Guía operativa para la vigilancia

de Resistencia Antimicrobiana
(RAM) en bacterias prioritarias
DIRECCIÓN NORMATIVA DE SALUD

por laboratorio

Pilotaje
 SECRETARÍA DE SALUD

Dr. Jorge Alcocer Varela

SECRETARIO DE SALUD

Dr. Hugo López-Gatell Ramírez

SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD

SUBSECRETARIO DE INTEGRACIÓN Y DESARROLLO DEL SECTOR SALUD

Dr. Gabriel García Rodríguez

DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA

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 INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
“DR. MANUEL MARTÍNEZ BÁEZ”
INDRE
Biól. Irma López Martínez

DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA

Mtra. Lucía Hernández Rivas

DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO

C.P. Julie Jeannette Ramírez Hernández

SUBDIRECTORA DE OPERACIÓN

Biól. Norma Angélica Montes Colima

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA

Mtra. Judith Estévez Ramírez

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS

Dra. Gabriela Meneses Ruiz

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA

Dra. Herlinda García Lozano

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA

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 GRUPO DE TRABAJO

LABORATORIO DE RESISTENCIA ANTIMICROBIANA

MTRO. JAVIER DE JESÚS PIÑÓN ORTEGA
JEFE DEL LABORATORIO DE RESISTENCIA ANTIMICROBIANA, DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA

M. EN GS. LUZ JARENNY MILLÁN IBARRA

QBP. KIRVI DANIEL VILLANUEVA GONZÁLEZ

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1. ABREVIATURAS

RAM: Resistencia Antimicrobiana

OMS: Organización Mundial de la Salud

InDRE: Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos

LRAM: Laboratorio de Resistencia Antimicrobiana

IRAB: Laboratorio de Infecciones Respiratorias Agudas Bacterianas

COEN: Laboratorio de Cólera y Enterobacterias

ITS: Infecciones de Transmisión Sexual

EDA: Enfermedad Diarreica Aguda

IVU: Infecciones de Vías Urinarias

CDC: Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades

ATCC: American Type Culture Collection (Colección americana de cultivos tipo)

5
2. INTRODUCCIÓN
La resistencia a los antimicrobianos (RAM) surge cuando las bacterias, los virus,
los hongos y los parásitos cambian a lo largo del tiempo, generalmente por
modificaciones genéticas, y dejan de responder a los medicamentos, lo que hace
más difícil el tratamiento de las infecciones e incrementa el riesgo de propagación
de enfermedades, de aparición de formas graves de enfermedades y de muerte.

Los antibióticos son cada vez más ineficaces, y el desarrollo de nuevos

antimicrobianos está agotado. Para el 2019 la OMS identificó solo seis antibióticos
innovadores. Sin embargo, si no se modifica la forma en que se utilizan
actualmente los antibióticos, esos nuevos antibióticos tendrán el mismo destino
que los actuales y se volverán ineficaces.

La RAM tiene costos considerables para las economías de los países y sus sistemas
de salud, ya que afectan a la productividad de los pacientes o sus cuidadores
debido a las estancias hospitalarias prolongadas y a la necesidad de una atención
más cara e intensiva.

Entre los principales factores de la RAM se encuentra el uso indebido y excesivo de

antimicrobianos, la falta de acceso a agua limpia, saneamiento e higiene tanto
para las personas como para los animales, medidas deficientes de prevención y
control de las enfermedades y las infecciones en los centros de atención de salud
y las explotaciones agrícolas, el acceso deficiente a medicamentos, vacunas y
medios de diagnóstico asequibles y de calidad, la falta de sensibilización y
conocimientos, y el cumplimiento de la legislación.

En la actualidad, para las infecciones bacterianas comunes como las infecciones

urinarias, la septicemia, las infecciones de transmisión sexual y algunas formas de
diarrea, se han observado en todo el mundo tasas elevadas de resistencia a los
antibióticos utilizados habitualmente en los tratamientos y en algunos países se
ha detectado resistencia a medicamentos de última opción, sin dejar algún
tratamiento eficaz.

6
3. MARCO LEGAL
Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos. Artículo 4. Diario Oficial de la
Federación 05/II/1917, Última Reforma D.O.F. 15/II/2012.

Leyes

Ley General de Salud, México. Nueva Ley publicada en el Diario Oficial de la Federación el
7 de febrero de 1984. Última reforma publicada DOF 07/06/2012.

Ley Federal de Responsabilidades Administrativas de los Servidores Públicos. D.O.F.

13/III/2012. Última reforma en D.O.F. 28/V/2009.

Normas

Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011, Para la organización y funcionamiento de

los laboratorios clínicos, última modificación publicada en el Diario Oficial de la Federación
el 27 de marzo de 2012.

Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiológica, publicada

en el Diario Oficial de la Federación el 19 de febrero de 2013.

Norma Oficial Mexicana NOM-045-SSA2-2005, Para la vigilancia epidemiológica,

prevención y control de las infecciones nosocomiales, última modificación publicada en el
Diario Oficial de la Federación el 20 de noviembre de 2009.

Acuerdos
Acuerdo por el que se declara la obligatoriedad de la Estrategia Nacional de Acción contra
la Resistencia a los Antimicrobianos publicado en Diario Oficial de la Federación el 05 de
junio de 2013.

7
4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

Establecer las directrices que permitirán el monitoreo de la resistencia a los

antimicrobianos en microorganismos prioritarios o de interés epidemiológico en el país.

4.2 Objetivos Específicos

1. Describir las funciones de los Establecimientos de Salud para la atención primaria

en el pilotaje de la Red Nacional para la Vigilancia de la Resistencia a los
Antimicrobianos.

2. Describir las funciones de los laboratorios participantes y la metodología que se

seguirá para la vigilancia de la RAM.

3. Esquematizar el proceso de selección y referencia de cepas a los laboratorios de

acuerdo a su nivel (Laboratorio de Primer, Segundo o Tercer nivel).

4. Generar y analizar datos de resistencia a los antimicrobianos utilizando

procedimientos estandarizados de registro descritos en este documento.

5. Generar un panorama de la resistencia a los antimicrobianos en microorganismos

prioritarios dentro de las unidades participantes.

