b a b ilid ad d e u n irse con o tra
m o lécu la co m o d e in tera ccio n a r co n su pro p io ex tre m o opuesto. Si j es m ay o r
q u e i (j > i), los sucesos d e lig ació n in tram o lec u la r p re d o m in a n y los círc u lo s son
lo s p ro d u c to s p rincipales. Si i es m ay o r q u e j (i > j), lo s p rocesos d e ligación
in term o lecu lar están fav o rec id o s y p re d o m in a n las estructuras h íb rid as lineales.
L a ligación d e frag m en to s a p lásm id o s pu ed e se r m ás efic ien te cu a n d o i es dos
o tres v ec es m a y o r q u e j — relación q u e fa v o rec erá la ligación interm olecular
pero p erm itirá la circ u lariza ció n d e las m oléculas re com binante— . A d em ás, la
co n c en tra ció n d e los ex tre m o s d e inserto (/¡nserto) d eb e ría se r apro x im a d am en te el
do b le d e la co n c en tra ció n d e lo s extrem os d el p lásm id o linearizado
(înserto 2lVector)-
L a efic ien cia d e tran sfo rm ac ió n es u n a m ed id a d e cu á n tas bac terias son capaces
de in co rp o rar plásm id o s re com binantes. S e ex p resa co m o tran sfo rm an tes/|ig
ADN.
L a pro b a b ilid ad d e e n c o n trar u n c lo n p a rtic u la r d en tro d e u n a lib rería recom
b in a n te g en e rad a d e fo rm a a le ato ria p u ed e se r estim ad a seg ú n la siguiente
ecuación:
ln (1 - P )
N
en la q u e / es el tam añ o p ro m ed io d e inserto c lo n a d o (en p b ), G es el tam año del

gen o m a d ia n a en p b , N es el nú m ero d e clo n e s ind ep e n d ie n tes y P es la p ro b a b i
lid ad d e aislar u n seg m en to d e A D N específico.
E l n ú m ero d e clones q u e ten e m o s q u e a n a liz ar en u n a lib rería d e A D N c p ara

o b ten e r el re co m b in an te d e u n A R N m ra ro con u n a pro b a b ilid ad dete rm in a d a
p u ed e ca lcu larse con la ecuación
N =
en la q u e N es el n ú m ero d e clo n e s de A D N c en la librería, P es la p ro b a b ilid ad de

q u e ca d a tip o d e A R N m sea re p rese n ta d o en la lib rería al m en o s u n a v e z (P es
n o rm alm en te estab le cid o c o m o 0 ,9 9 ; u n a pro b a b ilid ad d el 9 9 % d e e n c o n trar un
A R N m ra ro represe n ta d o en la lib rería d e A D N c), n es e l n ú m ero de m oléculas del
A R N m m ás raro en u n a c é lu la y T es el n ú m ero to tal d e m oléculas d e A R N m en
u n a célula.
C u an d o se c o n stru y e u n a lib rería d e expresión, la p ro b a b ilid ad d e o b ten e r un
c lo n reco m b in an te co n e l inserto p o sicio n ad o co rrec tam en te en el v e c to r viene
d ete rm in a d a p o r la ecuación
tam añ o d e la s ec u en cia co d ific an te (e n kb)

tam añ o del g en o m a (en k b ) x 6
L a h ib rid ac ió n d e u n a so n d a a u n a lib rería reco m b in an te d eb e ría se r llev ad a a

ca b o a u n a tem p eratu ra (T¿) 15 °C p o r d eb a jo d e la Tm d e la sonda:
T¡ = Tm — 15 °C
Tm se ca lcu la co n la ecuación
Tm = 16,6 lo g [M\ + 0,41 [PGc] + 8 1,5 - P m - B /L - 0 ,65 [Pf \
en la q u e M es la c o n c en tra ció n m o lar d e N a +, P Gc es el p o rc en taje de b a se s G y C

e n la so n d a de olig o n u cleó tid o , Pm es el po rc en taje d e b a se s n o com plem entarias,
P j es el po rc en taje d e fo rm a m id a , B es igual a 675 (p a ra sondas d e ha sta 100 n t de
tam añ o ) y L es el tam añ o de la so n d a en nt. L a Tm d e so n d as co n tam añ o su p erio r a
100 b ase s p u ed e se r ca lcu lad a con la sig u ien te fórm ula
T m = 81,5 °C + 1 6,6(lo g [N a+]) + 0,41 (% G C )

— 0 ,63 (% fo rm am ida) — 6 0 0 /L
en la que M e s la concentración m o lar d e N a +, h asta u n m áxim o d e 0,5 M ( I X SSC

contiene 0,165 M N a4) ; P gc es el porcentaje d e bases G y C en la sonda de
oligonucleótido (entre el 30 y el 70% ), Pm es el porcentaje de bases no com plem en
tarias, si se conoce (cada porcentaje de falta de com plem entariedad dism inuirá la Tm
en aproxim adam ente 1 °C ); Pj-es el porcentaje d e form am ida; B es 675 (para sondas
sintéticas d e h asta 100 n t de tam año), y L es el tam año d e sonda en nt.
E l nú m ero d e p o sicio n es d e u n g e n o m a co n cie rta co m p lejid ad a las cuales u n a

so n d a d e o lig o n u d e ó tid o se h ib rid ará v ien e determ in ad o p o r la ecuación
en la q u e P q es el n ú m ero d e com p lem e n ta ried a d es p erfectas independientes, L

e s el tam añ o d e la so n d a d e o lig o n u d e ó tid o y C es la co m p lejid ad d el g en o m a
diana.
L a h ib rid ac ió n d e u n a so n d a d e o lig o n u d e ó tid o al A D N d e u n a lib rería
re co m b in an te es típ ic am en te llev ad a a ca b o a 2-5 °C p o r debajo d e la Tm del
o lig o n u d e ó tid o . E l período d e tiem po ap ro x im a d o q u e se d e b e d eja r la re acc ió n de
h ib rid ac ió n para co n se g u ir la m ita d d e la eje cu ció n d e la m ism a v ien e determ inado
p o r la ecuación
en la q u e k es u n a co nstante d e ta sa de p rim er o rd e n y C es la co n c en tra ció n m o lar

d e la so n d a d e o lig o n u d e ó tid o (en m oles d e n t p o r L).
L a co n stan te d e tasa, k, re p rese n ta la ta sa d e h ib rid ac ió n d e u n a so n d a de
o lig o n u d e ó tid o a u n ác id o nu cle ic o d ian a im m o v ilizad o e n p re sen cia d e 1 M
ion d e sodio y está d ete rm in a d a p o r la ecuación
_ 3 y 105 ¿ ° ’s L / m o l/ s
en la q u e k se ca lc u la en L /M de n t p o r segundo, L es el tam añ o d e la so n d a de
o lig o n u d e ó tid o en n t y N es la co m p lejid ad de la sonda.
L a co m p lejid ad , cu an d o h ac e re feren cia a u n o lig o n u d e ó tid o , se ca lcu la co m o
el n ú m ero d e diferentes o lig o n u d e ó tid o s p o sib le s en u n a m ezcla. E l nú m ero total
d e diferentes o lig o n u d e ó tid o s en u n a m ezcla, su co m p lejid ad , se ca lcu la m ulti
p lican d o el nú m ero d e n t po sib le s en to d as las posiciones.
L a h ib rid ac ió n d e u n c lo n d e A D N reco m b in an te p u ed e se r llev ad a a cabo
u sa n d o u n a so n d a d e A D N cd pre p ara d a p o r el m éto d o d e trasla ció n de m ella. S i se
u san u n a tem p eratu ra d e h ib rid ac ió n d e 68 °C y u n a so lu ció n ac u o sa o b ien u n a
tem p eratu ra de 4 2 °C y u n a so lu ció n co n u n 5 0% d e fo rm a m id a , se p u ed e utilizar
la sig u ien te ecu ac ió n p a ra estim ar la ca n tid a d d e tiem po n ecesario p a ra lleg ar a la
m itad d e eje cu ció n d e la re acc ió n d e hibridación:
d o n d e X es la cantidad d e so n d a añ a d id a a la re acc ió n d e h ib rid ac ió n (en n g ); Y

es la co m p lejid ad d e la so nda, la cual, p ara la m a y o r parte d e sondas, es p ro p o r
cio n a l al tam añ o de la so n d a en k b , y Z es el vo lu m en de la re acc ió n de hib rid ac ió n
(en m L ).
Bibliografía 367
L a h ib r id a c ió n c a s i c o m p le ta s e a lc a n z a tr a s tr e s v e c e s e l p e río d o ty2.
L o s c lo n e s re c o m b in a n te s p u e d e n s e r id e n tif ic a d o s m e d ia n te a lg u n a d ig e s tió n
p o r r e s t r ic c i ó n q u e e lim in e e l in s e r to (o u n a s e c c ió n c a r a c te r iz a d a d e l m is m o ). E l
ta m a ñ o d e lo s fra g m e n to s g e n e r a d o s s e p u e d e d e te r m in a r p o r e le c tr o fo r e s is e n u n
g e l q u e ta m b ié n c o n te n g a u n m a rc a d o r d e ta m a ñ o s . E l m a rc a d o r se u tiliz a p a ra
g e n e r a r u n a c u rv a e s tá n d a r y u n a e c u a c ió n d e r e c ta d e re g r e s ió n q u e s ir v e p a ra
d e te r m in a r e l ta m a ñ o d e lo s f ra g m e n to s d e lo s c lo n e s re c o m b in a n te s .
D e le c io n e s d e A D N c d p u e d e n s e r p r e p a ra d a s c o n la n u c le a s a B A L 3 1 . E l
t ie m p o d e in c u b a c ió n r e q u e ri d o p a r a p r o d u c ir u n a d e le c ió n d e s e a d a p u e d e e s ti
m a rs e a p a rtir d e la e c u a c ió n
.. .. 2 M „*W
e n la q u e M¡ e s e l P M d e l d ú p le x d e A D N tr a s t m in u to s d e in c u b a c ió n ; M0 es el
P M o r ig in a l d e l d ú p le x d e A D N ; M„ e s e l P M p r o m e d io d e u n m o n o n u c le ó tid o
(c o n sid e ra d o c o m o 3 3 0 D a); Vm&x e s la v e lo c id a d m á x im a d e la r e a c c ió n (e n
m o le s d e n t e lim in a d o s /L /m in ); t e s e l p e r ío d o d e tie m p o d e in c u b a c ió n e n m in ;
Kmes la c o n s ta n te d e M ic h a e lis - M e n te n ( e n m o le s d e e x tre m o s d e A D N c d /L ) , y Sq
s o n lo s m o le s d e e x tre m o s d e A D N c d /L a t = 0 m in .
C la r k , L ., a n d J . C a r b ó n ( 1 9 7 6 ). A c o lo n y b a n k c o n ta in in g s y n th e tic C o l E l h y b r id p la s m id s
re p re se n ta tiv e o f th e e n tir e E. coli g e n o m e . Cell 9 :9 1 .
D a v is , L .G ., M .D . D ib n e r, a n d J.F . B a tte y ( 1 9 8 6 ).Basic Methods in Molecular Biology. E ls e v ie r
S c ie n c e , N e w Y o rk .
D u g a ic 2y k , A ., H .W . B o y e r, a n d H .M . G o o d m a n ( 1 9 7 5 ). L ig a tio n o f EcoR I e n d o n u c le a s e
g e n e r a te d D N A fra g m e n ts in to lin e a r a n d c irc u la r stru c tu re s. J. Mol. Biol. 9 6 :1 7 4 —184.
L a ird , C .D . ( 1 9 7 1 ). C h r o m a tid stru c tu re : r e la tio n s h ip b e tw e e n D N A c o n te n t a n d n u c le o tid e
se q u e n c e d iv e rs ity . Chromosoma 3 2 :3 7 8 .
L e g e r s k y , R .J ., J .L . H o d n e tt, a n d H .B . G ra y ( 1 9 7 8 ). E x tr a c e ll u la r n u c le a s e s o f p s e u d o m o n a d
Bal7>\ III. U s e o f th e d o u b le -s tra n d d e o x y rib o e x o n u c le a s e a c tiv ity a s th e b a s is o f a
c o n v e n ie n t m e th o d f o r m a p p in g f ra g m e n ts o f D N A p r o d u c e d b y c le a v a g e w ith r e s tric tio n
en zy m es. Nucl. Acids Res. 5 :1 4 4 5 .
M a n ia tis , T ., E .F . F r its c h , a n d J. S a m b r o o k (1 9 8 2 ). Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
C o ld S p r in g H a r b o r L a b o ra to ry , C o ld S p r in g H a r b o r , N Y .
W a lla c e , B .R ., a n d C .G . M iy a d a ( 1 9 8 7 ). O lig o n u c le o tid e p r o b e s fo r th e s c re e n in g o f r e c o m b in a n t
D N A lib ra rie s. Meth. Enzymol. 1 5 2 :4 3 2 .
W a lla c e , B .R ., J . S h a f fe r, R .C . M u r p h y , J . B o n n e r , T . H ir o s e , a n d K . I ta k u r a ( 1 9 7 9 ).
H y b r i d iz a tio n o f s y n th e tic o lig o d e o x y r ib o n u c le o tid e s to c|>X174 D N A : th e e ff e c t o f s in g le
b a s e p a ir m is m a tc h . Nucl. Acids Res. 6 :3 5 4 3 .
Capítulo
E x isten div erso s m o tiv o s p a r a crear clo n e s d e A D N recom binante. U n o es analizar
l a actividad d e u n elem ento d e c o n tro l ex ó g e n o , p o r ejem plo u n p ro m o to r o u n
enhancer. E sto se co n sig u e co lo c an d o el elem ento d e co n tro l m u y ce rca d e u n gen
in d icad o r q u e co d ific a p a ra u n a en z im a q u e se p u e d e a n a liz ar fácilm ente. L o s
g en e s m ás p o p u lare s p ara esta fin alid ad s o n el g en lacZ, q u e co d ific a p a ra la
(3-galactosidasa, e l g en cat, q u e c o d ific a p a r a la cloranfenicol acetiltransferasa
(C A T), y el g en luc, q u e co d ific a p a r a la p ro teín a luciferasa, c o n cap ac id a d para
g en e rar pro d u c to s q u e em iten luz.
L a ca n tid a d de en z im a p ro d u c id a p o r u n siste m a d e u n g en in d icad o r se ex p resa
n o rm alm en te en térm in o s d e un id ad e s. P a ra la m a y o r p a rte d e p ro teín a s, u n a
u n i d a d se defin e co m o la cantidad d e ac tiv id a d en z im á tic a p o r perío d o d e tiem po
div id id a entre la ca n tid a d d e p ro teín a n ec esaria p ara g en e rar dich a actividad b ajo
co n d ic io n e s d efin id a s d e re acc ió n en u n v o lu m en d eterm inado. U n a un id ad d e la
en d o n u c leasa d e re stric ció n E coR I, p o r eje m p lo , se d efin e co m o la ca n tid a d de
en z im a n ec esaria p ara d ig erir co m p leta m e n te 1 p g d e A D N d e d o b le c a d e n a en
60 m in a 37 °C en u n v o lu m en de re acc ió n d e 50 pL . E l cá lcu lo de las u n id ad e s de
p roteína, p o r tan to , re q u ie re el en sayo d e am b a s, la ac tiv id a d y la ca n tid a d de
proteína.
E ste capítulo tra ta so b re lo s cá lcu lo s n ecesarios p ara cu a n tific ar p ro te ín a y,
verem o s v ario s ejem plos d e cóm o, a n a liz ar la ac tiv id a d proteica.
11.1 C Á L C U L O D E L P E S O M O L E C U L A R D E U N A
P R O T E ÍN A A P A R T IR D E S U S E C U E N C IA
E l conocim iento del peso m olecular d e u n a proteína p u ed e ay u d a r a su
caracterización, análisis o purificación. Si conoce la secuencia d e am inoácidos de
u n a p ro teín a o la secuencia d e A D N del gen que codifica p ara dicha proteína y
p uede, p o r tanto, extrapolar su secuencia de am inoácidos, entonces p u ed e determ i
n a r e l p eso m olecular d e la proteína m ediante la su m a d el p eso m olecular d e los
am inoácidos individuales. D ado q u e los am inoácidos están unidos p o r puentes
p eptídicos form ando u n a ca d en a proteica, y dado q u e los puentes p eptídicos se
form an m ediante u n p aso que im plica la elim inación d e agua, cuando se realizan
estos cálculos se debe utilizar el p eso m olecular d e cada am inoácido m en o s el peso
370 CAPÍTULO 11 Proteína
d e u n a m olécula d e H2O (18,02 D a), tal com o s e m uestra en la T abla 11-1. N o debe
u sarse el p eso m olecular d e lo s am inoácidos libres dad o que esto sobrestim aría el
v a lo r d el p eso m olecular real d e la proteína. U n a v e z se h a sum ado el p eso m olecular
d e to d o s los am inoácidos individuales, tien e q u e añ a d ir 18,02 D a adicionales para
ten e r en cu e n ta el H extra e n el am inoácido am inoterm inal y e l O H extra en el
am inoácido en el extrem o carboxilo. L a expresión general p ara esta operación es
Val
P M p ro te in a = X P M aa) + 18,02
Ala
d o n d e PMproteina es el p eso m o lecu la r d e la p ro teín a , E es la su m a d e lo s p eso s

m o lecu la res en la p roteína, naa es el n ú m ero d e v ec es q u e u n am in o ác id o está
p re sen te en la p ro teín a , y PMaa es el p eso m o lecu la r d e ca d a am in o ác id o pre sen te
en la proteína.
T a b la 11-1 Los 20 am inoácidos, sus símbolos y sus pesos moleculares. Los

pesos m oleculares se calculan para la especie no ionizada m enos agua
Am inoácido A b reviación de Abreviación de Peso m olecular

tres letras una letra
Ácido glutámico Glu E 129,12

Ácido aspártico Asp D 115,09
Alanina Ala A 71,09
Arginina Arg R 156,19
Asparagina Asn N 114,11
Cisteína Cys C 103,15
Fenilalanina Phe F 147,18
Glicina Gly G 57,05
Glutamina Gln Q 128,14
Histidina His H 137,14
Isoleucina lie 1 113,16
Leucina Leu L 113,16
Lisina Lys K 128,17
Metionina Met M 131,19
Prolina Pro P 97,12
Serina Ser S 87,08
Tirosina Tyr Y 163,18
Treonina Th T 101,11
Triptófano Trp W 186,21
Valina Val V 99,14
Peso promedio 119,40
11.1 Cálculo del peso molecular de una proteína a p artir de su secuencia 371
P ro b le m a 11.1 Un fragmento de proteína tiene la siguiente secuencia de

aminoácidos. ¿Cuál es su peso molecular?
MGLKPCERVWFIIQHDDCYAARP
S o lu c ió n 11.1
Realizamos la suma de los pesos moleculares de todos los aminoácidos indivi
duales (basándonos en la Tabla 11-1) y añadimos el peso molecular de una
molécula de agua (18,02):
Peso molecular = 131,19 + 57,05 + 113,16 + 128,17 + 97,12 + 102,15

+129,12 + 156,19 + 99,14+ 186,21 + 147,18
+ 113,16+ 113,16 + 128,14+ 137,14+ 115,09
+ 115,09+ 103,15 + 163,18 + 71,09 + 71,09
+156,19 + 97,12 + 18,02
- 2.749,3
Por tanto, esta proteína tiene un peso molecular de 2.749,3 Da.
P ro b le m a 11.2 ¿Cuál sería una estimación rápida del peso molecular de la

proteína descrita en el Problema 11.1?
S o lu c ió n 11.2
Un cálculo simple y rápido del peso molecular de la proteína se lleva a cabo
multiplicando el número de aminoácidos en el fragmento de proteína (en este
caso, 23 residuos) por el peso molecular promedio de un aminoácido (119,4 Da;
Tabla 11-1):
23 x 119,4 = 2.746,2 Da
A este valor le añadimos el peso molecular de una molécula de agua:
2.746,2 + 18,02 = 2.764,22 Da
Por lo tanto, como estimación somera, el fragmento de proteína descrito en el

Problema 11.1 tiene un peso molecular de 2.764 Da.
Dado que el cálculo del peso molecular de proteínas de gran tamaño puede ser
rebuscado, una búsqueda por Internet puede facilitar el acceso a diferentes
aplicaciones que permiten calcular el peso molecular de la proteína auto
máticamente (como, por ejemplo, el sitio web mantenido por la University of Dela
ware y el Georgetown University Medical Center; Figuras 11-1 y 11-2).
■ FIGURA 11-1 Diversas calculadoras de peso molecular están disponibles en Internet. En el sitio http://pir
.georgetown.edu/pirwww/search/comp_mw.shtml, el investigador introduce el nombre de una proteína (en formato
UniProtKB) o los códigos de los aminoácidos de la proteína y el peso molecular se calcula automáticamente.
¡i ii i i i í i i i i i i i i
■ FIGURA 11-2 El peso molecular de una proteína se calcula automáticamente cuando la secuencia de
aminoácidos es introducida en el campo mostrado en la Figura 11-1. El peso molecular de la proteína es calculado
como la suma del peso molecular de cada aminoácido menos la contribución en peso molecular del agua, la cual ha
sido multiplicada por el número de aminoácidos de la cadena menos uno.
11.2 Cuantificación de protema mediante la medida de la absorbancia a 280 nm 373
11.2 C U A N T IF IC A C IÓ N D E P R O T E ÍN A M E D IA N T E
L A M E D ID A D E L A A B S O R B A N C IA A 2 8 0 NM
E x isten d iv erso s m éto d o s p a ra estim ar la co n c en tra ció n d e proteína. U n o d e los
m ás sim ples es m ed ir la a b so rb an cia a 2 8 0 nm . L as p ro teín a s ab so rb en lu z U V a
2 8 0 n m prin cip a lm e n te d eb id o a la p re sen cia d e lo s am in o ác id o s arom áticos
tiro sin a y trip tó fan o y a los p u entes disu lfu ro entre resid u o s cisterna (fenilalanina,
q u e es tam b ién u n a m in o ác id o arom ático, ab so rb e a 26 0 n m c o n m u c h a m ás
efic ien cia q u e a 2 8 0 nm ). D a d o q u e diferentes pro teín a s tie n e n diferen tes canti
dades d e am in o ác id o s c o n ca d en a s laterales arom áticas, h a b rá varia b ilid a d en el
g ra d o al cu a l diferentes proteínas ab so rb an lu z a 2 8 0 nm . A d em ás, las condiciones
q u e alteran la estru c tu ra terc iaria d e u n a p ro teín a (tipo d e tam p ó n , p H y agentes
re d u cto re s) pu ed e n afecta r a su absorbancia. P ese a la varia b ilid a d , la lec tu ra d e la
a b so rb an cia a 2 8 0 n m se u s a frecuentem ente, y a q u e s o n po ca s las sustancias
q u ím icas q u e tam b ién ab so rb en a es a lo n g itu d d e onda.
C o m o apro x im a ció n m u y so m era, u n a u n id ad d e a b so rb an cia a 2 8 0 n m es
igual a 1 m g p ro teín a /m L . L a so lu ció n co n p ro te ín a a an a liz ar d eb e ría s e r d ilu id a si
su a b so rb an cia a 2 8 0 n m es m a y o r q u e 2,0.
P ro b le m a 11.3 Una solución de una proteína purificada se diluye

dispensando 0,2 mL en un volumen total de 1,0 mL en una cubeta con 1 cm de
recorrido para el paso de luz. La lectura de espectrofotometría a 280 nm da un
valor de 0,75. ¿Cuál es la estimación somera de la concentración de proteína?
S o lu c ió n 11.3
Este problema puede ser resuelto estableciendo la siguiente regla de tres:
1 m g/m L _ x m g/m L
1 unidad de absorbancia 0,75 unidades de absorbancia
La resolución de la x da el siguiente resultado:
■ 8 (1 m g/m L) x (0,75) , . ,
i ---- —— y — ----- - = x = 0,75 mg de proteina/mL
g Dado que la muestra de proteína ha sido diluida 0,2 mL/1,0 mL, para determinar
'5 la concentración de proteína de la muestra original este resultado debe ser
I multiplicado por el inverso del factor de dilución:
I 0,75 mg 1,0 mL , , , .
8 :— x ------ - — 3,75 mg de proteina/mL
o mL 0,2 mL 3 K '
o
<¿
| Por lo tanto, la solución de proteína purificada tiene una concentración aproxi-
3 mada de 3,75 mg/mL.
374 C A P IT U L 0 11 Proteína
113 U S O D E L O S C O E F I C IE N T E S D E A B S O R B A N C IA
Y D E E X T IN C IÓ N P A R A E S T IM A R
L A C O N C E N T R A C IÓ N D E P R O T E ÍN A
E l coeficien te d e ab so rb a n c ia d e u n a p ro teín a es su a b so rb an cia a d eterm inada
co n c en tra ció n y lo n g itu d d e o n d a en u n a cu b e ta d e 1 cm . L o s coeficientes de
abso rb an cia se dete rm in a n n o rm alm en te p a r a co n c en tra cio n es convenientes,
co m o 1 m g/m L , 1% o 1 m olar. E n el CRC Handbook o f Biochemistry and
M olecular Biology (CRC Press, B o c a R ato n , F L , E stad o s U n id o s), lo s coeficien
tes d e a b so rb an cia v ien e n d ad o s p ara soluciones al 1% E l coe ficien te de
a b so rb an cia de u n a so lu ció n d e p ro te ín a al 1% es equ iv a le n te a la ab so rb an cia de
u n a so lu ció n a l 1% d e u n a p ro te ín a dete rm in a d a a cie rta lo n g itu d d e o n d a en u n a
cu b e ta d e 1 cm . E l coe ficien te d e abso rb an cia d e u n a so lu ció n c o n 1 m g /m L de
pro teín a (ab rev iad o c o m o ^ lmg/mL) es eq u iv a le n te a la a b so rb an cia d e u n a
so lu ció n c o n 1 m g /m L d e u n a p ro teín a d ete rm in a d a a cie rta long itu d d e on d a
en u n a c u b e ta d e 1 cm . D a d o q u e los coeficientes d e a b so rb an cia d e p e n d en d el pH
y la fu e rza iónica, c u a n d o se utilic en lo s valo re s ca lcu lad o s es im p o rtan te u sa r las
m ism as co n d ic io n e s ex p e rim en tales co n las q u e s e c a lcu laro n dich o s coeficientes.
E l c oeficien te d e extin ción m o la r (EM; tam b ién d en o m in ad o ab sortivid ad
m o la r y d esig n ad o co n el s ím b o lo s ) d e u n a p ro teín a es equ iv a le n te a la ab so r
b a n c ia d e u n a so lu ció n 1 M d e u n a dete rm in a d a pro teín a a cie rta lo n g itu d de o n d a
en u n a cu b e ta d e 1 cm . T iene un id ad e s d e M - I cm - 1 . S in em bargo, dad o q u e la
p rá ctica h ab itu al es u tiliz ar u n a cu b e ta d e 1 c m d e ancho, las u n id ad e s norm al
m en te se ignoran. A u n q u e la m ay o ría d e coeficientes d e e x tin ció n s o n determ i
n ad o s a 2 8 0 n m , n o siem p re es éste e l ca so y, p o r tan to , deb e p re sta rse ate n ció n a la
lo n g itu d d e o n d a d e lu z u tiliz ad a al h a c e r la m edida.
U sa n d o los co e ficien te s, la co n c en tra ció n d e pro teín a pu ed e se r d ete rm in a d a a
trav é s d e la s ig u ie n te re la ció n (S to sch ec k , 1990):
, , , r\ absorbancia
concentración d e p r o t e m a (en m g / m L ) = ---- 1 m g /m L—
^lcm
. . abso rb an cia
co n c en tra ció n d e p ro te m a (e n %) = — ------
, , , . , ,s abso rb an cia
co n c en tra ció n d e p ro te in a (e n m o larid ad ) — -----------------
Eu
U n a so lu ció n al 1% u tiliz ad a p a ra d ete rm in a r el p o rc en taje d e coe ficien te de
extinción d e la solución, A 1%, es equivalente a l g/100 m L. D ado que 1 g/100 m L
e s equivalente a 10 m g/m L , si la concentración d e proteína debe ser expresada en
m g/m L , el valor de absorbancia/A 1% debe ser m ultiplicado p o r u n factor de 10:
. . . . absorbancia
concentración d e p ro tein a (en m g /m L ) = ------- ^ ------ x 10
11.3 Uso de los coeficientes de absorbancia y de extinción para estimar la concentración de proteína 375
P ro b le m a 1 1 .4 La acetilcolinesterasa de E. electricus tiene un coeficiente de

absorbancia (>A1%) de 22,9 en 0,1 M NaCI, 0,03 M fosfato sódico, pH 7,0 a
280 nm. Una solución de esta proteína da una lectura de 280 nm de 0,34 en una
cubeta de 1 cm. ¿Cuál es su concentración en porcentaje?
La siguiente ecuación será utilizada:
absorbancia
concentración de proteina = ----— -----
La sustitución de estos valores da el siguiente resultado:
0,34
% de concentración de proteína = ----
K 22,9
- 0,015%
Por lo tanto, una solución de acetilcolinesterasa con una absorbancia de 0,34

tiene una concentración de 0,015%.
P ro b le m a 1 1 .5 ¿Cuál es la concentración de acetilcolinesterasa del Problema

11.4 en mg/mL?
Usaremos la siguiente ecuación:
., . , absorbancia
concentración de proteina (en m g/m L) = ---- ---------->
Con la introducción de los valores del Problema 11.2, tenemos
, ■ - 0-34
concentración de proteina = x ^
= 0,15 mg/mL
Por lo tanto, la solución de acetilcolinesterasa del Problema 11.4 tiene una

concentración de 0,15 mg/mL.
376 C A P ÍT U L 0 11 Proteína
P ro b le m a 1 1 .6 La acetilcolinesterasa tiene un coeficiente de extinción molar

[Em) de 5,27 x 105. En una cubeta de un 1 cm, una solución de la proteína tiene
un A2so de 0,22. ¿Cuál es su concentración molar?
La siguiente ecuación será utilizada:
., , / . . . .s absorbancia
concentración de proteina (en molaridad) = ----- ------
Em
La sustitución de los valores proporcionados da el siguiente resultado:
0,22
M ~ ----------- f = 4,2 x 10
,M
5,27 x I O 5
Por lo tanto, la solución de acetilcolinesterasa tiene una concentración de

4,2 x 10~7 M.
En Internet se pueden encontrar aplicaciones para calcular la concentración de

proteína basándose en su absorbancia y coeficiente de extinción. Un ejemplo es
la calculadora de concentración de proteína mantenida por la University of
Oxford (Figura 11 -3).
t Protein concentration calculator

t t f |l
ft
NuffieldDepartment otMedicine
Protein concentration calculator

te Now" buttonor click anywhereonthe screen outsidetheinput boxes.
tinction coefficient
Jlecular weight <Daeg36000}
The number of milligramsof pn
■ FIGURA 11-3 Una aplicación informática mantenida por la University of Oxford para determinar la
concentración de una proteína basándose en su coeficiente de extinción molar y absorbancia: http://www.ccmp.ox
.ac.uk/ocallaghan/webtools/protein_concentration_calculator.htm.
11.3.1 R ela ció n e n tre el co e fic ie n te d e a b s o rb a n cia

y el c o e fic ie n te de e x tin ció n m o lar
E l co e ficien te d e a b so rb an cia d e u n a so lu ció n d e p ro teín a al 1% (A [cm'%) se
re la cio n a co n el coe ficien te d e ex tin ció n m o lar (£ m ) d e la s ig u ie n te fo rm a
(K irschenbaum , 1976):
_ (A ¡^m) (p e so m olecular)
U n a so lu ció n d e p ro teín a al 0 ,1 % es eq u iv a le n te a 1 m g d e proteína/m L . Su

a b so rb an cia p u e d e se r esc rita co m o A 0,1%. S e p u ed e ca lcu lar divid ien d o el coefi
c ie n te d e ex tin ció n m o lar entre el p eso m olecular:
ô,i% _ Em
lcm p eso m o lecu la r
P ro b le m a 1 1 .7 La (3-galactosidasa de £ coli tiene un peso molecular de

750.000. Su coeficiente de absorbancia para una solución al 1% es 19,1. ¿Cuál es
su coeficiente de extinción molar?
La sustitución de estos valores en la ecuación anterior da el siguiente resultado:
(19,1) (750.000) 1 ,4 x 107 6
Por lo tanto, la (3-galactosidasa tiene un coeficiente de extinción molar de

1,4 x 106.
P ro b le m a 1 1 .8 El coeficiente de extinción molar de una proteína que está

estudiando es 6,0 x 104. En un gel SDS PAGE, la proteína muestra un peso
molecular de 75.000. ¿Cuál es la absorbancia esperada para 1 mg/mL de
solución de esta proteína?
Usaremos la siguiente relación para resolver este problema:
peso molecular
La sustitución de nuestros valores da lugar a
Por lo tanto, una solución de 1 mg/mL de esta proteína debería tener una
absorbancia de 0,8.
11.3.2 D e te rm in a ció n d e l c o e fic ie n te d e e x tin ció n d e u n a

p ro te ín a
E l coeficiente de ex tin ció n a 20 5 n m de u n a p ro te ín a p u ed e se r d eterm inado co n la
sig u ien te fó rm u la (S copes, 1974):
E sta ec u ac ió n p u ed e s e r u tiliz a d a cu a n d o la pro teín a está a u n a co ncentración

desc o n o cid a. U n a v e z se h a calculado la concentración, el coeficiente de extinción
a 2 8 0 n m p u e d e s e r determ in ad o c o n la sig u ien te ecuación:
m g d e p ro te ín a /m L
■#280 nm
^280
Nota: E s ta ecu ac ió n no d a rá u n re su lta d o p re ciso p a r a pro teín a s co n un

co n te n id o in u su al d e fenilalanina.
P ro b le m a 1 1 .9 Una solución de proteína de concentración desconocida se

diluye dispensando 30 p,L en un volumen final de 1 mL. A 205 nm, la solución
diluida da una lectura de absorbancia de 0,648. La absorbancia a 280 nm es
0,012. ¿Cuál es el coeficiente de extinción molar a 205 y a 280 nm?
Los valores proporcionados son utilizados en la ecuación para determinar el
coeficiente de extinción de una proteína:
= 27 + 120(0,019) = 27 + 2,28 = 29,28

Por lo tanto, el coeficiente de extinción a 205 nm es 29,28 para la muestra

diluida. Para obtener el coeficiente de extinción de la muestra no diluida, este
valor es multiplicado por el factor de dilución:
30 |xL
Así, el coeficiente de extinción molar a 205 nm es 976.
La concentración de proteína puede ser determinada usando la ecuación que

relaciona la molaridad, la absorbancia y el coeficiente de extinción molar:
molaridad =
C205
Dado que el coeficiente de extinción molar, f 205nnv ha sido calculado para la

muestra original (no la muestra diluida), el v a lo ra o s debe ser multiplicado por el
factor de dilución para que todos los términos sean determinados a partir de
datos equivalentes:
1.000 laL
¿205 = 0,648 x = 21,6
30 jiL
La ecuación para el cálculo de la molaridad se escribe ahora de la siguiente

manera:
21,6
molaridad = ---- = 0,22 M
976
El coeficiente de extinción molar a 280 nm (£280 nm) se calcula usando la

siguiente relación:
Para utilizar esta ecuación para este problema, el valor A2so debe ser multipli
cado primero por el factor de dilución para que todos los términos sean tratados
de forma equivalente:
30 \iL
El coeficiente de extinción molar a 280 nm puede ser calculado a continuación:
0,022 M
E280 nm = ' = 0,055
Por lo tanto, el coeficiente de extinción molar para esta proteína a 205 nm es 976
y a 280 nm es 0,4.
La absorbancia de una proteína a 280 nm viene dictada por su contenido en

triptófano, tirosina y cistina (la molécula formada por dos cisternas unidas por un
puente disulfuro). Pace et al. (1995) han mostrado que el coeficiente de
extinción molar de una proteína a 280 nm puede ser estimado sumando las
veces que cada uno de estos aminoácidos aparece en la proteína previa
multiplicación de este valor por los propios coeficientes de extinción de estos
aminoácidos (5 .5 0 0 /W-1cm -1 para el triptófano [W],1.490 M-1cm -1 para la
tirosina [Y] y 125 M-1cm -1 para la cistina [C]), según la siguiente relación:
Em = (nW x 5.500) + (nY x 1.490) + (nC x 125)
donde n es el número de veces que un residuo aparece en la proteína.
P ro b le m a 1 1 .1 0 Una proteína tiene cuatro residuos triptófano, seis residuos

tirosina y tres cistinas. ¿Cuál es su coeficiente de extinción molar estimado?
Usaremos la siguiente relación:
E m = (nW x 5.500) + (nY x 1.490) + (nC x 125)
Con la sustitución de nuestros valores, tenemos
Em = (4 x 5.500) + (6 x 1.490) + (3 x 125)
Em = (22.000) + (8.940) + (375)
E m = 31.315
Por lo tanto, la predicción del coeficiente de extinción molar de esta proteína es

31.315 M-1cm -1.
11.4 R E L A C IÓ N E N T R E L A C O N C E N T R A C IÓ N EN
M IL IG R A M O S P O R M IL IL IT R O Y L A M O L A R ID A D
L a co n c en tra ció n d e p ro teín a en m ilig ram o s p o r m ililitro se re la cio n a c o n la
m o larid ad d e la s ig u ie n te form a:
co n c en tra ció n (e n m g /m L ) = m o larid ad x p eso m o lecu la r d e la p ro teín a
E sta relación se p u e d e u s a r p a ra c o n v e rtir u n a co n c en tra ció n e n m ilig ram o s p o r

m ililitro a m o larid ad y v ice v ersa . N ó tese q u e esta ec u ac ió n d a rá u n resultado en
11.4 Relación entre la concentración en miligramos p or m ililitro y la molaridad 381
g ra m o s p o r litro. S in em bargo, esto es lo m ism o q u e m ilig ram o s p o r m ililitro. P o r

ejem plo, 4 g /L es lo m ism o q u e 4 m ilig ram o s p o r m ililitro, tal co m o se m u estra en
l a sig u ien te relación:
4 g 1L 1.000 m g _ 4 m g
L 1.000 m L g mL
P ro b le m a 11.11 Una proteína tiene un peso molecular de 135.000 g/mol.

¿Cuál es la concentración en mg/mL de una solución 2 x 10-4 M I
Usando la relación entre la concentración en mg/mL y la molaridad tenemos
, , 2 x 10-4 mol 135.000 g 1.000 mg 1L

m g/m L = ------- -------- x -------- ¡— x ----------- x ------------
a/ L mol g 1.000 mL
= 27 mg/mL
Por lo tanto, una solución 2 x 10-4 M de una proteína con un peso molecular
de 135.000 está a una concentración de 27 mg/mL.
P ro b le m a 1 1 .1 2 Una proteína tiene un peso molecular de 167.000. Una

solución de esta proteína tiene una concentración de 2 mg/mL. ¿Cuál es la
molaridad de la solución?
Para resolver la molaridad, la ecuación para convertir molaridad y peso mole
cular a mg/mL debe ser reorganizada de la siguiente forma:
peso molecular de la proteína
La sustitución de los valores proporcionados da el siguiente resultado:
2 m g/m L
' 167.000 g/mol '
Por lo tanto, la solución de proteína tiene una concentración de 1,2 x 10-5 M.

382 CAPITULO 11 Proteína
11.5 C U A N T IF IC A C IÓ N D E P R O T E ÍN A
M E D IA N T E A 280 C U A N D O E X IS T E N
Á C ID O S N U C L E IC O S C O N T A M IN A N T E S
A u n q u e lo s ác id o s nu cle ic o s ab so rb en lu z U V d e fo rm a m áx im a a 2 6 0 nm , no
m u estra n u n a fu e rte a b so rb an cia a 2 8 0 nm . L a m ed id a d e la co n c en tra ció n de
pro teín a d e ex tracto s crudos q u e tam b ién co n tien en ác id o s nu cle ic o s (A R N y
A D N ) d ará artificialm ente ele v ad as estim acio n e s de p ro teín a . L a lec tu ra a 2 8 0 nm
debe, p o r tan to , se r co rreg id a re sta n d o la co n trib u c ió n d e lo s ác id o s nucleicos.
E sta relación v ien e d ete rm in a d a p o r la sig u ien te ecu ac ió n (L a y n e, 1957):
co n c en tra ció n d e p ro te ín a (en m g /m L ) = (1,55 x A 28o) — (0 ,7 6 x A 260)
P ro b le m a 1 1 .1 3 Un investigador va a determinar la concentración de

proteína de un extracto crudo. Ajusta a cero el espectrofotómetro a 260 nm con
tampón, diluye 10 |xL del extracto en un volumen total de 1,0 mL en una cubeta
de cuarzo de 1 cm y a continuación toma una lectura del extracto crudo.
Obtiene una lectura A260 de 0,075. Ajusta a cero el espectrofotómetro a 280 nm
con tampón y lee el extracto diluido a dicha longitud de onda. Obtiene un valor
A 28o de 0,25. ¿Cuál es la concentración aproximada de proteína en el extracto
crudo?
Utilizando la ecuación anterior y sustituyendo los valores que el investigador
ha obtenido con el espectrofotómetro, se obtiene el siguiente resultado:
m g/m L = (1,55 x 0,25) - (0,76 x 0,075)

- 0,39 - 0,06 = 0,33 m g/m L
Por lo tanto, la proteína en la cubeta de 1 mL tiene una concentración aproxi

mada de 0,33 mg/mL. El investigador, sin embargo, diluye su muestra 10 \ ú j
1.000 p,L y toma una medida. Para determinar la concentración de proteína de la
muestra no diluida, este valor debe multiplicarse por el inverso del factor de
dilución:
, , 1.000 mL , ,
0,33 m g/m L x ---------— = 33 m g/m L
y/ 10 mL
Por lo tanto, la muestra original no diluida tiene una concentración de proteína

aproximada de 33 mg/mL.
11.7 Cuantificación de proteína a 205 nm cuando existen ácidos nucleicos contaminantes 383
11.6 C U A N T IF IC A C IÓ N D E P R O T E ÍN A A 2 0 5 NM
L as p ro teín a s tam b ién ab so rb en lu z a 2 0 5 n m y co n m a y o r sen sib ilid a d q u e a
2 8 0 nm . L a a b so rb an cia a esta lo n g itu d d e o n d a se d e b e prin cip a lm e n te a los
p u en te s p e p tíd ico s entre am inoácidos. D a d o q u e to d as las p ro teín a s p o se e n p u e n
tes pep tíd ico s, ex iste m en o s v a ria b ilid a d e n tre proteínas a la lo n g itu d d e o n d a de
2 0 5 n m q u e a la d e 2 8 0 nm . M ientras q u e la cuan tific ac ió n a 2 8 0 n m fun c io n a
m e jo r p a ra proteínas en el ra n g o d e 0 ,02 a 3 m g e n u n a cu b e ta d e 1 m L , la
a b so rb an cia a 2 0 5 n m es m ás sen sib le y fu n c io n a p a r a co n c en tra cio n es d e 1 a
100 (Lg d e p ro teín a p o r m ililitro.
L a c o n c en tra ció n d e p ro te ín a a 205 n m p u e d e s e r e stim ad a co n la ecu ac ió n de
S to sc h eck (1990):
co n c en tra ció n d e p ro te ín a (en m g /m L ) = 31 x A 205
P ro b le m a 1 1 .1 4 Una muestra de proteína purificada es diluida de manera

que 2 jiL de muestra son dispensados en un volumen final de 1,0 mL en una
cubeta de cuarzo. Una lectura de 205 nm da un valor de 0,0023. ¿Cuál es la
concentración de proteína aproximada de la muestra original?
Con la ecuación anterior y estos valores, obtenemos
m g/m L = 31 x 0,146 = 4,53 m g/m L
Por tanto, la concentración de proteína en la cubeta es 0,07 mg/mL. Sin

embargo, esto representa la concentración de la muestra diluida. Para obtener
la concentración de proteína de la muestra original no diluida, debemos multi
plicar este valor por el inverso del factor de dilución:
1.000 mL , ,
4,53 m g/m L x —^ ^ — = 2.265 m g/m L
Por lo tanto, la muestra no diluida tiene una concentración de 2.265 mg

proteína/mL.
117 C U A N T IF IC A C IO N D E P R O T E IN A A 2 0 5 NM
C U A N D O E X IS T E N Á C ID O S N U C L E IC O S
C O N T A M IN A N T E S
L o s ác id o s nu cle ic o s co n trib u y e n m u y p o c o a la lec tu ra d e ab so rb an cia a 205 nm .
N o o b stan te, sí q u e c o n trib u y e n d e fo rm a m ás sustancial a las lecturas realizadas
co n la o tra lo n g itu d de o n d a a la cual ab so rb en las proteínas: 2 8 0 nm . P ara co rreg ir
la co n trib u c ió n de A R N y A D N a la estim ació n d e p ro te ín a e n ex tracto s crudos, se

u tiliz a la sig u ien te ecu ac ió n (P eterson, 1983):
A
co n c en tra ció n d e p ro teín a (en m g /m L ) — —?—
(^27 + (120
V ^2C
P ro b le m a 1 1 .1 5 Un extracto crudo es diluido de manera que se dispensan

2,5 en un volumen final de 1.000 (xL en una cubeta de 1 cm. Se toman las
lecturas de absorbancia a 205 y 280 nm y se obtienen los siguientes resultados.
¿Cuál es la concentración de proteína en el extracto crudo?
^205 = 0,648
^280 = 0,086
S o lu c ió n 1 1 .1 5
Utilizando la fórmula anterior y los valores proporcionados se obtiene el
m g/m L =
r , x 0,0861
27 + (120) —----
L v 0,648j
27 + (120)0,13
0,648
_ 2 7 + 1 5 ,6
0,648 , ,
= — — - 0,015 m g/m L
42,6 a/
Así, la concentración de proteína en la cubeta es 0,015 mg/mL. No obstante,

dado que se trata de una muestra diluida, para obtener la concentración de
proteína en la muestra original no diluida, este valor debe ser multiplicado por el
inverso del factor de dilución:
1.000 m L , ,
0,015 m g/m L x ^ ^ = 6 m g/m L
Por lo tanto, el extracto crudo tiene una concentración de proteína de aproxi

madamente 6 mg/mL.
11.8 Medición de la concentración de proteína por ensayo colorimétrico: el ensayo Bradford 385
118 M E D IC IÓ N D E L A C O N C E N T R A C IÓ N D E
P R O T E ÍN A P O R E N S A Y O C O L O R IM É T R IC O :
EL EN SA YO BRAD FO RD
E x isten d iv erso s m éto d o s pu b licad o s p a ra la m ed ició n d e la co n c en tra ció n de
p ro teín a p o r en sa y o s colorim étricos. C a d a un o d e ellos se b a s a en la interacción
entre la p ro te ín a y u n re activ o qu ím ic o colorante. E sta in tera cció n c o n d u c e a u n
cam bio d e c o lo r dete ctab le co n u n espectrofotóm etro. L a a b so rb an cia d e u n a
m u estra p ro te ic a d e co n c en tra ció n d esc o n o cid a se c o m p a ra co n u n a cu rv a
e stán d a r g en e rad a a p a rtir d e u n a bate ría d e d ilu cio n es d e u n a p ro te ín a d e la cual
co n o c em o s la co n c en tra ció n . L a c o n c en tra ció n d e la m u estra d esc o n o cid a es
in terp o lad a a p a rtir d e la c u rv a estándar.
U n o d e lo s m éto d o s m ás p o p u lare s p a ra cu a n tific ar pro teín a s m ed ian te re acti
v o s colorantes re cib e el n o m b re d e en sayo B radford (en re feren cia a su inventor,
M ario n B rad fo rd [1976]). E l m éto d o u tiliz a Coomassie Brilliant Blue G-250
co m o su stan cia c o lo ra n te q u e se u n e a pro teín a s. C u an d o la p ro teín a s e u n e al
co lorante, se pro d u c e u n au m e n to d e ab so rb an cia a 595 n m . L a re acc ió n de u n ió n
al co lo ra n te tien e lu g a r en ta n sólo u n p a r d e m in u to s y el ca m b io d e co lo r es
estab le p o r u n a h ora. E l lím ite in ferio r d e sen sib ilid a d d el en sayo es ap roxim ada
m e n te d e 2 0 0 jig proteína/m L .
N o ta : P ara construir u n a cu rv a estándar se deberían utilizar réplicas (al m enos

dos, preferiblem ente tres) de cada dilución. S ólo u n a m uestra d e cada concentración
será utilizada aquí para sim plificar los cálculos.
P ro b le m a 1 1 .1 6 Un investigador prepara diluciones de albúmina de suero

bovino (BSA) en cantidades que varían desde 10 a 100 ng en un volumen de
0,1 mL (se ajusta el volumen con tampón cuando es necesario). Cinco m L de
reactivo colorante (Bradford, 1976) es añadido a cada tubo, y la mezcla se agita
con un vórtex y se deja reposar durante al menos 2 min a temperatura
ambiente. La absorbancia a 595 nm es a continuación leída con un
espectrofotómetro. Se obtienen los resultados mostrados en la Tabla 11-2. Una
proteína purificada de concentración desconocida es diluida de manera que
2 nL de la misma son dispensados en un volumen total de 100 nL, los cuales
reaccionan con el reactivo colorante Bradford del mismo modo que el estándar
proteico. Su absorbancia a 595 nm es 0,44. ¿Cuál es la concentración de proteína
en la muestra original no diluida, en mg/mL?
S o lu c ió n 1 1 .1 6
Los datos se representan en un gráfico de curva estándar (Figura 11-4) con
Microsoft Excel (véase el Apéndice A). El análisis de regresión lineal de la curva
estándar da lugar a la siguiente ecuación:
y = 0,0087x + 0,0396
T a b la 11-2 Absorbancia a 595 nm de

muestras de albúm ina de suero bovino (BSA)
con cantidades conocidas de proteína
ixg de BSA A 595

10 0,11
20 0,21
30 0,30
40 0,39
50 0,48
60 0,58
75 0,71
100 0,88
10 0 .1 1
20 0 .2 1
30 0.3
40 0 .3 9
50 0 .4 6
60 0 .5 8
75 0 .7 1
100 0 .8 8
■ FIGURA 11-4 Gráfico para el Problema 11.16.

