Universidad de Guanajuato

Departamento de Medicina y Nutrición

Manual de Microbiología Clínica

Dr. Alejandro E. Macías Hernández

Dr. Juan H. Macías de la Cruz
Dr. Juan M. Muñoz Barrett
Dr. Juan L. Mosqueda Gómez
Dr. José A. Álvarez Canales

2015
Contenido

Parte 1. PROCEDIMIENTOS COMUNES EN MICROBIOLOGÍA CLINICA

1.1. Generalidades
1.2. Medios de cultivo y técnicas de siembra
1.3. Microscopia
1.4. Obtención y transporte de muestras
1.5. Incubación
1.6. Bibliografía

Parte 2. LA FLORA NORMAL

2.1. Bibliografía

Parte 3. IDENTIFICACION BACTERIANA

3.1. Generalidades
3.2. Identificación de cocos grampositivos
3.2. Identificación de enterobacterias y bacilos gramnegativos no fermentadores
3.3. Identificación de bacilos grampositivos
3.4 identificación de cocos gramnegativos
3.5 Bibliografía

Parte 4. EL PROCESO DE LA MUESTRA

4.1. Secreciones de piel y tejidos blandos
4.2. Líquido cefalorraquídeo y otros líquidos corporales
4.3. Sangre y medula ósea
4.4. Orina
4.5. Expectoración y aspirado bronquial
4.6. Exudado de la faringe, nasofaringe y oído
4.7. Heces. Cultivo y parasitoscópico
4.7b. Métodos coproparasitoscópicos
4.7c. Tinción tricrómica permanente
4.7d. Bibliografía
4.8. Exudado vaginal, cervical y uretral
4.9. Secreciones oculares
4.10. Cultivo de sondas y catéteres

Parte 5. EL LABORATORIO EN INFECCIONES POR HONGOS

5.1. Generalidades
5.2. Procedimientos de laboratorio
5.3. Estudios de piel, cabello y uñas para micosis superficiales
5.4. Líquidos corporales (cefalorraquídeo, pericárdico, peritoneal, sinovial)
5.5. Orina
5.6. Exudado vaginal
5.7. Secreciones respiratorias
5.8. Sangre y médula ósea
5.9. Secreciones purulentas
5.10 Bibliografía
Parte 6. EL LABORATORIO EN INFECCIONES POR MICOBACTERIAS
6.1. Generalidades
6.2. Recolección de muestras
6.3. Enfermedad pulmonar
6.4. Enfermedades extrapulmonares
6.5. Siembra
6.6. Digestión para cultivo de micobacterias.
6.7 Bibliografía

Parte 7. ESTUDIOS PARA ANAEROBIOS EN LABORATORIOS

GENERALES
7.1. Generalidades
7.2. Toma de la muestra
7.3. Métodos para el estudio de anaerobios
7.4. Medios para la siembra
7.5. Interpretación de los cultivos
7.6. Informe de anaerobios y sensibilidad a antimicrobianos
7.6. Conclusiones
7.7. Bibliografía

Parte 8. ESPECTRO Y DOSIS DE ANTIBIÓTICOS DE USO COMÚN

8.1. Betalactámicos.
8.2. Aminoglucósidos
8.3. Tetraciclinas
8.4. Anfenicoles
8.5. Rifamicinas
8.6. Nitroimidazoles
8.7. Nitrofuranos
8.8. Macrólidos
8.9. Lincosamidas
8.10. Glucopéptidos
8.11. Sulfas
8.12. Quinolonas de primera generación
8.13. Nuevas quinolonas
8.14. Oxazolidonas
8.15. Polimixinas
8.16 Bibliografía

Parte 9. EL LABORATORIO EN LAS INFECCIONES NOSOCOMIALES.

9.1. Generalidades
9.2. Participación del laboratorio en el comité de infecciones
9.3. ¿Qué hacer si en su hospital no existe un comité de infecciones?
9.4. Funciones específicas que debe apoyar el laboratorio para el control de las infecciones
nosocomiales
9.5. Bibliografía
Parte 10. INMUNODIAGNOSTICO Y SEROLOGIA
10.1. Generalidades
10.2. Aglutinación y precipitación
10.3. Reacciones febriles
10.3.3. Consideraciones para la interpretación adecuada
10.4. Técnica de ELISA
10.5. El perfil de TORCH
10.6. Casos clínicos
10.7. Bibliografía

Parte 11. BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA A LA MICROBIOLOGIA

CLINICA
11.1. Técnicas de hibridación
11.2. Técnicas de PCR
11.3. Usos actuales de técnicas moleculares en el diagnóstico
11.4. Bibliografia

ANEXO 1. SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

A1.1. Generalidades
A1.2. Comportamiento en el laboratorio
A1.3. Manejo de derrames
A1.4. Manejo de los desechos

A N E X O 2 . A N O TA C I O N E S PA R A A C O M PA Ñ A R A L G U N O S
RESULTADOS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
Prólogo

Este manual está elaborado pensando en el personal médico y de laboratorio

interesado en las enfermedades infecciosas y su diagnóstico por el laboratorio. Si se
encuentra usted involucrado en la atención de pacientes, se beneficiará al encadenar
sus conocimientos clínicos con los del laboratorio, sin importar la especialidad a la que
se dedique. Si trabaja en un laboratorio encontrará, además de consejos técnicos,
información médica y epidemiológica para dar sentido a los procedimientos. Si requiere
procesar estudios de microbiología sin ser un experto en este campo, este manual
podrá serle de gran ayuda. Conviene aclarar que no pretende sustituir a ninguno de los
excelentes manuales de microbiología a disposición en el mercado, que contienen una
amplia información y agotan los temas más allá de los alcances de este manual. Sin
embargo, precisamente por su extensión, los textos de que se dispone pueden abrumar
de información a quien requiere además conocer técnicas de hematología, clínica
química e inmunología. Lo que pretendemos es ofrecer una guía práctica para proceder
de manera expedita ante situaciones comunes en laboratorios no especializados en
microbiología, con una orientación de utilidad clínica. Siendo así, los aspectos de
microbiología ambiental quedarán fuera del alcance de esta obra.

En la primera parte se describirán fundamentos, técnicas y procedimientos

comunes en el laboratorio. Es una sección breve y debe leerse cuando no se dispone
de experiencia en procesar muestras. Las subsecuentes son consideraciones
particulares para cada muestra o situación clínica y puede consultarse en cada caso.
Hemos incluido una descripción del laboratorio y su utilidad para el control de las
infecciones nosocomiales, así como una breve descripción de técnicas moleculares.

Por último, conviene mencionar que este manual tiende a recomendar técnicas y
procedimientos de bajo costo, lo que es sin duda una ventaja para muchos laboratorios
clínicos, que requieren dar información útil pero que no cuentan con elementos para
efectuar una microbiología de alta especialización.
Parte 1. PROCEDIMIENTOS COMUNES EN MICROBIOLOGÍA CLINICA

1.1. Generalidades

El ser humano tiene una estrecha relación con un mundo microscópico del que
apenas de percata. Un ejemplo de ello es el microbioma que habita en el sistema
digestivo de los humanos. Este complejo ecosistema de bacterias, en su mayoría
comensales, está relacionado con el control de procesos metabólicos e inmunológicos
e incluso con el estado de ánimo de los anfitriones. Afortunadamente, la proporción de
bacterias que pueden llegar a ser patógenas para el humano son relativamente pocas,
lo que hace a la microbiología clínica diferente de la microbiología general.

Actualmente las pruebas que detectan antígenos específicos del agente, o

fracciones de su componente genético a través de pruebas de biología molecular son
muy socorridas por los clínicos; al igual que las pruebas que evalúan la respuesta
serológica del paciente con la producción de anticuerpos. Sin embargo, los
procedimientos de diagnóstico por cultivo permanecen como una de las principales
armas en el arsenal del personal clínico. Este manual tiene como fin el desarrollo de las
habilidades clínicas del estudiante de medicina, y por lo tanto está enfocado al cultivo
de diferentes tipos de muestras y a la descripción de las bacterias que con mayor
frecuencia producen enfermedad.

Las enfermedades infecciosas constituyen la causa más común de consulta en

pacientes ambulatorios y son una de las complicaciones más graves de los
hospitalizados. El clínico debe mantener un juicio razonable sobre los estudios de
laboratorios que requiere para confirmar sus sospechas clínicas, o bien para tomar una
decisión relevante en el proceso de mejoría del paciente. El diagnóstico clínico es a
menudo suficiente para orientar la etiología e instaurar un tratamiento, si el médico
conoce las causas de la enfermedad más comunes. En una menor proporción, los
métodos diagnósticos son necesarios para confirmar una sospecha clínica, sobre todo
en pacientes hospitalizados o ambulatorios con enfermedades de causa poco
predecible. La labor del laboratorio de microbiología es compleja, ya que los causantes
pueden ser virus, bacterias, hongos, parásitos; mientras que las muestras pueden ser
líquidos, tejidos o secreciones. El cultivo es el método clásico para el diagnóstico; sin
embargo, se debe considerar que el aislamiento de un germen, no necesariamente
indica que este sea el causante de la enfermedad, ya que puede ser un colonizador
normal o incluso un contaminante en el laboratorio. Por ello, el laboratorio de
microbiología clínica se asemeja al de histopatología en la necesidad de vincularse
íntimamente con el médico. Por ejemplo, si se toma una biopsia intestinal ante un caso
de diagnóstico dudoso, la buena práctica obliga a informar al patólogo las
características del paciente y algunos datos clínicos para su orientación.
Desgraciadamente, esta práctica no se ha extendido aún a la microbiología: es común
que las muestras que llegan sean inadecuadas, con apenas una solicitud con el
nombre del paciente, pero sin otros datos que orienten para profundizar la pesquisa en
el laboratorio.

Un ejemplo que puede resaltar, aun de mejor manera la comunicación entre el

clínico y el personal del laboratorio es el aislamiento de un estafilococo coagulasa
negativo. Como se verá más adelante en este manual, estas son bacterias que habitan
en la piel de los humanos, y pueden ser un contaminante frecuente de las muestras
clínicas, cuando no se toman o manipulan con el adecuado cuidado. Entonces, el
personal del laboratorio se enfrenta a un gran problema, reportar o no reportar el
crecimiento de dicho germen. Sin embargo, si el clínico informa que el paciente es
portador de una válvula cardiaca artificial y que tiene datos de endocarditis bacteriana,
el diagnóstico se vuelve evidente. De igual manera, si el enfermo no tiene antecedentes
de importancia y fue valorado por fiebre aguda, el personal de laboratorio, podrá
reportarlo como un contaminante. Es por tanto de mayor importancia insistir en una
estrecha relación entre el personal clínico y el personal del laboratorio. De parte del
clínico, quien debe de complementar la información de las muestras enviadas a cultivo,
así como para resolver cualquier duda del personal de laboratorio; y de parte del
personal de laboratorio que debe procurar un dialogo constante, e incluso salir del
laboratorio en busca de información adicional. El clínico es pues, finalmente, el
elemento fundamental en el control de calidad externo, pues aunque el laboratorio
cuente con el más estricto control de calidad interno, es el clínico quien observa si los
resultados son congruentes con el caso de estudio. Finalmente, la mencionada relación
deja siempre un aprendizaje para el médico y el laboratorista: el primero aprende
elementos técnicos y el segundo, clínicos. Así el personal del laboratorio encuentra
mayor motivación en su trabajo, pues hace conciencia de su importancia. Todo esto
redunda en una mejor calidad y en un beneficio máximo para el enfermo.

Conviene agregar algunos conceptos acerca de la flora normal, ya que la piel y

las mucosas hospedan siempre una gran diversidad de microorganismos. Estos se
conocen como la flora residente, que puede ser sólo comensal, como en la piel, o
simbiótica, como en algunas regiones del intestino. Cuando se altera la flora residente,
como al utilizar antibióticos de amplio espectro, se crea un vacío ecológico que es
ocupado por flora transitoria, que puede incluso proliferar y producir enfermedad. En el
laboratorio, la flora normal y la flora transitoria suelen producir dificultades para
interpretar los resultados; por ejemplo, si el cultivo de una paciente con flujo vaginal
informa la presencia de Candida albicans, no puede asegurarse que sea causa de
problema, dado que esta levadura puede ser parte de la flora normal o transitoria, sin
causar enfermedad. Es por ello que debe tenerse conciencia, siempre que se interprete
el cultivo de una región normalmente colonizada, que no todo lo que crece en cultivo es
un patógeno. También es cierto que no todos los patógenos crecen en cultivo, como es
el caso de la diarrea por rotavirus, cuyos coprocultivos son, obviamente, negativos. Si
se informa el cultivo de enterobacterias normales, un clínico sin buena información
puede desorientarse e indicar tratamientos antimicrobianos innecesarios y hasta
perjudiciales. Desgraciadamente, en muchos laboratorios de países en desarrollo eso
es práctica común, dada la carencia de normas y regulaciones al respecto. Los
laboratorios han aprendido que al clínico le molesta que una prueba no encuentre
germen alguno y prefieren informar incluso la flora normal, generalmente por presiones
de orden económico más que por ignorancia. En países desarrollados, eso se evita con
la publicación de normas a las que deben ceñirse los reportes de resultados. Cuando
esas normas no existen, un clínico mal informado tendrá dificultades para interpretar
los estudios y con frecuencia indicará tratamientos innecesarios o, incluso, dañinos.
Estas situaciones son muy comunes y se hacen presentes cuando el laboratorio
informa flora normal en pacientes con uretritis, vaginitis, conjuntivitis, faringitis,
amigdalitis o, incluso, neumonía (recuerde que el esputo habitualmente se contamina
con gérmenes de la boca).

1.2. Medios de cultivo y técnicas de siembra

1.2.1. Generalidades de los medios de cultivo

Se podría decir que la microbiología clínica clásica es un proceso casi artesanal,

sobre todo comparado con las nuevas técnicas de identificación bacteriana. Aun así,
los cultivos bacteriológicos son fundamentales para los laboratorios de microbiología.
Muchas de las técnicas utilizadas son heredadas del siglo pasado, con apenas algunas
modificaciones. En general se puede decir que las muestras clínicas pueden ser
sembradas en medios sólidos o líquidos, que a su vez pueden ser selectivos o no
selectivos. La selección de los medios a utilizar dependerá de las características de las
muestras y de los gérmenes que se espera encontrar. Es por tanto conveniente
describir algunos ejemplos para aclarar estos conceptos.

Los medios sólidos se conocen también como agares, pues es esta sustancia
gelatinosa derivada de las algas lo que les brinda su consistencia gelatinosa, incluso en
el rango de temperatura del cuerpo humano. Cuando se siembra con una asa de
alambre una muestra en un medio sólido, se puede observar después de un período de
incubación, el crecimiento de colonias bacterias. Cada colonia proviene de una sola
bacteria, por lo que éstas se nombran unidades formadoras de colonias (UFC). Es así
como el número de colonias nos permite cuantificar el número de número de bacterias
que presentes en la muestra cultivada. Es importante recalcar que esta es sólo una
proporción, y para llegar a conocer el número de bacterias por volumen de muestra, se
deben de realizar cálculos adicionales. Esta característica es de importancia cuando se
requieren cultivos cuantitativos, como el caso de los cultivos de orina, que sólo son
considerados positivos cuando se excede de una cuenta predeterminada. Además, las
características de las colonias forman parte de los métodos de identificación
bacteriana, ya que cada género bacteriano expresa diferentes fenotipos característicos.

Al tener en cuenta estas bondades de los medios de cultivo sólidos, se puede

pensar erróneamente que es inútil contar con medios de cultivo líquidos. Un ejemplo
puede ilustrar la falsedad de esta afirmación. Como se sabe, un paciente con
bacteriemia (infección del torrente sanguíneo) puede estar gravemente enfermo a
pesar de que en su sangre sólo existan una o dos bacterias por cada 10 mililitros.
Existe entonces una franca diferencia con las infecciones urinarias, en donde hay más
de 100,000 bacterias o UFC por cada mililitro de orina. Por lo tanto, para considerar
positiva una muestra de orina, una gota es más que suficiente, mientras que para el
cultivo de sangre, una gota es más que insuficiente en la mayoría de los casos. Por ello
se requiere la siembra de un gran volumen, habitualmente de hasta 10 mililitros.
Suponga que quiere sembrar dicho volumen en una caja de Petri (en las que
difícilmente podrá sembrar más de 200 mililitros), y podrá deducir la importancia de los
medios líquidos. Por desgracia, en los medios líquidos es imposible cuantificar el
número de colonias, y sólo se podrá observar un aumento en la turbidez del medio de
cultivo como un indicador del crecimiento bacteriano. La identificación se logrará, con el
aislamiento en medios de cultivo sólidos, de las bacterias presenten en el medio de
cultivo líquido. Esto es de importancia, ya que este proceso incrementa el tiempo de
espera para la obtención de un resultado definitivo, sin embargo las características de
las bacterias en la tinción de Gram son de importancia para el inicio de la terapia.

Los medios de cultivo líquidos también muestran su utilidad como medios de

respaldo, sobre todo cuando se cuenta con un volumen limitado de muestra biológica.
Un claro ejemplo puede ser el líquido cefalorraquídeo, ya que en las meningitis, aunque
el cultivo primario en agares generalmente resulta positivo, no es raro que la cantidad
de bacterias, al igual que el inóculo, sea muy baja y por lo tanto resulte problemático
para el personal de laboratorio realizar la identificación final. El tener un medio de
cultivo de respaldo servirá entonces, como un reservorio de bacterias, que facilitará la
tarea de identificación, al poderse sembrar volúmenes mayores de muestra, siendo
esta una de sus principales ventajas.

La principal desventaja de los medios de cultivo líquidos radica en su mayor

fortaleza, al ser medios enriquecidos que favorecen el crecimiento de las bacterias
presentes en las muestras; resulta muy difícil discriminar entre contaminación e
infección. Suponga que tiene problemas para la toma de un hemocultivo (el paciente se
mueve, no puede encontrar una sitio de toma adecuado), y la aguja se contamina con
un solo estafilococo de la piel, tarde o temprano el caldo se enturbiará y el resultado
será positivo, sin tener la posibilidad de establecer el número inicial de bacterias.
Entonces se requiere de criterios en la interpretación y de contacto con el clínico para
validar el resultado.

Analicemos ahora la necesidad de contar con medios no selectivos y selectivos.

Suponga que le solicitan el coprocultivo de un enfermo con diarrea aguda, y suponga
que la causa es Vibrio cholerae. Dado que el excremento alberga a una gran cantidad
de bacterias colonizadoras, encontrar el Vibrio en un medio no selectivo, se puede
convertir en algo así como sacar una aguja de un pajar. Sin embargo, si se siembra en
un medio de TCBS (ver tabla) se observará con facilidad el desarrollo, puesto que se
inhibirá el crecimiento de otros gérmenes. Obviamente, los medios que se requieren
son diferentes para cada muestra y no tendrá caso sembrar el medio TCBS en el
cultivo del líquido cefalorraquídeo. Al tratar el proceso de cada muestra en la segunda
parte de este manual, se sugerirán los medios selectivos y no selectivos para cada
caso. En la tabla 1 se muestran los medios más comunes, así como algunas de sus
propiedades.
 TABLA 1.1 Medios sólidos más comunes en el laboratorio

AGAR COMENTARIO
SANGRE Es el medio de cultivo sólido más utilizado. Esta adicionado con
sangre (generalmente de cordero) y permite el desarrollo de
casi todos los gérmenes habituales excepto Neisseria y
Haemophilus.
CHOCOLATE Además de los componentes del agar sangre, contiene factores
nutricios que permiten el desarrollo de Neisseria y
Haemophilus. La sangre se adiciona cuando el medio esta
caliento, lo que la hemoliza, produciéndose así su color
característico.
MacCONKEY Es el medio selectivo más común. Contiene cristal violeta y bilis
que impiden el desarrollo de bacterias grampositivas. Además,
contiene lactosa y un indicador que permite reconocer las
bacterias que la utilizan, pues se tornan rojizas, mientras que
las que no la utilizan permanecen incoloras.
EMB Es un medio de cultivo selectivo, similar al MacConkey, en el
que las bacterias fermentadoras de lactosa obtienen una
coloración azul-obscuro. Su uso es menos frecuente.
MULLER-HINTON Medio de cultivo no selectivo y no enriquecido. Es utilizado
principalmente para probar la susceptibilidad a antibióticos.
SS Se asemeja al agar MacConkey, pero contiene aditivos apra la
selección e identificación de Salmonella y Shigella. Contiene
sales de hierro que forman un precipitado negro ante la
presencia de cepas de Salmonella productoras de sulfuro de
hidrógeno.
 TABLA 1.1 Medios sólidos más comunes en el laboratorio (continuación).

SAL Y MANITOL Se trata de un agar con un alto contenido de sal, lo que permite
seleccionar estafilococos de muestras contaminadas. Contiene
además manitol y un indicador que permite distinguir a las S.
aureus (utiliza el manitol y vira el medio al amarillo), de las
cepas coagulasa-negativas (el medio permanece rosado).
THAYER-MARTIN Es un agar chocolate adicionado con nistatina, vancomicina y
colimicina. Estos evitan el crecimiento de hongos, cocos
grampositivos y bacilos gramnegativos, permitiendo así el
aislamiento de Neisserias de muestras contaminadas.
TCBS Contiene tiosulfato, citrato, sucrosa y sales biliares, estos
componentes le permiten aislar Vibrios de heces fecales. El
medio es azul-verdoso por la presencia del indicador azul de
bromotimol. Las colonias de V. cholerae tornan el medio al
amarillo debido a que acidifican el medio al utilizar la sucrosa.
XLD Es un medio de xilosa, lisina, desoxicolato y sales de hierro,
utilizado para seleccionar Salmonella y Shigella de muestras
fecales. El indicador rojo fenol, le da su color característico.
Las colonias de enterobacterias no patógenas son amarillas
pues acidifican el medio. Las colonias de Salmonella y Shigella
permanecen rojizas. Se forma un precipitado negro con las
cepas de Salmonella productoras de sulfuro de hidrógeno.
SABOURAUD Es un medio general enriquecido para el desarrollo de todo tipo
de hongos. No es adecuado para la siembra de muestras
contaminadas con flora habitual.
MYCOSEL Es un medo selectivo para el desarrollo de hongos patógenos
pues contiene cicloheximida, lo que no permite el desarrollo de
saprofitos como Aspergillus. Esta adicionado con cloranfenicol
para inhibir la flora bacteriana. Es muy útil para el cultivo de
lesiones de la piel.
 1.2.2. Técnicas para la siembra o inoculación

La inoculación apropiada de los agares y de los caldos es importante para la

interpretación posterior de los resultados. Afortunadamente, estos procedimientos son
uniformes y sencillos.

Para la siembra de las placas de agar, se toma la muestra con hisopo o con la
propia asa de alambre y se distribuye en el primer cuadrante de la caja.
Posteriormente, se efectúan tres estrías adicionales que crearán un efecto de dilución
de la muestra, con la consiguiente separación de las colonias en la superficie del agar.
Esto permitirá observar las características físicas de las colonias, sin que se
superpongan unas con otras. Para lograr este efecto, es importante considerar que la
segunda estría debe introducirse en dos ocasiones sobre la anterior, y la tercera y la
cuarta solo una vez, pues de lo contrario no se observará el efecto de dilución (figura
1.1). En cultivos con inóculos que se esperan altos (como coprocultivos y secreciones
purulentas), el asa debe quemarse entre una estriación y la siguiente, esperando un
tiempo prudente para su enfriamiento.

FIGURA 1.1. Inoculación y estriación de la placa.

 El cultivo de la orina es cuantitativo, por lo que habrá de sembrarse de manera
diferente (figura 1.2). En este caso, se toma un volumen estandarizado (1 uL) con la
ayuda de un asa calibrada. Este volumen se distribuirá en una primera estría
longitudinal en la placa de agar. Sin quemar el asa, se procederá a realizar una estría
continua perpendicular a la primera. Cabe mencionar que existen otras técnicas
cuantitativas más finas para el conteo bacteriano, como los métodos de diluciones
seriadas; sin embargo, estas exceden los límites del presente manual.

FIGURA 1.2. Inoculación de un cultivo cuantitativo de orina.

Al igual que el resto del tracto digestivo, la cavidad oral se encuentra colonizada
por un gran número de bacterias comensales. Al realizar la siembra de un exudado
faríngeo, el personal de laboratorio debe enfocarse a la búsqueda de los estreptococos
betahemolíticos. La hemólisis de éstos se observa mucho mejor en condiciones pobres
de oxígeno. Por ello, se deben efectuar varios piquetes con el asa en el medio ya
estriado, para que los gérmenes desarrollen en el interior del agar, facilitando la
betahemólisis alrededor del piquete (figura 1.3). La inoculación del hemocultivo se
tratará en su capítulo, así como la siembra de catéteres y sondas.
FIGURA 1.3. Método óptimo para inocular la placa de un exudado faríngeo. En la figura
del lado derecho se representa la hemolisis en los piquetes después de 24 horas de
incubación

1.3 Microscopia

El microscopio es uno de los instrumentos más útiles en el laboratorio de

microbiología, ya que es parte esencial de muchas de las pruebas. De los diferentes
tipos de microscopios, el más común es el microscopio óptico, debido a la relativa
sencillez de estructura y funcionamiento en relación a los otros tipos de microscopios.
Es importante conocer su funcionamiento y las partes que lo componen para evitar
dañarlos. En general el microscopio se compone de por los sistemas que a
continuación se detallan:

• Soporte. Es el encargado de formar la estructura rígida del aparato, dándole

sostén a los demás sistemas y se encuentra conformado por el brazo, el pié y
la platina.

• Óptico.se encuentra formado por los oculares y los objetivos, los cuales
permiten visualizar la muestra a estudiar hasta con un índice de resolución de
0.2 micras, dependiendo de cuál de ellos utilicemos.

• Mecánico. Consiste en todo el sistema que permite la movilización, tanto de

los lentes como de la muestra de estudio. Se encuentra compuesto por los
tornillos macro y micrométricos, así como por el sistema de movimiento para
la muestra que se encuentra en la platina. Algunos autores también
consideran al revólver (en el que se encuentran los objetivos) como parte de
este sistema.
 • Luminoso. Formado por la fuente de luz, el condensador y el diafragma, los
cuales permiten controlar la intensidad de la luz para lograr una imagen más
nítida.

FIGURA 1.4. Microscopio óptico compuesto.

1.3.1 Utilización del microscopio

Antes de utilizar un microscopio hay que tener una serie de conocimientos

básicos, ya que de ello depende la calidad de la imagen a obtener, y por lo tanto el
diagnóstico. Para comenzar, el microscopio debe de transportase tomando el brazo con
una mano y la base con la otra y en posición vertical hasta el sitio en el cual será
utilizado. La superficie donde coloque el microscopio debe ser plana e inmóvil. Una vez
que el microscopio en su lugar, abata completamente la platina y coloque la muestra de
estudio. Procure que la muestra se encuentre sobre la fuente de luz, en caso de
tratarse de una tinción, deberá encontrarse en uno de los bordes de la tinción.

Para iniciar el enfoque, deberá utilizar el objetivo de 10X (seco débil), si inicia
este proceso con algún otro lente puede dañar tanto el lente como la preparación. Es
importante mencionar que en el caso de los microscopios binoculares se deben utilizar
amos ojos para observar correctamente, lo cual se logra colocando los ojos a 1 ó 2 cm
de distancia de los oculares y abriendo o cerrando el ángulo entre os mismos según
sea necesario; la luz con la que se observe debe ser blanca, si la luz es amarillenta
utilice un filtro azul. Una vez que logra fundir las dos imágenes de ambos oculares en
una sola, enfoque el campo deseado; para ello, utilice el tornillo macrométrico hasta
que pueda reconocer la muestra que está observando. Para darle nitidez a su campo
visual, utilice entonces el tornillo micrométrico. Una vez que logra observar el campo
deseado, podrá cambiar de lente de aumento, para ello basta con girar el revólver,
cuidando de no dañar la preparación.

Aquí es necesario comentar que, al utilizar los objetivos seco débil y seco fuerte
(10X y 40X, respectivamente), la luz a utilizar debe ser más difusa, por lo cual, el
condensador generalmente debe colocarse abajo (lejos de la platina). Mientras que al
utilizar el objetivo de 100X o de inmersión, la luz debe de incidir en un solo punto, por lo
cual debe subir el condensador. La cercanía de la muestra, cuando se utiliza el objetivo
de inmersión, produce aberraciones visuales, las cuales se corrigen añadiendo una
gota de aceite de cedro entre el objetivo y la muestra.

PREPARACIONES

Existen dos tipos de preparaciones para su observación al microscopio de luz, las

frescas y las fijas. Las preparaciones frescas, se obtienen de muestras clínicas
recientes de las cuales se requiere observar, sin mucho detalle, el tipo de células que
presenta, así como la presencia de agentes tales como bacterias, hongos, parásitos,
entre otros. La realización de una preparación fresca es sumamente sencilla, basta con
tomar una pequeña porción de la muestra o de su centrifugado sobre un portaobjetos,
diluirla con una gota de agua o solución salina, retirar los detritus celulares
macroscópicos como las fibras y colocar un cubreobjetos. Una vez preparada la
muestra se podrá pasar a su observación. El tiempo de observación de una muestra
fresca debe ser el suficiente para que no se deshidrate y se cristalice; así mismo, la
observación se debe realizar con los objetivos de 10X y 40X, utilizándose la inmersión
sólo en casos excepcionales y por personas experimentadas. Un procedimiento común
para la observación de toda muestra, independientemente del objetivo que se utilice, es
recorrerla de la esquina superior a la esquina inferior del lado opuesto formando
grecas. De esta manera se puede asegurar que se recorrió la totalidad de la muestra.
Este tipo de preparaciones son de gran utilidad sobretodo en muestras donde se quiere
ver la movilidad de algunos microorganismos, generalmente parásitos. Algunas veces,
las muestras necesitan ser aclaradas para observarse mejor, como en el caso de las
lesiones producidas por algunos hongos (dermatofitos). La técnica es la siguiente:

1. Tome una muestra de la lesión mediante raspado sobre un portaobjetos.

2. Cubra con hidróxido de potasio al 10 o al 20%.

3. Caliente levemente la laminilla, puede colocarla en la estufa microbiológica

por 15 minutos.

4. Coloque el cubreobjetos y observe al microscopio.

 Las preparaciones fijas sirven para observar con mayor detalle las características
de la muestra ya que se valen de la preservación de la misma mediante su fijación al
portaobjetos y su coloración posterior. Otra ventaja importante, es que pueden ser
estudiadas por uno o más observadores en momentos diferentes, lo cual puede ayudar
en el diagnóstico en el caso en el que el observador inicial tuviera duda o careciera de
la experiencia suficiente. Este tipo de preparaciones por lo general se observan
también a seco fuerte e inmersión.

1.3.2 Coloraciones

Históricamente, las primeras observaciones efectuadas al microscopio se

realizaron sin colorantes. Como se comenta anterior mente las preparaciones en fresco
continúan siendo de importancia para el diagnóstico (como el análisis del sedimento
urinario, la búsqueda de parásitos en excremento, y la búsqueda de formas micóticas
en la piel). Sin embargo, el uso de los colorantes representó un hito en la historia de la
microbiología, pues permitió observar y clasificar las bacterias de mayor importancia
clínica. De hecho, las dos técnicas de coloración más importantes (Gram y Ziehl-
Neelsen) se diseñaron hace más de cien años, y siguen efectuándose casi sin
modificaciones. Quien quiera que tenga que atender a pacientes, o que trabaje en un
laboratorio clínico, debe saber elaborar e interpretar estas coloraciones. De ellas
trataremos en esta sección.

La coloración de Gram es muy sencilla. Se prepara el extendido del material de

estudio y se deja secar al aire. Se fija al calor del mechero, pasándolo rápidamente en
tres ocasiones (¡no sobrecaliente!). La técnica se detalla a continuación:

1. Cubra el extendido con cristal violeta por un minuto y enjuague con agua.

2. Cubra con lugol para Gram por un minuto y enjuague.

3. Decolore con alcohol acetona hasta que sólo las partes más gruesas del
extendido tengan color, y enjuague.

4. Cubra con safranina por 30 segundos y enjuague. Seque al aire; o, sin tallar,
con papel secante y observe. Los grampositivos retienen el colorante violeta
(azules), no así los gramnegativos (rosados).

El orden violeta, lugol, alcohol y safranina se recuerda fácilmente con la

nemotecnia VLAS. La preparación se observa primero en seco débil para evaluar la
calidad de la muestra, informándose la cantidad y proporción de leucocitos, eritrocitos y
células epiteliales. Al pasar a inmersión, se observan e informan los distintos morfotipos
bacterianos:
 • Cocos grampositivos en racimos o tétradas (sugieren estafilococos).

• Cocos grampositivos en cadenas y diplococos lanceolados (sugieren

esreptococos).

• Diplococos en forma de punta de lanza (sugieren neumococos).

• Cocobacilos grampositivos (sugieren corynebacterias o actinomicetos).

• Bacilos grampositivos (sugieren clostridios o Bacillus sp.).

• Levaduras (sugieren Candida, Criptococcus, Coccidioides, Histoplasma).

• Bacilos gramnegativos gruesos, algunos con tinción bipolar (sugieren

enterobacterias).

• Bacilos gramnegativos pequeños (siguieren Pseudomonas, Bacteroides,

Haemophilus).

• Cocos gramnegativos (sugieren Neisseria, Moraxella, Prevotella,

Acinetobacter).

La importancia de la coloración de Gram es enorme, y en muchas ocasiones es

mayor que la de un cultivo. Los siguientes ejemplos bastan para convencerse de ello.

1. Frecuentemente permite contar con información relevante para el diagnóstico

mucho más tempranamente que el cultivo, lo que puede resultar vital para el
paciente, ya que la información es más útil mientras sea más oportuna. El
caso más claro puede ser el de los pacientes con bacterias en líquidos
normalmente estériles (sangre, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial), ya
que el manejo ideal depende del diagnóstico bacteriológico.

2. Coadyuva para evaluar la calidad de la muestra. El mejor ejemplo es el cultivo

de expectoración. Si en la coloración de Gram se observan abundantes
células epiteliales de la boca y escosas leucocitos, se colige que la muestra
es de calidad insuficiente para el cultivo, y que de hecho, no debe cultivarse.

3. Permite evaluar discrepancias entre la observación y el cultivo posterior. Por

ejemplo, en algunos cultivos de secreciones abdominales existe sólo
desarrollo de bacilos gramnegativos, pero en la coloración se observa
abundante flora de grampositivos. En estos casos, se deduce con facilidad
que existe flora de anaerobios que no desarrollaron pues no se sembró en el
ambiente adecuado. De hecho la sola observación de flora polimicrobiana en
 presencia de leucocitos hace pensar en anaerobios, aun antes del desarrollo
en cultivo.

4. En algunos casos tiene utilidad cuantitativa, por ejemplo, si se observan

bacterias en la coloración de la orina sin centrifugar, generalmente puede
deducirse que el cultivo será positivo a más de 100,000 UFC/mL.

5. Permite observar la presencia de la flora normal. El ejemplo más claro es la

observación del exudado vaginal. Si existe flora normal (bacilos
grampositivos) generalmente indica que no se encontrarán patógenos en
cultivo, ya que éstos generalmente desaparecen en la presencia de
patógenos. En este mismo caso, el cultivo puede desarrollar Candida, pero
seguramente tendrá representación clínica sólo si la levadura puede
observarse también en la coloración de Gram, ya que de otro modo
corresponde a un colonizador normal.

Estos ejemplos explican de sobra que se diga que un cultivo sin una coloración
de Gram es como una primavera sin sol. El tiempo que suele invertirse en la
elaboración de la coloración se justifica fácilmente por la utilidad que representa un
informe temprano y por el ahorro de tiempo y recursos pro no procesar muestras
inadecuadas. La coloración de Gram ha sido también la base para clasificar las
bacterias más comunes, como se observa en la Tabla 1.2. Algunos gérmenes se tiñen
mal, o no se tiñen, con la coloración de Gram, por lo que no es posible clasificaros aquí
(tabla 1.3).

TABLA 1.2. Bacterias más comunes, de acuerdo con su tinción.

AEROBIOS
Cocos grampositivos Streptococcus, Staphylococcus.
Bacilos grampositivos sin esporas Nocardia, Erypelothrix, Corynebacterium, Listeria.
Bacilos grampositivos con esporas Bacillus.
Cocos gramnegativos Neisseria
Bacilos gramnegativos gruesos Escherichia coli, Citrobacter, Serratia, Proteus,
(enterobacterias) Salmonella, Shigella, Yersinia.
Bacilos gramnegativos finos (no P s e u d o m o n a s , P a s t e u r e l l a , B r u c e l l a ,
fermentadores) Haemophilus, Legionella, Francisella,
Acinetobacter.
ANAEROBIOS
Cocos grampositivos Peptococcus, Peptostrptococcus.
Bacilos grampositivos sin esporas Actinomyces.
Bacilos grampositivos con esporas Clostridium
Bacilos gramnegativos Bacteroides, Fusobacterium

TABLA 1.3. Bacterias que no se tiñen adecuadamente con la coloración de Gram.

Espiroquetas Treponema, Borrelia, Leptospira.

Micobacterias Mycobacterium
Micoplasma Mycoplasma, Ureaplasma
Intracelulares obligados Chlamydia, Rickettsia, Coxiella.

La coloración de Ziehl-Neelsen generalmente se usa para detectar micobacterias

(causantes de la tuberculosis o la lepra), aunque algunas variantes se emplean en el
diagnóstico de actinomicosis o criptosporidiosis. Su elaboración también es sencilla:

1. Prepare el extendido igual que para la coloración de Gram.

2. Cúbralo con fucsina, caliente durante 5 minutos, manteniendo emanación de

vapor. ¡No permita que hierva o se seque!, si requiere, agregue más
colorante. Al finalizar enjuague con agua.

3. Decolore con alcohol ácido hasta que solo las regiones más gruesas
mantengan algo de color (generalmente uno o dos minutos). Enjuague.

4. Contratiña con azul de metileno por un minuto. Seque y observe. Los

gérmenes ácido-alcohol resistentes se observan de color rojo vivo sobre
fondo azul.

La coloración de Kinyoun, es una modificación de la tinción de Ziehl Neelsen,

sólo que se utiliza fucsina combinada con un detergente, y no requiere calor. Por lo
tanto, el único cambio es la colocación del colorante por 3 a 5 minutos, siendo igual el
resto de la técnica.

La coloración de Wright es excelente para teñir muestras con células hemáticas.

Su proceso es el siguiente:

1. Fije el extendido con metanol por 5 segundos.

 2. Insufle aire seco.

3. Cubra el extendido con el colorante de Wright (el tiempo depende de cada

lote).

4. Añada buffer hasta producir una superficie verdosa.

5. Mezcle el colorante y el buffer soplando suavemente.

6. Lave con buffer.

7. Seque.

Las tinciones de inmunofluorescencia utilizan un anticuerpo acoplado a un

compuesto fluorescente, dirigido contra un antígeno específico que permite visualizar
microorganismos u otras estructuras dentro de las células. Bajo un microscopio de
fluorescencia, un rayo de luz UV excita el compuesto fluorescente, que emite luz de
longitud de onda mayor (visible). Estas tinciones se utilizan para detectar bacterias de
difícil crecimiento, como Legionella o Chlamydia, o para detección de virus
(citomegalovirus, herpes).