5. JUSTIFICACIÓN

Laboratorio Nacional de Referencia para la Vigilancia de la Resistencia a los

Antimicrobianos

El Departamento de Bacteriología del InDRE ha realizado la vigilancia de la

resistencia a los antimicrobianos (RAM) de forma histórica a través de cuatro
laboratorios:

1- Laboratorio de Infecciones Respiratorias Agudas Bacterianas (IRAB): Es el

Laboratorio de Referencia Nacional para las Infecciones Respiratorias
Agudas Graves e Invasivas que ha monitoreado los patrones de resistencia
de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus
influenzae, Staphylococcus aureus, Estreptococos β-hemolíticos,
Enterococcus spp, Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter spp.

8
 2- El laboratorio de Cólera y Enterobacterias (COEN): Es el Laboratorio Nacional
de Referencia para patógenos entéricos como Vibrio cholerae, Vibrio
parahaemolyticus, Salmonella spp, Shigella spp y otras Enterobacterias
(Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae) y ha monitoreado los patrones de
resistencia a los antimicrobianos de éstos patógenos.
3- Laboratorio de Micobacterias (LMIC): Es el Laboratorio Nacional de
Referencia para Tuberculosis y Laboratorio Supranacional de Referencia de
Tuberculosis, el cual monitorea los patrones de resistencia de éste
microorganismo.

A partir del 22 de septiembre del año 2022, el Departamento de Bacteriología

conformó el nuevo Laboratorio de Resistencia Antimicrobiana, cuya función será
como Laboratorio Nacional de Referencia para el monitoreo de los patrones y
mecanismos de resistencia de las bacterias diferentes a las micobacterias por
métodos fenotípicos y genotípicos, así como el diagnóstico de bacterias exigentes
como Neisseria gonorrhoeae.

Dentro del contexto anterior, el InDRE participa con el Centro para el Control y la
Prevención de Enfermedades de Estados Unidos de América (CDC) dentro del
proyecto internacional “Creation of a national antimicrobial resistance
surveillance and telementoring network for primary healthcare settings”, donde
el objetivo del componente de laboratorio es establecer la Red Nacional de
Vigilancia por Laboratorio de la Resistencia a los Antimicrobianos, buscándose en
esta primera etapa el pilotaje de las metodologías de análisis de muestras, los
mecanismos de derivación de muestras y reporte de datos así como la obtención
de datos exploratorios en 3 estados de la República Mexicana: Sonora, Guerrero y
Ciudad de México, para las infecciones por bacterias de la lista prioritaria de la
Organización Mundial de la Salud asociadas a las Enfermedades Diarreicas Agudas
(EDA), Infecciones de Vías Urinarias (IVU) así como Infecciones de Transmisión
Sexual (ITS).

6. ALCANCE

En la primera fase de implementación participarán de manera específica los

siguientes estados coordinados por el Laboratorio Estatal de Salud Pública y en
donde se han seleccionado 6 unidades de atención primaria a la salud:

 Sonora

 Guerrero

9
  Ciudad de México

El Laboratorio Nacional de Referencia procesará las muestras recibidas en los

siguientes laboratorios.

 Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos

1. Laboratorio de Resistencia Antimicrobiana (LRAM)

2. Laboratorio de Cólera y Enterobacterias (COEN)

3. Laboratorio de Infecciones Respiratorias Agudas Bacterianas (IRAB)

10
7. GUÍA OPERATIVA PARA LA VIGILANCIA DE RESISTENCIA ANTIMICROBIANA EN
BACTERIAS POR LABORATORIO (UNIDADES DE PRIMER NIVEL DE ATENCIÓN
MÉDICA)

7.1 Contenido de los Kits para toma de muestra

ITS
 11 Espejos vaginales estériles
 50 Tubos de Agar inclinado Gelosa Chocolate con Polienriquecimiento
 50 Hisopos uretrales estériles (Exudado uretral)
 50 Hisopos estériles (Exudado Vaginal y Endocervical)
 50 Portaobjetos de vidrio
 50 Criotubos de 5 mL estériles
 1 Frasco con 25 mL metanol

EDA
 40 hisopos Cary-Blair

IVU
 19 vasos desechables estériles de 100 mL para toma de muestra de orina
 1 frasco con 250 mL de ácido bórico en agua destilada estéril
 25 pipetas de transferencia de plástico estéril

7.2 Toma de Muestra

A continuación, se anexa una liga para acceder a una carpeta de Drive en donde
podrá encontrar videos tutoriales cortos para el manejo de las muestras después de
ser tomada y de acuerdo a lo descrito a continuación en la presente guía. A su vez
podrá encontrar la presente guía en formato digital con la finalidad de que pueda
apreciar el contenido con mayor calidad en texto e imágenes:
https://drive.google.com/drive/folders/1Ywk8QbsPNi9v6hswWA99K1oXVVGXgbCT?u
sp=sharing

11
Infecciones de Transmisión Sexual (basado en los Lineamientos para la
Vigilancia por Laboratorio de la Sífilis y Otras Infecciones de Transmisión
Sexual y los Lineamientos para la Toma, Manejo y Envío de Muestras para
Diagnóstico a la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública, InDRE)

La vigilancia de resistencia estará focalizada en Neisseria gonorrhoeae, sin embargo,

como parte de los datos epidemiológicos a recolectar, las muestras también serán
analizadas para la identificación de Chlamydia trachomatis.

Serán candidatos a muestreo las mujeres y hombres que cumplan con el cuadro
clínico de infección gonocócica (uretritis y cervicitis gonocócica), es decir, toda
persona con descarga mucopurulenta o purulenta uretral o cervical. De contar con
laboratorio de microbiología, la definición se complementa cuando en el examen del
frote de la secreción muestre diplococos intracelulares Gram negativos. Así como las
mujeres con Enfermedad Pélvica Inflamatoria caracterizado por dolor bajo con o sin
acompañantes como son: descarga vaginal, dispareunia, metrorragia, disuria, dolor
durante la menstruación. Fiebre y ocasionalmente náuseas y vómito.

 Exudado Uretral

Recomiende al paciente que no orine por lo menos una hora antes de tomar la
muestra.