11.9 Utilización de la (3-galactosidasa para la monitorización de la actividad de un promotor 387
En esta ecuación,y representa la absorbancia a 595 nm y x representa la cantidad

en ng de proteína. Dado que tenemos el valor y (0,44), podemos resolver la x:
0,44 = 0,0087x + 0,0396
0,44 - 0,0396 = 0,0087x
0,4004 = 0,0087x
0,4004
------- = x = 46
0,0087
Por lo tanto, en el tubo de ensayo existen 46 ng de proteína, o, dicho de otra

forma, los 2 nL de preparación proteica que se han colocado en el tubo de
ensayo contienen 46 ng de proteína. Esto representa una concentración de
23 mg/mL en la muestra original, tal como se muestra en la siguiente conversión:
46 ng 1 000 nL 1 mg 23 mg
2 nL 1 mL 1.000 ng rnL
Por lo tanto, la preparación proteica original no diluida tiene una concentración

de 23 mg de proteína/mL.
11.9 U T IL IZ A C IÓ N D E L A p - G A L A C T O S ID A S A
P A R A L A M O N IT O R IZ A C IÓ N D E L A A C T IV ID A D
D E UN P R O M O T O R Y L A E X P R E S IÓ N G É N IC A
E l az ú ca r lac to sa es u n d isacá rid o d e g ala cto sa y g lu c o sa u n id o s p o r u n pu en te
(3-galactósido. L a en z im a (3-galactosidasa, el p ro d u c to d el g e n lacZ, ro m p e el
p u e n te (3-galactósido p ara lib era r lo s m o n o sacá rid o s g ala cto sa y g lucosa. U n
co m puesto co n o c id o co m o O N P G (o-nitrofenol-(3-D -galactopiranósido) tien e
u n a estru c tu ra q u e im ita a la la c to s a y p u e d e s e r d ia n a d e la (3-galactosidasa
(F ig u ra 11-5). 0-nitrofenol-(3-D -galactopiranósido, sin em b a rg o , co n tien e u n an i
llo o-n itro fe n o l (O N P ) e n v e z d e g lu cosa. C u an d o O N P G , u n co m p u e sto incoloro,
es frag m en tad o , s e lib e ra O N P, u n co m p u e sto am arillo. O -nitrofenol ab so rb e lu z a
4 2 0 nm . E ste p ro c eso re p rese n ta u n en sayo ad e cu a d o d e la ac tiv id a d (3-galacto-
sidasa. E n p re sen cia d e u n ex c eso d e O N P G , la ca n tid a d d e co lo r am arillo (es
decir, la ca n tid a d d e O N P liberada) es d irectam ente pro p o rcio n al a la cantidad de
(3-galactosidasa en el en sayo y al tiem p o q u e se h a d ejado d e reacción. D a d o q u e la
actividad d e la (3-galactosidasa se p u ed e an a liz ar c o n tan ta facilidad, el g en lacZ
p u e d e s e r c o lo c ad o en p o s ic ió n 3 ’ d e u n p ro m o to r p a ra d ete rm in a r su actividad
b ajo diferentes co n d icio n es. E l g en lacZ tam b ié n se p u e d e fu sio n ar m anteniendo
la p a u ta d e lec tu ra c o n u n g en q u e co d ific a p a ra u n a p roteína, to d o ello b ajo el
control d el p ro m o to r n atural d e la p ro teín a . E sta ap ro x im a ció n p erm ite m onitori-
za r la ac tiv id a d d e dich o p ro m o to r y la ex p resió n d el gen.
no2
NO;
"O
o-Nitrofenol
(amarillo)
p-D-Galactosa
■ FIGURA 11-5 La (3-galactosidasa rompe o-nitrofenol-(3-D-galactopiranósido (ONPG), un compuesto incoloro,

generando galactosa y o-nitrofenol (ONP). El ONP liberado es amarillo y absorbe luz a 420 nm.
11.9.1 A n á lis is d e la (3-galactosidasa en cu ltiv o s ce lu la re s

L a (3-galactosidasa se an a liz a n o rm alm en te a p a rtir d e cu ltiv o s de células E. coli en
crecim iento. L as células se c u ltiv an h a s ta q u e lleg an a la fase lo g arítm ica d e
crecim iento (2 — 5 x 110 8 células/m L ; D 0 6oo d e 0 ,28 a 0 ,7 0 ), el cultivo se
en fría en h ie lo d u ra n te 2 0 m in p a r a in h ib ir su crecim iento y s e ex tra e 1 m L p a ra
re alizar u n a lec tu ra DOôo- U n a a lícu o ta d el cultivo s e añ a d e a tam p ó n fosfato
(tam p ó n Z ), el cual co n tien e KC1, sulfato d e m ag n e sio y (3-m ercaptoetanol, de
m a n e ra q u e el v o lu m en final d e la reacción es 1 m L. P a ra h a c e r a las células
perm e ab les a O N P G , u n a g o ta d e to lu en o s e añ a d e al tu b o d e re acc ió n y a
con tin u ac ió n se ag ita el tu b o co n v ó rte x du ra n te 10 s. S e de ja ev a p o rar e l tolueno
y se c o lo c a el tu b o d e e n sa y o e n u n b añ o d e ag u a a 28 °C d u ra n te 5 m in. L a
re acc ió n se in icia cu an d o s e añ a d e O N P G . E l tiem p o d e reacción se m o n ito riz a y,
cu an d o se h a gen e rad o su ficie n te co lo r am arillo, se p ara la re acc ió n m ed ian te la
a d ic ió n d e ca rb o n ato só d ico p a ra a u m e n ta r el p H h a s ta u n n iv el en el cual la
ac tiv id a d (3-galactosidasa q u e d a inactivada. L a reacción d eb e ría d u ra r entre
15 m in y 6 h p a ra p ro d u c ir su ficie n te c o lo r am arillo. A co n tin u ac ió n , la D O se
m id e a 4 2 0 y 55 0 nm . L a lec tu ra ó p tim a a 4 2 0 n m d eb e ría se r en tre 0 ,6 y 0,9 . Si no
ca e d en tro d e este ra n g o , la m u estra d eb e ría se r d ilu id a adecuadam ente.
A m b o s, el O N P y la lu z d isp ersa d a p o r lo s re sto s celulares, con trib u y e n a la
a b so rb an cia a 4 2 0 nm . L a disp ersió n d e la lu z se corrige to m an d o u n a m e d id a de
a b so rb an cia a 55 0 n m , u n a lo n g itu d d e o n d a a la cu a l n o s e pro d u c e co ntribución
p o r p arte d el O N P. L a ca n tid a d d e lu z d isp ersa d a a 4 2 0 n m es p ro p o rcio n al a la
ca n tid a d d isp ersa d a a 55 0 nm . E s ta re la ció n se d escrib e p o r la ecuación
D O 420 d isp ersió n d e lu z = 1,75 x D O550

L a abso rb an cia a 4 2 0 n m del co m p o n e n te O N P p u ed e se r ca lcu lad a utiliz an d o

esta relación co m o fa cto r d e co rrec ció n y su stray e n d o la D O 550 m u ltip licad a p o r
1,75 d e la lec tu ra d e a b so rb an cia a 4 2 0 nm . L as u n id ad e s d e (3-galactosidasa son
e ntonces ca lcu lad as u sa n d o la fó rm u la d e M ille r (1972):
/ X V X DOéoo
en la q u e D O 420 y D O 550 so n leídas a p a rtir d e la m ez cla d e re acc ió n , DOôo es la

a b so rb an cia d el cultivo ce lu la r ju s to an te s d e em p e zar el en sa y o , t es igual al
tiem p o d e re acc ió n (en m in ) y v es el v o lu m en (en m L ) d el cultivo alicuotado
u tiliz ad o en el ensayo.
P ro b le m a 1 1 .1 7 El gen lacZ((3-galactosidasa) ha sido clonado adyacente a un

promotor inducible. Las células recombinantes son crecidas hasta una fase log y
una muestra es recogida para medir los niveles de (3-galactosidasa en el estado
no inducido. A continuación se añade el agente inductor y se deja que las células
crezcan durante 10 min antes de enfriarlas en hielo. Una alícuota de 1 mL del
cultivo muestra una D 06oo de 0,4. A una alícuota de 0,2 mL del cultivo se le
añaden 0,8 mL de tampón Z, tolueno y ONPG. Después de 42 min, se añade
Na2C 0 3 para parar la reacción. Una medida a 420 nm da una lectura de 0,8. La
medida a 550 nm da una lectura de 0,02. ¿Cuántas unidades de (3-galactosidasa
están presentes en los 0,2 mL de cultivo inducido?
S o lu c ió n 1 1 .1 7
Usando la ecuación
t X V X DO600
y sustituyendo nuestros valores da el siguiente resultado:
, , (0,8) - (1,75 x 0,02)

unidades = 1.000 x ^ - ^ — — ------- -—
42 x 0,2 x 0,4
_ 765
_ 3^36
= 228 unidades de enzima
Por lo tanto, existen 228 unidades de (3-galactosidasa en 0,2 m L de cultivo, o

228 unidades/0,2 mL = 1.140 unidades de (3-galactosidasa/mL.
11.9.2 A c tiv id a d e sp ecífica

A v e c e s p u e d e se r d ese ab le c a lcu lar la ac tiv id a d esp e cífica d e la (3-galactosidasa en
u n a reacción. L a a c tiv id a d esp e c ífic a se d efin e com o el n ú m ero d e un id ad e s de
en z im a p o r m iligram o d e p roteína. L a cuan tific ac ió n d e p ro teín a fue desc rita
an terio rm en te e n este capítulo. S in em bargo, au n q u e n o se cu a n tifiq u e directa
m en te la ca n tid a d d e p ro te ín a en u n extracto, se p u ed e estim ar d ic h a cantidad
asum iendo q u e existen 150 p,g d e p ro teín a p o r 109 células y qu e, en el ca so d e E.
coli, u n a D O 600 d e 1,4 es eq u iv a le n te a 109 células/m L .
P ro b le m a 1 1 .1 8 Sise asume que 1 mL de las células descritas en el Problema

11.17 contiene 43 (ig de proteína, ¿cuál es la actividad específica de la
(3-galactosidasa en ese problema?
S o lu c ió n 1 1 .1 8
En el Problema 11.17 se calculó que 1 mL de cultivo contiene 1.140 unidades de
(3-galactosidasa/mL. La actividad específica puede ser calculada ahora de la
siguiente forma:
1.140 unidades I.OOOug . .

--------- :----------— x ---------- = 26.512 unidades/mg de proteina
43 mg de proteina mg
Por lo tanto, la (3-galactosidasa en el cultivo celular tiene una actividad específica

de 26.512 unidades/mg proteína.
11.9.3 A n á lis is d e la (3-galactosidasa a p a rtir d e e x tra cto s

c e lu la re s p u rifica d o s
P ara algunas aplicaciones, la (3-galactosidasa pu ed e se r analizada a partir d e u n a
fuente m ás p u rificada que la descrita en el P roblem a 11.12. P or ejem plo, si las
células son elim inadas p o r centrifugación antes d el ensayo o si la proteína (o proteína
d e fusión) se purifica p o r técnicas bioquím icas, entonces e l v alo r D O é0o que es parte
d el cálculo para determ inar las unidades d e (3-galactosidasa es irrelevante.
E n u n pro to co lo descrito p o r R o b ertso n e t al. (1997), la ac tiv id a d (3-galactosi-
d a s a (Za) se ca lcu la co m o el n ú m ero d e m icro m o les d e O N P G con v e rtid o s a O N P
p o r un id ad d e tiem po y no re q u ie re u n a m ed id a d e den sid ad ce lu la r a 600 nm .
V iene d ete rm in a d a p o r la ecuación
en la q u e A 4\ <>es la a b so rb an cia a 4 1 0 nm ; E4\0 es el coeficiente d e ex tin ció n m olar

d e O N P a 4 1 0 n m (3,5 m L /p m o l), asu m ien d o el u s o de u n a cu b e ta c o n u n 1 cm de
re co rrid o d e luz; V es e l vo lu m en d e re acc ió n , y t es el tiem p o , en m in u to s, q u e se
h a dejado p a ra q u e a p a rec iera el co lo r am arillo.
P a ra llev ar a ca b o el en sayo (3-galactosidasa, 2 ,7 m L d e 0,1 M fosfato sódico,
p H 7 ,3 ; 0,1 m L de 3 ,3 6 M 2 -m ercap to e ta n o l; 0,1 m L d e 3 0 m M M g C k , y 0,1 m L
d e 34 ra M O N P G so n m ez clad o s en u n a c u b e ta d e espectrofotom etría. L a m ez cla
d e re acc ió n se u s a p a ra a ju star a c e ro e l esp e ctro fo tó m etro a 4 1 0 nm . D ie z (iL d e la
m u estra en la q u e se pre te n d e a n a liz ar la ac tiv id a d (3-galactosidasa son añ a d id o s a
los 3 m L d e m ez cla d e re acc ió n y e l a u m e n to d e a b so rb an cia a 4 1 0 n m es
m onitorizado. C u an d o la A 4U) alc an za u n v a lo r entre 0 ,2 y 1,2 se p ara la
m onitorización.
P ro b le m a 1 1 .1 9
a) Un gen que lleva al gen lacZ fusionado en pauta de lectura correcta es
colocado bajo el control del promotor temprano de SV40 en un plásmido
recombinante que es transfectado a células de mamíferos en cultivo.
Tras 48 h, 1 mL de células es sonicado y centrifugado para eliminar los
restos celulares. Se ajusta a cero el espectrofotómetro utilizando la
mezcla de reactivos, preparada tal como hemos descrito anteriormente. A
continuación, 10 p,L de muestra son añadidos a 3 mL de mezcla de reactivos
y el aumento en absorbancia a 410 nm es monitorizado. Tras 12 min,
se consigue una absorbancia de 0,4. ¿Cuál es la actividad de enzima
(3-galactosidasa, en micromoles por minuto, en la muestra de reacción?
b) Una muestra de 20 p,L de lisado celular, al cual se le han eliminado los
restos celulares, se utiliza para un ensayo Bradford destinado a medir la
cantidad de proteína. El ensayo indica que esta alícuota contiene 180 |jg
de proteína. ¿Cuál es la actividad específica de la muestra?
S o lu c ió n 1 1 .1 9 (a )
El ensayo da los siguientes resultados:
^ 4 10 = 0,4,
f - 12 min y
V = 3,01 mL (3 mL de mezcla de reacción + 10 p,L de muestra).
Estos valores son colocados en la ecuación que permite calcular la actividad

(3-galactosidasa:
------
^ _ (\3,5 T T -----
mL/m i ) 3'01 mL
m ol)
12 min
Z _ (0,114 ixm o)(3,01)

w -----h;— a 0,343 umo
j _ _ í----- p---- _ 0)03 umol/min
12 min 12 min
Por lo tanto, los 3,01 mL de reacción producen 0,03 pmol de ONP por minuto.
S o lu c ió n 1 1.19(b)
El ensayo Bradford para medir el contenido en proteína ha dado como resultado
180 (xg de proteína en los 20 |xL de muestra. Este valor se convierte a micro-
gramos por mililitro de la siguiente forma:
180 ixg proteína

— w — = 9 ^ L
La cantidad de proteína en 10 p,L de muestra se calcula de la siguiente forma:
9 ixg proteína
10 ixL x -------- ¡------- = 90 ixg proteina
|i,L
La actividad específica de 10 [xL de muestra en el ensayo enzimático es la

actividad dividida entre la cantidad de proteína en dicha muestra:
0,03 ^mol/min 0,0003 pmol/min

actividad específica = -
90 |xg p,g
Por lo tanto, la muestra tiene una actividad específica de 3 x 10-4 jxmol/min/^g.
11.10 C R O M A T O G R A F ÍA D E C A P A F IN A (T L C )
Y F A C T O R D E R E T E N C IÓ N (R f)
L a c r o m a to g ra f ía de c a p a fin a (T L C , del inglés Thin Layer Chromatography) es
u n m éto d o d e s ep a rac ió n de co m p u e sto s seg ú n su ta s a de m ov im ie n to a trav é s de
u n a ca p a fin a d e g el d e s ílic e (la fa se estacionaria) co n stru id o so b re u n a p la c a de
vidrio. U n a m u estra p ro teic a es c a rg ad a en u n p u n to en la b a s e d e la p laca
(ap ro x im ad am en te a 1 cm d el lím ite in ferio r) a lo largo d e u n a lín e a m arcada
co n láp iz p erp en d icu lar al eje larg o d e la placa. E ste p u n to s e d e sig n a co m o el
origen. L a p la c a d e T L C , ca rg ad a c o n m uestra, es a con tin u ac ió n c o lo c a d a de
fo rm a vertical e n u n a cá m ara d e cro m a to g rafía s e lla d a q u e co n tien e u n p equeño
v o lu m en de so lv en te (tal com o etilacetato o u n alcohol). E l so lv en te (denom inado
fase estacionaria) n o d e b e ría te n e r u n v o lu m en q u e cu b ra al origen. C u an d o la
p la c a d e T L C s e e n c u en tra en co n ta cto c o n el solvente, la ac ció n d e cap ila rid ad
h ac e q u e el s o lv en te s e m u e v a h a c ia arrib a a lo larg o d e la placa. L o s com puestos
11.10 Cromatografía de capa fina (TLC) y factor de retención (R f) 393
d e la m uestra, a m e d id a q u e se d isu elv en en el so lv en te en asc en sió n , tam b ién se

desp laz an h a c ia arrib a y se sep a ran a u n a v elo c id a d q u e d ep e n d e d e su p o larid a d ,
solu b ilid ad y s u in tera cció n co n la fa se estacionaria.
C u an d o el s o lv en te casi h a alc an za d o el final d e la p arte superior, la p lac a se
sep a ra de la cá m ara y e l fren te del s o lv en te se m arc a co n lápiz. L a p la c a p u ed e se r
in cu b a d a co n re activ o re v e la d o r (y o d o o n inhidrina), el cual p erm ite la
v isu alizac ió n d e las m o lécu la s separadas y a q u e p ro d u c en p u n to s m ás o m en o s
circulares en el gel. L o s pu n to s son re m a rc ad o s co n láp iz y su s dista n cias desd e el
o rig en se m id e n co n u n a re g la . L a d ista n cia d esd e el o rig en h a sta el centro
g eo m é tric o d el p u n to d iv id id o en tre la d ista n cia d esd e el o rig en h a s ta e l frente
(Rf). C u an to m a y o r se a u n v a lo r de
d el s o lv en te s e d en o m in a fa cto r d e rete n ció n
Rf, m ás h a m ig rad o el co m p u e sto d esd e el origen.
^ d ista n cia d e m ig rac ió n d el co m puesto

f d ista n cia d e m ig rac ió n d el solvente
E l v a lo r R f es u n a c o n s ta n te fís ic a p a r a u n a m o lé c u la o rg á n ic a y p u e d e se r
u s a d o p a ra co rro b o ra r la id e n tid a d d e u n a m o lécu la . S i d o s m o lé c u la s tien en
d iferen tes v a lo re s R f b a jo c o n d ic io n e s id é n tic a s d e cro m a to g ra fía — es decir,
si so n sep a rad a s en la m ism a p la c a d e T L C — so n co m p u e sto s d iferen tes. Si
d o s m o lé c u la s tie n e n el m ism o v a lo r Rf, p uede se r q u e se a n el m ism o
c o m p u e sto .
D a d o q u e es difícil q u e c o in c id a n las con d ic io n e s d e cro m a to g rafía entre
ex p e rim en to s (c o n cen tració n d e so lv en te, tem p eratu ra, g ro so r d el g el d e sílice,
ca n tid a d d e m u e s tra cargada, etc.), lo s v alo res Rf re la tiv o s (Rrei) son u sad o s a
m en u d o p a ra ex p resar lo s datos. U n v a lo r Rrei se ca lc u la en re feren cia al Rf d e u n a
e stán d a r c o n o c id a q u e es sep a rad a en la m ism a p la c a y a la m ism a vez. L o s v alo res
Rrei e n u n s o lv en te determ in ad o d e b e rían m an ten e rse constantes.
R f d e la m u estra d esc o n o cid a

rcl Rf d el e stán d a r
§ P ro b le m a 1 1 .2 0 Una muestra de proteína purificada encontrada en el

| congelador del laboratorio ha perdido su rotulación. Es separada en una
| placa de TLC para ver si puede ser rápidamente identificada. Cuando la
& placa de TLC se separa de la cámara de cromatografía, el frente del solvente
0 se marca y la placa se trata con spray de ninhidrina. Las medidas revelan que
1 el frente del solvente se ha desplazado 7,3 cm desde el origen, la muestra
oí no identificada ha migrado 4,1 cm y una estándar ha migrado 5,4 cm
g (Figura 11-6). ¿Cuál es el valor Rf de la muestra desconocida y cuál es su Rrei
Í3 comparado con el estándar?
Frente
del solvente
Origen
■ FIGURA 1 1 -6 Experimento de cromatografía en capa fina (TLC) descrito en el Problema 11.20.
El Rf de la muestra desconocida se calcula como la distancia que ha migrado
desde el origen (4,1 cm) dividida entre la distancia que se ha desplazado el
frente del solvente (7,3 cm). Esto da lugar a un valor Rf de 0,56:
4,1 cm
Rf - -í- ---- = 0,56
7,3 cm
El estándar ha migrado 5,4 cm. Tiene un valor Rf, por tanto, de 0,74 (5,4 cm
dividido entre 7,3 cm). El Rre| es el Rf de la muestra desconocida dividido entre el
Rf del estándar:
0,56
Rrel = —---= 0,76
0,74
El Rrei, por lo tanto, es 0,76.
11.11 E S T IM A C IÓ N D E L P E S O M O L E C U L A R
D E U N A P R O T E ÍN A P O R F IL T R A C IÓ N EN G E L
L a crom a to g r a fía d e filtración en gel (tam b ién den o m in ad a cr o m atografía de
exclu sión m o lecu lar) es u n m éto d o d e sep a rac ió n d e m oléculas en fu n c ió n d e su
tam año. M ed ian te esta téc n ic a, u n a m u estra p ro teic a es su sp en d id a en u n a
so lu ció n ac u o sa (la fa se m ó v il) y a p lica d a al extrem o su p erio r d e u n a c o lu m n a
d e cro m a to g rafía re lle n ad a con u n a m atriz d e dim in u ta s esferas p o rosas (la fase
11.11 Estimación del peso molecular de una proteína por filtración en gel 395
estacionaria). L as m oléculas m á s p eq u e ñ as d en tro d e la m u estra en tra rá n e n los

p o ro s d e las esferas y , p o r gra v ed ad , se d esplazarán h a c ia ab a jo a través d e la
co lum na, sig u ie n d o u n a larg a y le n ta ru ta a trav é s d e la m atriz. C o m o co n se cu en
c ia d e la c o m p lica d a ru ta q u e su p o n e en tra r y s alir d e las esferas, su d esp laz a
m ien to a lo larg o d e la co lu m n a se h ac e m ás lento. O tras m oléculas d e la m u estra
co n u n tam añ o su ficie n te m en te gra n d e co m o p ara n o p o d e r en tra r en los p o ro s de
las esferas se desp laz an p o r la co lu m n a siguiendo u n a ru ta m ás s im p le y directa.
E n co n se cu en c ia, eluirán ráp id am en te. L as m o lécu la s d e tam añ o interm edio p u e
d en te n e r diferen tes g ra d o s d e p e n e trac ió n en las esferas — las m oléculas m ás
p eq u e ñ as en tra rá n m ás q u e las m ás g ra n d es—-. D e este m o d o , las m oléculas d e la
m u estra elu y e n d e la c o lu m n a en o rd e n in v erso al tam añ o — las m o lécu la s m ás
g ra n d es (aq u ellas co m p leta m e n te ex c lu id a s) e lu y e n p rim ero m ien tras q u e las
m o lécu la s m ás p eq u e ñ as (aquéllas capaces d e en tra r en lo s p o ro s d e las esferas)
son las ú ltim a s en eluir— . U n m o n ito r d e U V d ete cta las diferentes m o lécu la s a
m e d id a q u e salen d e la colum na.
L a m atriz selec cio n ad a p a ra el fraccio n am ien to d e la m u estra y d eterm inación
del tam añ o m o lecu la r d ep e n d e d el ra n g o de tam añ o de las m o lécu la s en la m u estra
experim ental. L a m a y o r p arte d e pro v e ed o re s com erciales ofrece n u n a varie d ad de
m ateria les q u e fu n c io n a n c o m o m atrices d e c o lu m n a y tien en sus pro p io s tam añ o s
d e p o ro , ra n g o s d e fraccio n am ien to re co m en d a d o y lím ite s d e ex c lu sió n — e l peso
m o lecu la r d e la m o lécu la m ás p eq u e ñ a co n su ficie n te tam añ o com o p ara no p asar
p o r lo s p o ro s d e las esferas— . A lg u n o s d e lo s m ateriales m ás co m ú n m en te
u tiliz ad o s p a ra co lu m n as in clu y en S efacril® , S efadex® y Sefarosa® .
In d e p en d ien tem e n te d e las esferas q u e se usan , la co lu m n a deb e r se r calibrada
p rim ero. U n a m o lécu la c o n tam añ o m e n o r q u e la d e lo s p o ro s se p a s a p o r la
co lu m n a y se m id e el v o lu m en d e líq u id o q u e s e u tiliz a p a ra elu ir com pletam ente
la m olécula. E ste v o lu m en se den o m in a « v o lu m en to tal» y es desig n ad o co m o Vt.
D e l m ism o m o d o , u n a m o lécu la co n u n tam añ o m u ch o m ás gra n d e q u e el lím ite de
ex c lu sió n d el g el — u n a m o lécu la q u e co n to d a seguridad v a a se r ex c lu id a de
en tra r en lo s p o ro s d e las esferas— se p a s a a través d e la c o lu m n a y se m id e el
v o lu m en q u e se nec esita p a ra elu ir d ic h a m olécula. E ste v o lu m en s e den o m in a
v o lu m en v acío . R ep re sen ta la ca n tid a d d e líq u id o ex isten te entre las esferas d e la
co lum na. S e d esig n a Vq. E l vo lu m en total, Vt, a c o stu m b ra a se r alre d ed o r del 90%
d el v o lu m en d e m atriz — el v o lu m en in co rp o rad o p o r las esferas hidratadas
em p a q u etad as en la co lu m n a— . (E l v o lu m en d e m atriz se ca lc u la co m o t xr^h
d o n d e r es el ra d io m á s interno d e la c o lu m n a y h es la a ltu ra d el m aterial
em p a q u etad o en la co lu m n a.) E l v o lu m en v acío , Vq, se e n c u en tra e n el ra n g o de
ap ro x im a d am en te el 4 0 % d el v o lu m en d e m atriz.
P ara d ete rm in a r el tam añ o d e u n a m olécula, la co lu m n a de filtrac ió n en g el es
ca lib rad a u san d o u n g ru p o d e m o lécu la s e stán d a r d e tam añ o con o c id o . S e registra
el vo lu m en q u e s e n ec esita p a ra e lu ir ca d a m o lécu la d el estándar. E ste v o lu m en se
d e sig n a Ve y es característico p a ra ca d a m o lécu la del estándar. P a ra pro p o rcio n ar
con sisten c ia a los resultados, se d ete rm in a el coe ficien te de distrib u ció n (Kn) para
c a d a m olécula. E l m ism o se ca lcu la así
„ (V e ~ Vo)
° (V , - Vo)
L a representación del lo g 10 del p eso m olecular d e lo s estándar frente a los

valores K D g enera u n a cu rv a estándar con fo rm a d e recta. U n a proteína desconocida
pu ed e ser so m etid a a crom atografía a través d e la colum na y su p eso m olecular
extrapolado a partir de la cu rv a estándar, tal com o se m uestra en el P roblem a 11.21.
N o ta : L as pro teín a s tien en diferentes form as. P u ed en se r g lobulares, lineales o
estar p leg a d as en u n a in fin ita v a rie d ad d e co n figuraciones. L a fo rm a d e u n a
m o lécu la afecta rá a su m an e ra d e in tera ccio n a r c o n lo s p o ro s d e la s esferas de
la co lu m n a. L a elución, p o r tan to , está m ás estrictam ente re la cio n ad a c o n el
tam añ o m o lecu la r y la fo rm a q u e co n el p eso m olecular. L as p ro teín a s q u e se
utiliz an p a r a estab le cer u n a c u rv a e stán d a r deb e rían tener, en la m e d id a d e lo
p osible, la m ism a fo rm a g lo b al q u e la p ro teín a desc o n o cid a. N o o bstante, este
m éto d o d a u n a apro x im a ció n bastan te b u e n a del tam añ o d e u n a pro teín a en D a y,
p o r lo tan to , es ú til co m o h erram ien ta p a ra su caracterización.
P ro b le m a 1 1 .21 Se utiliza una cromatografía de filtración en gel para estimar

el peso molecular de una proteína. Se calibra una columna con un rango de
fraccionamiento de 5.000 a 250.000. La calibración nos da un volumen vacío, V0l
de 40 mL y un volumen total, Vt, de 90 mL. Se aplican varios estándares de peso
molecular a la columna y se miden los volúmenes de elución (valores 14 ), proceso
que genera los resultados mostrados en la Tabla 11-3. Una proteína purificada
tiene un volumen de elución de 60 mL. ¿Cuál es su peso molecular aproximado?
T a b la 11-3 Conjunto de datos para el Problem a 11.21, que m uestran el

peso m olecular de los estándares y sus volúm enes de elución
Proteína Peso m olecular V olum en de elución (Ve) en m L
Estándar A 12.500 82,5

Estándar B 15.300 81,25
Estándar C 22.000 77,5
Estándar D 25.100 75
Estándar E 28.700 70
Estándar F 33.300 68,75
Estándar G 45.200 67,5
Estándar H 74.500 55
Estándar I 96.800 52,5
Estándar J 120.000 50
Estándar K 244.000 41,25
11.11 Estimación del peso molecular de una proteína por filtración en gel 397
Calcularemos primero el coeficiente de distribución, KD, para cada molécula del
estándar. Dado que se ha determinado que el V0 para esta columna es 40 mL y el
Vt es 90 mL, el KD se calcula como
„ (V ,-V o )
D (1/t - V„ )
CV. - 40) ( M. - 40)

D (90 - 40) 50
Para la muestra estándar A, tenemos
(82,5 - 4 0 ) ^
50 50
Los valores K0 para el resto de estándares se calculan de forma similar y se

muestran en la Tabla 11-4.
Ahora podemos representar estos valores con Microsoft Excel (véase el

Apéndice A) frente al log de los valores de peso molecular de cada estándar;
el análisis de regresión lineal nos dará la ecuación de la recta que mejor se ajuste
a estos datos, la cual, para este ejemplo, es y = —0,6824x + 3,6742 (Figura 11 -7).
La proteína desconocida tiene un valor Ve de 60 mL. Su KD, por tanto, es 0,4:
(60 - 40) 20
K° = 5cT 50 4
T a b la 11-4 Conjunto de datos para el Problema 11.21, que m uestra los

volúm enes de elución para cada estándar y sus valores K D
Proteína Volumen de elución (en mL) Kd

Estándar A 82,5 0,85
Estándar B 81,25 0,825
Estándar C 77,5 0,75
Estándar D 75 0,7
Estándar E 70 0,6
Estándar F 68,75 0,575
Estándar G 67,5 0,55
Estándar H 55 0,3
Estándar 1 52,5 0,25
Estándar J 50 0,2
Estándar K 41,25 0,025
MW log MW KD
12500 4 .0 9 6 9 1 0 0 1 0 .8 5
15300 4 .1 8 4 6 9 1 4 3 0 .8 2 5
22000 4 .3 4 2 4 2 2 6 8 0 .7 5
25100 4 .3 9 9 6 7 3 7 2 0 .7
28700 4 .4 5 7 8 8 1 9 0.6
33300 4 .5 2 2 4 4 4 2 3 0 .5 7 5
45200 4 .6 5 5 1 3 8 4 3 0 .5 5
745 0 0 4 .8 7 2 1 5 6 2 7 0 .3
96800 4 .9 8 5 8 7 5 3 6 0 .2 5
120000 5 .0 7 9 1 8 1 2 5 0 .2
244000 5 .3 8 7 3 8 9 8 3 0 .0 2 5
y = - 0 .6 8 2 4 X + 3 .6 7 4 2
Curva estándar r z = o 9858
de fdtración en gel
Log de peso m olecular
■ FIGURA 11-7 Curva estándar generada por filtración en gel de proteínas de conocido peso molecular.
Este valor KD representa el valor y en la ecuación de la recta de regresión. La

utilización de esta ecuación y la sustitución de nuestro valor y nos permite
resolver el log del peso molecular de la proteína:
y = —0 , 6 8 2 4 x + 3 ,6 7 4 2
0 ,4 = — 0 ,6 8 2 4 x + 3 ,6 7 4 2
0 ,4 - 3 ,6 7 4 2 = — 0 ,6 8 2 4 x
-3 ,2 7 4 2 - — 0 ,6 8 2 4 x
11.12 El ensayo de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) 399
Por tanto, el log del peso molecular de la proteína desconocida es 4,798. Para
determinar su peso molecular, calculamos el antilog de este valor:
antilog 4,798 = 62.800
Así, la proteína desconocida tiene un peso molecular aproxim ado de

62.800 Da.
11.12 E L E N S A Y O D E C L O R A N F E N IC O L
A C E T IL T R A N S F E R A S A (C A T )
E l g en cat, q u e co d ific a p ara cloranfenicol ac etiltran sfe rasa (C A T), confiere
re sisten c ia al antib ió tico clo ra n fe n ic o l a aquellas bac terias q u e lo p o rta n y ex p re
san. E l g en cat, h a b ie n d o ev o lu c io n a d o en b ac terias, n o se e n c u en tra d e fo rm a
n a tu ra l en células d e m am íferos. S in em b a rg o , cu an d o se in troduce en células de
m am ífero s p o r tran sfecc ió n y b ajo el co n tro l d e u n pro m o to r ap ro p ia d o , el g e n cat
p u e d e expresarse. P o r este m o tiv o , h a sido u tiliz ad o frecu e n tem en te co m o gen
in d icad o r p a ra c o n tro la r la tran sfecc ió n y p a r a estu d iar la ex p resió n g én ic a en
células transfectadas.
L a cloranfenicol ac etiltran sfe rasa transfiere u n g ru p o acetilo (— C O C H 3) del
ac etil-co e n zim a A a d os p o sicio n es p o sib le s en la m o lé c u la d e cloranfenicol. P ara
re alizar u n en sayo de actividad CAT, se re co g e u n extracto de células q u e expresen
CA T y se in cu b a co n clo ra n fe n ic o l m arcado con [C 14]. L a tran sfere n cia del grupo
acetilo d esd e el ac etil-co e n zim a A h a c ia el cloranfenicol altera la m o v ilid a d del
antib ió tico e n u n a p lac a d e T L C . L a ca n tid a d d e cloranfenicol a c etilad a es direc
tam en te p ro p o rcio n al a la ca n tid a d d e en z im a CAT.
G o rm a n e t al. (1982) y K in g sto n (19 8 9 ) h a n desc rito d iv erso s p ro to co lo s para
lle v a r a cabo u n en sayo CAT. N o rm a lm e n te , 1 x 107 células d e m am ífero s son
tran sfecta d as co n u n p lásm id o q u e co n tien e u n cat b a jo control d e u n pro m o to r
eucariota. D espués d e d o s o tres d ías, las células s o n re su sp en d id as en 100 [iL de
2 5 0 vaM T ris, p H 7 ,5 . L as células son so nicadas y ce n trifugadas a 4 ° C para
e lim in ar lo s re sto s celulares. E l extracto es in cu b a d o a 60 °C d u ra n te 10 m in para
in ac tiv a r las acetilasas end ó g e n as y ce n trifu g ad o d e nu ev o a 4 ° C d u ra n te 5 m in.
Se añ a d en 2 0 |iL de extracto a u n a reacción q u e co n tien e 1 |xCi d e [C 14] clo ra n fe
n ico l (50 [iC i/m m ol), 140 m M T ris-H C l, pH 7,5 , y 0 ,4 4 m M ace til-co en z im a A en
u n v o lu m en final d e 180 |jL . S e d e ja q u e la re acc ió n te n g a lu g a r a 37 °C durante
1 h . S e añ a d en 4 0 0 |i,L d e acetato d e etilo frío, se m ez cla la m u estra y se centrifuga
d u ra n te 1 m in. L a fa se org á n ic a su p erio r s e tran sfie re a u n n u ev o tu b o y se se c a al
v acío . L a m u e s tra sec a se re su sp en d e en 30 p L d e acetato d e etilo y u n v o lum en
peq u e ñ o (5-10 pL ) es ca rg ad o c e rca del b o rd e d e u n g el d e s ílic e en u n a p la c a de
T L C . L a p lac a d e T L C se co lo c a en u n ta n q u e d e c ro m a to g rafía p re eq u ilib rad o con
2 0 0 m L d e cloroform o: m etan o l (19:1). S e d e ja q u e la c ro m a to g rafía p ro c e d a

ha s ta q u e el fren te d el s o lv en te se en c u en tre a 2/3 d e la d ista n cia en la plac a. Se
sec a la p la c a a l aire, se u tiliz a u n b o líg rafo co n tin ta ra d ia ctiv a p a ra m arc ar la
orientación d e la p lac a y se ex p o n e la p la c a a u n a p e líc u la d e ra y o s X . D a d o q u e el
cloranfenicol tien e d o s sitios p o ten c ia les d e acetilación, la ac tiv id a d C A T g en e ra
d os form as acetiladas, las cuales se desp laz an m ás rápido q u e la fo rm a no acetilada
(F ig u ra 11-8). E n con d ic io n e s d e ele v a d a ac tiv id a d C A T y cu an d o lo s sitios de u n a
acetilación están saturados, se p u ed e d ete ctar en u n a p o sició n m ás ele v a d a u n
te rc e r p u n to co rresp o n d ien te a la d o b le acetilación. C u an d o este te rc e r p u n to
aparece, el e n sa y o se e n c u en tra fu e ra d e su ra n g o lin eal y e l e x tra cto d eb e ría se r
diluido o b ie n s e d eb e ría utiliz ar m en o s tiem po d e reacción. L as zo n a s d e la placa
d e T L C corresp o n d ien te s a lo s p u n to s d el cloranfenicol y d e las form as del
cloranfenicol acetilad o se ra scan y s e intro d u cen en m ed io líq u id o p a ra se r
so m etid as a re cu en to d e ra d ia ctiv id ad en u n c o n ta d o r d e centelleo. L a actividad
d e cloranfenicol ac etiltran sfe rasa se ca lcu la d e la sig u ien te form a:
ac tiv id a d C A T = % d e clo ran fen ico l acetilado

cu e n tas d e esp ecies acetiladas
cuentas d e \ / cuentas de
esp ecies 1 + I cloranfenicol
acetiladas / \ n o acetilado
# Cloranfenicol
1,3-diacetato
•f
• •
Cloranfenicol
3-acetato
Cloranfenicol
1-acetato
t\ ? r
• Cloranfenicol
Origen
1 2 3
■ FIGURA 11-8 Ensayo de actividad CAT m ediante cromatografía en capa fina (TLC). El punto 1 sólo contiene
cloranfenicol marcado. El punto 2 muestra los dos puntos creados por los procesos de acetilación del cloranfenicol en un
único sitio. El punto 3 muestra el punto más superior en la placa que representa la doble acetilación.
11.12 El ensayo de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) 401
P ro b le m a 1 1 .2 2 Se lleva a cabo un experimento de transfección con

CAT como gen indicador, tal como se ha descrito anteriormente. Las
especies acetiladas de cloranfenicol dan 3 x 105 cpm. El punto
correspondiente al cloranfenicol no acetilado da 1,46 x 106 cpm. ¿Cuál
es la actividad CAT?
Los valores obtenidos en el contador de centelleo líquido son utilizados en la
fórmula que permite calcular la actividad CAT:
actividad CAT = % de cloranfenicol acetilado

cuentas de especies acetiladas ^
cuentas de\ / cuentas de \
( especies
acetiladas /
) + í cloranfenicol I
\ no acetilado /
3 x 105 com
% de actividad CAT = -------------------------------------v 1nn — 170/'
3 x 10 cpm + 1,46 x 106 cpm
Por lo tanto, el 17% del cloranfenicol se encuentra acetilado por CAT.
11.12.1 C á lcu lo d e las m o lé c u la s d e clo ra n fe n ico l

ace tiltra n s fe ra sa (CAT)
L a p ro te ín a C A T p u rific a d a tie n e u n a ac tiv id a d e s p e c ífic a d e 1 5 3 .000 n m o l/
m in /m g d e p ro te ín a (S h a w y B ro d sk y , 19 6 8 ) y tie n e u n p e s o m o le c u la r d e
2 5 .6 6 8 g /m o l (S h a w e t al., 1979). E sto s v a lo re s p u e d e n s e r u s a d o s p a ra c a lcu
l a r el n ú m e ro d e m o lé c u la s d e C A T en u n en sa y o , ta l co m o s e m u e s tra e n el
sig u ie n te p ro b lem a .
P ro b le m a 11.23 En el Problema 11.22, ¿cuántas moléculas de CAT están

presentes en el extracto?
El ensayo CAT contiene 1 (iCi de [C14] cloranfenicol con una actividad específica
de 50 nCi/mmol. La cantidad de cloranfenicol en la reacción se calcula de la
siguiente forma:
mmol
1 ixCi x ----- — = 0,02 mmol
r 50 pCi
El 17% del [C ] cloranfenicol es convertido a las formas acetiladas durante el

ensayo. El número de milimoles de cloranfenicol acetilado por CAT se calcula a
continuación multiplicando 0,02 mmol por 17/100 (17%):
0,02 mmol x —— = 0,0034 mmol

100
La reacción en el ensayo es incubada a 37 °C durante 60 min. La cantidad de

cloranfenicol acetilado-[C14] por minuto se calcula de la siguiente forma:
0,0034 mmol - ,, .
----------:-----= 5,7 x 10 5 mmol/min
60 min
Dado que la actividad específica de CAT viene determinada en unidades de

nanomoles, se necesita un factor de conversión para pasar de milimoles a
nanomoles. Del mismo modo, dado que también contiene un término de
«miligramo» y dado que el peso molecular se define como gramos/mol, se
necesita otro factor de conversión para pasar de miligramos a gramos. El
número de Avogadro (6,023 x 1023 moléculas por mol) será utilizado para
calcular el número final de moléculas. La expresión para calcular el número
de moléculas de CAT en el ensayo puede ser expresada de la siguiente forma:
5,7 X 1c r s mmo 1 1 x 106 nmol mg

min mmol 153.000 nmol/min
1 mol 6,023 x 1023 moléculas
1 x 103 mg 25.668 g
Nótese que el término
mg
1 5 3 .0 0 0 nmol/min
en la ecuación es el mismo que
min
m 9 X 1 5 3 .0 0 0 nmol
Por tanto, todas las unidades se anulan, excepto las «moléculas», el término
deseado. La multiplicación de los valores del numerador y denominador da
lugar al siguiente resultado:
3 , 4 x 1 0 25 moléculas
= ---------------- rr------ -- 8,7 x 10 moléculas
3 ,9 x 1 0 12
Así, la reacción del Problema 11.15 contiene 8,7 x 1012 moléculas de CAT.
11.13 Utilización de la luciferasa en un ensayo de gen indicador 403
1113 U T IL IZ A C IÓ N D E L A L U C IF E R A S A
EN UN E N S A Y O D E G E N IN D IC A D O R
E l g en luc, q u e co d ific a p a ra la en z im a lu cife rasa d e Photinus pyralis (luciérnaga),
se h a con v ertid o e n u n g en in d icad o r h ab itu alm en te u tiliz ad o en en sa y o s de
ex presión génica. L a lu cife rasa d e las células bac terian a s transform adas o
células d e m am ífero s tran sfecta d as q u e ex p resan e l g en luc se an a liz a m ediante
la co lo c ació n d e u n extracto ce lu la r en u n a m ez cla d e re acc ió n q u e contiene
cantidades en ex c eso d e lu cife rin a (e l sustrato d e la enzim a), ATP, M gSC>4 y
o x íg en o m o lecu la r (0 2 )- L a ox id ac ió n d ep e n d ien te d e ATP d e la lu c ife rin a p ro
d u ce u n destello d e lu z q u e pu ed e s e r d ete ctad o y cuantificado (c o m o un id ad e s de
lu z [LU , light units]) a 56 2 n m e n u n lum in ó m e tro . L a ca n tid a d d e lu z g en e rad a en
la reacción es pro p o rcio n al a la co n c en tra ció n d e luciferasa. E l en sayo d e lu cife
ra sa es m ás sen sib le q u e el d e (3-galactosidasa o CAT.
D a d o q u e el lum in ó m e tro u tiliz ad o p a ra a n a liz ar la actividad lu cife rasa p ro
p o rc io n a u n a lec tu ra en LU , se n ec esitan p o co s cá lcu lo s p a ra e v a lu ar el ensayo. En
el siguiente pro b lem a , sin em b a rg o , se dete rm in a rá el nú m ero d e m oléculas de
en z im a lu cife rasa en u n en sayo d e u n g en indicador.
P ro b le m a 1 1 .2 4 Para generar una curva estándar, se analiza en un

luminómetro la actividad de diferentes cantidades de luciferasa purificada. El
nivel mínimo de actividad fiable detectado por el instrumento es un pico de
emisión consistente de 10 LU, lo que corresponde a 0,35 pg de enzima.
¿Cuántas moléculas de luciferasa representa esta cantidad?
La luciferasa tiene un peso molecular de 60.746 g/mol (De Wet et al., 1987).
El número de moléculas de luciferasa se calcula multiplicando la cantidad de
proteína por su peso molecular y el número de Avogadro. Se usa un factor
de conversión para pasar de pg a g. El cálculo se realiza de la siguiente
forma:
1g 1 mol 6,023 x 1023 moléculas

0,35 pg x ------- ^ ---- x ----------- x —-------------- ;-----------
1 x 10 pg 60.746 g mol
2,11 x 1023 moléculas

_ 6,075 x 1016
= 3,47 x 106 moléculas
Por lo tanto, 0,35 pg de luciferasa corresponde en 3,47 x 106 moléculas.