1.4 Obtención y transporte de muestras.

La obtención y traslado de muestras para cultivo, es tan relevante como el propio

resultado del examen. Las técnicas del laboratorio de microbiología amplifican la
población bacteriana presente en la muestra, y un error en estos procesos puede llevar
a la falta de aislamiento del agente causal, o al aislamiento de un agente que no es el
causal de la enfermedad. Nunca se puede insistir demasiado en que una muestra
inadecuada llevará a un error en la decisión del clínico, y por lo tanto a un pobre
resultado de la terapéutica empleada.

Para la recolección y traslado de la muestra, existen principios que son generales

y otros particulares para cada muestra. Entre los principios generales cabe recalcar:

1. Rotule adecuadamente la muestra que enviará al laboratorio, asegúrese de

que el nombre y la localización coinciden con el paciente.

2. Envíe la muestra al laboratorio en cuanto sea posible. Asegúrese de conocer

los procedimientos para guardar muestras cuando el laboratorio esté cerrado.

3. Preferentemente tome el espécimen antes de administrar antibióticos. El uso

de antibióticos no contraindica la toma de la muestra.
 4. Acompañe la muestra de una solicitud en la que se expongan los datos
clínicos más relevantes, para que el laboratorista pueda seleccionar los
medios ideales.

5. Tome interés en el destino de la muestra. Si la envía a través de una tercera

persona, asegúrese que sea entregada en tiempo y forma. Para muestras
valiosas (biopsias, líquidos estériles), es mejor que lleve la muestra usted
mismo, recuerde: “no hay como uno”.

6. Solicite resultados preliminares de muestras en fresco, coloraciones y

cultivos.

Los principios particulares de cada muestra se mencionan en las secciones

posteriores, pero conviene adelantar los más importantes.

1.4.1 Sangre

La sangre es una de las muestras más importantes del laboratorio de

microbiología, ya que el diagnostico de septicemia sólo se puede hacer mediante el
aislamiento de bacterias en sangre. La piel se debe preparar primer con un antiséptico,
puede utilizar gluconato de clorhexidina, yodo – povidona o alcohol isopropílico. El
antiséptico deberá aplicarse del centro a la periferia, en movimientos circulares y
dejarse secar durante un minuto. En el adulto deberán tomarse de 5 a 10 mL y vaciarse
en un frasco con la cantidad suficiente de medio de cultivo para lograr una dilución
mínimas de 1:10 (o sea, al menos 100 mL de caldo). Es importante tomar al menos dos
hemocultivos y hasta tres, para darle una mayor sensibilidad a la prueba; cuando sea
posible tome al menos un hemocultivo de sangre central. Siempre es preferible la toma
de muestra durante el pico febril, a excepción de neonatos, adultos mayores y otros
pacientes incapaces de responder con fiebre. Es importante recordar que los niños
tienen un menor volumen sanguíneo circulante, por la tanto, una muestra de 5 a 10 mL
puede representar una proporción considerable. En los niños se deben tomar entre 1 y
2 mL (4 a 4.5% del volumen de sangre) para realizar el hemocultivo. En ambos casos,
los hemocultivos deberán tomarse con un lapso de 10 a 15 minutos. Evite el cambio de
la aguja para la inoculación de la muestra en el medio de cultivo, ya que el cambio de
aguja incrementa de manera considerable el riesgo de punción accidental.

1.4.2 Expectoración y aspirado bronquial

Un requisito fundamental para la obtención del esputo, es que el paciente sea

expectorador. Antes de la recolección de la muestra, el paciente deberá enjuagar la
boca con agua, para disminuir la cantidad de flora bacteriana en la cavidad oral. La
muestra debe recolectarse en frasco estéril y trasportarse con rapidez al laboratorio, a
donde debe llegar antes de hora. A su llegada al laboratorio, el personal técnico deberá
valorar la calidad de la muestra, mediante la tinción de Gram. Si existe un excesivo
número de células epiteliales orles, no debe sembrarse. Las muestras tomadas por
aspirado traqueal deberán sembrarse a pesar de no cumplir con este criterio.

1.4.3 Exudado faríngeo

El cultivo del exudado faríngeo es uno de los más frecuentemente solicitados al

laboratorio de microbiología; sin embargo, su relevancia clínica es mínima. La toma de
muestra debe tomarse con el mayor cuidado posible, toda vez que la cavidad oral se
encuentra colonizada por una gran cantidad de bacterias. La muestra se tomará con
abatelenguas e hisopo, se debe raspar la faringe y ambas amígdalas, evitando lo más
posible el contacto con el resto de la mucosa oral. Siempre que sea posible, inocule la
muestra de manera inmediata; cuando no sea posible, utilice un medio de trasporte
para introducir el hisopo. Este es uno de los pocos casos en que no suele hacerse una
coloración de Gram a la muestra, pues la flora normal es muy abundante, y sólo se
reserva para sospechas clínicas específicas como difteria y candidiasis.

1.4.4 Secreciones

Siempre es preferible que la secreción sea tomada mediante punción con jeringa,
ya que permite incluso el cultivo de anaerobios. Si cuenta con tubos de transporte para
anaerobios, vacíe ahí la muestra. No vacíe el contenido en tubos ordinarios pues, como
contienen oxígeno, se pierde la posibilidad del cultivo de anaerobios. Si no es posible
aspirar con jeringa, tome con hisopo estéril, de la región más profunda posible,
separando los bordes de la herida, o bien, del sitio donde exista mayor acumulación de
secreción; una vez tomada la muestra coloque el medio en un medio de transporte.
Elabore por separado un extendido para la tinción de Gram, ya que siempre es
preferible observar la secreción sin los artefactos del medio de transporte (fibras, geles,
etc).

1.4.5 Orina

Para hacer la correcta recolección de la muestra, se debe limpiar la región

periuretral (vulva y labios, o pene) con agua y jabón. La primera parte de micción debe
desecharse, ya que estará contaminada con flora habitual. Lo ideal es capturar el
chorro medio en frasco estéril. La orina constituye un medio de cultivo ideal, y como el
urocultivo es cuantitativo, es fundamental su envío inmediato al laboratorio. Si prevé
que existirá retraso para la entrega de la muestras, colóquela en hielo y envíe (¡no la
congele!).

1.4.6 Excremento
 Para el coprocultivo generalmente se solicitan sólo muestras diarreicas (con
excepción de los cultivos de interés epidemiológico), preferentemente obtenidas
durante los tres primeros días de la enfermedad. Al observar el espécimen enviado, la
muestra deberá tomarse de donde se observe una mayor cantidad de moco. Si no se
puede obtener una muestra espontánea, se puede introducir un hisopo en la ámpula
rectal, o preferentemente, una cucharilla especial de vidrio. Las muestras deben
procesarse de inmediato pues se produce una rápida proliferación de comensales y
desaparición de patógenos. Si no se puede procesar de inmediato, la muestra se debe
colocar en un medio de transporte (generalmente Cary-Blair).

1.4.7 Exudado vaginal

Sólo tiene utilidad cuando se toma con la técnica adecuada en el laboratorio (ver
capítulo correspondiente), ya que debe observarse en fresco, tomarse pH y otras
pruebas, carece de utilidad cuando se envía sólo el hisopo en medio de transporte.

1.4.8 Líquidos corporales

Si se obtienen en jeringa, envíese intacta al laboratorio; si se obtienen en tubos,

se deben enviar preferentemente con tapón de hule. El retraso en el transporte
ocasiona pérdida rápida de patógenos, principalmente de Haemophilus influenzae.

1.5 Incubación

1.5.1 Temperatura y humedad

Casi todos los cultivos de rutina deben sembrarse en incubadora de 35 a 37 °C.

es importante revisar todos los días las temperaturas de la incubadora y anotarlas en
un registro adherido por fuera, ya que el calor excesivo puede inactivar a muchos
patógenos y el enfriamiento, retardar su crecimiento. Para evitar la desecación de los
cultivos, es deseable una incubadora con control de humedad, en su defecto, se puede
colocar un recipiente con agua en su interior. Cuando se busca rutinariamente
Campylobacter en coprocultivo, se debe contar con una incubadora a 42 °C.

1.5.2 Tiempo

Casi todos los cultivos en aerobiosis se incuban entre 18 y 24 horas. En pocas

ocasiones se requiere esperar hasta 48 horas. Desde luego, esto es verdad sólo para
las bacterias habituales, pues los anaerobios pueden requerir varios días, y algunos
gérmenes como hongos o micobacterias, varias semanas. Es buena costumbre
mantener los caldos hasta 5 días, examinándolos todos los días en busca de turbidez.
Esto es particularmente útil cuando el inóculo fue pobre o el paciente estaba bajo
prescripción de antibióticos.
 1.5.3 Atmósfera

Muchas de las bacterias patógenas tienen la capacidad de crecer en la atmósfera

normal. Sin embargo, casi todos los gérmenes desarrollan mejor en un ambiente rico
en CO2, que se obtiene con incubadoras especiales alimentadas con cilindro de gas,
que producen un ambiente con un 6% de CO2. Si no se cuenta con ella, pueden
introducirse los medios en un frasco con vela de extinción (figura 1.4). Este sistema
proporciona una atmósfera con 3% de CO2, que, sin ser ideal, es suficiente para la
mayoría de los gérmenes que lo requieren (capnofílicos). Siempre que se siembre un
medio de chocolate o Thayer Martin, habrá de incubarse en un ambiente capnofílico.

Figura 1.4. La extinción de una vela produce una atmósfera con 3% de CO2.
 Este ambiente capnofílico no es una atmósfera anaerobia, como en ocasiones se
cree. Para el logro de una atmósfera anaerobia, se requiere de una jarra hermética en
que se coloca un sobre generador de CO2 y de H2, los cuales, en contacto con un
catalizador producen agua y consumen el oxígeno, logrando además un medio
reducido (figura 1.5).

Figura 1.5. Para lograr una atmósfera anaerobia, se requiere una jarra especial, un
sobre generado y un catalizador. Se coloca un indicador para asegurar que se logró el
ambiente deseado.
 1.6 Bibliografía
1. Baron EJ, Miller JM, Weinstein MP, Richter SS, Gilligan PH, Thomson RB, Bourdeau P,
Carroll KC, Kehl SC, Dunne WM, Robinson-Dunn B, Schwartzman JD, Chapin KC, Snyder
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2. Mühlhauser M, Rivas L. Laboratorio de microbiología: conocimientos básicos para un

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4. Deak E, Charlotn CL, Bobenchik AM, Miller SA, Pollett S, McHardy I, Wu MT, Garner OB.
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14. Yeh DD. A clinician’s perspective on laboratory utilization management. Clinica Chimica Acta
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Parte 2. LA FLORA NORMAL

Como se comentaba anteriormente, los humanos vivimos inmersos en un

universo de organismos microscópicos, con los que tienen una estrecha relación. Las
superficies externas del cuerpo, se encuentran recubiertas por bacterias comensales,
habitualmente no patógenas, que juegan un papel de importancia en el metabolismo
del humano. Por ejemplo, las bacterias que conforman la flora intestinal, facilitan la
absorción de nutrientes, el metabolismo de algunos elementos de la vitamina K,
pueden incluso disminuir la resistencia a la insulina, entre otras muchas funciones que
apenas se están detallando. También funcionan como un sistema de defensa contra
bacterias potencialmente patógenas, ya que compiten por los nutrientes evitando
mediante un mecanismo conocido como interferencia bacteriana, la colonización por
agentes externos.

La supresión de los microorganismos comensales habituales crea un vacío

ecológico, que tiende a ser ocupado de inmediato por gérmenes con los que no
estamos evolutivamente preparados para convivir. Debe aclararse, que los gérmenes
habituales pueden también causar enfermedad, si se conjuntan las condiciones
adecuadas. Un ejemplo puede ser la colonización por enterobacterias en pacientes
hospitalizados o en aquellos con deficiencia grave de neutrófilos, secundaria a la
quimioterapia contra el cáncer. Normalmente, Bacteroides fragilis es una de las
bacterias más comunes en el intestino grueso y es absolutamente inocua, pero cuando
esta sale del intestino al peritoneo, causa sepsis a menudo mortal.

Tanto el médico como el personal del laboratorio de microbiología deben conocer

los componentes de la flora habitual, también conocida como microbiota normal. Y es
que, si bien el reporte de un germen aislado de un sitio normalmente estéril (como la
sangre, o el líquido cefalorraquídeo) no suelen representar problemas en su
interpretación. El informe y la interpretación de cultivos de sitios normalmente
colonizados es un arte mal dominado por la mayoría del personal clínico. Por ejemplo,
si en un exudado uretral se informa E. coli, no significa por ello que esta enterobacteria
esté causando problema alguno, sobre todo cuando sabemos que es un componente
normal de la flora de la uretra terminal. Lo mismo puede decirse de los estafilococos
aislados de la garganta, de enterobacterias en la vagina, de estreptococos de la
conjuntiva, etc.

Conviene agregar que la flora normal puede dividirse en residente y transitoria.

La primera está dada por tipos de microorganismos relativamente constantes que, si se
trastornan (con el uso de antibióticos, por ejemplo), se restablece con rapidez. La
segunda consiste de gérmenes que provienen del ambiente y se establecen sólo por
horas o días, y no tienen importancia habitual siempre y cuando no se trastornes la
flora normal; cuando ello ocurre, o cuando el huésped sufre inmunosupresión, la flora
transitoria puede proliferar y causar enfermedad.

Tabla 2.1. Bacterias comensales de acuerdo a sitios específicos.

Sitio específico Flora normal

Piel y parte terminal • Estafilococo coagulasa negativo.
de la uretra. • Staphylococcus aureus (escasa cantidad).
• Candida (escasa cantidad).
• Acinetobacter (escasa cantidad).
Boca, mucosa nasal • Estreptococos (con excepción de
y faríngea. betahemolíticos).
• Estafilococos (coagulasa positivo y negativo).
• Enterobacterias (en escasa cantidad).
• Neumococo (30% de las personas).
Tubo digestivo • Estafilococos coagulasa positivo y negativo.
• Todas las enterobacterias, excepto Salmonella,
Shigella, Yersinia, Edwarsiella y Vibrio.
• Bacilos gramnegativos no fermentadores
(Pseudomonas).
• Enterococos.
• Estreptococos alfa hemolíticos y no hemolíticos.
Vagina • Lactobacilos
• Estreptococos alfa hemolíticos y no hemolíticos.
• Enterococos.
• Enterobacterias.
• Bacilos gramnegativos no fermentadores.
• Estafilococo coagulasa negativo.
• Staphylococcus aureus (escasa cantidad).
Conjuntiva • Estafilococo coagulasa negativo
• Estreptococos alfa hemolíticos y no hemolíticos.
• S. aureus (escasa cantidad).

Es muy complejo describir con precisión toda la flora normal. Para empezar
puede decirse que existe una gran cantidad de anaerobios en la piel, las vías digestivas
y las vías respiratorias altas, así como en la vagina. Por ello, no deben hacerse cultivos
para anaerobios de muestras tomadas de algunas de estas superficies, o que hayan
estado en contacto con ellas. De los anaerobios normales, generalmente predominan
los grampositivos, con excepción del colon, en donde predominan los bacilos
gramnegativos (Bacteroides fragilis). En pequeñas cantidades, puede existir una flora
normal de hongos del género Candida. Existe una gran variedad de parásitos
monocelulares que viven normalmente en el tubo digestivo, como amebas no
histolíticas, Endolimas, Blastocystis, Trichomonas (o vaginalis) y Chilomastix. No se
sabe bien si existe una flora viral normal, por lo que cualquier virus aislado en cultivo
suele considerarse patógeno. Además de la flora mencionada, existen muchas
bacterias en sitios específicos como se muestra en la tabla 2.1.

2.1 Bibliografía
1. Cho I, Blaser MJ. The human microbiome: at the interface of health and disease. Nat Rev
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2. Keeney KM, Yurist-Doutsch S, Arrieta MC, Finlay BB. Effects of antibiotics on human
microbiota and subsequent disease. Annu Rev Microbiol 2014;68:217-235.
Parte 3. IDENTIFICACION BACTERIANA

3.1 Generalidades

La identificación bacteriana es una de las funciones primordiales del laboratorio,

pero nada causa mayores diferencias de opinión entre los microbiólogos que la
comparación de criterios aplicados a la identificación entre un laboratorio y otro. Sin
embargo, debemos reconocer que las diferencias taxonómicas no siempre significan
diferencias en la eficacia del tratamiento o pronóstico. En realidad, no es generalmente
el nombre del microorganismo lo que cuenta. Mientras que algunos laboratorios
especializados podrán identificar todos los microorganismos hasta sus últimas
consecuencias, sin reparo en tiempo y costo, es claro que la mayoría de los
laboratorios generales no pueden hacerlo, ni los médicos a que sirven proporcionarán
un mejor cuidado a sus pacientes como consecuencia de ellos. De hecho, los médicos
que tratan enfermedades infecciosas sólo intermitentemente tenderán a usar esta
información.

Generalmente se identifican todas las bacterias aisladas en cultivo puro, o hasta

un máximo de tres aislamientos de crecimientos polimicrobianos (cuando la tinción de
Gram muestra abundancia de leucocitos y escasez de células epiteliales). En otros
casos, los aislamientos no deberán identificarse completamente. Por ejemplo, cuando
hay desarrollo de cuatro o más gérmenes, la identificación completa y sensibilidad a
antibióticos no contribuyen más al diagnóstico y al tratamiento que una identificación
presuntiva basada en las características generales de las colonias, en ocasiones
auxiliada por pruebas rápidas (catalasa, coagulasa, oxidasa, etc.). La identificación
incompleta se aplica también a microorganismos presentes en cuentas menos que
100,000 UFC/mL de oria, o cuando se obtienen más de dos gérmenes en cuentas
significativas. El dar utilidad a la identificación bacteriana de cultivos mixtos implica en
ocasiones identificar el germen que desarrolla más abundantemente, cuando
correlaciona con lo que se observa en la tinción de Gram. Es también un ejercicio
clínico que requiere que el personal del laboratorio mantenga contacto con el médico
tratante para tomar decisiones.

Debe advertirse que los costos de la identificación deben balancearse contra la

utilidad clínica. Por ejemplo, la identificación con antisueros es más precisa que la
sensibilidad a la bacitracina para la identificación del estreptococo del Grupo A, dado
que algunos estreptococos de otros grupos pueden por excepción dar esta prueba
positiva. Sin embargo, el costo es al menos 10 veces mayor con el primer método, por
lo que, para los fines clínicos, el segundo es generalmente satisfactorio.

Incluso, cuando se ha decidido efectuar una identificación completa de uno o

varios microorganismos, el trabajo debe considerar el tiempo, puesto que un informe es
más útil mientras sea más rápido. Por ejemplo, si existe duda en la identificación
precisa de una especie, será mejor informar “Enterobacter sp” que esperar 24 horas
más para enviar un resultado definitivo, este reporte será suficiente para que el clínico
pueda tomar una decisión en cuanto a la terapia que deberá implementar. En los
hemocultivos positivos, es de importancia reportar a la brevedad los hallazgos en la
tinción de Gram, sin esperar a la identificación final. Es siempre importante enviar
informes preliminares como “Desarrollo de bacilo gramnegativo, lactosa positivo,” y no
esperar hasta la identificación y antibiograma completos pues es común que, cuando
se recibe el resultado, ha dejado de tener utilidad. Nunca debe permitirse que una
muestra permanezca más de 48 horas en un laboratorio sin haber enviado algún
informe, así sea preliminar. Un informe inmediato que indique que la coloración de
Gram de la muestra contiene leucocitos y bacterias puede ser mucho más valioso para
el clínico que una identificación y antibiograma precisos dos días después.

Conforme con la estructura de este manual, se indican los criterios mínimos de

identificación, conscientes de que la pureza académica aconsejaría, en muchos casos,
un trabajo más exhaustivo, que frecuentemente excede las posibilidades de los
laboratorios generales. Por ello mismo, nos limitaremos a la identificación de gérmenes
aerobios y con orientación sobre las pruebas bioquímicas más que de otro tipo (como
el uso de antisueros, cromatografía o sondas moleculares). En el capítulo siguiente se
comentan algunos procedimientos para anaerobios.

3.2. Identificación de cocos grampositivos.

3.2.1 Generalidades.

Después de las enterobacterias, los cocos grampositivos son los

microorganismos más comunes en el organismo humano, ya que se encuentran
prácticamente en todos los sitios que se encuentran habitados por bacterias. Aun
cuando son comensales, frecuentemente están involucradas en cuadros infecciosos
que van desde una leve infección de la piel, hasta una septicemia mortal. Estos
microorganismos son aerobios y anaerobios facultativos. Los grupos más importantes
son la familia Micrococcaceae, de la cual destacan los estafilococos, y el grupo de los
estreptococos.

Debido a su importancia médica por la gran cantidad de cuadros que producen,

y a la confusión que pudiera generar su aislamiento en un momento determinado en
alguna muestra clínica, vamos a tratar específicamente a los géneros Staphylococcus y
Streptococcus. Aunque las características de las colonias de los dos géneros son muy
diferentes, puede existir alguna duda al momento de identificarlas, sobre todo al
realizarse una tinción de Gram y observar cocos positivos. La prueba diferencial entre
ambos géneros es la producción de catalasa, que resulta positiva sólo para los
estafilococos.

3.2.2 Estafilococos

Existen varias especies de estafilococos que se pueden aislar de muestras

clínicas, que para fines prácticos, conviene clasificar por su capacidad para coagular el
plasma (S. aureus), y los coagulasa negativos (S. epidermitis, entre otros). Hay que
recordar que, aun cuando las cepas que coagulan el plasma se consideran patógenas,
las que no lo hacen también pueden generar enfermedad en algunos pacientes. Por lo
que es necesario el criterio del clínico para determinar si los estafilococos coagulasa
negativos, pueden ser la causa de la enfermedad del paciente. Además de esta prueba,
el uso de manito y la producción de DNAsa, son pruebas que nos podrán ayudar a
diferencias a S. aureus del resto de estafilococos coagulasa negativos.

Para los fines clínicos, una vez que se ha determinado que la prueba de
coagulasa es negativa, se acostumbra informar sólo “Estafilococo coagulasa-negativo”,
ya que una identificación completa de la especie rara vez tiene beneficio para el
paciente. Sin embargo, debemos aclarar que no todos los estafilococos coagulasa
negativos son S. epidermidis, por lo que es mejor el informe con la primera
denominación.

3.2.3. Estreptococos

En este grupo se encuentran algunos de los microorganismos que producen más

enfermedad y muerte a escala mundial. La clasificación del genero Streptococcus se
basa en los carbohidratos de su pared celular (polisacárido C) y consta de 18 grupos
antigénicos denominados de la A a la H y de la K a la T. Los estreptococos
considerados patógenos pertenecen principalmente a los grupos A, B y D. Existen
además otros grupos potencialmente patógenos que no se encuentra dentro de la
clasificación anterior, el S. viridans y el S. pneumoniae.

Una de las características más importantes en estos grupos es la producción de

hemolisis en los medios con sangre. Se conoce como alfa cuando esta es parcial, beta
cuando es completa y gamma cuando no se produce (lo cual parece una denominación
incorrecta, pero está muy arraigada).

En el grupo A, se encuentra el S- pyogenes, estreptococo beta-hemolítico, que se

diferencia de los demás por su sensibilidad a la bacitracina. Es considerado el más
importante desde el punto de vista clínico debido a la gran variedad de cuadros que
produce, ya sea por lesión directa, o bien por fenómenos inmunológicos secundarios a
la infección.

Al grupo B pertenece el S. agalactiae que también es beta-hemolítico y se

caracteriza por presentar reacción de CAMP positiva. En esta prueba, que se detalla
más adelante, se observa un incremento en la intensidad de la hemólisis del S.
agalactiae cuando se interpola con la hemolisis producida por S. aureus. También es
característica la producción de hidrolisis del hipurato de sodio.

Los estreptococos del grupo D se dividen en enterococos y no enterococos, de

los cuales existen varias especies. Son más importantes clínicamente como grupo. Se
caracterizan por ser bilis-esculina positivos y pueden presentar cualquier tipo de
hemólisis. Existen otras pruebas para su clasificación como son el crecimiento en
medios con 6.5% de cloruro de sodio y la producción de pirrolidonil peptidasa. Los
enterococos están agrupados en su propio género, denominado (Enterococcus).

Más que una especie, el S. viridans, es un gripo de microorganismos, los cuales

no presentan hemólisis o la presentan de tipo alfa. Con frecuencia, se encuentran
involucrados en cuadros de endocarditis infecciosas.

Por último, el S. pneumoniae conocido como neumococo, produce cuadros

neumónicos y meníngeos. Este se caracteriza por ser sensible a la optoquina y por su
solubilidad en bilis, lo que lo diferencia de los S. viridans.

Existen en el mercado múltiples kits de identificación para estreptococos, asó

como antisueros para tipificarlos por grupos, pero son costosos y muchas veces no
está justificado su uso pues los procedimientos anteriormente mencionados son
suficientes para una identificación satisfactoria desde el punto de vista de la
microbiología clínica. En la figura 3.1 se muestra un diagrama de flujo para la
identificación de los cocos grampositivos aerobios.

3.1.4 Procedimientos para la identificación de cocos grampositivos

Para la identificación de los cocos grampositivos, es indispensable el uso de los

crecimientos bacterianos en el agar sangre, así como contar con un cultivo en agar
MacConkey negativo. Primero se debe analizar el tipo de hemolisis de las colonias
aisladas, y posteriormente se realizara la prueba de catalasa para distinguir entre el
género Staphylococcus y Streptococcus. Es importante efectuar una coloración de
Gram para confirmar que se trata de cocos grampositivos, pues las colonias de
levaduras, o incluso algunos cocos gramnegativos, pueden ser de fenotipo semejante
(colonias de aspecto semejante).
 3.1.5 Pruebas para la diferenciación de estafilococos.

Prueba de catalasa. Se coloca una gota de peróxido de hidrógeno (H2O2) al 3%

en un portaobjetos. Enseguida, tome del cultivo una colonia del microorganismo a
identificar con un asa de piquete, evitando tomar agar. La cepa aislada deberá
sumergirse en la gota de peróxido, la cual producirá burbujas cuando la prueba sea
positiva. La producción de burbujas se deba a la descomposición de peróxido de
hidrogeno en oxígeno y agua ante la presencia de esta enzima.

Prueba de coagulasa. La prueba de coagulasa es utilizada para la identificación

de S. aureus. Puede realizarse en placa o en tubo, la primera sirve para coagulasa
ligada (la cual se encuentra en la pared de la bacteria) y la segunda para observar la
acción de la coagulasa libre). Cualquier prueba negativa en placa debe comprobarse
mediante una prueba en tubo.

Prueba de coagulasa en placa. Se coloca solución salina estéril sobre un

portaobjetos y se emulsifica en ella una o varias colonias el microorganismo a estudiar,
hasta tener una suspensión lechosa. Se agrega luego una gota de plasma y se mezcla.
Enseguida, se mueve el portaobjetos en movimientos concéntricos. La prueba se
considera positiva al observar la formación de grumos blancos, lo cual requiere de 15 a
20 segundos, dándose como negativa si estos no se forman al cabo de 3 minutos.

Prueba de coagulasa en tubo. Se colocan 0.5 mL de plasma humano o de

conejo en un tubo de prueba. Se agrega con una asa una colonia del microorganismo y
se coloca el tubo en baño María a 37 °C. la prueba se hace positiva después de 1 a 4
horas, cuando se observa la producción del coágulo, aunque algunas cepas requieren
hasta de 18 horas. Algunos estafilococos producen fibrinolisina que destruye el coágulo
después de formado, por lo que siempre hay que hacer dos observaciones (2 a 4 horas
y 18 horas), para evitar pruebas falsas negativas.

3.1.6 Pruebas para diferenciación de estreptococos.

Sensibilidad a la bacitracina. Se realiza una siembra de la colonia sospechosa

por estría cerrada en un medio de agar enriquecido con sangre de carnero. Enseguida
se coloca un disco con bacitracina en bajas concentraciones (0.04 U) sobre la estría.
Se incuba durante 24 horas y se observa. La prueba se considera positiva cuando se
observa un halo de inhibición en el medio. Esta prueba es sensible para los
estreptococos del Grupo A (S. pyogenes).

Prueba de CAMP. Esta prueba consiste en el incremento de la actividad

hemolítica de la beta lisina estafilocócica mediante un factor producido por el
estreptococo del grupo B. El acrónimo CAMP pertenece a los apellidos de los
descubridores de la prueba. Para realizarla se siembra en línea una colonia del
estreptococo en estudio perpendicular a otra siembra en línea de una cepa de S.
aureus, en un agar sangre. Las líneas no deben tocarse, pero estar lo más cerca
posible. La prueba se considera positiva si se observa una hemólisis aumentada en
forma de punta de flecha en el lugar de aproximación de ambas líneas, esta prueba es
positiva para el estreptococo del Grupo B (S. agalactiae).

Prueba de bilis esculina. Se basa en la característica de algunos estreptococos

de crecer en agar con una concentración de 1 a 4% de sales biliares y de hidrolizar la
esculina. El medio de bilis esculina se prepara en tubos inclinados o bien, en placas de
agar. La prueba se realiza tomando de dos a cuatro colonias sospechosas y realizando
una siembra en “S” en el tubo o en la placa. La prueba se considera positiva cuando el
medio se torna a un color negro; debido a la producción de esculetina, la cual se
combina con sales de hierro contenidas en el medio. Esta prueba es positiva para los
estreptococos del Grupo D y los enterococos (S. bovis y Enterococcus sp.)

Sensibilidad a la optoquina. La prueba se realiza igual que la de la bacitracina,

con la diferencia de que el disco a utilizar será con 5 ug de optoquina. La incubación se
realizará por 18 a 24 horas en una jarra con vela de extinción. Un halo de inhibición se
interpreta como positivo. Esta prueba es muy útil pues es positiva para el neumococo,
lo que ayuda a diferenciarlo de otros estreptococos alfa hemolíticos (S. viridans y
enterococos).

3.2. Identificación de enterobacterias y bacilos gramnegativos no fermentadores

3.2.1 Generalidades

Como hemos visto capítulos anteriores, las enterobacterias son un grupo de

primordial importancia en la medicina porque se pueden encontrar en casi todas las
partes del organismo, y por ende, producir infecciones. Para comenzar diremos que las
enterobacterias, como su nombre lo dice, son microorganismos que habitan en el tubo
digestivo del hombre, son gramnegativos y anaerobios facultativos. Existen otras
bacterias que coinciden en estas condiciones con las enterobacterias, pero hay tres
características adicionales que deben de cumplir para pertenecer a este grupo:

1. Reducen los nitratos a nitritos.

2. Fermentan la glucosa.

3. Carecen de actividad de oxidasa.

4. Crecen en el medio de MacConkey

 La prueba de oxidasa, conocida también como citocromo-oxidasa, es
generalmente de primera en la línea pues, cuando es positiva, descarta la posibilidad
de que el germen sea una enterobacteria (con muy raras excepciones). Sólo se
requiere tomar una colonia de algún medio no selectivo y rasparla contra un papel filtro
impregnado del reactivo de la prueba. La inmediata aparición de color azul indica
resultado positivo. Con excepción de algunos biotipos de Enterobacter agglomerans y
algunas especies de Erwinia, todas las enterobacterias reducen los nitratos a nitritos.
Sin embargo, esta es una prueba bioquímica que se realiza pocas veces, toda vez que
la prueba de oxidasa es mucho más sencilla.

Como dijimos anteriormente, existen bacilos gramnegativos no fermentadores

que pueden aislarse en muestras clínicas del medio de MacConkey, por lo cual hay que
diferenciar entre éstos y las enterobacterias.

3.2.2. Identificación de las Enterobacterias

Una vez que el microorganismo se ha aislado en un medio selectivo como el

MacConkey y se sospecha que es una enterobacteria por tener un olor intestinal y
oxidasa negativa, se procede a identificarlo mediante pruebas bioquímicas que a
continuación se describirán. Existen otras pruebas que pueden utilizarse como la de
rojo de metilo, la actividad de ortonitrofenilgalactosidasas (ONPG), o la de fenilalanina
desaminasa, pero nosotros consideramos que las anteriores permiten resolver la
mayoría de los problemas en identificación.

1. La utilización de hidratos de carbono se puede verificar en tubos como

el agar hierro de Kligler o el agar hierro triple azúcar. El primero es el que nosotros
acostumbramos, se inocula por picadura y siembra además en superficie del inclinado
o pico de flauta. Se observa la utilización aeróbica de lactosa en el pico de flauta y la
fermentación (anaerobia) de glucosa en el fondo, con producción de gas o sin él. Como
se mencionó, todas las enterobacterias acidifican el fondo del tubo de Kligler. El medio
contiene un indicador de pH, de tal forma que al fermentarse los carbohidratos existe
un cambio en la coloración (vira al amarillo). Este medio también contiene hierro el cual
pone en evidencia la producción de sulfuro de hidrógeno (vira al negro), que se ve
mejor en el fondo ácido ya que el microorganismo requiere de un pH bajo para
producirlo.

2. El indol es un producto de la degradación del triptofano, y se puede hacer

patente en el medio mediante la adición de reactivo de Ehrlich o de Kovac, formándose
un sobrenadante rojo en el medio. El primer reactivo es más sensible, por lo cual es
preferible. El medio más común para observar la producción de indol es el SIM, cuyas
siglas significan sulfuro, indol y movilidad, por lo tanto sirve para otras dos
características, que trataremos posteriormente. El medio es semisólido y se siembra
por picadura.

3. El acetil metil carbinol (acetoína) es un producto de la degradación del

ácido pirúvico proveniente de la fermentación de la glucosa y su producción se hace
patente mediante la reacción de Voges-Proskauer en el medio líquido del mismo
nombre. La reacción se basa en la conversión de la acetoína en diacetil por acción del
KOH que se agrega al medio y del oxígeno atmosférico. Es necesario agregar además
alfa naftol para catalizar la reacción dando un pigmento rojo. El medio es líquido y se
siembra mediante la agitación del asa en su interior. Esta prueba es muy útil para la
identificación de los miembros de la tribu Klebsiella (Klebsiella, Enterobacter, Serratia).

4. Algunas bacterias utilizan el citrato como fuente de energía para su

metabolismo. Para esta prueba se utiliza el medio de citrato de Simmons, que contiene
citrato de sodio y fosfato de amonio (como fuente de nitrógeno). Las bacterias que usan
citrato utilizan la sal de amonio para extraer el nitrógeno, produciendo así amoniaco, el
cual se convierte en hidróxido de amonio que alcaliniza el medio. El medio se debe
sembrar mediante estría en la superficie y basta para considerarse positivo el
crecimiento de la colonia en la estría, o su acidificación (se torna azul).

5. Los microorganismos que hidrolizan la urea liberan amoniaco y dióxido de

carbono; el amoniaco forma carbonato de amonio, alcalinizando el medio y
produciendo una coloración rojo-rosado. Existen dos medios disponibles para realizar
esta prueba, el de Stuart que detecta solo grandes cantidades de amonio y el de
Christensen, que está menos amortiguado y es por lo tanto, más recomendable por ser
sensible a menores cantidades de amoniaco. El medio se inocula mediante la siembra
en la superficie en pico de flauta.

6. La descarboxilación de aminoácidos libera aminas de reacción alcalina

y dióxido de carbono requiriéndose de un pH inicial ácido. El medio que se utiliza es el
de Moeller, el cual es de color azul-grisáceo. En un inicio el color vira a amarillo por la
fermentación de glucosa pero al producirse la descarboxilación regresa a su color
original. El medio es sólido, se inocula mediante picadura ya que la reacción debe
llevarse en anaerobiosis, por lo que se observa en el fondo del tubo. El medio tiene la
ventaja de permitir observar también la desaminación de la fenilalanina en el pico de
flauta, que se torna rojizo.

7. La producción de sulfuro de hidrógeno mide la capacidad de los

microorganismos para liberar azufre de aminoácidos. Como vimos anteriormente, el
medio debe contener una fuente de azufre y un indicador de H2S en el medio (sales de
hierro). Los medios que se utilizan son el Kligler y el SIM, de los cuales ya hablamos.
La prueba es positiva al verse pigmento negro en el medio. El SIM es más sensible.
 8. El movimiento se observa en bacterias que son flageladas o que tienen
la capacidad de formar flagelos a ciertas temperaturas. Pueden hacerse coloraciones
especiales para flagelos, pero resultan poco prácticas. El medio para observar esto
debe de ser semisólido, utilizándose el de SIM (sulfuro, indol, movilidad) o el MIO
(movilidad, indol, ornitina). La prueba es positiva cuando el medio se ve turbio en lugar
del crecimiento sólo en el sitio de la picadura (debido a la diseminación bacteriana). En
las bacterias inmóviles el piquete de la inoculación permanece claramente visible. El
movimiento bacteriano se observa mejor mediante otras técnicas como en la de gota
suspendida. Esta técnica requiere ver la movilidad directamente al microscopio, en una
gota de solución salina que se coloca en un cubreobjetos que habrá de invertirse para
que la gota quede péndula. Finalmente, el cubreobjetos se descansa sobre un
portaobjetos al que se le han colocado dos pilares para evitar que la gota péndula haga
contacto con la superficie de éste. Debe distinguirse el movimiento bacteriano del que
poseen todas las partículas microscópicas, o movimiento browniano.

9. La prueba de DNAsa generalmente se efectúa en una caja de Petri con

agar que contiene DNA y un indicador (azul de toluidina) que vira a rosado en
presencia de la enzima. Es útil para distinguir especies de Serratia (resultado positivo)
de las de Klebsiella y Enterobacter (resultado negativo).

Tabla 3.1. Características bioquímicas para la identificación de enterobacterias.

C.   E.   E.   E.   E.   K.   K.   K.   P.  
freu aer agg cloa coli oxyt oza pne miri
Prueba ndii oge lom cae oca ena um abili
nes era e oni s
ns ae

U(liza  citrato +++ +++ + +++ 0 +++ +/-­‐ +++ ++

U(liza  glucosa +++ +++ +/-­‐ +++ +++ +++ + +++ +++
Producción  de  sulfuros +++ 0 0 0 0 0 0 0 +++
Indol +/-­‐ 0 +/-­‐ 0 +++ +++ 0 0 0
Lisina  descarboxilasa 0 +++ 0 0 +++ +++ + +++ 0
Movilidad +++ +++ +++ +++ +++ 0 0 0 +++
Orni(na +/-­‐ +++ -­‐ +++ ++ +/-­‐ +/-­‐ 0 +++
Ureasa ++ +/-­‐ +/-­‐ ++ 0 +++ +/-­‐ +++ +++
Voges-­‐Proskauer 0 +++ ++ +++ 0 +++ 0 +++ +/-­‐

Simbología: +++ (76 -100%), ++ (51-75%), + (26-50%). +/- (1-25%), 0 (0%).

 Se pueden realizar todas estas pruebas y otras más. Inclusive existen paquetes
completos ya disponibles para diagnóstico rápido, pero no tienen ninguna ventaja sobre
los convencionales y sí aumentan considerablemente su costo. Una vez que se
incuban los medios diferenciales inoculados por 18 a 24 horas se anotan los resultados
para compararlos posteriormente con tablas realizadas para el fin, las cuales tienen el
porcentaje de reacción a cada una de ellas de los diferentes microorganismos para
lograr su identificación, que puede llegar a ser incluso de género y especie. En nuestro
laboratorio utilizamos una tabla simplificada (tabla 3.1) que nos permite resolver la
identificación de la mayoría de las enterobacterias. Para proceder a la identificación se
puede seguir el diagrama que se muestra en la figura 3.1 Cuando no nos es posible
lograr la identificación con este esquema simplificado, procedemos a identificar por un
sistema comercial, que requerimos con poca frecuencia.
 Figura 3.1. Diagrama para la identificación de bacilos gramnegativos.