Antes de comenzar con la toma de muestra, identifique un tubo de Agar Gelosa

Chocolate con el identificador único del paciente (Clave interna, nombre del paciente
u otro) y fecha de toma de muestra.

Tome la muestra con hisopo uretral de alginato de calcio, dacrón o rayón,

introduciéndolo en la uretra a una profundidad de 2 – 4 cm ejerciendo un movimiento
de rotación durante 1 – 2 segundos.

Siembre inmediatamente (deslice gentilmente el hisopo sobre la superficie del medio

de cultivo desde la parte más interna del tubo hacia el exterior haciendo movimiento
de zig-zag y rotando el hisopo para descargar por completo la muestra).

12
El medio inoculado deberá ser enviado inmediatamente (menos de 24 horas) al
laboratorio a temperatura ambiente y preferentemente en atmósfera de CO2 (Lo
anterior se puede lograr introduciendo los tubos en un frasco amplio de boca ancha
con una vela encendida y posteriormente cerrando el frasco lo que ocasionará que la
vela se apague asegurando una cantidad de CO 2 adecuada)

Todos los tubos deberán estar perfectamente identificados.

Una vez sembrado el agar, coloque el hisopo dentro de un tubo de plástico estéril
identificado con los mismos datos anteriormente mencionados. En caso de que el
mango del hisopo sobrepase la capacidad del tubo, corte el excedente con tijeras
limpias con alcohol al 70%.

Repita el procedimiento de toma de muestra con un segundo hisopo. Frote el hisopo

con firmeza sobre un portaobjetos limpio y deje secar la laminilla al aire durante 5 – 10
minutos. Posteriormente agregue 1 gotas de metanol sobre la laminilla en la zona
donde se frotó el exudado y deje evaporar (para fijarlos). El hisopo usado para este
procedimiento también se introduce en el mismo tubo de plástico mencionado con
anterioridad tomando las mismas precauciones.

Envuelva las laminillas de vidrio en forma individual con varias cepas de papel
absorbente.

Envíe las laminillas y el tubo seco con los hisopos a temperatura ambiente, de modo
que lleguen al laboratorio antes de 24 horas. De no ser posible se debe de conservar
en refrigeración hasta por 5 días.

 Exudado Vaginal o Endocervical

La paciente no debe estar en periodo menstrual y deberá presentarse sin actividad

sexual por lo menos de 3 días anteriores al de la toma de muestra, sin tratamiento

13
antimicrobiano por lo menos 15 días antes de la toma de la muestra.

Antes de comenzar con la toma de muestra, identifique un tubo de Agar Gelosa

Chocolate con el identificador único del paciente (Clave interna, nombre del paciente
u otro) y fecha de toma de muestra.

Emplee un espejo vagina (libre de lubricante) para fijar el cérvix.

Sin eliminar el moco y el exudado del exocérvix, tome la muestra con un cepillo
citológico o un hisopo de alginato de calcio, dacrón o rayón, introduciendo 1 – 1.5
dentro del canal endocervical durante 5 – 10 segundos.

Retire el hisopo teniendo precaución de no tocar la superficie vaginal.

Siembre inmediatamente (Deslice gentilmente el hisopo sobre la superficie del

medio de cultivo desde la parte más interna del tubo hacia el exterior haciendo
movimiento de zig-zag y rotando el hisopo para descargar por completo la muestra).

El medio inoculado deberá ser enviado inmediatamente (menos de 24 horas) al

laboratorio a temperatura ambiente y preferentemente en atmósfera de CO 2 (Lo
anterior se puede lograr introduciendo los tubos en un frasco amplio de boca ancha
con una vela encendida y posteriormente cerrando el frasco lo que ocasionará que la
vela se apague asegurando una cantidad de CO 2 adecuada)

14
Todos los tubos deberán estar perfectamente identificados.

Una vez sembrado el agar, coloque el hisopo dentro de un tubo de plástico estéril
identificado con los mismos datos anteriormente mencionados. En caso de que el
mango del hisopo sobrepase la capacidad del tubo, corte el excedente con tijeras
limpias con alcohol al 70%.

Repita el procedimiento de toma de muestra con un segundo hisopo. Frote el hisopo

con firmeza sobre un portaobjetos limpio y deje secar la laminilla al aire durante 5 – 10
minutos. Posteriormente agregue 1 gotas de metanol sobre la laminilla en la zona
donde se frotó el exudado y deje evaporar (para fijarlos). El hisopo usado para este
procedimiento también se introduce en el mismo tubo de plástico mencionado con
anterioridad tomando las mismas precauciones.

Envuelva las laminillas de vidrio en forma individual con varias cepas de papel
absorbente.

Envíe las laminillas y el tubo seco con los hisopos a temperatura ambiente, de modo
que lleguen al laboratorio antes de 24 horas. De no ser posible se debe de conservar
en refrigeración hasta por 5 días.

Enfermedad Diarreica Aguda

Serán candidatos a muestreo todas las personas que cumplan con el cuadro clínico
de Enfermedad Diarreica Aguda (moderada o grave) es decir, toda persona de
cualquier sexo y edad que demande atención médica por presentar cuadro diarreico
con cinco o más evacuaciones en 24 horas, cuya evolución no sea mayor a cinco días
y que presente datos de deshidratación moderada. Además, puede presentar vómito
(más de cinco en 24 horas), cuadro disentérico, temperatura mayor a 38°C, datos de
deshidratación moderada a grave.

15
  Hisopado Rectal/Fecal

La toma de materia fecal se realiza con dos hisopos estériles con punta de algodón
(Incluidos con el medio de transporte), pudiendo ser hisopo fecal (obtenido a partir de
una muestra directa de materia fecal), o bien mediante hisopo rectal, el cual se
obtiene introduciendo el hisopo en el esfínter anal más de un centímetro y girando el
hisopo, el cual debe salir manchado con materia fecal. Tomo el hisopo por el tapón
rojo, jamás toque la varilla plástica del hisopo para evitar contaminación de la muestra.

Antes de comenzar con la toma de muestra, identifique cada tubo de Medio de

Transporte Cary-Blair con el identificador único del paciente (Clave interna, nombre
del paciente u otro) y fecha de toma de muestra. Posteriormente realice la toma de
muestra como se describió el en párrafo anterior.