11.14 T R A D U C C IÓ N I N V I T R O : D E T E R M IN A C IÓ N
D E L A IN C O R P O R A C IÓ N D E A M IN O Á C ID O S
L a tra d u c ció n in vitro p u e d e se r u tiliz ad a p a ra m arc ar c o n u n isótopo radiactivo
u n a p ro teín a c o d ific ad a p o r u n g en específico. A con tin u ac ió n se p u e d e u tiliz ar
u n a p e q u e ñ a ca n tid a d d e la p ro teín a m arc ad a c o m o traz ad o r a seg u ir d u ra n te la
p u rific ació n d e la m ism a p ro te ín a a p a rtir d e u n extracto celular. C o m o p a s a con
c u a lq u ie r ex p erim en to q u e im p lic a el u s o d e m are aje radiactivo, es im portante
d ete rm in a r la efic ien cia d e su in co rp o rac ió n en la m o lécu la diana.
P a ra p re p a ra r u n a re acc ió n d e tra d u c c ió n in vitro, el g e n d e in teré s d eb e ría
ex p re sa rse b a jo e l co n tro l d e u n p ro m o to r ac tiv o (/a c U V 5 , tac, \ P ^, etc .). E l
A D N q u e co n tie n e el g e n d e in te ré s es in c u b a d o en u n a re a c c ió n q u e co n tien e
ex tra cto S 3 0 o S I 00 sin A D N o A R N m e x ó g e n o s (S p irin e t al., 1988). L a
re a c c ió n d e b e ría c o n te n e r ta m b ié n trifo s fa to s, A R N t, ATP, G T P y u n a m ez cla
d e am in o á c id o s, e n la cu a l u n o d e e llo s (n o rm a lm e n te M et) s e añ a d e co m o
fo rm a ra d ia ctiv a.
P a ra d ete rm in a r la ca n tid a d d e inco rp o ració n d e l am in o ác id o ra diactivo, se
p re cip ita u n a a lícu o ta d e la re acc ió n co n T C A frío y com o tran sp o rta d o r
ca sam in o ácid o s (u n a m ez cla d e am in o ác id o s y alg u n o s p ép tid o s m u y p equeños
o b tenidos d e la hid ró lisis á c id a d e la caseína). E l pre cip ita d o se re co g e e n u n filtro
de fib ra d e v id rio y se la v a co n T C A varias v ec es y c o n ac e to n a u n a ú ltim a v e z para
elim in ar la [S35] M e t no incorporada. F in a lm e n te se sec a el filtro y se c u e n ta la
ra d ia ctiv id ad con u n co n ta d o r d e cen telleo líquido.
P ro b le m a 11.25 Se transcribe y traduce un gen en una reacción de 100 nL.

En dicha reacción se añaden 2 jxL de 20 mCi/mL [S35] Met (2.000 Ci/mmol).
Tras la incubación a 37 °C durante 60 minutos, una alícuota de 4 nL es
precipitada con TCA para determinar la incorporación de marcador
radiactivo. En el contador de centelleo líquido, el filtro genera una señal de
1,53 x 106 cpm. Una alícuota de 2 n i de la reacción es contada
directamente en el contador de centelleo para determinar las cuentas totales
en la reacción. Esta muestra da 2,4 x 107 cpm. ¿Qué porcentaje de la [S35]
Met ha sido incorporada en el polipéptido?
Para resolver este problema, se debe determinar el número total de cuentas en
la reacción. Calcularemos el número de cuentas en la alícuota de la reacción
precipitada con TCA y determinaremos el número de cuentas esperadas en la
reacción de traducción. El porcentaje de [S35] Met incorporado será calculado en
un último paso.
Dos ( i l de la reacción se colocan directamente en líquido de centelleo y se

cuentan. Dado que 2 p l dan 2,4 x 107 cpm y tenemos un total de 100 (xL en la
11.15 El punto isoeléctrico (pl) de una proteína 405
reacción, el número total de cuentas en la reacción se calcula de la siguiente

forma:
2,4 x 107 cpm , o

------^ K x 100 ixL = 1,2 x 109 cpm
2 |xL
Por lo tanto, en la reacción de 100 ^.L tenemos un total de 1,2 x 10 cpm.
Cuatro p,L son tratados con TCA. En el filtro, quedan precipitadas

1,53 x 106 cpm. A continuación, el número total de cuentas esperadas en la
reacción de 100 (xL es determinada de la siguiente forma:
1,53 x 106 cpm , 7

— — x 100 ixL = 3,83 x 107 cpm
4 |iL
Por lo tanto, esperaríamos que un total de 3,83 x 10 cpm se hubieran incor

porado en la reacción.
El porcentaje total de radiactividad incorporado en la proteína se calcula como

el número total de cuentas incorporadas dividido entre el número total de
cuentas en la reacción, multiplicado por 100:
1,2 x 109 cpm
Así, mediante este ensayo de precipitación con TCA, el 3,2% de la [S35] Met es
incorporado en el polipéptido.
11.15 E L P U N T O IS O E L É C T R IC O (p l)
D E U N A P R O T E ÍN A
E n el m éto d o d e sep a rac ió n seg ú n e l p u n to isoeléctrico, las pro teín a s se separan en
u n g el d e p o liacrila m id a q u e co n tien e u n g ra d ie n te d e pH . U n a p ro te ín a d eja rá de
m ig ra r cu an d o lle g u e al p u n to del g ra d ie n te en el cual n o tien e c a rg a neta. E l p H en
el cual esto ocurre se d en o m in a p u n to isoeléctrico (p l) de la proteína. E n dicho
pu n to , la p ro te ín a n o tien e c a rg a n i p o sitiv a n i n eg a tiv a — las cargas de sus an iones
y ca tio n e s están eq uilibradas— .
U n a p ro te ín a e s tá c o m p u e sta p o r u n a c a d e n a d e m u ch o s am in o á c id o s, c a d a
u n o d e ello s c a p a z d e d o n a r o a c e p ta r p ro to n e s . C a d a am in o á c id o in d iv id u a l
tie n e u n g ru p o carb o x ilo (— C O O H ), el cu a l p u e d e s e r io n iz a d o h a c ia u n a fo rm a
n o p ro to n a d a (— C O O - ), y u n g ru p o a m in o (— N H 2), q u e p u e d e s e r io n izad o
h a c ia la fo rm a p ro to n a d a — N Ü 3+. L a ca p a c id a d c o n la cu a l es to s g ru p o s se
io n iz a n d e p e n d e d e l p H d e l m ed io . S in e m b a rg o , d ad o q u e en u n a c a d e n a
p ro te ic a d e am in o ác id o s lo s g ru p o s a m in o y ca rb o x ilo es tá n in v o lu c ra d o s en
la fo rm a c ió n d e p u en te s p e p tíd ic o s e n tre lo s a m in o á c id o s d e la c a d e n a (e x cep
tu a n d o lo s ex tre m o s), el n iv e l d e io n iz a c ió n g lo b a l d e u n a p ro te ín a — su
c a rg a — d e p e n d e d e o tro s g ru p o s m o le c u la re s ca p ac es d e s e r io n izad o s. S e tra ta
d e lo s g ru p o s R q u e s e e n c u e n tra n en lo s a m in o á c id o s a rg in in a (A rg , R ), ácido
asp á rtico (A sp , D ), cistern a (C y s, C ), ác id o g lu tám ico (G lu , E ), h is tid in a (H is,
H ), lisin a (L ys, K ) y tiro s in a (Tyr, Y ). C a d a p ro te ín a , p o r tan to , te n d rá su p ro p io
p l d ep e n d ie n d o d e su c o n te n id o e n am in o ác id o s. L as p ro te ín a s b á s ic a s (a q u e
llas co n u n a p re p o n d e ra n c ia d e g ru p o s R b á s ic o s ) te n d rá n u n ele v ad o p l m ie n
tra s q u e la s p ro te ín a s á c id a s (a q u ellas c o n p re p o n d e ra n c ia d e g ru p o s R ác id o s)
te n d rá n u n p l b ajo .
E l pKg d e u n a m o lé c u la d e sc rib e la te n d e n c ia co n la c u a l la m o lé c u la p u ed e
e x p e rim e n ta r p ro to n a c ió n o d esp ro to n a ció n . E l p l d e u n a p ro te ín a , p o r ta n to ,
depende de lo s v a lo re s pK a de lo s am in o ác id o s que c o n tien e ; m ás
esp e c ífic a m e n te , d e lo s v a lo re s p K a d e lo s s iete a m in o á c id o s d e sc rito s an te
rio rm e n te cu y o s g ru p o s R p u e d e n s e r io n izad o s. E ste p a rá m e tro , a su v ez ,
d e p e n d e d el p H . E n u n ta m p ó n co n u n p H p o r d e b a jo d e l p l d e la p ro te ín a
(e s d ec ir, s i el tam p ó n es m ás ác id o ), la p ro te ín a tie n e u n a c a rg a n e ta p o s itiv a y,
d u ra n te la e le c tro fo re sis, m ig ra rá h a c ia el cá to d o (el p o lo n eg a tiv o ). E n un
ta m p ó n c o n u n p H p o r e n c im a d e l p l, la p ro te ín a p o s e e c a rg a n e ta n e g a tiv a y
m ig ra rá h a c ia e l án o d o (p o lo p o s itiv o ). E n u n p H eq u iv a le n te al p l d e la
p ro teín a , la p ro te ín a n o m ig ra rá en a b so lu to . L a s e p a ra c ió n d e p ro teín a s
s e g ú n s u p u n to is o eléc trico co n s titu y e el p rim e r p aso d e u n a ele ctro fo resis en
g e l b id im e n s io n a l — el se g u n d o p a s o se b a s a en la s d iferen c ia s d e m a s a d e las
p ro te ín a s q u e s e e s tá n sep a ran d o — .
L a te n d e n c ia co n la q u e lo s g ru p o s R esp e c ific a d o s ex p e rim en tan io n izac ió n
e s tá in flu e n c ia d a n o só lo p o r e l p H sin o ta m b ié n p o r la to p o g ra fía lo ca l — qué
a m in o á c id o s s e en c u en tra n e n p ro x im id a d c u a n d o la p ro te ín a s e en c u en tra
p le g a d a e n s u e s tru c tu ra trid im e n sio n a l— . D a d o q u e to d a v ía n o d isp o n em o s
d e u n a co m p re n s ió n c o m p le ta d e lo s p ro c e s o s d e p le g a m ie n to d e p ro te ín a s , los
v a lo re s p K a d e lo s a m in o á c id o s d e u n a p ro te ín a p u e d e n , co m o m áx im o ,
s e r só lo estim ad o s. A d e m á s, d ad o q u e la m a y o ría d e p ro te ín a s es tá n c o n sti
tu id a s p o r c ie n to s d e am in o á c id o s, c o m o m e jo r s e lle v a a c a b o el c á lcu lo d e
p l e s c o n u n a ap lic a c ió n in fo rm á tic a. P o d e m o s e n c o n tra r v a ria s ap lica cio n es
e n in tern e t, co m o p o r eje m p lo la q u e es m a n te n id a p o r el E u ro p e a n M o lecu la r
B io lo g y L a b o ra to ry (E M B L ) (F ig u ra 11-9). M e d ia n te e s te p ro g ram a, se
in tro d u ce la se c u e n c ia d e am in o ác id o s d e la p ro te ín a (p o r su có d ig o d e letra
ú n ic o ) y su p l es d ete rm in a d o p o r u n m éto d o q u e d e te rm in a el v a lo r p l
m e d ia n te e l c á lcu lo d e la c a rg a n e ta d e la p ro te ín a e n u n a m p lio ra n g o de
p H (F ig u ra 11-10).
11.15 El punto isoeléctrico (pl) de una proteína 407
EMBL W W W Gateway to Isoelectric Point Service

Isoelectric Point determination
Reference: Lehninger(1979)Biochimie
F.nter your sequence
M l - 9 Página w e b mantenida por EMBL

usarse para calcular el punto isoeléctrico de
a (pl).
EMBL WWW Gateway to Isoelectric Point Service
Mingo's Biochemistry Ik
6 0.0695014097411031
8 -0.0590586750133673
i.5 -0.183541169701062
9 -0.534711898572718
1534035
19177408
1)472756
■ FIGURA 1 1 -1 0 La calculadora de EMBL que
(S425769
determina el punto isoeléctrico (pl) de una proteína
11416308
7.03499999999987 (u mediante el cálculo de la carga neta de la proteína
that pH is 1.53122640416115C-05) sobre un am plio rango de pH.
■ RESUM EN D EL CAPITU LO
L a co n c en tra ció n d e p ro te ín a e n u n a so lu ció n p u e d e s e r estim ad a m id ie n d o su
abso rb an cia a 2 8 0 nm . U n a a b so rb an cia d e 1,0 a 2 8 0 n m es equ iv a le n te a 1 m g
p ro teín a /m L . L a co n c en tra ció n d e p ro teín a tam b ién p u ed e se r estim ad a m ediante
la dete rm in a ció n d e su coe ficien te d e a b so rb an cia — su a b so rb an cia a cierta
concentración, a u n a lo n g itu d d e o n d a d ete rm in a d a y e n u n recorrido d e lu z de
1 cm — . L a co n c en tra ció n d e u n a p ro teín a en m g /m L es eq u iv a le n te a la ab so r
b a n c ia d iv id id a entre su coe ficien te d e ab so rb an cia p a r a u n a so lu ció n a 1 m g/m L :
, , . _. abso rb an cia
co n c en tra ció n d e p ro tem a (e n m g /m L ) — — i mg/ mi.
L a concentración d e proteína en m olaridad pu ed e se r estim ada usando la absor

b an c ia y el coeficiente d e extinción m o lar (¿sM) d e la proteína (la absorbancia d e u n a
solución 1 M d e u n a proteína a cierta longitud d e o n d a e n u n a cu beta d e 1 cm ):
absorbancia
concentración d e pro teín a (en m olaridad) =
Em
E l coe ficien te d e ab so rb an cia p a ra u n a solución al 1% d e p ro teín a (A¡cm{°/o) se
re la cio n a co n el coe ficien te d e e x tin ció n m o lar (£ m ) d e la sig u ien te form a:
(^ ! cm)(Peso m olecular)
Em -
10
E l co e ficien te d e ex tin ció n a 20 5 n m d e u n a p ro te ín a p u ed e se r determ in ad o

m ed ian te la sig u ien te fórm ula:
'B2o“ ‘i£ rL = 2 7 + 120
E sta ecu ac ió n p u ed e se r u s a d a c u a n d o la p ro te ín a tien e u n a co n c en tra ció n

desconocida. E n el ca so d e q u e y a c o n o z ca m o s la co n c en tra ció n , el coeficiente
d e ex tin ció n a 28 0 n m p u e d e se r determ in ad o co n la sig u ie n te ecu ac ió n (excepto
en el caso d e p ro teín a s co n u n ele v ad o co n te n id o en fe nilalanina):
m g d e p ro te ín a /m L
E l coeficiente de ex tin ció n m o lar d e u n a p ro te ín a p u ed e s e r estim ado a p a rtir de

su co n te n id o en re sid u o s trip tó fan o , tiro sin a y c istin a m ed ian te la siguiente
re la ció n (e n la q u e n es el n ú m ero d e ca d a tip o d e re sid u o p re se n te en la proteína):
E m = (n W x 5 .5 0 0 ) + (« Y x 1.490) + (« C x 125)
L a co n c en tra ció n d e p ro te ín a en m g /m L se re la cio n a c o n la m o larid ad d e la

s ig u ie n te form a:
co n c en tra ció n (en m g /m L ) = m o larid ad x p eso m o lecu la r d e la pro teín a
E sta relación p u ed e se r u s a d a p a ra c o n v e rtir u n a co n c en tra ció n d e m g /m L en

m o larid ad , y viceversa.
C u an d o ex isten ácidos nu cle ic o s co n ta m in a n te s en la so lu ció n proteica, se
d eb e co rreg ir la lec tu ra a 2 8 0 n m m ed ian te la su strac ció n d e la co n trib u c ió n del
A D N o A R N . E sta re la ció n v ie n e d ete rm in a d a p o r la sig u ie n te ecuación:
co n c en tra ció n d e p ro teín a (e n m g /m L ) = (1,55 x A2go) — (0 ,7 6 x A 26o)
C u an d o s e cua n tific an p ro teín a s a b aja s co n c en tra cio n es (1 a 100 [xg pro teín a /
m L ), la m e d id a d e su a b so rb an cia a 205 n m p u ed e d a r resultados m ás correctos
q u e lo s q u e se estim an a p a rtir d e lec tu ras a 2 8 0 nm . L a co n c en tra ció n d e pro teín a
a 20 5 n m p u e d e se r e stim ad a c o n la s ig u ie n te ecuación:
co n c en tra ció n d e p ro te ín a (e n m g /m L ) = 31 x A2q5
Si se estim a la concentración d e proteína p o r su absorbancia a 205 nm , la

contam inación d e ácidos nucleicos pu ed e se r corregida u sando la siguiente ecuación:
A 205
concentración d e pro teín a (en m g /m L ) =
L a co n c en tra ció n d e p ro te ín a p u ed e se r d ete rm in a d a m ed ian te u n a reacción

c o n u n reactivo co m o el Coomassie Brilliant Blue G-250, ta l co m o su ce d e en el
e n sayo B radford, en el cual u n a c u rv a e stán d a r es u tiliz a d a p a ra e x tra p o lar la
co n c en tra ció n d e u n a m u estra desconocida.
L a caracterización d e elem entos gen é tic o s in v o lu cra d o s en la tran sc rip ció n
(prom otores, rep reso res, silenciadores, etc .) p u e d e s e r m o n ito riz ad a m ediante
co n stru c cio n es re co m b in an tes d e m a n e ra q u e lo s elem entos en cu e stió n qu ed en
p o sicio n ad o s ad y a ce n te s al g en q u e c o d ific a p a ra la (3-galactosidasa. L a pro teín a
(3-galactosidasa, la cual co n v ie rte el reactivo incoloro O N P G en el com puesto
O N P d e c o lo r am arillo, p u e d e se r cu a n tific ad a p o r la cantidad d e co lo r am arillo
gen e rad o en p re sen cia de O N P G . L as u n id ad e s d e (3-galactosidasa s e ca lcu lan así
un id ad e s
t x v x D O óoo
donde D 0 42o y DO 550 son las lecturas de la mezcla de reacción, D 0 60o es Ia

absorbancia del cultivo celular justo antes del ensayo, t es igual al tiempo de
re acc ió n (e n m in ) y v e s el v o lu m en (en m L ) d e la alícu o ta d e cultivo u sad o en el

ensayo. L a ac tiv id a d e sp e cífica d e (3-galactosidasa se defin e co m o el n ú m ero de
u n id ad e s d e en z im a p o r m iligram o d e proteína.
L a ac tiv id a d (3-galactosidasa (Za) tam b ién p u e d e se r ca lcu lad a co m o el nú m ero
d e m icrom o les d e O N P G con v e rtid o s a O N P p o r u n id ad d e tiem p o , co m o se
m u estra en la sig u ien te relación:
en la q u e o es la a b so rb an cia a 4 1 0 nm ; £410 e s el coeficiente de ex tin ció n m olar

d e O N P a 4 1 0 n m (3,5 m L/p,M ), asu m ien d o q u e la c u b e ta tien e 1 cm de recorrido
d e luz; V es el v o lu m en d e reacción, y t es el tiem p o , e n m in, q u e se in cu b a la
re acc ió n p a ra la g en e rac ió n d e co lo r am arillo.
L a cro m a to g ra fía d e c a p a fin a (T L C ) p u e d e s e r u s a d a p a r a s e p a ra r c o m
p u e s to s b a s á n d o s e en su so lu b ilid a d en u n a fa se so lv e n te y su m o v ilid a d
d ic ta d a p o r su a fin id a d p o r u n a fa s e e s ta c io n a ria d e g e l d e s ílic e d is p u e s ta
s o b re u n a p la c a d e vid rio . E l R f d e l c o m p u e sto e s u n a ca ra c te rís tic a fís ic a de un
c o m p u e sto es p e c ífic o y p u e d e s e r u tiliz a d o p a ra a y u d a r a su id en tifica ció n . S e
c a lc u la com o
d is ta n c ia d e m ig ra c ió n d el co m p u e sto
d is ta n c ia d e m ig ra c ió n d el so lv e n te
E l p eso m o lecu la r d e u n a p ro te ín a p u e d e se r estim ad o p o r c ro m a to g rafía de

filtración en g el a p artir d e u n a c u rv a estándar.
E l g en cat, q u e co d ific a a CAT, tam b ién se h a u tiliz ad o c o m o g e n in dicador
p a ra estu d io s d e ex presión g é n ic a e n células d e m am íferos. P a ra an a liz ar la
ac tiv id a d CAT, u n extracto d e células q u e ex p resan C A T es in cu b a d o co n cloran
fenicol m arc ad o c o n [C 14]. L a tran sfere n cia del g ru p o acetilo d esd e la acetil-
c o e n zim a A al clo ra n fe n ic o l altera la m o v ilid a d d el antib ió tic o en u n a p lac a d e
T L C . L as áreas en la p la c a d e T L C co rresp o n d ien tes a lo s p u n to s d e clo ran fen ico l
y cloranfenicol acetilad o s o n rascad a s y co ntadas en u n co n ta d o r d e centelleo
líq u id o . L a ca n tid a d d e cloranfenicol acetilado es d irectam ente pro p o rcio n al a la
cantidad d e en z im a C A T y la ac tiv id a d C A T se ca lcu la así
ac tiv id a d d e C A T = % d e cloranfenicol acetilado

cu e n tas d e esp ecies acetiladas
cuentas d e \ / cuentas de
e sp ecies I + I clo ran fen ico l
acetiladas / \ n o acetilado
E l g e n luc, q u e co d ific a p ara la en z im a lu cife rasa d e Photinus pyralis
(luciérnaga), se h a con v e rtid o en u n g en in d icad o r d e u so frecu e n te p a ra an a liz ar
la ex p resió n g énica. L a lu cife rasa p ro c ed en te d e células b ac terian a s transform adas
o d e células d e m am ífero tran sfecta d as q u e e x p resan el g en luc es an alizada
m ed ian te la in cu b a ció n d e u n extracto ce lu la r e n u n a m ez cla d e re acc ió n que
co n tien e ca n tid a d es en ex c eso d e lu cife rin a (el sustrato d e la enzim a), ATP,
M gSC>4 y o x íg en o m o lecu la r (O 2). L a ox id ac ió n dep e n d ien te de A TP d e lu cife rin a
d a lu g a r a u n b ro te de lu z q u e p u e d e s e r d ete ctad o y cuantificado (com o L U ) en un
lu m in ó m e tro a 56 2 nm . L a ca n tid a d d e lu z g en e ra d a en la re acc ió n es p ro p o rcio n al
a la co n c en tra ció n d e luciferasa.
L a trad u c ció n in vitro p u e d e se r co n tro la d a m ed ian te e l seguim iento d e la
ca n tid a d d e am in o ác id o s ra d ia ctiv o s in co rp o rad o s a u n a p ro teín a . E sto se llev a
a ca b o ca lcu lan d o el nú m ero d e cu e n tas q u e p re cip ita n co n T C A re co g id as en
filtros d e fib ra d e vidrio.
B r a d fo r d , M .M . ( 1 9 7 6 ). A r a p id a n d s e n s itiv e m e th o d f o r th e q u a n tita tio n o f m ic r o g ra m
q u a n titie s o f p r o te i n u tiliz in g th e p r in c i p le o f p r o te in -d y e b in d in g . Analyt. Biochem. 72:
p. 248.
D e W e t, J .R ., K .V . W o o d , M . D e L u c a , D .R . H e lin s k i, a n d S . S u b ra m a n i (1 9 8 7 ). F ire f ly lu c ife ra se
g e n e : stru c tu re a n d e x p re s s io n in m a m m a lia n c e lls . Mol. Cell Biol. 7 :7 2 5 - 7 3 7 .
G o rm a n , C .M ., L .F . M o f fa t, a n d B .H . H o w a r d (1 9 8 2 ). R e c o m b in a n t g e n o m e s w h ic h
e x p re s s c h lo ra m p h e n ic o l a c e ty ltr a n s f e ra s e in m a m m a lia n c e lls . Molec. Cell. Biol.
2 :1 0 4 4 - 1 0 5 1 .
K e n n e d y , J .F ., Z .S . R iv e r a , L .L . L lo y d , F .R W arn er, a n d M .R C . d a S ilv a (1 9 9 5 ). D e te r m in a tio n o f
th e m o le c u la r w e ig h t d is trib u tio n o f h y d r o x y e th y lc e llu lo s e b y g e l f iltr a tio n c h ro m a to g ra p h y .
Carbohydrate Polymers 2 6 :3 1 —3 4 .
K in g s to n , R .E . ( 1 9 8 9 ). U s e s o f f u s io n g e n e s in m a m m a lia n tra n s fe c tio n : h a rv e s t a n d a s s a y f o r
Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium
c h lo ra m p h e n ic o l a c e ty ltra n sfe ra se . I n
o f Methods from Current Protocols in Molecular Biology (F .M . A u s u b e l, R . B r e n t, R .
E . K in g s to n , D .D . M o o r e , J .G . S e id m a n , J .A . S m ith , K . S tru h l, R W a n g -Iv e rs o n , a n d S.
G . B o n itz , e d s.). W ile y , N e w Y o rk , p p . 2 6 8 - 2 7 0 .
K ir s c h e n b a u m , D .M . ( 1 9 7 6 ). I n CRC Handbook o f Biochemistry and Molecular Biology (G .
D . F a s m a n e d .), 3 rd e d . V o l. 2 . C R C P r e s s , B o c a R a to n , F L , p . 3 8 3 .
L a y n e , E . ( 1 9 5 7 ). S p e c tro p h o to m e tric a n d tu rb id im e tric m e th o d s f o r m e a s u r in g p r o te in s . Meth.
Enzymol. 3 :4 4 7 - 4 5 4 .
M ille r, J .H . ( 1 9 7 2 ). Experiments in Molecular Genetics. C o ld S p r in g H a r b o r L a b o ra to ry , C o ld
S p r in g H a r b o r , N Y , p p . 3 5 2 —3 5 5 .
P a c e , C .N ., F . V ajd o s, L . F e e , G . G rim sle y , a n d T . G ra y ( 1 9 9 5 ). H o w to m e a s u re a n d p r e d ic t th e
m o la r a b s o rp tio n c o e f fic ie n t o f a p r o te in . Protein Sci. 4 :2 4 1 1 —2 4 2 3 .
Meth. Enzymol. 9 1 :9 5 - 1 1 9 ..
P e te rs o n , G .L . ( 1 9 8 3 ). D e te rm in a tio n o f to ta l p r o te in .
R o b e r ts o n , D ., S . S h o re , a n d D .M . M ille r ( 1 9 9 7 ). Manipulation and Expression o f Recombinant
DNA: A Laboratory Manual. A c a d e m ic P r e s s , S a n D ie g o , C A , p p . 133—1 3 8 .
S c o p e s, R . K ( 1 9 7 4 ). M e a s u r e m e n t o f p r o te in b y s p e c tr o p h o to m e tr y a t 2 0 5 n m . Analyt. Biochem.
5 9 :2 7 7 - 2 8 2 .
S h a w , W .V ., a n d R .F . B r o d s k y ( 1 9 6 8 ). C h a r a c te r iz a tio n o f c h lo ra m p h e n ic o l a c e ty ltra n sfe ra se
fro m c h lo ra m p h e n ic o l-r e s is ta n t Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 9 5 :2 8 - 3 6 .
S h a w , W .V ., L .C . P a c k m a n , B .D . B u r le ig h , A . D e ll, H .R . M o r ris , a n d B .S . H a r tle y ( 1 9 7 9 ).

P r im a r y s tr u c tu re o f a c h lo ra m p h e n ic o l a c e ty ltra n s fe ra s e sp e c ifie d b y R p la s m id s . Nature
2 8 2 :8 7 0 - 8 7 2 .
S p irin , A .S ., V .I. B a ra n o v , L .A . R y a b o v a , S.Y . O v o d o v , a n d Y .B . A la k h o v ( 1 9 8 8 ). A c o n tin u o u s
c e ll-fre e tr a n s la tio n s y s te m c a p a b le o f p r o d u c in g p o ly p e p tid e s in h ig h y ie ld . Science 242:
p . 1162.
S to sc h e c k , C .M . ( 1 9 9 0 ). Q u a n tita tio n o f p ro te in . Meth. Enzymol. 1 8 2 :5 0 - 6 8 .
A n d re w s , P. ( 1 9 6 2 ). E s tim a tio n o f m o le c u la r w e ig h ts o f p r o te in s b y g e l filtra tio n . Nature
1 9 6 :3 6 - 3 9 .
E z z e d d in e , S ., a n d U . A l-K h a lid i ( 1 9 8 2 ). A s h o r t n o te o n th e m o le c u la r w e ig h t d e te rm in a tio n b y
g e l f iltr a tio n in m in u te s. Molec. Cell. Biochem. 4 5 :1 2 7 —1 2 8 .
L e M a ire , M .A ., A . G h a z i, J.V . M o lle r, a n d L .P. A g g e r b e c k ( 1 9 8 7 ). T h e u s e o f g e l c h ro m a to g
r a p h y f o r th e d e te rm in a tio n o f s iz e s a n d r e la tiv e m o le c u la r m a s s e s o f p ro te in s . In te rp re ta tio n
o f c a lib r a tio n c u rv e s in te rm s o f g e l-p o r e -s iz e d is trib u tio n . Biochem. J. 2 4 3 :3 9 9 —404 .
M a rg o lis , S . ( 1 9 6 7 ). S e p a ra tio n a n d s iz e d e te r m in a tio n o f h u m a n s e ru m lip o p r o te in s b y a g a ro se
g e l filtra tio n . J. Lipid Research 8 :5 0 1 —5 0 7 .
S te e re , R .L ., a n d G .K . A c k e rs ( 1 9 6 2 ). R e stric te d -d iffiisio n c h ro m a to g r a p h y th r o u g h c a lib ra te d
c o lu m n s o f g r a n u la r a g a r g e l: a s im p le m e th o d f o r p a rtic le -s iz e d e te rm in a tio n . Nature 196:
p. 475.
W h ita k e r, J.R . ( 1 9 6 3 ). D e te r m in a tio n o f m o le c u la r w e ig h ts o f p r o te in s b y g e l f iltr a tio n o n
Sephadex. Anal. Chem. 3 5 :1 9 5 0 - 1 9 5 3 .
Capítulo
Centrifugación
L a ce n trifu g ac ió n es la te c n o lo g ía d e sep a rac ió n d e m o lécu la s e n so lu ció n que
tie n e n diferentes d en sid ad e s m ed ian te la ro tac ió n alre d ed o r d e u n eje (en u n ro to r
d e ce n trífu g a) a alta v elocidad. E s u n a de las téc n ic as m ás útile s y m á s em pleadas
en u n laboratorio d e b io lo g ía m olecular. L a ce n trifu g ac ió n s e u tiliz a p ara reco
lec ta r células, p a r a p re cip ita r A D N , p a r a p u rific ar p artículas víricas y p a ra p o d e r
d is tin g u ir en tre sutiles con fo rm ac io n e s m oleculares. L a m ay o ría d e los lab o ra to
rio s q u e tien en u n a ac tiv id a d in v estig ad o ra in ten sa ten d rá n m ás d e u n tip o de
centrífuga, ca d a u n a ca p az d e u sarse co n div erso s rotores. L as p eq u e ñ as
centrífugas d e so b re m e sa se pu ed e n utiliz ar p ara sed im en tar células o p a ra ob ten e r
h eb ras d e A D N du ra n te la p re cip ita ció n co n etanol. L as ultracentrífugas se pu ed e n
u tiliz a r p a ra co n d e n sar en u n a b a n d a u n A D N plasm íd ic o en u n g ra d ie n te de
cloruro d e ce sio o p a ra diferenciar div ersa s estru ctu ras d e la re p lic ació n d el A D N
en u n gra d ie n te d e sacarosa.
12.1 F U E R Z A C E N T R Í F U G A R E L A T IV A (F C R )
(F U ER Z A g )
D u ran te la cen trifu g ac ió n , las m o lécu la s d e pro teín a s o A D N en su sp en sió n son
forzadas a ale ja rse d el ce n tro d e rotación. L a v elo c id a d a la q u e o cu rre este
fen ó m e n o d ep e n d e d e la velo c id a d d el ro to r (m ed id a en rp m [revolu cion es p or
m in u to]). L a fu e rza g en e rad a p o r el g iro d el ro to r se d efin e co m o fu erza
ce n trífu g a re la tiv a (F C R ), tam b ién se le d en o m in a fu e rza g y es pro p o rcio n al
al cu a d rad o d e la v elo c id a d del ro to r y a l ra d io d e giro (la dista n cia q u e sep a ra a la
m o lécu la d el eje d e rotación). L a F C R se ca lc u la u tiliz an d o c u a lq u ie ra d e las
sig u ie n tes ec u ac io n e s (so n equivalentes):
FCR = 1,118 x 10~5 rcm(rpm )2
414 C A P ÍT U L 0 12 Centrifugación
d o n d e r es el v a lo r del ra d io d esd e el ce n tro d el ro to r ha sta el p u n to en el tu b o de

ce n trífu g a a la q u e se n ec esita el v a lo r d e F C R (e n cm ) y rpm es igual a la velo cid ad
d e l ro to r e n rpm .
C o m o la F C R au m e n ta con el cu a d rad o d e la v elo c id a d d el rotor, d o b la r el
n ú m ero d e revo lu c io n es a u m e n ta rá la F C R cu a tro veces.
L a F C R se expresa generalm ente en unidades d e fu e rza d e la gravedad escrito
« x g» (núm ero d e veces d e fuerza d e la gravedad). U n a g es equivalente a la fuerza
d e la gravedad. D os g es dos veces la fu e rza d e gravedad. U n a F C R d e 12.500
equivale 12.500 v ec es la fu e rza d e gravedad y se expresa co m o 12.500 x g.
A la v e z q u e la d ista n cia desd e el centro d el ro to r au m e n ta , tam b ién lo h a c e la
fu e rza centrífuga. L a m ay o ría d e las esp ecificaciones d e los rotores q u e dan los
fabricantes pro p o rcio n an tres m ed id as del ra d io (r) d e u n rotor. E l rad io m ín im o
■ FIGURA 12-1 Sección transversal
(/*m(n) es la d ista n cia d el centro d el ro to r h a sta la p arte su p erio r d el líquido d el tu b o
de un típico rotor de centrífuga que
d e ce n trífu g a cu an d o éste está co lo c ad o en el ro to r en s u án g u lo pred eterm in ad o
muestra los radios mínimo y máximo
medidos desde el eje del rotor. (v é ase la F ig u ra 12-1). E l rad io m áxim o (rmáx) es la d ista n cia desd e el ce n tro del
ro to r h a s ta el p u n to m ás alejad o en el tu b o d e ce n trífu g a d esd e el eje d e rotación
(F ig u ra 1 2 - 1 ). E l rad io m ed io (/*med ) es igual a la su m a d el ra d io m ín im o m ás el
ra d io m áx im o divid id o en tre dos:
'‘min + rmáx
^mcd — 2
D a d o q u e e l ra d io m ín im o y el ra d io m edio varia rá n e n fu n c ió n del v o lu m en de

líq u id o q u e s e ce ntrifugue, la F C R gen e ralm en te s e ca lcu la utiliz an d o el v a lo r del
ra d io m áxim o.
P ro b le m a 12.1 Se sedimentan bacterias E. coli en un rotor SS-34 (radio

máximo de 10,7 cm) centrifugando a 7.000 rpm. ¿Cuál es la FCR (fuerza g)?
S o lu c ió n 12.1
Utilizaremos la siguiente ecuación:
fcr = !1'17M tS¡5)2
Sustituyendo los valores proporcionados tenemos el siguiente resultado:
FCR = 1 1 , 1 7 ( 1 0 , 7 ) M
' 'V 1 000/
FCR = (119,5 2 )(7 )2 = (1 19,52)(49) = 5.856
Por lo tanto, en un rotor SS-34, 7.000 rpm son equivalentes a 5.856 x g.

12.1 Fuerza centrífuga relativa (FCR) (fuerza g) 415
12.1.1 C o n v e rsió n d e la fu e rza g a re v o lu cio n e s

p o r m in u to (rpm )
L a m ay o ría de los p ro to co lo s d esc rito s en el ap a rtad o d e «M ateriales y M éto d o s»
d e lo s artíc u lo s d e revistas desc rib en las c o n d ic io n e s d e ce n trifu g ac ió n en
térm in o s d e fu e rza g. E sto p erm ite a otros in v estig ad o re s re p ro d u cir el pro to co lo
experim ental, incluso si tien en u n tip o diferen te d e c e n trífu g a y d e rotor. P ara
o b ten e r las rp m cu an d o ten e m o s la fu e rza g (F C R ), la ecuación
se co n v ie rte en
FCR
rpm — 1.000,
l l , 1 8 ( r c„
q u e tam b ié n se p u e d e esc rib ir d e la sig u ien te fo rm a
FCR
(1 ,118 x 10“-5)( r.
P ro b le m a 1 2 .2 Un protocolo plantea una centrifugación a 6.000 x g.

¿Cuántas rpm se deben utilizar con un rotor SS-34 (radio máximo de 10,7 cm)
para obtener esa fuerza g?
Sustituyendo nuestros valores en la ecuación anterior, obtenemos
rpm - 1.000 Q -OOO

K Y 11,17(10,7)
rpm - 1 0 0 ° ^ ^ ^ = 1 0 0 0^ 502 = 1.000(7,1) = 7.100
Por lo tanto, para tener 6.000 x g con un rotor SS-34 lo debemos acelerar hasta
las 7.100 rpm.
Si hacemos una búsqueda por Internet obtendremos una serie de calculadoras

de FCR, como la mantenida por DJB Labcare, Buckingham, UK (Figura 12-2),
donde la FCR o las rpm se pueden calcular automáticamente.
R C F (x g )/R P M C a lc u la to r
Enter the rotor radius cm

And now enter an RPM or RCF value, before pressing the relevant calculate button.
RPM ( Cakulltt KCF/9 )
■ FIGURA 12-2 Calculadora de la fuerza centrífuga relativa (FCR) que se puede encontrar en http://www.djblabcare.
co.uk/djb/info/6AJser_Tools.
Radio rpm
Radio de giro en cm Fuerza centrifuga Revoluciones
por minuto
50-
E -— 20.000
45-
-15.000
40 —^
- 10.000
3 5 -3 - 8.000
30 10.000 - - 6.000
5.000 -
4.000 - - 4.000
25 “ 3 3.000 -
20 2.000 - - 3.000
1 8 —3 1.000 -
- 2.000
5.000 -
1 6 _ =1
14^
1 2 -jj
10^
■ FIGURA 12-3 Nomograma para 6 —z |

calcular los parámetros de centrifugación. 5 —^
12.1.2 C á lcu lo d e la fu e rz a g y d e las re v o lu cio n e s

p o r m in u to (rpm ) u tiliz a n d o un n o m o g ram a
N o so tro s h e m o s calculado la fu e rza g y lo s v alo re s d e rp m u tiliz an d o la sig u ien te
ecuación:
12.2 Fuerza centrífuga relativa (FCR) (fuerza g) 417
Si calculam os u n gran núm ero d e valores d e g utilizando u n gra n núm ero d e

valores de rp m y radios d e giro, obtendrem os u n gráfico sim ilar al de la F igura 12-3.
E ste gráfico, denom inado n o m o g ra m a , es u n a representación gráfica d e la relación
entre las rpm , la fuerza g y el radio del rotor. S i se conocen d os d e estos valores, se
pu ed e d eterm inar el tercero utilizando u n a regla. H ay q u e alinear la re g la de form a
q u e interseccione los dos valores conocidos sobre sus escalas correspondientes. E l
tercer valo r vendrá dad o p o r la intersección d e la lín ea co n la tercera escala.
P ro b le m a 1 2 .3 Un rotor con un radio de giro de 7,5 cm se utiliza para

sedimentar una muestra de células. Las células se centrifugan a 700 x g.
¿Cuántas rpm se deben utilizar?
Utilizando el nomograma de la Figura 12-3, una línea recta conecta las tres
escalas de tal forma que pasa por la marca de 7,5 cm de la escala de «radios»
y la marca de 700 de la escala de «g». Esta línea cruzará la escala de «rpm» a 3.000
(Figura 12-4). Por lo tanto, el rotor se debe girar a 3.000 rpm.
Radio
Radio de giro en cm Fuerza centrifuga
I FIGURA 12-4 Solución del Problema 123.

