PRÁCTICA 4: METABOLISMO DE METALES Y DESINTOXICACIÓN

Metalotioneinas (Gagné, 2014 p.82)

Ecotoxicología
Dra. Donaji Josefina González Mille
Judith Alejandra García Grimaldo
-octubre-2023

Introducción
La metalotioneína (MT) es una familia de proteínas de bajo peso molecular (6 kDa) ricas en
cisteína que se localizan en la membrana del aparato de Golgi. Las MT tienen la capacidad
de unirse a metales pesados tanto fisiológicos como xenobióticos a través del grupo tiol de
sus residuos de cisteína, que representan el 20-30% de sus residuos de aminoácidos
constituyentes. (Sigel et al, 2009). Es decir, la MT contiene entre 61 y 68 residuos de
aminoácidos, de los cuales entre 18 y 23 son residuos de cisteína. Los tioles intervienen en
las propiedades de unión a metales de MT (Natthiya, 2012).

En los mamíferos se expresan cuatro tipos de MT, denominados metalotioneína-1 (MT1),

metalotioneína-2 (MT2), metalotioneína-3 (MT3) y metalotioneína-4 (MT4). MT1 y MT2 se
expresan en casi todos los tejidos, mientras que MT3 y MT4 son específicas de cada tejido.
La MT interviene en la regulación de la homeostasis de los metales en los mamíferos. La
expresión de MT se inicia por la unión del factor de transcripción de metales-1 (MTF-1) a la
región reguladora del gen MT denominada elementos metal-responsivos (MREs). La
inducción de MT a través de la región MREs puede ser iniciada por varios iones metálicos
como zinc (Zn), cobre (Cu) y Cd. Sin embargo, el Zn es el único metal pesado que puede
activar de forma reversible y directa la actividad de unión al ADN del MTF-1. (Natthiya,
2012).

La falta de región hidrófoba debido a la ausencia de aminoácidos no polares le otorga

estabilidad térmica a la proteína con la ausencia de la absorbancia habitual a 280 nm para la
mayoría de las proteínas. En condiciones naturales, la MT se une a elementos esenciales
como el cobre (Cu) y el zinc (Zn). La presencia de metales tóxicos como el mercurio (Hg)
cadmio (Cd) y plata (Ag) se une fuertemente al MT y libera Zn y Cu, que, a su vez, inducen
la síntesis de novo de MT (Shariati & Shariati, 2011).
Las metalotioneínas tienen diversas preferencias de unión a metales, que se han asociado a
la especificidad funcional.

Los MT también tienen la capacidad de secuestrar especies reactivas del oxígeno, como el
óxido nítrico y los radicales hidroxilos (Katakai et al, 2011), y la proteína también es inducida
por el estrés oxidativo (Bauman et al, 1991). Durante ese proceso, un ión metálico se
intercambia con las especies reactivas de oxígeno del complejo proteico donde la toxicidad
resultante dependerá de la naturaleza del metal liberado. Por ejemplo, la liberación de Cu o
Hg es mucho más dañina que la liberación de Zn de la MT. En este contexto, la movilización
de metales se acopla al estrés oxidativo.
La forma iónica de los metales podría unirse a los sitios de unión de metales de las
proteínas y liberar elementos esenciales como el Zn 2+ y el Cu+, que podrían provocar daño
celular o activar proteínas de unión a metales como las MT. Existe un equilibrio entre la
protección a los metales y la toxicidad, que depende del tipo y la concentración de los
metales implicados. Por ejemplo, el Cu y el Cd provocan un importante estrés oxidativo y
daños en las células. y también se unen fuertemente a las MT.
Según un estudio, los MT son excelentes marcadores del estrés por metales, pero no del
estrés oxidativo (Figueira et al, 2012).