Introduzca cada hisopo en el medio de transporte Cary-Blair, cuidando de que el

algodón quede a 2 cm por debajo de la superficie y sin perforar el fondo del medio de
transporte.

Envíe los dos hisopos dentro del medio de transporte a temperatura ambiente, de
modo que lleguen al laboratorio en máximo 5 días. Si la temperatura ambiente supera
los 30°C se recomienda mantener las muestras para su transporte en un ambiente
fresco utilizando refrigerantes para asegurar su viabilidad, pero sin que el refrigerante
tenga contacto con el medio de transporte.

16
 Barrera física

Muestras

Refrigerante

Infecciones de Vías Urinarias

Serán candidatos a muestreo todas las personas que cumplan con el cuadro clínico
de Infección de Vías Urinarias, es decir, personas de cualquier sexo que presenten
disuria, polaquiuria y urgencia miccional.

 Orina

Indique al paciente que deberá realizar una cuidadosa limpieza de la región

urogenital con agua y jabón y luego con benzal al 1%. Se recomienda obtener la
primera orina de la mañana. De no ser esto posible, se considera representativa
aquella muestra que haya permanecido en la vejiga por lo menos 4 horas, con la
finalidad de evitar resultados falsos negativos.

No se debe inducir la micción del paciente mediante la ingesta de abundantes

líquidos, ya que esto provocará que la muestra se encuentre diluida y, en
consecuencia, con menor número de bacterias.

Entregue al paciente un vaso estéril para recolección de. Identifique el recipiente con
el identificador único del paciente (Clave interna, nombre del paciente u otro) y fecha

17
de toma de muestra.

Indique al paciente que deberá tomar una muestra de micción espontanea, para lo
cual deberá desechar la primera parte de la micción y colectar el chorro medio en el
recipiente estéril, de boca ancha con tapa de rosca.

El volumen de la orina en el frasco no deberá superar la mitad (aproximadamente 60

mL), con 10 mL de orina es más que suficiente.

Reciba la muestra del paciente y verifique el volumen de orina. Por cada 10 mL de

orina, deberá agregar con una pipeta de transferencia estéril 1 mL de la suspensión
de ácido bórico. Para realizar lo anterior, agite vigorosamente el frasco de suspensión
de ácido bórico y tome el volumen necesario con la piepeta de transferencia
rápidamente para evitar el asentamiento del ácido bórico. Con la mayor precaución
posible para evitar contaminación de la muestra, entreabra el frasco con orina y
adicione el volumen medido de suspensión de ácido bórico.

Cierre perfectamente el frasco y mezcle cuidadosamente para no formar burbujas,

hasta que se disuelva por completo el ácido bórico.

Envíe el frasco al laboratorio en un plazo no mayor a 24 horas en condiciones de

refrigeración (2-8°C). Puede emplear la hielera y los refrigerantes enviados en el
paquete con los insumos de toma de muestra para garantizar estas condiciones. El
tiempo recomendable es hacer llegar la muestra al laboratorio en menos de 2 horas.

8. GUÍA OPERATIVA PARA LA VIGILANCIA DE RESISTENCIA ANTIMICROBIANA EN

BACTERIAS POR LABORATORIO (LABORATORIOS DE PRIMER O SEGUNDO NIVEL)

8.1 Contenido de los Kits para procesamiento de muestras

ITS
 500 Medios de transporte AMIES con carbón

IVU
 1 frasco con 500 g de Agar CLED

18
8.2 Procesamiento de muestras

Infecciones de Transmisión Sexual (basado en los Lineamientos para la

Vigilancia por Laboratorio de la Sífilis y Otras Infecciones de Transmisión
Sexual, InDRE y los Lineamientos para la Toma, Manejo y Envío de Muestras
para Diagnóstico a la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública)

Una vez que reciba el tubo de Agar chocolate inoculado, incube en atmósfera de CO 2
al 5% a 36°C ± 2°C por periodos de 24 horas hasta máximo 72 horas. En caso de no
contar con una incubadora con CO 2, puede emplear una cámara de anaerobiosis o
un frasco amplio de boca ancha con una vela encendida y posteriormente cerrando
el frasco lo que ocasionará que la vela se apague asegurando una cantidad de CO 2
adecuada.

Revise el cultivo cada 24 horas en busca de colonias convexas, brillantes, prominentes,

mucoides, de 1 a 5 mm de diámetro, de color transparente o ligeramente opacas, no
pigmentadas y no hemolíticas.

En caso de que el cultivo no presente contaminación importante y observe colonias

sospechosas proceda a realizar las pruebas de identificación presuntiva de Neisseria
gonorrhoeae descritas a continuación:

19
 Tinción de Gram

• Divida un portaobjetos en dos o máximo 4 partes e identifique las muestras a

probar.

• Con ayuda de un gotero o una pipeta, coloque una pequeña gota de agua
destilada en la zona correspondiente del portaobjetos.

• Frote la gota de agua una asada pequeña de biomasa y suspéndala de forma

homogénea en la gota de agua.

• Destine una zona de una laminilla para el control de calidad de la tinción, para
ello, suspenda en la misma gota de agua una asada pequeña de Staphylococcus
aureus ATCC® 25923 (Cocos Gram positivos) y una pequeña asada de
Escherichia coli ATCC® 25922 (Bacilos Gram negativos).

• Deje secar las laminillas a temperatura ambiente.

• Pase rápidamente, dos o tres veces, la laminilla sobre la flama de un mechero

bunsen para fijar la muestra.

• Sobre la tarja, o un recipiente destinado para ello, realice la tinción de Gram.

Puede apoyarse de un soporte de varillas de vidrio para colocar las
preparaciones.

• Cubra cada muestra con solución de Cristal Violeta para Gram y deje reposar
durante 1 minuto.

• Enjuague la laminilla con abundante agua destilada, ayudándose de una

piseta.

• Cubra cada muestra con solución de Lugol Gram y deje reposar durante 1
minuto.

• Enjuague la laminilla con abundante agua destilada, ayudándose de una

piseta.

20
 • Decolore la laminilla con mezcla Alcohol-Acetona 1:1 para Gram. Cubra la
laminilla con la solución y muévala constantemente durante 30 segundos.

• Enjuague la laminilla con abundante agua destilada, ayudándose de una

piseta.