12.2 C Á L C U L O D E T IE M P O S D E S E D IM E N T A C IÓ N
E l cá lcu lo d e l tiem p o (en ho ra s) q u e se re q u ie re p ara s ed im en tar u n a partíc u la en
ag u a a 2 0 °C a través d el recorrido m áx im o (la d ista n cia e n tre rm¡n y r m4x) v ien e
dad o p o r la ecuación
k
t - -
s
d o n d e t es e l tiem p o d e sed im en tac ió n e n h o ra s, k es el fa cto r d e co m pensación

d el ro to r y 5 es el coe ficien te d e sed im en tac ió n d e la p artíc u la q u e se qu iere
sed im en tar e n ag u a a 2 0 °C , ex p resad a en un id ad e s S v ed b erg (v é ase m ás
adelante).
E l fa cto r d e co m p e n sa ció n , k, se defin e p o r la ecuación
k — 2
rp m '
.1 .000 ,
E l fa cto r k es u n a m ed id a d e la efic ac ia d e sed im en tació n d el rotor. S u v alo r

d ism in u y e c o n el aum e n to d e la v elo c id a d d el rotor. C u an to m e n o r se a el fa cto r k,
m a y o r es la efic ac ia d el ro to r p a ra sed im en tar u n a d ete rm in a d a m olécula. E l factor
k p a ra c u a lq u ie r rotor, pro p o rcio n ad o p o r el fabricante, su p o n e q u e el fluido q u e se
h a ce n trifu g ad o tien e la d e n sid ad d el ag u a a 2 0 °C . E l fa cto r k se increm entará si el
m edio tien e u n a m a y o r d e n sid ad o visco sid ad q u e el agua. P o r eje m p lo , a la m ism a
v elo c id a d d el rotor, el fa cto r k es m ás alto p a ra u n g ra d ie n te d e sac aro sa q u e para
u n m ed io acuoso.
H a y d iv e rso s fa c to re s q u e a fe c ta n a la v e lo c id a d a la cu a l u n a m o lé c u la
b io ló g ic a d e te rm in a d a se d im e n ta d u ra n te u n a ce n trifu g ac ió n . S u ta m a ñ o , su
fo rm a y su d e n sid a d in flu y e n en la v e lo c id a d a la cu a l u n a m o lé c u la s e m u e v e a
tra v é s d e u n m ed io . U n a m o lé c u la q u e te n g a u n p eso m o le c u la r ele v ad o
se d im e n ta rá m ás rá p id o q u e u n a q u e te n g a u n p eso m o le c u la r m enor. L a
u n i d a d S v e d b e r g d e sc rib e la v e lo c id a d d e s e d im e n ta c ió n d e la m o lé c u la
re la c io n a d a co n su tam añ o . S e e x p re s a co m o u n a d im e n sió n d el tie m p o , de
ta l m o d o q u e 1 u n id a d S v ed b erg es ig u al a 10-13 seg u n d o s. P a ra la m a y o ría de
la s m o lé c u la s b io ló g ic a s lo s v a lo re s d e la s u n id a d e s S v ed b erg o sc ila n e n tre 1 S
(1 u n id a d S v ed b erg ; 1 x 1 0 -13 s) y 200 S (2 0 0 u n id a d e s S vedberg;
2 0 0 x 10-13 s). L o s n o m b re s d e las s u b u n id a d e s rib o so m a le s d e 30S y 50S
d e E. coli, p o r eje m p lo , d eriv a n d e su c o e fic ie n te d e s e d im e n ta c ió n ex p resad o s
en u n id a d e s S v ed b erg . E l m ism o c rite rio se a p lic a a lo s A R N rib o so m ales
b a c te ria n o s 5S , 16S y 23S .
12.2 Cálculo de tiempos de sedimentación 419
P ro b le m a 1 2 .4 Un rotor SS-34 tiene un rmfn de 3,27 cm y un rmáx de 10,70 cm

para un tubo sellado que está lleno en todo su volumen. Si una molécula de
120 S se centrifuga en un medio acuoso a 20.000 rpm a 20 °C, ¿cuánto tiempo
tardará la molécula en sedimentar?
Primero hay que calcular el factor k. Sustituyendo los valores en la ecuación
anterior obtenemos el siguiente resultado:
k = (253-°°o)Kw)1
/ 20.000\ 2
V 1.000 )
_ (253.000)[ln(3,27)]
“ (20?
(253.000)(1,18)
~ 400
_ 298.540
“ 400
= 746
Por lo tanto, un rotor SS-34 girando a 20.000 rpm tiene un valor del factor k de
746. Colocando este valor en la ecuación que calcula el tiempo de
sedimentación, tenemos
_ 749
- 120 S
- 6,24 h
= 6 h, 14 min
Por lo tanto, para sedimentar una molécula de 120 S, se debe centrifugar en un

rotor SS-34 a 20.000 rpm durante 6 h y 14 min.
E n In tern et s e p u ed e en c o n trar e l p ro g ram a q u e ca lcu la auto m ática m e n te los

v alo res d e k. U n ejem plo es el diseñ ad o p o r H u L ab o rato ry en T exas A & M
U niversity, C o lle g e S tation, T X , E stados U n id o s (F ig u ra 12-5).
Rotor Calculations
Select a R otor: ( -C usto m - |B |
C lick to above for values o r en te r custom :

R ad ius (m in): mm
R ad ius (m ax): mm
M ax. R otor sp eed : rpm
R PM : ( Compute from RPM~)
RCF(aVg): ( Compute from R C r (avg) '
R C F (m ax): ( Compute from RCF (m a x ))
k-FaetOr: ( Compute from k-Factor )
■ FIGURA 12-5 Calculadora de la fuerza centrífuga relativa (FCR), de las revoluciones por m inuto (rpm ) y de A: que
se puede encontrar en hulab.tamu.edu/rcfcalc.htm l.
L a fu e rza ce n trífu g a re la tiv a (F C R ), o fu e rza g, es p ro p o rcio n al al cu a d rad o d e la
velo c id a d d el ro to r (en rp m ) y a la d ista n cia ra d ia l (r):
l M . f r - ) ® 1
P ara c a lcu lar la fu e rza g o las rp m p ara c u a lq u ie r ra d io d e u n ro to r se p u e d e

u tiliz ar u n nom ogram a.
E l tiem p o (t) q u e se re q u ie re p a ra sed im en tar u n a p artíc u la en ag u a a 20 °C a
trav é s d e la m áx im a lo n g itu d d e recorrido d el ro to r es ex p resad o p o r la relación
k
t - -
s
d o n d e k es e l fa cto r d e com p e n sa ció n d el ro to r y s (u n id ad S vedberg) es el

coeficiente de sed im en tac ió n d e la p artícula. E l va lo r d e k se ca lcu la d e la sig u ien te
fo rm a
(253.000)
rp m \ 2
1. 0 0 0 /
Lecturas recomendadas 421
T o rri, A l F ., a n d P.T . E n g lu n d ( 1 9 9 2 ). P u r if ic a tio n o f a m ito c h o n d r ia l D N A p o ly m e r a s e fro m
C r ith id ia f a sc ic u la te . J B io l Che 2 6 7 :4 7 8 6 - 4 7 9 2 .
G ra h a m , J . ( 2 0 0 1 ). Biological Centrifugation: The Basics from Background to Bench. B IO S
S c ie n tif ic P u b lis h e rs , L td ., O x fo r d , U K .
R ic k w o o d . D . (e d .) ( 1 9 9 3 ). Preparative Centrifugation: A Practical Approach. O x fo rd
U n iv e rs ity P r e s s , O x fo r d , U K .
R ic k w o o d , D ., T .C . F o r d , a n d J . S te e n s g a a r d (1 9 9 4 ). Centrifugation: Essential Data. J o h n W ile y
& S o n s in a s s o c ia tio n w ith B I O S S c ie n tific P u b lis h e rs , L td ., O x fo r d , U K .
Capítulo
Medicina forense y paternidad
E n casi to d o s lo s delitos vio len to s, y a se a ase sin a to , v io lació n o asalto, p o r lo
g en e ral alg ú n tip o d e m aterial b io ló g ic o q u ed a en la esc en a o en la víctim a. E ste
m ateria l p u ed e se r pelo , saliva, sem en, p ie l o sangre. T odos ello s c o n tien e n A D N
— A D N q u e p u e d e p erte n ec er a la v íctim a o a l agresor— . L a aplica ció n d e la
té c n ic a d e P C R a estas m uestras, h a rev o lu c io n ad o la ca p ac id a d d e la ju s tic ia para
h a c e r cu m p lir la ley en la p ro v isió n d e p ru e b as al trib u n al cu an d o se ju z g a la
cu lp a b ilid ad o la in o ce n cia d e u n sospechoso.
E n m ed icin a forense, la té c n ic a d e P C R s e u s a p a ra la am p lifica ció n d e regiones
p o lim ó r tlc a s , regiones d e A D N q u e so n v ariab les en tre las personas. A lgunos
p o lim o rfism o s se b a sa n en m u tacio n e s pu n tu a le s específicas e n el A D N , otros en
l a ad ic ió n o s u p re sió n d e secu en cias repetitivas. H an sido id en tifica d as u n a serie
d e sec u en cia s polim órficas q u e s o n las u tiliz ad as p a ra la id en tifica ció n de cuerpos.
T am bién h a y u n a serie d e téc n ic as diferentes p o r m ed io de las cuales lo s pro d u c to s
d e P C R se p u ed e n a n a liz ar e id en tifica r polim orfism os.
Si e l p erfil del A D N del so sp ec h o so y el d el A D N re cu p erad o en la esc en a d e u n
crim en n o coinciden, en tonces se p u ed e d e c ir q u e el so sp ec h o so se ex c lu y e co m o
d o n an te de la m uestra. Si h ay u n a co in c id e n cia, en tonces el so sp ech o so se in clu y e
com o u n po sib le donante d e la pru e b a d e A D N y, p o r lo tanto, es esencial determ inar
la significación d e la co in c id e n cia. U n ab o g a d o im p lic ad o en el ca so q u errá saber
l a p ro b a b ilid ad d e q u e a lg u ien q u e n o se a e l so sp ech o so p u e d a h a b e r d ejado la
p ru e b a de A D N en la escena. E sta p re g u n ta está re la cio n ad a co n la estad ística de
p o b lac io n e s, y éste es el prin cip a l ob jetiv o d e este capítulo.
L a té c n ic a d e P C R , paralelam e n te a su desa rro llo c o m o u n a h erram ien ta en la
m ed icin a forense, tam b ié n h a en c o n trad o ap lica ció n en las pru e b as d e paternidad.
D e h e c h o , las m ism as secu en cias p o lim ó rfica s u tiliz ad as p o r lo s crim inólogos
p a ra estu d iar la partic ip a ció n d e u n so sp ec h o so en u n acto crim in al tam b ién son
u tiliz ad as p o r lo s laboratorios d e análisis p ara id en tifica r al p ad re d e u n n iñ o cu y a
p ate rn id ad e s tá en disputa. L a re cu p erac ió n y el aislam iento d e m uestras d e A D N
a s í co m o su am plificación son ese n cialm en te los m ism o s p ro c eso s en m ed icin a
forense y en las p ru e b as d e pate rn id ad . S in em b a rg o , lo s cá lcu lo s m atem áticos
424 CAPÍTULO 13 M edicina forense y paternidad
utiliz ad o s p a ra av e rig u ar la significación d e u n a co in c id e n cia se utiliz an d e form a

lig era m e n te diferente e n tre las d o s aplicaciones.
13.1 A L E L O S Y G E N O T IP O S
U n alelo es u n a de las dos o m ás form as alternativas d e u n a región del genom a
(o locus). A lgunas regiones pueden tener m uchos alelos diferentes. E sto es especial
m ente relevante en las regiones q u e albergan m últiples secuencias repetidas, donde
u n a secuencia d e A D N pu ed e estar repetida m uchas veces; c a d a variación en el
núm ero d e repeticiones d e u n a secuencia concreta se designa com o u n alelo diferente.
U n g en o tip o es la com binación particular d e alelos que alberga u n organism o. P ara
cualquier región polim órfica, cada individuo p osee dos alelos posibles — un o que
p roviene de la m adre y otro del padre— . Sin em bargo, para u n a población es posible
cualquier com binación d e alelos dentro d e los individuos d e esa población. P ara un
locus que tenga tres alelos, A, B y C, h ay seis genotipos posibles. U n individuo puede
tener cualquiera d e las siguientes com binaciones d e alelos: AA, AB, AC, BB, B C y CC.
E l núm ero de posibles genotipos se pu ed e calcular de dos m aneras. Se puede
calcular sum ando el núm ero d e alelos p ara cada entero positivo m enor a ese núm ero.
P or ejem plo, para u n locus con tres posibles alelos, el núm ero d e genotipos posibles es
3 + 2 + 1 = 6
D e fo rm a sim ilar, p ara u n siste m a d e cinco alelos, h a y 15 g en o tip o s posibles:
5 + 4 + 3 + 2 + 1 = 15
E l n ú m ero d e g en o tip o s tam b ién se p u e d e ca lcu lar utiliz an d o la ecuación
. .. » ( » + 1)
n u m ero d e g en o tip o s = ----- ------
d o n d e n es igual al nú m ero d e ale lo s p o sibles.

E l prim er m éto d o es fá cil d e re co rd a r p ero re su lta m u y in có m o d o p a ra sistem as
q u e ten g a n u n gra n n ú m ero d e alelos.
P ro b le m a 13.1 Un locus VNTR (número variable de secuencias múltiples

repetidas, del inglés variable number o f tandem repeats) tiene 14 alelos
diferentes. ¿Cuántos genotipos son posibles para este VNTR en una población?
S o lu c ió n 13.1
Utilizando la ecuación antes descrita, obtenemos
1 4 (1 4 + 1 ) _ (1 4 )(1 5 ) _ 210
número de genotipos =
2 “ 2
Por lo ta n to , para un locus co n 14 alelos d iferen tes son posibles 105 g en o tip o s
diferentes.
13.1 Alelos y genotipos 42 5
13.1.1 Cálculo de las frecuencias del genotipo

L a fre c u e n c ia d e u n g e n o tip o es la p ro p o rció n re p rese n ta d a p o r u n solo genotipo
dentro d el to tal d e g en o tip o s d e u n a p o b lac ió n . P o r eje m p lo , si el g en o tip o A A
(p a ra u n locus co n tres alelos d iferen tes) se dete cta su p re sen cia e n seis de ca d a 200
m u estra s, la frecu e n cia d el g en o tip o es 6/200 = 0 ,0 3 . L a su m a d e to d as las
frecu e n cias d el g en o tip o d e u n locus d eb e se r ig u al a 1,0. S i no es así, los
cálculos d e frecu e n cia d eb e n se r re v isa d o s d e n u ev o .
P ro b le m a 1 3 .2 Un locus tiene tres posibles alelos: A, B y C. Se analiza la

presencia de las diferentes combinaciones de alelos para los genotipos de 200
personas, obteniendo los resultados que se muestran en la siguiente tabla.
¿Cuáles son las frecuencias de los genotipos?
G e n o tip o N ú m ero d e in d iv id u o s
AA 6
AB 34
AC 46
BB 12
BC 60
CC 42
T o tal 200
Las frecuencias de los genotipos se obtienen dividiendo el número de indivi
duos que tienen un genotipo entre el total de personas de la muestra.
Las frecuencias de los genotipos para cada genotipo figuran en la columna de la
derecha de la siguiente tabla.
G e n o tip o N ú m e ro d e R elació n d e in d iv id u o s F re c u e n cia del

p e rs o n a s r e sp e cto al to tal g en o tip o
AA 6 6/200 = 0,03
AB 34 34/200 = 0,17
AC 46 46/200 = 0,23
BB 12 12/200 = 0,06
BC 60 60/200 = 0,30
CC 42 42/200 = 0,21
T o tal 200 1,00
Observe que la suma de las frecuencias genotípicas llega hasta 1,00.

426 CAPÍTULO 13 Medicina forense y paternidad
13 . 1.2 Cálculo de las frecuencias de alelos

L a f r e c u e n c ia d e u n a le lo es la p ro p o rc ió n d e u n ale lo fre n te a la p o b la c ió n to ta l
d e a le lo s . P a ra c u a lq u ie r p o lim o rfis m o , a ex c e p c ió n d e lo s p re s e n te s e n el
c ro m o s o m a X o Y, c a d a in d iv id u o lle v a d o s ale lo s p o r locus, u n o h e re d a d o
d e la m a d re y el o tro d e l p ad re. D e n tro d e u n a p o b la c ió n , p o r lo ta n to , h a y el
d o b le d e ale lo s to ta le s re s p e c to a l n ú m e ro d e p e rs o n a s . A l c a lc u la r el n ú m e ro d e
u n ale lo en partic u la r, lo s in d iv id u o s h o m o c ig o to s co n trib u y e n co n d o s ale lo s al
n ú m e ro to ta l d e es e a le lo . L o s in d iv id u o s h e te ro c ig o to s c o n trib u y e n c a d a u n o
co n u n ale lo a l n ú m e ro to ta l d e es e ale lo e n partic u la r. P o r e je m p lo , si h a y seis
p e rs o n a s c o n e l g e n o tip o AA, é stas a p o rta n 12 ale lo s . T re in ta y c u a tro p e rs o n a s
h e te ro c ig o ta s AB co n trib u irá n co n u n to ta l d e 3 4 ale lo s A y 34 a le lo s B a l to tal.
L a fre c u e n c ia d el ale lo A en u n s is te m a d e tre s ale lo s s e c a lc u la d e la sig u ie n te
fo rm a
[2 (n.°deA A ) + ( n .°d e A B ) + ( n.°deA C )\

f recuencia del alelo A
2n
d o n d e n es e l n ú m ero d e perso n as en el estudio. L as frecu e n cias d e lo s o tro s alelos

se calcu lan d e fo rm a sim ilar. L a su m a de to d as las frecuencias d e lo s ale lo s d e un
locus específico d eb e se r igual a 1,0.
P ro b le m a 1 3 .3 ¿Cuáles son las frecuencias para los alelos A ,B y C descritos en

el Problema 13.2?
Vamos a asignar una frecuenciap para el alelo A, q para el alelo B y r para el alelo
C. Tenemos los siguientes datos de los genotipos.
G enotipo Número de individuos

AA 6
AB 34
AC 46
BB 12
BC 60
CC 42
Total 200
Las frecuencias de los alelos se calculan de la siguiente forma:
[2(6) + 34 + 46]
2 (200)
13.2 La ecuación de Hardy-Weinberg y el cálculo de las frecuencias de genotipos esperadas 427
[2 (1 2 )+ 3 4 + 60]
2 (200)
2 (4 2 )+ 4 6 + 60 190
rC = 1 v — i = ---- = 0,475
2(200) 400
Por lo tanto, la frecuencia para el alelo A es 0,230, la frecuencia para el alelo B es

0,295 y la frecuencia para el alelo C es 0,475. Observe que la suma de las
frecuencias de todos los alelos llega hasta 1,000 (0,230 + 0,295 + 0,475 = 1,000).
13.2 L A E C U A C IÓ N D E H A R D Y - W E IN B E R G
Y E L C Á L C U L O D E L A S F R E C U E N C IA S
D E G E N O T IP O S E S P E R A D A S
G regor M endel dem ostró al cruzar las plantas d e guisantes con características dife
rentes q u e los gam etos se com binan al azar. É l utilizó el cuadro de Punnett para
p redecir el resultado d e cualquier cruce genético. P o r ejem plo, al cruzar dos plantas
heterocigotas p ara la altura, donde T representa un fenotipo alto dom inante y t
representa el fenotipo bajo recesivo, el cuadro de Punnett tendría el siguiente aspecto:
Polen
Óvulos T
A p artir d el cuadro d e P unnett, M endel predijo q u e la d esc en d en c ia del cruce

d eb e ría te n e r u n a re la ció n fe n o típ ica d e las plan tas altas re sp ecto a las p lan tas bajas
d e 3:1.
G . H . H ardy, u n m atem á tico b ritá n ic o , y W . W e in b erg , u n m éd ico ale m á n , se
d ie ro n c u e n ta d e q u e p o d ría ap lic a rs e u n en fo q u e s im ila r p a ra p re d e c ir e l re su l
ta d o d e u n ap a rea m ie n to al azar, no só lo p a r a u n c ru c e e n c o n c reto sino tam b ié n
p a r a lo s c ru c e s q u e o c u rre n d e n tro d e to d a u n a p o b la c ió n . D e s p u é s d e to d o , la
c o m b in a c ió n a l a z a r d e lo s g a m e to s , ta l co m o fu e e s tu d ia d a p o r M e n d e l p a r a u n
c ru c e e n co n c reto , es m u y sim ila r co n c e p tu a lm e n te al ap a rea m ie n to al a z a r d e
lo s g e n o tip o s. E n u n c ru c e e n c o n c re to , la c o m b in a c ió n d e u n esp e rm a to z o id e
co n u n ó v u lo s e rá u n a c u e s tió n d e su erte . E n u n a p o b la c ió n in fin ita m en te
g ra n d e , c o n u n ap a rea m ie n to al azar, la c o m b in a c ió n d e g e n o tip o s s e rá u n a
c u e s tió n d e su erte . D e te rm in a r la d is trib u c ió n d e la s fre c u e n c ia s d e g en o tip o
en u n a p o b la c ió n e m p a re ja d a a l a z a r ta m b ié n s e p u e d e re a liz a r u tiliz a n d o u n
cu a d ro d e P u n n ett. S in e m b a rg o , en lu g a r d e u n so lo c ru c e en tre d o s p ad res,
H a rd y y W e in b erg ex a m in a ro n lo s cru ces e n tre to d a s la s m a d re s y to d o s lo s
p a d re s d e u n a p o b lac ió n .
P a ra u n locus co n d os alelos, A y B, se p u e d e d esa rro llar u n cu a d ro d e P unnett
d e ta l m a n e ra q u e la frecu e n cia del alelo p s e asig n a al ale lo A y la frecu e n cia del
alelo q se le a sig n a al alelo B . L as frecu e n cias alélicas se m u ltip lican , com o se
p u e d e v e r e n e l sig u ien te cu a d ro d e P unnett:
Padres
pA qB
Madres pA pApA pAqB
qB pAqB qBqB
Si AA re p rese n ta la ho m o cig o sis, entonces su frecu e n cia en la po b lac ió n es p 2

(p x p = p 2). L a frecu e n cia d e lo s individuos h o m o cig o to s BB es q2. C o m o los
in d iv id u o s h ete ro cig o to s p u ed e n ap a rec er d e d o s form as, a l re cib ir los ale lo s de
fo rm a altern a d e c a d a progenitor, la frecu e n cia del g en o tip o A B en u n a po b lac ió n
es 2p q y a q u e (p x q) + (p x q) = 2pq.
L a su m a d e las frecu e n cias d e lo s g en o tip o s v ien e e x p resad a p o r
p 2 + 2p q + q2 = 1,0
E sta re la ció n se den o m in a ec u a c ió n d e H a rd y -W e in b e rg . E sta ecu ac ió n es la

q u e s e u tiliz a p a r a ca lcu lar las frecuencias d e gen o tip o s esp erad as a p a rtir d e las
frecu e n cias d e los alelos.
E l cuadro d e P u n n ett se p u e d e u tiliz ar p a ra v e r ca d a u n o d e lo s alelos. P or
eje m p lo , u n siste m a q u e tien e tres alelos A, B y C, c o n frecuencias de ale lo s p, q y r,
re spectivam ente, te n d rá el s ig u ie n te cu a d ro d e P unnett:
Padres
pA qB rC
pA pApA pAqB pArC
Madres qB pAqB qBqB qBrC
rC pArC qBrC rCrC

13.2 La ecuación de Hardy-Weinberg y el cálculo de las frecuencias de genotipos esperadas 429
L a s u m a d e la s fre c u e n c ia s d e lo s g e n o tip o s p a r a e s te s is te m a d e tres

a le lo s es
p 2 + q - + r + 2pq + 2p r + 2 qr = 1,0
E sto d em u e stra q u e n o im p o rta cu ántos alelos están sien d o exa m in a d o s, la

frecu e n cia d e los ho m o cig o to s siem p re es e l cu a d rad o d e la frecu e n cia d e los
ale lo s ( p2), y la frecu e n cia d e lo s hete ro cig o to s es siem p re el do b le de la frecu e n cia
d e u n ale lo p o r la frecu e n cia d el o tro ale lo (2pq).
L a ecu ac ió n de H ardy-W einberg d eriv a d e u n estricto co n ju n to de condiciones.
A su m e q u e la p o b lac ió n está en e q u ilib rio — q u e no su fre n in g ú n ca m b io n eto en
las frecu e n cias d e ale lo s a lo largo d el tiem po— P ara alc a n z a r e l equilibrio, se
d eb e n cu m p lir las sig u ie n tes condiciones:
1. A pa rea m ie n to a l azar.
2. U n a p o b lac ió n infinitam ente grande.
3 . N o h ay m utación.
4 . N o h ay e n tra d a o salid a d e individuos.
5. N o h a y selec ció n d e g en o tip o s (to d o s los g en o tip o s son ig u alm en te viab les y
fértiles p o r igual).
P o r su p u esto , re alm en te n o h a y p o b lac io n e s q u e cu m p lan estos requisitos. S in

em bargo, la m a y o ría d e las p o b lac io n e s su ficie n te m en te g ra n d es se ap ro x im an a
estas co n d ic io n e s h a s ta e l p u n to d e q u e la ecu ac ió n d e H ardy-W einberg s e p u ed e
ap lica r p ara c a lcu lar las frecuencias d e lo s genotipos.
P ro b le m a 1 3 .4 ¿Cuáles son las frecuencias de genotipos esperadas para los

alelos descritos en el Problema 13.3? (Supongamos que la población está en un
equilibrio de Hardy-Weinberg.)
Del Problema 13.3 hemos obtenido las siguientes frecuencias alélicas:
pA ~ 0,230
qB ~ 0,295
rC ~ 0,475
La ecuación de Hardy-Weinberg da los siguientes resultados:
Genotipo Multiplicación Cálculo Frecuencia

de genotipo
esperada
AA (free, de A)2 (0,230)2 = 0,053

AB 2(frec. de A)(frec. de B) 2(0,230)(0,295) = 0,136
AC 2(frec. de A)(frec. de C) 2(0,230)(0,475) = 0,218
BB (free, de B)2 (0,295)2 = 0,087
BC 2(frec. de B)(frec. de C) 2(0,295)(0,475) = 0,280
CC (free, de C)2 (0,475)2 = 0,226
Observe que el total de todas las frecuencias de los genotipos es igual a 1,000,
como sería de esperar si los cálculos se han realizado correctamente.
13.3 L A P R U E B A D E C H I- C U A D R A D O : C O M P A R A N D O
LO S V A L O R E S O B S E R V A D O S F R E N T E A LO S
ESPERA D O S
E n e l P ro b lem a 13.4, las frecu e n cias d e lo s g enotipos s e calcu lan a p artir d e las
frecuencias de los ale lo s u sa n d o la ecu ac ió n d e H ardy-W einberg. E stas frecuencias
d e los g enotipos re p rese n ta n lo q u e se d e b e esp e rar d e la po b lac ió n d e la m u estra
si es q u e la po b lac ió n está en el equilibrio d e H ardy-W einberg. E n el P ro b lem a
13.2, se c a lcu lan las frecu e n cias gen o típ ica s observ ad as dentro d e la p oblación.
A h o ra n o s h em o s d e preguntar: ¿las frecu e n cias gen o típ icas o b serv ad as difieren
sig n ificativ am en te d e las frecu e n cias d e gen o tip o esperadas? E sta p re g u n ta p u ed e
ab o rd arse m ed ian te u n a p ru e b a estad ística d e n o m in ad a chi-cuadrado.
C h i- c u a d r a d o se u tiliz a p a ra p ro b a r si la distrib u ció n ob serv ad a de u n o s datos
se aju sta o n o a u n a p a u ta prevista. D a d o q u e es p o c o p ro b a b le q u e las frecuencias
g en o típ ica s observ ad as se ajusten ex a ctam en te com o p re d ic e la ecu ac ió n de
H ardy-W einberg, es im p o rtan te te n e r en cu e n ta la n a tu ra leza d e las diferencias
entre lo s valo res o b serv ad o s y esp e rad o s y h a c e r u n a valo ra ció n so b re la « b o n d ad
d el ajuste» entre ellos. E n la p ru e b a d e ch i-c u ad rad o , el va lo r esperado se re s ta del
v a lo r o b serv ad o en c a d a ca teg o ría y este va lo r es elevado al cuadrado. C a d a v a lo r
al cu a d rad o se p o n d era divid ié n d o lo entre el v a lo r esp e rad o p a ra e s a categoría. L a
su m a d e esto s v alo re s al cu a d rad o y po n d erad a, llam ad a chi-cuadrado (cuyo
sím bolo es x 2)> está re p rese n ta d a p o r la siguiente ecuación:
2 _ ^ (o b se rv ad o — e s p e rad o )2
' esperado
13.3 La prueba de chi-cuadrado: comparando los valores observados frente a los esperados 431
E n la p ru e b a d e ch i-cu ad rad o , s e p ru e b an d o s h ipótesis. L a h ip ó te s is n u la (H¿)

afirm a q u e no h a y d iferen c ia en tre d os v alores, el o b serv ad o y el esperado; y son
estad ística m e n te iguales y c u a lq u ie r d iferen c ia q u e s e p u e d a d ete ctar se d eb e al
azar. L a h ip ó tesis a ltern ativ a (Ha) afirm a q u e los d os co njuntos d e dato s, los
v alo res o b serv ad o s y esp e rad o s, son diferentes; la d iferen c ia es estadísticam ente
s ig n ificativ a y d e b e se r p o r a lg u n a o tra ra zó n q u e el azar.
E n las p o b lac io n e s, u n a d istrib u ció n n o rm al d e los v alo re s e n to m o a u n a
frecu e n cia m ay o ritaria d e b e e s ta r re p rese n ta d a p o r u n a c u rv a e n fo rm a d e ca m
pana. E l grado d e d istrib u ció n represe n ta d o p o r u n a cu rv a se a so c ia c o n u n v alo r
d en o m in ad o g ra d o s d e lib e r ta d (gl). C u an to m e n o r se a el v a lo r d e g l (m en o r es el
ta m a ñ o d e la m uestra), m a y o r es la d isp ersió n e n la distrib u ció n , y se rá m ás difícil
d is tin g u ir u n a c u rv a en fo rm a d e cam pana. C u an to m a y o r se a el v a lo r d e g l (m ay o r
es el tam añ o d e la m uestra), m ás ce rca está la distrib u ció n d e u n a n o rm al, u n a
cu rv a e n fo rm a d e cam pana. E n la cie n cia forense, los g ra d o s d e lib ertad p a ra la
m ay o ría d e los pro b lem a s, son igual a u n o m en o s el nú m ero d e las ca tegorías en la
distribución. P a ra tales p ro b lem a s el n ú m ero d e categorías es igual al nú m ero de
ale lo s diferentes (o el nú m ero d e gen o tip o s diferentes, d ep e n d ien d o d e cuál es el
o bjeto d e la p rueba). E n chi-cuadrado se p u e d e n o b se rv a r las diferencias
estad ística m e n te significativas si el tam añ o d e la m u estra es p eq u e ñ o (m en o s de
100 in d iv id u o s d e u n a m u estra de u n a p o b lac ió n ) o si h a y desv iac io n es drásticas
d el equ ilib rio d e H a rdy-W einberg.
U n a pru e b a d e ch i-c u ad rad o se re aliza en u n d ete rm in a d o n iv el d e sig n ifican
cia, p o r lo g eneral d e u n 5% (a = 0,05; p = 0,95). A u n n iv el d e sig n ifican c ia del
5 % , estam os dicien d o q u e h a y m en o s de u n 5% de p ro b a b ilid ad d e q u e la h ip ó tesis
n u la será re ch az ad a a p e s a r d e q u e se a v erd ad . P o r el contrario, h a y u n a p ro b a
b ilid a d del 9 5% d e q u e la h ip ó tesis n u la s e a correcta; n o h a y n in g u n a d iferen c ia
en tre lo s v alo res o b serv ad o s y esp e rad o s. U n a tab la d e d istrib u ció n d e chi-cua-
d ra d o (véase la T abla 13-1) pro p o rcio n ará el v a lo r esperado d e ch i-c u ad rad o p ara
u n a p ro b a b ilid ad d a d a y el v a lo r d e g ra d o s d e lib ertad gl. P o r eje m p lo , s u p o n g a
m o s q u e se o b tien e u n va lo r de ch i-c u ad rad o d e 2,3 p a ra u n co n ju n to d e d ato s que
= tien e och o g ra d o s de lib ertad y q u erem os p ro b a r a u n nivel de sig n ifican c ia d el 5% .
§ D e la tab la d e d istrib u ció n d e ch i-cu ad rad o , n o s en c o n tram o s c o n u n v a lo r de
| 15,51 p ara u n v a lo r d e p ro b a b ilid ad d e 0,95 y och o grados de libertad. P o r lo tanto,
•5 h a y u n a p ro b a b ilid ad d e 0,9 5 (9 5 % ) d e q u e el v a lo r de ch i-c u ad rad o s e a in ferio r a
o 15,51. D a d o q u e e l v a lo r d e ch i-c u ad rad o d e 2,3 e s in ferio r a 15,51, la hip ó tesis
® n u la n o es rech azad a; lo s datos n o p ro p o rcio n an ev id e n cia su ficie n te p a ra co n c lu ir
^ q u e lo s d ato s o b serv ad o s difieren d e lo s esperados.
§ L a p ru e b a d e chi-cuadrado p u ed e s e r u tiliz ad a e n la m ed icin a forense p ara
,5 c o m p a rar las frecuencias d e g enotipo ob serv ad as con las esp e rad a s a p artir del
g¡ an á lisis d e H ardy-W einberg, y p ara c o m p a rar las frecuencias alélicas locales
jjj (ob se rv ad a s) c o n las que h a y en u n a b a s e d e d ato s m ás g ra n d e o a n iv el nacional
w (valores esperados).
T a b la 13-1 Tabla de la distribución de chi-cuadrado. A los ocho grados de

libertad, por ejem plo, hay una probabilidad del 0,95 (95%) de que el valor
de chi-cuadrado sea inferior a 15,51. Si el v alo r de chi-cuadrado obtenido es
inferior a 15,51, entonces no hay pruebas suficientes para concluir que los
valores observados difieren de los valores esperados. Por debajo de 15,51,
las diferencias entre los valores observados y esperados se deben
sim plem ente al azar
gi p = 0,75 p = 0,90 p = 0,95 p = 0,975 p = 0,99
i 1,32 2,71 3,84 5,02 6,64

2 2,77 4,60 5,99 7,37 9,21
3 4,10 6,24 7,80 9,33 11,31
4 5,38 7,77 9,48 11,14 13,27
5 6,62 9,23 11,07 12,83 15,08
6 7,84 10,64 12,59 14,44 16,81
7 9,04 12,02 14,07 16,01 18,48
8 10,22 13,36 15,51 17,54 20,09
9 11,39 14,68 16,92 19,02 21,67
10 12,5 15,9 18,3 20,5 23,2
11 13,7 17,3 19,7 21,9 24,7
12 14,8 18,6 21,0 23,3 26,2
13 16,0 19,8 22,4 24,7 27,7
14 17,1 21,1 23,7 26,1 29,1
15 18,2 22,3 25,0 27,5 30,6
16 19,4 23,5 26,3 28,8 32,0
17 20,5 24,8 27,6 30,2 33,4
18 21,6 26,0 28,9 31,5 34,8
19 22,7 27,2 30,1 32,9 36,2
20 23,8 28,4 31,4 34,2 37,6
21 24,9 29,6 32,7 35,5 38,9
22 26,0 30,8 33,9 36,8 40,3
23 27,1 32,0 35,2 38,1 41,6
24 28,2 33,2 36,4 39,4 43,0
25 29,3 34,4 37,7 40,7 44,3
30 34,8 40,3 43,8 47,0 50,9
40 45,6 51,8 55,7 59,3 63,7
50 56,3 63,2 67,5 71,4 76,2
60 67,0 74,4 79,1 83,3 88,4
70 77,6 85,5 90,5 95,0 100,4
80 88,1 96,6 101,9 106,6 112,3
90 98,7 107,6 113,2 118,1 124,1
100 109,1 118,5 124,3 129,6 135,8
13.3 La prueba de chi-cuadrado: comparando los valores observados frente a los esperados 433
P ro b le m a 1 3 .5 En los Problemas 13.2 y 13.4, se calcularon las frecuencias de

genotipos observadas y esperadas para una población ficticia. Esto se puede ver
en la siguiente tabla. Utilizando la prueba de chi-cuadrado con un nivel de
significación del 5% (95% de probabilidad), calcule si las frecuencias de genotipo
observadas son significativamente diferentes de las frecuencias de genotipo
esperadas.
Genotipo Frecuencia observada Frecuencia esperada
AA 0,03 0,053
AB 0,17 0,136
AC 0,23 0,218
BB 0,06 0,087
BC 0,30 0,280
CC 0,21 0,226
Se prepara una tabla de forma que se puedan seguir las etapas involucradas en
la obtención del valor de chi-cuadrado. Para no utilizar números muy pequeños
o decimales, las frecuencias de la tabla se multiplicarán por 100 expresado para
dar los valores en porcentaje.
Genotipo Frecuencia Frecuencia Diferencia Cuadrado (O - E )2IE

observada esperada (O - E ) de la
(O) (E) diferencia
(O - E )2
AA 3 5,3 -2 ,3 5,3 1,00

AB 17 13,6 3,4 11,6 0,85
AC 23 21,8 1,2 1,4 0,06
BB 6 8,7 -2 ,7 7,3 0,84
BC 30 28 2,0 4 0,14
CC 21 22,6 -1 ,6 2,6 0,12
Total X2= 3,01
Por lo tanto, se obtiene un valor de chi-cuadrado de 3,01. Los grados de

libertad es igual al número de categorías (seis, porque hay seis genotipos)
menos 1:
g l= 6 — 1 = 5
De los datos de la Tabla 13-1 se obtiene, con cinco grados de libertad y una
probabilidad de 0,95, un valor de chi-cuadrado de 11,07. Por lo tanto, hay una pro
babilidad del 95% de que \ 2 será menor de 11,07 si la hipótesis nula es
verdadera, si no hay una diferencia estadísticamente significativa entre las

frecuencias genotípicas observadas y esperadas. Dado que obtenemos un valor
de chi-cuadrado de 3,01 que es inferior a 11,07, no rechazamos la hipótesis nula;
no hay pruebas suficientes para concluir que las frecuencias genotípicas obser
vadas difieren de las frecuencias de genotipo esperadas. Esto sugiere que la
población puede estar en el equilibrio de Hardy-Weinberg.
13.3.1 V a ria n z a d e u n a m u estra

L a v a ria n za de una m uestra (s2) es la m e d id a del grado d e disp ersió n d e u n a serie
d e n ú m ero s d e u n listado. S i lo s v alo re s d e lo s nú m ero s d el listado son pró x im o s a
lo s v alo res esp e rad o s, la v aria n za se rá peq u e ñ a. Si esto s valo res están alejados, la
v aria n za s e rá gra n d e. L a v aria n za d e u n a m u estra v ien e d a d a p o r la ecuación
,2 E ( O - E f
n —1
d o n d e n es el n ú m ero d e categorías.
E l cálcu lo d e la v aria n za d e u n a m u estra tien e s u m áx im o im pacto c u a n d o se
u tiliz a p a ra co m p a rar d os con ju n to s d iferentes d e datos, p o r eje m p lo las d istrib u
cio n e s d e frecu e n cias d e g en o tip o en N u e v a Y ork en co m p a rac ió n co n las d e S anta
F e, N u e v o M éxico. U n a p o b lac ió n q u e n o está en el equilibrio de H ardy-W einberg
es m ás p ro b a b le q u e te n g a u n a v aria ció n m a y o r en las frecuencias d e g en o tip o que
u n a q u e está en el equ ilib rio d e H a rdy-W einberg. L a v aria n za d e u n a m u estra de
po b lac io n e s alejadas d el equilibrio d e H ardy-W einberg p u ed e te n e r u n v a lo r a
n iv el d e lo s centenares.
P ro b le m a 1 3 .6 ¿Cuál es la varianza de una muestra para los datos del

Problema 13.5?
La suma de la columna (O — E)2 del Problema 13.5 es
5,3 + 11,6 + 1,4 + 7,3 + 4 + 2,6 = 32,2
El valor de n en este problema es 6 ya que hay seis posibles genotipos.

Sustituyendo estos valores en la ecuación de la varianza obtenemos el siguiente
resultado:
, 32,2 32,2
S2 - — — = — — = 6,44
6 -1 5
Este valor es relativamente pequeño, indicando que las frecuencias de genotipo

observadas no varían mucho de las esperadas.
13.4 La probabilidad de inclusión (P¡) 435
13 . 3.2 Desviación estándar de una muestra

L a d esviación están d ar d e u n a m u estra (s) es la raíz cu a d rad a d e la varianza de
u n a m uestra y tam bién es u n a m edida d e la d ispersión respecto a los valores
esperados. E n térm inos m ás sencillos, se pu ed e co n sid erar co m o la distancia m edia
entre los datos observados y los valores esperados. S e calcula m ediante la fórm ula
S i h a y p o c a v aria ció n en tre los datos o b serv ad o s y los v alo re s esp e rad o s, la
d esv iac ió n e stán d a r s e rá peq u e ñ a. Si h a y u n a g ra n v aria ció n entre los datos,
en to n c es en pro m ed io , lo s v alo re s d e lo s datos estarán lejo s d e la m ed ia y la
d esv iac ió n e stán d a r s e rá grande.
P ro b le m a 1 3 .7 ¿Cuál es la desviación estándar del conjunto de datos del

Problema 13.5?
En el Problema 13.6, se ha calculado una varianza de 6,44. La desviación estándar
es la raíz cuadrada de ese número:
s = \/6,44 = 2,54
Por lo tanto, la desviación estándar es 2,54. El promedio de la frecuencia de

genotipo observada se encuentra dentro de una desviación estándar (2,54
puntos porcentuales) de cada frecuencia de genotipo esperada. Las frecuencias
de genotipo AB y BB son mayores que una desviación estándar respecto a las
frecuencias esperadas (AB está a 3,4 puntos porcentuales de distancia del valor
esperado; BB está a 2,7 puntos porcentuales de distancia del valor esperado;
véase la Solución 13.5).
13.4 L A P R O B A B IL ID A D D E IN C L U S IÓ N ( P ¡ )
L a p rob ab ilid ad d e in clu sió n (P¡) n o s d a la p ro b a b ilid ad d e q u e d os individuos
d e u n a p o b lac ió n , esc o g id o s al azar, te n g a n el m ism o genotipo. C u an to m en o r sea
el v a lo r d e P¡, m ás cap acid ad d e discrim in ac ió n te n d rá n uestro m éto d o d e g eno-
tip ad o p a ra d iferenciar in d iv id u o s. L a p ro b a b ilid ad d e in clu sió n es eq u iv a le n te a la
su m a d e los cu adrados d e las frecu e n cias d e g en o tip o esperadas. P o r ejem plo, u n
v a lo r d e P¿ d e 0 ,06 s ig n ifica q u e el 6% (0,06 x 100 = 6 % ) d e las v ec es que
escojam os al a z a r a d os in d iv id u o s d e u n a p o b lac ió n , éstos ten d rá n el m ism o
genotipo.
P ro b le m a 1 3 .8 ¿Cuál es la probabilidad de inclusión para los genotipos del

Problema 13.4?
Las frecuencias de genotipo esperadas para una población ficticia son las
siguientes:
Genotipo Frecuencia esperada
AA 0,053
AB 0,136
AC 0,218
BB 0,087
BC 0,280
CC 0,226
P¡ es la suma de los cuadrados de las frecuencias de genotipo esperadas. Se

calcula de la siguiente forma:
P¡ = (free. esp. de A A )2 + (free. esp. d e A B )2 + (free. esp. de>4C)2
+ (free. esp. de BB)2 + (free. esp. de BC)2 + (free. esp. de CC)2
Sustituyendo los valores apropiados en esta ecuación obtenemos el siguiente

resultado:
P¡ = (0,053)2 + (0,136)2 + (0,218 )2 + (0,087)2 + (0,280)2 + (0,226)2
= 0,003 + 0,018 + 0,048 + 0,008 + 0,078 + 0,051

- 0,206
Por lo tanto, el 20,6% de las veces que escojamos al azar a dos individuos de la
población, éstos tendrán el mismo genotipo.
13.5 L A P R O B A B IL ID A D D E E X C L U S IÓ N ( P e)
L a p rob ab ilid ad d e exclu sión (P e) eq u iv a le a 1 m en o s la P¡:
Pe = 1 - P¡
P e p ro p o rcio n a la m e d id a d e q u é p ro b a b ilid ad h a y d e q u e d os individuos

te n g a n g en o tip o s diferentes. P o r ejem plo, si u n siste m a d e tip ific ac ió n d e A D N
13.6 Tipificación del ADN y promedio ponderado 437
tien e u n a Pe d e 0,9 9 9 7 , esto s ig n ifica q u e el 99 ,9 7 % d e las vec es q u e escojam os al

az a r a d os in d iv id u o s d e u n a pob lac ió n , ésto s ten d rá n g en o tip o s d iferentes que
p u ed e n s e r diferen c ia d o s p o r el m éto d o utilizado.
U n a Pe co m b in a d a es eq uivalente a 1 m en o s el pro d u c to d e las P¡ de to d o s lo
m arcadores. S e u tiliz a cu a n d o se u san m ú ltip les loci p a ra u n e n sa y o d e
tip ificació n . E l v a lo r d e P¡ p a ra u n solo m arc ad o r gen é tic o es eq u iv a le n te a 1
m en o s el va lo r Pe p ara ese m arcador. C u an to s m ás loci se u tilic en en u n en sayo de
tip ific ac ió n d e A D N , m a y o r será el v a lo r d e la Pe com binada.
P ro b le m a 1 3 .9 ¿Cuál es la probabilidad de exclusión para los genotipos del

Problema 13.8?
En el Problema 13.8, se calculó un valor de P¡ de 0,206. Pe es 1 menos P¡. Esto
proporciona
Pe = 1 - 0,206 = 0,794
Por lo tanto, el 79,4% de las veces en que escojamos al azar a dos individuos de la
población, éstos tendrán los genotipos diferentes.
13.6 T IP IF IC A C IÓ N D E L A D N Y P R O M E D IO
PO N DERADO
L as frecu e n cias d el g en o tip o y d e ale lo s observ ad as s e co n sig u en m ed ian te la
ecu ac ió n d e H ardy-W einberg. M u ch o s lab o ra to rio s d e crim in alístic a ob tien en los
v alo re s d e frecu e n cias d e ale lo s a p a rtir d e las b ase s d e datos nacionales. E stas
¿ b ase s d e d atos p u ed e n te n e r las frecuencias d e los ale lo s d e lo s g ru p o s de
i§ p o b lac ió n m ás im portantes (caucásicos, afroam ericanos e hispanos).
= U n crim en ocurrido en u n a c iu d a d su ele s e r perp etrad o p o r u n o d e sus h ab i-
^c tantes. P o r esta ra zó n , las áreas m etro p o litan as m ás im portantes ela b o ran u n a base
| d e datos d e la frecu e n cia de ale lo s d e u n a m u estra al a z a r de su p ro p ia población.
| S in em bargo, in clu so sin esto s d ato s, to d a v ía s e p u ed e o b ten e r u n a b u e n a
= estim ación d e las frecu e n cias d e lo s g en o tip o s d e u n a ciudad d en tro d e sus
.i3 lím ites. E sto se p u e d e h a c e r u tiliz an d o lo s d atos d el censo. P o r ejem plo, la
§ p ro p o rció n d e hab itan te s ca u cá sic o s d en tro d el áre a censal d e la ciu d a d se pu ed e
^ m u ltip licar p o r la frecu e n cia d e gen o tip o d e la b a s e de dato s nac io n al p ara ob ten e r
|jj u n pro m ed io p o n d erad o d e es e g ru p o d e po b lac ió n . L o s pro m ed io s p o n derados
«3 p a ra c a d a g ru p o d e po b lac ió n se añ a d en p a ra d a r u n a estim ació n glo b al d e la
© frecu e n cia d e u n g en o tip o partic u la r e n el áre a d el censo.
P ro b le m a 1 3 .1 0 Se tipifica una mancha de sangre para un solo locus STR

(repeticiones cortas múltiples, del inglés short tandem repeat). Se ha
encontrado que el ADN contiene cinco repeticiones y seis repeticiones
(designado 5, 6; se lee «cinco coma seis») para este STR particular. La base de
datos del FBI muestra que este genotipo heterocigoto tiene una frecuencia del
0,003 en los caucásicos, del 0,002 en los afroamericanos y del 0,014 en la
población hispana. La ciudad en la que se recogen estos datos tiene una
distribución de población del 60% de caucásicos, 30% de afroamericanos y
10% de hispanos. ¿Cuál es la frecuencia ponderada global promedio de este
genotipo?
S o lu c ió n 1 3 .1 0
Cada frecuencia de genotipo se multiplicará por la fracción de población for
mada por cada grupo étnico. Estos valores se suman para dar el promedio
ponderado. El cálculo es el siguiente:
promedio ponderado = (0,60 x 0,003) + (0,30 x 0,002) + (0,10 x 0,014)
= 0,0018 + 0,0006 + 0,0014 = 0,0038
Por lo tanto, la frecuencia de genotipo media ponderada para este STR 5 ,6 en la

población de la ciudad es de 0,0038. Este valor se puede convertir en la
proporción por habitante, dividiendo 1 entre 0,0038:
— -— = 263
0,0038
De este modo, se espera que 1 de cada 263 individuos tomados al azar de la

población de la ciudad tenga el genotipo STR 5, 6.
13.7 L A R E G L A D E L A M U L T IP L IC A C IO N
C u a n to m a y o r n ú m e ro d e lo c i s e u tiliz a n p a r a la tip ific a c ió n d e A D N , m a y o r
es la c a p a c id a d d e la tip ific a c ió n p a r a d is tin g u ir e n tre in d iv id u o s . L a m a y o ría
d e lo s A D N s e a n a liz a n p a r a v a rio s m a rc a d o re s y lu e g o la s fre c u e n c ia s
g e n o típ ic a s s e m u ltip lic a n e n tre sí p a r a d a r la fre c u e n c ia d e to d o el p erfil.
E sto s e c o n o c e c o m o la re g la d e la m u ltip lic a c ió n . P a ra q u e su u s o te n g a
v a lid e z , lo s lo c i d e b e n e s ta r e n e q u ilib rio d e lig a m ie n to . E s d ec ir, lo s m a rc a
d o re s s e e n c u e n tra n e n d ife re n te s c ro m o s o m a s, o lo s u fic ie n te m e n te se p a ra d o s
d e n tro d e l m ism o c ro m o s o m a p a r a q u e s e g re g u e n d e fo rm a in d e p e n d ie n te , y a
q u e n o e s tá n lig a d o s.
13.8 índice de paternidad (IP) 439
P ro b le m a 13.11 Se tipifica un ADN para cinco loci diferentes no ligados. Se

calculan las siguientes frecuencias de genotipo para cada locus. ¿Cuál es la
frecuencia de genotipo para el perfil completo?
Locus Frecuencia de genotipo
1 0,021
2 0,003
3 0,014
4 0,001
5 0,052
Para calcular la frecuencia de genotipo del perfil completo, se multiplican las
frecuencias de genotipo entre sí:
frecuencia global = 0,021 x 0,003 x 0,014 x 0,001 x 0,052 = 4,6 x 10-11
Por lo tanto, la frecuencia de genotipo del perfil completo es de 4,6 x 10-11.