!
 3.2.3. Bacilos no fermentadores (MacConkey positivos)

Se conoce como no fermentadores a un grupo diverso de bacilos gramnegativos,

incapaces de acidificar el fondo del tubo de Kligler y de crecer adecuadamente en
anaerobiosis. Entre estos se consideran generalmente a Pseudomonas, Acinetobacter,
Stenotrophomonas, Brucella, Moraxella y Haemophilus Estos tres últimos requieren
medios enriquecidos para su desarrollo, por lo que no suelen considerarse junto con los
primeros. Entonces, la designación de “no fermentador” suele reservarse para los
bacilos gramnegativos que no acidifican el fondo del tubo de Kligler, pero que crecen en
el medio de MacConkey. El panel bioquímico convencional utilizado para identificar
enterobacterias no es de utilidad en este caso. En su lugar, se utilizan pruebas
rutinarias como la oxidasa, la morfología microscópica, la movilidad, el crecimiento en
agar MacConkey y la apariencia de la colonia. En realidad, la identificación de bacilos
no fermentadores en laboratorios generales no se realiza meticulosamente, lo cual se
debe, principalmente, a que la mayoría de las infecciones por no fermentadores derivan
de los mencionados géneros Pseudomonas,

Stenotrophomonas y Acinetobacter, los cuales son fáciles de identificar sin

necesidad de invertir en medios costosos. Obviamente, se corre el riesgo de tomar
algún otro género como una Pseudomonas oxidasa negativa o como un Acinetobacter.

Cuando se cuenta con un bacilo que desarrolló en el agar de MacConkey y que,

por su fenotipo colonial, sugiere un no fermentador (olor no intestinal, generalmente
lactosa negativa) se procede a realizar una prueba de oxidasa (tomar colonia de algún
medio no selectivo pues tomadas del MacConkey pueden ocurrir falsas positivas). Si
ésta resulta positiva y además se observa que la colonia produce un pigmento verde
azulado en el agar de Müeller-Hinton (piocianina) se identifica como P. aeruginosa. En
el caso de no resultar positiva la prueba de oxidasa se investiga la movilidad de la
cepa, con lo cual podemos diferenciar a otras especies de pseudomonas (móviles), del
género Acinetobacter (inmóvil). Toda investigación de movilidad de un germen no
fermentador debe hacerse en gota suspendida. Un germen no fermentador que ha
adquirido gran importancia en infecciones nosocomiales es Stenotrophomonas
maltophilia que puede identificarse fácilmente por su color verde lavanda en agar
sangre y chocolate, olor amoniacal, oxidasa negativa, movilidad positiva y crecimiento
en MacConkey como lactosa-negativa. Es afortunado que P. aeruginosa, S. maltophilia
y Acinetobacter sp. sumen más del 90% de los no fermentadores que crecen en
MacConkey, por lo que la identificación no suele ser complicada. Puesto que resulta
poco práctico contar con una gran diversidad de pruebas bioquímicas requeridas para
identificar no fermentadores poco comunes, recurrimos a sistemas comerciales cuando
no logramos identificar a los no fermentadores con pruebas sencillas, como puede
observarse en el diagrama anexo.
 3.2.3. Bacilos gramnegativos exigentes (MacConkey negativos)

Entre los bacilos exigentes, o de difícil crecimiento, se cuentan H. influenzae,

Campylobacter, Bordetella, Brucella, Gardnerella y Pasteurella. Característicamente, no
desarrollan en el agar MacConkey y requieren atmósfera capnofílica. Suelen ser
cocobacilares más que bacilares, por lo que incluso Moraxella y Neisseria (cocos
gramnegativos) suelen confundirse con ellos. Para su identificación son importantes
características como: crecimiento en agar sangre (por 48 h, en atmósfera capnofílica),
oxidasa, acidificación del fondo del tubo de Kligler y catalasa. Nosotros utilizamos el
algoritmo de Blachman, que reproducimos enseguida

3.3. Identificación de bacilos grampositivos

Los bacilos grampositivos aerobios que se aíslan con mayor frecuencia

corresponden al género productor de esporas Bacillus, que generalmente
corresponden a contaminantes, aunque B. cereus puede ocasionar un cuadro de
intoxicación por alimentos y B. anthracis, el ántrax, enfermedad de animales herbívoros
y humanos en contacto con ellos, que ocurre principalmente en países del Asia. De los
no productores de esporas son importantes Listeria, Corynebacterium, Erysipelothrix y
Lactobacillus. Ocasionalmente, algunas cepas aerotolerantes de los anaerobios
Clostridium, Propionibacterium y Actinomyces (anaerobios estrictos) pueden desarrollar
en aerobiosis, aunque lo hacen pobremente. Como se observa en el diagrama de flujo
anexo, el primer paso de la identificación de un bacilo grampositivo consiste en
determinar la presencia de esporas. Esta identificación puede lograrse de varias
maneras, como la simple observación de las esporas en la coloración de Gram
después de incubar 24 h a 48 °C o la inducción de esporas por choque con alcohol o
por calentamiento. Este último es el que preferimos por ser menos subjetivo; consiste
en efectuar una dilución del germen en un caldo y calentar en baño María a 70 oC por
10 minutos. De la dilución se toma luego una asada para resembrar en agar sangre a
36 °C por 18 a 24 h. Si hay crecimiento, puede deducirse que el microorganismo forma
esporas. La identificación se continúa con pruebas sencillas como la catalasa, la
movilidad observada en gota suspendida, el crecimiento en agar de bilis esculina (con
hidrólisis de la esculina), la morfología en el Gram, la hemólisis y la producción de
sulfuro.

Los bacilos grampositivos aerobios ramificados, Nocardia y Streptomyces, se

conocen como actinomicetos aerobios. Se consideraron antiguamente como hongos
por su apariencia en los tejidos, pues parecen formar hifas. Ocasionan cuadros de
micetoma, o pie de Madura, así como neumonía e infecciones diseminadas en
pacientes con deficiencia inmune. Se les distingue fácilmente por su apariencia
ramificada, su crecimiento lento en agar sangre (cinco a 10 días) y su buen desarrollo
en agar Sabouraud para hongos. Sus colonias semejan trozos de gis.
 3.4 identificación de cocos gramnegativos

Los cocos gramnegativos son patógenos relativamente poco comunes. De los

anaerobios, predomina con mucho el género Prevotella, que tiene poca importancia
como causante de enfermedades específicas, pues casi siempre ocurre en infecciones
polimicrobianas. Los aerobios sí son causantes de enfermedades específicas y se les
reconoce como la familia Neisseriaceae, constituída por cocos gramnegativos que
tienen tendencia a agruparse en parejas. Se divide en 4 géneros: Neisseria, Kingella,
Acinetobacter y Moraxella (Bramhamella).

El género Neisseria es el más importante y está constituido por cocos que

tienden a agruparse en forma de granos de café. Sus especies patógenas, el
meninigococo y el gonococo, no desarrollan en el agar sangre y requieren del medio de
chocolate; esto las distingue de otros miembros de la familia. El resto de las Neisserias
son comensales de las vías respiratorias altas y casi nunca actúan como patógenos.
Aunque existen medios bioquímicos para su diferenciación, la asociación clínica suele
ser bastante característica, por lo que no suele identificárseles hasta el nivel de
especie; por ejemplo, cuando se aíslan de secreción uretral, generalmente se infiere
que se trata del gonococo. Desde luego que, para fines legales, la identificación deberá
llevarse a sus últimas consecuencias. En el cuadro se muestran las pruebas que más
comúnmente se usan para la distinción en géneros.

El género Acinetobacter se estudia también, comúnmente, con los bacilos

gramnegativos no fermentadores debido a que desarrolla en el medio de MacConkey y
a que, bajo influencia de antibióticos, es capaz de formaciones bacilares. Actualmente
este germen, sobre todo las variedades multidrogo-resistentes, son un azote para los
hospitales, donde generan brotes infecciosos con altas tasas de mortalidad.
Bramhamella catarrhallis, conocida antiguamente como Moraxella catarrhallis, es un
habitante normal de la boca y las vías respiratorias altas, pero se le encuentra
frecuentemente como causante de neumonía en pacientes ancianos con enfermedad
pulmonar conocida. El grupo Kingella es parte de la flora normal de la boca y raramente
causa enfermedad, pero se le ha descrito en algunos casos de endocarditis subaguda.
Tabla 3.2. Características de los cocos gramnegativos utilizadas para su identificación.

Característica Neisseria Bramhamella Acinetobacter Kingella

Oxidasa + + - -
Catalasa + + + -
Reducción de nitritos + - - +
Crecimiento en - - + -
MacConkey

5. Bibliografía
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Parte 4. EL PROCESO DE LA MUESTRA

4.1. Secreciones de piel y tejidos blandos

4.1.1. Generalidades

La piel es la interfase del organismo con el medio ambiente y constituye el

órgano más accesible. Se compone de una zona superficial llamada epidermis y una
zona profunda llamada dermis. La epidermis carece de vasos sanguíneos y se nutre
sólo por difusión. En la piel existen los llamados anexos, que comprenden los folículos
pilosos, glándulas sebáceas y glándulas sudoríferas. Debajo de la dermis se encuentra
la grasa subcutánea y la siguen las membranas que cubren los músculos (fascias),
ligamentos y otros tejidos conectivos (figura 4.1). Por fortuna los planos fasciales
suelen ser inicialmente impenetrables para las infecciones. Sin embargo, las
infecciones graves penetran más allá de las fascias, como ocurre en extremidades de
pacientes diabéticos, o a consecuencia de golpes severos. Aquí se tratarán únicamente
las infecciones comunes de piel y tejidos subcutáneos.

Figura 4.1. Corte esquemático de la piel normal. Observe los distintos planos

Las infecciones cutáneas se clasifican en primarias y secundarias. La primaria

ocurre de novo en pacientes sin una puerta de entrada obvia como sucede en las
erisipelas. Las secundarias son complicaciones de lesiones de la piel como raspaduras,
heridas quirúrgicas y heridas penetrantes. Algunas veces estas infecciones son
monomicrobianas como en la infección por Staphylococcus aureus, o polimicrobianas,
como en las gangrenas. Característicamente, estas infecciones polimicrobianas se
asientan sobre tejido muerto y no curan si no se procede a su retiro quirúrgico, como en
el caso del pié diabético. Las infecciones también pueden ser agudas o crónicas: la
erisipela desaparece después de unos días; en cambio, las infecciones por hongos, o
tiñas, pueden durar años.

Clínicamente, las lesiones se dividen en eritematosas superficiales, úlceras,

nódulos y fístulas, así como las infecciones de heridas y de quemaduras.

4.1.2. Toma de muestras, inoculación e interpretación de resultados

Infecciones superficiales con eritema. La infección más frecuente de este tipo

es la erisipela. Comúnmente es causada por estreptococos betahemolíticos del Grupo
A (Streptococcus pyogenes). La infección primaria involucra la dermis y la parte más
superficial del tejido subcutáneo. Los datos clínicos son dolor, enrojecimiento,
inflamación y endurecimiento de la piel, ocasionalmente con pequeñas vesículas o
bulas en la superficie. Hay apariencia de "cáscara de naranja" y existe un borde bien
definido. En forma aguda hay fiebre y se pueden tocar los ganglios linfáticos del pliegue
más cercano. Pueden aparecer algunas vesículas, pero es poco común que la
infección se haga profunda.

A diferencia de la erisipela, la celulitis es una infección difusa que tiende a

expandirse por debajo de la dermis, afectando la grasa subcutánea. Existe dolor local,
reblandecimiento, eritema e inflamación, asociados con fiebre, escalofríos e inflamación
de los ganglios linfáticos de la región. El margen de la lesión está mal definido, no
elevado ni demarcado. El estreptococo del Grupo A y el S. aureus son la etiología más
común. En los diabéticos, el estreptococo del Grupo B (S. agalactiae) es una causa
común. Haemophilus influenzae es una causa poco común pero distintiva de la
infección asociada con bacteriemia y típicamente afecta a niños de 6 meses a 4 años
de edad. En individuos con eosinofilia crónica, son comunes las infecciones cutáneas
recurrentes (síndrome de Job).

El diagnóstico de erisipelas y celulitis generalmente es clínico y se puede iniciar

el tratamiento antimicrobiano empíricamente, guiado por las causas conocidas. Para
las erisipelas suela prescribirse penicilina y para las celulitis, dicloxacilina o
clindamicina. En niños menores de 4 años con celulitis, es mejor prescribir amoxicilina
con ácido clavulánico para cubrir H. influenzae. En el laboratorio puede realizarse
cultivo con técnica de aspiración con jeringa. Si no se aspira ningún material, se puede
inyectar 0.1 a 0.5 ml de solución salina estéril en el tejido, aspirando de inmediato. Se
siembra en agar sangre y algún caldo, como el BHI. En los niños, debe sembrarse
además un medio de chocolate (para aislar H. influenzae, en su caso). Debe aclararse
que la posibilidad de obtener un cultivo positivo en estos casos es menor del 50%, por
lo que la clínica es el arma más útil en el diagnóstico de las erisipelas y celulitis
comunes no complicadas.
 Erisipeloide. Es una infección poco común causada por un bacilo grampositivo:
Erysipelothrix rhusiopathiae. Clínicamente se parece a la erisipela, pero es
predominantemente una enfermedad ocupacional de pescadores. En el laboratorio, la
coloración de Gram y el cultivo usualmente son negativos. Se puede comprobar la
etiología de la lesión mediante biopsia del margen de la lesión y cultivo.

Impétigo. Es una lesión superficial de la epidermis, que produce lesiones

eritematosas que se acompañan generalmente de bulas (ampollas). El impétigo no
buloso comúnmente es producido por estreptococos del Grupo A, y es difícil distinguirlo
de la erisipela. Por otra parte, la forma bulosa se asocia con S. aureus. Después de
algunos días, las bulas se llenan de pus (pústulas) y se rompen. La secreción purulenta
forma la característica costra de miel y cera de abeja (melicérica) con un halo rojizo.
Como se mencionó para la erisipela, el diagnóstico se basa en el hallazgo clínico. En
este caso, el cultivo tendrá mayores posibilidades de desarrollo, sobre todo si se aspira
líquido de las ampollas, o se toma secreción suficiente con hisopo. La muestra se
inocula en agar sangre y algún medio líquido de respaldo. El tratamiento requiere retiro
de las costras y prescripción de antibióticos.

Foliculitis, furunculosis y carbúnculo. Las foliculitis son abscesos cutáneos

localizados. Se observan como pequeños abscesos, del tamaño de una cabeza de
alfiler y son causadas por S. aureus. Como su nombre lo indica, nace del mismo
folículo piloso (figura 4.2). La etiología se confirma con el cultivo del pus. Causas poco
comunes son gramnegativos de la familia de las enterobacterias y ocurre en pacientes
con acné que reciben antibióticos por períodos prolongados.

Figura 4.2.. Foliculitis. La infección se desarrolla en el folículo piloso.

 Furúncuo. Es un absceso que nace también de los folículos pilosos, pero forma
una masa mayor, firme y tensa, que puede incluso acompañarse de datos generales
como fiebre (figura 4.3).

Figura 4.3. Furúnculo.

Un carbúnculo es más profundo y extenso. Puede presentarse como varios

abscesos que envuelven algunos folículos pilosos y glándulas sebáceas; algunos
drenan por los folículos. Se asocia con fiebre y muchas veces, con bacteriemia (figura
4.4). También en este caso, S. aureus es el patógeno más frecuente (recuerde que S.
aureus es el germen productor de abscesos por excelencia). El cultivo puede obtenerse
de la secreción, cuando ha drenado, pero es más conveniente el aspirado con jeringa.
Algunos autores se refieren a esta lesión como ántrax cutáneo, pero nosotros hemos
preferido una traducción semiliteral de la expresión del inglés (carbuncle), para
diferenciarla de la lesión específica de Bacillus anthracis, que es muy semejante
(anthrax), pero ocurre como una enfermedad ocupacional en cardadores de lana y que,
paradójicamente, se traduce al español como carbunco.
 Figura 4.4. Carbúnculo. Observe la formación de un gran absceso, que drena a
través de múltiples sitios.

Paroniquia. Es una infección superficial de la piel que circunda las uñas, y puede
ser aguda o crónica. La infección aguda es causada por S. aureus. La infección crónica
se asocia con Candida en personas que frecuentemente sumergen las manos en
líquidos (enfermedad ocupacional, común en enfermeras). Se utiliza para cultivo el
drenaje del pus.

Infecciones superficiales por hongos. Involucran la capa queratinizada de la

piel (la capa más superficial), el pelo o las uñas. Es causada por dermatófitos, Candida
o levaduras lipofílicas. En general, los dermatófitos: Epidermophyton, Thichophyton o
Microsporum produce la tiña del cuerpo (empeine o "jiote"). Cándida albicans coloniza
la piel o las membranas mucosas especialmente si hay maceración, por ello
generalmente produce lesión alrededor de algún pliegue, principalmente en personas
obesas, y es la causante de la tiña inguinal. Malassesia furfur (P. ovale) es una
levadura lipofílica que produce la pitiriasis versicolor, que se observa como manchas
blanquecinas en personas morenas, o manchas oscuras en personas blancas.

Si se sospecha tiña de la piel, uñas o pelo, la lesión se limpia y se raspan sus

bordes activos. El material obtenido se disuelve en KOH (que lisa las células de la piel,
pero no las formas micóticas), y se examina al microscopio en busca de hifas. Es un
procedimiento sencillo, y generalmente resulta positivo en presencia del germen, por lo
que es de gran utilidad cuando el diagnóstico clínico de micosis no es claro. También
puede cultivarse, para los casos en que pudiera escapar el hongo a la observación en
fresco. El medio de cultivo de elección es el Mycosel, que contiene inhibidores para
evitar el crecimiento de contaminantes. Cuando se sospecha pitiriasis versicolor se
pega una cinta adhesiva transparente en la lesión; al desprenderse, se coloca en un
portaobjetos con azul de metileno o azul de algodón: las levaduras e hifas se colorean
intensamente, resultando de fácil observación al microscopio (imagen de “espagueti
con albóndigas”).

Nódulos y úlceras. En éstos se afectan la epidermis y parte de la dermis. Una

gran variedad de microorganismos puede causar nódulos y úlceras después de
inocularlos directamente en la piel. Ejemplos importantes son Bacillus anthracis,
especies de Nocardia, Mycobacterium marinum y Sporothrix schenckii.
Alternativamente, la infección cutánea puede ser secundaria a diseminación sanguínea,
como las lesiones múltiples de pacientes con endocarditis bacteriana. Un caso muy
peculiar es el de la esporotricosis, que generalmente causa un nódulo en el sitio de la
inoculación, que después se ulcera y va formando nuevos nódulos a través del trayecto
linfático; es una enfermedad común en jardineros y campesinos, pues el hongo es
ubicuo y se inocula a través de picaduras con espinas. Los nódulos y úlceras por M.
marinum suelen ocurrir en las manos de personas que las introducen frecuentemente
en acuarios.

Las úlceras cutáneas preexistentes pueden infectarse como ocurre en úlceras

por presión en pacientes con movilidad pobre o Diabetes mellitus. Las coloraciones y
cultivos son los métodos diagnósticos. En este caso, los responsables frecuentemente
son bacilos gramnegativos y cocos grampositivos aerobios y anaerobios; de hecho,
puesto que habitualmente existe tejido muerto, en la tinción de Gram puede observarse
una flora abundante y polimicrobiana, lo que sugiere desde luego la presencia de
anaerobios (recuerde que los anaerobios son flora de putrefacción que siguen al tejido
muerto).

Fístulas. Son una comunicación entre un tejido profundo infectado o un absceso

del tejido subcutáneo y abierto a la superficie de la piel. Es frecuente encontrar flora
polimicrobiana, por la presencia de anaerobios, como en las infecciones intestinales
fistulizadas. En algunos casos, el patógeno da características especiales al proceso,
como en los casos de infecciones por micobacterias, actinomicosis y nocardiosis. El
cultivo de la secreción es difícil de interpretar pues los microorganismos presentes
pueden ser contaminantes de la superficie. En todo caso, el manejo con antibióticos no
suele resolver estos problemas, que requieren drenaje del absceso y retiro del tejido
muerto; desde luego, al tratamiento quirúrgico se puede agregar el antibiótico de
acuerdo con los hallazgos del cultivo y la coloración de Gram. Ocasionalmente, es
posible aspirar los abscesos con jeringa. Si ocurre así, la muestra será más valiosa.
Las especies de Nocardia ocasionan el micetoma de las extremidades (pié de Madura)
con abscesos y fístulas crónicos, que producen una secreción descrita como “baba de
nopal”.

Infecciones en quemaduras. La superficie de la quemadura contiene tejido

muerto y líquido rico en proteínas, que constituyen un verdadero medio de cultivo.
Cuando la concentración de microorganismos es alta, ocurre la infección invasora con
bacteriemia. Para cultivos, se recomienda un trozo de tejido obtenido por técnica
quirúrgica; de este modo, el resultado será fidedigno. Sin embargo, es poco común que
los clínicos hagan biopsias para cultivo en estos casos, por lo que pueden hacerse
cultivos de sitios diferentes (preferentemente si existe secreción) con hisopo, y
considerar como patógenos los que aparezcan en dos ocasiones o de dos sitios
diferentes. Desde luego, en los pacientes febriles conviene la toma de hemocultivos,
pues el germen de esta fuente seguramente será patógeno. Históricamente, los
responsables de estas infecciones son los estafilococos y estreptococos, pero con el
advenimiento de la terapéutica antimicrobiana, actualmente predominan P. aeruginosa
y C. albicans.

Infección de heridas quirúrgicas La infección de heridas quirúrgicas ocurre

cuando existe contaminación en la cirugía. Los agentes más frecuentes incluyen S.
aureus y otros microorganismos de vías digestivas y piel. Los anaerobios se
caracterizan por el mal olor de las secreciones. Para el cultivo se aspira el pus o se
impregna de él un hisopo estéril.

Infecciones de heridas complicadas Estas ocurren después de una herida

contaminada por un traumatismo. Muchas de estas infecciones son severas y
asociadas con alta mortalidad, por la presencia de tejido o muerto que es asiento para
infecciones por anaerobios. Un ejemplo de ello es la gangrena gaseosa y la fascitis
causada por Clostridium perfringes (anaerobio estricto). En presencia de tejido muerto
también son comunes los estafilococos, estreptococos, enterobacterias y otros
anaerobios. La coloración de Gram es de gran ayuda para iniciar el tratamiento. Si es
posible tomar secreción por aspiración, o biopsia, debe sembrarse en búsqueda de
anaerobios. Especies de Aeromonas y Vibrio no cholerae son causa de celulitis aguda
seguida de la introducción de estos microorganismos en heridas o laceraciones
provocadas en agua salada.

Mordeduras complicadas con infección. Estas heridas están muy

contaminadas con flora de la cavidad oral. La infección va de acuerdo a la profundidad
de la herida y la flora presente en los dientes (generalmente estreptococos aerobios y
anaerobios). La mordedura humana puede causar severas lesiones con necrosis. La
rabia y el tétanos son infecciones que complican a las mordeduras por animales, pero
no se investigan generalmente por cultivo. Las mordeduras de gato suelen ser serias
pues casi siempre contienen Pasteurella y los largos colmillos del animal pueden
inocular profundamente, perforando las fascias.

El mejor material para cultivo de las mordeduras es el aspirado de la herida en su

parte profunda, aunque es común que se indique el manejo basado sólo en el
conocimiento epidemiológico de las causas más comunes.
 4.1.3 Bibliografía
1. Breeling JL, Weinstein L. Infections from bites and scratches, burns, and environmental
organisms. In: Isselbacher KJ, Braunwald E, Wilson JD, Martin JB, Fauci AS, Kasper DL
(ed.), Harrison’s Principles of Internal Medicine, 13th ed. McGraw-Hill, Inc, New York, NY,
1994:569-72.

2. Goldstein EJC. Bite wound and infection. Clin Infect Dis 1992:14:633.

3. Miller JM, Holmes HT. Specimen collection, transport, and storage. In Murray PR, Baron EJ,
Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 6th ed. American
Society for Microbiology, Washington D.C., 1995;19-32.
 4.2. Líquido cefalorraquídeo y otros liquidos corporales

4.2.1. Generalidades

El líquido cefalorraquídeo (LCR) es producido por los plexos coroideos y se trata

de un filtrado de plasma. Su función principal es la de nutrir al sistema nervioso central
(SNC) así como de proporcionarle un sistema de amortiguamiento para los
movimientos bruscos. Su cantidad normal oscila alrededor de los 150 mL en el adulto y
de 10 a 60 mL en el recién nacido. El estudio del LCR es de primera elección en
muchos problemas del SNC debido a la facilidad de su obtención y a lo relativamente
barato del método, además de que proporciona datos de utilidad en un rango amplio de
enfermedades, desde traumatismos hasta enfermedades tumorales. Cuando se solicita
el estudio microbiológico del LCR, el médico sospecha infección del SNC. Debido a que
el riesgo de muerte o de daño irreversible es grande, excepto si el tratamiento se inicia
de inmediato, ésta es una de las urgencias en infectología, por lo que el personal del
laboratorio debe dar prioridad a su estudio e informe temprano.

4.2.2. Toma de muestra

El LCR se extrae mediante punción lumbar a nivel del tercer o cuarto espacio
intervertebral de la columna lumbar. La muestra, aproximadamente 5 mL, debe
extraerse en tubo estéril para el estudio físico, químico, citológico y microbiológico. En
prematuros y niños pequeños es necesario trabajar muestras menores. Es de
suponerse que la técnica para la obtención debe realizarse bajo condiciones lo más
asépticas posibles para evitar una contaminación de la muestra y la introducción de
microorganismos al espacio subaracnoideo, lo que conllevaría a una meningitis. Una
vez obtenida la muestra, debe de enviarse inmediatamente al laboratorio para su
estudio, pues gérmenes como Haemophilus y neumococo mueren si hay retraso.

4.2.3. Análisis del LCR

El análisis microbiológico no debe disociarse del análisis físico y citoquímico,

pues frecuentemente es el conjunto de datos lo que permite llegar a un diagnóstico. Por
ello comentaremos brevemente cada uno.

Examen físico. Debe rendirse informe del volumen recibido, así como su
aspecto. Normalmente es transparente, con aspecto de agua de roca. Si el aspecto es
sanguinolento se centrifuga y se anota si el sobrenadante es xantocrómico (amarillento)
o claro.
 Examen químico. Se puede realizar una amplia gama de estudios químicos del
LCR, pero los más importantes son la concentración de proteínas y de glucosa. La
cantidad de cloruros que antes se suponía importante en las meningitis tuberculosas,
ahora se encuentra en desuso debido a que no tiene buena especificidad. Las
proteínas aumentan en cualquier enfermedad inflamatoria, aguda o crónica, como en
meningitis piógena o tuberculosa. El nivel de glucosa en LCR depende de su nivel en
sangre y también de la presencia de gérmenes piógenos, en cuyo caso estará baja.
Esta determinación se hace por el mismo método que para la sangre.

Examen citológico. Debe efectuarse en forma rutinaria dentro de los 30 minutos

después de su extracción. Para la cuenta se utiliza la cámara de Neubauer, pues las
células a contar son generalmente, eritrocitos o leucocitos. La muestra puede
analizarse directamente o utilizando diluciones si se encuentran muchas células. Para
obtener el por ciento de linfocitos y neutrófilos se efectúan tinciones sencillas, siendo
necesario algunas veces destruir los eritrocitos, si es que se encuentran, para realizar
una buena cuenta de leucocitos.

Con los estudios iniciales, se puede inferir si existe enfermedad infecciosa del
SNC, como se observa en la Tabla 1. El objetivo inicial será distinguir entre meningitis
bacteriana aguda, meningitis o encefalitis viral, así como meningitis tuberculosa o
micótica. La decisión inicial podrá modificarse con el resultado de las tinciones, el
cultivo y la serología. Los exámenes de control son importantes pues la normalización
del LCR es buena señal de una terapéutica adecuada.

Tabla 4.1. Características comunes del líquido cefalorraquídeo en diversas entidades

clínicas.

Condición Apariencia Leucocitos/mm3 Glucosa Proteinas

Normal Agua de roca 0–3 50-60%/ 15-45 mg/dL
plasmática
Vira Agua de roca 10 -100 Normal Normal
Bacteriana Turbia 100 a incontables Muy baja Muy alta
Micobacterias Xantocrómica o 100 a 1000 Baja Altas
Micótica turbia

Examen microbiológico y cultivo. Este consiste en la elaboración de

coloraciones de Gram para bacterias, Ziehl-Neelsen para micobacterias y tinta china
para hongos. Asimismo, debe sembrarse agar sangre, agar chocolate y caldo de
respaldo. En el caldo deben sembrarse entre 1 y 5 mL, pero cuando la muestra es
pequeña puede sembrarse todo el sobrante. Sobre todo en cultivos de niños es
imprescindible una excelente calidad en el agar chocolate, para poder aislar H.
influenzae. Algunos autores recomiendan que la siembra se haga del precipitado de un
centrifugado, pero esto no se encuentra bien evaluado. Es posible que sea mejor
sembrar todo el volumen disponible en caldo de hemocultivo. Cuando lo indica el
clínico, debe sembrarse el botón del centrifugado en algún medio general para hongos
(como Sabouraud, a 25-30 oC) o micobacterias (como Lowenstein-Jensen). Las
coloraciones deben informarse el mismo día.

Examen serológico y detección de antígenos. La serología se ha convertido

en una herramienta muy importante en el estudio integral del LCR, debido a que,
mediante ella, se pueden realizar diagnósticos preliminares es en un lapso muy corto.
Existen preparados comerciales de anticuerpos adsorbidos a partículas de látex o a
bacterias muertas (coaglutinación), que pueden aglutinar en presencia de antígenos
específicos de algunas bacterias, como es el caso de los neumococos y estreptococos
del grupo B, meningococo y H. influenzae. También se pueden realizar pruebas de
otros tipos, ELISA por ejemplo, para distintas enfermedades, tales como criptococosis,
cisticercosis, toxoplasmosis, amebosis, etc. Si se efectúan estas últimas es importante
contar con métodos estandarizados e informar al médico la sensibilidad y especificidad
de la prueba en particular.

4.2.4. Otros líquidos corporales

Otros líquidos corporales normalmente estériles (articular, pleural, pericárdico,

amniótico, ascitis) deben procesarse para examen microscópico directo y cultivo, de
manera semejante al LCR. Como regla general, si se observa una bacteria por objetivo
de inmersión en las tinciones, existen al menos 100,000 bacterias por mL de muestra.
Frecuentemente, el número de bacterias en un líquido normalmente estéril es muy
bajo, por lo que se recomienda que se concentre por centrifugación para obtener un
botón de precipitado. Esto debe intentarse sólo si se cuenta con centrífuga refrigerada
que sea capaz de obtener una fuerza de 1500 g, durante 15 minutos, seguidos de la
preparación de extendido y cultivo del botón, así como cultivo en caldo del
sobrenadante. Si no se cuenta con centrífuga adecuada, deberá inocularse un volumen
de hasta 10 mL en botella de hemocultivo, además del cultivo directo en placas.

4.2.5. Líquido de diálisis

La diálisis peritoneal continua ambulatoria (DPCA) se ha vuelto muy común como

modalidad de tratamiento para paciente con insuficiencia renal avanzada, pero se
complica por una alta incidencia de peritonitis. En el procedimiento, se introduce un alto
volumen de líquido en el peritoneo, a través de un catéter permanente, y se saca hacia
la misma bolsa, en un sistema cerrado que actúa por gravedad. Desgraciadamente, la
infección complica frecuentemente estos procedimientos y deberá sospecharse
siempre que el paciente aqueje fiebre o dolor abdominal acompañados de
enturbiamiento del líquido. Este líquido puede utilizarse para estudio microbiológico y
citológico. Se acepta que si la cuenta de leucocitos es mayor de 100/mm3 la
probabilidad de infección es alta. Aun en presencia de infección, el aislamiento del
patógeno es un reto para el laboratorio puesto que el contenido bacteriano es muy
bajo. Se acepta ya que debe procesarse como si se tratara de un hemocultivo, además
de la siembra directa en placa, lo que incrementa notablemente la posibilidad de aislar
el germen.

4.2.6 Bibliografía

1. Forbes BA, Granato PA. Processing specimens for bacteria. In Murray PR, Baron EJ, Pfaller
MA, Tenover FC, Yolken RH (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 6th ed. American Society
for Microbiology, Washington D.C., 1995;265-81.

2. Miller JM, Holmes HT. Specimen collection, transport, and storage. In Murray PR, Baron EJ,
Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 6th ed. American
Society for Microbiology, Washington D.C., 1995;19-32.

3. Reinhold CE, Nickolai DJ, Piccinini TE, Byford BA, York MK, Brooks GF. Evaluation of broth
media for routina culture of cerebrospinal and joint fluid specimens. Am J Clin Pathol
1988;89:671-4.

4. Runyon BA, Umland ET, Merlin T. Inoculation of blood culture bottles with ascitis fluid:
improved detection of spontaneous bacterial peritonitis. Arch Intern Med 1987;147:73-5.

5. Ryan S, Fessia S. Improved method for the recovery of peritonitis-causing microorganisms

from peritoneal dyalisate. J Clin Microbiol 1987;25:383-4.
 4.3. Sangre y medula ósea

4.3.1. Generalidades

Se llama bacteriemia a la presencia de microorganismos vivos en la sangre, que

ocurre cuando falla el confinamiento de una infección en tejidos extravasculares, o se
omite el drenaje o tratamiento adecuado de un foco infeccioso. Habitualmente, un
repentino flujo de bacterias hacia la sangre (como el que puede ocurrir después de
someterse a tratamiento dental) es "limpiado" en minutos u horas, excepto cuando se
trata de una infección grave o existe un foco intravascular de infección. La entrada
directa de bacterias a la sangre ocurre en infecciones intravasculares, catéteres y
líquidos intravenosos o intraarteriales contaminados. También puede originarse en una
flebitis. Cuando la bacteriemia no procede de los vasos sanguíneos se conoce como
“bacteriemia secundaria” y es más común en pacientes no hospitalizados. Las
bacteriemias secundarias pueden originarse en el sistema genitourinario (25%), el
sistema respiratorio (20%), los abscesos (10%), las heridas quirúrgicas (5%) y las vías
biliares (5%). El patrón clínico de una bacteriemia puede ser:

1. Transitoria, como ocurre después de la manipulación de tejidos infectados,

instrumentación de mucosas colonizadas y cirugía en áreas contaminadas.
También ocurre en infecciones generales o localizadas como meningitis,
neumonía y osteomielitis.

2. Intermitente, generalmente asociada con abscesos intra-abdominales:

pélvico, perinefrítico, hepático, etc.

3. Continua, característica de la endocarditis bacteriana y otras infecciones

intravasculares, así como de la etapa temprana de la fiebre tifoidea y
brucelosis.

Una comprensión de las circunstancias en que ocurre una bacteriemia es

provechosa en la planeación de estudios diagnósticos y la interpretación de resultados
del hemocultivo. Un hemocultivo está indicado en todo paciente con sospecha de
bacteriemia, con fiebre o hipotermia menor de 36'C, leucocitosis (especialmente con
formas de banda) o granulocitopenia, un relativo incremento en el pulso, cambios
inexplicables en la conciencia e hipotensión sanguínea. Puede haber excepciones para
esta indicación, como los pacientes con fiebre y foco séptico evidente, como el enfermo
con infección urinaria no nosocomial, en donde es mejor cultivar la orina y la
información del hemocultivo no añadiría mucho al diagnóstico. Sin embargo, conviene
acotar que el hemocultivo es un estudio subutilizado en nuestro medio, pues es común
que no se indique en situaciones de utilidad evidente, como el paciente con fiebre en
un hospital, por lo que se dejan de reconocer cuadros de bacteriemia que son
imposibles de diagnosticar por la clínica

4.3.2. Procedimiento

El mayor problema para interpretar los hemocultivos es la contaminación por los

gérmenes normales de la piel, lo que se puede evitar preparando la zona a puncionar
con algún antiséptico (clorhexidina, yodo-povidona, alcohol isopropílico al 70%, etc).
Una vez hecho esto, la piel se podrá palpar únicamente si se portan guantes estériles
para evitar nuevamente la contaminación, o si se ha preparado también con antiséptico
la piel de quien punciona. Aunque en algunos pacientes puede ser la única alternativa
(como en los neonatos), debe evitarse la aspiración de la vena femoral ya que la piel de
la región es muy difícil de desinfectar y existe un número menor de microorganismos en
el drenaje venoso de las extremidades inferiores que en los brazos. Aunque se discute
si la obtención de sangre a través de catéteres pueda auxiliar en el diagnóstico de la
colonización de éstos, en general se acepta que la sangre para hemocultivo no debe
obtenerse de catéteres, cuando sea posible. Se ha demostrado que la sangre venosa o
arterial no tiene diferencias para los fines del cultivo. El volumen a obtener es diferente
en el adultos que en niños y siempre debe tenerse en consideración la posibilidad de
producir anemia en el paciente, especialmente si se trata de un recién nacido. La
sangre deberá entrar en dilución con el caldo de cultivo en proporción 1:10, por lo que
se obtendrá en un adulto 10 mL de sangre y en un niño lactante 2 mL, en un mínimo de
caldo de 100 y 20 mL, respectivamente. De inmediato se inocula el frasco con el medio
de cultivo para no alterar la viabilidad de los microorganismos. A pesar de que se
podría aconsejar cambiar la aguja para la inoculación de los medios de cultivo, la
manipulación de las agujas puede ser un factor de riesgo tanto para la contaminación
del hemocultivo, como de punción del personal, por lo que este proceso debe evitarse.
Para evitar la contaminación, debe desinfectar el punto de inoculación con un
antiséptico. En algunas instituciones se acostumbra inocular junto a un mechero de
alcohol, pero no es un requisito indispensable.

La muestra debe obtenerse en la primera hora de la elevación de la temperatura

si se presenta el patrón "en picos". Cuando la fiebre es continua se recomienda
obtenerla después de la mayor elevación. Se acostumbra tomar un mínimo de dos
botellas, y un máximo de tres. La toma debe ser separada en el tiempo por 10 a 30
minutos, en punciones de sitios diferentes. Esta aclaración es pertinente pues es
común que de una extracción se inoculen dos botellas: esto corresponde a tomar un
solo hemocultivo.

Una buena alternativa para los hemocultivos en caldo la constituyen los cultivos
de lisis-centrifugación (Isolator). Con este sistema, la sangre se lisa en un tubo especial
y se centrifuga. El botón del centrifugado se siembre entonces como si fuera una
secreción, por lo que no se requieren resiembras y es posible cuantificar las colonias.
Este sistema tiene la ventaja adicional de permitir un desarrollo acelerado de algunos
gérmenes intracelulares (como hongos y micobacterias). Para laboratorios que
procesan un gran número de muestras, existen diversos métodos de lectura
automatizada, cada uno con ventajas y limitaciones.

4.3.3. Proceso de la muestra

Los medios de cultivo se expenden en el comercio ya preparados, aunque se les

puede preparar fácilmente para ahorrar costos. Hay diferentes tipos de medios de
cultivo que se pueden utilizar: caldo de soja tripticasa, tioglicolato, infusión de cerebro-
corazón (BHI), etc. Como estándar se utiliza el caldo de soja tripticasa que por sus
propiedades nutritivas favorece el crecimiento de múltiples microorganismos aerobios y
anaerobios. Pero, independientemente del medio utilizado, debe contener sulfato
sódico de polietanol (SPS) como anticoagulante, el cual no es tóxico para las bacterias,
inhibe el complemento y la actividad de la lisozima, interfiere con la fagocitosis e
inactiva algunas sustancias como los aminoglucósidos. Algunos frascos tienen una
atmósfera rica en un gas inerte que facilita el crecimiento de aerobios y anaerobios.
Una vez inoculado, el medio se incuba a 36 °C durante 7 días, realizando
observaciones y resiembras a las 24 horas de incubación; si resulta negativo, se vuelve
a revisar a las 48 horas y nuevamente a los 7 días. Algunos autores recomiendan
efectuar sólo las primeras dos resiembras. Las resiembras se efectúan extrayendo una
gota del medio, e inoculándolo en agar sangre y agar de MacConkey. En hemocultivos
tomados de niños menores de 5 años, debe efectuarse también la resiembra en agar
chocolate (para detectar Haemophilus spp.).