• Cubra cada muestra con solución de Safranina para Gram y deje reposar
durante 1 minuto.

• Enjuague la laminilla con abundante agua destilada, ayudándose de una

piseta.

• Para validar la tinción de Gram, revise el control de calidad al microscopio. Se

deberán distinguir claramente los Cocos Gram positivos y los Bacilos Gram
negativos. De no ser el caso, se deberá repetir la tinción, verificando cualquier
factor que pudiera haber causado el error del proceso.

• Una vez validado el control de calidad de la tinción de Gram, revise las

muestras. Todas aquellas en donde observe diplococos pequeños Gram
negativos en forma de grano de café serán sospechosas de ser Neisseria
gonorrhoeae.

 Cultivo

• Si por tinción de Gram, la muestra es sospechosa de ser Neisseria

21
gonorrhoeae se deberá proceder a realizar el cultivo bacteriano. Si por la
naturaleza de la muestra original (Contaminación presente o pocas colonias
sospechosas), no es posible realizar previamente la tinción de Gram, podrá
comenzarse el proceso desde este numeral.

• Previo al trabajo de la muestra, saque una placa de Agar Chocolate con

Polienriquecimiento y Agar Thayer Martin del refrigerador. identifique con los
datos del tipo de medio de cultivo, la muestra a trabajar y la fecha de siembra
y coloque las placas, con la tapa hacia abajo, en una incubadora a 36 ± 2°C por
lo menos 2 horas antes de su uso. Nunca siembre la muestra en un medio frio.

• Durante este paso contemple realizar la siembra de las cepas control,

para los microorganismos poco exigentes puede emplear cualquier medio de
cultivo nutritivo no selectivo (Puede mantener estos cultivos viables durante
aproximadamente 1 mes, siempre y cuando este medio no se deseque). Para
las Neiserias no gonocócicas emplee el Agar Suero de Caballo (Puede
mantener estos cultivos viables durante aproximadamente 1 semana). Para
Neisseria gonorrhoeae emplee Agar chocolate con Polienriquecimiento
(Puede mantener este cultivo viable durante máximo 3 días).

• Genere una zona de trabajo aséptica, puede emplear un Gabinete de

Bioseguridad Clase II o mecheros bunsen encendidos. Limpie la superficie de
trabajo con una gasa impregnada de alcohol al 70% o Hipoclorito de Sodio al
2%. Coloque un contenedor para desecho de RPBI, asas desechables estériles,
o cualquier otro material que requiera.

• Una vez temperadas las placas, usando el equipo de Protección

Personal, estríe el Agar Chocolate con Polienriquecimiento para aislamiento y
posteriormente inocule de forma masiva el Agar Thayer Martin una asada del
cultivo en el tubo.

• Lleve inmediatamente después de inoculadas las placas a una

incubadora a 36 ± 2°C con 5% de CO 2 y una bandeja con agua. Coloque las
placas con la tapa hacia abajo. En caso de no contar con una incubadora con

22
 las características mencionadas, puede emplear una jarra de anaerobiosis.

• Incube durante 24 horas y al final de este periodo de tiempo busque

colonias pequeñas, no pigmentadas, grisáceas, convexas y mucoides de un
diámetro de 0.5 – 1 mm.

• En caso de que no exista crecimiento, reincube las placas 24 horas y

hasta 72 horas. El crecimiento en el medio selectivo Thayer Martin aumenta la
sospecha de Neisseria gonorrhoeae resistente a los inhibidores del VCNT, sin
embargo, algunas cepas de Neisseria gonorrhoeae llegan a ser inhibidas, por
lo que siempre deberá sembrar a la par el Agar Chocolate con
Polienriquecimiento.

• Realice el control de calidad de crecimiento del medio empleando

Neisseria gonorrhoeae ATCC® 49226 como control positivo y Moraxella
catarrhalis ATCC® 49143 como control negativo para el Agar Thayer Martin.
Ambas cepas deben crecer en Agar Gelosa Chocolate con Polienriquecimiento.

 Prueba de Oxidasa

• Si el cultivo en tubo lo permite, realice la prueba a partir de él, de lo contrario,

espere hasta obtener crecimiento en el cultivo realizado en el apartado anterior.

Abra una ampolleta de reactivo de Oxidasa de Kovacs e impregne con el líquido

una tira de papel filtro. Mantenga este papel dentro de una caja Petri desechable.
Otra opción, si dispone de ellas, es emplear las tiras de oxidasa comerciales listas
para su uso.

• Con ayuda de un asa desechable, ya sea en el Gabinete de Bioseguridad o cerca

de un mechero bunsen, tome una pequeña cantidad del cultivo problema y
descárguelo sobre la tira con oxidasa de Kovacs.

• La reacción es positiva cuando se detecta un vire a púrpura dentro de los

siguientes 20 segundos. Los gonococos son oxidasa positivos.

23
• Emplee como control de calidad de la prueba Pseudomonas aeruginosa
ATCC® 27853 como control positivo y Escherichia coli ATCC® 25922 como control
negativo.

• Deseche el papel dentro de la caja Petri desechable sellada, así como las asas
bacteriológicas empleadas, en el contenedor de RPBI. Deseche el contenedor del
reactivo de Oxidasa de Kovacs en el contenedor de residuos de manejo especial.

 Prueba de Superoxol

• En el Gabinete de Bioseguridad o trabajando cerca de un mechero bunsen, en

una placa Petri, y con ayuda de un gotero o una pipeta Pasteur con bulbo,
coloque suficientes gotas de peróxido de hidrógeno al 30% como cepas a probar.
Las gotas deberán contar con espacio suficiente entre ellas.

• Usando asas bacteriológicas desechables tome una pequeña cantidad del

cultivo problema o de referencia y colóquelo cerca de su respectiva gota de
peróxido, pero de tal manera que no tengan contacto.

• Finalmente, y con ayuda de asas bacteriológicas nuevas ponga en contacto el

peróxido de hidrógeno al 30% con la bacteria. Si la reacción es positiva, observará
burbujeo, sin embargo, deberá registrar el burbujeo según su intensidad de
acuerdo a la siguiente tabla. Un claro indicativo de gonococo es el Superoxol
positivo (4+) sin embargo, algunos de ellos pueden tener una reacción menos
intensa o nula.