Este valor se puede convertir en la proporción por habitante, dividiendo 1 entre
4, 6 x 10-11:
----------- r r = 2,2 x 1010

4,6 x 10~11
De este modo, se espera que 1 de 2,2 x 1010 individuos tomados al azar de la

población tenga esta combinación de genotipo especial.
13.8 ÍN D IC E D E P A T E R N ID A D (IP )
E l ín d ic e d e p a te r n i d a d (LP) d esc rib e la p ro b a b ilid ad d e pate rn id ad . S e ca lcu la
com o
d o n d e X es la p ro b a b ilid ad d e q u e el pre su n to p ad re es, d e h ec h o , el pad re, e Y es la

p ro b a b ilid ad d e q u e u n h o m b re a l az a r d e la m ism a ra z a s e a el padre.
E l cá lcu lo del IP d ep e n d e del p a tró n de h eren cia — q u é ale lo s fu e ro n aportados
p o r la m ad re y cuáles p o r el pre su n to p ad re— (T abla 13-2).
E l IP p u ed e se r interpretado en e l sen tid o d e cual es la pro b a b ilid ad d e q u e al
az ar u n h o m b re sin paren tesc o y d e la m ism a ra z a se a el p ad re biológico.
T a b la 13-2 Los genotipos de la madre, el niño y el supuesto padre y los

valores del num erador (X) y del denom inador (Y) para el cálculo del
índice de paternidad (IP) (IP = X/Y). A, B, C y D son los alelos posibles y p
denota la probabilidad (frecuencia de los alelos). Por ejem plo, pA denota
la frecuencia del alelo A en los datos de población para la carrera del
presunto padre
G en o tip o s N um erado r D e n o m in a d o r
M adre Niño P resunto

p a d re
AA AA AA 1 Pa
AA AA AB 1/2 Pa
AA AA BC 0 Pa
AB AA AA 1/2 P a /2
AB AA AB 1/4 P a /2
AB AA AC 1/4 P a /2
AB AA BC 0 P a /2
AA AB AB 1/4 P b/2
AA AB BB 1 Pb
AA AB BC 1/2 Pb
AA AB CD 0 Pa
AB AB AA 1/2 (p A + p B)/2
AB AB AB 1/2 (P a + P b)/2
AB AB BC 1/4 (p A + P b)/2
AB AB AC 1/4 (P a + P b)/2
AB AC AC 1/2 Pc
AB AC CD 1/4 Pc/2
AB AC BC 1/4 P c/2
AB BC CC 1/2 Pc/2
AB BB AB 1/4 P b/2
AB BC BC 1/2 Pc
AB BC CD 1/4 P c/2
AB AB CD 0 (p A + P b)/2
AC AB BB 1/2 P b/2
AC AB BD 1/4 P b/2
AC AB BC 1/4 P b/2
AC AB CD 0 P b/2
P ro b le m a 1 3 .1 2 El locus D1S80 se está utilizando para hacer una prueba

rápida de paternidad. D1S80 es un VNTR que, dentro de la población
humana, puede llevar desde 14 hasta 41 copias de una secuencia de ADN de 16
pb. La madre es portadora de 18 y 21 repeticiones, el niño de 18 y 31
repeticiones y el presunto padre, un afroamericano, es portador de los
alelos de 24 y 31 repeticiones. Dentro de la población afroamericana, el
alelo de 24 repeticiones tiene una frecuencia de 0,234 y el alelo de 31
repeticiones tiene una frecuencia de 0,054 (Budowle et al., 1995). ¿Cuál es
el IP?
S o lu c ió n 1 3 .1 2
En primer lugar, identificaremos el patrón de distribución de los alelos:
Individuo Madre Niño Presunto padre
Alelos D1S80 18,21 18,31 24,31

Patrón de alelos AB AC CD
La Tabla 13-2 muestra que, para este patrón de herencia, como numerador se
debe utilizar V4 y como denominador pc/2. La frecuencia para el alelo con 31
repeticiones es de 0,054. El IP se calcula como
' Pc/2
0,25 0,25
, - = 9,259
0,054/2 0,027
Por lo tanto, el IP de este ejemplo es 9,259 y podemos decir que hay una
probabilidad entre 9,259 de que un hombre sin parentesco y de la misma raza
sea el padre biológico.
13.8.1 C á lcu lo del ín d ice d e p a te rn id a d (IP) cu a n d o n o se

co n o ce el g e n o tip o d e la m ad re
S e p u ed e ca lcu lar u n IP au n si no se co n o c e el gen o tip o d e la m adre. E l p atró n de
h eren cia y el cálcu lo d el IP se m u estra n en la T ab la 13-3.
T a b la 1 3 -3 Cálculo del índice de paternidad (IP) cuando el genotipo de la

madre no está disponible
G enotipo del niño Genotipo del presunto Cálculo del índice de

padre paternidad
AA AA 1/Pa
AA AB 1/2pA
AB AB (Pa + P b )/4 (P a x p B)
AB BB 1 /2 p B
AB BC 1 /4 p B
P ro b le m a 1 3 .1 3 Una mujer de raza caucásica se ha planteado como un

huérfano. Su madre murió al dar a luz y ella nunca conoció a su padre. Por medio
de un trabajo de investigación, ella localizó y contactó con un hombre blanco del
que sospecha que sea su padre biológico. Él está de acuerdo con la realización de
una prueba genética rápida que lo excluya como padre. Se amplifican los alelos
D1S80. Ella tiene un genotipo de 22,32 (22 repeticiones y 32 repeticiones). El
presunto padre tiene un genotipo de 20,32. Estos alelos tienen la siguiente
frecuencia en la población caucásica (Budowle et al., 1995). ¿Cuál es el IP?
A le lo F re c u e n cia d el a le lo
20 0,018
22 0,038
32 0,006
S o l u c ió n 1 3 .1 3
Dado que la mujer y el presunto padre comparten un alelo, él no puede ser
excluido como padre biológico. El patrón de alelos es el siguiente (N ota: 6 es el
alelo de 32 repeticiones y C es el alelo de 20 repeticiones):
In d iv id u o G e n o tip o d e la m u je r G e n o tip o d el p re su n to
p ad re
Genotipo 22,32 20,32

Patrón de alelos AB BC
A partir de este patrón de herencia de alelos y de la Tabla 13-3, debemos realizar

el siguiente cálculo del IP:
IP = 1/4pB
Sustituyendo la frecuencia del alelo de 32 repeticiones en la ecuación, obtene

mos
IP - 1/4pe = 1/4 x 0,006 - 1/0 ,024 = 41,67
Por lo tanto, el IP es de 41,67 y hay una posibilidad entre 41,67 de que un

hombre caucásico escogido al azar sea el padre biológico real.
13.8.2 El ín d ice co m b in a d o d e p a te rn id a d (ICP)

S i se utiliz an m ú ltip les loci p a r a dete rm in a r la p a te rn id ad (y esto es lo q u e o curre
c a si siem pre, y a q u e a u m e n ta la cap ac id a d d e discrim inación), en tonces e l p ro
du cto d e to d o s los v alo re s individuales d e IP p a ra ca d a locus es el ín d ice co m b i
n ad o d e p atern id ad (IC P ). P u ed e interpretarse en el sen tid o d e cuál es la posi
b ilid a d so b re el v a lo r d el IC P d e q u e al az ar u n h o m b re d e la m ism a raza, sin
paren tesc o , se a el p ad re b iológico.
C o n el IC P tam b ién p o d em o s c a lcu lar la p rob ab ilid ad d e p atern id ad — la
p ro b a b ilid ad d e q u e el pre su n to p ad re es, d e hec h o , el p ad re b io ló g ic o — . Se
ca lcu la com o
p ro b a b ilid ad d e pate rn id ad = (I C P /IC P + 1) x 100
L a pro b a b ilid ad d e pate rn id ad asu m e q u e la p rob ab ilid ad a p rio ri en u n a

p ru e b a d e p ate rn id ad es, sin n in g u n a pru e b a, 0,50. E n o tras p alabras, h a y u n a
p ro b a b ilid ad d el 5 0% d e q u e c u a lq u ie r h o m b re n o ana liz ad o s e a e l p a d re y u n a
p ro b a b ilid ad d el 5 0% d e q u e él n o s e a e l padre.
P ro b le m a 1 3 .1 4 Se analizan unos microsatélites en un caso de paternidad.

Un total de nueve loci tienen los siguientes valores de IP. ¿Cuál es el ICP y cuál es
la probabilidad de paternidad?
Locus STR índice de paternidad
D3S1358 2,76
vWA 4,15
FGA 1,37
D8S1179 3,52
D21S11 1,94
D18S51 2,89
D5S818 3,68
D13S317 2,12
D7S820 5,38
El ICP se obtiene multiplicando todos los valores de IP juntos:
ICP = 2,76 x 4,15 x 1,37 x 3,52 x 1,94 x 2,89 x 3,68 x 2,12 x 5,38
= 12.998
Por lo tanto, el ICP es 12.998. Las probabilidades a favor de la paternidad son de

12.998 a 1. O bien, existe la posibilidad de una de cada 12.998 de que un
caucásico al azar sea el padre biológico real.
La probabilidad de paternidad es
probabilidad de paternidad = (12.998/12.999)100 = 99,9923%
Por lo tanto, en igualdad de condiciones, la probabilidad de paternidad es del

99,9923%.
E l nú m ero d e po sib le s g en o tip o s a p a rtir d e n ale lo s s e ca lcu la d e la fo rm a
siguiente
n(n + 1)
n u m ero de g en o tip o s = ----- ------
L a frecu e n cia d e u n g en o tip o se ca lcu la co m o e l n ú m ero d e individuos co n u n

determ in ad o g en o tip o divid id o e n tre el to tal d e los in d iv id u o s d e la m uestra. L a
frecu e n cia d e u n alelo se ca lcu la com o el n ú m ero de vec es q u e u n ale lo ap arece en
u n a m u estra d e in d iv id u o s h o m o cig o to s y h e te ro cig o to s d iv id id o entre el do b le del
n ú m ero d e in d iv id u o s d e la m uestra.
L a ec u ac ió n d e H ardy-W einberg p e rm ite la c o n v e rsió n d e la frecu e n cia de
alelos en frecu e n cias d e gen o tip o . L a frecu e n cia d e u n g en o tip o h o m o cig o to se
ca lcu la co m o el cu adrado d e la frecu e n cia de alelo. L a frecu e n cia d e u n genotipo
h ete ro cig o to s e ca lcu la co m o el d o b le d el pro d u c to d e lo s d os ale lo s d iferentes.
L a p ru e b a d e ch i-c u ad rad o s e p u e d e u tiliz ar p ara co m p a rar d o s co n ju n to s de
datos co n los v alo res o b serv ad o s y esp e rad o s utiliz an d o la ecu ac ió n
2 _ (o b se rv ad o — e s p e rad o )2
' esperado
L a v aria n za de u n a m u estra , el gra d o con el cual u n gru p o d e datos se dispersa,

s e ca lcu la u tiliz an d o la ecuación
_2 _ E ( ° - E f
n —1
L a d esv iac ió n estándar, la ra íz c u a d rad a d e la v aria n za d e u n a m u estra y otra

fo rm a p a ra an a liz ar la d isp ersió n resp ecto a lo s valo res esp e rad o s, s e ca lcu la com o
la ra íz c u a d rad a d e la v aria n za d e la m uestra:
L a p ro b a b ilid ad d e in clu sió n (P¡) p erm ite c a lcu lar la p ro b a b ilid ad d e q u e dos
p erso n as escogidas al az a r te n g a n el m ism o genotipo. S e ca lcu la co m o la su m a d e
lo s cu a d rad o s d e las frecuencias d e g en o tip o esperadas. L a pro b a b ilid ad d e
e x c lu sió n (Pe) p ro p o rc io n a u n a m e d id a d e cu á n p ro b a b le es q u e d os p ersonas
te n g a n diferen tes g en o tip o s. Se ca lcu la co m o 1 m en o s la P¡.
E l pro m ed io p o n d erad o d e las frecu e n cias d el g en o tip o s e ca lcu la p a ra ten e r
u n a id e a d e la frecu e n cia d e u n gen o tip o en p a rtic u la r en u n a ra z a d ete rm in a d a del
lu g a r en q u e se reco g iero n las pru e b as d e A D N . S e ca lcu la co m o el pro d u c to de la
frecu e n cia d el g en o tip o (de la b a s e d e d ato s) y el p o rc en taje d e u n a ra z a en
p a rtic u la r d en tro d e la po b lac ió n en estudio.
L a re g la d e la m u ltip licac ió n p erm ite d ete rm in a r la frecu e n cia d e l g enotipo
g lobal m ultip lican d o to d as las frecu e n cias d e g en o tip o individuales entre sí.
L as pru e b as d e pate rn id ad se u tiliz an p a ra d ete rm in a r si u n h o m b re es el
p re su n to p ad re b io ló g ic o d e u n n iño . E l EP, calcu lad o de fo rm a q u e tien e en cu en ta
la p o s ib le c o n trib u c ió n d e lo s ale lo s d e la m ad re y e l pre su n to padre, d a u n a id e a de
la p o sib ilid ad de q u e el p re su n to padre sea , de h ec h o , el p ad re b io ló g ic o . E l IC P es
el pro d u c to co m b in ad o d e to d o s los v alo re s d e IP in d iv id u a l p a ra ca d a locus d e la
p ru e b a. L a p ro b a b ilid ad d e p a te rn id ad se ca lcu la com o
p ro b a b ilid ad d e pate rn id ad = (I C P /IC P + 1 ) x 100
E s ta es la p ro b a b ilid ad d e q u e u n p re su n to h o m b re se a el p ad re b iológico.
B IB L IO G R A F IA
B u d o w le , B ., F .S . B a e c h te l, J .B . S m e ric k , K .W . P re sle y , A .M . G iu sti, G . P a r s o n s , M .C . A le v y ,
a n d R . C h a k r a b o r ty ( 1 9 9 5 ). D 1 S 8 0 p o p u la tio n d a ta in A fr ic a n A m e ric a n s , C a u sc a sia n s,
S o u th e a s te rn H is p a n ic s , S o u th w e s te r n H is p a n ic s , a n d O rie n ta ls. J. Forensic Sci. 4 0 :3 8 - 4 4 .
B u c k le to n , J ., a n d J. C u r r a n ( 2 0 0 8 ). A d is c u s s io n o f th e m e rits o f r a n d o m m a n n o t e x c lu d e d a n d
lik e lih o o d ra tio s. Forensic Sci. International: Genetics 2 :3 4 3 - 3 4 8 .
B u c k le to n , J ., J .-A . B r ig h t, a n d S J . W a lsh (2 0 0 9 ). D a ta b a s e c rim e to c rim e m a tc h r a te c a lc u la tio n .

Forensic Sci. International: Genetics 3 :2 0 0 —2 0 1 .
B u d o w le , B ., T .R . M o re tti, A .L . B a u m s ta r k , D .A . D e f e n b a u g h , a n d K .M . K e y s ( 1 9 9 9 ).
P o p u la tio n d a ta o n th e th ir te e n C O D I S c o re s h o r t ta n d e m re p e a t lo c i in A fr ic a n A m e ric a n s ,
U .S . C a u c a s ia n s , H is p a n ic s , B a h a m ia n s , J a m a ic a n s , a n d T rin id a d ia n s. J. Forensic Sci.
4 4 :1 2 7 7 - 1 2 8 6 .
D ra b e k , J. ( 2 0 0 9 ). V a lid a tio n o f so ftw a re f o r c a lc u la tin g th e lik e lih o o d ra tio f o r p a re n ta g e a n d
k in sh ip . Forensic Sci. International: Genetics 3 :1 1 2 —118.
F u n g , W . K , a n d Y .-Q . H u ( 2 0 0 8 ). Statistical DNA Forensics: Theory, Methods and Computation.
J o h n W ile y & S o n s , L td ., W e s t S u s s e x , E n g la n d .
K a is e r , L ., G .A .F . S e b e r, a n d J.M . O p itz ( 1 9 8 3 ). P a te rn ity te stin g : I. C a lc u la tio n o f p a te r n ity
in d e x e s. Amer. J. Med Genet. 1 5 :3 2 3 - 3 2 9 .
L i, C .C ., a n d A . C h a k ra v a rti ( 1 9 8 5 ). B a s ic fa lla c ie s in th e f o rm u la tio n o f th e p a te r n ity in d e x . Am
J. Hum. Genet. 3 7 :8 0 9 - 8 1 8 .
L u c y , D . ( 2 0 0 5 ). Introduction to Statistics fo r Forensic Scientists. J o h n W ile y & S o n s , L td ., W e st
S u s s e x , E n g la n d .
R e isn e r, E .G ., a n d P. R e a d in g ( 1 9 8 3 ). A p p lic a tio n o f p r o b a b ility o f p a te r n ity c a lc u la tio n s to a n
a lle g e d in c e s tu o u s re la tio n sh ip . J. Forensic Sci. 2 8 :1 0 3 0 - 1 0 3 4 .
S o n g , Y .S ., A . P a til, E .E . M u rp h y , a n d M . S la tk in (2 0 0 9 ). A v e ra g e p r o b a b ility th a t a “ c o ld h it” in
a D N A d a ta b a s e s e a r c h r e s u lts in a n e rr o n e o u s a ttrib u tio n . J. Forensic Sci. 5 4 :2 2 —2 7 .
T h o m p s o n , W .C ., F. T a ro n i, a n d C .G .G . A itk e n ( 2 0 0 3 ). H o w th e p r o b a b ility o f a f a ls e p o s itiv e
a ffe c ts th e v a lu e o f D N A e v id e n c e . J. Forensic Sci. 4 8 :4 7 —5 4 .
T u r c h i, C ., M . P e s a re s i, F. A le s s a n d r in i, V . O n o fr i, A . A rs e n i, a n d A . T a g lia b ra c c i ( 2 0 0 4 ).
U n u s u a l a s s o c ia tio n o f th r e e ra re a lle le s a n d a m is m a tc h in a c a s e o f p a te r n ity te s tin g . J.
Forensic Sci. 4 9 :2 6 0 - 2 6 2 .
T v e d e b r in k , T ., P.S . E rik se n , H .S . M o g e n s e n , a n d N . M o r lin g (2 0 0 9 ). E s tim a tin g th e p ro b a b ility
o f a lle lic d r o p -o u t o f S T R a lle le s in f o re n s ic g e n e tic s. Forensic Sci. International: Genetics
3 :2 2 2 - 2 2 6 .
Apéndice
Uso del Excel de Microsoft

para generar gráficos
E xcel, d e M icrosoft, es u n p ro g ra m a d e software q u e p erm ite al u su ario crear y
d iseñ ar h o jas d e cálculo co m o las em p lea d as n o rm alm en te en la co n ta b ilid ad
em presarial. E l p ro g ram a tam b ién m u e s tra u n a ex c elen te u tilid a d p a ra el
d iseñ o d e g rá fico s q u e s e p u ed e a d a p tar fácilm ente a los d ato s o b tenidos a p artir
d e c u a lq u ie r tip o d e ex p erim en to llevado a ca b o en u n lab o ra to rio de
b iotecnología.
A q u í s e pre se n ta u n ejem plo d e cóm o E x ce l se p u e d e u tiliz a r para rep rese n ta r
u n a re cta e stán d a r de u n a esc ala de frag m en to s d e 100 pb d e A D N cu y o s tam añ o s
se co n v ie rten a v alo res d e lo g aritm o s fren te a la d ista n cia q u e estos fragm entos h an
m ig rad o durante la electroforesis en u n g el d e agarosa. E l an á lisis d e re g resió n
lin eal se u tiliz a p a ra ca lcu lar la re cta q u e m ejo r se aju sta a lo s datos y la ecuación
q u e defin e a esta re cta y q u e p erm ite ca lcu lar e l tam añ o d e fragm entos d e A D N de
lo n g itu d desconocida.
1. E n u n o rd e n ad o r eq u ip a d o co n M icro so ft O ffice, ab rir el p ro g ra m a E xcel

hac ien d o clic so b re su icono. E n ord enadores co n M icro so ft W in d o w s, pu ed e
q u e te n g a que seg u ir la ru ta In ic io > P r o g r a m a s > M ic ro s o f t E x ce l.
D a Microsoft Office
Excel
2 0 1 2 . E ls e v ie r E s p a ñ a , S .L . R e s e rv a d o s to d o s lo s d e re c h o s. 4 47
448 APÉNDICE A Uso del Excel de Microsoft para generar gráficos
2. A b ra u n a h o ja d e E xcel.
3 . E n la c o lu m n a A , fila 1, esc rib a « p b » . E n la co lu m n a B , fila 1, esc rib a

« D istan cia (x)». E n la c o lu m n a C , fila 1, esc rib a «lo g p b (y)».
4. E n la co lu m n a A , d ebajo d e la c a b ec era «p b » , en tre el tam añ o d e c a d a
frag m en to d e la esc ala d e 100 p b , em p e zan d o p o r el frag m en to 1.500 pb
(entrado en la c e ld a A 2). E n las filas d e la c o lu m n a B d eb a jo d e la ca b ec era
« D istan cia (x)», entre la distancia, en cm , d e ca d a b a n d a co rresp o n d ien te a u n
frag m en to d e la esc a la d e 100 p b q u e h a n m ig rad o d esd e el pocilio.
Excel File Edit View Insert Format Tools Data Window Help
r, # • • I - /v ,.v & | E ) 3 *
- =1 = 1
. .
5. H a g a clic en la p rim era c e ld a b ajo la c a b ec era « lo g p b (y)» p a ra re saltarla.

H a g a clic en el ico n o d e fu n c ió n f x en la b a rra d e herram ien tas p o r en c im a de
la h o ja d e cálculo p a r a q u e a p a rez ca e l cu a d ro d e I n s e r t a r F u n c ió n . E n la
S elec ció n de c a te g o ría s : ab ra la lista, selec cio n e « M atem á tic as y
trigonom etría». E n la S elec ció n d e fu n c ió n : ab ra la lista, selec cio n e «L O G
10». H a g a clic en A C E P T A R . A p a rec erá la ca ja d e diálo g o d e L O G 10.
APÉNDICE A Uso del Excel de M icrosoft para generar gráficos 449
6. H a g a c lic en c u a lq u ie r p arte dentro d e la ca ja d e diálo g o d e L O G 10 y

a rrástre la fu e ra del esp a cio d e la h o ja d e cálcu lo d el L ib ro d e fo rm a q u e sean
v isibles las en tra d as d e las co lu m n as. H a g a clic en « 1 .5 0 0 » en la c e ld a A 2.
« A 2 » ap a rec erá en la ca ja N ú m e r o . H a g a clic en A c e p ta r. A p a rec erá el v a lo r
d el lo g d e 1.500 en la ca ja re saltad a en la c o lu m n a « lo g p b (y)».
V Excel File Edit View Insert Format Tools Data Window Help
iocio V X m i -QG.otAz;
7 . R esalte la co lu m n a C p o r entero d esd e la p o sició n C 2 h a sta la ú ltim a en tra d a

d e la colum na.
ro í i-'i"
E n el teclado, p re sio n e las tec la s d e C o n tr o l y D . E sta acció n re lle n ará to d o s

lo s v alo re s d e lo g d e la c o lu m n a C .
© o o
[« ] EZZ
bp Distance (x )
1500 2.3
1400 2.35
1300 2.45
1200 2.55
1100 2.7
1000 2.85
900 3
800 3.2
700 3.5
600 3.9
500 4.15
400 4.55
300 5.1
200 5.85
100 7
APÉNDICE A Uso del Excel de Microsoft para generar gráficos 451
9 . S in selec cio n ar la fila 1 (la d e la ca b ec era de las co lu m n as) o la co lu m n a 1 (la

c o lu m n a « p b » ), re salte los v alo re s d e las co lu m n as d e « D istan cia (x)» y «lo g
p b (y)».
800
bp D is ta n c e ( x ) log b p (y )
1500 2 .3 3 .1 7 6 0 9 1 2 6
1400 2 .3 5 3 .1 4 6 1 2 8 0 4
1300 2 .4 5 3 .1 1 3 9 4 3 3 5
12 0 0 2 .5 5 3 .0 7 9 1 8 1 2 5
11 0 0 2 .7 3 .0 4 1 3 9 2 6 9
1000 2 .8 5 3
900 3 2 .9 5 4 2 4 2 5 1
800 3 .2 2 .9 0 3 0 8 9 9 9
700 3 .5 2 .8 4 5 0 9 8 0 4
600 3 .9 2 .7 7 8 1 5 1 2 5
500 4 .1 5 2 .6 9 8 9 7
400 4 .5 S 2 .6 0 2 0 5 9 9 9
300 5 .1 2 .4 7 7 1 2 1 2 5
200 5 .8 5 2 .3 0 1 0 3
100 7 2
10. E n la b a rra d el m enú, h a g a clic en e l b o tó n d el ico n o d e G r á fic o s (tiene la

a p a rien c ia d e u n gráfico d e b arras) p a ra ac tiv a r la v en ta n a d el A s is te n te d e
g rá fic o s .
T o o ls Data W in d o w _ H e lp
í
’ I I T fx '& > 100* ^ 1 X ►
11. E n la v e n ta n a d el A s is te n te d e g rá fic o s , selec cio n e el tip o d e gráfico «X Y

(D isp e rsió n )» y h a g a clic en F in a liz a r. A p a rec erá u n g rá fico so b re la h o ja de
cá lcu lo do n d e se m o strará n lo s datos rep rese n ta d o s e n el tipo d e gráfico
seleccionado.
12. D e la b a rra d e m en ú en la p a rte su p erio r d e la p ág in a , a c tiv e In sertar y

selec cio n e L ín ea d e ten d en cia.
F o rm at T o o ls W in d o w H elp
13. E n el cuadro d e L ín ea d e te n d en cia verifiq u e q u e está seleccionado C u rva

d e regresión lineal.
APÉNDICE A Uso del Excel de Microsoft para generar gráficos 453
14. H a g a clic en e l b o tó n O p c io n e s en la ven ta n a d e L ín e a d e te n d e n c ia . E n la

v en ta n a d e O p c io n e s a c tiv e lo s cu a d ro s d e « M o strar la ec u ac ió n en el
gráfico » y « M o strar el coeficiente d e correlación en el g ráfico». H a g a clic
en A c e p ta r. A p a re c e rá e n el gráfico u n a lín ea d el m e jo r ajuste. L a ecuación
d e la re g resió n lin eal y el v a lo r d e r al cu a d rad o tam b ién aparecerán.
Add Trendline
/---------------------------------- j Type ---------------------------------- -
Trendline name_____
©Automatic: Linear (Seriesl)
O Custom: |
Forecast
Forward: 0 [CJ Units
Backward' 0 Units
□ Set intercept - 0
0 Display equation on chart
0 Display R-squared value on chart
♦ S cn e si
— Linear (Se riesl)
^ — linear (Se riesl)
10
15. U sted p u ed e u tiliz ar las O p c io n e s d e g rá fic o en el m en ú del G r á fic o para

d efin ir la etiq u eta d e lo s ejes, q u itar o m o d ificar la ley e n d a, añ a d ir o q u itar la
p arrilla y a ñ a d ir u n títu lo al gráfico. (N o ta : E l gráfico h a d e estar seleccionado
en la h o ja d e cálculo p a ra a c ce d er al m en ú desp leg a b le d el G rá fic o .)
Chart Options
16. L a a p a rien c ia d el g rá fico se p u e d e c a m b ia r d e m u ch a s form as. H a g a clic

so b re los ejes x o y p a ra c a m b ia r el esq u e m a d e n u m era ció n y lo s valores
m ín im o s y m áxim os. H a cien d o clic so b re los p u n to s o en lín ea entre p in ito s le
p erm itirá ca m b ia r s u aspecto. L a ecu ac ió n d e re g resió n se p u e d e elim in ar
h ac ien d o clic y arrastrando.
Log del pb frente a distancia desde el pocilio
Distancia desde el pocilio V = -0.24i6x + 3.7009

R - 0.998
índice alfabético
A req u erim ien to s d e can tid ad es, n o rm a de la m ultiplicación, 438-439

Á cido(s), 3 6 ,4 0 314-315 p ro b ab ilid ad
c o njugado , 41 v isió n g eneral, 3 1 3-3 1 4 d e e x clusión, 4 36-437
d e B ronste d , 4 0 g en eració n d e de lec io n es an id ad a s co n d e in clu sión, 4 3 5 -4 3 6
nu cleicos la n u c lea sa B A L , 3 1 ,3 5 8 -3 6 2 p ru eb a d e C hi-cuadrado, 4 30-434
c álc u lo d e la co ncen tració n lib re ría s d e e x p resió n y o rien tac ió n del rea cc ió n en c ad e n a d e la polim erasa, 423
de A D N d e c ad e n a sen cilla in serto , 3 3 9 -340 tip ificació n d e l A D N y prom edio
A D N d e elev a d o p e so m olecular, lig ació n p o n derado, 436-438
109-110 em p aq u etam iento d e los g eno m as v a ria n za d e un a m ue stra, 4 3 4
c álcu lo d e m ilim o larid ad , 110 d e riv ad o s d e X, 3 2 7 -330
Hg/mL, 108-109 p ro b ab ilid ad , 320-321
de A R N , 115 v ecto res B
caracterizació n del A D N . Véase d eriv a d o s d e X, 3 2 2 -3 2 7 B acterió fag o . Véase A D N recom b inante
A su n to s fo ren ses; Pru e b as de p lasm íd icos, 3 3 0-335 c álc u lo del títu lo , 91-93
p aternid ad v isió n g eneral, 3 1 9-3 2 0 d ilu c io n e s, 93-95
coeficien te d e ex tin ció n d e l dATP, 113 m ed ició n d e frag m en to s d e A D N p o r m e d id a d e l tam año d e e x plosión, 95-98
cuantificació n d e o lig o n u d e ó tid o s electro fo resis e n g e l, 3 5 1 -3 5 8 m u ltip licidad de infección, 83-85
pm ol/(iL, 112-115 p aso s d e la clo n ac ió n d e ge n es, 313 p ro babilidad d e u n a infección celular,
(ig/m L , 111-112 req u erim ien to s del n ú m e ro d e clones 85-91
unid a d es d e d en sid ad ó p tica, 111 librerías p ru eb a d e fluctuación
d eterm in ació n d e la co ncen tració n d e d e A D N c , 3 3 7 -338 cálcu lo de la tasa d e m utación
A D N d e c ad en a do b le g e n ó m icas, 3 3 6 -337 ap ro x im ación gráfic a, 73-77
A 2so, 100-102 tab la d e c o d on es, 3 4 6 d istrib ución de Po isso n , 71-73
cálcu lo de la m ilim o larid ad , 104-105 A D N c. Véase A D N com p lem en tario ejem p lo , 67-68
coeficien te d e ex tin ció n , 102-104 A lelo v a rian za, 69-70
E n sa y o P ico G reen , 105-108 d efin ició n , 4 2 4 v isió n g eneral, 66-67
esp ectro sco p ia d e u ltrav io leta, 99 frecu en cia, 4 2 6 -4 2 7 v isió n g en eral, 83
ge l teñid o c o n bro m u ro d e etid io y A m in o ácido s B A L , 31 Véase también A D N
cu an tificació n d e A D N , 120 in co rp o ració n para la trad u cció n in vitro, recom binante
peso m o lecular, m o larid ad y relació n 4 0 4 -405 B a se , 3 6 , 4 0
del ta m añ o c o n la c antidad, tip o s y p e so m o lecu lar, 3 7 0 c o n ju g ad a , 36, 41
115-119 A m p licó n , reacció n en c ad en a d e la d e B ron ste d, 4 0
radiom arcaje. Véase R adiom arcaje polim erasa, 167 e x p on en te s, 3
A dición de co las h om opolim éricas, 141-147 A n álisis B ro m u ro de etid io , c uantificación d e l A D N ,
A D N . Véase A D N co m p lem en tario ; Á cidos d e la e x p resió n g én ica. Véase R eacció n 120
nucleicos; S ín tesis d e e n c aden a d e la p o lim erasa
o lig o n u d e ó tid o s ; A D N d e la v a rian za (A N O V A ), reacción en
reco m b in an te c ad e n a d e la p o lim erasa a c
c o m plem en tario (A D N c) tie m p o real, 2 3 9 -2 4 0 , 245 C alv a, fago, 66
librerías. Véase A D N reco m b in an te d e reg resió n CAT. Véase C loranfenicol a ce tiltran sferasa
síntesis e n say o T aq M an , 2 3 0 -2 3 2 C eb ad o r. Véase R e acción e n c ad e n a de la
prim era c ad e n a, 135-138 reacció n e n c ad e n a d e la polim erasa polim erasa
se g u n d a cad en a, 139-141 cu antitativ a, 198, 2 0 0-2 0 6 C e n trifu g ación
recom bin an te d im en sio n al, co n cen tració n , 16-17 fu e rz a cen trífuga relativa, 4 13-41 4
an álisis p o r h ib rid ació n A N O V A . Véase A n álisis d e la va ria n za fu e rz a g
cálcu lo d e la tem peratu ra d e fusión, A n tilo g , 3 8 , 60 n o m og ram a, 41 6 -4 1 7
34 1 -342 A n tilo g aritm o , 171 rev o luciones p o r m inuto conversión,
co nd icio n es d e in cu b ació n , 3 4 4 -3 5 0 A R N . Véase Á cid o s n ucleicos; 4 15-416
dise ñ o d e la so nd a, 3 4 2 -3 4 4 R ad io m arcaje; R e acció n en tiem p o d e sedim entación, 4 18-420
son d a s d e A D N d e c ad en a do b le, c ad e n a d e la polim erasa C iclo u m b ral. Véase R e acción en cadena
350-351 A sisten te d e gráfico s. Véase E xcel d e la polim erasa a
visió n g en eral, 340-341 A su n tos foren ses tie m po real
efic ie n cia de tran sfo rm ació n , 3 3 5 -336 d e sv iación están d a r d e u n a m u estra, C lo n ac ió n génica. Véase A D N
endo n u cle asa d e restricción 435 recom binante
cálcu lo de la c an tid ad de ex trem o s d e ecu a ció n d e H ardy-W einberg, 4 2 8 -4 3 0 C lo ra n fe n ic o l acetiltransferasa (CAT)
frag m en to , 3 1 6 -3 1 9 frecuencia(s) e n say o , 399-401
frecuen cia d e lo s sitio s d e corte, d e a lelo s, 4 2 6 -4 2 7 n ú m ero d e m oléculas, 4 01-402
31 5 -316 d e l g en o tip o , 4 2 5 , 4 2 7 -4 3 0 C o d ó n , tab la, 346
2 0 1 2 . E ls e v ie r E s p a ñ a , S .L . R e s e rv a d o s to d o s lo s d e re c h o s 455
456 índice alfabético
C o eficiente C ro m ato g rafía E n say o

d e c orrelación, reacció n e n c ad e n a de la d e exclusión molecular. Véase de B ra d fo rd , pro teín a, 3 85-38 7
polim erasa cu an titativ a, 2 0 6 Crom atografía d e filtración e n gel d el catió n d im eto x itritilo. Véase Síntesis
d e v a ria ció n (C V ), 2 7 4 -2 7 5 , 2 8 4 -285 d e filtració n e n g e l, p ro teín as, 3 9 4-3 9 9 d e o lig o n ucleótidos
C o ncentración. Véase también M o larid ad ; en c a p a fin a (T L C ) E n talp ia, tem p eratu ra d e fu sió n del c eb a do r
N orm alid ad fac to r d e reten ció n , 3 9 3 -394 e n la reacción en c ad e n a d e la
á cid o s nucleicos. Véase también Á cidos p ro teín as, 3 9 2 -3 9 4 p o lim erasa, 184, 187
nucleico s C u a d ro d e Pu n n et, 4 2 7 -4 2 8 E rro r están d ar, 2 5 2
a n álisis d im ensional, 16-17 C u rio , 123-124 E stad ístico F, 2 4 1 -2 4 3 , 2 4 5 , 2 47-24 8
b acteria. Véase C re cim ien to b acterian o CV. Véase C o eficien te d e variació n E u ro p ean M o le cular B iology L aboratory
c álculo (E M B L ), b a se de da to s de
de diluc ione s, 15-16 p u n to iso eléctrico, 40 6 -4 0 7
de so luciones X v e ce s co n cen trad as, D E xcel
17-18 D en sid ad óptica. Véase C recim iento ap licacio n es d e la reacción e n c ad e n a de
d e fin ición, 15, 23 bacterian o la p o lim erasa a tie m po real,
proteín a. Véase P roteína D esin teg ra ció n p o r m inu to (d pm ), 149 2 5 0 , 2 5 7 -2 5 8 , 2 7 7 , 280-282,
soluciones e n porcen taje D eso x in u cleo tid il tran sferasa term ina, 2 8 7 -288
c álculo de diluc io n e s, 2 0 -2 4 m a re aje d e ex tre m o s del A D N cálcu lo de la co n centración d e A D N , 107
prep aración, 19-20 p o rce n taje d e inco rpo ració n , 133-134 c re ad o r d e gráfic o s, 451
C on stan te d e diso c ia ció n , 41 activ id ad e sp ecífica, 134 e n say o B rad fo rd , 3 8 5-386
C orrelación cuadrada, reacció n en cadena D esv iac ió n e stán d ar e stim ació n del p e so m ole cu lar d e una
d e la p o lim erasa cu an titativ a, d e u n a m uestra, tip ificació n del A D N , p ro teín a p o r filtración e n gel,
204-205 435 3 9 7 -398
C recim ien to d e sv iac ió n e stán d ar d e u n a m u e stra en la gu ía para la u tilid ad para h a ce r gráficos,
bacterian o tip ificació n d e l A D N , 4 3 5 4 4 7 -4 5 4
c oncentración e n say o T aq M an , 2 2 7 -2 2 9 m ed ició n del A D N p o r geles, 3 53-357
celular, 50 rea cc ió n en c ad en a d e la p o lim erasa a reg resió n lineal, 2 3 0
representación del lo g aritm o d e la tie m p o real, 2 2 7 -2 2 9 , 2 5 2 , E x p on ente, 3 , 54
c o n centració n celu la r fren te al 2 5 4 -2 5 5 , 2 6 3 -2 6 4 , 274
tiem po, 56 D iana, reacció n en caden a de la po lim erasa,
167 F
curva , 4 5-46
D íg ito s sig n ificativ o s F a c to r de retenció n, c rom atografía de capa
d ensidad ó ptica
fin a, 3 9 3-394
datos de las m u estras p a ra realizar red o n d e o en e l c álcu lo , 2-3
F ag o . Véase B acteriófago
c álculos, 4 9 -5 0 v isió n g en eral, 1-2
gráficos D ilu ció n (es). Véase B acterió fag o ;
C o n c en tra ció n; M o larid ad ; d e retard o , c recim iento b a cte riano, 53
c recim iento fase s, 5 3-54
D ilu c ió n se riad a estacion aria, c recim iento bacteriano,
lo g DO550 fre n te al tiem p o,
5 3 -5 4
54-55 seriada, célu las, 4 6-48
D istrib u ció n log arítm ica, crecim iento b a cte riano, 53
v isió n g eneral, 4 5 -4 6
Fu erza
diluc ió n seriada, 4 6 -4 8 d e P o isson , cálcu lo d e la tasa de m u tació n
p a ra b acterias, 7 1-73 centrífu ga relativa. Véase C e ntrifugación
e xten sión en p lacas p a ra el c álcu lo d e la
g. Véase C e n trifu g ación
ta sa d e m u tació n , 7 8-79 F, 2 4 1 -2 4 3 , 2 4 8 -2 4 9
gráficos sem ilogarítm ico s d p m . Véase D esin teg ració n p o r m inuto
c álculo del tie m p o d e generació n , G
6 1-64 (3-G alactosidasa (lacZ ), ensayo
con centración fre n te a l tiem p o , E activid ad e sp ecífica, 390
62-63 E cu ació n c u ltiv o celu lar, 3 8 8-389
den sid ad celula r fre n te a tie m p o d e d e H ard y -W ein b erg , 4 2 8 -4 3 0 ex tracto s c elu lares p urifica d o s, 390-392
g e neració n , 6 4 -6 6 d e H en d erso n -H asselb alch , 41 p rin cip io s, 3 8 7
D O jso , 60 E le ctro fo resis e n gel G el d e p o liacrilam id a. Véase E lectroforesis
prueba de fluctuación m ed ició n d e frag m en to s d e A D N , e n gel
cálculo de la tasa d e m u tació n 35 1 -358
a proxim ación g ráfica, 7 3-77 tin c ió n co n b ro m u ro d e etid io y d e m a n ten im ien to , reacción e n cad e n a d e
d istribu ción d e P o isso n , 7 1-73 cu an tificació n del A D N , 120 la p o lim erasa a tie m po real,
ejem plo, 67-68 E M B L . Véase E u ro p ean M o le cular B io lo g y 237
v a rianza, 69-70 L ab o rato ry indicador. Véase C lo ram fenicol
v isió n g eneral, 6 6-67 E n d o n u clea sa d e restricció n . Véase A D N acetiltransferasa;
tie m po de generació n reco m b in ante (3-G alactosidasa; L uciferasa
c álculo, 58-60 E n erg ía lib re d e G ib b s, tem p eratu ra d e G eno tip o
con stan te de crecim ien to , 5 7-58 fu sió n del c eb a d o r en la cálc u lo co n n ú m e ro s, 4 2 4
pendiente, 57 r eacció n e n c ad e n a de la ecuació n d e H ard y -W einberg, 4 28-430
celular. Véase C recim ien to b acterian o p o lim erasa, 184-1 8 5 , 188 frecu en cia, 4 2 5 ,4 2 7 -4 3 0
índice alfabético 457
G ra d o s de lib ertad , 2 4 2 , 431 N o ta ció n c ien tífica c o n versió n d e m g /m L a m olaridad,