La determinación del contenido de tioles en la MT puede realizarse convenientemente

mediante espectrofotometría (Viarengo et al, 1997), lo que hace que este ensayo sea muy
accesible para muchos laboratorios, independientemente de la especie de ensayo, aunque
mucho menos sensible que el ensayo de saturación de plata. En este enfoque modificado,
las proteínas MT se reducen primero por un fuerte reductor antes del fraccionamiento
selectivo con disolventes y los pasos de precipitación con disolventes orgánicos, ya que la
MT es muy propensa a la oxidación durante el aislamiento. A continuación, la fracción de MT
aislada se trata a pH bajo en presencia de quelante y sal alta para desplazar los metales y
mantener la
apo-MT para la determinación espectrofotométrica de tioles (R-SH) utilizando el reactivo de
Ellman.

Objetivos
 Determinar la cantidad de metalotioneína en tejido a través del ensayo
espectrofotométrico
Fundamento de la técnica
La determinación espectrofotométrica de la metalotioneína (MT) es un método comúnmente
utilizado para cuantificar los niveles de MT en muestras biológicas. El método
espectrofotométrico se basa en la medición de la absorbancia de un complejo formado entre
la MT y un ion metálico, normalmente cadmio (Cd) o zinc (Zn), a una longitud de onda
específica. La concentración de MT en la muestra puede calcularse mediante la ley de Beer-
Lambert, que relaciona la absorbancia de una solución con la concentración de la especie
absorbente. Primero se debe preparar una curva estándar: Diluir una concentración conocida
de solución patrón de MT en un tampón adecuado, añadir un ion metálico, como Cd o Zn, a
las soluciones patrón para formar el complejo MT-metal, medir la absorbancia de las
soluciones patrón a la longitud de onda específica, representar gráficamente los valores de
absorbancia frente a las concentraciones de MT correspondientes para obtener una curva
estándar. Después se homogeniza la muestra biológica para disgregar las células y liberar el
MT, se centrifuga para eliminar cualquier material insoluble. En ocasiones, se utiliza un
método de precipitación de proteínas, como la precipitación con ácido tricloroacético (TCA),
para eliminar las proteínas que puedan interferir con la medición de MT. Se procede a medir
la absorbancia de la muestra con un tampón adecuado y un ion metálico, como Cd o Zn,
agregados a la muestra para formar el complejo MT-metal, se incuba la muestra durante un
tiempo determinado para permitir la formación del complejo. Y se mide la absorbancia de la
muestra a la longitud de onda específica utilizando un espectrofotómetro. Finalmente se
calcula la concentración de MT utilizando la curva estándar para determinar la concentración
de MT en la muestra basándose en su absorbancia. (Zorita et al, 2005; Li et al, 2021)

Material
 Agitadores magnéticos
 Cubrebocas
 Guantes de nitrilo
 Matraces
 Micropipetas
 Papel absorbente
 Vasos de precipitado
 Microtubos eppendorf
 Microplacas de 96 pocillos

Reactivos
 Tris-acetato-NaCl-Buffer
 Solución de stock de Ellman
 Reactivo de Ellman
 Reactivo de fosfina
 Estándar de GSH
 Etanol al 8% - cloroformo
 Etanol-87% / cloroformo 1%
 Solución de NaCl-EDTA
 Solución de ARN
 Solución de HCl 6N
 Solución de HCl 0.1 M
Equipo
 Balanza analítica
 Campana de extracción
 Cronómetro
 Placa de agitación
 Espectrofotómetro UV-visible
 Centrífuga
 Vórtex
Preparación de soluciones.
 Tris-acetato-NaCl buffer:
 o Disolver 12.11 g Tris base (100 mM) y 116.88 g NaCl (2 M) en 900 mL agua SQ.
Ajustar el pH a 8.2 con ácido acético al 20% y aforar a 1 L con agua SQ.
moles de soluto g
M= ; moles= ;
litros solución PM
PM (Tris base)=4 ( )
12 g
mol
( C )+11 1 ( g
mol )
( H ) +14
g
mol (
( N )+ 3 16
g
)
mol
( O )=121
g
mol