Resultado Descripción Imagen

Negativo (-) Ausencia de Burbujeo

24
 Burbujeo apenas
Positivo (1+) perceptible y de desarrollo
lento

Burbujeo perceptible y de
desarrollo un poco más
Positivo (2+)
rápido que en una
reacción 1+

Burbujeo claramente
Positivo (3+) perceptible y de desarrollo
rápido

Burbujeo exacerbado,
Positivo (4+) acuminado y persistente,
de desarrollo explosivo

• Emplee como control de calidad de esta prueba Neisseria gonorrhoeae ATCC®

49226 como control positivo (4+), Neisseria cinerea ATCC® 14685 como control
positivo (2+) y Kingella denitrificans ATCC® 33394 como control negativo.

 Pruebas confirmatorias

o Identificación de especies de Neisseria con Galería API NH

• Dentro del Gabinete de Bioseguridad abra una cámara de incubación (fondo y

25
tapa) y agregue agua destilada en los pozos de la cámara.

• Anote en la lengüeta de la cámara los datos de identificación de la cepa.

• Abra una galería y retírela de la bolsa hermética. Colóquela dentro de la

cámara.

• A partir del cultivo puro, y con ayuda de un hisopo estéril, tome una cantidad
de bacterias y suspéndala en solución salina al 0.85% estéril.

• Ajuste la suspensión al estándar 4 de MacFarland.

• Con ayuda de una micropipeta, inocule los sustratos PEN, GLU, FRU, MAL, SAC,
ODC y URE con 50 µL de la suspensión bacteriana. En los últimos tres sustratos
correspondientes a LIP/ProA, PAL/GGT y βGAL/IND inocule con 150 µL de la
suspensión bacteriana.

• En los primeros 7 pocillos, cubra el líquido con una capa de aceite mineral
estéril.

• Tape la cámara e incube a 36 ± 2°C durante 2 horas.

• Lea las reacciones con la ayuda de la tabla de lectura de la ficha técnica del
proveedor.

• En el caso de los pozos LIP/ProA y PAL/GGT añada una gota de reactivo ZYM B
y realice una nueva lectura después de 3 minutos.

• En el caso del pozo βGAL/IND añada una gota de reactivo de James y realice
una nueva lectura después de 3 minutos.

26
 Galería API NH, inoculada con Neisseria gonorrhoeae
• Los resultados se codifican en un perfil numérico de acuerdo al valor asignado
en la hoja de resultados para cada prueba (1, 2 o 4).

• Sume los valores de las pruebas positivas para cada grupo y obtenga el código
de 4 cifras (La prueba de Penicinilasa no tiene valor de código).

• Realice la interpretación de forma visual comparando con la ficha técnica o

emplee el portal APIWeb para realizar la interpretación.

• Realice el control de calidad de cada lote nuevo de Galerías API NH usando

como cepa de control la Neisseria Gonorrhoeae ATCC® 49226.

o Prueba de Producción de Polisacáridos

• Previo a su uso, atempere un Agar Polisacáridos en la incubadora a 36 ± 2°C.

• Marque en la placa, con ayuda de un plumón indeleble, 4 cuadrantes

identificados perfectamente, de tal forma que un cuadrante de la placa pueda
ser empleado para el control positivo de la prueba Neisseria polysaccharea
ATCC® 43768 y otro para el control negativo de la prueba Neisseria meningitidis
ATCC® 35561. Los otros dos cuadrantes podrán ser empleados para la prueba de
dos cepas problema.

• A partir del cultivo puro, tome una asada de la bacteria e inocule el medio en
forma de botón en el centro de cada cuadrante.

• Incube las placas a 36 ± 2°C en una atmósfera húmeda y enriquecida con 5%

de CO2 durante 18 a 24 horas.

27
 • Revele las pruebas añadiendo, con ayuda de un gotero o una pipeta Pasteur,
una gota de solución de Lugol para tinción de Gram, sobre el inóculo en la placa.
Una prueba positiva a producción de polisacáridos adquirirá inmediatamente
un color oscuro (marrón-púrpura-negro). Los gonococos son polisacáridos
negativos.

o Prueba de Reducción de Nitratos

• Dentro del Gabinete de Bioseguridad, y con ayuda de un hisopo, tome una

gran cantidad de bacteria problema y suspendala en Solución salina al 0.85%
estéril (hasta obtener una apariencia lechosa).

• Abra un tubo con Medio Movilidad y Nitratos y con ayuda de una micropipeta,
inocule cada uno de los tubos con medio de cultivo con 500 µL de la suspensión
bacteriana.

• Incube a 36 ± 2°C en aerobiosis durante 48 horas.

• Transcurrido el tiempo, abra la prueba bioquímica dentro de una campana de

extracción de gases y adicione 5 gotas de Reactivo A de Nitrato. Agite levemente
el tubo para mezclar el reactivo.

• Agregue 5 gotas de Reactivo B de Nitrato y agite ligeramente para mezclar el

reactivo.

• La reacción es positiva si en unos pocos minutos se desarrolla un color rosado-

rojo, y la prueba está finalizada.

• Si el medio se mantiene incoloro después de añadir los Reactivos de Nitrato A

y B, añada al medio una pequeña cantidad (no mayor a 4 mg) de polvo de Zinc.
Agite vigorosamente el tubo para mezclar el zinc y déjelo reposar a temperatura
ambiente entre 10 y 15 minutos.

o Si el control negativo cambia a rosa-rojo la cantidad de zinc añadida es

suficiente para generar la reacción (y no es demasiado como para causar una

28
 reducción rápida de nitrato a nitrógeno gaseoso)

o Si el medio permanece incoloro después de añadir el polvo de zinc, el

resultado de la prueba es positivo (el nitrato ha sido reducido a nitrito y
completamente reducido a nitrógeno gaseoso).

o Si el medio se torna rosa-rojo después de añadir el polvo de zinc, el

resultado es negativo.

• Emplee como control de calidad de la prueba Neisseria mucosa ATCC® 19696

como control positivo y Neisseria lactamica ATCC® 23970 como control
negativo de la prueba. Los gonococos son Reducción de Nitratos negativo.

o Prueba de DNAsa

• Previo a su uso, atempere un Agar DNAsa en la incubadora a 36 ± 2°C.