G rá fico de disp e rsió n , reacció n en cadena c o n v ersión a n o tació n d ecim al, 5-6 380-381
d e la p o lim erasa cuantitativa, e x p resió n, 3-5 crom atografía
198, 2 0 0 m ultip licació n y div isió n , 7 -1 0 d e c a p a fina, 3 92-394
sum a y resta, 6-7 p o r filtrac ión en g e l, 3 94-399
N ú m e ro e n say o d e B radford, 385 -387
H d e A v ogadro, 2 4 in co rp o ración de a m inoác idos pa ra la
H em ocitóm etro , c álcu lo d e la va ria b le d e se cu en cias m últiples trad u c ció n in v itro , 404-405
co n cen tració n celu lar, 7 9-80 rep e tid a s (V N T R ), 4 2 4 p e so m o le cu lar a partir d e la secuencia,
H ipótesis nula, 2 3 9 , 431 369-373
i
p
PCR. Véase R e acció n e n c ad e n a d e la
p u n to isoeléctrico, 4 05-407
P rueba(s)
d e ch i-cu ad rado, tipifica ció n del A D N ,
ICP. Véase In d ice co m b in ad o d e paternidad
po lim erasa 4 30-434
Indice c om b in ad o d e p atern id ad (IC P),
P e so fó rm ula, 2 4 d e patern id ad
4 4 3 -4 4 4
c álc u lo d e la co n cen tració n d e A D N , d e c h i-cu adrado, 4 30-434
Inv erso del lo g aritm o . Véase A n tilo g
115-119 d e sv iación e stán d a r d e un a m uestra,
p roteín a a pa rtir d e u n a secu en cia, 435
L 3 6 9 -373 ecu a ció n d e H ardy-W einberg, 428-430
L acZ . Véase (3-G alactosidasa v isió n g en eral, 2 4 frecu en cia
L igación. Véase A D N R eco m b in an te p H , 3 5-40 d e u n alelo, 4 26-427
L og aritm o, 3 5 , 3 8 , 5 4 p l. Véase P u n to isoeléctrico d e u n g en o tip o , 4 2 5 , 4 27-430
c om ún, 54 , 171 P ico G reen, c álcu lo d e la co n cen tració n de índice
A D N d e d o b le cad en a, c o m b in ad o d e paternidad, 4 43-444
natural, 71
L u ciferasa, e n say o , 403 105-108 d e paternidad
pATa, 40-43 n o se c o n o ce el gen o tip o d e la
P lásm id o . Véase A cid o s n ucleicos; m adre, 441-443
M R adiom arcaje v isió n g eneral, 439-441
M areaje p O H , 37 n o rm a de la m ultiplicación, 43 8 -4 3 9
c o n c ebad o res a leato rio s. Véase Pre fijo s m étricos p rob ab ilidad
R adiom arcaje facto res d e co n v ersió n y sim p lificació n d e e x clu sión, 436-437
isotópico. Véase R ad io m arcaje d e térm in o s, 10-12 d e in c lu sió n , 435-436
M arg e n de e rro r, 2 5 2 , 2 5 6 -2 5 7 , 2 6 2 , 2 6 5 , tip o s y v a lo re s, 10-11 reacción e n c ad e n a de la polim erasa,
27 2 P ro b ab ilid ad 423
M éto d o d e lo s m ín im o s cu ad rad o s, reacción d e e x clu sió n, tip ificació n d e l A D N , tip ificación d e l A D N y prom edio
en c ad e n a d e la p o lim erasa 4 3 6-43 7 p o n derado, 4 36-438
cu an titativ a, 198, 2 0 0 d e in clu sió n , tip ificació n d e l A D N , v a ria n za d e u n a m uestra, 4 3 4
M ic ro so ft E x cel. Véase E xcel 4 3 5 -4 3 6 P ru eb a-t, 2 3 9
M od e lo Pfaffl. Véase R e acció n en cadena P ro b a r u n a h ip ó te sis, 2 3 9 P u nto isoeléctrico (pl), proteína, 4 05-407
d e la p o lim erasa a tie m p o real P ro p a g ac ió n d e e rro re s, 2 5 6
m oi. Véase M u ltip lic id a d d e infección P ro p ied ad
M olaridad a so ciativ a d e la m ultip licació n , regla del R
conv ersió n en p o rcen taje e x p o n en te , 8-9 R a d ia ctiv id ad específica. Véase
m o laridad a p o rce n taje, 3 2 co n m u tativ a d e la m u ltip licació n , regla R adio m arcaje
p orcentaje a m o larid ad , 33 del e x p o n en te , 8
diluc ione s, 3 0 -3 2 d e la ig u ald ad p a ra la m u ltiplicación , 18 m áx im o , centrifugación, 4 1 4
m ol, 24 Pro teín a. Véase también los enzim as m ín im o , c en trifugación, 414
p rep aració n d e u n a so lu c ió n co m p u esto s esp ecífico s R ad io m arcaje
h idratad o s, 2 8 -3 0 P ro teín a adición d e colas hom opolim éricas, 141-147
secos, 2 5 -2 8 c álcu lo d e l c o eficien te d e ex tin ció n , c álcu lo del n úm ero d e c opias d e un
rela ción c o n la n o rm alid ad , 3 4 3 7 8-3 8 0 p lá sm id o , 124-126
M u ltip licidad d e in fecció n (m oi), c o n centració n a p a rtir de la a b so rb an cia c u rio , 123-124
b acterió fag o , 83-85 A 205, 383 m areaje
A 28o, 373 d e ex tre m os del A D N con la
c o eficien tes d e e x tin ció n , 3 7 4 -376 d e soxinucleotidil transferasa
N c o rreccio n es p o r la c o n tam in ació n d e term in al
N ivel(es) ácido n ucleico p orcentaje d e incorporación, 133-134
d e c o nfian za, 2 5 2 -253 A 205, 3 8 3-38 4 activ id ad específica, 134
d e significan cia, 241 A 28o, 3 8 2 del A D N m ediante c ebadores
N o m ogram a , cen trifu g ació n , 4 1 6 -4 1 7 rela ció n e n tre e l c o eficien te de aleatorios
N o rm alidad, rela ció n c o n la ab sorb ancia y e l co eficien te a ctiv id ad específica, 132
m o larid ad , 3 4 d e e x tin ció n , 3 7 7 -378 p o rcen taje d e in corpo ración, 129
458 índice alfabético
R a diom arcaje (cont.) co m p etitiv a p a ra u n ensay o T

rend im iento c u an titativ o , 195-206 T am añ o d e ex p lo sió n , b acteriófago cálculo,
real, 131-132 c o n tro les, 2 1 5 -2 1 6 , 2 3 7-238 95-98
te ó rico, 130-131 c u an tificació n relativa T aq M an . Véase R e acció n en cadena
v isió n g eneral, 128-129 a n álisis d e la cin ética d e la d e la po lim erasa a
síntesis del A D N com p lem en tario reacció n , 2 9 4 -2 9 9 tiem p o real
p rim era c adena, 135-138 m éto d o T em peratura d e fu sió n (Tm)
se gunda c ade na, 139-141 Rfí, 29 9 -303 h ib rid ació n d e u n a so n d a de A D N ,
transcripción, in vitro, 147-149 relativo d e la c u rv a estándar, 3 4 1-342
traslación de m ella del A D N 27 6 -293 reacció n en c ad e n a d e la polim erasa
c álculo de la in co rp o ració n de m o d elo Pfaffl, 3 0 3 -3 0 6 ceba d or
m areaje, 127 efic ie n cia d e la am p lificació n , in teraccio n es e n tre nucleótidos
radiactividad e sp ecífica d e lo s 2 3 2 -2 3 6 a d y acen tes, 183-188
p rodu cto s, 128 e n say o c álcu lo ráp id o , 181-182
visió n g eneral, 126-127 S Y B R g ree n , 211 c o n cen tració n d e sa l, c ontenido
R eacción T aqM an d e G /C y longitud del
en c ad e n a d e la polim erasa d esv iació n están d ar, 2 2 7 -2 29 A D N co m o variables,
PC R . Véase también R e acció n en estándares 182-183
c adena d e la p o lim erasa a a n álisis de reg resió n , 2 3 0 -2 3 2 se cu en cia d ia n a, 173-176
tiem po real c u rv a , 2 2 0 -2 2 7 T iem p o
A D N p o lim erasa prep aració n , 2 1 6 -2 2 0 de g e n eració n . Véase C recim iento
requerim iento s, 191-192 v isió n g eneral, 2 1 1-2 1 2 , 2 1 6 b acterian o
tasa d e error, 192-194 m ed ició n d e la ex p re sió n g énica, d e sedim en tación , c entrifugación,
am plificación 2 3 6 -2 3 8 4 1 8 -4 2 0
c álc ulos, 167-170 n o rm alizació n , 215 T ip ificació n d e l A D N . Véase A suntos
p otencial, 1 p rin cip io s, 2 1 2-2 1 4 fo ren ses; Pru e b as de
a su ntos forenses, 423 m u ltip lex , reacción e n c ad e n a de la p atern id ad
c o n centraciones d e los p o lim erasa, 2 3 7 T L C . Véase C ro m ato g rafía en
d e ox inu cle ó sid o s, 189-191 R eferen c ia p asiv a, rea cc ió n e n c ad en a c ap a fin a
eficiencia, 170-173 d e la p o lim erasa a tie m p o real, Tm. Véase T em peratura d e fusión
pa sos, 165 215 T ran scrip ció n , in vitro, 147-149
pruebas de patern id ad , 4 2 3 Regla T ran scrip tasa reversa
requ erim ientos d e la p o tencia p a ra lo garitm o s, 171 reacció n e n c ad e n a de la polim erasa
d e lo s c ebado res, 176-181 d e l p ro d u cto p a ra la cu antificación de
d e l m olde, 166-167 d e l e x p on en te , 7 A R N , 195
tem peratura de fusión lo g aritm os, 3 8 ,1 7 1 sín tesis d e A D N com plem entario
c eba dor regla d e l e x p o n en te , 8 (A D N c), 135
cálculo ráp id o , 1 8 1 -182 R evo lu c io n es p o r m inuto. Véase T ran sfo rm ació n . Véase A D N
c once ntra ció n d e sa l, con ten id o C en trifu g ació n reco m b in ante
e n G /C y lo n g itu d del A D N T raslació n d e m ellas. Véase
co m o variab les, 182-183 R adiom arcaje
interaccion es ady acen tes, U n id a d S v e d b erg , 41 8
183-188 Sín tesis d e o lig on ucleó tid o s
secu e n cia dia n a, 173-176 cálc u lo s d e l rendim iento
transcripta sa rev ersa en la reacción p o r pa so s, 1 5 8,1 6 0 -1 6 1
en c a d e n a de la polim erasa, te ó rico , 156-158 v
195 to ta l, 158-159 V alor
a tie m po real (RT-PCR ) d ise ñ o d e la so n d a p a ra an álisis p o r P, 2 4 3 , 249
ciclo um bral hib rid a ció n , 3 4 2 -3 4 4 Z , 253
c álc ulos del in crem en to del e n say o del catió n dim eto x itritilo , 158 V arianza
nú m e ro d e ve ce s, 2 1 4 m icro m o les d e n u cleó sid o añ ad id o s en d e un a m u e stra e n la tipificació n del
el m étod o A A C t cada p aso , 161-162 A D N , 434
efic ie n cia d e la am p lificació n , p a so s, 155 in tergru p o , 2 4 0
2 50-2 59 S o lu cio n es en p o rcen taje. Véase in trag ru p o , 2 4 0
elec ció n d e u n a referen cia C o n c en tra ció n; M olarid ad pru eb a d e flu ctu ación, 69-70
end ó g en a , 2 3 9 -2 5 0 S um a d e lo s erro res al c u ad rad o , reacción reacción en c ad en a d e la
ge n d e referen c ia y efe cto s del e n c ad en a d e la po lim erasa p o lim erasa a tie m p o real,
tratam ien to e x perim ental, c u an titativ a, 2 0 4 2 3 9 -2 4 1 ,2 4 6
2 59-2 76 S Y B R g ree n . Véase R e acció n en cadena V N T R . Véase N ú m e ro va ria ble de
p a ra la cu an tificació n relativa, d e la p o lim erasa a se cu encias m últiples
2 38 -2 39 tie m p o real rep etidas
Ejercicios adicionales - Capítulo 1
1. ¿C u án to s d íg ito s significativos h a y en las sig u ie n tes m edidas?

a ) 4 .5 2 1 .0 0 0 pb
b) 0 ,0 0 0 2 3 7 pg
c) 3 ,4 0 A ngstrom s
d ) 0 ,0038 cen tim o rg a n s
2. R esu elv a las sig u ie n tes o p eracio n e s y re d o n d ee lo s resultados.
a ) 0 ,3 7 7 8 + 3 7,4
b ) 4 2 ,7 - 36,9825
c) 0,2 3 3 9 x 4 ,7
d) 1 “
0,13
0 ,0 003728
0,000297
3. E scrib a en no tac ió n c ie n tífic a lo s siguientes núm eros.
a ) 48 .3 6 0 .0 0 0 .0 0 0
b) 2
c) 0,0000035
d ) 2 .8 3 4 ,7 x 1 0 " 5
e) 373 x 106
4. E scrib a en fo rm a dec im a l los sig u ie n tes núm eros.
a ) 7,63 x 10 ~ 5
b) 2 8 ,5 7 x 10~6
c) 31 x 100
d) 7 ,34 x 107
e) 5 8 3 ,6 x 10*
5. R esu elv a las sig u ie n tes o p eracio n e s y ex p rese el re su lta d o en no tac ió n
científica.
a ) 3 x 106 + 4 x 105
b) 3 x 105 + 2 x 104
c) 4 x 10" 5 + 9 x 1 0 " 4
d) 3 x 105 - 4 x 104
2012. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos. el

el Ejercicios adicionales
e) 7 x 10 ~ 3 - 2 x 10"*
f) (4 x 105) x (3 x 103)
g) (3 x 103) x (3 x 1 0 " 2)
h ) (6 x 10~3) x (3 x 1 0 " 4)
4 x 103
2 x 102
, 6 x 104
J) 2 x 1 0 - 3
8 x 10~7
k) 2 x 105
7 x 10~7
2 x 1 0 -5
6. E x p re se los siguientes n ú m ero s u tiliz an d o el prefijo m étrico apropiado.
a ) 2 .0 0 0 b ase s
b) 4 ,5 x 106 pb
c) 2 .0 0 0 m ilisegundos
d) 0,035 m L
e) 4 x 10- 9 g
RESPUESTAS
1. a) 4 (so n 4 , 5, 2 y 1)
b) 3 (so n 2 , 3 y 7)
c) 2 (so n 3 y 4 )
d ) 2 (so n 3 y 8)
2. a) 37,8
b) 5,7
c) 1,1
d ) 2.9 0 0
e) 1,26
3. a) 4 ,8 3 6 x ÍO10
b) 2 x 10°
c) 3,5 x 1 0 " 6
d) 2 ,8 3 4 7 x 1 0 " 2
e) 3,73 x 10*
4. a) 0,0000763
b) 0,00 0 0 2 8 5 7
c) 31
d ) 7 3 .4 0 0 .0 0 0
e) 58.3 6 0 .0 0 0 .0 0 0
5. a) 3 ,4 x 106
b) 3,2 x 105
Ejercicios adicionales - Capítulo 1 e3
c) 9 ,4 x 10"'
<l) 2,6 x 105
e) 6,8 x 10~¡
D 1,2 x 10“
VO
©_
X
g)
1') 1,8 x 10 '
¡) 2 x 1 0 1
i) 3 x 107
k) 4 x 1 0 " 1’
O 3,5 x 1 0 ~ :
a) 2 kb
b) 4,5 Mpb
c) 2 s
d) 35 pL
e) 4 Pg
1. ¿ C ó m o p re p ara ría 75 0 m L d e u n tam p ó n de ele ctro fo resis 0 ,5 X a p a rtir d e u n a

solución s to ck 5X ?
2. ¿C ó m o p re p ara ría 25 m L d e u n a so lu ció n d e SD S 0 ,4 X a p artir d e u n stock
20X ?
3. ¿C óm o p re p ara ría 50 m L de una so lu ció n d el tam p ó n T ris, ácido
etilen ed iam in o tetracético (T E ) 0,2 5 X a p artir d e u n stock 100X ?
4. ¿ C ó m o p re p ara ría 75 m L d e clo ru ro s ó d ico al 2 5 % (p/v)?
5. ¿ C ó m o p re p ara ría 25 m L d e clo ru ro d e ce sio al 0 ,4 % (p/v)?
6 . ¿ C ó m o p re p ara ría 150 m L d e g licerol al 2 5 % (v/v)?
7 . Si se disu elv en 30 g de N aC I en u n v o lu m en final d e ag u a d e 40 0 m L , ¿cuál es
el p o rc en taje (p /v ) d e la co n c en tra ció n d e N aC I en la solución?
8 . Si se añ a d en 20 m L d e ag u a d estilad a a 5 m L d e g licerol al 70% , ¿ c u ál es la
co n c en tra ció n d e la so lu ció n d ilu id a d e glicerol?
9. ¿Q u é v o lu m en d e N aC I al 10% es n ecesario p ara o b ten e r 5 m L (volum en
inicial) d e ag u a al 0 ,25% ?
10. ¿C u ál es el p eso m o lecu la r d el M g C k ? (E l p eso atóm ico del M g es 24 ,3 0 5 . El
cloro tien e u n p eso atóm ico d e 35 ,4 5 3 .)
11. ¿C u ál es el peso m o lecu la r d el az ú ca r rib o sa (C 5H 10O 5)? (E l peso ató m ico del
ca rb o n o es 12,01. E l h id ró g en o tien e u n p eso atóm ico d e 1,01 y el o x ígeno
tien e u n p eso atóm ico d e 16,00.)
12. ¿ C ó m o pre p ara ría 50 0 m L de T ris b a s e 2 5 0 m M ? (E l p eso m o lecu la r d el Tris
b a s e es 121,14 g/m ol.)
13. ¿ C o n cu á n ta a g u a c o n trib u y e el cloruro d e calcio dih id rato (C aC l2 • 2 H 2O;
P M 147,02) cu an d o pre p ara m o s 2 .0 0 0 m L d e u n a so lu ció n 30 0 mA/?
14. ¿C on c u á n ta ag u a c o n trib u y e el citrato só d ico d ihidrato (P M 2 9 4 ,1 0 ) cuando
se p re p ara n 4 0 0 m L d e u n a so lu ció n 2 A/?
15. ¿C ó m o se p re p ara n 2 L d e N a O H 35 mA/? (E l h id ró x id o d e sodio tien e un
p eso m o lecu la r d e 4 0 .)
16. ¿C u án to s m o les d e N aC I h a y en 3 5 0 m L d e u n a so lu ció n 2 A/?
17. ¿C u án to s m ilim o les d e N aC I h ay en 75 m L d e u n a so lu ció n 0,025 Af?
D2012. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos.

18. U sted tien e u n stock d e T ris 2 5 0 m M. ¿Q u é v o lu m en d e esta so lu ció n stock

h a y q u e a ñ a d ir al ag u a p a ra pre p a ra r 50 0 m L d e T ris 7,5 m M ?
19. ¿ C ó m o p re p ara ría 1 m L d e T ris 25 m M a pa rtir d e u n stock a 500 m M ?
20. E x p re se la so lu ció n d e N a O H 50 m M en porcentaje.
21. ¿C u ál es la co n c en tra ció n m o lar d e u n a so lu ció n d e g licero l al 15% ?
(E l g licero l tien e u n peso m o lecu la r d e 92,1.)
22. ¿C u ál es la m o larid ad d e u n a so lu ció n d e H 2SO 4 2 N I
2 3 . ¿C ó m o p re p ara ría 50 0 m L d e HC1 2 N a p a rtir d e u n stock 5 M I
24. ¿C u ál es el p H d e u n a solución 0 ,0 2 N d e HC1?
2 5 . ¿C u ál es la co n c en tra ció n d el ion H + en u n a so lu ció n 10 m M de HC1?
26. ¿C u ál es el p H d e u n a so lu ció n d e N a O H 0,5 M I
27. U n a so lu ció n de HC1 tien e u n pH d e 2,8 . ¿C u ál es la co n c en tra ció n d e HC1 de
la solución?
28. ¿C ó m o se p re p ara n 100 m L de u n tam p ó n de fosfato só d ico 20 0 m M (pH 7,6 )
a p a rtir d e u n s to ck d e fosfato só d ico m o n o b ásico 5 0 0 m M (N aH 2P 0 4) y de
fosfato só d ico d ib ásico 50 0 m M (N a2H P 0 4)?
RESPUESTAS
1. M ez cle 75 m L d e tam p ó n d e trabajo p a ra g eles 5 X co n 675 m L d e agua
destilada.
2. M ez cle 0,5 m L d el sto ck 2 0 X co n 2 4,5 m L d e ag u a destilada.
3 . M ez cle 125 [aL d el s to ck 100X con 4 9 ,8 7 5 m L d e ag u a destilada.
4. D isu elv a 18,75 g d e N aC I en ag u a y enrase a u n vo lu m en final d e 75 m L con
a g u a destilada.
5. D isu elv a 0,1 g d e C sC l en a g u a y en rase a u n v o lu m en final d e 25 m L.
6 . M ez cle 37,5 m L d e g licerol y 112,5 m L d e a g u a destilada.
7. 7 ,5 %
8 . 14%
9. 128 [xL d e N a C I al 10% a ñ a d id o s a 5 m L d e ag u a s u p o n en u n a so lu ció n de
N aC I al 0 ,2 5 % c o n u n v o lu m en final d e 5 ,1 2 8 m L.
10. 95,211 g/m ol
11. 150,15 g/m ol
12. D isu elv a 15,14 g d e T ris b a s e en ag u a h a s ta u n v o lu m en final d e 500 m L.
13. 2 1 ,6 m L d e agua.
14. 38,8 m L d e agua.
15. A ñ a d a 2,8 g d e N a O H a 2.0 0 0 m L d e a g u a destilada.
16. 0 ,7 m o les d e N aC I
17. 1,875 m ilim o les d e N aC I
18. M ez cle 14 m L d e T ris 25 0 m M y 48 5 m L d e ag u a destilada.
19. A ñ a d a 50 [xL d e T ris 500 m ili a 95 0 (xL d e a g u a destilada.
20. N a O H 0,2%
Ejercicios adicionales
1. U n cultivo b ac terian o se d ilu y e d e la s ig u ie n te form a:
0,1 m L 0,1 m L 0,5 m L

10 m L 10 m L 10 m L
y 0,1 m L se ex tienden so b re u n a p lac a d e agar. ¿C u ál es la d ilu ció n d e las

células ex te n d id a s so b re la placa?
2. U tiliz an d o vo lú m en es inferiores a 10 m L y m ayores a 0,1 m L , ¿cóm o pu ed e
d ilu ir u n cultivo b ac terian o d e fo rm a q u e ex tien d a 0,1 m L d e u n a dilución
final d e 3 x 10~6 m L ? (U tilice el m en o r nú m ero d e tu b o s d e dilu ció n y tom e
0,1 m L d el cultivo original.)
3 . U n a dilu ció n d e 3 x 10 - 6 d e u n a e x te n sió n d e bac terias so b re u n a p lac a de
agar, tras u n a in cu b a ció n du ra n te u n a noche, d a lu g a r a 2 7 0 colonias. ¿C u ál es
la co n c en tra ció n d e bac terias d el cultivo original?
4 . U n a dilu ció n d e 2 x 10-5 d e 50 m L d e cultivo g e n e ra 175 co lo n ias cu a n d o se
ex tien d e sobre u n a p lac a d e agar. ¿Q ué ca n tid a d de bac terias h a y en el cultivo
original?
5. U n cultivo d e E. coli tien e u n a co n c en tra ció n d e 3 ,2 x 107 bacterias/m L . Se
to m a u n a a lícu o ta d el cultivo d e 0,75 m L , se ce n trifu g a y el sed im en to se
re su sp en d e en 1,5 m L d e m edio L u ria (L B ). ¿C u ál es la co n c en tra ció n d e las
bac terias re su sp en d id as?
6 . U n cultivo d e E. coli tien e u n a co n c en tra ció n d e 2 ,8 x 107 bacterias/m L .
U sted n ec esita 0,5 m L (v o lu m en fin al) d e bac terias en LB a una
co n c en tra ció n d e 4 ,2 x 108 bacterias/m L . ¿Q ué h a ría usted?
7 . U n c u ltiv o d e E. coli tien e u n a co n c en tra ció n d e 7 ,8 x 10 8 bacterias/m L .
¿Q u é dilu ció n se d eb e ría h a c e r en el c u ltiv o p a ra q u e exte n d ie n d o 0,1 m L
sobre u n a p la c a d e a g a r ob tu v iéra m o s 2 5 0 co lonias? (U tilice el m e n o r núm ero
d e d ilu cio n es y vo lú m en es su p erio res a 0,1 m L e inferiores a 10 m L . Tom e
0,1 m L del cultivo original p ara re alizar las diluciones.)
8 . Tras 2 h después d e la inoculación (y durante la fase exponencial del creci
m iento), un cultivo de E. coli tiene u n a concentración d e 2,5 x 108 bacterias/m L.
2012. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos. e7

e8 Ejercicios adicionales
L a concentración b acteriana inicial del cultivo e ra 3 ,0 x 107 bacterias/m L. ¿C uál

es el v alo r K del cultivo?
9 . ¿C u ál es el tiem p o d e gen e rac ió n d el cultivo b ac terian o desc rito en el
P ro b lem a 8 ?
10. U n cultivo b ac terian o tien e u n a co nstante d e crecim iento, K, d e 0 ,0 0 5 5 /
m in u to y u n a co n c en tra ció n in icial d e 1,5 x 107 bacterias/m L . ¿C u ál es la
co n c en tra ció n b ac te ria n a d el cultivo a 1 h 20 m in?
11. U n cultivo b ac terian o se co n tro la m ed ian te la m ed ició n d e la D O 550 y la
co n c en tra ció n b ac terian a , o b ten ién d o se lo s sig u ie n tes datos:
Horas tras la DO 550 Bacterias/mL

inoculación
0 0,005 1,0 x 107

1 0,017 3,4 x 107
2 0,060 1,2 x 108
3 0,209 4,2 x 108
4 0,724 1,4 x 109
5 1,148 2,3 x 109
6 1,660 3,3 x 109
7 2,400 4,8 x 109
8 3,802 7,6 x 109
a ) ¿C u ál es el v a lo r d e K p a ra este co n ju n to d e datos?
b) ¿C u ál es el tiem po d e g en e rac ió n d e este cultivo?
c) ¿C u ál es la co n c en tra ció n d e bac terias u n a h o ra y m ed ia tras la
inoculación?
d) U tilizando el p ro g ram a E xcel d e M icro so ft, re p rese n ta r en u n gráfico la
co n c en tra ció n b a c terian a frente a las h o ra s tras el in o cu lo y a p a rtir del
gráfico, ca lcu lar el tiem po d e generación. (V éase el A pé n d ic e A para
s a b e r có m o u tiliz a r la utilidad d e E xcel p a ra gráficos. Se d eb e u tiliz ar el
gráfico d e « X Y (D ispersión)». E l eje d e ordenadas se h a d e re p rese n ta r en
e sc ala logarítm ica. P a ra c a m b ia r el eje d e ord e n ad as, selec cio n e e l eje y
e sc o ja «D ar form ato al eje: E sca la L o g arítm ica » y «N úm ero:
C ientífico».)
12. S e m ide la ta sa d e m u tació n d e u n a b ac teria re sp ecto a su re sisten c ia fren te a
u n antib ió tic o p o r m edio d e la téc n ic a de ex te n sió n en placa. S e extiende u n a
d éc im a p arte en m L d e u n a alícu o ta d e u n cultivo b ac terian o c o n u n a
co n c en tra ció n d e 1 x 105 b ac terias/m L so b re 35 p lac as d e a g a r L B sin
antib ió tic o y en 3 0 p lac as d e a g a r L B q u e co n tien e n e l antib ió tic o de
selección. B ajo las co n d ic io n e s d e cultivo em pleadas, las bac terias tienen
u n tiem p o d e g e n e rac ió n d e 45 m in. L as 65 p lacas se incu b a n du ra n te 7 h
30 m in , tras lo cual se rocían co n u n esp ray 30 p lac as d e las 35 q u e inicial

m ente no co n te n ía n el antibiótico. E stas plac as ro ciad as se incu b a n 14 h m ás
p a ra p erm itir la ap a rició n d e co lo n ias resistentes al antibiótico. L as bacterias
d e las 5 p lacas restantes (d e las 35 p lac as d e a g a r LB sin antibiótico) se
re co g en y se ca lcu la el n ú m ero to ta l d e bac terias p o r placa. E l resultado
o b tenido es d e 1 x 108 bac terias p o r placa. L as cin c o p lac as contienen
b acterias. L as 30 p lac as que ten ían antib ió tico d esd e el inicio d an lu g a r a
d os co lo n ias resistentes al an tibiótico. T ras la incu b a ció n d e las p lac as q u e se
roc ia ro n c o n el antibiótico selec tiv o , aparecieron 20 co lo n ias resistentes al
an tibiótico. ¿C u ál es la ta s a d e m u tació n p ara la re sisten c ia al antibiótico?
13. S e d ilu y en 50 [xL d e u n a su sp en sió n d e células d e o v ario d e h á m s te r chino
(C H O ) en u n vo lu m en to tal d e 5 m L de m ed io d e cultivo. S e c o lo c a u n a gota
d e la dilu ció n so b re la re jilla d e u n hem o c itó m etro . Se cu e n tan 2 5 0 células a
p a rtir del co n ta je d e 2 0 cam pos. ¿C u ál es la c o n c en tra ció n d e la suspensión
celular?
RESPUESTAS
1. (1 x 10-2 ) (1 x 10-2 ) (5 x 1 0 " 2) x 0,1 = 5 x 10- 7 m L
0,1 m L 0,1 m L 3 mL
2. - x 0,1 m L
10 m L X 1 0 m L X lO m L
3 . 9 x 107 b acterias/m L
4 . 3,5 x 108 bacterias
5 . 1,6 x 107 b acterias/m L
6 . C en trifu g u e 7,5 m L d e células y re su sp en d a el sed im en to en 0,5 m L d e LB .
7 . N e cesitará u n a dilu ció n d e 3,2 x 10- 7 . A q u í se m u estra u n a fo rm a de
conseguirla:
0,1 m L 0,1 m L 0 ,3 2 m L
- x 0,1 m L sem brado
10 m L X 10 m L X 10 m L
8. 0,0 0 7 7 /m in
9. 39,1 m in
10. 4 ,2 x 107 bacterias/m L
11. a) K = 0 ,0 09/m inuto
b) 33 m in
c) 6,5 x 107 b acterias/m L
d) P ara c a lcu lar el tiem po de gen e rac ió n h a y q u e escoger, en u n a gráfica, dos
p u n to s q u e su p o n g an la dup licac ió n d el n ú m ero d e células d en tro d e la
fase lo g arítm ica d e crecim iento. E n este ca so ca lcu lam o s el tiem p o de
gen e rac ió n u tiliz an d o las co n c en tra cio n es de 2 x 108 y 4 x 108 b ac terias/
m L. E stas co n c en tra cio n es co rresp o n d e n , re spectivam ente, a 2 ,4 y 2,95 h
tras la inoculación.
el O Ejercicios adicionales
„ ., 60 m in .
2 ,4 h x — ------ = 144 m m
h
60 m in
2 ,95 h x — ------= 177 m in
h
177 m in — 144 m in — 33 m in
P o r lo tan to , el tiem p o d e gen e rac ió n es d e 33 m in.
| Concentración bacteriana frente a tiempo tras la inoculación |
1.00E+10
| Tiempo tras la inoculación |
12. 8,7 x 10 9 m u tacio n e s/b a cteria /d iv isió n b a c terian a

13. 1,25 x 107 bacterias/m L
1. U n a a lícu o ta d e 0,2 m L d e u n stock d e fagos q u e tien e u n a concentración

d e 6 x 10 8 fa g o s/m L se añ a d e a 0,7 5 m L d e bac terias a u n a co n c en tra ció n de
1 x 10 8 bacterias/m L . ¿C u ál es la m oi?
2. U n sto ck de fagos q u e tien e u n a co n c en tra ció n de 5 x 109 fa g o s/m L se d iluye
en 0,1 m L /10 m L y 0,1 m L d e la dilu ció n se añ a d en a 0,5 m L d e bac terias que
p ro v ien e n de u n a dilu ció n de 0,2 m L /1 0 m L de u n cultivo b ac terian o co n u n a
co n c en tra ció n d e 2 x 108 bacterias/m L . ¿C u ál es la m oi?
3 . U n a a lícu o ta d e 0,5 m L d e u n cultivo d e E. coli q u e tien e u n a co ncentración
d e 5 x 107 b ac terias/m L se co lo c a en u n tu b o d e ensayo. ¿C u ál es el vo lum en
q u e h ay q u e a ñ a d ir d el sto ck d e bac terió fa g o s q u e está a u n a co n c en tra ció n de
4 x 10 8 fa g o s/m L a la alícu o ta d e bac terias p ara o b ten e r u n a m oi d e 0,7?
4. U n cultivo de E. coli se in fec ta co n fagos a u n a m oi de 0,5. ¿Q u é po rc en taje de
b ac terias serán infectadas p o r cuatro fagos?
5 . U n a alícu o ta de 0,2 m L d e u n cu ltiv o d e E. coli c o n u n a co n c en tra ció n de 2 x
108 bac terias/m l es in fec tad a p o r u n a alícu o ta d e 0,1 m L de u n s to ck d e fago
q u e tien e u n a co n c en tra ció n d e b ac terió fa g o s d e 1,2 x 108 fagos/m l.
¿C u án ta s células infectarán tres fagos?
6. U n cultivo d e E. coli es infectado p o r u n fago lítico a u n a m oi d e 4. ¿C uál es la
probabilidad de que cualquier bacteria individual no será infectada inicialm ente?
7 . E n el P ro b lem a 6, ¿ q u é p ro p o rció n d e bac terias no se infectarán?
8. U n cultivo d e bac terias es infectado p o r u n fago c o n u n a m oi d e 0,3. Se retira
1/2.000 p arte d el cultivo infectado. ¿C u án ta s b ac terias infectadas p o r los
fa g o s h a b rá en e s a alícuota?
9. E n 1/200 a lícu o ta d e u n cultivo infectado co n u n a m o i d e 0 ,0 3 , ¿cuál es la
pro b a b ilid ad d e q u e no h a y a b ac terias infectadas en la alícuota?
10. E n 1/40 a lícu o ta d e u n c u ltiv o infectado co n u n a m oi d e 0,3 , ¿cuál es la
pro b a b ilid ad d e en c o n trar 10 células infectadas?
11. ¿C u ál es la pro b a b ilid ad d e q u e u n a a lícu o ta d e 4 0 bac terias to m ad as d e un
cultivo infectado a u n a m o i d e 0,3 te n g a cin c o o m ás células infectadas?
12. E n 1/40 alícu o ta d e u n c u ltiv o infectado co n u n fa g o a u n a m oi de 0 ,3 , ¿cuál es
la pro b a b ilid ad d e e n c o n trar n in g u n a y u n a b ac teria in fectada?
2012. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos. el 1

el 2 Ejercicios adicionales
13. Si, en u n cultivo d e bac terias infectadas, el 20 % d e las b ac terias no pro d u c en

u n a ex p lo sió n d e fagos, ¿cuál fue la m o i utilizada?
14. U n s to ck d e fagos se d ilu y e d e la sig u ien te form a:
0,1 m L 0,1 m L 0,1 m L 0 ,2 m L

10 m L 10 m L 10 m L 10 m L
U n a a lícu o ta d e 0,1 m L d e la d ilu ció n final se m ez cla co n u n a a lícu o ta de

b ac terias, se plaq u e a so b re a g a r d ilu id o y se in cu b a u n a noche. A p a rec en 85
calvas en la p lac a tras la incubación. ¿C u ál e s el título d el s to ck d e fagos?
15. U n stock d e fa g o s tien e u n a co n c en tra ció n d e 5 ,5 6 x 109 P F U /m L . ¿C óm o
h a y que d ilu ir este sto ck p a ra q u e u n a a lícu o ta d e 0,1 m L d e la ú ltim a dilu ció n
d é lu g a r a 2 0 0 calvas cu an d o se siem b re n ? (U se el m e n o r n ú m ero d e dilu
ciones. A l diluir, n o u s a r u n v o lu m en m a y o r d e 10 m L n i in ferio r a 0,1 m L.
T om e 0,1 m L d el s to ck d e fa g o s original p a ra la p rim era d ilución.)
16. U n a m u estra d e 4 x 108 bac terias se in fec ta a u n a m oi d e 0,1 y el fa g o se deja
a b so rb er d u ra n te 15 m inutos. L o s fa g o s no adso rb id o s se elim inan p o r
dilu ció n y centrifugación. S e a n a liz an las calvas p ro d u c id a s d ilu y en d o u n a
a lícu o ta d e las bac terias infectadas d e la siguiente form a:
mL 0,2 m L
x 0,1 m L sem brados
mL 10 m L
T ras la in cu b a ció n d e las placas, aparecen 120 calvas.

L as bac terias infectadas se incu b a n d u ra n te 90 m in y se valo ra el títu lo d e los
fa g o s re alizan d o la dilu ció n d e la siguiente form a:
10 m L 10 m L 10 m L
A p a rec en 30 calvas en la p lac a tras u n a n o ch e d e incubación. ¿C u ál es el

tam añ o d e la ex p lo sió n d e fagos?
RESPUESTAS
1. m o i = 1 , 6 fa g o s/c élu la
2. m o i = 2,5 fa g o s/c élu la
3 . 0 ,0 4 4 m L d el s to ck d e fagos
4. 6 ,2 5 % d e las bac terias serán in fectadas p o r 4 fagos.
5. 1,08 x 106 bac terias serán infectadas p o r 3 fagos.
6. 0,0183
7 . 1 d e ca d a 55 b ac terias no será infectada.
8. P o r ca d a alícu o ta d e 2 .0 0 0 bac terias se infectarán 600.
Ejercicios adicionales - Capítulo 4 el 3
9. 2,4 8 x 10~ , o u n a pro b a b ilid ad d e c a d a 40 3 d e q u e u n a a lícu o ta d e 200

bac terias c o n te n g a bac terias sin infectar.
10. 0,1 , o u n a pro b a b ilid ad d e 1 so b re 10.
11. H ay el 9 9 ,2 4 % d e pro b a b ilid ad d e en c o n trar 5 o m ás bac terias infectadas en
u n a a lícu o ta d e 4 0 bacterias.
12. 8 x 10- 5 , o 1 entre 12.500 d e q u e u n a a lícu o ta d e 4 0 b ac terias co ntenga
n in g u n a o u n a b ac teria infectada.
13. m o i = 1 ,6 1
14. 4,2 5 x ÍO10 P F U /m L
15. U n a dilu ció n seria d a p o d ría se r la siguiente
0,1 m L 0,1 m L 0,1 m L 3,6 m L

x 0,1 m L sem brado
10 m L 10 m L 10 m L 10 m L
16. T am año d e e x p lo sió n = 50 P F U /IC

1. S e dilu y en 15 (xL d e u n a m u estra d e 35 0 |xL de A D N en 985 pL d e ag u a y se

m id e su abso rb an cia en u n esp ectrofotóm etro d e UV. A u n a A 2ao tien e u n
v a lo r d e 0 ,2 3 6 y a A 280 d e 0,127.
a ) ¿C u ál es la co n c en tra ció n d e A D N d e la p re p ara ció n inicial?
b ) ¿C u án to A D N se h a aislad o en total?
c) ¿C u ál es la relación 260 /2 8 0 ?
2 . V einte p L de u n a p re p ara ció n d e u n plásm id o se dilu y en en u n vo lu m en final
d e 1 m L y tie n e n u n a lec tu ra a A 260 d e 0,354. U tiliz an d o la le y d e B eer,
ca lcu le la co n c en tra ció n d e A D N d e esta m u estra en p,g/mL.
3 . U n a m u estra d e A D N tien e u n a a b so rb an cia a 2 6 0 n m d e 0 ,182. ¿C u ál es la
co n c en tra ció n d e la m u estra e x p resad a en m ilim oles?
4. U n a so lu ció n d e A D N tien e u n a co n c en tra ció n d e 0,0 2 2 m M . ¿C u ál es la
co n c en tra ció n en pmoles/(xL?
5. U n a d ilu ció n d e 2 0 [xl d e u n a p re paración d e A D N en u n v o lu m en final de
1.000 |iL tien e u n a a b so rb an cia a 2 6 0 n m d e 0,1 2 4 . ¿C uál es la co ncentración
d e la p re p ara ció n d e A D N en pm oles/|xL?
6. S e realiza u n a recta estándar utilizando P icoG reen. L as concentraciones d e A D N
del estándar y sus m edidas de fluorescencia se presentan en la siguiente tabla.
ADN estándar Unidades

((jug/mL) de fluorescencia
0 0
1 2.485
2,5 5.125
5 9.850
10 19.920
15 28.034
20 38.108
25 48.022
U n a m u estra d esc o n o cid a tien e u n a flu o re scen c ia d e 2 2 .8 4 2 . ¿C u ál es la

co n c en tra ció n d e la m u estra e n p,g/mL?
e14 2012. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos.

7 . Q uince (xL d e u n a preparación del A D N d e bacteriófago M I 3 diluidos en un

v o lum en final de 1.000 pL tienen u n a A260 d e 0,156. ¿C uál es la concentración
del A D N d e M I 3 d e la preparación?
8 . U n a p re p ara ció n del A D N d e u n fa g o M I 3 re co m b in an te tien e u n a
co n c en tra ció n d e 848 [jg/m L. ¿C uál es su co n c en tra ció n en p m o l/|iL ?
9 . U n a m u estra d e 50 p L d e A D N d e fago M I 3 d ilu id a en 1.000 (xL tien e u n a
abso rb an cia a 2 6 0 n m d e 0,112. ¿C u ál es la co n c en tra ció n d el A D N d e M I 3
d e la p re p ara ció n en
10. U n a alícu o ta de 20 p L to m a d a de u n stock d e 2 m L d e u n olig o n u cleó tid o se
dilu y e en ag u a ha sta u n v o lu m en to ta l d e 1 m L . L a m u estra d ilu id a tien e u n a
abso rb an cia d e 0,1 8 4 a 26 0 nm . ¿C u án ta s un id ad e s de D O de oligonucleótido
h a y en la so lu ció n stock?
11. S e diluyen 10 |¿L d e u n stock d e oligonucleótido en 1.000 |xL. L a dilución tiene
u n a A 26o d e 0,124. ¿C uál es la concentración del stock d e oligonucleótido en
n g/|iL ?
12. U n olig o n u cleó tid o tien e la s ig u ie n te secuencia:
ACCGATATCGCGGATCGCGCA
U n a p arte a lícu o ta d e 30 p L d e u n a so lu ció n sto ck de este olig o n u cleó tid o se

dilu y e en u n v o lu m en final d e 1 m L. L a m u estra d ilu id a tien e u n a A 260 de
0,1 7 3 . U tilic e lo s coeficientes d e ex tin ció n d e las b a se s d el o ligonucleótido
p ara c a lcu lar la co n c en tra ció n d e la so lu ció n sto ck e n pm o l/p L .
13. L a co n c en tra ció n d e u n s to ck d e u n olig o n u cleó tid o es d e 50 p m o l/p L . Se
qu iere u tiliz ar u n a alícu o ta del stock c o m o ce b ad o r en u n a P C R d e tal m odo
q u e en la re acc ió n de 50 p L esté a u n a co n c en tra ció n d e 2 \iM. ¿Q ué cantidad
d el s to ck d e olig o n u cleó tid o h ay q u e p ip etea r en lo s 50 [iL d e la reacción de
P C R p ara o b te n e r la c o n c en tra ció n d ese ad a?
14. Se dilu y en 2 0 [xL d e u n s to ck d e A R N en ag u a h a sta u n v o lu m en final de
1 m L. L a m u estra d ilu id a tien e u n a ab so rb an cia d e 0 ,2 0 2 a 26 0 nm . ¿C u ál es
la co n c en tra ció n d e A R N del stock en (xg/mL?
15. E l g e n o m a d e u n a ce p a d e E. coli tien e u n tam añ o d e 4.6 3 9 .2 2 1 pb.
A su m ien d o q u e h a y u n g e n o m a p o r b ac teria, ¿c u án tas bac terias d e E. coli
s o n n ec esarias p ara o b ten e r 0,5 n g d e A D N co n u n ren d im ien to d el 100% ?
16. ¿C uántos |xg o f A D N se pu ed en obtener a partir d e 8 m L d e fagos \ (48.502
pb/genom a) co n u n título d e 4 x 1010 fagos/m L y asum iendo u n rendim iento
del 90% ?
17. E l genom a h u m ano tiene u n tam año aproxim ado de 3.100.000.000 pb. ¿C uántos
gram os de g en o m a h u m ano encontrarem os en 1 m ol de g en o m a hum ano?
18. Si u sted p e s a 154 lib ras y asu m e q u e su cu e rp o tien e 100 trillo n e s d e células,
¿ q u é p o rc en taje d e s u p eso está form ado p o r A D N n u cle ar? (1 k g es e q u i
v ale n te a 2,2 libras.)
19. E l fa g o X tien e 4 8 .5 0 2 pb. ¿C u án to s pm o les del fa g o X h a y en 2 0 p g d el A D N
deX ?
el 6 Ejercicios adicionales
20. ¿C u án ta s m oléculas del g e n o m a d e \ (4 8 .5 0 2 p b de tam añ o ) h a y p re sen tes en

50 |xg d el A D N d e X?
21. ¿ C u án to s p,g de plásm id o d e 4.3 2 8 pb d e tam añ o h a y en 50 p m o les del A D N
en u n a pre p ara ció n d el plásm ido?
22. ¿C u ál es el p eso m o lecu la r d e u n o lig o n u d e ó tid o fo sfo rila d o q u e tien e la
sig u ie n te secuencia?
AGA TGCATCGCATTAGG CA
23. D o sc ie n to s nan o g ram o s d el A D N d e X co rta d o co n Hind III se utiliz an co m o

m arcadores en u n g el d e a g a ro sa p ara ele ctro fo resis do n d e se an a liz a la
pre sen cia d e u n p ro d u c to d e P C R d e 75 0 p b . L a b a n d a d el p ro d u c to de
P C R tien e la m ism a intensidad, tras la tin ció n co n b ro m u ro d e etid io , que
la b a n d a d e 2 .3 2 2 p b d el p atró n X. ¿C u ál es la cantidad d e A D N apro x im a d a
d e la b a n d a d el p ro d u c to d e P C R ?
RESPUESTAS
1. a ) 78 7 p,g/mL
b ) 275 îg
c ) 1,86
2. 885 p,g d e A D N /m L
3 . 0,0 2 7 m M
4. 22 pm ol/|xL
5. 9 2 5 ,4 pm o l/p L
6. R ep re sen tan d o lo s d ato s p o r m edio d e E xcel, ob ten e m o s la sig u ie n te re cta y
la co rresp o n d ien te ecu ac ió n q u e m ejo r se ajusta. U tilizando esta ecu ació n , la
m u estra d esc o n o cid a tien e u n a co n c en tra ció n d e 11,9 p,g/mL.
7 . 343,2 [xg d e A D N /m L
8. 0 ,32 pmol/[xL
9. 2 6 3 ,5 \xM
10. 18,4 u n id ad e s d e D O
11. 4 0 9 ,2 ng/pL
12. 2 5 ,4 pm o l/p L
13. U se 2 [iL d el s to ck d e o ligonucleótido.
14. 4 0 4 [xg d e A R N /m L
15. 9 8 .0 3 9 bacterias
16. 15,4 p g d e A D N d e X
17. A p ro x im ad a m en te 2 x 1012 g ra m o s p o r m ol.
18. A p ro x im ad a m en te el 1%
19. 0,625 p m o les
20. 9 ,4 x 1 0 u g en o m a s d e X
21. 143 [xg
22. 6 .3 5 6 ,8 D a
23. 9 ,6 ng
1. ¿C u án ta s cp m se p ro d u c irán a p a rtir d e 2 m C i d e 32P ?

2. Si u n co n ta d o r d e cen telleo líq u id o p u e d e d ete ctar u n 3 0% d e las d esin te
graciones, ¿c u án tas cpm se esp e ran o b te n e r d e 50 0 (xCi d e m aterial
radiactivo?
3 . U n p lásm id o d e 4 .2 8 0 p b se a m p lifica en u n cultivo d e E. coli h a s ta la fase
lo g arítm ica en p re sen cia d e [3H ]-tim idina, m om ento en el q u e se aísla el A D N
y se fracc io n a en u n gra d ie n te d e clo ru ro d e ce sio co n b ro m u ro d e etidio. L a
fracción q u e co n tien e el plásm id o em ite 4 2 .5 0 0 cpm . L a fracción co rresp o n
dien te al A D N cro m o só m ico de E. coli em ite 3 9 8 .0 0 0 cpm . L a c e p a d e E. coli
u tiliz a d a en este estu d io tien e u n g en o m a c o n u n tam año d e 4 .6 4 8 .0 0 0 pb.
¿C u ál es el n ú m ero d e co p ia s d el p lásm id o ?
4 . C o n 5 0 0 ng d e u n p lásm id o se re aliza u n a re acc ió n d e traslación d e m ella
u tiliz an d o 15 pC i d e [ a - 32P]dA TP e n u n a re acc ió n d e 30 (xL. S e to m a u n a
a lícu o ta d e 1 p,L y se d iluye co n 49 |xL d e tam p ó n T E . S e d ep o sitan 10 (iL
so b re u n filtro p a ra d ete rm in a r las cp m totales. E l re su lta d o es d e 3 ,2 x 1 05
cp m en u n co n ta d o r d e cen telleo líquido. O tra a lícu o ta d e 10 pL d e la dilución
se p re cip ita con T C A y se recoge en u n filtro. M id e 2,3 x 1 05 cpm .
a) ¿C u ál es el po rc en taje d e incorporación?
b) ¿C u ál es la ac tiv id a d esp e cífica d el p ro d u c to m arcado?
5 . C in c u en ta pC i d e [a -32P ]d C T P (activ id a d esp e cífica 3.0 0 0 C i/m m ol) se u ti
lizan en u n pro to co lo d e m are aje d e ce b ad o re s aleatorios c o n 50 n g d e A D N
desn a tu ralizad o co m o m olde en u n a re acc ió n d e 100 |xL. T ra s la re acc ió n de
ex ten sió n , u n a a lícu o ta d e 1 p,L se d iluye en 4 9 p,L d e T E . D iez p,L d e esta
dilu ció n se d e p o sitan en u n filtro, se sec an y se valo ra n com o la actividad total
d e la reacción. C o m o re su lta d o se o b tien e 8,2 x 105 cpm . U n a seg u n d a
a lícu o ta d e 10 p,L d e la m u estra d ilu id a es d ep o sitad a en u n filtro y se p re cip ita
c o n T C A p a ra d ete ctar el ác id o nu cle ic o m arcado. C o m o re su lta d o se obtiene
6,3 x 1 05 cpm .
a) ¿C u ál es el po rc en taje d e incorporación?
b ) ¿C u ál es el ren d im ien to teórico d el A D N m arc ad o (e n n an o g ram o s)?
c) ¿C u ál es el ren d im ien to re al d el p ro d u c to m arcado?
d ) ¿C uál es la actividad específica del producto m arcado (en cpm /ng de A D N )?