Un cultivo positivo se reconoce por turbidez del medio, con o sin burbujas de gas,
colonias en el sedimento de sangre, colonias compactas en la superficie del sedimento
y hemólisis, además del resultado de los subcultivos. Dado su costo y baja probabilidad
de positividad, nosotros consideramos que las resiembras rutinarias en anaerobiosis no
son recomendables, sino que deben reservarse para pacientes con abscesos
abdominales o cuando lo solicite el clínico.

También se consiguen en el comercio los frascos de Ruiz Castañeda, que tienen

una fase sólida y una líquida. Tienen la ventaja de que las resiembras requieren sólo
invertir el frasco, inoculándose así el medio sólido, donde se podrán ver las colonias a
través del vidrio.

4.3.4. Informe de resultados

A las 24 horas de incubación, el laboratorio hace un reporte preliminar

informando la negatividad o positividad del cultivo. Si se obtiene desarrollo de un
germen, se informan sus características de Gram, lo que permite al clínico iniciar el
tratamiento. Generalmente, a las 24 horas se debe conocer el tipo de germen, a las 48
horas ya se debe contar con la identificación presuntiva del microorganismo, y a las 72,
la sensibilidad a antibióticos e identificación fina, con lo que se pudiera modificar el
tratamiento empírico inicial. En todos estos pasos se deben enviar informes
preliminares al expediente del enfermo o, preferentemente, hablar con el clínico a
cargo. En el caso de un hemocultivo negativo a las 48 horas de incubación, se continúa
ésta hasta completar 7 días, lo cual es el límite para esperar un crecimiento, excepto
cuando se sospechan condiciones especiales que se deben informar al laboratorio,
como las infecciones micóticas, cuyo desarrollo puede tardar aún más. Si se sospecha
infección micótica (pacientes inmunodeficientes u hospitalizados bajo manejo
antibiótico), deberá ventilarse una de las botellas con una aguja que se encaja en la
goma del frasco, de entrada por salida. Esta maniobra incrementa las posibilidades del
aislamiento de hongos.

Los cultivos por lisis-centrifugación se interpretan como si se tratara de una

secreción y se informa, además de los gérmenes desarrollados, el número de colonias.

4.3.5. Interpretación de resultados

La causa de la bacteriemia puede generalmente inferirse del germen aislado.

Cuando se obtienen Bacillus (bacilos grampositivos) o S. epidermidis, generalmente
existe contaminación en la toma, aunque debe comentarse siempre con el clínico la
posibilidad de que sean verdaderos patógenos si el paciente tiene accesos vasculares
por infusión, porta válvulas cardiacas artificiales o está gravemente inmunodeprimido.
El resultado se relaciona con el comportamiento clínico del paciente. Si se aíslan
estreptococos no hemolíticos en ausencia de un foco de infección, excluyendo los
enterococos, el significado es incierto, y debe platicarse el caso con el clínico. El
enterococo generalmente indica infección agregada en paciente que está recibiendo
antibióticos parenterales (cefalosporinas). El aislamiento de un estreptococo
betahemolítico en un recién nacido generalmente indica sepsis neonatal por
estreptococo del grupo B (S. agalactiae).

Enterobacterias, Pseudomonas, Haemophilus, S. aureus y S. pneumoniae son la

causa más común de bacteriemias, y generalmente puede encontrarse clínicamente el
foco primario de infección. Cuando el paciente está hospitalizado y no se encuentra el
foco infeccioso, debe considerarse la colonización de los catéteres vasculares. En
hospitales de países en desarrollo es común la contaminación de los líquidos de
infusión por técnicas deficientes de enfermería; generalmente desarrollará Klebsiella o
Enterobacter, que son microorganismos que pueden utilizar las soluciones como medio
de cultivo.
 Los cultivos de médula ósea deben obtenerse por un médico experimentado. Se
procesan de manera semejante, aunque con un volumen menor (generalmente 1 ó 2
mL) y sembrando de inicio un tubo para micobacterias (Lowenstein-Jensen) y una caja
de Petri en algún medio general para hongos (Sabouraud). Las resiembras serán
semanales y deben seguirse hasta por dos meses. Los cultivos de médula ósea
revelan el agente etiológico en pacientes con salmonelosis, brucelosis, tuberculosis y
micosis profundas. En algunas instituciones, la médula ósea se inocula directamente en
un tubo de Isolator 1.5, de donde se sembrarán los distintos medios. Parece una opción
muy razonable puesto que muchos de los patógenos que se encuentran en médula
ósea son predominantemente intracelulares.

4.3.6 Bibliografía
1. O'Grady NP, Alexander M, Burns LA, Dellinger EP, Garland J, Heard SO, Lipsett PA, Masur
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11. Baron EJ, Miller JM, Weinstein MP, Richter SS, Gilligan PH, Thomson RB, Bourdeau P,
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12. Mermel LA, Allon M, Bouza E, Craven DE, Flynn P, O'grady NP, Raad II, Rijnders BJ,
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America. Clin Infect Dis 2009;49(1):1-45.
 4.4. Orina

4.4.1. Generalidades

El análisis de orina marcó probablemente el inicio del laboratorio médico. En la

antigüedad los médicos eran capaces de obtener información diagnóstica a partir de
observaciones básicas como color, turbidez, olor, volumen, viscosidad y sabor. Es
interesante notar que todavía el personal de laboratorio determina estas características
urinarias (¡con excepción del sabor, desde luego!). Sin embargo, el análisis de orina ha
expandido su alcance para incluir no sólo el examen físico de la orina, sino también el
análisis químico y el examen microscópico del sedimento, además del cultivo. Aunque
trataremos principalmente aspectos microbiológicos, revisaremos brevemente el
examen general de la orina, pues ambos se mezclan en las decisiones clínicas.
Además, el examen general de orina es uno de los procedimientos básicos en el
laboratorio, siendo muy útil no sólo para revelar anomalías en el sistema urinario, sino
también para detectar algunas enfermedades generales o de otros órganos que
puedan reflejarse en la orina.

4.4.2. Obtención de la muestra

El hecho de que la muestra de orina se obtenga con tanta facilidad, con

frecuencia lleva a descuidos en el tratamiento después de su obtención. Puesto que la
orina es un medio de cultivo ideal, existen múltiples cambios que pueden ocurrir por el
almacenamiento inadecuado, por lo que es necesario el manejo correcto después de
que se obtiene la muestra. En realidad, las tres reglas principales para el manejo de las
muestras de orina se aplican en todas las muestras recibidas en el laboratorio:

1. La muestra se debe depositar en un recipiente limpio y seco. Para cultivo,

el frasco deberá ser estéril. Los recipientes desechables son cada vez más
populares.

2. Los recipientes se deben etiquetar con el nombre del paciente, fecha y hora
de obtención, así como información adicional, como el número de cama de
hospital.

3. Se debe enviar la muestra al laboratorio en forma rápida y examinar dentro

de una hora. Se deben refrigerar las muestras que no se pueden enviar o
examinar en una hora.

Existen diferentes tipos de toma de muestra para el examen de la orina. El más

utilizado es la toma de la mitad de la micción, que consiste en tomar la muestra
después de que el paciente ha orinado un poco, lo cual sirve como arrastre mecánico
para la flora que se encuentre en el tercio terminal de la uretra proporcionándonos orina
menos contaminada. También se les da instrucción completa sobre los métodos de
limpieza de genitales y la obtención sólo de la mitad de la micción. Las muestras
pediátricas son un reto para su obtención. Existen bolsas de plástico transparente con
un adhesivo para pegar en el área genital de los niños y niñas, o bien de pacientes
adultos sin sonda pero con incontinencia urinaria o pérdida de la conciencia. Las
muestras de bolsa recolectora pueden ser útiles cuando los resultados se interpretan
en conjunto con la coloración de Gram de la orina sin centrifugar y al análisis del
sedimento. Se puede obtener orina mediante sondeo vesical, lo cual lleva el riesgo de
introducir bacterias del tercio terminal de la uretra hacia la vejiga. Se puede recurrir a la
aspiración por punción suprapúbica, en cuyo caso la orina será estéril, pero la técnica
es cruenta y se realiza con rareza.

4.4.3. Técnica para el examen general de orina

El estudio de la orina es físico, químico y microscópico. Para el estudio físico de

la orina basta con observar las características de la muestra, como: color, olor, aspecto,
turbidez y volumen. La gravedad específica se mide por urinómetro, o en ausencia de
éste, mediante tira reactiva, que servirá también para el estudio químico. Mediante la
utilización de la tira reactiva se analizan las características químicas de la orina. El
número de metabolitos estudiados dependerá de los reactivos que contenga la tira en
cuestión, siendo común en la mayoría de ellas: hemoglobina, sangre, urobilinógeno,
bilirrubinas, cuerpos cetónicos, proteínas, glucosa, pH y nitritos.

El examen microscópico se realiza centrifugando 15 ml de orina a 1000 rpm

durante 5 minutos. Posteriormente se tira el sobrenadante y se vierte el sedimento
sobre un portaobjetos, se le coloca un cubreobjetos y se procede a observar al
microscopio con seco fuerte. En este estudio se buscarán: células propias del
organismo y del tejido, como son las del epitelio y que pueden ser, desde células del
meato, hasta del epitelio renal. Células propias del organismo pero que no pertenecen
al sistema urinario como los leucocitos y los eritrocitos, o de epitelio vaginal, lo cual nos
habla de contaminación de la muestra. Células ajenas al organismo, pudiendo ser
estas bacterias, hongos o protozoarios. Finalmente, se pueden diagnosticar
enfermedades por metazoarios como en el caso de la esquistosomiasis, donde se
observan los huevos del parásito en la orina. Los cristales son otro objeto de estudio en
el sedimento urinario, siendo los más importantes los uratos, fosfatos y oxalatos, cuya
presencia dependerá de la dieta así como del pH urinario. La mayoría de los autores
concuerdan en que la observación de los cristales tiene poco interés clínico.

La enumeración cualitativa o semicuantitativa del tipo y número de elementos

observados en el examen microscópico del sedimento urinario es de utilidad para el
diagnóstico de problemas infecciosos. La orina normal recogida del chorro medio no
contiene más de uno o dos eritrocitos o leucocitos y una célula epitelial por campo de
400 aumentos. Un aumento de 10 o más leucocitos por campo se ha correlacionado
bien con infección urinaria. Por último, otro elemento de importancia en el estudio del
sedimento son los cilindros, los cuales son formaciones tubulares de proteína que se
filtra por los glomérulos y que se gelifica en los túbulos. La presencia de estas
estructuras refleja una lesión glomerular, más aún cuando contiene alguna sustancia o
células

en su matriz. Los cilindros granulosos están formados de leucocitos y son

comunes en estados infecciosos; los cilindros de eritrocitos se forman en la
glomerulonefritis. Para observarlos al microscopio es necesario recorrer el campo hasta
las orillas del cubreobjetos, ya que frecuentemente se desplazan a la periferia. Como
se mencionó en el capítulo de microscopia, es necesario recorrer la muestra en grecas
y observar por lo menos 10 campos para poder obtener un promedio de las células.

4.4.4. Urocultivo. Generalidades

Las infecciones de vías urinarias (IVU), cuyas manifestaciones van desde

bacteriuria asintomática hasta pielonefritis y abscesos retroperitoneales, constituyen
uno de los problemas más comunes en la población general y en individuos
hospitalizados. La mayoría de los casos están causados por enterobacterias y en
menor proporción, por cocos grampositivos. Las mujeres sufren con mayor frecuencia
de IVU porque la uretra femenina es mucho más corta que la del varón. La uretra
provee una barrera mecánica que aísla el aparato urinario del exterior. En el varón,
cuando no existen anormalidades anatómicas la infección es rara. Se conoce como el
factor contribuyente más común la obstrucción secundaria a hipertrofia prostática, o la
contaminación por vía ascendente (instrumentación).

El diagnóstico de las IVU está basado en el número de bacterias o "unidades

formadoras de colonias" (UFC) por mL en un cultivo urinario. La presencia de 100,000
UFC de una bacteria por mL es suficiente para establecer el diagnóstico de bacteriuria
significativa, si bien existen casos de infecciones sintomáticas con cuentas menores y
de cuentas significativas sin sintomatología. Afortunadamente, la mayor parte de las
IVU son monomicrobianas y la presencia de dos o más gérmenes habitualmente indica
contaminación, aunque debe evaluarse la posibilidad de infección polimicrobiana en
pacientes con sonda vesical a permanencia o vejiga neurogénica.

El laboratorio de microbiología debe procesar sus estudios considerando siempre

el beneficio para el paciente. Esto requiere que las muestras se procesen lo más rápido
posible, con un costo razonable y un informe temprano al médico tratante. Como las
infecciones urinarias constituyen uno de los problemas más comunes en la práctica
médica, es frecuente que el tratamiento deba iniciarse sobre las bases empíricas en
espera del resultado del urocultivo o en ausencia de éste, por lo que se han propuesto
procedimientos de diagnóstico rápidos y económicos como la coloración de Gram en la
orina sin centrifugar, la determinación de nitritos urinarios por tira reactiva y la cuenta
de leucocitos en el sedimento urinario.

La gran mayoría de las infecciones urinarias son causadas por enterobacterias

(Escherichia coli, Klebsiella sp., Proteus sp., etc.), que son capaces de reducir el nitrato
presente en la orina hasta nitrito, por lo que se ha utilizado esta propiedad para
predecir el diagnóstico de infección urinaria. Desgraciadamente, esta prueba no resulta
de utilidad para descartar infecciones por Pseudomonas, Candida o estafilococos, pues
éstos no reducen el nitrato (no son enterobacterias).

4.4.5. Procesamiento para el cultivo de orina

El urocultivo se realiza mediante la inoculación en agar sangre y agar

MacConkey. Hay que recordar que para este estudio la orina debe ser recolectada en
frasco estéril. La siembra de la orina en agar sangre es para realizar el cultivo
cuantitativo; en este caso se usa una asa calibrada de 1 uL y se vacía en una línea
vertical sobre el agar, sobre la que se efectuará una sola estría corrida
perpendicularmente, sin quemar el asa, como se describió en su momento. La siembra
en agar MacConkey se realiza para aventajar en la identificación de las bacterias
causantes de infección ya que generalmente son gramnegativas.

La buena práctica obliga a elaborar un examen general de orina paralelamente.

Si no se solicitó por el clínico debe al menos analizarse el sedimento luego de
centrifugar 10 a 15 mL por cinco minutos a 1000 RPM. Los valores numéricos normales
para el sedimento no están bien establecidos pero son aproximadamente de 0-2
eritrocitos, de 0-5 leucocitos y de 0-2 cilindros hialinos por campo seco fuerte. En los
casos de obtención de muestra con bolsa recolectora, deberá efectuarse siempre la
coloración de Gram de una gota de orina sin centrifugar, ya que si se observa una o
más bacterias por campo de inmersión en la muestra existen al menos 106/mL. Es
aconsejable también determinar la presencia de nitritos por tira reactiva.

4.4.6. Informe de resultados del cultivo

Se informa siempre el número de leucocitos promedio por campo seco fuerte.

Cuando se hayan efectuado, se informa la coloración de Gram de la orina sin
centrifugar y la presencia de nitritos. Por último, se informa el resultado del cultivo.
Cada colonia que observamos procede de una sola bacteria (unidad formadora de
colonias o UFC), por lo que de su número podemos inferir la cuenta de bacterias
presentes en la muestra. Se cuentan las colonias en el agar sangre, y se multiplican
por el factor del asa. Por ejemplo, si se cuentan 120 colonias, y se utilizó asa de 1 uL
para la inoculación, se calculan 120,000 UFC por mL de orina, aunque se informará
sólo que el número sobrepasa a las 100,000 UFC. Cuando existe un número escaso de
colonias, o existe flora polimicrobiana, habitualmente se puede atribuir a
contaminación, aunque, como se mencionará, debe efectuarse correlación clínica.

4.4.7. Interpretación clínica de los resultados

Hemos llegado al punto más importante para el clínico. Lo más común es que no
exista problema para la interpretación. Por ejemplo, si tenemos un urocultivo con más
de 100,000 UFC/mL, proveniente de un paciente con síntomas como dolor para la
micción, el diagnóstico está fuera de toda duda. Pero no es raro que existan dudas en
la interpretación, como el urocultivo positivo en un individuo sin molestias urinarias y sin
leucocitos en el sedimento; en este caso debe repetirse la toma para confirmar el
hallazgo (este individuo portaría lo que se conoce como bacteriuria asintomática).

Un caso opuesto se encuentra cuando el cultivo es negativo pero existen más de

10 leucocitos por campo en el sedimento (piuria estéril). Lo más probable es que el
paciente sufra infección y se encuentre tomando ya un antibiótico eficaz. Recuerde que
la mayoría de los antimicrobianos se excretan por vía renal, alcanzando
concentraciones muy altas en orina, incluso mayores que en el suero. El caso ilustra
también la necesidad de comunicarse con el clínico, o poner una nota aclaratoria pues,
si el paciente no se encuentra bajo prescripción con antibióticos, habrán de descartarse
gérmenes que no desarrollan en cultivos convencionales, como micobacterias o
chlamydias.

Cuando existe desarrollo abundante de dos o más gérmenes debe sospecharse

que el enfermo sea portador de sonda vesical permanente, o que padezca alteraciones
en la función de la vejiga, como la vejiga neurogénica, común en diabéticos y
parapléjicos, que ocasiona la incapacidad de vaciar completamente la vejiga, con la
consecuente orina residual, asiento de infecciones. Si no es el caso, debe comunicarse
al clínico la posibilidad de contaminación de la muestra.

El diagnóstico de infección urinaria (o de ausencia de infección) es

particularmente difícil en niños en que la orina debe colectarse con bolsa. Por ello,
varios autores sugieren que debe cultivarse sólo orina obtenida por punción de la
vejiga. Sin embargo, nuestra experiencia muestra que raramente se toman esas
muestras y que generalmente la muestra obtenida por bolsa permite establecer el
diagnóstico si se efectúan además el análisis del sedimento, la prueba de nitritos y la
coloración de Gram de la orina sin centrifugar. Por ejemplo, aunque exista
contaminación con flora de la piel puede establecerse que existe infección cuando la
prueba de nitritos es positiva, la coloración de Gram muestra bacilos gramnegativos
gruesos y el cultivo desarrolla predominantemente una enterobacteria. Por otro lado,
puede establecerse ausencia de infección si ninguna de las anteriores es positiva y el
cultivo desarrolla menos de 100,000 UFC/mL de algún germen.

4.4.8 Bibliografía
1. Baron EJ, Miller JM, Weinstein MP, Richter SS, Gilligan PH, Thomson RB, Bourdeau P,
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 4.5. Expectoración y aspirado bronquial

4.5.1. Generalidades

El estudio de la expectoración se ha realizado desde la época de Hipócrates,

cuando se utilizaban las características físicas de la muestra para el diagnóstico: el
color, olor, consistencia y sabor, eran fundamentales (¡al igual que la orina!). La
expectoración, o esputo, es una mezcla de agua, sales, plasma, moco y células, cuyas
proporciones son inconstantes. El análisis de las características macroscópicas del
esputo vino a enriquecerse con el descubrimiento del microscopio y las técnicas de
cultivo, ya que los hallazgos obtenidos han marcado la pauta para el estudio integral de
muchas enfermedades respiratorias, principalmente las de origen infeccioso.

En realidad, una muestra de esputo no siempre es representativa de las

secreciones de vías respiratorias bajas, ya que éstas generalmente son deglutidas, y
cuando llegan a ser expectoradas, a su paso por la faringe sufren contaminación tanto
de las células de la zona como de la flora allí presentes; además, en la cavidad oral se
contaminan aún más y se diluyen con la saliva. Otro problema con respecto a las
muestras de expectoración, sobre todo en lo que a infecciones se refiere, es que los
patógenos pulmonares tales como Streptococcus pneumoniae y Haemophilus
influenzae pueden formar parte de la flora normal de la faringe y confundir los
diagnósticos. Por todo lo anterior, la obtención de una muestra adecuada ha sido
motivo de múltiples estudios para llegar a un consenso de los requerimientos
necesarios para que dicha muestra sea representativa de las vías respiratorias bajas.
Conviene también agregar aquí que el diagnóstico de infección respiratoria debe
efectuarse clínicamente y que los hallazgos microbiológicos sirven para apoyar la
sospecha y atribuir un agente causal.

El aspirado bronquial, por su parte, se toma generalmente de pacientes con

sondas (tubos) para respirar, y suelen ser de mejor calidad que el esputo, aunque
también las sondas sufren colonización con el transcurso de los días. Con el desarrollo
de la broncoscopia con instrumento flexible, se han vuelto también comunes las
muestras obtenidas por lavado bronquial.

4.5.2. Obtención de la muestra

Existen varias formas de obtener muestras de vías aéreas inferiores. La más

utilizada de todas, por cómoda y práctica tanto para el médico como para el paciente,
es la recolección del material expectorado por la mañana, ya que, aun cuando la
mayoría del esputo es deglutido, puede obtenerse una porción del que se acumuló
durante toda la noche. En pacientes hospitalizados, el horario no se restringe a la
mañana. Cuando el paciente tiene dificultad para expectorar, se pueden utilizar
nebulizaciones para facilitarlo, siendo las más utilizadas de agua destilada estéril, o
bien una solución de cloruro de sodio al 10% con propilenglicol al 10% para aumentar
la penetración del vapor. Es recomendable que se instruya al paciente para la toma de
muestra, indicándole que realice un enjuague bucal así como gargarismos antes de
recoger la muestra, con lo cual se disminuye la contaminación sin alterar las
características de la misma. En pacientes hospitalizados que sean incapaces de
expectorar se pueden realizar métodos alternativos para la toma de muestra, como la
aspiración con sonda o por punción transtraqueal y el lavado bronquial por
broncoscopia. Los dos últimos eliminan la posibilidad de contaminación de la muestra
pero deben de ser realizados en medios hospitalarios por personal calificado, ya que
pueden tener complicaciones importantes.

4.5.3. Manejo y estudio macroscópico de la muestra

La muestra debe recogerse en un recipiente de boca ancha (lo cual es válido

para muestras expectoradas, ya que las aspiradas pueden ir en tubos), estéril, de
material desechable o de plástico incinerable, de preferencia con tapón de rosca o que
pueda ser cerrado herméticamente a presión para que la muestra no contamine el
exterior del frasco. El recipiente debe rotularse y ser enviado de inmediato al
laboratorio, donde será analizado durante las primeras horas. La muestra puede ser
refrigerada por un día sin que se afecte su celularidad, pero no es recomendable, ya
que la valoración microbiológica no podrá realizarse adecuadamente debido a que la
cantidad de microorganismos disminuye.

En el laboratorio el estudio inicia por la descripción de las siguientes

características: 1) Aspecto y consistencia: se describe como líquido, mucoso,
sanguinolento, purulento, seropurulento, mucosanguinolento, etc.; 2) Color: está dado
por las sustancias contenidas en el mismo, puede ser blanquecino, amarillo, verdoso
(por pus o pigmentos bacterianos), asalmonado, rojizo, etc.; 3) Olor. Generalmente no
se altera, pero en algunos casos puede ser muy fétido, como en los abscesos
pulmonares por anaerobios, y 4) Otros hallazgos. Estos pueden ser de varios tipos,
tales como objetos extraños, restos de alimentos (en casos de broncoaspiración
nocturna en pacientes con hernia hiatal), moldes bronquiales, masas caseosas,
cálculos pulmonares, etc. En algunas ocasiones y en zonas endémicas, estos
hallazgos pueden incluir larvas de nemátodos que se encuentren migrando por pulmón,
como en el caso de la ascariosis, estados larvarios de céstodos.

4.5.4. Estudio microscópico de la muestra

Una vez terminado el estudio macroscópico, se realiza un extendido que se deja

secar al aire y posteriormente se fija por calor o alcohol metílico. Se tiñe con la técnica
de Gram, que sirve para analizar, además de si la muestra es buena para el cultivo, el
tipo de flora predominante. El principal problema de una muestra de esputo es su
representatividad, la cual se puede valorar de acuerdo a diferentes criterios, validos
únicamente para muestras expectoradas, ya que las obtenidas por métodos
instrumentales se suponen representativas. En el caso de encontrar macrófagos,
podemos decir que la muestra proviene del árbol bronquial, ya que no se encuentran
en las secreciones faríngeas, lo mismo sucede cuando encontramos células
pulmonares. Desgraciadamente, en algunas ocasiones, aun cuando la muestra tiene
este tipo de células, se encuentra contaminada por flora faríngea. Para tratar de
discernir si la muestra es adecuada para el cultivo, se han realizado cuantificaciones de
dos tipos de células; escamosas de faringe y leucocitos. Existen diferentes criterios de
clasificación que dependen del investigador en cuestión para decidir si la muestra es
adecuada para cultivo o no. Los criterios más utilizados son el de Welch y Kelly y el de
Bartlett, los cuales analizan campos a bajo aumento (10x) y cuantifican tanto células
escamosas como leucocitos. Para fines prácticos, cualquier muestra con menos de 10
células escamosas y más de 25 leucocitos por campo es adecuada para cultivo,
aunque hay laboratorios que solo toman en cuenta el número de células escamosas
(menor de 10) para realizarlo.

Otro aspecto del estudio microscópico del esputo es la búsqueda de

Mycobacterium tuberculosis, para la cual se requiere de tinciones especiales para ácido
alcohol resistentes, hongos como Coccidioides, Criptococcus e Histoplasma, así como
Pneumocystis carinii de pacientes con inmunosupresión. Este último se busca sólo de
muestras obtenidas por lavado bronquial que deberán primero ser sometidas a
centrifugación.

Una vez que se ha realizado el estudio microscópico y que se ha visto que la

muestra es buena, se procede a cultivarla en agar sangre, agar chocolate y agar
MacConkey, medios que van a permitir el crecimiento de la mayoría de los patógenos
pulmonares. Solo se utilizaran otros medios de cultivo y otras técnicas de diagnóstico,
tales como la utilización de anticuerpos fluorescentes y tinciones especiales, cuando el
clínico así lo solicite.

4.5.5. Informe de resultados

Es obligación del laboratorio discernir entre las muestras adecuadas y las que no
lo sean, sobre todo cuando procede a cultivarlas, ya que, de otra manera, al realizar
siembras de muestras malas y reportar el crecimiento de algún germen, el clínico
puede dar tratamiento para un microorganismo que muy probablemente no se
encuentre involucrado en el proceso. Así pues, una vez que se ha observado una
muestra que no sea adecuada para cultivo, el laboratorio debe reportárselo al clínico
diciéndole la razón de ello, como: "La muestra enviada al laboratorio no es adecuada
para cultivo debido a que contiene más de 10 células escamosas por campo de bajo
aumento, favor de enviar nueva muestra".

La identificación y reporte de los patógenos se efectúa de manera convencional.

Es importante el informe cuantitativo de la intensidad del desarrollo. Es común que
haya desarrollo de flora polimicrobiana, por lo que habrá de efectuarse correlación con
los gérmenes observados en la tinción de Gram, para trabajar aquellos que con mayor
probabilidad se relacionen con el problema del paciente. Algunos autores sugieren que,
cuando se obtenga sólo un escaso desarrollo de estreptococos y estafilococos
coagulasa negativos, se informe que hay sólo flora contaminante. Nosotros estamos de
acuerdo con esta costumbre.

4.5.6 Bibliografía
1. Baron EJ, Miller JM, Weinstein MP, Richter SS, Gilligan PH, Thomson RB, Bourdeau P,
Carroll KC, Kehl SC, Dunne WM, Robinson-Dunn B, Schwartzman JD, Chapin KC, Snyder
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4. Murray PR, Washington JA II. Microscopic and bacteriologic analysis of expectorated

sputum. Mayo Clin Proc 1975;50:339-44.
 4.6. Exudado de la faringe, nasofaringe y oido

4.6.1. Exudado faríngeo. Generalidades

Como su nombre lo indica, el estudio consiste en la toma de una muestra de la

orofaringe en su pared posterior, para su cultivo en busca de bacterias patógenas. Para
entender su utilidad y limitaciones, conviene recordar la flora normal y patógena de la
faringe: Una vez que el individuo nace, la cavidad oral, y por ende, la faringe, se
colonizan por bacterias comensales durante las primeras horas de vida; estas bacterias
provienen seguramente de las vías respiratorias altas de los familiares que tienen
mayor contacto con ellos y consisten principalmente en cocos grampositivos aerobios
como estreptococos alfa hemolíticos, Streptococcus pneumoniae y especies de
estafilococos. Posteriormente se agregan cocos gramnegativos (Branhamella**) y
bacilos grampositivos como los difteroides, además de algunas especies de cocos
anaerobios. Con la dentición, la cavidad oral es colonizada por flora anaerobia, la cual
va a persistir en una proporción de 2:1 con respecto al aerobio más frecuente y va a
acompañar al individuo por el resto de su vida. Esta flora anaerobia está compuesta
principalmente por bacilos gramnegativos de los géneros Bacteroides y Fusobacterium,
así como de espiroquetas, cocos grampositivos y algunas especies de vibrios y
lactobacilos. La cavidad es colonizada también por levaduras escasas (Candida). En
los individuos adultos es común encontrar también algunas especies de actinomicetos.
En lo que respecta a la flora patógena, los criterios para clasificarla son ahora muy
distintos a los que se utilizaban hace algunos años, ya que especies que antes se
consideraban patógenas a ese nivel, como por ejemplo el Staphylococcus aureus, son
conocidas ahora como comensales. También es importante mencionar que en la
faringe pueden encontrarse otros organismos que son patógenos pero a otros niveles,
como vías aéreas bajas, senos paranasales, oído medio y sistema nervioso central.
Estos microorganismos, como Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis y el ya
mencionado S. aureus, no deben informarse en el cultivo del exudado faríngeo.

Las bacterias que con más frecuencia producen alteraciones faríngeas son:
Streptococcus pyogenes, el cual pertenece al grupo A de la clasificación de Lancefield y
es betahemolítico; Corynebacterium difteriae, germen productor de la difteria y que es
poco común actualmente; Neisseria gonorrhoeae, por contacto sexual y por último,
Bordetella pertussis, la cual produce la tos ferina. Es importante recalcar que el
exudado faríngeo está encaminado a cultivar principalmente a los estreptococos del
grupo A, ya que es, como dijimos antes, el patógeno más frecuente, además de que
para cultivar a los otros organismos patógenos se requiere de medios especiales y sólo
se hará ante solicitud especial de casos esporádicos. Médicos y personal del
laboratorio deben tener siempre este hecho en mente, para no atribuir al cultivo
faríngeo propiedades diagnósticas que no posee.

4.6.2. Técnica para toma de muestra y cultivo de exudado faríngeo

La técnica para el hisopado de la faringe varía dependiendo de quien la realice,

pero para fines prácticos, la que produce mejores resultados es la siguiente: Se pide al
individuo que abra la boca, se ilumina la cavidad oral y la faringe lo mejor posible
(puede realizarse con la iluminación ambiental) y se le pide al paciente que inhale aire
por la boca tratando de decir una "A" larga, esto se realiza con dos finalidades; primero,
el aire al pasar inhibe parcialmente a los nervios vago y glosofaríngeo, con lo cual se
puede disminuir en alguna medida el reflejo nauseoso, y en segundo lugar, al tratar de
producir el sonido la epiglotis se deprime, permitiendo una mejor visualización de la
faringe y, por ende, una mejor toma de muestra. Mientras el paciente realiza lo anterior
se procede a tomar la muestra con un hisopo estéril frotándolo bien en los pilares
anteriores y la retrofaringe, teniendo cuidado de no tocar la úvula para no despertar el
reflejo nauseoso. Es conveniente tomar la muestra sin abatelenguas cuando sea
posible, aunque en algunos casos, como cuando la muestra se toma en un niño que no
coopera, su utilización es inevitable. Una vez tomada la muestra se procede a realizar
la siembra por estría diluida, como se explica en el capítulo correspondiente. La
muestra se siembra sólo en agar sangre, que deberá ser forzosamente de carnero y
deberán efectuarse piquetes en el agar para observar mejor la hemólisis. La incubación
se hace en atmósfera capnofílica. Habrá de informarse sólo la presencia o ausencia de
estreptococo betahemolítico del Grupo A. El médico deberá ser consciente de que este
estudio no tiene ninguna otra finalidad.

4.6.3. Exudado nasofaríngeo y de oído

El cultivo del exudado nasofaríngeo tiene poca utilidad en la práctica clínica, y

quizá su única indicación sería en el caso de un paciente con tos ferina y se quisiera
aislar al agente etiológico de la secreción nasofaríngea. Anteriormente se utilizaba en
casos de otitis media aguda porque se suponía que el germen encontrado en el cultivo
era el mismo que producía la infección, pero estudios posteriores demostraron que no
existe una relación directa entre el cultivo nasofaríngeo y el agente etiológico de la
otitis. Para obtener una muestra es necesario contar con una asa de alambre con punta
de Dacrón, o bien con hisopos de alginato de calcio, ya que ambos son preferibles a los
hisopos de algodón. El hisopo, el cual se humedece previamente con solución salina
estéril, se introduce lenta y cuidadosamente por una narina, pegándose al tabique
nasal, en caso

de que éste no pase por alguna obstrucción, puede utilizarse la otra narina. Una
vez que la punta del hisopo se encuentre en nasofaringe, se realizan movimientos
circulares para que se impregne bien y se extrae para realizar la siembra. La siembra
se realiza en un medio específico para Bordetella pertussis (Bordet Gengou). Debe
mencionarse que es común que le médico solicite cultivo del exudado nasofaríngeo
como auxiliar en el diagnóstico de sinusitis, lo cual es un error.

En lo referente al cultivo del exudado de oído, este es un método que

actualmente se encuentra en desuso por varias razones, la primera y más importante
es debido a que este tipo de cuadros son generalmente tratados de manera empírica
con antibióticos de amplio espectro. La segunda es porque las muestras obtenidas de
la secreción a través del oído externo se encuentran contaminadas con la flora nativa y
no corresponden al germen causal, o bien la membrana timpánica ya lleva mucho
tiempo rota y la flora tiende a ser polimicrobiana. La toma de estas muestras se reserva
para casos de otitis media aguda con perforación y salida de secreción así como las
obtenidas por timpanocentesis (punción del tímpano).

4.6.4 Bibliografia

1. Bartlet RC. Medical microbiology: How fast to go-How far to go. In: Lorian V (Ed.).
Significance of Medical Microbiology in the Care of Patients. The Williams and Wilkins Co,
Baltimore, 1977:15-35.

2. Upton A, Farrell E, Stewart J, Lennon D. Disappointing performance of rapid antigen

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3. Shulman ST, Bisno AL, Clegg HW, Gerber MA, Kaplan EL, Lee G, Martin J, Beneden CV.
Clinical practice guideline for the diagnosis and management of Group A streptococcal
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4. Baron EJ, Miller JM, Weinstein MP, Richter SS, Gilligan PH, Thomson RB, Bourdeau P,
Carroll KC, Kehl SC, Dunne WM, Robinson-Dunn B, Schwartzman JD, Chapin KC, Snyder
JW, Forbes BA, Patel R, Rosenblatt JE, Pritt BS. A guide to utilization of the microbiology
laboratory for diagnosis of infectious diseases: 2013 recommendations by the Infectious
Diseases Society of America (IDSA) and the American Society for Microbiology (ASM). Clin
Infect Dis 2013;57(4):e22-e121.
 4.7. Heces. Cultivo y parasitoscópico

4.7.1. Generalidades

Las infecciones intestinales, junto con las infecciones respiratorias, son los
problemas infecciosos más comunes en el ser humano, y constituyen prioridades de
salud pública en casi todos los países. Por ejemplo, en México la diarrea infantil causa
graves problemas de desnutrición pues suele ser recurrente en el mismo enfermo a
quien además, por atavismos, se le suprime la alimentación en cada cuadro. El
descubrimiento de que los pacientes con diarrea deben recibir líquidos y alimentos
orales se considera uno de los grandes descubrimientos de la medicina en el Siglo XX.
Pudiera sorprender que se le equipare en importancia al desarrollo de los antibióticos o
de métodos sofisticados de diagnóstico, pero nos ubica en la prioridad para todo
paciente con infección intestinal: antes de preocuparse por el diagnóstico etiológico,
atienda el estado de hidratación y las condiciones generales; generalmente, el manejo
del paciente con diarrea no incluye un antibiótico y, cuando lo incluye, no hay urgencia
por iniciarlo.

La gran diversidad de la flora bacteriana normal en el tubo digestivo complica el

diagnóstico por el laboratorio. Como en ningún otro sitio, podemos entonces reafirmar
lo que se menciona en el capítulo introductorio: No todo lo que desarrolla en cultivo es
patógeno. El postulado complementario es verdadero también en la medida en que
conocemos que muchos cuadros están causados por gérmenes no cultivables o de
cultivo no convencional, o sea: “No todos los patógenos crecen en cultivos
convencionales”, como el caso de las diarreas por rotavirus o campylobacter. Conviene
desde ahora aclarar un hecho: aun en los laboratorios mejor equipados, el diagnóstico
etiológico de un problema diarreico no se logra en más del 20 por ciento de los niños y
el 10 por ciento de los adultos. Entonces, resulta que el coprocultivo no debe ser un
estudio rutinario para todos los casos de diarrea, pues ésta habrá curado cuando se
disponga del resultado, sino para casos seleccionados por su gravedad, duración
mayor de cinco días, fiebre elevada o heces mucosas o sanguinolentas.

Por su etiología, las gastroenteritis pueden ser de diversas categorías. Las

frecuencias relativas implican en primer lugar a gérmenes que no invaden la mucosa,
como las infecciones virales y las intoxicaciones por alimentos, asociadas a toxinas de
Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Vibrio cholerae,
Aeromonas y E. coli enterotoxigénica; en estos casos, es poco común la coexistencia
de fiebre o de leucocitos en la evacuación. Sólo recientemente se han identificado los
agentes virales: en adultos y niños mayores de dos años el virus Norwalk es el más
común; en niños menores suele ser el rotavirus. El S. aureus es un contaminante
habitual de productos de pastelería y carnes procesadas por manejadores de alimentos
que lo portan en la nariz; sus toxinas causan vómitos, diarrea y retortijones dentro de
dos a ocho horas de la ingestión, limitándose en pocas horas. El C. perfringens
prolifera en carnes recalentadas que se dejaron a temperatura ambiente, en donde se
producen esporas y enterotoxinas; esta gastroenteritis aparece de 8 a 24 horas
después de la ingestión. El B. cereus produce toxinas que contaminan granos y
legumbres; el período de incubación es de 8 a 16 horas. La E. coli toxigénica es causa
de la mayoría de los casos de la llamada diarrea del viajero (venganza de Moctezuma).