• Dentro del Gabinete de Bioseguridad y con ayuda de un asa bacteriológica

desechable estéril, tome una gran cantidad del cultivo puro a probar.

• Realice una estría en el medio de cultivo.

• Incube en aerobiosis a 36 ± 2°C durante 24 – 48 horas.

• Si el medio tiene indicador como verde de metilo, la desaparición del color

alrededor de la estría es indicativo de una prueba positiva por producción de
DNAsa. Si el color permanece, la prueba es negativa.

• Si el medio de cultivo no contiene indicador, cubra la placa con una solución

de Ácido Clorhídrico 1N y realice la lectura a los 5 minutos. La presencia de un
halo transparente alrededor de la estría es evidencia de una prueba positiva.

• Emplee como control de calidad de esta prueba Staphylococcus aureus

ATCC® 25923 como control positivo y Neisseria meningitidis ATCC® 35561 como
control negativo. Los gonococos son DNAsa negativos.

o Pruebas de identificación automatizadas

29
Puede ser empleado cualquier panel comercial diseñado para la identificación de
Neisseria gonorrhoeae de acuerdo a las indicaciones del fabricante. A continuación,
mencionamos de forma ilustrativa el procedimiento para la Tarjeta Vitek® 2 NH

• Dentro del Gabinete de Bioseguridad y con ayuda de un asa bacteriológica

desechable o un hisopo, tome un poco de bacteria a partir del cultivo fresco.

• Suspenda el inóculo en 3mL de solución salina al 0.45% en los tubos

desechables empleados por el equipo.

• Con ayuda del Nefelómetro del equipo Vitek® ajuste a una densidad óptica
equivalente al 2.70 – 3.30 de MacFarland.

• Coloque los tubos en el soporte del equipo.

• Abra las tarjetas necesarias para la prueba y colóquelas en el soporte del equipo
de tal forma que el tubo de carga de la muestra quede dentro de la suspensión
bacteriana preparada.

Lleve el soporte al equipo y siga las instrucciones vigentes del fabricante para el
uso del equipo.

Envío de muestras al InDRE

El laboratorio deberá recibir a partir de la Unidad de Atención Médica de Primer nivel

lo siguiente:

 1 Tubo de Agar Gelosa Chocolate con Polienriquecimiento inoculado con la

muestra del paciente, transportado a temperatura ambiente y de preferencia
en atmósfera de CO2 al 5%.

 1 Tubo con 2 hisopos inoculados sin ninguna otra substancia, transportado a

temperatura ambiente si es el mismo día o en refrigeración si tiene más de 1
día.

 1 Laminilla de vidrio con el frote fijado, envuelta en papel para protección,

30
 transportada a temperatura ambiente si es el mismo día o en refrigeración si
tiene más de 1 día.

La única muestra que será procesada en el laboratorio de primer o segundo nivel será
el tubo con Agar Gelosa Chocolate con Polienriquecimiento inoculado. Si durante el
proceso se recuperó una cepa sospechosa o confirmada como Neisseria
gonorrhoeae, esta deberá ser enviada al InDRE en un cultivo fresco de 24 horas en
Agar Gelosa Chocolate con Polienriquecimiento, a temperatura ambiente,
correctamente identificada y sellada con el sistema de triple embalaje. Además, se
deberá enviar un hisopo AMIES con carbón inoculado con la cepa sospechosa o
confirmada de ser Neisseria gonorrhoeae a temperatura ambiente, correctamente
identificada y sellada con el sistema de triple embalaje.

En el paquete se deberá incluir el tubo sin aditivos que contiene los dos hisopos
inoculados, así como la Laminilla de vidrio con el frote fijado enviados por la clínica de
primer nivel de atención.

Enfermedad Diarreica Aguda (basado en los Lineamientos para la Vigilancia

por Laboratorio de la Enfermedad Diarreica Aguda Bacteriana, y los
Lineamientos para la Toma, Manejo y Envío de Muestras para Diagnóstico a
la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública, InDRE)

La muestra de materia fecal deberá ser procesada lo antes posible una vez recibida
en el laboratorio, de acuerdo a los lineamientos específicos para el procesamiento de
las muestras. Para la finalidad del presente proyecto, son de interés las bacterias
recuperadas del hisopo para identificación de enterobaterias cuyo proceso se
describe a continuación:

• Con un hisopo, realice una impronta en un cuadrante del medio de baja

selectividad (Agar MacConkey).

• Siembre por estría cruzada. Queme el aza y enfríe entre el segundo y el tercer
cuadrante.

31
 • El hisopo con el que se inoculó la placa de medio de baja selectividad se
introduce en un tubo con caldo de enriquecimiento para Salmonella (Caldo
tetrationato, caldo selenito).

• Incube la placa y el tubo a 36°C ± 1°C de 18 a 24 horas.

• Transcurrido el tiempo de incubación, tomé el hisopo del caldo de

enriquecimiento y haga la descarga en un extremo en al menos dos medios de
alta selectividad (agar verde brillante y agar sulfito de bismuto).

• La placa de verde brillante se siembra con asa redonda por estría cruzada.
Queme y enfríe el asa entre el segundo y el tercer cuadrante.

• La placa de sulfito de bismuto se siembra con un asa redonda por estría

cruzada sin quemar el asa entre cuadrantes.

• Incube la placa de agar verde brillante a 36°C ± 1°C de 18 a 24 horas, y la placa

de agar sulfito de bismuto durante 48 horas.

• A partir de las colonias aisladas, realice pruebas bioquímicas tradicionales o por

métodos automatizados para la identificación del agente causal. En caso de
contar con métodos automatizados para la determinación de la susceptibilidad
y resistencia a los antimicrobianos, realice la prueba según las indicaciones del
fabricante.

Envío de muestras al InDRE

• Inocule la cepa identificada en un tubo de ensaye de 13X100 mm con tapón de

rosca, en agar base sangre e incube durante 24 horas a 36°C ± 1°C. Durante la
inoculación seleccione de 3 a 5 colonias diferentes con el asa con las que
inoculará el medio de cultivo.