6. U n a re acc ió n d e la tran sfera sa term in al p ara m arc ar ex tre m o s 3 ' u tiliz a

140 pg d e u n fragm ento d e 500 p b d e A D N en 100 |xL d e re acc ió n con
2 0 0 jxCi de [ a - 32P ]co rd ic ep in a-5 /-trifosfato (3 .000 C i/m m ol). T ras la
a d ic ió n d e los ex tre m o s 3', se d ilu y e 1 [xL d e la re acc ió n en 99 |xL de
tam pón. U n a alícu o ta d e 10 p L d e la m u estra d ilu id a se d e p o sita en u n filtro
y se v alo ra el to tal d e las cpm . R esu lta 3,4 x 105 cpm . U n a seg u n d a alícu o ta
d e 10 |xL d e la re acc ió n d ilu id a se p re cip ita con T C A p ara m ed ir el m areaje
incorporado. S e o b tien e 2,3 x 10 5 cpm .
a) ¿C u ál es el p o rc en taje incorporado?
b ) ¿C u ál es la ac tiv id a d e sp e cífica d e l p ro d u c to m arcado?
7. E n u n ex p erim en to d e síntesis d e A D N c, 2 0 (xg d e A R N m se m ez clan en u n a
re acc ió n c o n 4 m M de c a d a d N T P (c o n cen tració n final) y los reactivos
n ecesarios p a ra la síntesis d e la p rim era ca d en a en u n v o lu m en final de
110 |xL. S e tran sfieren 10 pL d e la reacción a u n nu ev o tu b o de
m icro c en trífu g a q u e co n tien e 1 pL d e [<x-32P ]dC T P (3 .0 0 0 C i/m m ol;
20 pCi/pL). S e d e ja q u e la re acc ió n tran sc u rra d u ra n te 30 m in; tras este
tiem p o , 1 pL se d ilu y e h a s ta 100 pL d e tam p ó n (v o lu m en final). D iez pL
d e esta d ilu ció n se dep o sitan en u n filtro y se m ide la to talid ad d e las cpm . El
resultado es 5,2 x 105 cpm . O tra a lícu o ta d e 10 [xL d e la m u estra d ilu id a se
tra ta c o n T C A , se d ep o sita en u n filtro y se valora. S e obtiene 3,7 x 103 cpm .
a) ¿ C u án to A D N c se s in te tiz a en esta reacción?
b) ¿Q u é p o rc en taje d el A R N m in icial se co n v ie rte en A D N c?
c) ¿Q u é ca n tid a d d el A D N c sintetizado está d isp o n ib le p a ra la síntesis d e la
seg u n d a cadena?
d) ¿ C u án to s nan o m o les d e d N T P se in corporan al A D N c en la prim era
reacción?
8. L o s 100 pL re s ta n te s d e la re a c c ió n d e sín te sis d e la p rim e ra c a d e n a del
A D N c q u e s e d e sc rib e en e l P ro b le m a 7 s e d ilu y e n h a s ta 2 1 0 pL (v o lu m en
fin a l) e n la re acc ió n d e la s e g u n d a c a d e n a d e l A D N c. S e s ac an 10 pL y se
co lo c a n en u n n u e v o tu b o q u e co n tie n e 10 pC i [ a - 32P ]dC T P. S e d e ja esta
re a c c ió n d e m a rc a d u ra n te 1 h , tras lo cu a l se añ a d en 9 0 [xL d e la so lu ció n
d e p a ro a lo s 10 pL de la re acc ió n d e m arc a. L a p rim e ra re acc ió n s e p a ra
p o r u n tra ta m ie n to p o r calor. S e a b s o rb e n 5 pL de la re acc ió n d e m a rc a en
u n filtro y se v alo ra . E l re su lta d o es 1,2 x 10 5 cpm . O tra a líc u o ta d e 5 [xL
se p re c ip ita co n T C A p a ra m e d ir la in co rp o rac ió n d e m are aje. E sta m u e s
tr a m id e 8 0 0 cpm .
a) ¿C u án to s n g d e la seg u n d a ca d en a d el A D N c se sintetizan?
b ) ¿Q u é porcentaj e de la p rim era ca d en a se co n v ie rte a la seg u n d a c a d e n a del
A D N c?
9. Se cortan 5 pg d e u n p lásm id o d e 4 .2 7 6 pb en su d ian a Hind LEI. Se añaden
2 [xL d e u n s to ck 50 0 \\M d e d G T P a 50 (xL d e u n a re acc ió n q u e co n tien e el
plásm id o co rta d o y 2 (xCi d e 3H -dG T P (c o n cen tració n final 0,01 \xM) com o
m o lécu la trazadora. U n pU de la re acc ió n se d ep o sita en u n filtro y se valoran

las cp m totales. E l re su lta d o es 6,5 x 104 cpm . T ras la reacción d e la
tran sfera sa term inal, se tom an 2,5 (xL y se pre cip ita n c o n T C A so b re u n filtro
p a ra m ed ir la in co rp o rac ió n d e dG TP. E ste filtro d a u n v a lo r d e 9 .2 6 0 cpm .
a) ¿C u án to s p ico m o les d e extrem os 3' están disp o n ib les co m o sustrato para
la tran sfera sa term inal?
b ) ¿C u ál es la co n c en tra ció n \¡M d e dG T P en la reacción?
c) ¿C u án to s p ico m o les d e d G T P se d e p o sitan en el filtro u tiliz ad o p ara
v alo ra r las cp m totales?
d ) ¿C u ál es la actividad esp e cífica d e la m u estra d ep o sitad a en el filtro p ara
c a lcu lar las cp m to tales (en cpm /pm ol d e dG T P )?
e) ¿C u án to s p ico m o les d e d G T P se in co rp o ran a la co la ho m o p o lim é rica?
f) ¿C u án to s re sid u o s G se añ a d en a ca d a ex tre m o 3"?
10. S e re aliza u n ex p erim en to d e tran sc rip ció n in vitro en e l cu a l se añ a d e 1 m C i
d e [a -35S ]U T P (2 .0 0 0 C i/m m o l) a u n a re acc ió n de 50 [iL q u e co n tien e 2 m M
d e ca d a ATP, C T P y GTP, A R N p o lim e rasa y 2 [xg d e A D N . U n a v e z se h a
co m p leta d o la re acc ió n , 1 [aL se diluye en 99 p,L d e T E y u n a a lícu o ta d e 5 pU
d e la dilu ció n s e d ep o sita so b re u n filtro p a ra m ed ir las cp m totales. El
resultado es 6,2 x 107 cpm . O tra a lícu o ta de 5 p,L d e la dilu ció n se pre cip ita
c o n T C A so b re u n filtro p ara c a lcu lar la cantidad d e m areaje q u e se h a
incorpo rado al ácido nucleico. E ste filtro d a u n v a lo r d e 1,2 x 107 cpm .
a) ¿C u án to A R N se h a sintetizado en la reacc ió n ? (S e asu m e q u e la
tran sc rip ció n h a inco rp o rad o igual ca n tid a d d e c a d a u n o d e los
nucleótidos.)
b ) ¿C u ál es la ac tiv id a d esp e cífica d el A R N sintetizado?
RESPUESTAS
1. 4 ,4 4 x 109 cpm
2. 3 ,33 x 10 8 cpm
3 . 116 copias d el plásm ido
4 . a ) In c o rp o ra ció n d el 72%
b ) 6 ,9 x 107 cpm/(xg
5. a) Inc o rp o ra ció n d el 7 6 ,8 %
b ) 22 n g d e A D N
c) 16,9 n g d e A D N
d ) 4 ,7 x 107 cp m /n g d e A D N
6 . a) Inc o rp o ra ció n d el 6 7 ,6%
b ) 1,6 x 106 cpm/(xg d e A D N
7 . a) 4 .0 6 6 n g d e A D N c sintetizado
b ) E l 2 0 ,3 % d el A R N m se h a con v ertid o en A D N c.
Ejercicios adicionales - Capítulo 6 e2 l
c) 3.6 9 6 n g d e A D N c
d ) 11,2 nm o l de dN T P se h a n inco rp o rad o al A D N c en la re acc ió n principal.
8. a) 3.5 0 4 ng d e A D N c se h an sintetizado en la re acc ió n d e síntesis d e la
seg u n d a ca d en a d el A D N c.
b ) El 9 4 ,8 % d e co n v e rsió n en la seg u n d a ca d en a d el A D N c.
9. a) 3,6 p m o l d e extrem os 3'
b ) 2 0 \xM d e dG T P
c) 2 0 p m ol dG T P
d ) 3.2 5 0 cp m /p m o l d e dG T P
e) 58,8 p m o l d e dG T P incorporados
f) 16 re sid u o s G añ a d id o s a ca d a extrem o 3'
10. a) 213 n g d e A R N sintetizado
b) 9 ,4 x 1010 cp m /m g d e A R N
1. A su m ien d o una efic ien cia d el 100% , ¿c u án to s m icrom oles de

o lig o n u d e ó tid o d e 26 b ase s d e tam añ o s e sintetizarán en u n a c o lu m n a
d e 0 ,2 (xmol?
2. A su m ien d o una efic ien cia d el 100% , ¿c u án to s m icrom oles de
o lig o n u d e ó tid o d e 26 b ase s d e tam añ o s e sintetizarán en u n a c o lu m n a
d e 4 0 n m ol?
3 . U n 2 6 -m er se sin te tiz a en u n a c o lu m n a d e 4 0 nm ol. A su m ien d o u n a eficiencia
d e síntesis d el 100% , ¿cuál es el ren d im ien to m áx im o te ó ric o to tal de
o lig o n u d e ó tid o (en u n id ad e s d e D O )?
4. S e sin te tiz a u n 18 -m er en u n a co lu m n a de 1 pinol. A s u m ien d o u n a eficiencia
d e síntesis d el 100% , ¿cuál es el ren d im ien to m áx im o teórico to tal de
o lig o n u d e ó tid o (en u n id ad e s d e D O )?
5. A su m ien d o u n a síntesis o ptim izada, ¿cuál es el ra n g o ap ro x im a d o d e re n d i
m iento (en u n id ad e s d e D O ) q u e se p u e d e esp e rar p a ra u n 18 -m er en u n a
co lu m n a d e 4 0 nm ol?
6 . S e s in te tiz a u n 2 4 -m er en u n a c o lu m n a d e 4 0 nm ol. E l v a lo r d e la fracción
tritilo a 4 9 8 n m p a ra la adición d e la p rim era b a s e es de 0,122. E l va lo r a A 498
d e la fracción tritilo p a ra la b a s e 2 4 es d e 0 ,069. ¿C u ál es el po rc en taje del
re n d im ien to to tal?
7 . ¿C u ál es el re n d im ien to p aso a p aso p ara la síntesis d esc rita en el anterior
P ro b lem a 6?
8 . A s u m ien d o u n ren d im ien to p aso a p aso d el 9 8 % , ¿q u é po rc en taje se pu ed e
esp e rar p ara la síntesis d e u n 32-m er?
9 . A s u m ien d o u n re n d im ien to p aso a p aso d el 9 7 % , ¿ q u é p o rc en taje d el rendi
m iento to tal se p u ed e esp e rar p a ra la sín te sis d e u n 32-m er?
10. L a fracc ió n tritilo d e la ad ic ió n del cu a rto nu cle ó tid o d e u n a síntesis 4 0 nm ol
se d iluye h a sta 5 m L d e v o lu m en final c o n ác id o to lu en o su lfó n ico m onohi-
drato 0,1 M en acetonitrilo. E l re su lta d o d e la lec tu ra a 4 9 8 n m es d e 0,195.
¿C u án to s m icro m o les d e n u cle ó sid o s e h an a c o p lad o en esta etapa?

RESPUESTAS
1. 5,2 |_imol
2. 1,04 [im ol
3. 10,4 u n id ad e s d e D O
4. 180 u n id ad e s d e D O
5. 4,5 un id ad e s d e D O a 9 u n id ad e s d e D O
6. 58% d e ren d im ien to global
7. 9 7 ,7 % d e ren d im ien to p aso a paso
8. 53 ,5% d e ren d im ien to global
9. 38 ,9% d e ren d im ien to global
10. 0 ,0 1 4 [im ol d e n u cle ó sid o añ a d id o s
1. S e n ec esitan 50 n g d e A D N h u m an o p a ra u n a am p lifica ció n p o r P C R . E l

s to ck d e A D N tien e u n a co n c en tra ció n d e 333 [ig/m L.
a ) ¿Q u é vo lu m en d e la so lu ció n d e s to ck h ay q u e u tiliz ar p a ra u n a reacción
d e 5 0 pL ?
b) A su m ien d o q u e se u tiliz a u n a p ip e ta q u e trab a ja en u n rango d e 0,5 a
10 p,L, ¿cóm o se p o d ría d ilu ir la so lu ció n sto ck de tal fo rm a q u e to m ando
2 p,L se añ adieran a tam p ó n d e dilución, d e tal m an e ra q u e a p a rtir d e esta
dilu ció n se p u d iera n a ñ a d ir 2 (¿L a la re acc ió n d e P C R ?
2. A su m ien d o q u e la efic ien cia de re acc ió n es del 100% y partie n d o d e u n a so la
m o lécu la d e A D N co m o m olde, ¿cuántas m oléculas se gen e rarán tras 36
cic lo s d e am p lifica ció n co m o pro d u c to d e la P C R ?
3 . A su m ien d o q u e la efic ien cia d e re acc ió n es del 100% y p artiendo d e 10.250
m o lécu la s d e A D N com o m olde, ¿c u án to s am p lico n es se gen e rarán tras 32
cic lo s d e P C R ?
4. P o r m ed io d e u n a P C R se h an gen e rad o 75 n g d e u n a m p licó n d e 800 pb. Se
h an utiliz ad o 50 n g de A D N hu m a n o co m o m olde. ¿C uántas am plificaciones
h a hab id o ?
5. C in c o m il copias d e u n a s ec u en cia de A D N se am p lifican co n u n a eficiencia
d el 95% . ¿C u án to s cic lo s se n ec esitan p ara g en e rar 4 x 1012 co p ia s d e la
secuencia?
6 . Tras 28 cic lo s d e u n a P C R , q u e parte d e 5 .0 0 0 co p ia s d e la sec u en cia m olde,
se p ro d u c en 5 x 1011 copias d el am plicón. ¿C u ál es la efic ien cia d e la
reacción?
7 . U n producto d e 540 pb de u n a P C R posee u n 48 % d e G + C , y las condiciones
d e am plificación sup o n en trabajar co n K C I 50 m M y M g C b 2 vaM. ¿C uál es la
Tm d el am plicón?
8 . M ed ian te u n a cin é tic a d e d esn a tu ralizac ió n se sab e q u e u n p ro d u c to d e 500
pb d e u n a P C R tien e u n a Tm d e 8 4 °C en u n a so lu ció n d e N aC I 20 m M y
M gC l2 5 m M. ¿C u ál es su co n te n id o en G + C ?
9 . U n stock d e ce b ad o r q u e co n tien e los d os ce b ad o re s n ecesarios p ara u n a
reacción d e am plificación p o r P C R tien e u n a co n c en tra ció n d e 20 \xM. ¿Q ué
vo lu m en de la so lu ció n sto ck se d e b e añ a d ir a 20 \iL d e la re acc ió n p ara ten e r
u n a co ncentración final d e 1,5 \xMl
e24 ©2012. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos.
10. V einte p L d e u n a P C R co n tien e n 0,5 \sM d e u n ce b ad o r d irecto d e 21

nucleótidos. ¿C uántas m o lécu la s d el ce b ad o r h a y en la P C R ?
11. C in c u e n ta p L d e u n a P C R , q u e co n tien e ce b ad o re s a 0,5 \iM, g e n e ra n u n
p ro d u c to d e 7 0 0 p b . A s u m ie n d o u n a e fic ie n c ia d e la re a c c ió n d el 100% y
q u e n in g u n o d e lo s o tro s re activ o s es lim ita n te , ¿c u án to s pg d e p ro d u c to se
p u e d e n ob ten e r?
12. C ie n ng d e A D N gen ó m ico hu m an o , en 50 p L d e u n a P C R , p ro d u c en tras 32
cic lo s 5 p g d e u n pro d u c to de 800 pb. L a reacción co n tien e ce b ad o re s a 1 pM .
a) ¿Q u é p o rc en taje d el ce b ad o r se in co rp o ra al p ro d u c to d e P C R ?
b) ¿ C u án to s cic lo s se re q u ie re n p ara c o m p leta r la inco rp o ració n to tal d e las
m o lécu la s d e ce b ad o r al p ro d u c to d e P C R ?
13. U n ce b ad o r d e P C R tien e la sig u ien te secuencia:
AGTACTCGGACACGATCAG
S e u tiliz a a u n a co n c en tra ció n d e 0,5 pM en u n a P C R q u e co n tien e KC1

4 0 m M y M g C l2 2 m M.
a ) U tiliz an d o la ecu ac ió n Tm = 2 °C (A + T ) + 4 °C (G + C ), ¿cuál es la Tm
del ce b ad o r?
b ) ¿C u ál es la Tm del ce b ad o r u tiliz an d o la s ig u ie n te ec u ac ió n ?
r „ = 8 1 , 5 + 16,6 [ 1 |0 ] S0^ SA L]] + 0,41 (% d e G + C , - f
c) ¿C u ál es la Tm d el c e b a d o r utiliz an d o las in teraccio n es en tre n ucleótido

adyacentes?
14. ¿Q u é ca n tid a d d e u n s to ck d e d N T P 10 m ili h a y q u e a ñ a d ir a 4 0 pL d e u n a
P C R (v o lu m en final) para te n e r u n a co n c en tra ció n de 20 0 pM d e ca d a dN T P ?
15. U n a re acc ió n d e P C R d e 2 0 pL , q u e u tiliz a u n c e b ad o r directo y otro reverso
d e 25 nu cle ó tid o s, g en e ra u n pro d u c to d e 50 0 pb. L a reacción contiene
2 5 0 pM d e ca d a dNTP.
a ) A su m ien d o q u e la re acc ió n tien e u n a efic ien cia del 100% y q u e nin g u n o
de lo s otros re activ o s es lim itante, ¿q u é ca n tid a d d e p ro d u c to se pu ed e
generar?
b ) ¿C u án ta s copias d el pro d u c to d e 5 0 0 p b s e p roduce?
16. U n stock d e Taq A D N p o lim e rasa tien e u n a co n c en tra ció n d e 5 unidades/pL .
¿Q u é ca n tid a d del s to ck h a y q u e a ñ a d ir a u n a reacción d e 50 p L p a ra que
c o n te n g a 2,5 u n id ad e s?
17. U n a A D N p o lim e rasa term o rresisten te d e Pyrococcus tien e u n a fid elid ad de
c o p ia d e u n erro r p o r c a d a 800 .0 0 0 nu cle ó tid o s polim erizados. U n a P C R con
u n a e fic ien cia d el 95% g en e ra u n p ro d u c to d e 70 0 pb. T ras 32 cic lo s de

am plificación, ¿cuál es el p o rc en taje d e pro d u c to q u e c o n te n d rá u n erro r de
incorporación?
18. L a tra n sc rip c ió n d el A R N m d e c-m yc se e s tu d ia en cé lu la s q u e h an
p a d e c id o e stré s térm ico . S e co lo c an 10 [xL d e ex tra cto c e lu la r d e c é lu la s
tra ta d a s en c a d a u n o d e lo s seis tu b o s d e u n a. E n c a d a tu b o se añ a d e un
A R N c o m p e tid o r, q u e tie n e la s m ism a s sec u en cia s d e u n ió n y u n a efi
c ie n c ia d e a m p lific a c ió n e q u iv a le n te a la se c u e n c ia d e c-myc, a ra zó n de
0, 5 0 , 100, 2 5 0 , 50 0 y 1 .0 0 0 co p ia s p a ra c a d a tu b o . S e u tiliz a la tran s-
c rip ta s a re v e rs a p a r a g e n e ra r u n A D N c en c a d a tu b o y d e sp u é s se añ a d en
to d o s lo s c o m p o n e n te s n e c e sa rio s p a r a la am p lifica ció n p o r P C R . El
p ro d u c to d e P C R d e c-myc m id e 4 0 0 p b . E l p ro d u c to g e n e ra d o p o r el
m o ld e c o m p e tid o r m id e 3 8 0 pb. T ras 2 0 cic lo s , lo s p ro d u c to s son a n a li
z a d o s p o r ele ctro fo resis e n g el d e ag a ro sa. E l g el se tiñ e y su fo to g ra fía es
es c a n e a d a p a ra m ed ir el n ú m e ro d e p íx e le s p re sen tes en c a d a b a n d a . Se
o b tie n e n lo s sig u ie n tes re su lta d o s. ¿ C u án ta s co p ia s d el A R N m d e c-myc
h a y en c a d a u n a d e la s alíc u o ta s d e 10 p L d e lo s e x tra c to s ce lu la re s d e las
cé lu la s trata d as?
Reacción Copias del Píxeles Píxeles

molde asociados con la asociados
competidor banda del gel con la banda
del producto del gel de
competidor producto
de c - m y c
1 0 0 15.630
2 50 2.820 13.870
3 100 6.460 7.650
4 250 12.220 4.320
5 500 16.850 1.490
6 1.000 25.270 410
RESPUESTAS
1. a ) 0 ,15 jxL d e la so lu ció n stock d e A D N
b) T om e 2 (xL d e la so lu ció n stock d e A D N m ás 2 3 ,2 jxL d el tam p ó n de
dilu ció n (v o lu m en d e dilu ció n to tal = 2 5 ,2 (xL) y co lo q u e 2 [xL d e esta
dilu ció n p a ra te n e r 50 n g d e A D N h u m an o en la m ez cla d e reacción de
PCR.
2. 6,9 x 1 0 10 copias
3 . 4 ,4 x 1013 am plicones
4. U n increm ento d e 5 ,6 x 106 veces.

5. 31 ciclos
6 . E fic ie n cia d el 9 3%
7 . 8 8,6 °C
8 . 3 3 ,1% d e G + C
9 . 1,5 pL d el s to ck d e ce b ad o r
10 . 6 x 1012 m oléculas d el ce b ad o r directo
11. 11,6 p g del pro d u c to d e P C R d e 7 0 0 pb
12. a ) S e in co rp o rará el 19% del ce b ad o r en el p ro d u c to d e P C R d e 800 pb.
b ) 35 ciclos
13. a ) 58 °C
b ) 65 °C
c) 6 0,9 °C
14. 0,8 p L d el s to ck d e dN T P
15. a ) 6,6 |_Lg d el pro d u c to d e la P C R
b ) 1,3 x 1013 copias
16. 0,5 pL d el s to ck d e la Taq A D N p o lim e rasa
17. E l 1,4% del p ro d u c to d e la P C R ten d rá b a se s m al em parejadas.
18. L a ecu ac ió n q u e co rresp o n d e a la re g resió n lineal es y = 1,8357.x — 3,8043:
Log Compet Log Comp/Tar

1 ./ -0.67
2 -0.05
2.4 0.47
2.7 1.08
3 1.81
E l extracto ce lu la r co n tien e 118 co p ia s del A R N m de c-myc p o r c a d a alícuota

d e 10 pL.
1. U n en sayo d e T aqM an se h a op tim iz ad o p ara d a r u n a reacción eficiente para

am p lifica ció n y dete cció n d el Gen A. B ajo u n p rim e r gru p o de co n d ic io n e s, se
o b tien e u n v a lo r d e C T d e 2 6 ,7 . B ajo u n s eg u n d o g ru p o d e condiciones,
utilizan d o la m ism a ca n tid a d in icial d e m olde, se o b tien e u n v a lo r d e C T de
23 ,6 . ¿C uál es el nú m ero d e v ec es d e in cre m en to en la ca n tid a d d e sec u en cia
am p lifica d a en el s eg u n d o gru p o d e co n d ic io n e s com p a rad o co n el g enerado
p o r el p rim er gru p o d e co n d ic io n e s?
2. ¿C uántas copias h a y p re sen tes d e u n g en de co p ia ú n ic a d ip lo id e en el últim o
tu b o d e la dilu ció n (c o n u n a co n c en tra ció n d e 0,0 2 3 n g /p L ) desc rito en el
P ro b lem a 9.2?
3 . U n plásm id o , q u e lle v a el g en d el a c tiv a d o r tisu la r d e p lasm in ó g en o (tPA),
tien e u n tam año d e 4 .9 5 6 pb. ¿C u án to s p g d e esta m o lécu la re com binante
re p rese n ta n un g en d e tPAl
4. ¿Q ué cantidad d el p lásm id o reco m b in an te descrito en el P ro b lem a 3 es
equ iv a le n te a 4 0 0 .0 0 0 co p ia s d el g en tPAl
5 . S e añ a d e u n a alícu o ta d e 5 pL d e p lásm id o reco m b in an te desc rito en el
P ro b lem a 3 a u n a re acc ió n d e P C R a tiem p o re al d e fo rm a q u e se colocan
4 0 0 .0 0 0 co p ia s d el g en tPA desc rito en el P ro b lem a 4. L a so lu ció n s to ck del
p lásm id o re co m b in an te tien e u n a co n c en tra ció n d e 5 (xg/(xL. L as diluciones
d eb e n te n e r u n vo lu m en final de 800 |xL. ¿Q u é dilu cio n es se p u ed e n h a c e r de
fo rm a q u e la ú ltim a te n g a la co n c en tra ció n q u e se nec e sita (co n tie n e 4 0 0 .0 0 0
co p ia s d el g en tPA en u n a a lícu o ta d e 5 pL )?
6. U n a P C R a tiem po re al de cuatro réplicas d e u n a m u estra arro ja los siguientes
re su lta d o s d e CT. ¿C u ál es la d esv iac ió n está n d a r d e este gru p o d e datos?
Número de la réplica de la muestra CT

1 32,84
2 32,68
3 32,76
4 33,04
7. Se v an a cuantificar u n as m uestras d e A D N desc onocidas m e

tiem po real utilizando u n a curva estándar. S e preparan y ensayan las diluciones
d el A D N h um ano estándar para u n g en d e copia única. L os resultados se
e28 © 2 0 1 2 . E ls e v ie r E s p a ñ a , S .L . R e s e rv a d o s to d o s lo s d e re c h o s.
m uestran en la siguiente tabla. U n a m uestra d e A D N d esconocida d a u n v alo r de

C t d e 29,36. S e debe representar u n a curva estándar utilizando el logaritm o
d e la concentración de A D N (en e l eje de abscisas) frente a las C p (en el eje de
ordenadas) y determ inar la concentración d e la m uestra d e A D N desconocida a
partir d e la ecuación d e la recta d e regresión d e la cu rv a estándar. (V éase el
A péndice A p ara sab e r cóm o utilizar la utilidad de E xcel para la cu rv a estándar.)
Concentración de ADN (ng/mL) CT promedio*
50 2 3 ,6 1
1 6 ,7 2 5 ,0 8
5 ,5 6 2 6 ,2 2
1 ,8 5 2 7 ,5 1
0 ,6 2 2 8 ,8 5
0 ,21 3 0 ,1 2
0 ,0 6 8 3 1 ,5 1
0 ,0 2 3 3 2 ,7 0
* Estos valores representan el prom edio de tre réplicas de cada dilución.
8. U n a P C R a tiem po real tien e u n a efic ien cia del 80% . Si se co m ien z a co n 500
m o lécu la s d e interés, ¿c u án tas m oléculas d e p ro d u c to se g enerarán tras 40
ciclos?
9. L a re g resió n lineal d e u n a cu rv a estándar, u tiliz ad a p a ra la cuan tific ac ió n de
A D N , tien e u n a p en d ie n te de —3,4 8 3 . ¿C u ál es la efic ien cia de am plificación
d e las reacciones u tiliz ad as p ara gen e rar la cu rv a estándar?
10. P a ra g en e rar u n a cu rv a e stán d a r co n u n a e fic ien cia d e reacción d el 90% ,
¿c u án to s v alo res d e C p d eb e h a b e r entre d os m uestras d e d ilu cio n es con
co n c en tra cio n es d e 1,85 n g /p L y 16,7 ng/(xL?
11. S e v a a h a c e r u n e n sa y o p ara a v e rig u ar el efecto q u e tien e la in fec ció n d e un
retrovirus, re cién d escubierto, so b re la ex p resió n d el fa cto r d e transcripción
GATA3 en lo s linfocitos T. S erá nec esario u n g en d e m an ten im ien to co m o
re feren cia d e la ex p resió n q u e n o se hallará afectad a p o r e l crecim iento del
v iru s. S e p re p ara n 2 4 cu ltiv o s celulares de lin fo cito s T. A tiem p o cero, se aísla
el A R N to tal de seis d e estos cultivos. A co n tin u ac ió n se infectan los cultivos
celulares co n el retrovirus y a l , 2 y 4 h s e a ísla el A R N to tal d e seis cultivos
en ca d a caso, se p a s a el A R N a A D N c y se v alo ra n tres m uestras d e cada
tiem p o p ara G APDH y otras tres m u estra s d e ca d a tiem p o p ara RNasaP. L os
resultados ob tenidos se m u estra n en la siguiente tabla. S e u tiliz a el A n á lisis de
V arianza (A N O V A ) d e u n solo fa cto r y e l estadístico F p a ra d ete rm in a r qué
gen, GAPDH o RNasaP, se v e m en o s afectado p o r la in fec ció n v iral, p o r lo
tan to serv iría c o m o m ejo r g en d e re feren cia p a ra este estudio. C alcule un
v a lo r d e p p ara c a d a estadístico F.
Muestra Gen Posición del CT

valorado pocilio
No infectado, t0 GAPDH Al 32,1

B1 32,5
Cl 31,8
1 hora postinfección DI 32,3
El 32,4
F1 31,9
2 horas postinfección G1 32,3
H1 32,2
A2 32,6
4 horas postinfección B2 32,5
C2 32,4
D2 32,3
No infectado, t0 RNasaP E2 28,7
F2 28,9
G2 29,1
1 hora postinfección H2 27,8
A3 27,6
B3 27,9
2 horas postinfección C3 26,3
D3 26,1
E3 26,5
4 horas postinfección F3 25,4
G3 25,8
H3 25,5
12. A n tes d e re alizar u n análisis d e la ex p resió n del g en p53 en re sp u esta a u n a

n u e v a d ro g a d iseñ ad a p a ra au m e n ta r su ex p resió n en las células d el p ulm ón,
se ev a lu ará la ex p resió n d el g en d e m antenim iento TOP1 p a ra sab e r su
utilidad co m o g en d e re feren cia (calibrador). C o m o se u tiliz ará el m étodo
d e A A C T , TOP1 d eb e te n e r u n a efic ien cia d e am p lifica ció n sim ilar a la de
p53 en las co n d ic io n e s ex p e rim en tales em pleadas. S e a ísla el A R N total, a
p artir d e c u ltiv o s d e células p u lm o n are s, y se co n v ie rte a A D N d , y las
ca n tid a d es q u e v a n d esd e 2 h a s ta 0 ,05 n g se en sa y an p o r trip lic ad o para
p53 y TOP1 p o r m ed io d e P C R a tiem po real. L o s re su lta d o s o b tenidos se
m u estra n en la s ig u ie n te tabla. D e te rm in ar si esto s d o s gen e s tien en u n a
efic ien cia d e am p lifica ció n sim ilar en las co n d ic io n e s experim entales u tili
zadas y si TOP1 sería u n b u en g en d e re feren cia p ara el experim ento
planteado.
Ejercicios adicionales - Capítulo 9 e3 l
ARN total inicial (ng) Valores de CT Valores de CT

para p53 para TOP1
2,00 26,40 25,22

2,00 26,36 25,18
2,00 26,42 25,26
1,00 27,40 26,42
1,00 27,42 26,36
1,00 27,44 26,35
0,05 28,36 27,64
0,05 28,34 27,62
0,05 28,34 27,64
0,02 29,84 29,02
0,02 29,81 29,00
0,02 29,83 29,04
0,01 30,85 30,42
0,01 30,81 30,44
0,01 30,86 30,30
0,05 31,84 31,43
0,05 31,81 31,60
0,05 31,78 31,65
13. S e re aliza u n estu d io p a ra a n a liz ar el efecto de tem p eratu ras ele v ad as sobre la
ex p resió n d el g en c-myc en p re sen cia d e u n n u ev o fárm aco. U n gru p o d e 10
m u estra s se llev a a 43 °C y tras 1 h d e in cu b a ció n a es a tem p eratu ra se extrae
el A R N to ta l y se co n v ie rte en A D N c p o r m ed io d e la tran sc rip tasa reversa.
C o m o co n tro l, se incuban o tras 10 m u estra s a 37 °C . S e o b tien e el A R N total
y se p ro c e sa d e la m ism a fo rm a q u e las m u estra s so m etid as a calor. A m b o s
g ru p o s d e m u estra s h an sido trata d o s en pre sen cia d el n u ev o fárm aco.
RNasaP se u tiliz a co m o re feren cia interna. RNasaP y c-myc se cuantifican
¿ en po cilio s p o r separado. L o s re su lta d o s ob tenidos se m u estra n en la siguiente
f tabla. U tilizando e l 2 -AACT, ca lcu lar el ca m b io rela tiv o d el nú m ero d e veces
« d e la ex p resió n d e c-myc en las m u estra s so m etid as a tem p eratu ra elevada.
1 (C alc u la r los m árg e n es d e erro r a u n n iv el d e co n fia n za d el 99% .)
1
Tratamiento Pocilio C j de c-myc Pocilio CT de
RNasaP
37 °C Al 27,4 F1 26,4
B1 28,1 G1 26,7
CI 27,6 H1 26,2
DI 27,8 A2 26,5
El 27,7 B2 26,2
(continúa)
Tratamiento Pocilio CT de c-myc Pocilio CT de

RNasaP
43 °C C2 32,3 H2 25,9
D2 32,5 A3 26,1
E2 32,4 B3 26,5
F2 32,7 C3 26,0
G2 32,6 D3 26,6
14. S e está m id ie n d o la ex p resió n d e c-myc en células d e co razó n y cerebro. El

g en RNasaP se u tiliz a c o m o re feren cia y las células d e co razó n co m o cali
brador. S e o b tien e el A D N c a p artir d el A R N to tal aislad o d e am b o s tipos
celulares. S e an alizan cuatro réplicas p ara ca d a u n o d e lo s tip o s celulares
utilizan d o u n a so n d a m arc ad a en az u l p ara c-myc y u n a so n d a m arc ad a en
v erd e p ara RNasaP. L o s resultados o b ten id o s se m u estra n en la sig u ien te
tabla. C alcular, utiliz an d o el m éto d o 2 _AACT, el cam b io d el nú m ero d e veces
d e la ex p resió n d e c-myc en las células d e cerebro com p a rad o co n su
ex p resió n en las células d e co razó n . (C alc u la r el m arg e n d e erro r co n u n
intervalo d e co n fia n za d el 99% .)
Tipo celular Pocilio CT de c-myc CT de RNasaP
Corazón Al 32,8 28,4

B1 32,4 28,6
Cl 32,6 28,3
DI 32,7 28,2
Cerebro El 24,5 28,5
F1 24,4 28,7
G1 24,6 28,1
H1 24,2 28,4
15. S e re aliza u n en sayo d e cu ltiv o ce lu la r d e la re sp u esta del g en d e TNF-a a u n

nu ev o fárm aco. L a ex presión d e RN asaP se u tiliz a com o control interno. Se
to m an m uestras a 0 , 2 y 4 h tras la ex p o sició n al fárm aco, ob ten ién d o se el
A D N c a p a rtir d el A R N to tal m ed ian te el u s o d e la tran sc rip tasa reversa. El
TNF-a se estu d ia p o r m edio d e u n a P C R a tiem po re al u tiliz an d o u n a sonda
m arc ad a en azul. RN asaP se an a liz a u tiliz an d o u n a so n d a m arc ad a en verde.
L o s re su lta d o s o b ten id o s se m u estra n en la sig u ien te tabla. U tiliz an d o el
tiem po cero co m o ca lib rad o r y el m éto d o 2 ~ AACT, c a lcu lar el n ú m ero de
v ec es q u e c a m b ia la ex p resió n d el g en d e TNF-a n o rm aliza d a resp ecto a la
ex p resió n d e RNasaP y re la tiv a al tiem po cero p a ra las ex p o sicio n e s al
fárm aco d e 2 y 4 h . C alcu lar la d esv iac ió n e stán d a r y la cv p ara ca d a uno
d e lo s tres tiem pos.
Muestra Pocilio Tiempo (h) CT de TNF-a CT de

RNasaP
1 A1 0 23,2 28,2
2 B1 0 23,6 28,0
3 C1 0 23,3 28,4
4 D1 0 23,4 28,1
5 E1 2 25,6 28,3
6 F1 2 25,4 28,2
7 Gl 2 25,5 28,3
8 H1 2 25,4 28,5
9 A2 4 34,6 28,3
10 B2 4 34,8 28,1
11 C2 4 34,7 28,2
12 D2 4 34,6 28,4
S e d e te rm in a la e x p re s ió n re la tiv a d e c-myc e n tre s tip o s d e te jid o s

d iferen tes: a d ip o so , p u lm ó n y m ú scu lo . L a RN asaP se u tiliz a rá co m o
re feren cia . E l A R N (p ro d u c to co m e rcial) se co n v ie rte e n A D N c , s e re aliza
u n a d ilu c ió n seria d a, y s e an a liz a n c-myc y RN asaP p o r s e p a ra d o en d os
p la c a s ó p ticas d e m ic ro titu la c ió n d ife re n te s p a ra la g en e rac ió n d e cu rv as
d e c a lib ració n p a ra c a d a g en . U n n an o g ram o d el A R N to ta l d e cada
m u e s tra d e lo s tres tip o s d e te jid o s se co n v ie rte en A D N c m ed ian te la
tra n s c rip ta s a re v e rs a y la s alíc u o ta s se d is p e n s a n en las m ism a s p lac as q u e
s e u tiliz a n p a ra g e n e ra r las c u rv as estándar. U n a d e la s p la c a s s e an a liz a
p a ra c-m yc y la o tra p a ra RN asaP p o r P C R a tiem p o real. E s ta s m u estra s
s e an a liz a n p o r trip lic ad o . L o s p o c ilio s d e A l a F 2 d e c a d a p la c a se
re s e rv a n p a ra el A R N d ilu id o p a r a g e n e ra r las c u rv as e s tá n d a r p a ra ca d a
g en . L o s p o c ilio s d e G 2 a G 3 c o n tie n e n el A D N c d e lo s tres d iferen tes
tip o s d e tejid o s. L o s re su lta d o s o b te n id o s s e m u e stra n en la sig u ie n te
tab la. U tiliz a n d o el m éto d o d e la C u rv a E s tá n d a r R elativ a, c a lc u la r los
n iv eles re la tiv o s d e tra n sc rip c ió n d e c-m yc en el te jid o a d ip o so , lo s
p u lm o n e s y la s cé lu la s m u scu lares. ¿ C u ále s son lo s n iv e le s de
tra n sc rip c ió n d el g e n c-myc en re la ció n a s u ca n tid a d e n el te jid o ad ip o so ?
A s e g ú re s e d e c a lc u la r la s d es v ia c io n e s e s tá n d a r p a ra c a d a ca m b io n o rm a
lizad o d e l n ú m e ro d e v e c e s d e la c a n tid a d d e c-myc.
ng de ARN* Placa 1 CT de Placa 2 CT de

(ensayo c-myc (ensayo RNasaP
de c-myc) de
RN asaP )
2 A1 25,5 Al 23,3
2 B1 25,6 B1 23,5
1 CI 26,5 CI 24,4
1 DI 26,6 D1 24,5
0,5 El 27,6 El 25,5
0,5 F1 27,7 F1 25,7
0,2 G1 28,8 G1 26,9
0,2 H1 29,2 H1 27,0
0,1 A2 29,8 A2 28,0
0,1 B2 30,1 B2 27,8
0,05 C2 31,0 C2 28,9
0,05 D2 31,2 D2 29,1
0,025 E2 31,9 E2 29,8
0,025 F2 32,2 F2 29,9
1 ng de ADNc en adiposo G2 26,2 G2 29,5
1 ng de ADNc en adiposo H2 26,0 H2 29,3
1 ng de ADNc en adiposo A3 26,3 A3 29,1
1 ng de ADNc en pulmón B3 23,1 B3 29,5
1 ng de ADNc en pulmón C3 23,3 C3 29,4
1 ng de ADNc en pulmón D3 23,5 D3 29,4
1 ng de ADNc en músculo E3 29,4 E3 29,3
1 ng de ADNc en músculo F3 29,5 F3 29,6
1 ng de ADNc en músculo G3 29,3 G3 29,5
‘ El a u to r es consciente de que cada dilución de la curva estándar debe analizarse, a l menos, por
triplicado. Sin em bargo, p o r razones de espacio sólo se presentan dos muestras de cada dilución.
17. S e an a liz a el n iv el d e ex presión d el g en tPA en relación c o n el d e RNasaP

(el g en de re feren cia p a ra este ex p e rim en to ) en células m usculares cultivadas
en u n m ed io experim ental. S e aísla el A R N to tal d e las células m usculares
cu ltiv ad a s y se co n v ie rte a A D N c p o r tran sc rip ció n reversa. L o s genes d e tPA
y RNasaP s e an a liz an d e fo rm a sim u ltán e a p o r P C R a tiem po real utilizando
su s p ro p io s ce b ad o re s y so n d as m arc ad a s en ca d a u n o d e los cu a tro po cilio s
d e u n a p lac a óp tic a d e m icrotitulación. S e o b tien en los re su lta d o s m ostrados
en la s ig u ie n te tabla.
Pocilios CT de tPA CT de RNasaP
Al 29,3 26,2
B1 29,4 26,0
Cl 29,2 25,9
DI 29,3 25,8
L as cu rv as d e am p lifica ció n p a ra ca d a g en , en ca d a u n o de lo s cuatro pocilios,

se su perponen. L a sig u ien te fig u ra m u estra la cu rv a d e am p lifica ció n p a ra el
p o cilio A l .
Rn frente a ciclo
U tiliz an d o la apro x im a ció n de la cin é tic a d e la re acc ió n de L iu y S ain t (2002),

calcule la ex p resió n re la tiv a d e tPA com p a rad a c o n la de la RNasaP (véanse
las p ág in a s 294-296).
18. S e estu d ia la ex p resió n d e d os genes, TNF-a (el g en d e e stu d io ) y RNasaP
(el g en d e referencia), en leucocitos en p re sen cia de u n n u ev o tipo d e m edio
d e cultivo. Se a ísla el A R N to tal y se co n v ie rte a A D N c y se an alizan lo s dos
gen e s d e fo rm a sim u ltán e a en el m ism o p o cilio , utiliz an d o sus pro p io s pares
d e ce b ad o re s y sondas. E n u n u m b ral fijad o a 1,34 R„, el TNF-a tien e u n v a lo r
d e C t d e 3 0,5 y la RNasaP tien e u n v a lo r d e C t d e 26 ,2 (véase la siguiente

figura).
R„ frente a ciclo
U tilic e el m éto d o Ro para ca lcu lar la d iferen c ia del n ú m ero d e vec es d el nivel
relativo d e la ex p resió n d e estos d o s genes.
19. S e re p ite el ex p e rim en to d e sc rito en el P ro b le m a 18, p e ro e s ta v e z la c u rv a
e s tá n d a r p a ra TNF-a y RN asaP se g e n e ra u tiliz a n d o u n A D N h u m a n o
co m e rcial. L a ec u ac ió n d e la re c ta d e re g re sió n p a ra la c u rv a está n d a r de
TNF-a es y = —3,34x + 2 4 ,6 3 . L a e c u a c ió n d e la re c ta d e re g re sió n p a ra la
c u rv a e s tá n d a r d e RN asaP e s y = —3 ,4 2 x + 2 6 ,2 8 . A ju stan d o la lín e a de
u m b ral a 1 ,34 R„ p a ra la c u rv a d e a m p lific a c ió n d e u n p o c ilio e n e l cu a l se
h a an a liz a d o d e fo rm a s im u ltá n e a ta n to TNF-a c o m o RN asaP o b ten e m o s
u n v a lo r d e C t d e 3 1 ,2 p a ra TNF-a y 2 7 ,7 p a ra RNasaP. U tiliz a n d o el
m é to d o d e R 0 in c o rp o ra n d o la s efic ien cia s d e am p lifica ció n , c a lc u la r la
d ife re n c ia e n el n ú m e ro d e v e c e s d e c a d a u n o d e lo s d o s g e n e s e n las
ca n tid a d e s d e A D N c.
20. S e estu d ia el efecto d e u n a in fec ció n viral so b re la ex p resió n del g en de IL-12

en células cultivadas en u n m edio experim ental. L a ex presión d e la (3-actina
sirv e c o m o referencia. A n tes d e la infección (tiem p o t0) se ex tra e el A R N de
m u estra s, se p a s a a A D N c y se d isp en sa en los po cilio s d e u n a placa
d e m icrotitración. S e d e ja q u e el v iru s infecte a células d e p u lm ó n en cultivo
y 3 h m ás tard e (t¡ horas), se ex tra e el A R N to tal y se co n v ie rte en A D N c. L as
m u estra s d e A D N c, p a ra IL-12 y (3-actina antes y 3 h desp u é s d e la infección
se an alizan d e fo rm a sim ultánea e n lo s m ism o s p o cilio s u tiliz an d o los ceba
d o re s y so n d as específicas. L o s perfiles d e am plificación d e lo s d os pocilios,
u n o que re p rese n ta to y el otro t3, se m u estra n en la siguiente figura.
A partir d e u n a cu rv a estándar, se determ ina q u e la eficiencia d e am plificación
d e IL-12 es d e 1,95. P o r m edio d e u n a segunda curva estándar, se av e rig u a que
la eficiencia de am plificación p ara la (3-actina es d e 1,98. P rom ediando diver
sos pocilios o b tenem os lo s resultados que se m uestran en la siguiente tabla.
Gen Condición experim ental CT promedio
IL-12 Antes de la infección viral (t¿) 26,18

IL-12 3 horas postinfección (t3 horas) 33,15
(3-actina Antes de la infección viral (to) 30,45
(3-actina 3 horas postinfección (t3 horas) 30,47
U tilic e el m o d elo de Pfaffl p a ra c a lcu lar el efecto d e la infección viral so b re la

ex p resió n d el g en IL-12.
RESPUESTAS
1. C o n el seg u n d o g ru p o d e co n d ic io n e s se o btiene u n increm ento d e 8,6 v ec es
d e la s ec u en cia am plificada.
2. A lre d ed o r d e 2 0 0 co p ia s d el gen.
3 . 5,43 x 10_6 p g
4. 4 0 0 .0 0 0 copias d el g en tPA es equ iv a le n te a 2 ,2 p g d el plásm ido
recom binante.
5. Q u e rem o s term in ar co n u n tu b o q u e co n tien e 80 0 p L d e A D N co n u n a
co n c en tra ció n d e 0 ,4 4 pg/(xL. E sto se p u ed e o b ten e r co n las sig u ien tes d ilu
ciones (la co n c en tra ció n d e ca d a d ilución, en p g /p L , se escribe debajo d e c a d a
d ilución):
5 x 106 p g 7 pL 8 pL 8 pL 80 pL
pL X 800 p E X 80 0 p L X 8 0 0 p L X 800 pL
sto ck 4 4 .0 0 0 440 4 ,4 0,44
P o r lo tan to , 5 p L d e la ú ltim a dilu ció n d e esta serie co n te n d rán 400 .0 0 0

co p ia s d el g en clo n a d o tPA. (H ay nu m ero sa s p o sib ilid ad e s d e variaciones
p ara h a c e r la dilu ció n seria d a aparte d e la m o strad a aquí.)
6. 0 ,15 ciclos
7.
Curva estándar y - -2,7178x + 28,281
Rz = 0,9997
Logaritm o de la concentración del ADN (ng/pl)
L a m u estra d esc o n o cid a tien e u n a co n c en tra ció n d e 0 ,38 ng/pL .