La fiebre suele estar presente cuando la infección está causada por Salmonella,
Shigella, Edwarsiella, Campylobacter o E. coli enteroinvasora; en estos casos, existe
invasión de la mucosa intestinal y es común que el paciente aqueje cólicos y heces con
moco o sangre (disentería), siendo usual la presencia de leucocitos. Es en este
segundo grupo en donde el cultivo tiene su mayor aplicación. La infección por Shigella
es la causa más reconocida de disentería bacilar, y generalmente ocurre después de la
ingestión de alimentos contaminados. La infección por Campylobacter jejuni se
reconoce cada vez más por su importancia, sobre todo en niños menores de cinco
años (causa más casos de diarrea que Salmonella y Shigella juntos). Cuando existen
leucocitos o eritrocitos en la evacuación, debe descartarse también la etiología
parasitaria (E. histolytica y G. lamblia, así como Cryptosporidium e Isospora en
inmunosuprimidos). En la tabla 1 se esquematizan las principales causas de diarrea
infecciosa y su mecanismo.

Finalmente, el clínico y el laboratorista deben considerar que existen muchas

causas de diarrea no infecciosa, como la malabsorción de alimentos, el consumo de
laxantes y aceites y la alimentación excesiva en solutos (diarrea osmótica). Incluso el
consumo de antibióticos puede causarla, al favorecer el crecimiento de especies
potencialmente patógenas, como Clostridium difficile, causante de la colitis
seudomembranosa por el consumo de clindamicina o betalactámicos. En términos
generales puede decirse que el coprocultivo debe hacerse sólo de heces diarreicas,
con excepción de los casos estudiados con fines epidemiológicos (como la búsqueda
de vibrios o Salmonella en manejadores de alimentos).

4.7.2. Toma de la muestra

En los adultos, la muestra se recibe en un frasco de boca ancha por el propio

paciente. En los niños, puede obtenerse del pañal o a través de un hisopo o cucharilla
rectal que se introduce a través del ano. En cualquier caso, debe hacerse llegar de
inmediato al laboratorio pues es común que los gérmenes no patógenos desarrollen
con más facilidad que los patógenos en el excremento evacuado. Cuando no pueda
hacerse llegar de inmediato debe colocarse un poco de la muestra en un medio de
transporte adecuado (Cary-Blair).
 4.7.3. Proceso de la muestra

En el laboratorio, siempre deberán anotarse las características de las

evacuaciones y hacer una observación en fresco en busca de leucocitos o eritrocitos,
incluso cuando el clínico no lo ha solicitado. Esta es una parte integral del estudio pues,
como se menciona en las generalidades, las diarreas con excreción de leucocitos
suelen indicar invasión de la mucosa (Salmonella, Shigella, campylobacter, E. coli
invasora, parásitos), mientras que sin ellos generalmente indica problema tóxico o viral
(S. aureus, B. cereus, C. perfringens, E. coli toxigénica, Vibrio cholerae, Aeromonas,
rotavirus y virus Norwalk).

No existe un panel aceptado de medios que han de sembrarse. Nosotros

recomendamos un medio selectivo para Salmonella y Shigella (Agar SS), un medio de
agar sangre (sólo para efectuar la prueba de oxidasa) y un medio de XLD, o xilosa-
lisina-desoxicolato). Cuando la muestra procede de niños menores de 5 años y tiene
leucocitos, conviene sembrar un agar para campilobacter, que deberá sembrarse en
atmósfera de CO2 a 42 oC. En condiciones de epidemias, o cuando el paciente
adquirió la diarrea en zona costera, conviene sembrar un medio de TCBS para vibrios.

4.7.4. Interpretación de los resultados

Una información importante para la interpretación se da aun antes de contar con

el desarrollo en las cajas; nos referimos a la observación de leucocitos pues, como se
mencionó, es un dato pivote para sospechar la etiología.

El primer paso en la interpretación del desarrollo consiste en una prueba de

oxidasa de un barrido de colonias del agar sangre; una prueba negativa prácticamente
descarta la presencia de Vibrio y Aeromonas. Una prueba positiva obliga a su
búsqueda (observar el TCBS o sembrarlo, en su caso). Algunos pacientes pueden
tener Pseudomonas en la evacuación con la consecuente prueba de oxidasa positiva.
Afortunadamente, la hemólisis verdosa o lavanda y el olor característico habitualmente
permite apreciar su presencia y no continuar la búsqueda del germen oxidasa positivo,
pues Pseudomonas no se considera patógeno en heces.

A continuación, se procede a revisar el agar SS en busca de colonias lactosa

negativas (incoloras) o sulfuro positivas (centro negruzco), que generalmente
corresponden a Salmonella, Shigella, Edwarsiella o Proteus. Se toman varias colonias
por separado y se efectúan pruebas bioquímicas de al menos 3 colonias diferentes.
Puede efectuarse preliminarmente sólo una “minibioquímica” con tubos de Kligler,
ureasa y hierro-lisina, lo que permite efectuar pruebas con antisueros al día siguiente
(del tubo de Kligler); existen en el mercado antisueros polivalentes contra Salmonella,
de uso muy sencillo. Si se trata de proteus, generalmente puede verse el swarming u
oleadas en el agar sangre, y en ningún caso se considera patógeno en excremento.
Cuando existe un inóculo muy escaso de Salmonella o Shigella, el medio de SS no
mostrará su desarrollo pues es un medio muy selectivo. Por ello debe observarse el
medio de XLD para buscar colonias rojizas, que corresponden usualmente a
Salmonella o Shigella. En este caso, se efectúan las pruebas bioquímicas o de
antisueros. Cuando hay un germen productor de sulfuro, ureasa negativa e indol
positivo, debe sospecharse Edwarsiella tarda. Nosotros no recomendamos el cultivo de
caldos de enriquecimiento en heces, pues en nuestra experiencia (y la de otros) no
mejora el aislamiento de patógenos.

Cuando existe desarrollo en el medio de TCBS se buscan colonias amarillas

(Vibrio cholerae) o verdosas (V. parahemoliticus). En ambos casos, deben separarse en
agar sangre para efectuar pruebas confirmatorias por aglutinación con antisueros al día
siguiente. Cuando se sembró el medio de Campylobacter, se observa su desarrollo. Si
hay colonias, se efectúa una prueba de oxidasa (debe resultar positiva en presencia de
Campylobacter). De las colonias se efectúa una coloración de Gram para observar su
apariencia característica (gramnegativos en alas de gaviota). Finalmente, cuando no se
encuentre patógeno específico alguno, se informa el resultado como ausencia de ellos.
Es decir, no debe reportarse como negativo sino, por ejemplo:

Coprocultivo: No desarrolló Salmonella, Shigella, Vibrio, Edwarsiella,

Aeromonas, ni Campylobacter.

4.7b. Métodos coproparasitoscópicos

4.7b.1. Introducción

Como su nombre lo indica, un método coproparasitoscópico, al que desde ahora

vamos a referirnos como CPS, es una técnica de laboratorio para estudiar el
excremento en busca de parásitos, tanto protozoarios como helmintos, ya sea porque
habiten en el tubo digestivo o porque aparezcan en él en algún momento de su ciclo
vital. La importancia de un CPS radica en la capacidad del médico para indicarlo en el
momento apropiado, ya que es bastante común que se solicite al laboratorio ante la
presencia de algún síntoma digestivo vago, que difícilmente puede atribuirse a las
parasitosis.

Si bien es cierto que las parasitosis intestinales no tienen un cuadro clínico

específico, también es cierto que existen ciertos signos o síntomas que nos obligan a
inclinarnos hacia el diagnóstico de una u otra enfermedad. Esto depende
fundamentalmente del hábitat del parásito y de su mecanismo patogénico; un ejemplo
común es la diarrea por Giardia lamblia, parásito que habita en el duodeno y que
lesiona la mucosa mediante su disco suctor evitando la absorción de los alimentos,
principalmente grasas, las cuales aparecen en el excremento en la enfermedad aguda.
En este caso, el CPS de Faust, que es muy bueno para obtener quistes del parásito en
la enfermedad crónica, nos resulta poco apropiado debido a que sólo vamos a
encontrar grasa en las muestras estudiadas, ya que concentra la muestra por flotación.
Así pues, es importante conocer los diferentes métodos que existen y sus indicaciones
para lograr un resultado útil.

4.7b.2 Clasificación

Los métodos coproparasitoscópicos los podemos clasificar en tres grupos

principales:

Métodos cualitativos. Por su fácil realización son los más utilizados, sólo nos
indican si existe la parasitosis pero no nos refieren la cantidad de parásitos por gramo
de heces. Son útiles para todas las parasitosis cuando no se quiere cuantificar ésta,
sobre todo en las protozoosis, en las cuales esto no es necesario. Dentro de los
métodos cualitativos más utilizados se encuentran los siguientes:

1. CPS directo en fresco.

2. CPS por concentración-flotación de Faust.

3. CPS por concentración-sedimentación de Ritchie o método de formalina-éter.

4. CPS por decantación en copas.

Métodos cuantitativos. Se utilizan poco, principalmente en las helmintiasis en

las cuales es importante conocer la magnitud de la enfermedad, tales como las
uncinariasis o la tricocefalosis. En ellas se utiliza una cantidad determinada de
excremento y posteriormente se multiplica el número de huevecillos encontrados por
diferentes factores dependiendo de la consistencia de las heces. Dentro de este grupo,
los métodos más utilizados son:

1. CPS por concentración-flotación de Ferreira.

2. CPS de Stoll.

3. CPS de Kato.

Métodos especiales. Sirven para recolectar o concentrar parásitos

obteniéndolos de su hábitat normal, de algún lugar especial en el que se encuentren en
un momento determinado por las características de su ciclo, o bien por ciertas
características biológicas propias de cada parásito tales como el termo e hidrotropismo.
Las técnicas son muy variadas dependiendo del parásito en cuestión. Los métodos
más comunes son:

1. Sondeo duodenal. Para parásitos de duodeno o vías biliares.

2. Tamizado de heces. Para proglótidos de tenias.

3. Método de Graham. Para huevecillos de oxiuros o larvas de strongyloides.

4. Método de la cucharilla rectal. Para parásitos de colon, principalmente

amebas patógenas.

5. Exudado vaginal. Para Trichomonas vaginalis.

4.7b.3. Método de Ritchie

De los métodos anteriores describiremos sólo los más utilizados. Uno de ellos es
el de concentración por centrifugación de Ritchie o método de la formalina-éter.

Manejo de la muestra El número de muestras a estudiar es generalmente de

tres, aunque para algunas parasitosis es necesario un mayor número. Para facilitar el
estudio es conveniente dar al paciente un recipiente de boca ancha que contenga un
conservador como el FAF (formol, alcohol, fenol), el cual servirá además para mantener
los parásitos en buenas condiciones para estudios posteriores. Con este paso,
podemos estudiar en una sola muestra las heces de diferentes días. Se le pide al
paciente que deposite en el frasco una cantidad moderada de excremento
(aproximadamente 10g, o el tamaño de una nuez) durante tres días consecutivos de la
primera evacuación del día.

Proceso

1. Se procede a homogeneizar la muestra con la ayuda de un abatelenguas.

2. Se filtra la muestra por una malla de gasa a un tubo de centrífuga.

3. Se centrifuga a 2000 rpm durante un minuto y se tira el sobrenadante

vertiendo nuevamente FAF en el tubo. Este paso se realiza las veces que sea
necesario para obtener un sobrenadante claro (generalmente bastan tres
veces).

4. En caso de no tener la muestra previamente en FAF y estar realizándolo con

solución salina, después de la última centrifugación se vierten 10 ml de formol
al 10% en el tubo de ensaye y se deja reposar por 15 minutos para la fijación
de los parásitos. Este paso no es necesario cuando la muestra ya se
 encuentra en FAF, en cuyo caso se le coloca nuevamente FAF en lugar de
formol

5. Se colocan en el tubo 5 ml de éter, se coloca un 0tapón de corcho y se agita

vigorosamente durante 30 segundos.

6. Se retira el tapón cuidadosamente debido a la formación de gases por el éter

y se centrifuga a 1500 rpm durante dos minutos, tiempo después del cual, la
muestra se retira de la centrífuga.

Al observar el tubo, vamos a distinguir cuatro fases diferentes en él, la superior,

en la cual se encontrará el éter y las grasas, la segunda que contendrá detritus
vegetales, una tercera que contiene el formol o el FAF y por último, el sedimento en el
cual se van a encontrar los parásitos. Esta última se extraerá del tubo mediante una
pipeta Pasteur y se colocará en los extremos de un portaobjetos limpio, una con
solución salina, y la otra con lugol parasitoscópico para teñir algunas estructuras de los
parásitos. A ambas se les coloca un cubreobjetos y se procede a su revisión en el
microscopio a seco débil y en grecas en busca de quistes, larvas o huevecillos. Se
utiliza el seco fuerte para la identificación.

4.7c. Tinción tricromica permanente

4.7c.1 Introducción

Las técnicas de coloración de parásitos preservadas con fijadores como el

Schaudin o el PVA (polivinilalcohol) han demostrado ser muy superiores a los métodos
convencionales de diagnóstico en el caso de las enfermedades parasitarias del tubo
digestivo. Esto es debido a que el análisis de la muestra se realiza mejor con la fijación
y coloración de los parásitos. De hecho, los expertos aceptan que para la mayoría
de los protozoarios, la identificación con los CPS convencionales, o en fresco, es
sólo presuntiva y debe confirmarse siempre en tinción. Otra ventaja es que puede
ser leída por diferentes observadores en tiempos distintos. Para realizar una coloración
es necesario preparar las muestras con fijadores como los anteriormente mencionados,
lo cual facilita su adhesión a las laminillas así como su coloración.

4.7c.2. Técnica

Al momento de obtener la muestra, la cual debe de ser fresca, puede procesarse

inmediatamente introduciendo un extendido de la misma en fijador de Schaudin durante
una hora, aunque el tiempo puede variar desde 20 minutos hasta 24 horas o más, o
bien puede mezclarse una cantidad de muestra con tres de PVA para procesarse en
cualquier momento posterior, conservándose de esta manera indefinidamente. El
extendido se realiza de forma circular en un extremo de un portaobjetos, dejándose
secar por un lapso de una hora, al término de la cual se le pasa una hoja de papel
secante por encima para retirar el exceso de líquido. Luego puede procederse a la
coloración. Es conveniente mencionar que da mucho mejor resultado la coloración si se
deja secar el extendido durante 24 a 72 horas. Es también conveniente que la muestra
llegue ya preservada en PVA al laboratorio pues evita la descomposición del transporte.
Sin embargo, cuando se entrega el recipiente con PVA al paciente, debe mostrar un
rótulo de toxicidad (debe mostrar calavera) pues es muy tóxico y algunas madres lo
han dado a ingerir a los niños en la creencia de que sirve como laxante para obtener la
muestra. Para los reactivos de la coloración se utilizan jarras de Coplin, en los cuales
se van introduciendo los portaobjetos con los extendidos de la manera siguiente:

1. Alcohol iodado, 10 minutos.

2. Etanol al 70%, 3-5 minutos.

3. Etanol al 70%, 3-5 minutos.

4. Coloración tricrómica, 6-8 minutos.

5. Alcohol ácido, 5-10 segundos. Durante este paso se observará

cuidadosamente cuando el exceso de colorante se retire de la preparación,
para lo cual basta con introducirla dos veces de manera rápida en la jarra
con el reactivo, pasándose rápidamente a la siguiente jarra.

6. Etanol al 95%. Dos introducciones rápidas.

7. Etanol al 95%, 5 minutos.

8. Etanol al 95%, 5 minutos.

9. Etanol absoluto, 3 minutos.

10. Xileno, 3 minutos.

11. Montar con resina o material apropiado inmediatamente después de salir del
paso 10, sin dejar que se seque.
 4.7d. Bibliografía
1. Baron EJ, Miller JM, Weinstein MP, Richter SS, Gilligan PH, Thomson RB, Bourdeau P,
Carroll KC, Kehl SC, Dunne WM, Robinson-Dunn B, Schwartzman JD, Chapin KC, Snyder
JW, Forbes BA, Patel R, Rosenblatt JE, Pritt BS. A guide to utilization of the microbiology
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Diseases Society of America (IDSA) and the American Society for Microbiology (ASM). Clin
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2. Humphries RM, Linscott AJ. Laboratory diagnosis of bacterial gastroenteritis. Clin Microbiol
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4. García LS, Bullock-Iacullo S, Palmer J, Shimizu RI. Diagnostic of parasitic infections:

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Tenover FC, Yolken RH (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 6th ed. American Society for
Microbiology, Washington D.C., 1995;1145-1158.
 4.8. Exudado vaginal, cervical y uretral

4.8.1. Antecedentes, exudado vaginal y cervical.

Estos estudios se solicitan generalmente por la presencia de flujo vaginal

(vaginitis), en ocasiones acompañado de dolor bajo de abdomen (cervicitis y
enfermedad pélvica inflamatoria). Es sorprendente que, a pesar de ser uno de los
problemas más comunes de la consulta ginecológica, aún se desconozca mucho de la
etiología de ambas enfermedades. Es importante que el médico y el personal del
laboratorio conozcan la utilidad y limitaciones de los estudios microbiológicos para
evitar tratamientos inadecuados. Recuerde que existe una flora vaginal normal
(lactobacilos, anaerobios, cocos grampositivos, bacilos gramnegativos, levaduras), por
lo que no puede pretenderse que cualquier aislamiento en cultivo tenga implicaciones
clínicas.

Las infecciones o infestaciones vaginales son: 1) Candidosis; 2) Trichomoniasis;

y 3) Vaginosis bacteriana. La candidosis vaginal es común y tienen predisposición a
ella las mujeres que utilizan anticonceptivos, las diabéticas y las que han tomado
antibióticos. El flujo es blanquecino y produce comezón intensa, aunque no suele haber
mal olor. Puesto que Candida es parte de la flora vaginal normal, su aislamiento en
cultivo no siempre tiene importancia y se prefiere la coloración de Gram y/o el examen
en fresco del flujo. La trichomoniasis es una enfermedad venérea muy común que se
diagnostica con facilidad en el examen en fresco; produce un flujo amarillento y
comezón intensa.

La vaginosis bacteriana es una enfermedad común que generalmente se

presenta en el 35% de las mujeres con enfermedades de transmisión sexual, del 15 al
20% de las mujeres embarazadas y del 5 al 15% de pacientes con algún problema
ginecológico. Los factores de riesgo se asocian con actividad sexual promiscua y uso
de anticonceptivos, así como la utilización del dispositivo intrauterino. La vaginosis
bacteriana se considera una infección polimicrobiana donde Gardnerella vaginalis,
bacilos gramnegativos (enterobacterias y anaerobios), Peptostreptococcus,
Ureaplasma y micoplasmas casi siempre se están presentes. Las especies de
Mobiluncus se han encontrado hasta en el 97% de pacientes y su papel en esta
enfermedad todavía está por determinarse. Por otro lado, los lactobacilos se
encuentran muy disminuidos en las pacientes con vaginosis bacteriana y se les
considera protectores de la vagina debido a la producción de peróxido de hidrógeno,
bacteriocinas y la disminución del pH que inhibe la colonización por otros
microorganismos. Debido a la gran variedad de gérmenes que se postulan como
causantes, actualmente el diagnóstico no se basa en el cultivo, sino en la coloración de
Gram del exudado vaginal.

La cervicitis suele manifestarse por flujo mucopurulento, a veces acompañado de

dolor bajo de vientre. Generalmente es causada por Chlamydia trachomatis o Neisseria
gonorrhoeae. Sin embargo, hasta en la mitad de los casos no puede encontrarse
ninguno de los dos y, aunque se han postulado muchos agentes causales, hasta el día
de hoy se deben considerar desconocidos. El diagnóstico debe sospecharse
clínicamente, en conjunto con una coloración de Gram del exudado cervical.

4.8.2. Antecedentes, exudado uretral del varón

La sola salida de secreción purulenta, comúnmente acompañada de ardor para

orinar, es suficiente para hacer el diagnóstico clínico de uretritis en el hombre. Sus
causas más comunes son N. gonorrhoeae y C. trachomatis. Existen algunos casos por
herpes y por Trichomonas. Ureaplasma urealyticum ha sido implicado en algunos
casos, pero la asociación es aún dudosa. Cuando sólo existe la disuria, pero no puede
encontrarse secreción, deberá descartarse prostatitis o cistitis.

4.8.3. Toma e interpretación del exudado vaginal y cervical.

El estudio del exudado cervical y vaginal debe incluir siempre la observación de

las características del flujo (volumen, color, olor), el examen en fresco para observar T.
vaginalis y levaduras, la prueba de aminas (KOH), la coloración de Gram del exudado
vaginal (fondo de saco) y cervical, así como el cultivo del exudado cervical en medio de
Thayer Martin. Como se deduce de los antecedentes, es generalmente inútil la toma de
cultivos vaginales. En esto están de acuerdo la mayoría de los autores.

El examen en fresco se hace de un poco de solución salina donde se ha

introducido un hisopeado del fondo de saco posterior. Se observa a 400X (con el
objetivo seco fuerte) para buscar T. vaginalis o levaduras. Otro hisopado se introduce
en KOH para detectar el olor de las aminas ("olor a pescado"). La coloración de Gram
es muy importante. Si las células epiteliales son normales y existen abundantes bacilos
grampositivos con morfología de Lactobacillus, puede decirse en general que el
resultado es normal pues los patógenos (con excepción de Candida) los desaparecen.
La presencia de levaduras en el Gram indica candidosis con más precisión que el
cultivo. Para indicar la presencia de vaginosis bacteriana, existen varios criterios para
su interpretación, siendo el más aceptado el criterio de Spiegel, en donde cada
morfotipo bacteriano es cuantificado por el objetivo de inmersión mediante el siguiente
esquema: 

 1+, 1 por campo;

2+, 1 a 5 por campo;

3+, 6 a 30 por campo;

4+, más de 30 por campo.

Bacilos largos grampositivos se consideran Lactobacillus y bacilos pequeños

Gram-variable se les considera Gardnerella. Otros organismos se caracterizan como
cocos positivos o negativos. Cuando el morfotipo del Lactobacillus se encuentra
presente solo o únicamente en combinación con el morfotipo de Gardnerella, la
coloración se interpreta como normal. Cuando hay presencia de flora mixta incluyendo
no solamente el morfotipo de Gardnerella sino otras bacterias gramnegativas y
grampositivas, y cuando el morfotipo del Lactobacillus está ausente o solo en números
muy pequeños (1+, 2+), la coloración se considera diagnóstica de vaginosis bacteriana.
En estos casos, suelen existir las células clave, o células epiteliales de bordes mal
definidos por la colonización con flora mixta.

El Gram del exudado cervical es de utilidad para auxiliar en el diagnóstico de

cervicitis, en cuyo caso podrán observarse más de 30 leucocitos por campo de
inmersión. El cultivo en Thayer Martin es 90% sensible para confirmar la presencia del
gonococo. Para confirmar la presencia de Chlamydia habrán de efectuarse pruebas de
fluorescencia o ELISA. Recuerde que hasta el 50% de las cervicitis son de causa
desconocida, por lo que es muy importante reportar el Gram, para ayudar en su
sospecha.

4.8.4. Exudado uretral del varón

Para el estudio del exudado uretral del varón, generalmente es necesario

"ordeñar" la uretra y obtener secreción para Gram, cultivo en Thayer Martin y,
eventualmente, estudios de fluorescencia o ELISA para Chlamydia. La observación de
diplococos intracelulares gramnegativos en "grano de café" es lo suficientemente
característicos para hacer el diagnóstico de gonorrea. Cuando la uretritis no es
gonocócica, deberá buscarse Trichomonas en un sedimento urinario, así como buscar
la presencia de Chlamydia.
 4.8.5 Bibliografía
1. Márquez-Davila G, Martínez-Barreda CE. Predicive value of the “clue cells”investigation and
the amine volitilization test in vaginal infections caused by Gardnerella vaginalis. J Clin
Microbiol 1985;22:686-7.

2. Nugent RP, Krohn MA, Hillier SL. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by
a standardized method of Gram stain interpretation. J Clin Microbiol 1991;29:297-301.

3. Spiegel CA. Diagnosis of bacterial vaginosis by direct Gram stain vaginal fluid. J Clin
Microbiol 1983;18:170-7.

4. Vontver LA, Eschenbach DA. The role of Gardnerella vaginalis in non-specific vaginitis. Clin
Obstet Gynecol 1981;24:439-60.
 4.9. Secreciones oculares

4.9.1. Generalidades

El ojo y sus estructuras asociadas están predispuestos a la infección por una

gran variedad de microorganismos. Las indicaciones y técnicas de la investigación
microbiológica están determinadas por el sitio de infección, severidad del proceso y
conocimiento del microorganismo probablemente responsable. Los pacientes con
infección ocular representan un gran problema para la recolección de las muestras
porque el ojo es un órgano de dimensiones pequeñas y altamente sensible; además, la
muestra generalmente es pequeña y el crecimiento del germen puede alterarse por
diversos factores como la dilución que sufre al inocularse en un medio relativamente
grande, o el uso previo de antibióticos que, por ser de uso local, alcanzan altas
concentraciones.

La flora normal del ojo puede variar diariamente, y por lo tanto, no puede usarse
el término germen patógeno pues resulta obsoleto. Como se ha insistido en otros
capítulos, la connotación de patógeno depende de interrelación con el clínico. El
desarrollo de Staphylococcus aureus puede representar sólo una colonización si la
muestra se tomó, por ejemplo, como escrutinio en un paciente hospitalizado sin
problemas oculares.

4.9.2. Toma de muestras

Para mantener una calidad óptima en la muestra, se recomienda que ésta sea
tomada en el laboratorio generalmente con hisopos de dimensiones adecuadas. Los
hay fabricados de algodón, poliéster y alginato de calcio. En ocasiones se utiliza una
espátula de material que permite la esterilización rápida y con él se realiza un raspado
en el sitio deseado para obtener la muestra. Si se trata de una secreción purulenta o
líquida en un compartimento cerrado, se prefiere el método de aspiración con jeringa
estéril para conservar la viabilidad de los microorganismos anaerobios. Es importante
tomar en cuenta el sitio de probable punción pues ésta se encuentra contraindicada en
algunas zonas del ojo. En todo caso, es un procedimiento que debe efectuar sólo el
especialista.

Los anestésicos tópicos tienen propiedades antimicrobianas que pueden alterar

el resultado del cultivo, por lo que se recomienda la toma de la muestra antes de su
aplicación. El hidroclorato de proparacaína al 0.5% es el menos antiséptico y el de
elección cuando no se puede evitar su uso, como en la obtención de material
proveniente de córnea. Los anestésicos locales no interfieren con las técnicas
citológicas.
 Los medios de cultivo utilizados en las secreciones oculares, comúnmente son
medios generales como agar sangre y chocolate. Como la causa de infección puede
ser amplia, incluyendo bacterias, virus y hongos, según la sospecha clínica, está
indicado el cultivo en medios como Thayer-Martin, Sabouraud, etc. Generalmente, no
se efectúa cultivo para anaerobios pues la superficie ocular está colonizada
normalmente, por lo que se reserva para muestras obtenidas por punción con jeringa.
Las tinciones también se realizan de acuerdo con la sospecha clínica. La coloración de
Gram acompañará a todo cultivo. Sólo si la solicita el clínico deberán hacerse
baciloscopias o tinciones especiales.

Los párpados son órganos que forman parte del aparato protector del ojo. Están
expuestos a multitud de afecciones por lo que toda lesión atípica en ellos debe ser
estudiada con biopsia. Generalmente el cultivo de muestras provenientes de la piel
intacta del párpado es de difícil interpretación como es el caso de las erisipelas, por lo
que su estudio es relegado. Si la lesión está abierta, se toma la muestra con un hisopo
de algodón rotándolo sobre la superficie y se inoculan con él los medios de cultivo. Si la
lesión es cerrada y candidata a aspirar se procede a realizarla con jeringa estéril no sin
antes limpiar la piel con alcohol y antiséptico yodado (Isodine®). En ocasiones, existen
lesiones purulentas de los párpados constituidas por lipogranulomas estériles (como el
orzuelo o chalación).

A pesar de la protección que brindan las pestañas, los párpados, la capa lagrimal
preocular y el epitelio, la conjuntiva está predispuesta a la infección por diversos
microorganismos. Las principales rutas de inoculación son fomites, contacto mano-ojo y
la extensión de la infección de los anexos. La conjuntiva está en interrelación constante
con hongos y bacterias del aire y los anexos, y hacen que la flora normal sea compleja
y determinada por muchos factores. Es obligatorio hacer cultivo de las dos conjuntivas
aun en infección unilateral. Por las características clínicas se puede distinguir una
conjuntivitis bacteriana, viral o por Chlamydia (pero esta afirmación no es válida en
conjuntivitis neonatal) y así indicar qué tipo de microorganismo se espera recuperar en
el cultivo e indicar el medio de cultivo adecuado. Para obtener la muestra, un hisopo de
algodón se pasa por la conjuntiva inferior tarsal y fornix (ángulo del ojo) y se inoculan
los medios. El proceso se repite en el otro ojo. La coloración Gram se hace siempre, ya
que nos auxiliará en la identificación de las formas infecciosas, alérgicas o irritación
conjuntival. Cuando se sospecha Chlamydia como!88 causa, se deberá usar hisopos de
alginato de calcio porque el algodón le resulta tóxico. En este caso, resulta más
importante la coloración o las determinaciones por ELISA que el cultivo.

La infección de la conjuntiva en el recién nacido ocurre por inoculación en la

infección ascendente de vagina y cérvix en la ruptura prematura de membranas, por
secreciones al nacer o por contacto con personas o materiales contaminados.
Característicamente, es causada por Neisseria gonorrhoeae o Chlamydia pero, a
diferencia del adulto, no tiene signos que orienten a la etiología por lo que se
recomiendan los cultivos que cubran todas las posibilidades.

Factores exógenos y alteraciones locales y generales del huésped, hacen a la

córnea susceptible de infectarse por diversas bacterias, causando una infección seria
que requiere una pronta y meticulosa investigación por el laboratorio. La principal vía es
el daño a la córnea con material contaminado o invasión de un defecto preexistente,
pues son pocas las bacterias capaces de penetrar el epitelio intacto de la córnea. El
método de obtención del material es el raspado en múltiples áreas de la córnea con
espátula, excepto cuando hay una lesión focal o perforación. Este procedimiento
idealmente lo realiza el oftalmólogo auxiliado de la lámpara de hendidura o con
microscopio quirúrgico. El material obtenido pasando un hisopo por la superficie, no
será representativo.

La endoftalmitis (infección de las estructuras internas del ojo) es la infección más

severa. Para lograr conservar la función ocular, se requiere un alto grado de sospecha,
rápida investigación en el laboratorio y un agresivo tratamiento antimicrobiano. El
procedimiento para obtener la muestra depende siempre del especialista pues requiere
muestras por punción. Sin embargo, lo más común es que el tratamiento se establezca
por posibilidad epidemiológica y que se relegue el cultivo.

4.9.3. Proceso e interpretación

La coloración Gram que acompaña al cultivo apoyará sus hallazgos. En los

extendidos de conjuntiva, la respuesta inflamatoria se estima contando los leucocitos
por cada 10 células epiteliales. En una conjuntivitis aguda bacteriana, hay más de 10
polimorfonucleares por cada 10 células epiteliales. Las infecciones virales producen
comúnmente menos de 10 linfocitos y monocitos por cada 10 células epiteliales.
También se pueden observar las inclusiones dentro del citoplasma producidas por C.
trachomatis.

Los extendidos de córnea reconocen las bacterias responsables de las queratitis

y pueden identificar hongos elementales. La queratitis alérgica se sospecha cuando
hay secreción escasa y presencia de eosinófilos (tinción de Wright).

Para la interpretación de los cultivos de conjuntiva, se requiere familiarizarse con

la flora normal (ver anexo), pues el aislamiento de algún germen de ella requiere
interpretación juiciosa, en conjunto con el clínico. La selección para la identificación y
sensibilidad a antibióticos depende de la orientación clínica. El microorganismo más
frecuentemente aislado es Staphylococcus aureus seguido por Streptococcus del grupo
A y Streptococcus pneumoniae. En niños menores de cinco años predomina
Haemophilus influenzae. Las enterobacterias son raras en los cultivos oculares, aunque
esto no es válido en pacientes hospitalizados y postoperados. En el recién nacido es
más frecuente encontrar Neisseria gonorrhoeae y C. trachomatis que a otras edades.
En una infección crónica, frecuentemente se aíslan hongos, y de éstos, Aspergillus es
el más común.

Cuando el inicio del tratamiento es urgente, se puede orientar por los hallazgos
de la coloración y la identificación parcial que da el cultivo y posteriormente en el
laboratorio se continúa la identificación total. El reporte incluye la descripción de los
hallazgos en las tinciones y el nombre del germen aislado en el cultivo, ya identificado
totalmente y con su respectiva sensibilidad a antibióticos. Sin embargo, casi siempre es
importante el envío de informes preliminares.

4.9.4. Bibliografía
1. Baron EJ, Miller JM, Weinstein MP, Richter SS, Gilligan PH, Thomson RB, Bourdeau P,
Carroll KC, Kehl SC, Dunne WM, Robinson-Dunn B, Schwartzman JD, Chapin KC, Snyder
JW, Forbes BA, Patel R, Rosenblatt JE, Pritt BS. A guide to utilization of the microbiology
laboratory for diagnosis of infectious diseases: 2013 recommendations by the Infectious
Diseases Society of America (IDSA) and the American Society for Microbiology (ASM). Clin
Infect Dis 2013;57(4):e22-e121.

2. Jones DB, Liesengang TJ, Robinson NM. Cumitech 13, Laboratory Diagnosis of Ocular
Infections. Washington JA (Ed.). American Society for Microbiology, Washington D.C., 1981

3. Miller JM, Holmes HT. Specimen collection, transport, and storage. In Murray PR, Baron EJ,
Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 6th ed. American
Society for Microbiology, Washington D.C., 1995;19-32.
 4.10. Cultivo de sondas y catéteres

4.10.1. Generalidades

El procedimiento de invasión más frecuentemente aplicado a los pacientes

hospitalizados es la colocación de catéteres endovenosos. De hecho, es tan común
que el lector pensará que nos referimos ahora a los catéteres centrales. Esta imagen
de inocuidad de los catéteres periféricos, y frecuentemente por extensión, los centrales,
ha sido responsable de una buena parte de las bacteriemias nosocomiales. Por ello es
importante conocer cómo y para qué se cultivan estos dispositivos.

Al respecto de las sondas (intrapleurales, vesicales, endotraqueales,

nasogástricas etc.) mencionaremos en síntesis -lo que sirve y lo que no sirve-. En lo
general se ha establecido que es mejor cultivar el líquido que se ha drenado que la
sonda que lo drenó. Para estas últimas no existen parámetros definidos de las cuentas
bacterianas asociadas a enfermedad. En estos términos parece más razonable cultivar
la orina que el catéter vesical. Aun así, le recomendamos no rechazar las solicitudes de
cultivo de otros médicos; es probable que no le envíen el líquido y pierda al cliente.
Abordaremos algunos casos particulares de procedimientos de otros dispositivos
especiales.

4.10.2. Cultivo de catéteres endovenosos

La técnica más aceptada del cultivo de catéteres endovenosos es la descrita por

Maki hace más de 20 años. Esta se basa en el rodamiento de la punta del catéter (3-5
cm) en agar sangre.

Obtención, Transporte y Siembra de muestras Se retira el catéter con el

cuidado convencional de esterilidad (guantes, cubrebocas). Se cortan 3 a 5 cm de
punta del catéter y se coloca en un tubo estéril. El transporte al laboratorio y siembra
deberán hacerse cuanto antes. En el laboratorio, (aunque podría hacerse a la cabecera
del paciente) se coloca la punta del catéter en una placa de agar sangre y se rueda en
4 ó 5 sentidos con la ayuda de un hisopo estéril. Se cuentan las unidades formadoras
de colonias después de incubarse por 24 horas a 35 °C. Se procede luego a la
identificación y determinación de sensibilidad de los las colonias con métodos
convencionales.

Las cuentas obtenidas de este procedimiento se informan como: "Negativo",

"Menos de 15 UFC de...", "Más de 15 UFC de..."; o bien "Contaminación masiva de…"
con la identificación y sensibilidad al germen. Raramente se presentan casos con
cuentas limítrofes; algunos autores consideran cuentas entre 10 y 15 UFC como
"colonización", mientras que cuentas superiores se describen como contaminación. Los
informes preliminares siempre serán útiles. La bondad del método está basada en la
facilidad del procedimiento de siembra, el bajo consumo de material de laboratorio y la
sencillez para generar un criterio cuantitativo con buena asociación con enfermedad.

4.10.3. Otros procedimientos

Se han ensayado otros procedimientos para mejorar el aislamiento en

dispositivos endovenosos, de derivación ventriculo-peritoneal etc. Estos incluyen la
siembra en placa de volúmenes controlados de solución salina instilada a través del
catéter. El informe llevará un criterio cuantitativo que, sin embargo, no ha superado al
obtenido por la técnica de Maki.

La coloración directa de los catéteres con naranja de acridina y la búsqueda de

bacterias con microscopio de fluorescencia, tiene la ventaja de ser una prueba rápida
que dará un resultado cualitativo controlable sólo en manos experimentadas. La
superficie de los catéteres contaminados mostrará bacterias o levaduras y
eventualmente la posibilidad de dar un resultado presuntivo de la identidad a través del
morfotipo. En suma, hasta ahora el procedimiento mejor controlado para el cultivo de
catéteres endovasculares es el efectuado por rodamiento. En el caso de los catéteres
ventriculo-peritoneales, peritoneales de diálisis, endopleurales, etc., efectúe un
procedimiento similar (rodamiento) y establezca comunicación con el médico que lo
solicita. Los gérmenes aislados y la sensibilidad a antibióticos pueden aportar
información útil (aunque limitada) al tratamiento del problema. Como se dijo, es mejor
cultivar los líquidos que estos dispositivos drenaban.

4.10.4. Bibliografía

1. Gross PA, Harkavey LM, Barden GE, Kerstein M. Positive Foley catheter tip cultures-fact or
fancy? JAMA 1974;228:72-3.

2. Macías-Hernández AE, Cortés Gallo G, Muñoz-Barrett JM, González-Campos H, Medina-

Valdovinos H, Ruiz-Martínez LM. Contaminación de catéteres endovenosos en un servicio
pediátrico. Boletín Med Hosp Inf Mex 1994;51:524-7.

3. Maki D, Weise CE, Safarin HW. A semiquantitative culture method for identifying
intravenous-catheter-realted infection. New Engl J Med 1977;296:1305-9.

4. Martin MA, Pfaller MA, Wenzel RP. Coagulase-negative staphylococcal bacteremia. Ann
Intern Med 1989;110:9-16.
Parte 5. EL LABORATORIO EN INFECCIONES POR HONGOS

5.1. Generalidades

En la actualidad, nuevos procedimientos y terapéuticas han permitido que

paciente con enfermedades graves, puedan ser tratados. Debido al estado de
inmunosupresión de estos pacientes, generalmente grave, el clínico debe poner
especial atención al desarrollo de infecciones. En las últimas dos décadas, esta
problemática se ha visto reflejada en un incremento considerable de las infecciones por
hongos; que además, se añaden a las infecciones superficiales comunes.
Tradicionalmente, el manejo de muestras se considera como el prototipo de riesgo y su
estudio se ha relegado en casi todos los laboratorios generales. De hecho, es
importante que no se trabajen hongos de micosis profundas si no se cuenta con
personal capacitado y equipo de seguridad biológica, como campana con filtro de alta
eficiencia. Sin embargo, los laboratorios generales están obligados al estudio de estos
problemas; pueden trabajar estudios de poco riesgo, como los relativos a dermatofitosis
(micosis superficiales) e inocular los medios en casos de micosis profundas, para luego
enviarlos a laboratorios especializados para su identificación, en caso de que exista
desarrollo.