• Una vez que se muestre crecimiento en el tubo, cierre completamente el tapón

de rosca y selle con parafilm.

• Envíe las muestras al InDRE en sistema de triple embalaje a temperatura

32
 ambiente.

Infecciones de Vías Urinarias (basado en los Lineamientos para la Toma,

Manejo y Envío de Muestras para Diagnóstico a la Red Nacional de
Laboratorios de Salud Pública)

• Atempere e identifique con los datos de la muestra, así como fecha de siembra
una placa de Agar Sangre de Carnero y una placa de Agar CLED (Cistina-Lactosa
deficiente de electrolitos).

• Mezcle suavemente el frasco con la orina evitando formar burbujas.

• Utilizando un asa estéril calibrada de 0.001 mL, introduzca el asa en la orina de

forma vertical permitiendo cargar el volumen total. En caso de no contar con
este tipo de asas, puede tomar el volumen especificado con una micropipeta,
descargar el líquido sobre la placa y posteriormente estriar con el asa que tenga
disponible.

• Siembre en los diferentes medios haciendo una línea en un cuadrante y

posteriormente siembre por estría en las otras tres zonas.

• Incube las placas en aerobiosis a 36°C ± 1°C durante 18 horas y realice la lectura
de las placas. En caso de que a las 18 horas exista presencia de colonias pequeñas
o escasas apenas perceptibles, incube hasta por 48 horas.

• Cuente las colonias de cada placa en los cultivos positivos. Multiplique el

número de UFC contadas por placa por 1000 para determinar la cantidad de
microorganismos por mL de muestra original. Cuando las colonias están
confluyentes y no se puede contar el número máximo se deberá reportar el
conteo como >100,000 UFC.

• Realice pruebas primarias para la confirmación a nivel especie del

microorganismo aislado.

• Considere patógenos, independientemente de la cuenta, microorganismos

33
 inusuales como Salmonella Typhimurium, así como bacilos gram negativos
oxidasa e indol positivos.

• En el resto de los casos interprete según como se indica a continuación:

 1 Patógeno aislado

<10,000 UFC/mL no procesar

≥10,000 UFC/mL (o ≥1,000 UFC/mL en mujeres entre 14 y 30 años de edad),

Identificar y realizar pruebas de susceptibilidad.

 2 Patógenos aislados

<10,000 UFC/mL no procesar

≥10,000 UFC/mL, Identificar y realizar pruebas de susceptibilidad.

 3 Patógenos aislados

Un cultivo mixto en población ambulatoria sin complicaciones puede

indicar contaminación al momento de la recolección.

Para el reporte de resultados tome en cuenta los criterios de la cuenta de Kass:

a. Menor a 10,000 UFC/mL, solo se reportan S. aureus o S. agalactiae

b. Entre 10,000 y 100,000 UFC/mLse reporta la cuenta exacta

c. Mayor a 100,000 UFC/mL se reporta: mayor a 100,000 UFC

Streptococcus agalactiae debe ser reportado siempre, independientemente

del recuento de UFC, cuando se aísle en mujeres en edad fértil.

Envío de muestras al InDRE

• Para cepas no fastidiosas, inocule la cepa identificada en un tubo de ensaye de

13X100 mm con tapón de rosca, en agar base sangre e incube durante 24 horas

34
 a 36°C ± 1°C. Durante la inoculación seleccione de 3 a 5 colonias diferentes con el
asa con las que inoculará el medio de cultivo.

• Una vez que se muestre crecimiento en el tubo, cierre completamente el tapón

de rosca y selle con parafilm.

• Envíe las muestras al InDRE en sistema de triple embalaje a temperatura

ambiente.

• Para cepas fastidiosas, inocule con un cultivo fresco de 24 horas de la cepa

aislada, un hisopo e introdúzcalo en medio de transporte AMIES con carbón.
Durante la inoculación seleccione de 3 a 5 colonias diferentes con el hisopo con
las que inoculará el medio de cultivo, también puede hacer un arrastre de
biomasa de la superficie de la placa.

• Envíe las muestras al InDRE en sistema de triple embalaje a temperatura

ambiente.

9. REQUISITOS DOCUMENTALES
9.1 Unidades de Primer Nivel de Atención Tomadoras de Muestras

Las Unidades de Primer Nivel de Atención Tomadoras de Muestras deberán remitir

las muestras al Laboratorio Estatal de Salud Pública (LESP) de acuerdo a lo
establecido en la presente guía acompañando la muestra con la documentación
solicitada por el LESP y la historia clínica del paciente que por lo menos deberá incluir:

 Datos particulares del paciente

 Impresión diagnóstica

 Sintomatología

 Fecha de Toma de muestra

 Tipo de Muestra

35
  Tratamiento previo (Solo si existe)

 Tratamiento administrado

Si la muestra está contemplada dentro de un programa obligatorio, además de lo

anteriormente mencionado deberá registrar la muestra de la forma habitual
establecida.

9.2 Laboratorio Estatal de Salud Pública

 Los Laboratorios Estatales de Salud Pública deberán referir las muestras de

acuerdo a los procedimientos estándar para cada diagnóstico específico (de
existir). En estos casos deberán enviar la cepa aislada por duplicado (Una al
laboratorio cabeza de diagnóstico de la enfermedad específica y una al
Laboratorio de Resistencia Antimicrobiana).

 Cuando el microorganismo aislado o el tipo de muestra tomada no esté

contemplada dentro de algún diagnóstico del InDRE, deberá enviar la muestra
únicamente al laboratorio de Resistencia Antimicrobiana del InDRE.

 Los especímenes enviados al Laboratorio de Resistencia Antimicrobiana del

InDRE deberán ir acompañados de la historia clínica del paciente, el formato
REMU-F-12 FORMATO ÚNICO PARA EL ENVÍO DE MUESTRAS BIOLÓGICAS, así
como el oficio de solicitud con justificación “8 – Proyecto” dirigido a la Bióloga
Irma López Martínez, Directora de Diagnóstico y Referencia en el Instituto de
Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE), con atención a la Bióloga
Norma Angélica Montes Colima, Jefa del Departamento de Bacteriología del
InDRE.

36
10. DIAGRAMA DE FLUJO DE TRABAJO

37
38