8. 8,13 x 1012 m o lécu la s d el p roducto
9 . U n a efic ien cia del 9 3 ,7%
10. H a de h a b e r valo res d e 3,43 C T entre m u estra s q u e tien en u n a co ncentración
d e 1,85 n g /p L y 16,7 n g /p L en u n a re acc ió n c o n u n a e fic ien cia d el 90% .
11. L a h ip ó tesis n u la q u e se p ru e b a es q u e no h a y d iferen c ia en lo s v alo res m edios

d e C t p a ra las m uestras to m ad as a las 0 , 1, 2 y 4 h o ra s tras d e infección.
C u alq u ier d iferen c ia q u e se ob serv a es e l re su lta d o d e la casualidad.
E l estadístico F p a ra G A P D H es 0 ,8 4 0 8 . E l estadístico F para la RNasaP es
72 ,4 3 5 4 . E l v a lo r estadístico F crítico p ara u n n u m era d o r co n tres g rados de
libertad y u n d e n o m in ad o r co n och o g ra d o s de lib ertad es 4,0 7 . P u esto que el
estad ístico F p ara G A P D H es d e 0 ,8 4 0 8 y es m e n o r q u e el v a lo r crítico de
4,0 7 , la h ip ó tesis n u la p u e d e se r a c ep tad a y se pu ed e co n c lu ir q u e la infección
viral no tien e n in g ú n efecto so b re la ex p resió n d e G A P D H h a s ta 4 h o ra s
d esp u é s d e la in fec ció n viral. S in em b a rg o , dad o q u e el estadístico F de
7 2 ,4 3 5 4 p ara la RN asaP es m a y o r q u e el v a lo r crítico, deb e m o s re ch az ar
la h ip ó tesis n u la y co n c lu ir q u e la in fec ció n viral tien e u n efecto so b re la
ex p resió n d e la RNasaP. E l estad ístico F p a ra G A P D H tien e u n v a lo r de p de
0 ,5 0 8 8 , lo q u e sig n ifica q u e h a y u n a p o sib iü d a d d el 50 ,8 8 % d e q u e el
m u estre o aleatorio d aría u n a d iferen c ia e n tre las m edias d e las m u estra s tan
g ra n d e o m ay o re s q u e las o b servadas. E l estadístico F p a ra el conjunto de
d ato s d e la RNasaP tien e u n v a lo r de p d e m en o s d e 0 ,0 0 0 1 , lo q u e sig n ifica
q u e sólo h a y u n a p o sib ilid ad d el 0 ,01% d e q u e u n ex p erim en to co m o éste
d ie se u n estad ístico i 7 su p erio r a 72 ,4 3 5 4 , si en re alid ad no h a b ía efecto d e la
ex p resió n v iral en la ex presión d e la RNasaP. P o r lo tan to , G A P D H , y a que
está re lativam ente p o co afecta d a p o r las infecciones virales, serv iría co m o la
m ejo r o p ció n p ara su u s o com o u n g en d e referencia.
ng Inp ut RN¿ Log ng CT Yerr

2 0.3 0 1 0 3 1.1 6 0.0 8
1 0 1.0 4 0.0 7
0 .5 -0 .3 0 1 0 3 0 .7 2 0.0 1
0 .2 - 0 .6 9 8 9 7 0.8 1 0.0 4
0.1 -1 0 .4 5 0.0 9
0 .0 5 -1 .3 0 1 0 3 0 .2 5 0.1 8
12. C o m o la p en d ie n te d e esta lín ea (0,5 4 8 8 , v éa se an teriorm ente) es su p erio r a

0,1 (tal co m o se describ e en el tex to es el va lo r d e co rte o rientativo), po d em o s
co n c lu ir q u e p5 3 y TOP1 tien en u n a e fic ien cia d e am p lifica ció n su ficie n te
m en te diferente en las co n d ic io n e s de este ex p erim en to y q u e TOP1 n o es u n a
b u e n a elecció n co m o g en d e referencia.
13. L a cantidad n o rm aliza d a d e c-myc en las células incubadas a 37 °C en
relación a sí m ism o tien e u n ra n g o d e 0,7 a 1,5. E n las células trata d as con
calor, el g en c-myc se e x p resa a u n n iv el d e 22 a 4 7 v ec es m en o s q u e el del
calibrador.
14. E l g en c-myc se e x p resa 315 v ec es m ás en las células d e l ce reb ro q u e en las
células d el co razó n c o n u n ra n g o d esd e 208 a 47 8 v ec es m ás. E l v alo r
n o rm alizado d e c-myc e n el c o razó n en relación a l m ism o co razó n tien e u n
ra n g o q u e o scila d e 0 ,7 a 1,5 veces.
15. A t = 0, el pro m ed io del va lo r 2 _AACT e s 1,02 con u n a d esv iac ió n están d a r de
0,21 y u n C V d e 20,9. T ras 2 h d e ex p o sició n al fárm aco, la ex presión de
TNF-a es 3,9 v ec es in ferio r a la d el tiem po to (c o n u n a d esv iac ió n están d a r
d e 0,4 7 y u n C V d e 12,1). T ras 4 h d e ex p o sició n al fárm aco, la ex p resió n de
TNF-a e s 2 .4 1 5 v ec es in ferio r a la d el tiem p o t0 (c o n u n a d esv iac ió n están d ar
d e 377 y u n C V d e 15,6).
16. C u an d o se re p rese n ta n las d ilu cio n es seriadas, las rectas d eb e n te n e r el
sig u ien te aspecto. E l en sayo p a ra c-myc d eb e d a r u n a re cta cu y a ecuación
es>> = —3,4292x + 26,581. L a cu rv a están d a r d e RNasaP d eb e d a r u n a re cta
c u y a ecu ac ió n es,y = —3,4136x + 24,491.
::" v“
°o?o\°ol S2 i" !s:s“” s¡
l lli
íi§¡ 1
i s i
Ejercicios adicionales - Capítulo 9 e4l
L o s niv eles d e la ex p resió n d e c-myc, no rm aliza d o s resp ecto a la RNasaP, en

lo s tres tipos d e tejid o s tie n e n lo s sig u ie n tes valores:
Tejido c-m yc RN asaP c-m yc

normalizado
respecto a
RN asaP
A diposo 1,32 ± 0,14 0,04 ± 0,01 33 ± 8,91

P ulm ón 9,11 ± 1,22 0,04 ± 0,01 2 28 ± 63,84
M úsculo 0,15 ± 0,01 0,03 ± 0,01 5 ± 1,7
C u an d o se co m p a ran los n iv eles no rm aliza d o s d e c-myc en re la ció n co n los

del m ú scu lo , se o b tien en lo s sig u ie n tes valores:
Tejido c-m yc normalizado en relación a adiposo
A diposo 1,0 ± 0,27

Pulm ón 6,9 ± 1,9
M úsculo - 6 , 6 ± 2,2
P o r lo tan to , cu a n d o se n o rm alice re sp ecto a la RNasaP, el g e n c-myc se

tran sc rib e 6,9 v ec es m ás en las células d el p u lm ó n y 6 ,6 v ec es m en o s en las
células del m ú scu lo en re la ció n a su ex p resió n en el tejid o adiposo.
17. L a re sp u esta a este p ro b lem a p u ed e te n e r c ie rta varia b ilid a d dep e n d ien d o
d e dó n d e se asig n en en la cu rv a las posicio n es « A » y «B ». E n este ejem plo de
so lu ció n d el pro b lem a , se esc o g en las p o sicio n es 1,84 y 2 ,8 4 en el eje R„,
d eb id o a q u e son v alo re s que se h allan d en tro d e la p arte ex p o n e n cial d e las
curvas. L o s valo re s co rresp o n d ien te s q u e in terse ccio n an co n el eje h orizontal
p a sa n d o p o r la cu rv a son lo s sig u ie n tes n ú m ero s d e cic lo s (C t):
Gen « „ ,A fln,B C t ,a C t ,b
tP A 1,84 2,84 31,1 33,0

R N asa P 1,84 2,84 27,5 29,5
U tiliz an d o estos v alo re s, la tPA se e x p re sa 3,3 ± 0 ,1 2 v ec es m en o s q u e la

RNasaP.
18. E l TNF-a se ex p resa 19,3 v eces m en o s q u e la RNasaP.
19. E l A D N c d e TNF-a es 17 v ec es m en o s ab u n d a n te q u e el d e la RNasaP.
20 . L a ex p resió n d e la IL-12 h a dism in u id o 104 v ec es en relación al v a lo r d e la
[3-actina.
1. S e h a pu rific ad o u n plásm id o d e c lo n a ció n q u e se deb e co rta r co n la en d o n u

cle a sa d e re stric ció n E coR I. E l sto ck de plásm id o tien e u n a co n c en tra ció n de
32 0 (ig/m L. L a en z im a E coR I tien e u n a co n c en tra ció n d e 2 .0 0 0 u n id ad e s/
m L . S e q u iere co rta r 2 p,g d e plásm id o co n 3,5 u n id ad e s d e E coR I en u n a
re acc ió n d e 50 pL. ¿Q u é v o lu m en d e p lásm id o y EcoR I se d eb e n utilizar?
2. ¿C o n q u é frecu e n cia se p u ed e esp e rar en c o n trar la d ia n a d e re stric ció n de
M bo I, G A T C , en u n a s ec u en cia d e A D N al azar?
3 . ¿ C u án to s p ico m o les d e extrem os h a y en 2 p g d e u n frag m en to d e 4 5 0 pb?
4. E l b ac terió fa g o X, u n a m o lécu la d e A D N cd lin eal (c u an d o los extrem os
coh e siv o s n o están em p a rejad o s) tien e siete dian a s d e re co n o cim ien to p o r
la en z im a d e restricción Hind ID. E l g e n o m a d e X tien e 4 8 .5 0 2 p b . Si se cortan
2 p g o f X co n Hind III, ¿c u án to s p ico m o les d e extrem os se pro d u c en ?
5. S eis p g de u n có sm id o circ u lar de 45 .0 0 0 p b s e cortan p o r och o dian a s co n la
en z im a d e re stric ció n P st I. ¿ C u án to s p ico m o les d e extrem os se pro d u c en ?
6. S e h an aislad o fragm entos B a m ü \ d e la d ig estió n d el A D N d e Bos taurus.
L o s fragm entos p u rific ad o s tien en en pro m ed io u n tam añ o d e 15.000 p b y
u n a co n c en tra ció n d e 50 0 p,g/mL. S e h a n d e lig ar esto s fragm entos en el
v e c to r d e clo n a ció n X EM B L3 en u n a re acc ió n d e 100 pL. L o s ex tre m o s de
X EM B L3 están a u n a co n c en tra ció n d e 75 0 pg/m L . ¿Q ué v o lu m en d e frag
m en to s BamYH y q u é v o lu m en d e extrem os d el v e c to r X EM B L3 h a y que
u tiliz ar en la reacción d e lig ació n p a ra te n e r u n a re la ció n m o lar d e 2:1 entre
lo s extrem os d e lo s insertos y d el vector?
7 . ¿Q u é ca n tid a d del v e c to r X EM B L3 se d eb e co rta r p a ra g en e rar la cantidad de
ex tre m o s n ecesarios en el P ro b lem a 6?
8. L a reacción de ligación d e 100 pL , descrita e n e l P roblem a 6 , se añade a 300 pL
d e extracto d e em paquetam iento. T ra la inoculación, se extraen 5 p L y se
diluyen en 500 p L co n tam pón d e dilución. E sta m uestra dilu id a se diluye de
nuevo, 10 p L e n 10 m L y 10 p L de la ú ltim a dilución se extienden en u n placa
co n u n cultivo d e E. coli en fase logarítm ica. T ras la incubación d e u n a noche a
37 °C , aparecen 2 7 0 calvas. ¿C u ál es la eficiencia de em paquetam iento?
9. U n p lásm id o d e 3 .6 8 2 p b se co rta p o r s u ú n ic a d ian a Hind III. E l plásm ido
dig erid o tien e u n a co n c en tra ció n d e 2 0 0 pg/m L . S e d eb e lig ar u n fragm ento

d e A D N de 6.9 7 6 pb co n el p lásm id o co rta d o en u n v o lu m en final d e reacción

d e 100 [íL. E l frag m en to d e A D N tien e u n a co n c en tra ció n d e 500 p,g/mL.
¿Q ué v o lú m en es de plásm id o y de fragm ento se deb e n m ez clar p ara ten e r u n a
ó p tim a p ro d u c ció n de reco m b in an tes? (E n esta reacción, i d eb e se r tres vec es
m ay o r q u e el v e c to r j.)
10. U n a reacción d e ligación d e 100 |xL co n tien e 2 5 0 n g d e u n v ec to r de
clonación q u e llev a el g en d e la re sisten c ia a la k anam icina. S e añaden
2 |¿L d e la re acc ió n d e lig ació n a 100 p L d e células com petentes. T ras el
sh o ck térm ico , se añ a d en 898 p L de m edio d e L u ria y el cultivo es incubado
du ra n te 60 m in antes d e e x te n d er en 25 |xL so b re u n a p lac a c o n kanam icina.
T ras u n a n o ch e d e in cubación, su rg e n 315 co lo n ias en la placa. ¿C u ál es la
efic ien cia d e tran sfo rm ac ió n (en tran sfo rm an tes p o r p,g d e A D N )?
11. S e u tiliz a u n v e c to r có sm id o p ara c lo n a r frag m en to s del g en o m a d el arroz
(3,9 x 108 pb ). S e qu iere ais la r el g en S N O R K E L 2 a partir d e u n a lib rería de
fragm entos d e 4 5 .0 0 0 pb. ¿C u án to s clones ind ep e n d ie n tes h a y q u e an a liz ar
p a ra te n e r el 9 9 % d e po sib ilid ad e s d e ais la r el g en q u e interesa?
12. S e p re p ara u n a lib rería d e A D N c, q u e re p rese n ta a 3 0 0 .0 0 0 m o lécu la s de
A R N m , a p a rtir d e células d e p u lm ó n . U n g en determ in ad o tien e u n a
co n c en tra ció n d e 25 transcritos p o r célula. ¿ C u án to s clones h a y q u e an a liz ar
p a ra te n e r u n 99 % d e p robabilidades d e e n c o n trar al m en o s u n re com binante
q u e c o n te n g a ese gen?
13. U n g en d e Vibrio cholerae, involucrado en su v irulencia, tien e u n tam añ o de
1.700 pb. F rag m en to s tro ce ad o s d e g e n o m a d e la b ac teria se c lo n a n en un
v e c to r de expresión. ¿C u ál es la pro p o rció n d e re co m b in an tes q u e ten d rá n el
g en de la v iru len c ia en fase co n la sec u en cia q u e co d ific a la pro teín a ? ( Vibrio
cholerae tien e u n g en o m a d e 4 m egabases [M b].)
14. U n a so n d a tien e la s ig u ie n te secuencia:
CTA A TCG CA TCCG A TCG A TTCA TG A G A T
S i se u tiliz a la so n d a para d ete ctar u n seu d o g é n en u n clon re co m b in an te p o r

m edio d e h ib rid ac ió n en I X S S C (N aC I 0,15 M, C itrato N a3 0,015 M ) y
fo rm a m id a al 2 4 % , ¿ q u é tem p eratu ra h ay q u e u tiliz ar p a ra llev ar a cabo la
re acc ió n ? (L a so n d a p o see d os b ase s n o co in cid en tes co n el seu d o g én .)
15. U n frag m ento d e 34 0 p b d e P C R desn a tu ralizad o se u tiliz a co m o so n d a para
id en tifica r u n c lo n re co m b in an te p o r h ib rid ac ió n en I X S S C y fo rm a m id a al
40% . E l fragm ento d e P C R tien e u n co n te n id o e n G /C d el 58% . ¿A qué
tem p eratu ra h a y q u e re alizar la hib rid ac ió n ?
16. U n a so n d a de 10 nu cle ó tid o s se u tiliz a p a ra id en tifica r u n clon re com binante
d e u n a lib rería d e u n a b ac teria q u e tien e u n tam añ o d e g en o m a de 4 M b. ¿E n
cuántas posicio n es se p u ed e esp e rar q u e anille esta sonda?
17. ¿Q u é tam añ o d eb e ría te n e r u n o lig o n u d e ó tid o p ara q u e h ib rid ara en cinco

lu g ares d el g e n o m a h u m an o al azar? S e d eb e asu m ir u n g en o m a hu m a n o de
1,8 x 10“ pb.
18. U n a so n d a de 25 nu cle ó tid o s p ara d ete ctar p o r h ib rid ac ió n u n a co lo n ia en un
filtro y co n u n co m p leto aju ste co n la sec u en cia d el g en se d eb e detectar. L a
h ib rid ac ió n se d e b e re alizar en p re sen cia d e N aC I 0,5 M a la tem p eratu ra
ad e cuada. E n la so lu ció n d e h ib rid ac ió n el o lig o n u d e ó tid o está a u n a
co n c en tra ció n d e 5 0 ng/m L . ¿C u án d o se h a b rá realizado la m itad d e la
h ib rid ac ió n ? (A su m a que, en la p ráctica, la re acc ió n se h a b rá com p leta d o a
la m itad, tran sc u rrid o cuatro v ec es m ás d e tiem p o q u e el teóricam ente
ca lculado.)
19. S e qu iere id en tifica r u n g en a p a rtir d e u n a lib rería reco m b in an te p o r m ed io de
h ib rid ac ió n co n u n a m ez cla d e so n d as diseñadas a p a rtir d e u n seg m en to d e la
p ro teín a del gen q u e tien e la sec u en cia
G lu A sn C y sP h e lle T rp T y rH is
S e llev ará a ca b o la h ib rid ac ió n d e la lib rería reco m b in an te co n 50 n g /m L de

la so n d a en clo ru ro só d ico 0,5 M a u n a tem p eratu ra d e v ario s g ra d o s p o r
d ebajo d e la Tm d e la m ez cla d e sondas. ¿C u án d o se h a b rá co m p leta d o la
m itad d e h ib rid ac ió n ? (S e asu m e q u e la h ib rid ac ió n re al d u ra cuatro v ec es
m ás q u e el t \¡2 calculado.)
20 . S e utilizarán 2 5 0 n g d e u n a so n d a d e A D N cd d e 2 .5 0 0 p b , o b ten id a p o r
traslació n d e m ella, d isu elto s en 20 m L d e tam p ó n d e h ib rid ac ió n p ara tratar
u n filtro re su lta n te d e u n a tran sfere n cia d e colonias. L a h ib rid ac ió n se
re alizará a 68 °C . ¿C u án d o se h a b rá com p leta d o la hib rid ac ió n ?
21. D o s pro d u c to s d e P C R , q u e se clo n a ro n en u n v ec to r plasm íd ic o , se h an
m ez clad o y se sep a ran en u n g el de p o liacrila m id a p a ra a n a liz ar s u integridad
y p a ra ase g u rarse d e q u e son d el tam añ o correcto. E n u n carril a d y a ce n te se
c a rg a u n a esc ala d e 50 p b (v é ase la fig u ra siguiente). L as b an d a s d e 50 p b de
la esc ala están señ a la d as y sus dista n cias d e m igración d esd e el p ocilio están
definidas. U n p ro d u c to d e P C R (b a n d a 1) m ig ra 5,9 cm d esde el pocilio. El
o tro p ro d u c to d e P C R (b a n d a 2 ) m ig ra 5,45 cm d esd e el p o cilio . U tilice
M icro so ft E xcel p a ra d ete rm in a r la ecu ac ió n d e la re cta q u e m e jo r se aju sta
a la esc ala d e 50 p b (logaritm o de los p b fren te a cm desde el po cilio ) y utilice
la ecu ac ió n p ara c a lcu lar el n ú m ero d e p ares d e b ase s d e las b an d a s 1 y 2.
22. S e q u iere crear u n a dele ció n d e 6.0 0 0 pb (3 .000 pb p o r ca d a ex trem o ) en un
có sm id o de 43 .5 0 0 p b utiliz an d o B A L 31. S e co rta n 10 p,g del cósm ido p o r la
p arte central d el seg m en to d e A D N q u e se qu iere delecionar. S e añ a d en 0,5
u n id ad e s d e B A L 3 1 a u n a re acc ió n d e 100 \\L. ¿C u án to s m inutos se debe
d e ja r la re acc ió n a c tiv a an te s d e a ñ a d ir el E G T A p ara p ararla?
RESPUESTAS
1 . U tilic e 6,25 p L d el p lásm id o y 1,75 p L d e la en z im a E coR I.
2. D e b ería h a b e r u n a d ia n a M bo I ca d a 2 5 6 b ase s, en pro m ed io , a lo largo de u n a
m o lécu la d e A D N .
3 . 13,5 p ico m o les d e ex tre m o s d e A D N
4. 1 pico m o l d e extrem os se o b tien e al d ig erir 2 pg d e X con Hind III.
5. 3,2 p ico m o les d e extrem os.
6. A ñ a d ir 10,3 pL d el frag m en to Bam Hl (p a ra te n e r 5,15 p,g d e inserto) y
2 6,8 pL d e extrem os X EM B L3.
7. S e h an d e d ig erir 29 p,g d e X EM B L3 con BamHl.
8. L a efic ien cia d e em p aquetam iento es d e 3,5 x 10 P F U /pg.
9 . 15,8 p L d e p lásm id o d ig erid o m ás 2 3,9 p L del fragm ento d e A D N de
6 .9 7 6 pb.
10. 2 ,5 2 x 106 transform antes/p,g
11. H a y q u e an a liz ar 3 9 .9 5 0 clones independientes.
12. H a y q u e an a liz ar 5 5 .3 4 0 clones re co m b in an tes independientes.
13. 1 d e 14.000 clones
14. 2 3,7 °C
15. D e 5 1,9 a 5 6,9 °C
16. 8 p o sicio n es
17. 15 n t d e long itu d
18. S e co m p leta la m itad d e la h ib rid ac ió n en 76,2 seg undos. E n la p rá ctica, dado
q u e la ta sa real p u e d e se r h a s ta cu a tro v ec es su p erio r q u e el t i /2 calcu lad o , la
reacción se co m p leta a la m itad en 5 m in , 5 s.
19. 15 h , 56 m in
2 0 . L a m ita d d e la re acc ió n se co m p leta en 8 horas.
2 1 . L a ecu ac ió n p a ra la lín ea d e m ay o r aju ste e s ^ = —0 ,1 8 14.x + 3,7004. L a b a n d a
1 tien e u n a lo n g itu d d e 4 2 7 pb. L a b a n d a 2 tien e u n a lo n g itu d d e 515 pb.
2 2 . 23 m in , 48 s
1. U n frag m en to d e A D N tien e la sig u ien te secuencia:
5'-A T G T A T C T A G C C T T C A T T A A T G A C A A G G A G C T G C C C -3 '
¿C u ál es el p eso m o lecu la r d el p o lip ép tid o co d ific ad o p o r esta s ec u en cia de

ADN?
2 . S e dilu y en 0,1 m L d e u n a solución d e proteína en 1 m L (volum en final) y se
colocan 0,1 m L d e esta dilución en 900 p,L d e ag u a dentro d e u n a cu b e ta de
1 cm d e p aso d e luz. E sta m u estra a 28 0 n m tien e u n a lectura d e 0,42.
A sum iendo q u e u n a solución d e p ro teín a a 1 m g/m L tien e u n a absorbancia
de 1,0, ¿cuál es la concentración d e la p ro teín a d e la m u estra m ás concentrada?
3 . L a alb ú m in a séric a bo v in a (B S A ) tien e u n coe ficien te d e ex tin ció n (A 1%) de
6,61 a 28 0 nm . U n a so lu ció n de B S A d a lu g a r a u n a lec tu ra a 2 8 0 n m de 0,23
en u n a c u b e ta d e 1 cm . ¿C u ál es la co n c en tra ció n en porcentaje?
4. U n está n d a r d e la p ro teín a B S A tien e u n a co n c en tra ció n d e 5 m g/m L .
S up o n ie n d o u n coe ficien te d e ab so rció n (A 1/o) d e 6 ,6 1 , ¿cuál d eb e ría ser
su a b so rb an cia (A) a 28 0 n m en u n a cu b e ta co n u n a n c h o d e 1 cm ?
5. L a a lb ú m in a d e su ero b o v in o tien e u n coeficiente d e ex tin ció n m o lar de
ap ro x im a d am en te 4 3 .6 0 0 M ~ x c m - 1 . U n a so lu ció n d e B S A en u n a cu b e ta
d e 1 cm de an c h o d a u n a lec tu ra a 2 8 0 n m d e 1,07. ¿C u ál es su co ncentración
m olar?
6 . U n a p ro teín a q u e se está estudiando tien e u n p eso m o lecu la r de 65 .0 0 0 en un
gel d e S D S-PA G E . S e h ac e u n a so lu ció n al 1% d e la p ro teín a purificada, y en
u n a cu b e ta d e 1 cm d e p aso d e lu z a 2 8 0 n m tien e u n a lec tu ra d e 19,2. ¿C u ál es
su coe ficien te d e ex tin ció n m olar?
7 . L a a lb ú m in a d e suero b o v in o tien e u n coe ficien te d e e x tin ció n m o lar de
apro x im a d am en te 4 3 .6 0 0 M ~ l c m - 1 . U n a so lu ció n al 1% d e B S A en u n a
cu b e ta d e 1 cm d e p aso de lu z d a u n a a b so rb an cia d e 6,61 a 2 8 0 nm . ¿C u ál es
su p eso m olecular?
8. S e dilu y en 50 (xL de u n a so lu ció n de pro teín a en u n vo lu m en final d e 0,1 m L
y se an a liz a a 205 y 2 8 0 n m en u n a cu b e ta q u e tien e u n p aso d e lu z d e 1 cm .
L o s resultados q u e se o b tien en son los siguientes:

A-205 nm — 0,472
A-280 nm = 0,056
¿C u ál es el co e ficien te d e e x tin ció n m o lar d e la p ro teín a a 28 0 nm ?
9 . U n a p ro teín a contiene lo s sig u ie n tes residuos: 7 trip tó fan o s, 5 tiro sin as y 2
cisternas. ¿C u ál es su coeficiente d e e x tin ció n m o lar predicho?
10. Se p re p ara n u n a serie d e dilu cio n es d e B S A co m o e stán d a r p a ra u n ensayo
B rad fo rd d e proteínas. A 595 n m se o b tien en los siguientes valores:
l¿g de BSA en la cubeta ^595 nm
0 0,05
5 0 ,12
10 0 ,26
20 0 ,48
30 0,65
40 0 ,88
50 1,07
60 1,26
U n a m u estra de p ro teín a d e co n c en tra ció n d esc o n o cid a d a u n a ab so rb an cia a

595 n m de 0 ,52 u san d o el re activ o d e B radford. ¿C u án to s p,g d e p ro teín a h ay
en el tu b o d e ensayo?
11. U n a solución de u n a p roteína, co n u n p eso m o lecu la r d e 4 0 .0 0 0 D a , está a u n a
co n c en tra ció n d e 8 x 10-5 M . ¿C u ál es su co n c en tra ció n en m g/m L ?
12. U n a solución d e u n a p roteína, c o n u n p eso m o lecu la r d e 6 8 .0 0 0 , está a u n a
co n c en tra ció n d e 10 m g/m L . ¿C u ál es la m o larid ad d e la solución?
13. U n extracto crudo d e u n a p ro teín a tien e u n a lec tu ra a 2 6 0 n m d e 0,035 y a
2 8 0 n m de 0,85. ¿C u ál es la co n c en tra ció n ap ro x im a d a d e la p ro teín a (e n m g/
m L ) en el extracto crudo?
14. Se dilu y en 10 [iL d e u n sto ck d e u n a pro teín a p u rific ad a en u n vo lu m en final
d e 0,5 m L. E sta m uestra, a 20 5 nm , tien e u n a lec tu ra d e 0 ,066. ¿C u ál es la
co n c en tra ció n d e p ro teín a del s to ck en m g/m L ?
15. S e dilu y en 10 [aL d e u n extracto cru d o d e p ro teín a en u n v o lu m en final de
1 m L. A 20 5 nm , se o b tien e u n a lec tu ra de 0,5 2 7 . A 2 8 0 n m , la so lu ció n tiene
u n a a b so rb an cia d e 0,0 4 5 . ¿C u ál es la c o n c en tra ció n d e p ro teín a s en el
extracto en m g/m L ?
16. Se d ese a en sa y ar el n iv el b asa l p ara la actividad (3-galactosidasa de referencia
en u n a c e p a d e E. coli. U n a alícu o ta de 1 m l d el cultivo en la fa se lo g arítm ica
tien e u n a DOóoo d e 0,25. U n a alícu o ta d e 0,1 m L d el cultivo se añ a d e al
tam p ó n Z , to lu en o y O N P G . D e sp u és d e 45 m inutos, se d etien e la reacción
p o r la a d ic ió n d e carbonato sódico. S e o b tien en v alo res de 0,43 y 0 ,03 a 4 2 0 y

55 0 nm , re spectivam ente. ¿C u án ta s u n id ad e s d e (3-galactosidasa h ay en la
alícu o ta d e 0,1 m L ?
17. U n m i d e células, descritas en el P ro b lem a 16, se lisa n y su a b so rb an cia se
m ide a 26 0 y 28 0 nm , con lo s sig u ie n tes resultados:
2 6 0 n m = 0,052
2 8 0 n m = 0,422
¿C u ál es la ac tiv id a d e sp e cífica d e la (3-galactosidasa ensa y ad a en e l P ro b lem a
16?
18. V einte îL d e u n extracto ce lu la r se añ a d en a 2 m i de reactivo d e en sayo d e la
(3-galactosidasa y se co n tro la la a b so rb an cia a 4 1 0 n m du ra n te u n p e río d o de
2 0 m inutos, m om ento en el q u e se o b tien e u n a ab so rb an cia de 0,56. ¿C u ál es
la actividad (3-galactosidasa d e la m u estra en m icro m o les p o r m inuto?
19. Si la alícu o ta d e 2 0 |iL del P ro b lem a 18 co n tien e 50 [ig d e proteína, ¿cuál es
su ac tiv id a d específica?
20 . S e u tiliz a u n a cro m a to g rafía en c a p a fin a p ara ca rac teriza r u n a proteína.
C u an d o se h a re su elto la plac a, el fren te del s o lv en te se h a desp laz ad o
9,5 cm y la pro teín a 7 ,4 cm . ¿C u ál es su v a lo r R f?
2 1 . S e u tiliz a u n a cro m a to g rafía d e filtrac ió n en g el p ara estim ar el p eso m o le
c u la r d e u n a pro teín a desconocida. L a ca lib ració n d e la c o lu m n a q u e se
u tiliz ará re v ela u n v o lu m en d e ex c lu sió n (V0) d e 32 m i y u n v o lu m en total
(F t) d e 72 m i. S e co rre el e stán d a r de p ro teín a a trav é s d e la co lu m n a c o n los
sig u ie n tes resultados:
Proteína estándar Peso molecular Volumen de elución

( V e) en mL
Estándar 1 10.200 65
Estándar 8 110.000 44
Estándar 9 142.300 42
Estándar 10 180.000 40
Estándar 11 220.000 38
U n a pro teín a desc o n o cid a recorre la co lu m n a c o n u n v o lu m en d e e lu c ió n de

53 m i. ¿C u ál es su peso m o lecu la r ap ro x im a d o ?
22. S e u tiliz a C A T en u n ex p erim en to co m o g en in d icad o r p ara p o n e r a p ru e b a u n

p ro m o to r d e sh o ck térm ico en células tran sfectad as. L a fo rm a acetilad a de
x 104 cpm . L a m an c h a
cloranfenicol, a p a rtir d e u n a p la c a d e T L C , em ite 2,3
d e cloranfenicol d esa cetilad o em ite 4,7 x 105 cpm . ¿C u ál es la ac tiv id a d de
C AT?
2 3 . S i el en sayo C A T desc rito en el P ro b lem a 2 0 co n tien e 5 |xCi d e [14C ] clo
ranfenicol co n u n a actividad e sp e cífica d e 100 pC i/m m ol y la re acc ió n de
e n sa y o se d ejó tran sc u rrir d u ra n te 4 0 m in a 37 °C , ¿c u án tas m oléculas de
C A T h a y p re sen tes en el extracto?
24. U n g en se tran sc rib e y trad u c e en u n a reacción d e 2 0 0 p L q u e co n tien e 5 |_iL
d e 10 m C i/m L [35S] M et, q u e tien e u n a ac tiv id a d esp e cífica d e 5.000 C i/
m m ol. D esp u és de la in cu b a ció n a 37 °C du ra n te 60 m in u to s, se p re cip ita con
T C A u n a a lícu o ta d e 10 [iL p ara re co g er las m oléculas q u e h an in co rp o rad o el
m arc ad o ra diactivo. E l filtro tien e 2,8 x 107 cpm . U n a alícu o ta de 5 [xL de la
re acc ió n s e v alo ra p a ra el to ta l d e cu entas. E l v a lo r es de 5,4 x 109 cpm . ¿Q ué
po rc en taje d e la M et ra d io m a rca d a se h a incorporado a polipéptido?
RESPUESTAS
1. 1.453,75 D a
2. 42 m g d e proteína/m L
3. 0 ,0 3 5 %
4. A = 3,31
5. 2,5 x 10-5 M
6. 1,25 x \ 0 5M ~ ' cm ” 1
7. 6 6 .0 0 0 D a
8. 0 ,0 9 8 M ~ x c m ' 1
9. 4 6 .2 0 0 c m -1
10. 23 |xg d e pro teín a
11. 3 ,2 m g/m L
1 12. 1,47 x 10_4M
S 13. 1,3 m g/m L
I 14. 102,3 m g/m L
15. 1,4 m g/m L
i
16. 33 6 u n id ad e s d e (3-galactosidasa
1
i 17. 5.472 u n id ad e s/m g d e p ro teín a
.¡3 18. 0,0 3 2 [amóles d e O N P /m in
|
o
19. 6 ,4 x 10~4 (xmol O N P/m in/p,g
20. R f = 0,78
<¿
i
log MV K
10200 4.00860017
15400 4.18752072
18600 4.26951294
27400 4.43775056
32800 4.51587384
48200 4.68304704
76000 4.88081359
110000 5.04139269
142300 5.1532049
180000 S.25527251
220000 5.34242268
0.8 *“<5— -------------
07 V a
0 ,6 -------------
Logaritm o del peso m olecular
La proteína desconocida tiene un peso molecular aproximado de 40.500 Daltons
22. E l 4 ,7 % d el clo ran fen ico l fu e con v e rtid o a la fo rm a acetilada.

23. 9 x 1012 m o lécu la s d e C A T
24 . S e h a in co rp o rad o el 0 ,2 5 % d el [35S] M et al polipéptido.
1. U n A D N es pre cip ita d o en eta n o l p o r m edio d e la ce n trifu g ac ió n de la m uestra

a 1 2.500 x g d u ra n te 10 m in a 4 °C e n u n a m icrocentrífuga. Si e l ro to r tien e un
ra d io d e 7,3 cm , ¿c u án tas rp m se d eben u tiliz a r p a ra p re cip ita r el A D N ?
2 . U n ro to r co n u n ra d io m áx im o d e 14,4 cm se h ac e g ira r a 5.0 0 0 rpm . ¿C u ál es
la fu e rza g l
3 . U sa n d o el n o m o g ram a de la sig u ien te figura, c a lcu lar el n ú m ero d e re v o lu c io
n es nec esarias p a ra o b ten e r 2 .0 0 0 x g co n u n ro to r q u e tien e u n radio d e 14 cm .
4 . L a A D N p o lim e rasa m ito c o n d rial d e Críthidia fasciculate tien e u n coeficiente

d e sed im en tac ió n d e 4,1 S (Torri y E n g lu n d , 1992). S e d ese a sed im en tar la
en z im a en u n a so lu ció n ac u o sa a 2 0 °C en u n ro to r B eck m a n C o u lte r T ip o 30
q u e tien e u n rm¡n d e 4,91 cm y u n r máx d e 10,48 cm . S e q u iere ce n trifu g ar la
m u estra a 3 0 .0 0 0 rp m , la m áx im a velo cid ad d el rotor. ¿ C u án to tiem p o se
n ec esita c e n trifu g ar la p o lim e rasa p a ra sedim entarla?

RESPUESTAS
1. 12.376 rpm
2. 4 .0 2 5 x g
3. A p ro x im ad a m en te 3 .6 0 0 rpm
4. 52 h
1 . E l locus S T R D 8S 1179 cu e n ta co n 12 ale lo s diferentes. ¿C u án to s g enotipos

s on po sib le s p a ra este locus1?
2. U n locus V N T R tien e tres po sib le s ale lo s d e 14, 15 y 16 repeticiones. Se
dete rm in a n los gen o tip o s d e 9 0 0 perso n as, ele g id a s al azar, p a ra las diferentes
com b in ac io n es d e ale lo s co n los sig u ie n tes resultados:
Genotipo Número de individuos
14, 14 197
14, 15 96
14, 16 268
15, 15 46
15, 16 127
16, 16 166
¿C u ále s son las frecu e n cias d e g enotipo?

3 . ¿C u ále s son las frecuencias p ara los ale lo s d e 14, 15 y 16 repeticiones
descritos en el P ro b lem a 2?
4 . A s u m ien d o e l equ ilib rio d e H ardy-W einberg, ¿cuáles son las frecuencias
gen o típ ica s esperadas p a ra los ale lo s d esc rito s en el P ro b lem a 3?
5 . E n u n a po b lac ió n d e 90 0 in d iv id u o s eleg id o s al azar, ¿c u án tas perso n as cabe
esp e rar q u e te n g a n ca d a u n o d e lo s g en o tip o s p o sib le s d esc rito s en el
P ro b lem a 3?
6 . M ediante el te s t d e ch i-c u ad rad o c o n u n n iv el d el 5% d e significancia,
ca lcu lar si las frecu e n cias g en o típ ica s ob serv ad as y las esp erad as descritas
en el P ro b lem a 2 y ca lcu lad as en el P ro b lem a 4 son significativam ente
diferentes.
7 . ¿C u ál es la v aria n za d e la m u estra d e los d ato s d el P ro b lem a 6?
8 . ¿C u ál es la desv iació n e stán d a r en el P ro b lem a 6?
9 . ¿C u ál es la pro b a b ilid ad d e la in clu sió n p a ra los g en o tip o s esp e rad o s en el
P ro b lem a 4 ?

10. ¿C u ál es la pro b a b ilid ad d e discrim in ac ió n para los g en o tip o s en el P roblem a

4?
11. U n so sp ec h o so d e asesinato tien e el g en o tip o 10, 12 p a ra el locus D 13S 317
S T R . E n la b a s e d e datos C O D IS , este g enotipo tien e u n a frecu e n cia de
0 ,0 4 8 6 p ara los afroam ericanos, d e 0 ,0315 p ara lo s cau cásico s y d e 0 ,0438
p ara lo s h isp an o s (B u d o w le et al., 1999). L a c iu d a d en q u e se com etió el
ase sin a to se co m p o n e de u n 3 5% d e afroam ericanos, u n 25 % de cau cásico s y
d e u n 4 0 % d e hispanos. ¿C u ál es la frecu e n cia m ed ia po n d erad a general para
este g enotipo?
12. S e tip ific a el A D N d e u n so sp ech o so p ara och o loci diferentes sin ligación con
lo s sig u ie n tes resultados:
Locus STR Frecuencia de genotipo
vWA 0,071
FGA 0,004
D3S1358 0,013
D8S1179 0,022
D21S11 0,006
D18S51 0,017
D5S818 0,023
D13S317 0,002
¿C u ál es la frecu e n cia d e g en o tip o total?

13. S e re aliza u n a p ru e b a d e pate rn id ad c o n lo s sig u ien tes resultados:
Marcadores STR Genotipo de la Genotipo del Genotipo del

madre niño supuesto
padre
vWA 15, 16 15, 16 15, 15

FGA 22, 22 22, 24 2 2 ,24
D8S1179 10, 12 12, 14 14, 16
D21S11 27, 32.2 30, 32.2 30, 33.2
E l su p u esto p ad re es caucásico. L o s ale lo s descu b ierto s en esta p ru e b a tienen

las sigu ientes frecuencias (B u d o w le et al., 1999):
Marcadores STR Alelo Frecuencia
vWA 15 0,11224
16 0,20153
FGA 22 0,18878
24 0,13776
25 0,06888
D8S1179 10 0,10204
12 0,14541
14 0,20153
16 0,01276
D21S11 27 0,04592
30 0,23214
32.2 0,11224
33.2 0,03061
¿C u ál es el IP C y la p ro b a b ilid ad d e pate rn id ad ?
RESPUESTAS
1 . 78 g enotipos diferentes
Genotipo Número de individuos Frecuencia de genotipo
14, 14 197 0,22

14, 15 96 0,11
14, 16 268 0,30
15, 15 46 0,05
15, 16 127 0,14
16, 16 166 0,18
3 . Pi 4 = 0 ,4 2 , p 15 = 0 ,18 y p i6 = 0,40.
Genotipo Frecuencia de genotipo

esperada
14, 14 0,1764
14, 15 0,1512
14, 16 0,3360
15, 15 0,0324
15, 16 0,1440
16, 16 0,1600
5.
Genotipo Número de personas esperado
con ese genotipo
14, 14 159
14, 15 136
14, 16 302
15, 15 29
15, 16 130
16, 16 144
6. S e ca lcu la u n v a lo r d e x 2 d e 4,01. P ara cin c o grados de libertad, la tab la d e chi

cu a d rad o m u estra u n v a lo r d e 11,07. C o m o el v a lo r calcu lad o es in ferio r al
d erivado d e la tab la de ch i cu a d rad o , h a y q u e co n c lu ir q u e las frecuencias de
g en o tip o o b serv ad as n o difieren d e fo rm a s ig n ificativ a d e las esperadas.
7 . s2 = 5,2
8. s = 2,28
9. P¡ = 0 ,2142
10. Pd = 0 ,7858
11. Se esp e ra q u e u n a d e ca d a 2 4 perso n as ele g id a s al az a r en la ciudad del
asesinato te n g a este genotipo.
12. F rec u en cia d el g en o tip o g en eral = 3,81 x 1 0 -16. U n o d e ca d a 2 ,6 x 1015
in d iv id u o s se p o d ría esp e rar q u e tu v ie ra este p a rtic u la r gen o tip o general.
13. IP C = 6 1 ,82. L as p ro b a b ilid ad e s a fa v o r d e la pate rn id ad son d e 62 a 1. L a
p ro b a b ilid ad d e p ate rn id ad es d el 98,4% .

2012.calculo en Biologia Molecular y Biotecnologia STEPHENSON 2ed

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

2012.calculo en Biologia Molecular y Biotecnologia STEPHENSON 2ed

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Cálculo en biología molecular

A m s te r d a m B a r c e lo n a B e ijin g B o sto n F ila d e lf ia L o n d res M a d rid

CAPÍTULO 1 Notación científica y prefijos métricos...........................................................................1

CAPÍTULO 2 Soluciones, mezclas y medios.......................................................................................... 15

CAPÍTULO 3 Crecimiento celular.............................................................................................................. 45

CAPÍTULO 4 T ra b a ja n d o con b a c te rió fa g o s ................................................................................... 83

CAPÍTULO 5 C uantificación d e ác id o s n u c le ic o s .......................................................................... 99

5 .6 P e s o m o le c u la r, m o la rid a d y ta m a ñ o d e l á c id o n u c l e ic o ................. 115

CAPÍTULO 6 M areaje d e ác id o s n ucleicos con ra d io is ó to p o s ............................................... 123

CAPÍTULO 7 S ín te sis d e o lig o n u d e ó tid o s .................................................................................... 155

CAPÍTULO 8 La re acc ió n e n c a d e n a d e la p o lim e ra s a (PCR)............................................... 165

CAPÍTULO 9 La re acc ió n e n c a d e n a d e la p o lim e ra s a a tie m p o re al (RT-PCR)...........211

9 .4 E fic ie n c ia d e a m p lific a c ió n ....................................................................... 2 3 2

CAPÍTULO 10 ADN recombinante............................................................................................................... 313

1 0 .8 M e d ic ió n d e fra g m e n to s d e A D N p o r e le c tro fo re s is e n g e l ........351

1 1 .1 3 U tiliz a c ió n d e la lu c ife ra s a e n u n e n s a y o d e g e n i n d i c a d o r ..... 4 0 3

CAPÍTULO 12 Centrifugación ............................................................................................................... 4 1 3

CAPÍTULO 13 Medicina forense y paternidad ..............................................................................4 2 3

Notación científica y prefijos métricos

dígitos distintos d e cero se su p o n e q u e n o so n significativos. Si determ inam os que

P ro b le m a 1.1 ¿Cuántos dígitos significativos hay en cada una de las

1.1.1 R ed o n d eo d e d íg ito s s ig n ific a tiv o s en los cá lcu lo s

Guía para redondear dígitos significativos

P ro b le m a 1.2 Realice los siguientes cálculos y exprese el resultado utilizando

28,5884 g se redondea a 28,6 g

b) 3,4 cm x 8,115 cm = 27,591 cm2

27,591 cm2 se redonde a 28 cm2

c) 1,2 L-í- 0,155 L = 7,742 L

7,742 L se redonde a 7,7 L

10-3 = - ^ = --------- ---------- = — — = 0,001

1.2.1 E x p re sa n d o n ú m e ro s en n o ta ció n cie n tífica

2. E s crib a el nu ev o nú m ero h a s ta incluir, a la izq u ierd a y la d erech a , a to d o s los

P ro b le m a 1.3 Escriba los siguientes números en notación científica.

3.001.000.000 = 3,001 x 109

60,23 x 1022 = 6,023 x 1023

P ro b le m a 1.4 Escriba los siguientes números en notación científica.

0,000000000015 = 1,5 x 10-11

b) Mueva la coma a la derecha cinco posiciones de forma que quede colocada a

0,0000500042 = 5,00042 x 10~5

c) Mueva la coma dos posiciones hacia la izquierda para que se sitúe a la

437,28 x 10-7 = 4,3728 x 10-5

1.2.2 C o n v irtie n d o n ú m e ro s en n o ta ció n cie n tífic a

P ro b le m a 1.5 Escriba los siguientes números en forma decimal.

4,37 X 105 = 437.000,0

b) Mueva la coma una posición a la derecha, agregando un cero a la derecha

c) Mueva la coma siete posiciones a la derecha, agregando seis ceros para

23,4 x 107 = 234.000.000,0

d) La coma se mueve cuatro posiciones a la izquierda. Se añaden ceros para

3,2 x 10-4 = 0,00032

1.2.3 S u m a n d o y re sta n d o n ú m e ro s e sc rito s en n o ta ció n

P ro b le m a 1.6 Realice las siguientes operaciones.

1.2.4 M u ltip lica n d o y d iv id ie n d o n ú m e ro s e x p re sa d o s

L a regla d el p rod u cto: cu an d o se m u ltip lica u tiliz an d o n o tac ió n científica,

L a regla d el cocien te: cu a n d o se d iv id e u tiliz an d o notac ió n científica, el

C u an d o realice el p ró x im o g ru p o d e p ro b lem a s, las sig u ien tes ley e s m ate­

P rop ied ad con m u tativa d e la m u ltip licación : el re su lta d o d e la m ulti­

P rop ied ad a sociativa d e la m u ltip licación : el re su lta d o d e la m ultiplicación

P ro b le m a 1.7 Calcule el producto.

= (4 x 2) x (10“ 2 x 1 (T 3) Utilice las reglas conmutativa

P ro b le m a 1.8 Calcule la división.

= 2 x 1012 Número redondeado a un dígito

El exponente del denominador

_ x 10_ s _ (_ 3) El exponente del denominador se

C u an d o realice el p ró x im o g ru p o d e p ro b lem a s, las sig u ien tes ley e s m ate

P rop ied ad con m u tativa d e la m u ltip licación : el re su lta d o d e la m ulti

cabo m atem á tica m en te ap lica n d o u n fa cto r d e co n v e rsió n so b re los d os térm i

1.000 ixL ___