Los hongos son ubicuos en la naturaleza y tienen una gran variedad pues se
conocen más de 200 mil especies. Sin embargo, sólo poco más de 100 se reconocen
como patógenos para el humano. En general, pueden dividirse en hongos verdaderos
(mohos) y levaduras. Los primeros semejan a las plantas en que producen
ramificaciones (hifas) que en conjunto forman un micelio que es fácilmente reconocible
en los cultivos por su apariencia vellosa. Por otra parte, las levaduras (como Candida o
Cryptococcus) son hongos unicelulares redondeados que se reproducen por gemación;
sus colonias suelen ser mucoides y circulares, parecidas a colonias bacterianas.
Algunos hongos, como los de las micosis profundas (Histoplasma, Blastomyces,
Coccidioides) existen como un moho en la naturaleza pero en los tejidos aparecen
como una levadura; éstos se conocen como hongos dimorfos.

Los mohos se reproducen por esporas que en ocasiones se agrupan en órganos

especializados, o frutos, que se conocen como macroconidias. Su reconocimiento
microscópico, es importante en la identificación de los mohos. En esta área, la
micología es diferente que la bacteriología; pues está depende generalmente de
características bioquímicas para la identificación, mientras que la micología requiere
más de la experiencia de quien observa las colonias a simple vista y las formas en el
microscopio.
 5.2. Procedimientos de laboratorio

En general, los procedimientos de la micología son semejantes a los de la

bacteriología, pero los hongos requieren más tiempo para su desarrollo, lo que obliga a
tener medios que resistan la desecación y la contaminación por saprófitos. El primer
requisito se obtiene sellando las cajas de Petri o incubándolas en ambientes húmedos.
Como se mencionó en la sección de incubación, los cultivos de hongos deben
incubarse a temperatura ambiente o en una incubadora a 30 oC. Los medios se dividen
en generales o selectivos (a éstos se les agregan inhibidores de saprófitos) y existen
en una gran variedad. Sin embargo, consideramos que todo laboratorio debe contar
con un medio general, como el agar Sabouraud, y uno selectivo, como el de Mycosel;
éste contiene cicloheximida para inhibir el desarrollo de Aspergillus y otros hongos
ambientales, pero permite en desarrollo de los dermatófitos y hongos dimorfos.

A continuación, describiremos brevemente situaciones particulares en estudios

de micología, que representan los casos más comunes en la práctica diaria.

5.3. Estudios de piel, cabello y uñas para micosis superficiales

El diagnóstico de las micosis superficiales, o dermatofitosis, suele ser sencillo y el

médico generalmente indica un tratamiento aun sin auxilio del laboratorio. Sin embargo,
en ocasiones hay lesiones atípicas y el médico solicita observación en fresco y cultivo
de las escamas. En todos estos casos, se limpia el área a estudiar con alcohol y se
raspa con una laminilla estéril para obtener escamas que habrán de vaciarse
directamente en un medio de Sabouraud, uno de Mycosel y una laminilla para su
estudio directo. Los medios se sellan con cinta y se incuban a 30 oC, o a temperatura
ambiente; entre cinco y siete días después se podrá observar el desarrollo tanto en el
medio no selectivo (Sabouraud) como en el selectivo (Mycosel), ya que los dermatofitos
no se inhiben por cicloheximida. Si se observa desarrollo sólo en Sabouraud,
generalmente se trata de contaminantes. La identificación definitiva requiere adherir
una cinta Scotch a la colonia y pegarla en una laminilla que contenga un fijador
coloreado, generalmente azul de algodón. La observación microscópica de las
macroconidias permite identificar al dermatófito después de que ha desarrollado en
cultivo (Epidermophytum sp., Microscoporum sp., Trichophytum sp).

Para la observación directa en fresco, se agrega hidróxido de potasio (KOH,

10%) a la laminilla con escamas y se calienta en el mechero sin permitir la ebullición,
tratando de disolver la queratina. Una vez enfriada, la muestra se observa directamente
en el microscopio (100 y 400 aumentos) para encontrar hifas o levaduras. La sola
observación de ellas suele ser suficiente para el clínico, quien frecuentemente no
estará interesado en la identificación definitiva, ya que el manejo será semejante para
todas las especies. Es por ello que se dice que si la observación en fresco es
claramente positiva para hongos o levaduras, podrá muchas veces obviarse el cultivo.
Sin embargo, conviene aclarar que el cultivo es un estudio de mayor sensibilidad, por lo
que es imprescindible en todos los casos en que la observación en fresco sea negativa
o dudosa.

5.4. Líquidos corporales (LCR, pericárdico, peritoneal, sinovial)

Deben obtenerse bajo condiciones de punción estéril y enviarse de inmediato al

laboratorio o almacenarlos a 4 oC hasta por doce horas. En estos casos el médico
persigue micosis profundas y es común que los cultivos se siembren en conjunto con
los cultivos convencionales. El sólo mantener las cajas por varios días, cuando los
cultivos convencionales son negativos, es una costumbre que permite detectar en
ocasiones micosis inesperadas, pues casi todos los hongos desarrollan en agares
convencionales, como el agar sangre, y resisten la temperatura de incubación de 37
oC. Sin embargo, siempre conviene sembrar una agar especial para hongos, como el

Sabouraud que deberá incubarse por lo menos cuatro semanas, si bien no es muy
necesario sembrar medios selectivos pues estos líquidos generalmente carecen de
flora contaminante. Puesto que es riesgoso trabajar con hongos verdaderos de micosis
profundas, deberán abrirse las cajas sólo en campana de seguridad biológica o
enviarse a un laboratorio especializado si se observa desarrollo. En estudios de LCR,
se efectúa una observación mezclando una gota del centrifugado de la muestra con
una de tinta china para descartar la presencia de cryptococo.

5.5. Orina

Estos cultivos se solicitan casi siempre en busca de infecciones por Candida,

pues los hongos verdaderos no suelen aparecer en orina, incluso en micosis profundas.
Candida suele desarrollar en el agar sangre que se siembre rutinariamente en los
urocultivos, en donde suele confundirse con estafilococo. Cuando se solicita
especialmente, conviene también sembrar un medio de Sabouraud. Es importante
recalcar que la presencia de Candida en un urocultivo, no representa necesariamente
una infección; ya que esta puede ser contaminación de la flora habitual. De hecho, su
relevancia clínica es cuestionable, excepto cuando se tiene una sospecha clínica
considerable (como candidiasis sistémica).

5.6. Exudado vaginal

Sólo Candida se busca rutinariamente en el exudado vaginal. Sin embargo, debe

decirse que este hongo es parte de la flora vaginal normal de muchas mujeres, por lo
que el cultivo tiene poca utilidad. Sin embargo, la observación en fresco de levaduras
directamente de la muestra, o su aparición en la coloración de Gram, indica su
presencia en cantidad suficiente como para considerarla patógena, por lo que estos
estudios han sustituido al cultivo.

5.7. Secreciones respiratorias

Puesto que estas secreciones pasan por las vías superiores, es importante que
se evalúe su calidad (abundantes leucocitos, escasas células epiteliales) antes de
pretender cultivarlas. Se prefiere la expectoración matutina. Se persigue Candida
(generalmente pacientes hospitalizados o inmunosuprimidos), Cryptococcus o, en
zonas endémicas, Coccidioides.

5.8. Sangre y médula ósea

Cuando el médico sospecha candidiasis diseminada, debe dar aviso al

laboratorio para ventilar los medios convencionales de hemocultivo con una aguja. Es
preferible la toma de estos cultivos en tubos de lisis-centrifugación (véase sección de
hemocultivos), de donde posteriormente se sembrará un medio de agar sangre y
Sabouraud, como si fuera una secreción. Si hay desarrollo de levaduras, se procede a
su identificación. Si hay desarrollo de un hongo verdadero en las cajas, deberán
enviarse a un laboratorio especializado. Incubar al menos cuatro semanas.

5.9. Secreciones purulentas

Estas se siembran básicamente para descartar la presencia de abscesos por

Coccidioides en zonas endémicas o esporotricosis. Se siembra como una secreción
convencional. Si hay desarrollo, deberán enviarse las cajas a un laboratorio
especializado. Incubar al menos 4 semanas. También es posible observar las
levaduras directamente de la muestra al aclarar con KOH.
 5.10 Bibliografía
1. Baron EJ, Miller JM, Weinstein MP, Richter SS, Gilligan PH, Thomson RB, Bourdeau P,
Carroll KC, Kehl SC, Dunne WM, Robinson-Dunn B, Schwartzman JD, Chapin KC, Snyder
JW, Forbes BA, Patel R, Rosenblatt JE, Pritt BS. A guide to utilization of the microbiology
laboratory for diagnosis of infectious diseases: 2013 recommendations by the Infectious
Diseases Society of America (IDSA) and the American Society for Microbiology (ASM). Clin
Infect Dis 2013;57(4):e22-e121.

2. Walsh TJ, Gamaletsou MN, McGinnis MR, Hayden RT, Kontoyiannis DP. Early clinical and
laboratory diagnosis of invasive pulmonary, extrapulmonary, and disseminated
mucormycosis (zygomycosis). Clin Infect Dis 2012;54 (suppl 1):s55-s60.

3. Ostrosky-Zeichner L. Invasive mycoses: diagnostic challenges. Am J Med 2012;125 (1

suppl):s14-s24.

4. Holmberg K. New diagnostic methods in medical microbiology. Scand J Infect Dis

1982;36:121-6

5. Roberts GD. Laboratory diagnosis of fungal infections. Hum Pathol 1976;7:161-8.

Parte 6. EL LABORATORIO EN INFECCIONES POR MICOBACTERIAS

6.1. Generalidades

La tuberculosis es sin duda la enfermedad infecciosa más prevalente en el

mundo. A pesar de esto, nuestros laboratorios no han generado la capacidad de cultivar
micobacterias. En los países en desarrollo se generan frecuentemente cepas
resistentes a antifímicos ante las limitaciones diagnósticas del sistema de salud y falta
de apego a los tratamientos por parte de los pacientes y médicos tratantes. Cada
laboratorio que procesa muestras en microbiología recibirá eventualmente alguna de
éstas y al menos deberá conocer algunos de los fundamentos del proceso de
recolección y cultivo de micobacterias. Para ello abordaremos en este manual algunos
procedimientos, puesto que cada laboratorio ha de participar hasta la medida de sus
posibilidades en la tarea diagnóstica hasta donde esté en sus posibilidades.

6.2. Recolección de muestras

Para obtener resultados óptimos, hemos de procurar que las muestras reúnan las
siguientes condiciones:

• Que sean tomadas antes de iniciar el tratamiento; aun unos cuantos días de
tratamiento podrán inhibir el desarrollo de micobacterias y lo que llevará a
serias dudas en el diagnóstico. Recoja las muestras en contenedores
plásticos limpios, estériles y desechables. De no ser así posible, utilice
contenedores de vidrio que hayan sido sometidos a limpieza y esterilización
profunda.

• Que se obtengan una serie de tres a seis muestras individuales, únicas

matinales en días suscesivos.

• Que se transporten inmediatamente al laboratorio. Refrigere (3 a 5 oC) por un

máximo de 48 horas si no pueden ser entregadas o procesadas en el
momento.

• Selle y empaque los contenedores de manera cuidadosa para evitar fugas o

ruptura durante su transporte.

6.3. Enfermedad pulmonar

Aunque Mycobacterium tuberculosis tiene la capacidad de producir enfermedad

en cualquier órgano, al menos 85% de éstas afectan los pulmones. De ahí que la
mayoría de las muestras provienen de secreciones pulmonares, que se han obtener de
diferentes maneras:

Esputo. Para obtener una muestra deseable se deberá instruir al paciente en el

sentido de:

• Enjuague bucal con agua antes de recolectar el esputo. Esto reducirá el

número de partículas de alimento y medicamentos que pudieran afectar el
proceso. La saliva y moco nasofaríngeo no son esputo.

• Reunir sólo material proveniente de los pulmones después de tos profunda y

productiva.

• La recolección del esputo deberá hacerse en contenedores adecuados. El

número de muestras a procesar dependerá de los resultados de las
búsquedas previas de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR). Cuando al
menos dos de tres muestras han sido positivas, entonces tres muestras serán
suficientes para el cultivo. Si ninguna o sólo una de tres ha sido positiva, se
necesitan más para establecer el diagnóstico (habitualmente seis). Si el
paciente produce muy poca expectoración se puede hacer una recolección
de 24 horas; sin embargo ésta tendrá mayores posibilidades de resultar
contaminada, por lo que es poco recomendable

Esputo inducido. La inhalación de solución salina en aerosol genera la

suficiente irritación como para inducir muestras útiles. Este tipo de muestras suelen ser
líquidas y asemejarse a saliva, por lo que deberán ser etiquetadas como “muestra
inducida”. De esta manera no deberán desecharse para ser procesadas como esputo.

Lavado gástrico. Este tipo de muestra debe ser obtenida en caso no poder
obtener los anteriores. Para resultados óptimos el paciente deberá hospitalizarse la
noche anterior; temprano en la mañana antes de que el paciente se levante o coma la
muestra deberá obtenerse luego de colocar una sonda nasogástrica.

Lavados bronquiales, biopsias y aspirados transtraqueales. Generan no sólo

una muestra útil, sino que inducen la producción natural de esputo de tal manera que
más muestras podrán ser obtenidas para proceso.

6.4. Enfermedades extrapulmonares

Dos grupos de muestras podrán obtenerse de enfermedades extrapulmonares;

asépticas y muestras potencialmente contaminadas con flora del sitio en que son
obtenidas.
 6.4.1. Especímenes asépticos fluidos-

Las muestras de líquido (cefalorraquídeo, pleural, pericárdico, sinovial, pus, o

sangre y médula ósea) podrán contener pequeñas cantidades de micobacterias por lo
que es posible que los mejores resultados se obtuvieran mediante el cultivo de grandes
volúmenes en medios líquidos (Middlebrook 7H-9, Dubos Tween o Proskauer-Beck). La
relación de muestra y medio de cultivo deberá de ser entre 1 a 5 y 1 a 10. Estas
muestras podrán ser inoculadas directamente y requieren atmósfera rica en CO2 a 35 -
37 oC y someterlas a agitación manual suave diariamente.

Cada semana estas muestras deberán ser sometidas a búsqueda de BAAR para
sembrarlas una vez que sea positiva la búsqueda. Al cabo de cuatro semanas de
negatividad se recomienda sembrar el sedimento producto de centrifugación a 3,000g.
Aquellas muestras que pudiesen coagularse espontáneamente deberán ser
adicionadas de heparina (0.2mg/mL) al momento de la toma.

El uso de la técnica de lisis-centrifugación ha mostrado particular utilidad en el

caso de sangre o médula ósea de pacientes con SIDA e infección por micobacterias no
tuberculosas. A 10 mL de sangre colocada en un tubo Isolator® se le agita
manualmente de manera suave y se le deja por una hora para completar la lisis de los
elementos formes. La muestra es sometida a centrifugación (3,000g) para sembrar 1.5
a 2 mL en medios sólidos. Es factible que ésta técnica fuese aplicable para otro tipo de
muestras líquidas y puede recomendarse para todos los laboratorios que sólo cuenten
con medios sólidos como el Lowenstein-Jensen.

6.4.2. Especímenes asépticos,-tejidos sólidos-

Este tipo de muestras no deberán ser conservadas o fijadas antes de su envío.

Será suficiente la refrigeración previa. Para las muestras sólidas deberá, mediante un
mortero estéril, obtenerse un fluido capaz de ser colocado en los medios de cultivo
sólidos. La adición de solución salina estéril o albúmina puede facilitar la tarea. En el
caso de recibir muestras de las que no se puede asegurar su esterilidad, se
recomienda dividir la muestra licuada para siembra directa y siembra después de
descontaminación. La siembra en medios líquidos de respaldo pudiera aplicarse en
este proceso como antes se ha descrito.

6.4.3. Especímenes potencialmente contaminados

La mayoría de las muestras recibidas en el laboratorio caen en esta categoría.

Deberán ser manejadas como esputo. En esta categoría cae la orina y todas aquellas
muestras de las cuales no se puede asegurar la toma o transporte estériles.
 Se requieren dos procedimientos básicos: la descontaminación (a fin de eliminar
otros elementos bacterianos viables) y la centrifugación (para concentrarlas). Para
digerir y eliminar las bacterias y moco acompañantes se suele utilizar hidróxido de
sodio sólo o adicionado de N-acetil-L-cisteína (NALC). Brevemente los procedimientos
de centrifugación/digestión y descontaminación serán descritos.

Centrifugación/Digestión. La eficiencia máxima del proceso de centrifugación

estará en relación con la capacidad para concentrar la mayor proporción de
micobacterias y que éstas permanezcan viables. Someter a elevadas fuerzas
gravitacionales a cualquier microorganismo pudiera bien concentrarlo, pero la fricción
inducida afectará su viabilidad. Si a esto agregamos el efecto tóxico de las soluciones
descontaminantes, el proceso podría esterilizar por completo las muestras. Por ello en
lo general se recomienda el uso de centrífugas refrigeradas y soluciones alcalinas con
pH controlado. Las siguientes son recomendaciones generales estimar la fuerza
gravitacional a emplear y la preparar las soluciones empleadas en la digestión.

1) Prepare alícuotas de 10 mL de NaOH/Citrato de Sodio en condiciones de

esterilidad. Esta solución deberá mantener pH cercano a 6.8; esto se logra con la
preparación mediante la siguiente tabla:

Tabla 6.1. Preparación de solución decontaminante/digestiva NALC-NaOH

Volumen de solución NaOH 4%* (mL) Citrato de sodio NALC

a preparar (mL) 2H2O 2.9%** (mL)
50 25 25 0.25
100 50 50 0.50
200 100 100 1.00
500 250 250 2.50

* Agregue 4.0 g de NaOH a 100 mL de agua destilada

** Agregue 2.9 gr de citrato de sodio dihidratado (o 2.6 g de citrato de sodio anhidro) a 100 mL de agua
destilada.

2) Estime la fuerza gravitacional de su centrífuga para alcanzar 3000g durante 25

a 30 min, habitualmente 2000 rpm (o el máximo de rpm de su centrífuga). La
temperatura a fijar en la centrífuga deberá ser entre 4 y 6 oC. Para el cálculo de la
fuerza centrífuga relativa (RCF) es aplicable la siguiente fórmula:
 En donde R max es el radio máximo de los cabezales de la centrífuga en
milímetros y rpm el número de revoluciones por minuto. El resultado obtenido será en
unidades gravitacionales g. Para estimar el número de rpm para generar una fuerza
gravitacional dada la fórmula quedaría como sigue:

A falta de una centrífuga refrigerada deberemos considerar que el tiempo no

deberá exceder a 15 minutos dado que la temperatura de la preparación se verá
incrementada por efecto de la fricción. El incrementar el número de rotaciones por
minuto y aplicar tiempos menores podrá tener tan buenos efectos como aquellos
conseguidos con centrífugas refrigeradas. Recuerde siempre que tanto los tubos
utilizados como la centrífuga deberán ser capaces de contener los aerosoles
potencialmente infectantes. Idealmente los tubos a utilizar deberán estar diseñados con
capacidad alta (50 mL) que toleran altas fuerzas gravitacionales, éstos suelen ser
plásticos de fondo cónico y tapón de rosca.

Otras soluciones que se pueden utilizar para la digestión/descontaminación

serían el Z-TSP, hidróxido de sodio de Petroff, ácido oxálico o bien ácido sulfúrico. Sin
embargo, en nuestra experiencia, es más controlable y económico efectuar los
procedimientos antes mencionados.

6.5. Siembra

El diagnóstico definitivo de las enfermedades causadas por micobacterias es su

recuperación en cultivo y su identificación. Comúnmente se utiliza el medio de
Lowenstein-Jensen (LJ), medio que contiene básicamente huevo y verde de malaquita.
Estos medios tiene como ventaja el hecho de que pueden ser almacenados por
tiempos prolongados sin deterioro por la pérdida de humedad y en lo general son más
accesibles comercialmente. Como desventajas mencionaremos la dificultad para
prepararlos y que, de sufrir contaminación, la superficie completa será cubierta por
otros gérmenes.

Existen medios líquidos y otros sólidos como el Middlebrook que contiene una
base de agar. Las ventajas de estos radican básicamente en la facilidad para observar
el desarrollo de las colonias toda vez que se trata de medios transparentes. Las
desventajas radican en su labilidad a la desecación y que, si se exponen de manera
prolongada a la luz se generarían gases de formaldehido suficientes para inhibir el
desarrollo de las micobacterias. Además, la preparación y limitado acceso en el
mercado podrían generarle dificultades.

Las muestras a manejar podrán ser inoculadas directamente, unas cuantas

gotas distribuidas homogéneamente en la superficie del medio serán suficientes.
Después de unos minutos será absorbida por el medio y la muestra aparecerá
escasamente sobre la superficie. Si utiliza los tubos de LJ, manténgalos en posición
ligeramente inclinada en una jarra con atmósfera rica en CO2 (5% CO2 / 95% aire
ambiental; que se consigue mediante la extinción de una vela). Asegúrese de que el
tapón de rosca quede un poco abierto a fin de que la atmósfera de la jarra sea
compartida con aquella de los tubos.

Revise la superficie de los medios incubados cada semana de manera visual y

prepare frotis para búsqueda de BAAR. Al término de 10 a 12 semanas podrá emitir los
informes de negatividad. Cada semana envíe reportes preliminares.

En caso de obtener aislamientos de BAAR informe tales como Mycobacterium

sp. y busque completar identificación y drogoresistencia a través de los laboratorios de
referencia de particulares o de la Secretaría de Salud.

6.6. Digestión para cultivo de micobacterias.

6.6.1. Expectoración y lavado gástrico.

1. Ponga 10 mL de la expectoración en el tubo de plástico 50mL. Si el volumen

es menor de 10 mL, complete con agua estéril.

2. Agregue 10 mL de NaOH/Citrato de sodio estéril (hasta la marca de 20 mL).

3. Agregue una pizca de acetilcisteína

4. Deje actuar por 15 minutos exactos, mezcle de tiempo en tiempo por inversión
pero no agite intensamente.

5. Agregue agua estéril hasta la marca de 50 mL.

6. Centrifugue por 25 minutos en centrífuga refrigerada, velocidad máxima.

Espere a que la centrífuga pare sola, no use el freno.

7. Tire el sobrenadante en recipiente con antiséptico.

8. Agregue 1.5 mL de solución salina estéril.

9. Siembre aproximadamente 100 a 200 microlitros en L-J utilizando una jeringa

de insulina. Incube en C02

10. Haga un frotis del precipitado y tiña con BAAR.

11. Envíe el tubo a esterilización.


6.1.2. Muestras de orina.

1. Tome muestra con técnica de urocultivo.

2. En tubo estéril de 50 ml centrifugue 20 a 50 mL por 20 minutos.

3. Deseche el sobrenadante y complete hasta 10 mL con agua estéril

4. Agregue 10 mL de NaOH/Citrato de sodio estéril (hasta la marca de 20

mL).

5. Deje actuar por 15 minutos exactos, mezcle de tiempo en tiempo por

inversión pero no agite intensamente.

6. Siga el procedimiento de expectoraciones a partir del paso 5.

6.1.3. Biopsias.

1. Recorte pequeños trozos y muela en mortero estéril con un poco de

solución salina.

2. Coloque el macerado en un tubo y agregue el mismo volumen de NaOH/

Citrato de sodio

3. Espere 15 minutos y agregue agua 1:1.

4. Si la biopsia está en el fondo no requiere centrifugar. Si se suspendió,

centrifugue por 10 minutos.

5. Tire el sobrenadante y agregue 1 mL de solución salina.

6. Siembre como en expectoraciones.

6.1.4. Sangre.

1. Solicite muestra en tubo de lisis-centrifugación de adulto, centrifugue y

siembre directamente micobacterias y hongos.
6.1.5. Medula ósea.

1. Solicite muestra en tubo de lisis-centrifugación de niño (Isolator 1.5).

Siembre directamente.

6.7 Bibliografía
1. Baron EJ, Miller JM, Weinstein MP, Richter SS, Gilligan PH, Thomson RB, Bourdeau P,
Carroll KC, Kehl SC, Dunne WM, Robinson-Dunn B, Schwartzman JD, Chapin KC, Snyder
JW, Forbes BA, Patel R, Rosenblatt JE, Pritt BS. A guide to utilization of the microbiology
laboratory for diagnosis of infectious diseases: 2013 recommendations by the Infectious
Diseases Society of America (IDSA) and the American Society for Microbiology (ASM). Clin
Infect Dis 2013;57(4):e22-e121.

2. Machado D, Ramos J, Couto I, Cadir N, Narciso I, Coelho E, Viegas S, Viveiros M.

Assessment of the BD MGIT TBc Identification Test for the detection of Mycobacterium
Complex in a network of mycobacteriology laboratories. Biomed Res Int 2014;2014:398108.

3. Parsons LM, Somoskövi A, Gutierrez C, Lee E, Paramasivan CN, Abimiku A, Spector S,

Roscigno G, Nkengasong J. Laboratory diagnosis of tuberculosis in resource-poor countries:
challenges and opportunities. Clin Microbiol Rev 2011;24(2):314-350.

4. Public Health Mycobacteriology. A guide for the level III laboratory. Kent BT, Kubica GP. CDC
Atlanta GA 1985.
Parte 7. ESTUDIOS PARA ANAEROBIOS EN LABORATORIOS
GENERALES

7.1. Generalidades

La inexperiencia del personal de muchos laboratorios, el tiempo y costos de los

procesos, los requerimientos para la toma y transporte de la muestra, aunados a las
dificultades para obtener la especiación y sensibilidad a antibióticos, han hecho que se
subestime la importancia de los anaerobios en la clínica. Como se verá en este
capítulo, estas dificultades no deben ser obstáculo para que cualquier laboratorio
estudie e informe racionalmente la presencia de anaerobios, ya que un abordaje que no
pierda de vista la clínica podrá vencer fácilmente muchos de esos problemas.

Para fines clínicos, se consideran como anaerobios sólo los anaerobios estrictos,
pues si bien muchos gérmenes aerobios son anaerobios facultativos (principalmente
las enterobacterias y los cocos grampositivos), las infecciones que causan estos
gérmenes son diferentes a las de aquéllos. Los anaerobios son los microorganismos
colonizadores más comunes del cuerpo; en algunos sitios llegan a superar a los
aerobios en proporción de 1000:1. En cada reservorio, las especies de anaerobios
predominantes son diferentes.

Las infecciones por anaerobios son característicamente mezclas polimicrobianas

de microorganismos aerobios y anaerobios de la flora normal, lo que permite que los
primeros consuman el oxígeno y los segundos se aprovechen de esta circunstancia, en
un sinergismo característico. De hecho, los anaerobios se pueden considerar como
oportunistas; generalmente son causa de infecciones endógenas que se producen al
romperse barreras mucosas o cutáneas por necrosis, tumores, trauma, diabetes, etc.
Cuando la barrera se rompe, los anaerobios se diseminan y colonizan tejidos
adyacentes normalmente estériles. Por fortuna, los tejidos tienen un alto potencial de
óxido-reducción, lo que inactiva rápidamente a los anaerobios. Las infecciones
anaerobias monomicrobianas son relativamente raras y comúnmente privativas de
gangrena gaseosa, tétanos (clostridios), actinomicosis y colitis por Clostridium difficile.
Así pues, debe sospecharse la presencia de anaerobios cuando la coloración de Gram
del espécimen muestre flora polimicrobiana. Clínicamente, se sospecha que una
infección incluye anaerobios si existe olor fétido o producción de gas, la infección
aparece cerca de superficies mucosas o tejido muerto, o si se obtiene un cultivo
convencional negativo de una área claramente infectada, en cuyo caso la coloración de
Gram mostró la mencionada flora polimicrobiana.
 7.2. Toma de la muestra

Para demostrar una infección por anaerobios deben utilizarse técnicas especiales
para la recolección, transporte y proceso de la muestra. Para la recolección es de vital
importancia evitar la contaminación con la flora adyacente, por lo que el método
preferido es la punción con jeringa de un material contenido en espacio cerrado,
expulsando el aire de la jeringa y vaciándolo en medio de transporte especial. Muchos
médicos desconocen estos sencillos procedimientos y vacían muestras adecuadas de
la jeringa a tubos ventilados, destruyendo los anaerobios. Por ello, cuando no se
dispone de medio de transporte especial para anaerobios (lo cual es muy común en
laboratorios generales) debe transportarse de inmediato la jeringa al laboratorio pues el
propio material purulento es un medio de transporte adecuado. (Sin embargo, por
cuestiones de seguridad, algunos laboratorios tienen por norma no recibir muestras en
jeringa).

Es importante no sembrar muestras inadecuadas para evitar gastos innecesarios

y dar información que desoriente. En nuestro laboratorio sembramos rutinariamente
para anaerobios sólo las siguientes muestras:

• Secreciones aspiradas con jeringa.

• Biopsias.

• Aspirados transtraqueales o transparietales (pared torácica).

• Gránulos sulfurosos de pacientes con sospecha de actinomicosis.

Sólo cuando el clínico lo considera necesario, se siembran los cultivos de sangre.

Otros líquidos corporales se siembran para anaerobios sólo cuando son purulentos.

Antes de continuar con los métodos para obtener la atmósfera anaerobia

debemos recordar que todo cultivo de anaerobios debe precederse de una coloración
de Gram, pues la sola presencia de flora polimicrobiana sugiere su existencia.

7.3. Métodos para el estudio de anaerobios

Es común que se crea que una atmósfera anaerobia es sólo la falta de oxígeno,
pero esto es un error, pues se requiere además de un bajo potencial de óxido-
reducción. Históricamente, los anaerobios se estudiaron primero en medios líquidos a
los que se les agregaban sustancias reductoras, como el tioglicolato o la carne molida.
Sin embargo, los medios líquidos no permiten la observación y discriminación de las
colonias que es posible en medios sólidos en caja de Petri. Por ello, actualmente se
prefiere la siembra en atmósfera anaerobia que permite sembrar medios sólidos
además de los medios líquidos de respaldo.

De todos los métodos empleados para obtener la atmósfera anaerobia el de uso

más común en laboratorios generales es, sin duda, la jarra de anaerobios en la que se
colocan sobres generadores de gas y un catalizador. Nosotros lo recomendamos
también porque es de bajo costo, fácil operación y poco requerimiento de espacio.

7.4. Medios para la siembra

Se dispone en el comercio de muchos medios para el desarrollo de anaerobios,

como el agar sangre enriquecido con vitamina K, pero en nuestro laboratorio
sembramos las muestras en agar sangre convencional, agar feniletilalcohol (inhibe el
desarrollo de gramnegativos aerobios) y en caldo de tioglicolato. Es una buena
alternativa siempre y cuando se encuentren previamente reducidos en anaerobiosis.
Por ello, cuando llega una muestra y los medios no están preparados, es preferible
primero prerreducirlos por una hora en la jarra de anaerobios, pues si se toman
directamente del refrigerador estarán oxigenados y pueden causar la muerte de los
anaerobios de la muestra.

Una vez sembrada la muestra en los medios prerreducidos, se cierra la jarra y se

espera entre 48 y 72 horas antes de observar el crecimiento. Siempre que se efectúa
un cultivo de anaerobios debe hacerse también la siembra en aerobiosis y en jarra con
vela, pues esto sirve de control para descartar la existencia de aerobios o gérmenes
exigentes de CO2.

7.5. Interpretación de los cultivos

Al interpretar los cultivos, debe poderse responder inicialmente la pregunta:

¿Existen anaerobios en la muestra? La respuesta será afirmativa cuando haya
desarrollo en anaerobiosis, pero no en aerobiosis, o bien, cuando en anaerobiosis
desarrollan gérmenes distintos a los que aparecen en aerobiosis. Esta situación existe,
por ejemplo, cuando en anaerobiosis hay desarrollo de gramnegativos que no
aparecieron en el MacConkey. La prueba definitiva para asegurar que un germen es
anaerobio se obtendrá al resembrar la colonia en aerobiosis y en CO2, observando la
ausencia de desarrollo. Desde luego la sola presencia de flora polimicrobiana en las
tinciones permite sospechar anaerobios con anticipación y enviar un informe preliminar.

Conocer la existencia o ausencia de anaerobios resulta de gran utilidad para el

clínico, ya que su presencia generalmente indica la necesidad de retirar tejido muerto o
de drenar colecciones purulentas. Adicionalmente, habrán de agregarse antibióticos
eficaces contra estos gérmenes.
 7.6. Informe de anaerobios y sensibilidad a antimicrobianos

Identificar con precisión un anaerobio e informar su patrón de sensibilidad no es

tarea fácil y generalmente se reserva para laboratorios especializados. El tiempo y
costo de los procedimientos limita su utilidad clínica pues los resultados se informan
generalmente una semana después de obtenida la muestra. Esto causa desilusión en
algunos laboratorios que deciden olvidarse de los anaerobios. Conviene entonces abrir
un paréntesis para hablar de la utilidad clínica de los resultados de cualquier
laboratorio. EL SOLO INFORME DE QUE LA MUESTRA CONTIENE ANAEROBIOS
SUELE RESOLVER EL PROBLEMA DIAGNOSTICO. De este modo, casi nunca se
requiere de una identificación fina si consideramos que se conoce la bacteriología usual
de los diferentes tipos de infecciones causadas por anaerobios y que los patrones de
sensibilidad antimicrobiana están convencionalmente aceptados de acuerdo con la
experiencia de laboratorios especializados y, sobre todo, con la experiencia clínica.
Además, no existe una razón epidemiológica para la identificación pues las infecciones
por anaerobios son predominantemente endógenas. El clínico puede elegir fácilmente
el antibiótico adecuado, toda vez que el laboratorio haya informado la presencia de
anaerobios y sus características en la coloración de Gram, de acuerdo con
conocimientos convencionales de sensibilidad, como lo muestra la tabla siguiente.

Tabla 7.1. Sensibilidad de bacterias anaerobias

Antibiótico Todos los ANE B. fragilis

Penicilina ++ -
Tetraciclina ++ -
Cloramfenicol ++ ++
Clindamicina ++ ++
Metronidazol - ++

ANE: anaerobios no esporógenos.

Como puede verse, el clínico requiere saber, además de la presencia de

anaerobios, si alguno de ellos sugiere ser B. fragilis, puesto que, con excepción de este
germen, los anerobios suelen ser sensibles a penicilina y tetraciclina. Es por ello que el
informe definitivo es algo como lo siguiente:

"El cultivo desarrolló anaerobios estrictos, que incluyen Bacteroides. Se

recomienda utilizar clindamicina o metronidazol"
 7.6. Conclusiones

• De acuerdo con lo anterior, se pueden proponer algunas conclusiones

importantes para el clínico y el laboratorio:

• Cualquier laboratorio clínico debe estar capacitado para ayudar al médico en el

estudio de infecciones por anaerobios.

• Para el estudio de anaerobios no es indispensable contar con instalaciones o

personal especializados. Lo substancial puede resolverse con equipo de costo
bajo y, sobre todo, con la comunicación con el clínico.

• Toda vez que puede establecerse la presencia de anaerobios y sus

características en la coloración de Gram, el problema diagnóstico suele estar
resuelto para los fines clínicos.

• También para los fines clínicos, generalmente no es necesario utilizar los

servicios de laboratorios especializados para establecer especie y patrón de
sensibilidad antimicrobiana de los anaerobios.

7.7. Bibliografía
1. Baron EJ, Miller JM, Weinstein MP, Richter SS, Gilligan PH, Thomson RB, Bourdeau P,
Carroll KC, Kehl SC, Dunne WM, Robinson-Dunn B, Schwartzman JD, Chapin KC, Snyder
JW, Forbes BA, Patel R, Rosenblatt JE, Pritt BS. A guide to utilization of the microbiology
laboratory for diagnosis of infectious diseases: 2013 recommendations by the Infectious
Diseases Society of America (IDSA) and the American Society for Microbiology (ASM). Clin
Infect Dis 2013;57(4):e22-e121.

2. Burnham CAD, Carrollo KC. Diagnosis of Clostridium difficile infection: an ongoing

conundrum for clinicians and for clinical laboratories. Clin Microbiol Rev 2013;26(3):604-630.

3. Bartlett JG, Sullivan-Sigler N, Louie TJ, Gorbach S. Anaerobes survive in clinical specimens
despite delayed processing. J Clin Microbiol 1976;3:133-37.

4. Macías Hernández AE, Hernández Ramos I, Medina Valdovinos H. Anaerobios en

laboratorios de recursos limitados: Sugerencias para optimizar su estudio. Enf Infec
Microbiol 1992;12:239-45.

5. Swenson RM, Lorber B. Speciation of anaerobic bacteria: A clinically based rationale. In:
Lorian V (Ed.). Significance of Medical Microbiology in the Care of Patients. The Williams
and Wilkins Co, Baltimore, 1977:104-114.
Parte 8. ESPECTRO Y DOSIS DE ANTIBIÓTICOS DE USO COMÚN

El descubrimiento y uso de antibióticos fue una revolución pues dio nacimiento a la

terapia médica curativa; sin embargo, su uso adecuado requiere de buena información y
criterio clínico pues se inducen resistencias y complicaciones con facilidad.

Cuando se describe el espectro de acción de un antibiótico, se refiere a que una

especie determinada puede ser sensible a ese antibiótico, pero debe considerarse que no
siempre es así. Por ejemplo, sabemos que Klebsiella pneumoniae se encuentra dentro
del espectro de la cefalotina, pero ya no es común que este antibiótico sea eficaz contra
esta especie cuando se le aísla de una infección hospitalaria; sin embargo, el
antibiograma deberá incluirlo en todo caso. Por otra parte, sabemos que Pseudomonas
aeruginosa no es parte del espectro antimicrobiano de la ampicilina, por lo que siempre
será un disparate un informe que indique sensibilidad en este caso. De hecho, es un
despropósito incluir ampicilina en el panel de sensibilidad de P. aeruginosa, dado que
siempre se presume resistente. Esta consideración avala la importancia de conocer el
espectro de acción de los antibióticos, cuya descripción es el objetivo fundamental de esta
sección. Las dosis anotadas presuponen su aplicación para adultos con peso promedio
de 70 k y función renal normal, en infecciones comunes, generalmente por vía oral (VO),
intravenosa (IV) o intramuscular (IM); no intente memorizarlas. Las dosis pediátricas
deben calcularse en cada caso, de acuerdo con el peso o superficie corporal. Las dosis
anotadas para la vía IV suponen pacientes hospitalizados con infecciones serias. Se
señalan los nombres comerciales más comunes sólo para fines de consulta.

8.1. Antibióticos betalactámicos.

Su nombre deriva de la existencia de un anillo betalactámico en su estructura.

Estos incluyen las penicilinas, las cefalosporinas, los carbapenemes y los
monobactámicos. Las penicilinas constituyen un grupo de agentes antibacterianos muy
útiles debido a su eficacia y baja toxicidad.

Penicilinas. Bencilpenicilinas o penicilinas propiamente dichas:

• Penicilina G (Megapenil®), 10 millones IV por día

• Penicilina procaina (Penprocilina®), 800,000 U IM c12h

• Penicilina V (Pen V K®), 500 mg VO c6h

 • Penicilina benzatina (Benzetacil®), 1.2 millones IM

Activas contra cocos y bacilos grampositivos y anaerobios (con excepción de

Bacteroides fragilis en las infecciones abdominales). Los neumococos han desarrollado
altos niveles de resistencia a las penicilinas, por lo que ya no son el antibiótico de
elección en infecciones graves como neumonías o meningitis, obligando al uso de
cefalosporinas de tercera generación. Los mismo ha ocurrido con Neisseria
gonorrhoeae, que se maneja actualmente con tetraciclinas. Siguen siendo el manejo de
elección para la faringitis purulenta y la sífilis, así como la listeriosis.

Aminopenicilinas

• Ampicilina (Binotal®, Pentrexil®), 500 mg VO c6h, 1g IV c6h

• Amoxicilina (Amoxil®), 500 mg VO c8h, 500 mg IV c8h

• Clavulanato + Amoxicilina (Augmentin®), 500 mg (amox) VO c8h, 1g IV c8h

• Sulbactam + Ampicilina (Unasyna®), 1 g (ampi) IV c6h

Además de que poseen todo el espectro de las bencilpenicilinas, tienen acción

contra Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Proteus mirabilis y Haemophilus
influenzae. Ya no se les utiliza como primera elección contra Haemophilus, pues la
resistencia es muy común, por lo que no debe usárseles en el manejo de la otitis media
o la neumonía del lactante. Se han vuelto poco útiles para infecciones urinarias pues en
muchos países, como México, la resistencia de E. coli a la ampicilina supera al 70%,
por lo que se han substituido por antisépticos como nitrofurantoína o fosfomicina, o bien
cefalosporinas orales como el ceftibutén.

El clavulanato y el sulbactam tienen, por sí mismos, escaso poder antibiótico,

pero funcionan como “suicidas” al inhibirse irreversiblemente con las betalactamasas,
por lo que la ampicilina y amoxicilina retoman su acción contra H. influenzae,
Staphylococcus aureus, E. coli o B. fragilis, cuando la resistencia está mediada por
betalactamasas.

Penicilinas Resistentes a Penicilinasas

• Dicloxacilina (Posipen®), 500 mg VO c6h, 1 g IV c6h

Se utilizan cuando se sospecha S. aureus, dado que es generalmente resistente

a la penicilina. Tiene también acción contra cocos grampositivos (como estreptococos
aerobios y anaerobios) pero en acción menor que las bencilpenicilinas. Las penicilinas
resistentes a penicilinazas se utilizan mucho para infecciones de piel y tejidos blandos,
así como en manejos combinados con aminoglucósidos o quinolonas en pacientes
hospitalizados (para cubrir también gramnegativos). Por desgracia, el estafilococo
resistente a meticilina (SARM) supera ya con mucho a las cepas sensibles en los
hospitales y el fenómeno aumenta en la comunidad, lo que ha obligado al mayor uso de
la vancomicina y el linezolid.

• Penicilinas Contra Pseudomonas

• Ticarcilina + Clavulanato (Timentin®), 3 g IV c8h

• Piperacilina + Tazobactam (Tazocin®), 4 g de piperacilina IV c8h

De su nombre se deduce su acción; cubren también el espectro de la ampicilina.

Desafortunadamente, una gran proporción de las cepas hospitalarias de Pseudomonas
son ya resistentes a ellas, por lo que han sido desplazadas por las cefalosporinas o los
carbapenémicos. Es por lo anterior que estas penicilinas se usan ya sólo en
combinación con inhibidores de betalactamasas tales como tazobactam o clavulanato,
como lo que retoman su actividad contra Pseudomonas y enterobacterias en los
hospitales.

Cefalosporinas

Las cefalosporinas se dividen en primera, segunda, tercera, cuarta y quinta

generaciones, designación relativa a su espectro antibacteriano y cronología de
aparición.

1. Primera generación

• Cefalotina (Keflin®), 1 g IV c6h

• Cefalexina (Keflex®), 500 mg VO c6h

• Cefadroxilo (Duracef®), 1 g VO c24h

Tienen acción contra cocos grampositivos, incluyendo S. aureus, pero no cocos

anaerobios (peptoestreptococo), ni enterococo. De los gramnegativos, cubren sólo E.
coli, Klebsiella sp. y Proteus mirabilis (PEK). Las cefalosporinas de primera generación
se utilizaban comúnmente para infecciones urinarias e infecciones de la piel, pero los
altos niveles de resistencias de E. coli y S. aureus las han vuelto poco eficaces. En los
hospitales, se les utiliza aún como profilaxis en cirugía como dosis única.

2. Segunda generación

• Cefaclor (Ceclor®), 250-500 mg VO c8h

 • Cefuroxima (Zinnat®), 250-500 mg VO c12h, 750 mg IV c8h

Las cefalosporinas de segunda generación tienen acción semejante a las de

primera, más Haemophilus, Enterobacter y Neisseria (HENPEK). Existen algunas,
como la cefoxitina, con excelente acción contra anaerobios, pero no están disponibles
en México. Además de las indicaciones de las cefalosporinas de primera generación,
se les utiliza para infecciones respiratorias y otitis en lactantes. En neumonía, se les
utiliza ya poco pues se prefiere a las de tercera generación.

3. Tercera generación

• Cefotaxima (Claforan®), 1-2 g IV c8h

• Ceftriaxona (Rocephin®), 1-2 g IV/IM c24h

• Ceftazidima (Fortum®), 1-2 g IV c8h

• Ceftibutén (Cedax®), 400 mg VO c24h

A la cobertura de las de primera y segunda generaciones, se agregan los

gramnegativos y algunos anaerobios (excluyendo B. fragilis de las sepsis
abdominales). Las cefalosporinas de tercera generación tienen buena acción contra
neumococo y Haemophilus, por lo que se les utiliza ampliamente en el manejo de la
neumonías y meningitis extrahospitalarias; conviene aclarar que no son una buena
elección cuando se requiere cubrir S. aureus. Estos antibióticos ocasionan un gran
vacío ecológico, que en ocasiones resulta en infecciones agregadas por Candida,
enterococo o gramnegativos resistentes (Enterobacter, Acinetobacter y Pseudomonas),
principalmente cuando se les utiliza en hospitales. También se asocian con colitis y
diarrea por Clostridium difficile, que se ha vuelto epidémico en muchos hospitales. La
ceftazidima supone acción contra P. aeruginosa y enterobacterias multirresistentes, por
lo que se le utilizaba frecuentemente en infecciones hospitalarias. Desgraciadamente,
en este siglo las cefalosporinas de tercera generación se han vuelto de uso limitado en
los hospitales debido al desarrollo de BLEE (beta lactamasas de espectro extendido)
por la enterobacterias.

El ceftibutén se encuentra disponible por vía oral y se absorbe casi al 100%, por
lo que se usa mucho para infecciones urinarias comunitarias cuando hay resistencia a
las drogas comunes. Su acción no es buena contra neumococo, por lo que no se
recomienda en el manejo de infecciones respiratorias o del sistema nervioso.

Cuarta Generación

• Cefepima (Maxipime®), 600 mg IV c12h

 Las cefalosporinas de cuarta generación agregaron una mejor cobertura contra
S. aureus que las de tercera generación, pero como un son activas contra SARM, su
uso ha sido limitado. Suponen también mejor acción contra Pseudomonas y
Enterobacter, pero también se desarrollaron pronto resistencias en la terapia de
infecciones hospitalarias.

Quinta Generación

• Ceftarolina (Zinforo®), 1-2 g IV c12h

Esta nueva cefalosporina tiene un espectro enfocado a los grampositivos,

incluyendo a SARM. En estudios clínicos ha mostrado que no es inferior a la
vancomicina para manejo de neumonía e infección de tejidos blandos de la comunidad.
No tiene buena acción contra P. aeurignosa, Acinetobacter sp., ni enterobacterias
productoras de BLEE.

Carbapenémicos

• Imipenem (Tienam®), 500 mg IV c 6h

• Meropenem (Merrem®) 1g IV c 12h

• Ertapenem (Invanz®) 1g IV/I M c 24h

Estos compuestos son lo que más se asemeja a un antibiótico "total". Tienen

acción contra casi todos los grampositivos y gramnegativos, aerobios y anaerobios, con
la notable excepción de Stenotrophomonas maltophilia y SARM. Son también notorios
por su alto costo. Deben reservarse para el manejo de cepas resistentes de
enterobacterias, Acinetobacter y P. aeruginosa en hospitalizados. Ertapenem se usa
contra enterobacterias pues carece de efecto contra Pseudomonas y Acinetobacter.
Los carbapenemes se utilizan poco en pacientes ambulatorios.

Por desgracia, después de 2010 han aparecido resistencias a los

carbapenémicos por P. aeruginosa, A. baumanii y enterobacterias “KPC”. Eso ha
obligado a rescatar la colistina, antibiótico que se había abandonado por su
nefrotoxicidad.

Monobactámicos

• Aztreonam (Monobac®), 1-2 g IV c8h

Este antibiótico tiene un espectro muy reducido, y cubre sólo los bacilos
gramnegativos, con un espectro muy semejante a los aminoglucósidos. Tiene por
ventaja que se puede dosificar como una penicilina, sin el riesgo de la toxicidad de
aquéllos. Se utiliza con rareza en la actualidad.

8.2. Aminoglucósidos

• Estreptomicina, 1g IM c24h

• Kanamicina (Kantrex®), 15 mg/kg IM c24h

• Gentamicina (Garamicina®), 5 mg/kg IM/IV c24h

• Amikacina (Amikin®), 10-15 mg/kg IM/IV c24h

• Netilmicina (Netromicina®), 6 mg/kg IM/IV c24h

Los aminoglucósidos tienen un espectro muy restringido a los bacilos

gramnegativos aerobios (Pseudomonas, enterobacterias). De los grampositivos, cubren
discretamente a los estafilococos y estreptococos cuando se usan en combinación con
betalactámicos. Como no afectan a los anaerobios, no ocasionan grandes vacíos
ecológicos, ni se acompañan comúnmente de infecciones agregadas.
Desgraciadamente, todos pueden desencadenar intoxicación renal u ótica cuando se
les dosifica sin cuidado. Actualmente, la estreptomicina se reserva sólo para la
tuberculosis y la brucelosis. La kanamicina ya no debe utilizarse pues es muy tóxica e
induce fácilmente resistencias. Del resto, se prefiere la amikacina pues induce menos
cepas resistentes. Se les usa para esquemas cortos contra infecciones urinarias en la
comunidad. En los hospitales, los aminoglucósidos se usaban extensamente por su
acción contra enterobacterias, Pseudomonas y Acinetobacter, pero por desgracia la
resistencia a cefalosporinas suele acompañarse actualmente a la de los
aminoglucósidos, lo que ha limitado su uso.

8.3. Tetraciclinas

• Tetraciclina clorhidrato (Tetrex®), 250 mg VO c6h

• Minociclina (Minocin®), 100 mg VO c12h

• Doxiciclina (Vibramicina®), 100 mg VO c12h

El espectro de todas las tetraciclinas es muy semejante. Antiguamente se

usaban para infecciones por cocos grampositivos (incluyendo anaerobios) y E. coli,
aunque las resistencias las han hecho inútiles para ello. Actualmente se les usa más
bien por su acción contra gonococo y Chlamydia, por lo que son excelente opción en la
uretritis, cervicitis y enfermedad pélvia inflamatoria. En combinación con estreptomicina
o rifampicina, se utilizan en la brucelosis. Son activas también contra las espiroquetas o
algunos gérmenes intracelulares como ricketsias, por lo que se usan en el tifo y la
fiebre Q. En la actualidad, la tetraciclina más usada es, con mucho, la doxiciclina pues
carece de la toxicidad ótica de la minociclina y tiene una larga vida media.

8.4. Anfenicoles

• Cloranfenicol (Chloromycetin®, Quemicetina®), 500 mg VO/IV c8h

El cloranfenicol es activo contra muchas bacterias, incluyendo espiroquetas,

ricketsias, clamidias, micoplasmas, neisseirias y pneumococo. Sin embargo, se usaba
principalmente en infecciones graves por Salmonella typhi o por H. influenzae que son
poco comunes ahora. También es un antibiótico con buena acción en casi todas las
infecciones por anaerobios, incluyendo las causadas por B. fragilis. Se le relaciona con
depresión reversible de médula ósea (anemia y leucopenia) en relación con la dosis o,
incluso, reacciones idiosincrática de anemia aplástica irreversible (1 por 10,000
pacientes tratados).

8.5. Rifamicinas

• Rifampicina (Rifadin®), 600 mg VO c24h

Es activa contra casi todos los cocos grampositivos, incluyendo S. aureus (no
SARM). De los gramnegativos incluye a las neisserias y H. influenzae. Sin duda, la
mayor utilidad de la rifampicina deriva de su acción contra micobacterias, lo que mejoró
el manejo y pronóstico de la tuberculosis. De hecho, el pronóstico de un paciente
tuberculoso es pobre cuando su cepa es resistente a la rifampicina, lo cual empieza a
ser un hecho cada vez más común en el mundo, a consecuencia de tratamientos
incompletos que inducen la resistencia. Dada la carencia de antifímicos, debemos
procurar usar este antibiótico lo menos posible para otras indicaciones.

8.6. Nitroimidazoles

• Metronidazol (Flagyl®), 500 mg VO/IV c8h

El metronidazol es un antibiótico muy potente contra los anaerobios

gramnegativos, incluyendo B. fragilis de las sepsis abdominales, aunque es poco activo
contra los grampositivos por lo que suele asociarse a la penicilina, pues casi todas las
infecciones por anaerobios son polimicrobianas. Se le utiliza aún más por su acción
antiparasitaria en amibiasis, giardiasis y trichomoniasis. Su administración
frecuentemente produce estado nauseoso y sabor metálico en la boca. Es bien
conocido que produce fenómeno antabús (reacciones graves al ingerir alcohol).
 8.7. Nitrofuranos

• Nitrofurantoina (Macrodantina®), 50 a 100 mg VO c6h

Los nitrofuranos orales se deben usar exclusivamente para infecciones urinarias

y tienen buena acción contra la mayoría de los patógenos, con exclusión de
Pseudomonas y Proteus spp. Se absorben bien por vía oral y han mantenido buena
actividad incluso en regiones donde las resistencias a los antibióticos se han
diseminado en la comunidad.

8.8. Macrólidos

• Eritromicina (PantomicinaR), 500 mg VO c12h

• Claritromicina (KlaricidR), 250-500 mg VO c12h

• Azitromicina (Azitrocin®), 250-500 mg VO c24h

La eritromicina tiene acción contra cocos grampositivos, aunque S. aureus es

generalmente resistente en la actualidad. Se le utiliza más por su acción contra
neumococo, Chlamydia, Legionella y Mycoplasma. La claritromicina tiene un espectro
semejante a la eritromicina, pero con ventajas pues provoca menos irritación gástrica y
tiene mayor vida media. La azitromicina tiene una prolongada vida media por lo que se
utiliza para manejos de dosis única en infecciones por Chlamydia, gonococo o
Estreptococcus pyogenes.

8.9. Lincosamidas

• Clindamicina (Dalacin C®), 300 mg VO/IV c8h

• Lincomicina (Lincocin®), 500 mg VO c8h, 900 mg IV c8h

La clindamicina y lincomicina tienen también buena acción contra cocos

grampositivos (incluyendo S. aureus), aunque el uso de la segunda es poco
recomendable en la actualidad. La clindamicina se utiliza ampliamente por su acción
contra casi todos los anaerobios (incluyendo B. fragilis).

Desgraciadamente, no cubre Clostridium difficile, agente que prolifera cuando se

usa este antibiótico y conduce frecuentemente a colitis pseudomembranosa, que se
manifiesta inicialmente como diarrea mucosa o sanguinolenta, principalmente en
hospitalizados. Se le utiliza también con frecuencia en infecciones de la piel y la
faringitis estreptocóccica, principalmente en personas alérgicas a los betalactámicos.
La clindamicina se utiliza mucho en odontología para las infecciones dentales y
peribucales.
 8.10. Glucopéptidos

• Vancomicina (Vancocin®), 1g IV c12h

• Teicoplanina (Targocid®), 6 mg/kg IV/IM c24h

Son muy activas contra todos los cocos grampositivos, incluyendo enterococos.
La vancomicina y teicoplanina se utilizan principalmente en hospitales para infecciones
por SARM pues en ese caso son una de las pocas alternativas disponibles. Casi todas
las infecciones por estafilococo coagulasa negativo son resistentes a oxacilina, por lo
que requieren este manejo. Desdichadamente son costosos y tóxicos, además de que
sólo pueden administrarse por vía parenteral. La vancomicina requiere la vía
intravenosa, la teicoplanina puede administrarse por vía intramuscular. Se han
informado ya cepas de Enterococcus faecium resistente a vancomicina en muchos
hospitales, lo que ha obligado al mayor uso del linezolid.

8.11. Sulfas

• Sulfadiacina

• Trimetoprim-sulfametoxazol (Bactrim®), 160/800 mg VO c12h

Las sulfas son activas contra varios gramnegativos y grampositivos, y alcanzan

altas concentraciones urinarias, por lo que se les utilizó mucho en urosepsis. Sin
embargo, causan resistencia con gran facilidad y sólo se les encuentra actualmente en
asociación con trimetoprim (TMT/SXT), lo que incrementa su acción contra casi todos
los cocos grampositivos y bacilos gramnegativos aerobios y anaerobios (exceptuando
P. aeruginosa y B. fragilis). Uno de los principales efectos indeseables de las sulfas son
las reacciones cutáneas, que pueden ir desde eritema fijo a drogas, hasta reacciones
graves como el eritema polimorfo y el síndrome de Steven-Johnson. Siempre que se
les prescriba debe advertirse al paciente esta posibilidad para que suspenda la
administración de inmediato ante cualquier reacción cutánea. El TMT/SXT se utiliza
para el manejo y profilaxis de Pneumocystis en pacientes inmunosuprimidos. La
sulfadiacina de plata (Silvadene®) se utiliza mucho en quemaduras como antibiótico
tópico.

8.12. Quinolonas de primera generación

• Ciprofloxacina (Ciproxina®), 250-500 mg VO c12h, 200 mg IV c12h

• Norfloxacina (Noroxin®), 400 mg VO c12h

• Lomefloxacina (Maxaquin®), 400 mg VO c24h

 Las quinolonas derivan del ácido nalidíxico (que actualmente ya no se utiliza).
Tienen buena acción contra bacilos y cocos gramnegativos aerobios. No tienen
actividad contra anaerobios ni cocos grampositivos. Como puede verse, su espectro se
parece mucho al de los aminoglucósidos, pero a diferencia de éstos, por vía oral
alcanzan muy buenas concentraciones en sangre (biodisponibilidad superior al 60%).
Cuando aparecieron en el mercado, prometían una revolución en el manejo para
muchos pacientes con infecciones graves por gramnegativos en los hospitales; aunque
se les sigue utilizando para ello, inducen resistencias con relativa facilidad, lo que ha
limitado su uso. La ciprofloxacina sigue siendo la moneda de cambio de las quinolonas
de primera generación, ya que si un germen es resistente a ella, suele ser resistente a
las demás. Las quinolonas de primera generación se utilizan extensamente en el
manejo de infecciones urinarias.

8.13. Nuevas quinolonas

• Levofloxacina (Tavanic®), 500 mg VO/IV c24 h

• Moxifloxacina (Avelox®), 400 mg VO c24h

• Gatifloxacina (Tequin®), 400 mg VO/IV c24h

Además de la acción de las quinolonas de primera generación, las nuevas

quinolonas tienen acción contra cocos grampositivos, neumococo, Legionella,
Haemophilus y algunos anaerobios, por lo que se les puede indicar para infecciones
respiratorias. Tienen también acción contra Chlamydia y gonococo, por lo se pueden
usarse para infecciones genitales. Otra característica de estas quinolonas es su alta
biodisponibilidad oral, pues se absorben casi al 100%, así como su prolongada vida
media, que permite indicarlas en una toma diaria.

8.14. Oxazolidonas

• Linezolid (Zyvoxam®). 200 mg IV o 400 mg VO c12 h

Este antibiótico tiene acción contra cocos grampositivos, incluyendo enterococos

y estafilococos resistentes a la meticilina. De hecho, para enterococos, tiene acción
incluso contra cepas resistentes a la vancomicina. Por ello, en la actualidad se usa
ampliamente en los hospitales.

8.15. Polimixinas

• Colistina (Colmesdant®) 150 mg IV c12h

La colistina (polimixina E) es un viejo antibiótico que se había abandonado por su

neurotoxicidad, pero ha debido ser rescatado por ser efectivo contra todos los bacilos
Gram-negativos. Se usa contra bacterias multidrogo-resistentes como P. aeruginosa, A.
baumanii y Enterobacterias productoras de carbapenemasas (EPC).

8.16 Bibliografía
1. Cosgrove SE, Avdic E, Dzintars K, Smith J. Antibiotic guidelines 2015-2016, treatment
recommendations for adult impatients. Osler, Johns Hopkins Medicina, 2015.

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4. Dellit TH, Owens RC, McGowan JE, Gording DN, Weinstein RA, Burke JP, Huskins C,
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Diseases Society of America and the Society for Healthcare Epidemiology of America
guidelines for developing an institutional program to enhance antimicrobial stewardship. Clin
Infect Dis 2007;44(2):15-177.
Parte 9. EL LABORATORIO EN LAS INFECCIONES NOSOCOMIALES.

9.1. Generalidades

Las infecciones nosocomiales representan un importante problema en todos los

hospitales, ya que afectan entre 5 y 15% de los pacientes internados, se asocian con
prolongación de la estancia hospitalaria y aumentan la mortalidad, los costos de
operación, el uso de antibióticos y procedimientos, y desde luego, el sufrimiento del
paciente. Para contar con un programa de control de infecciones nosocomiales se
requiere un laboratorio de microbiología clínica que apoye al comité de control de
infecciones intrahospitalarias en la realización de diversas actividades, que
describiremos posteriormente. Es indispensable que el laboratorio sea manejado por
personal calificado y sensibilizado para conocer la importancia de su trabajo. La
mayoría de los hospitales en países en desarrollo cuentan con un laboratorio general,
donde el laboratorio de microbiología clínica es sólo una sección manejada por
personal sin contacto con los problemas clínicos y con funciones meramente técnicas.
Con frecuencia en el hospital no existe siquiera una enfermera dedicada a la vigilancia
y control de las infecciones. Por ello, debemos anotar que, para lograr un control de las
infecciones nosocomiales debe lograrse una coordinación entre los clínicos, las
enfermeras y el personal del laboratorio de microbiología, con participan activa dentro
del comité.

Para el comité, la comunicación con el laboratorio permite evaluar los resultados

de los estudios microbiológicos, sugerir el tipo de muestras necesarias para confirmar
infección o simple contaminación, y hacer recomendaciones específicas en el manejo
adecuado de las muestras clínicas. Por su parte, para el clínico representa ventajas
como: promoción de educación del personal médico y de enfermería en el área de
microbiología, y fomento del empleo de métodos de diagnósticos nuevos y económicos.
Finalmente, esta comunicación es un canal por el que se van definiendo los manejos
de las muestras (interés clínico o interés epidemiológico), la identificación y el tipo de
sensibilidad antimicrobiana.

Un ejemplo puede mostrar la importancia de la comunicación: suponga que en un

hospital aparece una epidemia de infecciones de sangre. Inicialmente, el laboratorio
encuentra dos o más hemocultivos para un mismo germen. El personal del laboratorio,
o la enfermera encargada del control, alertan a los clínicos sobre la necesidad de tomar
hemocultivos a todos los pacientes febriles sin foco infeccioso evidente. Al persistir el
aislamiento inusual en hemocultivos, el comité de infecciones establece programas
emergentes de vigilancia y control. Si los hemocultivos sospechosos provienen de una
zona específica del hospital, se buscan allí los factores causales (personal inexperto,
equipos contaminados, relajación de las medidas de control). Si provienen de zonas
diversas (como pediatría y medicina interna), se buscan condiciones generales como
soluciones parenterales contaminadas o contaminación del sistema de agua potable,
etc. Puede observarse que sólo la interrelación puede limitar tempranamente estos
problemas que, de otra forma, terminan sólo con el agotamiento de susceptibles, que
es una forma elegante de llamar al egreso o la muerte de los pacientes en riesgo.
También puede observarse que, en ocasiones, la toma de cultivos tiene un interés de
grupo.

9.2. Participación del laboratorio en el comité de infecciones

El laboratorio, a través de un representante, debe siempre participar en el comité;

quienes establecerán el panel de antibióticos para incluir en las pruebas de sensibilidad
y la definición de muestras adecuadas o inadecuadas, así como el tipo de cultivos a
efectuar. Entre ambos debe evaluarse la carga de trabajo para el laboratorio y la
utilidad de los estudios, así como la gestión de fuentes alternas de recursos para evitar
su cobro a los pacientes o la merma significativa de los recursos del laboratorio en las
instituciones.

9.3. ¿Qué hacer si en su hospital no existe un comité de infecciones?

La respuesta debe ser directa: sugiera de inmediato la instalación de uno, en

el que esté representado cada uno de los servicios, el laboratorio y el representante de
la dirección. Prácticamente nada trascendente puede hacerse de otra manera. Debe
iniciarse por conocer el problema; no es raro que los hospitales que carecen de un
comité informen tasas bajas de infección: es más bien la regla pues, cuando no se les
busca con intención, las infecciones nosocomiales parecen no existir. De hecho,
siempre que se inician las funciones de un comité de infecciones debe advertirse a las
autoridades del hospital que aparecerá información hasta entonces inexistente, que
debe manejarse con discreción y diplomacia para evitar problemas: los hospitales
gubernamentales temen acciones superiores y los privados, alarma entre sus clientes
(¡Esto puede causar que se frustre la integración del comité!). Si trabaja usted en el
laboratorio, sugiéralo a los clínicos más interesados; si se desempeña en la clínica,
coméntelo con el jefe del laboratorio.

Los sistemas de vigilancia que se emplean en cada hospital varían en relación

con el número de camas, el tipo de pacientes y la cobertura que se desea (es decir, si
no se cuenta con personal, vigile al menos las áreas de mayor riesgo, como las
unidades de cuidados intensivos y recién nacidos). Los sistemas más utilizados son los
de visita en el laboratorio, en donde se detectan los cultivos positivos de sangre, orina o
secreciones, dos o tres veces por semana, lo que permite detectar hasta el 80% de las
infecciones nosocomiales, así como problemas de alta contagiosidad, como la hepatitis
B o infecciones por bacterias multirresistentes (como bacilos gramnegativos
productores de BLEE o de carbapenemasas, o estafilococo resistente a meticilina).
Además, esta visita al laboratorio tiene por objeto definir si el microorganismo es
infectante o colonizante, para indicar medidas específicas con oportunidad, y evitar
riesgos de infección en otros pacientes. Por otra parte, una enfermera entrenada en
epidemiología debe visitar las salas de internación, para detectar otras infecciones
mediante entrevistas con el personal o revisión de la curva de temperatura de los
pacientes, anotando en un sistema de tarjetas.

Es necesaria la jerarquización de los procedimientos y estudios que se realizarán

para la detección o seguimiento de un problema epidémico o endémico porque, con
relativa frecuencia, se solicitan al laboratorio diversos estudios como la toma de cultivos
faríngeos, nasales o cutáneos al personal, muestreos bacteriológicos de materiales
esterilizados, análisis microbiológico del agua o del aire, así como una diversidad de
estudios de superficies inanimadas. Estos estudios son una gran carga de trabajo para
el laboratorio, incrementan exageradamente los costos de operación y generan
información abundante pero poco útil. También puede ocurrir la aparición de falsos
brotes a consecuencia de defectos en el manejo de las técnicas para la identificación
bacteriana (como aumento del número de hemocultivos positivos debido a
contaminación cruzada dentro del laboratorio). Por ello, la acciones unilaterales,
clínicas o de laboratorio, suelen ser contraproducentes.

9.4. Funciones específicas que debe apoyar el laboratorio para el control de las
infecciones nosocomiales

Para que el laboratorio sirva de apoyo al sistema de vigilancia de infecciones, es

necesario tener un control estricto en las siguientes actividades:

Toma y transporte de la muestra. La toma y transporte de las muestras son

factores vitales para el aislamiento de los patógenos. Incide también en la optimización
de los recursos, al evitar el procesamiento de muestras inadecuadas. La toma de la
muestra debe hacerse en el sitio adecuado, por ejemplo, si se sospecha meningitis,
debe hacerse punción lumbar, y no esperar el resultado del hemocultivo para confirmar
infección. Además, el tiempo debe ser el oportuno; por ejemplo, los hemocultivos deben
tomarse en el momento de la fiebre y no después, ya que las bacteriemias suelen ser
transitorias o intermitentes en la mayoría de las infecciones. Además, debe emplearse
el procedimiento adecuado; por ejemplo, en pacientes con abscesos es mejor obtener
muestras por punción que esperar al drenaje para enviar el espécimen en hisopo.

Las muestras deben llegar cuanto antes al laboratorio. Una vez allí, deben
procesarse sin demora para evitar contaminación y asegurar una atmósfera adecuada
a los patógenos. Si la muestra va a enviarse con demora, debe transportarse en medio
adecuado.

Evaluación inicial de las muestras. Todos los laboratorios deben hacer una
evaluación inicial de las muestras para definir si son adecuadas para cultivo. Las
razones para ello son epidemiológicas, económicas, de volumen de trabajo y clínicas.
Los motivos epidemiológicos son la eliminación de muestras no significativas o no
indicativas de infección con lo que se eliminaría el riesgo de incrementar los gérmenes
sin significado. En cuanto a la economía, es costoso y poco práctico procesar muestras
de mala calidad, dado lo difícil de su interpretación para definir cuál es el verdadero
patógeno. Las razones clínicas son para definir si el paciente está infectado o
colonizado, y evitar el uso indiscriminado de antibióticos.

Identificación de los microorganismos. Los gérmenes más comúnmente

involucrados en las infecciones nosocomiales son los bacilos gramnegativos
(Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas, Serratia, Proteus, E. coli y Acinetobacter),
seguidos de los estafilococos (incluyendo los coagulasa negativos), enterococos y
Candida. Recientemente se ha añadido a esta lista de patógeno Clostridium difficile,
pero al ser un patógeno anaerobio estricto, sólo en los laboratorios con el equipo
necesario puede llegarse a su aislamiento; sin embargo, se debe sospechar de
infección por este germen ante diarreas en pacientes que previamente fueron tratados
con antibióticos de amplio espectro. Con menor frecuencia, pueden ocurrir infecciones
por Legionella y Listeria, o infestaciones por amiba, así como enfermedades virales
como herpes, rotavirus o citomegalovirus.

La identificación de los gérmenes, con género y especie permite consolidar el

programa de infecciones nosocomiales, y hace posible definir si un agente específico
predomina en alguna sala. Esta labor se facilita por el hecho de que más del 90% de
los bacilos gramnegativos de un hospital corresponden a enterobacterias,
Pseudomonas y Acinetobacter. Por otra parte, la mayoría de los cocos corresponden a
estafilococos y estreptococos.

Es de particular importancia que el laboratorio esté al acecho para detectar

patógenos nuevos, como el estafilococo resistente a meticilina, bacilos gramnegativos
multirresistentes (Pseudomonas, Enterobacter y Acinetobacter), enterococo y
levaduras. En ocasiones, es importante para el clínico saber si dos aislamientos
corresponden exactamente al mismo germen (por ejemplo, cuando dos pacientes de la
misma sala tienen neumonía por el mismo germen). Por desgracia, lo medios para
obtener esta tipificación (análisis de plásmidos, fagotipificación, polimorfismo genético,
etc.) suelen estar fuera del alcance los laboratorios no especializados. Sin embargo, en
cualquier laboratorio puede efectuarse un resistotipo, es decir, la comparación de la
sensibilidad a antibióticos, o una identificación bioquímica.
 Investigación epidemiológica. Los brotes epidémicos aparecen
inesperadamente, por lo que es importante que el laboratorio informe a los clínicos tan
pronto como observe una proporción desmedida de algún patógeno. Por su parte, el
clínico debe hacer lo propio cuando note un incremento de casos con características
semejantes.

Sistema de hemocultivos. Este rubro mereció mención aparte puesto que el

diagnóstico de bacteriemia se establece en el laboratorio, lo que marca una diferencia
franca con otras definiciones. Es decir, si usted quiere definir infección de herida
quirúrgica requiere encontrar pus en la herida, y si requiere definir gastroenteritis debe
observar diarrea. Por el contrario, la bacteriemia puede sólo sospecharse clínicamente
y debe confirmarse en el laboratorio. Es por ello imprescindible que el sistema de
hemocultivos funcione bien cuando el laboratorio atiende pacientes hospitalizados
(tiempo preciso de toma, volumen adecuado de la muestra, dilución suficiente en
caldo).

Reporte oportuno de los resultados. Los resultados son más útiles cuanto más
temprano se informen. Los resultados de identificación deben informarse de inmediato
al clínico o a la enfermera epidemióloga. Generalmente, la notificación se hace primero
con una identificación presuntiva que luego se confirma con el resultado definitivo.

Estudios en personal del hospital y del medio ambiente. Cuando se habla del
papel que le laboratorio debe desempeñar en el control de las infecciones hospitalarias,
es común que se piense de inmediato en cultivos del personal o del medio ambiente.
Debe establecerse, sin embargo, que este tipo de estudios raramente están indicados y
deben limitarse dado su alto costo y dificultad para la interpretación. Por excepción se
efectúan cuando se busca la participación de portadores asintomáticos o de fomites en
la etiología de un brote por un germen ya definido, pero nunca suplen a la necesidad de
intensificar las medidas de control y educación del personal.

Otras rutinas aceptadas como útiles son el control semanal de eficacia de

esterilización de autoclaves, el muestreo de la fórmula para infantes, el cultivo del agua
utilizada en hemodiálisis. El agua para uso corriente en un hospital puede ser fuente de
infecciones en países en desarrollo, pero no deben hacerse cultivos indiscriminados,
sino mantener vigilancia cotidiana en el nivel de cloración. No deben hacerse
rutinariamente cultivos ambientales, de productos comerciales estériles o de equipo
respiratorio.

En suma, el laboratorio de microbiología tiene gran valor en la prevención y

control de las infecciones nosocomiales, pero no puede trabajar aisladamente. Si no
existe un comité de infecciones que integre las acciones médicas y paramédicas, poco
o nada puede hacerse.
 9.5. Bibliografía
1. Herwaldt LA, Wenzel RP. Dynamics of hospital-acquired infection. In Murray PR, Baron EJ,
Baron EJ, Miller JM, Weinstein MP, Richter SS, Gilligan PH, Thompson JR RB. A guide to
utilization of the microbiology laboratory for diagnosis of infectious diseases: 2013
recommentations by the Infectious Diseases Society of America (IDSA) and the American
Society for Microbiology (ASM). Clin Infect Dis. first published online July 10, 2013 doi:
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2. Emori TG, Gaynes RP. An overview of nosocomial infections, including the role of the
microbiology laboratory. Clin Microbiol Rev 1993;6(4):428-42.

3. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Principles and procedures for blood
cultures; approved guideline. CLSI document M47-A. Wayne, PA: Clinicla and Laboratory
Standards Institute 2007.

4. Howanitz PJ. Errors in laboratory medicine, practical lessons to improve patient safety. Arch
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5. Howanitz JH, Howanitz PJ. Laboratory results, timeliness as a quality attribute and strategy.
Am J Clin Pathol 2001;116:311-5.

6. Pfaller MA, Herwaldt LA. The clinical microbiology laboratory and infection control: emerging
pathogens, antimicrobial resistance, and new technology. Clin Infect Dis 1997;25:858-70.

7. Stelling J, Yih WK, Galas M, Kulldorff M, Pichel M, Terragno R, et al. Automated use of
WHONET and SaTScan to detect outbreaks of Shigella spp. using antimicrobial resistance
phenotypes. Epidemiol Infec 2010;138:873-883.
Parte 10. INMUNODIAGNOSTICO Y SEROLOGIA

10.1. Generalidades

El diagnóstico microbiológico por el laboratorio suele hacerse de varias maneras,

siendo las más comunes:

Identificación del agente en cultivo. Esta técnica se considera el estándar; sin

embargo, tiene el inconveniente del tiempo y las dificultades para lograr el desarrollo de
algunos microorganismos (como los virus). Además, como se mencionó al principio de
este manual, es común que se requiera criterio en su interpretación pues no todo lo que
crece en cultivo es un patógeno y no todo lo que es patógeno crece en cultivo.

Identificación de productos microbianos. El ejemplo más demostrativo puede

ser la capacidad de lisar el limo (proteína lábil) por el suero de pacientes con sepsis por
gramnegativos o la identificación de la toxina de Clostridium difficile en heces en
pacientes con colitis por antibióticos. Estas pruebas se usan poco, pero la segunda
puede ser gran utilidad para limitar el uso indiscriminado de antibióticos en los
hospitales.

Identificación de anticuerpos específicos contra microorganismos. Son las

pruebas más utilizadas y en las que nos enfocaremos mayormente. Esta área es la que
se conoce propiamente como serología. Requiere también un criterio para su
interpretación pues las enfermedades suelen dejar una huella y, en fase aguda, se
requiere de un período de conversión (período de ventana).

Identificación de anticuerpos inespecíficos (reacción cruzada). Por

coincidencia biológica, en algunas enfermedades se producen anticuerpos contra
antígenos que cruzan con el agente biológico de algunas enfermedades. Los casos
clásicos son las pruebas no treponémicas para la detección de sífilis (VDRL y RPR), en
las que se aprovecha que los enfermos generalmente producen anticuerpos que cruzan
contra los extractos de corazón de ternera unida a lípidos (cardiolipina); estos
anticuerpos se conocen como reaginas y no deben confundirse contra la denominación
de reaginas para referirse a anticuerpos causantes de alergia. Otro prototipo de
anticuerpos en reacción cruzada es la que los pacientes con tifo desarrollan contra
antígenos del Proteus OX19. Al igual que en pruebas específicas, se requiere un
período de ventana.

Identificación de antígenos específicos. Estas pruebas resultan de gran

utilidad pues no requieren período de seroconversión ni dejan huella serológica. La
prueba más utilizada de este grupo es la detección del antígeno de superficie de
Hepatitis B. Utiliza las mismas técnicas de la serología, pero muchas pruebas se hacen
en tejidos o productos, como la detección del antígeno de rotavirus en heces, de virus
respiratorios en secreciones, o de Chlamydia trachomatis en exudado cervical o uretral.
Mención especial requiere la detección de antígenos de Haemophilus, neumococo o
neisseria en líquido cefalorraquídeo por la técnica de coaglutinación o aglutinación en
látex. Existen algunas pruebas que pueden efectuarse con inmunofluorescencia directa
sobre un frotis de la muestra (detección de Chlamydia, Herpes, Bordetella)

Identificación de fracciones específicas de ácidos nucleicos. Estas pruebas

están causando gran expectativa por el desarrollo de técnicas como la reacción en
cadena de polimerasa (PCR). Se describen brevemente en el capítulo 11.

El principio de la serología es simple, es el estudio del suero en busca de

anticuerpos. Las técnicas serológicas son muchas, existen pruebas de aglutinación,
floculación, precipitación, inmunoelectroforesis, fijación de complemento,
inmunofluorescencia directa o indirecta, ELISA, electroinmunotransferencia (mejor
conocida como Western blot), entre otras. Sin duda las técnicas de aglutinación y las
de ELISA son las más difundidas, tanto por su facilidad de realización, como por su
bajo costo, lo cual facilita su implementación en laboratorios de bajos recursos. En este
capítulo nos referiremos a estas pruebas así como a un ejemplo de cada una.

10.2. Aglutinación y precipitación

En este tipo de reacciones, se utilizan antígenos solubles para buscar

anticuerpos en el suero. Una vez que el reactivo y el suero se ponen en contacto, los
anticuerpos son compartidos por los antígenos, con lo que se logra un conglomerado
(aglutinación) el cual puede verse a simple vista. El conocimiento de este fenómeno
ayuda a interpretar las reacciones y a comprender por qué, al existir una gran cantidad
de anticuerpos en el suero de un paciente, puede ocurrir el fenómeno de prozona
(aglutinación negativa cuando hay exceso de anticuerpos). Un ejemplo de pruebas de
aglutinación son las reacciones febriles, las cuales trataremos en seguida.

10.3. Reacciones febriles

Son pruebas que se implementaron con el fin de poder discernir, mediante el

laboratorio, sobre la etiología de un cuadro febril generalmente agudo, en
enfermedades con características clínicas semejantes. Inicialmente, estas pruebas se
utilizaban para cuatro enfermedades: tifo, tifoidea, brucelosis y tularemia. En la
actualidad, las pruebas son para el diagnóstico de: tifo, tifoidea, paratifoidea y
brucelosis. Estas pruebas pueden ser cuantitativas mediante la dilución del suero en
estudio, con lo cual se puede inferir si existe o no una infección actual, o se trata
únicamente de memoria inmunológica. Los antígenos se encuentran preparados
comercialmente en suspensión acuosa, provistos de un gotero que permite hacer la
dilución.

10.3.1. Prueba en placa

1. Separar el suero,

2. En una placa de vidrio, haga una cuadrícula con lápiz graso (cada cuadro
debe medir aprox. 2.5 cm de lado) para formar varias columnas de 5
cuadrados. (Una por cada reacción a estudiar).

3. En cada uno de los cinco cuadrados deposite las siguientes cantidades de

suero, con pipeta manual (evite pipetear con la boca). En cada cuadrado se
añadirá una gota del antígeno para obtener la dilución, según la siguiente
tabla:

Tabla 10.1. Dilución de antígenos para pruebas serológicas.

Cuadro Suero (mL) Antígeno Dilución final

1 0.08 1 gota (0.03 mL) 1 : 20
2 0.04 1 gota 1 : 40
3 0.02 1 gota 1 : 80
4 0.01 1 gota 1 : 160
5 0.005 1 gota 1 : 320

Los antígenos que se van a utilizar son:

• Tífico "O"

• Tífico "H"

• Paratíficos A y B

• Brucelar (extracto de membrana de Brucella abortus).

• Proteus OX19, el cual da reacción cruzada con algunas ricketsias.

4. Proceder de inmediato y mezclar el contenido de cada cuadro con un

aplicador de madera (uno para cada reacción), comenzado por la dilución
mayor (1:320->1:20).
 5. Mezclar durante tres minutos con suave movimiento de rotación. Debe
leerse de inmediato, prolongar la observación ocasiona que algunas
reacciones negativas comiencen a parecer positivas.

6. Informar el título como aquél en el que se obtenga una aglutinación visible

claramente, para cada reacción. Si no existe aglutinación alguna se informa
como negativa. Si existe aglutinación, se informa el máximo título alcanzado,
y nunca como positiva, pues este criterio depende del clínico. Si existe duda
en algún cuadrante, la reacción es negativa. Por ejemplo, si encuentra
aglutinación clara en 1:80, pero tiene dudas en 1:160, se informa 1:80. Este
punto es importante, pues generalmente se procede al contrario,
informándose valores inexistentes.

10.3.2. Técnica en tubos

Esta técnica no se utiliza rutinariamente pues es laboriosa, pero debe efectuarse

para confirmar títulos positivos en placa, ya que es menos subjetiva y más
reproducible. Por ello, se considera como el estándar de oro. Es particularmente útil en
las reacciones de Brucella.

1. En una serie de ocho tubos numerados, deposite en c/u 0.5 mL se solución

salina al 0.9%.

2. En otro tubo, deposite 0.8 mL de solución salina, agregándole 0.2 mL del

suero en estudio (dilución 1:5) y mezcle.

3. Pase 0.5 mL del suero diluido al primer tubo de solución salina. Mezcle
perfectamente y pase 0.5 mL al tubo siguiente. Repita esta operación hasta
llegar al tubo 7. Después de mezclar este tubo, se toman 0.5 mL y de
descartan.

4. En un tubo aparte, se hace una dilución del antígeno a estudiar en solución

salina, en dilución 1:20. Para ello, se añaden 0.020 mL (200 uL) del antígeno
a 4 mL de salina.

5. A cada tubo de suero diluido (incluyendo el octavo) se agregan 0.5 mL de la

suspensión diluida de antígeno y se mezcla agitando vigorosamente. En el
primer tubo tendremos una dilución 1:20, en el segundo 1:40, hasta 1:1280
en el séptimo. El tubo 8 servirá como control del antígeno. Se incuba de
acuerdo con la siguiente tabla:

Tabla 10.2. Temperatura y tiempo de incubación para cada germen en la prueba de

aglutinación en placa.
Antígeno Incubación
Brucela 48 horas en baño a 37 °C
Proteis 15 – 18 horas a 37 °C
Tífico H 1 – 2 horas a 37 °C
Tífico 0 15 – 18 horas a 50 °C
Paratíficos 15 – 18 horas a 50 °C

La reacción positiva se aprecia por la precipitación completa de los antígenos en

forma de grumos en el fondo del tubo, quedando totalmente cristalino el sobrenadante.
La reacción negativa muestra turbidez semejante a la del testigo (octavo tubo). Se
informa de acuerdo con el máximo título alcanzado.

10.3.3. Consideraciones para la interpretación adecuada

Las pruebas que detectan anticuerpos, como las reacciones febriles, tienen la
desventaja de requerir un tiempo para que las inmunoglobulinas aparezcan en el suero.
Este tiempo, o período de ventana, aunque conocido desde hace varias décadas, se
hizo de fama cuando se desarrollaron las pruebas para detectar anticuerpos contra el
virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Pudo observarse que cuando un individuo se
contagiaba, manifestaba una enfermedad leve con fiebre, sarpullido y crecimientos de
ganglios del cuello; sin embargo, la detección de anticuerpos anti VIH se tornaba
positiva entre 3 semanas y 6 meses después, cuando generalmente el portador no
tenía ya molestias. Este período de ventana es variable para cada enfermedad; en las
enfermedades agudas es de una a dos semanas. En las crónicas, puede tomar varios
meses. El fenómeno de laboratorio (cambio de negativo a positivo) se conoce como
seroconversión, y para las reacciones de aglutinación se requiere de un cambio en la
titulación de cuatro veces. Por ejemplo, si inicialmente (suero agudo) el título de
anticuerpos contra Antígeno H es de 1:80, se requerirá un título mínimo de 1:320 en la
segunda determinación 10 ó 15 días después (suero convaleciente). Por ello, es difícil
determinar cuál es el título positivo de un suero convaleciente, cuando se desconoce el
valor del suero agudo, en cuyo caso se exige un mínimo de 1:320.

El conocimiento de este fenómeno es elemental para saber interpretar las

pruebas serológicas. Suponga que atiende a un enfermo con cuadro febril de dos días
de evolución y otros datos clínicos compatibles con tifoidea. Si solicita las reacciones
febriles serán, obviamente, negativas ese día, pues se habrá de seroconvertir unos 10
días después, cuando probablemente el enfermo se encuentre ya sin molestias. Ello
explica por qué las reacciones febriles son uno de los estudios más mal utilizados en la
práctica médica: a pacientes con tifoidea se les asegura que no la padecen pues sus
reacciones son negativas. Por otra parte, a pacientes con serología positiva se les
indica tratamiento para infecciones que pudieron haber curado hace varios años,
dejando una huella serológica.

En el caso del tifo existe un problema semejante. Es una enfermedad poco

común en la actualidad, pero aún observamos casos esporádicos. El paciente es
llevado en mal estado, con fiebre elevada, sarpullido generalizado y desorientación
mental. Todos los estudios microbiológicos resultan negativos, incluyendo las
reacciones febriles. Cuando se indica un tratamiento adecuado (generalmente por un
clínico que tiene idea de cómo se interpretan las reacciones febriles) el paciente
responde rápidamente y puede ser egresado. Si se le cita dos semanas después,
acudirá sin molestia alguna, pero el título de OX19 se encontrará generalmente por
arriba de 1:640.

Un caso particular es el de las reacciones contra Brucella (prueba de Huddleson),

pues esta enfermedad es de inicio indolente, lo que hace que el enfermo busque
atención después de la segunda semana, cuando ya ocurrió la seroconversión.
Además se espera que, al resolverse la enfermedad, el título de la reacción sea menor
de 1:80. Por ello se dice que, de las reacciones febriles, sólo las reacciones de Brucella
son de utilidad en la primera consulta.

Por último, conviene remarcar lo que se comentó en las técnicas: frecuentemente

se dan títulos falsamente elevados pues se tiende a hacer lecturas tardías o se dan
como positivas aglutinaciones mínimas en placa, sin confirmar en tubo. Por ello, una
gran cantidad de personas reciben tratamiento múltiples por supuesta tifoidea crónica,
o brucelosis crónica, cuando en realidad sólo muestran huellas serológicas de
enfermedades previas ya resueltas. Es común también que se soliciten reacciones
febriles a personas que se sienten crónicamente fatigadas, sin fiebre o pérdida de
peso; nunca falta un laboratorio que informe febriles "positivas" con las consecuencias
en el manejo del paciente. Hemos conocido pacientes que, después de cuatro años,
han recibido más de 20 esquemas diferentes de manejo contra tifoidea o brucelosis
que no padecen. Paradójicamente, resulta casi imposible convencer al "paciente" de
que no tiene enfermedad orgánica. Y lo que es peor, es que también resulta imposible
convencer a su médico.

10.4. Técnica de ELISA

Las siglas quieren decir: análisis inmunoadsorbente ligado a enzimas, lo cual

significa que se marca un reactivo, generalmente un anticuerpo, con una enzima. El
suero problema se incuba, suponiendo que contiene anticuerpos, con una fase sólida
que contiene antígeno. Después de un tiempo, se lava la fase sólida y se incuba con un
antianticuerpo marcado con una enzima. De existir anticuerpos en el suero, éstos
debieron pegarse al antígeno de la fase sólida; entonces el antianticuerpo se pega a los
anticuerpos presentes y sólo basta lavar nuevamente y agregar un sustrato para
evidenciar la presencia del anticuerpo mediante la coloración, por la acción de la
enzima sobre el sustrato. Debido a que el anticuerpo buscado queda emparedado entre
el antígeno de la fase sólida y el antianticuerpo marcado con la enzima, el método se
conoce como de sandwich.

10.5. El perfil de TORCH

TORCH es un acrónimo que se utiliza para definir a varias enfermedades

(toxoplasmosis, otras, rubéola, citomegalovirus, y herpes). En el rubro de otras pueden
agregarse sífilis, Sida y hepatitis B. Se le considera en conjunto pues todas ellas
pueden causar problemas en productos de mujeres embarazadas con la enfermedad,
que van desde el aborto hasta cuadros indetectables en un recién nacido
aparentemente normal. También este complejo manifiesta en ocasiones un síndrome al
nacimiento: productos pequeños, malformaciones diversas del sistema nervioso y
cardiovascular, hepatosplenomegalia, dificultades para el crecimiento y desarrollo. A
menudo se refiere a estas manifestaciones como el síndrome de Torch.

En todas las enfermedades del complejo de Torch existen dificultades en el

diagnóstico pues se trata de gérmenes no cultivables o de difícil cultivo. Es por ello que
la serología ha desplazado al resto de los métodos de diagnóstico. Por ejemplo, ya
nunca se busca el cultivo de virus de la rubéola para los fines clínicos. En las
infecciones por citomegalovirus, aunque el cultivo tiene utilidad, está fuera del alcance
de muchos laboratorios y la serología lo ha desplazado con creces; lo mismo puede
decirse para infecciones por virus de inmunodeficiencia o hepatitis. Debe aclararse, sin
embargo, que el desconocimiento de la aplicación adecuada de la serología ha hecho
que se abuse de este perfil, con fines de escrutinio. Y es que el clínico generalmente no
considera que está detectando anticuerpos (inmunoglobulinas), y que para todas las
enfermedades existe un período de ventana, como ya se describió. Una dificultad
adicional deriva de que algunas inmunoglobulinas de la madre filtran libremente a
través de la placenta a la sangre del producto y, frecuentemente, dan pruebas positivas
en éste hasta por varios meses.

Para cada una de las enfermedades, existen múltiples técnicas de serología

(aglutinación, hemaglutinación, inmunodifusión, inmunofluorescencia, ELISA, etc.). Por
su fácil elaboración, la técnica de ELISA ha desplazado al resto en casi todos los
laboratorios. Así, aunque la técnica de inhibición de la hemaglutinación se utilizó
durante décadas para la detección de anticuerpos contra rubéola, actualmente casi
ningún laboratorio la realiza; la prueba de Sabin-Feldman, otrora de uso difundido en la
toxoplasmosis, ha quedado en desuso en favor de la de ELISA. Además de la facilidad
en su realización, algunos de los equipos de ELISA permiten discriminar entre
inmunoglubulinas de tipo G y M. Esto es de gran importancia por dos motivos: la
aparición de las inmunoglubulinas de tipo M antecede por varios días a las de tipo G,
además de que las primeras no se filtran a través de la placenta. Por ello, la presencia
de IgM específica en el recién nacido indica que padeció la enfermedad in útero,
diagnóstico imposible si sólo se busca IgG, que puede ser de la madre.

Discriminar el tipo de inmunoglobulina tiene una importancia adicional: la IgG

generalmente permanece durante toda la vida del individuo, mientras que la IgM
desaparece después de algunas semanas de la enfermedad. La figura 10.1 muestra las
curvas características de las inmunoglobulinas G y M para la mayoría de las
enfermedades; conocer este fenómeno permite interpretar adecuadamente la
serología.

La descripción de breves casos clínicos hará entender mejor la utilidad y el

criterio para interpretar las pruebas.

10.6. Casos clínicos

Caso 1 (Período de ventana) Mujer con 15 semanas de embarazo, maestra de

kinder, alarmada porque le apareció un leve sarpullido, desde dos días anteriores a la
consulta. Quiere descartar la posibilidad de rubéola. El médico le solicita "anticuerpos
contra rubéola". El resultado informado es: negativo. El médico le indica a la paciente
que no debe preocuparse pues no padece rubéola.

Este caso ejemplifica el compromiso que el médico tiene para interpretar

adecuadamente la serología y la necesidad de contar con determinaciones confiables.
Aquí existe un grave error en la interpretación que es, además, muy común. Si el
cuadro de la paciente es de rubéola, se encuentra en la primera semana y estará en
período de ventana. Repetir la prueba 10 ó 15 días después encontraría la
seroconversión y llegaría al diagnóstico correcto. De hecho, un médico bien informado
sabría que el resultado inicial negativo puede ser un signo ominoso (suero agudo). Es
muy probable que, si se hubiera solicitado específicamente la fracción IgM, el resultado
hubiera sido positivo, aunque pudiera no serlo en los primeros siete días. El período de
ventana para IgM es más corto que el de IgG, pero existe de todos modos. Cuando se
cuenta con determinación de IgM, un solo suero tomado en etapa convaleciente puede
hacer el diagnóstico; de hecho, si no se cuenta con un suero agudo, es la única
alternativa aceptable. Si se cuenta sólo con la determinación de IgG, debe tomarse un
suero agudo y repetir la toma dos semanas después para atestiguar la seroconversión.
Cuando el laboratorio no informa el tipo de inmunoglobulina estudiada, generalmente
significa que se buscó sólo IgG. En caso de duda, sin embargo, debe comunicarse al
laboratorio.

Figura 10.1. Respuesta serológica a las infecciones

Caso 2 (Memoria) Acude una paciente por aborto recurrente. El médico solicita
al laboratorio perfil de TORCH. El laboratorio informa anticuerpos contra Toxoplasma:
positivo, resto negativos. El médico indica tratamiento contra la toxoplasmosis.

Este es un error muy común también, y muestra cómo un estudio de laboratorio

no sustituye al criterio clínico. En primer lugar, la toxoplasmosis (como la rubéola) no
son causa de abortos recurrentes pues es una enfermedad que ocurre una sola vez y
deja huella serológica, como en este caso. De hecho, el laboratorio seguramente
determinó IgG y la paciente está protegida contra la toxoplasmosis pues ya la habría
padecido. En todo caso, el médico puede solicitar estudio de la fracción IgM para
confirmar que no existe enfermedad actual. La solicitud de perfiles de manera
indiscriminada, como estudios de escrutinio, resulta muy costosa y generalmente de
poco valor en el diagnóstico.

Caso 3 (Filtración placentaria) Un recién nacido tiene peso bajo. La exploración

muestra hepatosplenomegalia. El pediatra solicita al laboratorio perfil de Torch. El
laboratorio informa anticuerpos contra Citomegalovirus: positivo. El médico hace
diagnóstico de infección por este virus.

No se efectuaron pruebas discriminatorias de las fracciones IgG e IgM, por lo que

los anticuerpos pueden pertenecer a la madre. En el recién nacido debe determinarse
la fracción IgM. El resultado positivo confirmaría el diagnóstico.

10.7. Bibliografía
1. Mühlhauser M, Rivas L. Laboratorio de microbiología: conocimientos básicos para un
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Parte 11. BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA A LA MICROBIOLOGIA
CLINICA.

Como se mencionó en el capítulo anterior, el método tradicional para la

identificación de un agente patógeno es el cultivo. Sin embargo, los cultivos de virus,
hongos, micobacterias, chlamydias y micoplasmas son en ocasiones difíciles, lentos o
costosos. En esos casos, suele confiarse en la identificación por serología o histología;
por desgracia, estos métodos proporcionan sólo evidencia circunstancial de infección y
en algunos casos es poco reproducible. Por estas razones existe una tendencia hacia
el diagnóstico molecular para la detección directa de secuencias específicas de DNA o
RNA de un microorganismo en particular. Estas técnicas han reducido el tiempo
requerido para el diagnóstico de gérmenes de difícil crecimiento; de hecho, algunos
agentes se han descubierto sólo por técnicas moleculares, como el virus del herpes
asociado al sarcoma de Kaposi.

Las dos principales técnicas moleculares usadas para detección microbiana son
la hibridación de ácidos nucleicos con sondas moleculares específicas de DNA o RNA,
y la amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR). Existen otros muchos
métodos, pero son generalmente variaciones de los anteriores. Para los métodos
basados en sondas moleculares se requiere una muestra que contenga una alta
cantidad del microorganismo buscado o una muestra de cultivo bacteriano. Cuando la
cantidad del agente es escasa, la muestra debe someterse primero a amplificación por
PCR; de esta manera, ha sido posible la detección microbiana en muestras tan
pequeñas como salpicaduras de sangre.

11.1. Técnicas de hibridación

Bajo condiciones apropiadas de temperatura y pH, los ácidos nucleicos de

cadena única (como el RNA o el DNA desnaturalizado) tienen la propiedad de
combinarse para formar una doble cadena estable. Este fenómeno se conoce como
“hibridación” pues puede lograrse incluso con ácidos nucleicos de especies diferentes
como el hombre y las bacterias.

En las pruebas de hibridación, la muestra se somete a agentes alcalinos para

que el DNA se desnaturalice en dos cadenas y se coloca entonces en una superficie
adherente como nitrocelulosa para evitar que las cadenas se recombinen (Figura 11.1).
Gracias a las propiedades físicas de los ácidos nucleicos, la unión con la nitrocelulosa
ocurre sobre el soporte de azúcar-fosfato, lo que permite que las bases nitrogenadas
(A,T,C,G) se proyecten afuera. Para caracterizar o identificar el DNA “blanco” (“target”
DNA), se agrega una solución que contiene una “sonda,” compuesta por una secuencia
conocida de DNA o RNA, marcada con un marcador, generalmente radiactivo. Se
permite entonces que ocurra la hibridación y se lava luego de un período de incubación
para remover toda la sonda no ligada. Después de los lavados, permanecerá en la
nitrocelulosa el DNA blanco y la sonda ligada, en su caso. La identificación del DNA
blanco se logra entonces al captar la presencia del marcador. En el caso de materiales
radiactivos, se puede colocar una placa radigráfica, en donde aparece una mancha o
“blot”, en un proceso conocido como “autoradiografía”. En la figura 11.1 se
esquematiza el procedimiento.

Figura 11.1. Hibridación del DNA. Cuando una molécula de DNA (a) se calienta o se
coloca en un medio alcalino, se desnaturaliza en dos cadenas separadas (b). Esas
cadenas se adhieren entonces en superficies de nitrocelulosa (c) con solo calentar
hasta que se evapore todo el líquido. Se agrega una solución que contiene una sonda

marcada con material radiactivo y se deja algún tiempo para permitir la hibridación con
el DNA blanco fijado en la membrana. Luego se hace un lavado para barrer toda la
sonda que no se ligó; finalmente se coloca la nitrocelulosa sobre una placa radiográfica
para revelar la mancha.

La prueba de “Southern blot” es otro ejemplo de esta aplicación. En este caso, el

DNA se fracciona primero con enzimas bacterianas que lo cortan en puntos específicos
(“enzimas de restricción”). La intensidad de la mancha puede medirse, con lo que se
logra la cuantificación del agente.

La sonda generalmente contiene menos de 30 bases de una secuencia

conocida. Por ejemplo, la secuencia TTAGGC, se ligaría al blanco AATCCG, de
acuerdo con las reglas conocidas de combinación de las bases (A-T, C-G). Para ser
útil, la sonda debe tener dos características: debe contener una secuencia
característica del agente estudiado y no debe hibridarse con el DNA propio del huésped
de quien se tomó la muestra.

Las técnicas de hibridación son útiles para la detección directa de

microorganismos en muestras clínicas. Debido a que se detectan secuencias
genéticas, y no antígenos o anticuerpos, estas pruebas tienen mayor sensibilidad y
especificidad que las serológicas. Existen actualmente técnicas de hibridación en
laminillas de microscopio, utilizando marcadores fluorescentes, que se utilizarán cada
vez más en histopatología (hibridación “in situ”).

Figura 11.2. Prueba de Southern blot. El DNA primero se fracciona con enzimas de
restricción y se le corre en un gel por electroforesis (a). Por capilaridad se transfieren
entonces los fragmentos a una membrana de nitrocelulosa (b). Finalmente, se efectúa
la hibridación (c), con lo que se puede observar el fragmento deseado.

11.2. Técnicas de PCR

Normalmente, la reproducción del material genético se efectúa por enzimas

llamadas polimerasas del DNA. Estas enzimas inician la síntesis del DNA a partir de
una plantilla iniciadora (“primer”). Estas plantillas con oligonucleótidos de 20 a 30
bases, muy semejantes a las que se utilizan en las técnicas de hibridación, pero que,
en el caso de la PCR, deberán ser dos colocadas en direcciones opuestas en ambas
cadenas del DNA (Figura 11.3). De este modo, cualquier segmento del material
genético puede ser multiplicado miles de veces seleccionando un par de plantillas que
flanqueen el segmento deseado. La muestra se coloca en un tubo en solución con las
plantillas, la polimerasa y bases de DNA. Cuando la mezcla se calienta, el DNA se
desnaturaliza y las plantillas se hibridan, lo que permite que la enzima inicie el proceso
de extensión del DNA. Cuando la muestra se somete a ciclos de calentamiento y
enfriamiento, la reacción se repite, lo que lleva a una amplificación exponencial en cada
ciclo. Generalmente se utilizan enzimas de bacterias que toleran altas temperaturas,
como la enzima “Taq”, derivada del bacilo Thermus aquaticus, que vive en ambientes
con temperaturas cercanas a los 100 oC. Cuando se requiere amplificar RNA, debe
primero sintetizarse un DNA complementario por medio de alguna enzima transcriptasa
reversa.

La PCR requiere tres temperaturas o pasos de incubación que se repiten de 20

a 50 veces. Cada repetición se conoce como ciclo. En el primer paso
(desnaturalización), la mezcla se calienta a 90 oC para que las cadenas de DNA se
separen. En el segundo paso (hibridación) la muestra se enfría a 60 oC, con lo que se
hibridan las plantillas en las dos cadenas del DNA. En el tercer paso (extensión) la
muestra se calienta a 70 oC para permitir la acción de la enzima termoestable. Todos
los componentes de la prueba se agregan al inicio en un tubo y no requiere detenerse
para agregar más reactivos pues se le coloca en excedente. Al final de la reacción los
productos de PCR serán millones de copias del segmento blanco del DNA flanqueado
por las plantillas (“amplicones”). Estos amplicones pueden detectarse fácilmente por
técnicas de hibridación como la mencionada anteriormente. También pueden
detectarse por corrimiento en electroforesis. Un esquema del procedimiento se observa
en la figura 3.

Las técnicas de PCR han tenido un impacto sustancial en el diagnóstico de las

enfermedades infecciosas. Este método logra la amplificación específica de pequeñas
cantidades de DNA microbiano incluso cuando se encuentra en mezcla con DNA del
propio huésped. Su mayor ventaja es que es mucho más sensible que las técnicas de
hibridación. En términos de sensibilidad, las técnicas de hibridación requieren un
mínimo de 1000 copias del DNA blanco, mientras que las técnicas de PCR pueden
identificar desde 10 copias. Además, la muestra puede obtenerse de cualquier líquido o
tejido corporal, aun cuando se encuentre contaminado o parcialmente degradado. Por
ejemplo, pueden hacerse pruebas en tejidos fijados en parafina por muchos años,
incluso cuando ya hayan sido teñidos para su observación microscópica.
 !

Figura 11.3. Representación esquemática de un ensayo de PCR. El objetivo es la

amplificación dirigida de un segmento deseado de DNA. Inicialmente, la mezcla se
calienta para lograr la desnaturalización del DNA (a). Al permitir el enfriamiento, las
plantillas (“primers”) se hibridizan con sus secuencias complementarias (b). Entonces
toma lugar la acción de la polimerasa para sintetizar el DNA (c) a partir de las plantillas.
Los pasos se repiten en un equipo ciclador por 20 a 50 veces, para lograr una
amplificación exponencial.
 11.3. Usos actuales de técnicas moleculares en el diagnóstico

Una vez que se estandaricen y sean más económicas, una gran cantidad de
pruebas moleculares se efectuarán en el futuro para suplementar y reemplazar las
técnicas actuales. En los países desarrollados, las técnicas moleculares han
desplazado a las tradicionales en muchas enfermedades por gérmenes que no crecen
en cultivo habitual, como virus, micobacterias, hongos, chlamydias y bacterias de difícil
crecimiento. Incluso en sitios donde se cuenta con el cultivo de estos gérmenes, en
algunos casos los estudios moleculares son ya la primera elección, como la detección
de citomegalovirus en tejidos, papovavirus en exudado cervical, o chlamydia en orina.
Otra aplicación promisoria de la PCR es el diagnóstico de condiciones infecciosas en
las que se encuentran muy pocos microorganismos, como el virus del herpes en líquido
cefalorraquídeo de pacientes con encefalitis. Se les utiliza también ampliamente para la
cuantificación viral en plasma (“carga viral”) en pacientes con infecciones por virus de
inmunodeficiencia o de la hepatitis C. Estos métodos han sido de gran utilidad también
para el diagnóstico de enfermedades que se encuentren en período de ventana de
formación de anticuerpos. En fin, se han identificado ya por técnicas moleculares más
de 100 microorganismos patógenos. Sin embargo, debe decirse que estos
procedimientos requieren un estricto control de calidad y no deben ofrecerse para fines
clínicos si no se les ha estandarizado en cada laboratorio y si no han sido aprobados
para ese fin. En tales casos, deben considerarse aún como técnicas en investigación y
no deben reemplazar a los métodos actuales.

11.4. Bibliografia
1. Mühlhauser M, Rivas L. Laboratorio de microbiología: conocimientos básicos para un
clínico. Rev Med Clin Condes 2014;25(3):569-579.

2. Bertelli C, Greub G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in

clinical microbiology. Clin Microbiol Infect 2013;19:803-813.

3. Naber SP. Molecular pathology. Diagnosis of infectious disease. N Engl J Med

1994;331:1212-15.

4. Stansfield WD, Colome JS, Cano RJ. Molecular and cell biology. McGraw-Hill, New York,
1996.
ANEXO 1. SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

A1.1. Generalidades

Existen tratados enteros acerca de la seguridad en el laboratorio, y nunca es

exagerado insistir en ella. En general, puede decirse que en el laboratorio de
microbiología existen los riesgos biológicos además de los ya conocidos en laboratorio
generales (radiación, intoxicación, electrocución, inflamación y trauma mecánico con
equipos). Todos son importantes, pero abundaremos en los primeros.

Las medidas de control de riesgo están diseñadas para proteger a quien trabaja
en el laboratorio y al público en general (control de los desechos). La mayoría de los
riesgos dentro del laboratorio se reducen significativamente efectuando técnicas y
procedimientos apropiados, colocando equipos de contención y barreras de protección,
así como adecuando las instalaciones. Pero lo más importante es que, quien trabaja en
el laboratorio, esté consciente del riesgo y los caminos para reducirlo. No es posible
eliminar por completo los riesgos, pero sí lo es reducirlos al mínimo.

De acuerdo con las estadísticas internacionales, las enfermedades que más

comúnmente se transmiten en el laboratorio de microbiología son (en ese orden):

Puesto Enfermedad
1 Brucelosis
2 Tofoidea
3 Tuberculosis
4 Hepatitis
5 Coccidioidomicosis
6 Shigellosis
7 Leptospirosis
8 Fiebre Q (laboratorios con animales de experimentación)
9 Tularemia (laboratorios con animales de experimentación)

Pueden ocurrir algunas otras infecciones, pero con mucha menor probabilidad,
por lo que no las trataremos aquí. Además, si se tienen precauciones para las antes
mencionadas, se tendrá generalmente protección automática contra las otras.
Analizaremos por qué ocurren las principales infecciones y cómo evitarlas. Como
ocurre para el control de infecciones nosocomiales, el lavado de manos después de
trabajar es una medida importante para el control de todas.

Brucelosis Generalmente ocurre cuando el personal no reconoce que una

especie de Brucella está desarrollando en hemocultivo y la trabaja sin precaución. Se
presume que el mecanismo más común de transmisión es por aerosoles. Sospeche
Brucella en cualquier bacilo gramnegativo, MacConkey negativo, aislado de un
hemocultivo. Trabaje de preferencia en campana de seguridad biológica.

Salmonellosis y shigellosis Esta infección generalmente se adquiere al

trabajar coprocultivos e ingerir los microorganismos. Debe evitarse comer o beber en el
área de trabajo. Nunca se toque la cara en el laboratorio, ni se aplique maquillaje.
Nunca pipetee con la boca. Nunca utilice Salmonella o Shigella para fines de
enseñanza.

Tuberculosis Se estima que la incidencia de tuberculosis en el personal de

laboratorio es tres a diez veces mayor que en la población general. La mayoría de los
casos ocurren luego de procesar muestras de pacientes con tuberculosis activa a
través de la generación de aerosoles. Debe evitarse destapar las muestras después de
agitadas o introducir el asa caliente en ellas. Para efectuar cultivos de micobacterias,
debe preferirse siempre su manejo en campana de seguridad biológica.

Hepatitis Las hepatitis de mayor riesgo en el laboratorio son las de tipo B y C.

Se contraen por punciones accidentales con agujas contaminadas, o por inoculación
directa en mucosas con líquidos corporales. Siempre deberán usarse guantes para el
manejo de sangre, suero y otros líquidos corporales. Si existe posibilidad de
salpicadura, utilizar lentes o acrílico protector. Desechar todos los objetos
punzocortantes en contenedores especiales. La adherencia a estas precauciones
protege también contra las infecciones por virus de inmunodeficiencia (VIH). Toda
persona que trabaja en un laboratorio clínico debe estar vacunada contra la hepatitis B.

Infecciones por hongos El manejo de hongos levaduriformes como Candida y

Cryptococcus es seguro y pueden manejarse como bacterias convencionales.
Asimismo, el manejo de los hogos verdaderos de lesiones superficiales (tiñas,
dermatomicosis) no se considera de riesgo. Sin embargo, los hongos dimorfos
(levaduras en tejidos que se convierten en hongos verdaderos en el laboratorio), como
Coccidiodes, Histoplasma y Blastomyces se inoculan fácilmente en los pulmones al
inhalarlos cuando las cajas se destapan por accidente o ignorancia. Siempre que
siembre un cultivo de hongos, selle la caja con cinta adherible. Nunca inhale cajas que
puedan contener hongos verdaderos. Cuando observe desarrollo en un cultivo de
hongos de lesiones profundas, destape la caja sólo en una campana de seguridad
biológica o envíe la muestra a un laboratorio de referencia.
 A1.2. Comportamiento en el laboratorio

Cuando una persona desconoce los riesgos en el laboratorio, o cuando su

conducta o actitud desdeña dichos riesgos, se vuelve un riesgo para sí y los demás.
Los estudios han mostrado que quienes tienen más accidentes son quienes se
interesan poco por el riesgo, las que quieren terminar rápidamente y las que
desconocen cómo conducirse en el laboratorio.

En términos generales, debe actuarse con sentido común; los accidentes suelen
ser consecuencia de descuidos personales, más que defectos en el material y equipo.
Asegúrese entonces de cumplir las siguientes normas elementales:

1.Si desconoce cómo efectuar un procedimiento, no vacile en preguntar.

2.Utilice bata en el trabajo. Es preferible el uso de ropa de algodón. Las ropas

sintéticas suelen ser de fácil combustión. Si ésa ocurriera busque la fuente
de agua más cercana. Cerciórese de conocer la localización de los
extintores.

3.Los alcoholes y sus vapores son inflamables o explosivos. No los trabaje cerca
del mechero. No utilice el mechero de alcohol si presenta derrames del
contenido.

4.No toque equipos eléctricos si tiene las manos mojadas, puede sufrir una
descarga.

5.Evite salpicaduras de ácidos o cáusticos. Si ocurre, lave de inmediato el área

con agua corriente. Si diluye ácidos o cáusticos en agua, siempre
agréguelos poco a poco. Nunca agregue agua a ácidos concentrados.

6.Todas las botellas o picetas de reactivos deben estar rotuladas. Nunca dé por
supuesto su contenido.

7.Considere todas las muestras de pacientes como potencialmente infectantes.

Evite punciones accidentales o aspiración de agentes infecciosos con pipeta.
Si va a tener contacto con sangre o líquidos corporales, utilice guantes.

8.No se toque la boca, nariz u ojos. Nunca inhale cajas con cultivos que pudieran
contener hongos o micobacterias.

9.No fume, come ni beba en el área de trabajo.

10.No se distraiga en el trabajo, mantenga sus sentidos en lo que está haciendo.

 11.Si usa el pelo largo, evite tenerlo suelto.

12.Lave sus manos antes de salir del laboratorio.

13.Vacúnese contra la hepatitis B

14.Si sufre un accidente, avise al jefe del laboratorio

A1.3. Manejo de derrames

Se debe tener un protocolo para el manejo de materiales infecciosos que se han

derramado accidentalmente. Derrames pequeños se limpian de inmediato con una
solución de blanqueador casero al 1:10. Cuando hay un derrame mayor, cubrir de
inmediato con toallas desechables y verter en ellas blanqueador casero 1:10 hasta
cubrirlo. Desconecte ventiladores o fuentes de aire acondicionado. Deje actuar el
blanqueador por 10 minutos y recoja utilizando guantes y doble cubreboca. Avise del
accidente al jefe del laboratorio.

A1.4. Manejo de los desechos

Los objetos punzocortantes deben desecharse en contenedores especiales. Los

desechos infecciosos se deben enviar a incinerar o bien, esterilizar en autoclave y
hacerlos irreconocibles antes de desecharlos a la basura general. Los materiales de
biopsia y tejidos corporales deberán ser enviados a incineración. La sangre, el suero,
los líquidos corporales, heces y secreciones podrán desecharse cuidadosamente en el
drenaje, por personal experimentado y con equipo de protección para evitar
salpicaduras.

Bibliografía
1. Blazer MJ, Fatal salmonellosis originating in a clinical microbiology laboratory. J
Clin Microbiol 1981:13:855-8.
2. Grist NR, Emslie JAN. Infection in British clinical laboratories 1988-89. J Clin Pathol
1991;44:667-9.
3. Jacobson JT, Orlob RB, Clayton JL. Infections acquired in clinical laboratories in
Utah. J Clin Microbiol 1985;21:486-9.
4. Muller HE. Laboratory acquired mycobacterial infection. Lancet 1988;ii:331.
5. Sewell DL. Laboratory-associated infections and biosafety. Clin Microbiol Rev
1995;8:389-405.
A N E X O 2 . A N O TA C I O N E S PA R A A C O M PA Ñ A R A L G U N O S
RESULTADOS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

El laboratorio debe promover la comunicación con el clínico a través de notas en

los resultados. Aquí se muestran las más comunes.

• Urocultivo negativo con piuria. La piuria estéril sugiere infección con uso de
antibióticos. De no ser así, favor de indicárnoslo para continuar su estudio.

• Urocultivo positivo sin piuria. La ausencia de piuria pudiera indicar

bacteriuria asintomática o, más remotamente, contaminación en la toma. Si
existe duda, enviar nueva muestra sin costo para el paciente.

• Secreción con cultivo negativo y cocos en tinción. El Gram mostró cocos

que no desarrollaron en aerobiosis. Sugiere presencia de anaerobios estrictos.
Se recomienda utilizar penicilina o clindamicina.

• Secreción negativa con flora polimicrobiana en tinción. El Gram mostró

flora polimicrobiana, pero el cultivo no desarrolló en aerobiosis. Sugiere
presencia de anaerobios estrictos. Se recomienda utilizar clindamicina, o una
combinación de penicilina y metronidazol.

• Secreción con flora polimicrobiana en Gram y cultivo. Desarrollaron varios

gramnegativos y grampositivos aerobios y anaerobios. Ninguno parece más
importante que el resto, por lo que no es recomendable efectuar antibiograma.
Sugiere infección en presencia de tejido necrótico o drenaje insuficiente. Se
recomienda asociar un aminoglucósido o una cefalosporina, con clindamicina o
con metronidazol más penicilina.

• Pus estéril sin gérmenes en tinción. El cultivo negativo sugiere infección por
gérmenes no convencionales. Requerimos mayor información clínica para
continuar el estudio. Si considera que esto es necesario, favor de comunicarse
con nosotros.

• Hisopados de mala calidad. En el Gram hay escasos leucocitos y abundantes

células epiteliales. Indica muestra de calidad insuficiente para diagnóstico.

• Coprocultivo negativo con leucocitos en el fresco. La presencia de

leucocitos puede indicar diarrea invasora. Este cultivo no puede descartar la
presencia de Campylobacter, E. coli invasora o parasitosis.
• Expectoración de mala calidad. En la tinción de Gram se observaron
abundantes células epiteliales y pocos leucocitos. Existe contaminación oral,
por lo que la muestra es de insuficiente calidad para el diagnóstico. Puede
solicitarse nuevo estudio sin costo.
 GERMENES A LOS QUE NO SE EFECTUA ANTIBIOGRAMA

• Estreptococo betahemolítico (grupos A o B). No se efectuó sensibilidad

pues el fenómeno in vitro no corresponde con la respuesta clínica. Este
germen es siempre sensible a betalactámicos, eritromicina y clindamicina.

• Peptoestreptococo. No se efectuó sensibilidad pues el fenómeno in vitro no

corresponde con la respuesta clínica. Se recomienda utilizar penicilina o
clindamicina.

• Gardnerella vaginallis. No se efectuó sensibilidad pues el fenómeno in vitro

no corresponde con la respuesta clínica. Se sugiere utilizar metronidazol.

• Haemophilus influenzae. No se efectuó sensibilidad pues el fenómeno in vitro

no corresponde con la respuesta clínica. Se sugiere utilizar cefalosporina de
segunda o tercera generación, amoxicilina con clavulanato, o cloramfenicol.