M=
g
PM . L
→ g=M . PM . L=( 100 mM ) 121.136 ( g
mol ) ( 0.2 L )=2.4227 g
g g g
PM ( NaCl)=22.99 ( Na ) +35.45 Cl=58.44
mol mol mol
M=
g
PM . L
→ g=M . PM . L=( 2 M ) 58.44 ( g
mol ) (0.2 L)=23.376 g
 Ácido acético al 20% en agua desionizada:
25 ml de ácido acético x ( 25 ml ) ( 0.20 )
25 ml corresponden al100 %∴ = → x=
100 % 20 % 1
x=5 ml
 Solución de stock de Ellman:
o Se prepara una solución de stock de 5 mM de ácido 5,5′-ditiobis(2-
nitrobenzoico) (DTNB- C14H8N2O8S2) en Tris-acetato de 200 mM, pH 8.2,
conteniendo 0.1 mM de EDTA. Un stock de 100 ml se prepara como sigue:
2.422 g de Tris-base y 4.5 mg de EDTA se disuelven en 80 mL de agua
desionizada y el pH se ajusta a 8.2 con ácido acético al 20%. Disolver 0.2 g de
DTNB y aforar a 100 mL con agua desionizada. Almacenar a 4°C en la
oscuridad por 2 meses.
PM (Tris base)=4
12 g
mol ( )( C )+11 1 (g
mol )
( H ) +14
g
mol (
( N )+ 3 16 )
mol
g
( O )=121
g
mol
M=
g
PM . L (
→ g=M . PM . L=( 200 mM ) 121.136) mol
g
( 50 mL )=1.2115 g

PM ( EDTA)=10 12.011( g
mol ) (
( C )+14 1.00784 ) (g
mol ) (
( H )+ 2 14.0067
g
mol
( N ) +2 22.989769
g
)
mol (
( Na ) +8 15

M=
g
PM . L
→ g=M . PM . L=( 0.1 mM ) 372.24 ( ) g
mol
(50 mL)=1.8612 mg -> se usaron 2.25 g

PM ( DTNB )=14
12 g
mol( )
(C)+8 1 (g
mol ) ( ) ( ) (
( H ) +2 14
g
mol )
N + 8 16
g
mol
( O ) +2 32.065
g
mol
S=396.34
g
mol

M=
g
PM . L (
→ g=M . PM . L=( 5 mM ) 396.34 ) g
mol
( 50 mL )=0.0991 g 0.1 g

 Reactivo de Ellman: (al 8% a partir del stock de Ellman en 40 ml Tris-NaCl buffer)

o Diluir 3.2 mL del stock de Ellman con 36.8 mL de Tris-acetato-NaCl buffer.
Mantener fuera de la luz, preparar una hora antes de su uso.
 40 ml x ( 40 ml )( 0.08 )
40 ml corresponden al 100 %∴ = → x=
100 % 8 % 1
x=3.2 ml de lasolucion de stock de Ellman y aforar con Tris−Nacl buffer hastalos 40 mL

 Reactivo de fosfina: hecho

o Diluir la solución madre de fosfina (Tris(2-carboxietil) fosfina) (TCEP) (0,5 M)
1/10 en tampón Tris-acetato-NaCl para obtener una concentración final de 50
mM. Proteger de la luz.
10 ml x ( 10 ml ) ( 0.1 )
10 ml corresponden al100 % ∴ = → x= =1 ml
100 % 10 % 1
 Estándar GSH (1 mM):
o 3 mg de GSH en 10 mL de HCl (0,1 M). Estable durante una semana, proteger
de la luz.
moles de soluto g
M= ; moles= ;
litros solución PM

(
PM (GSH )=10 12.011
mol
g
) (
C+17 1.0078
g
mol ) ( H +3 14.007
g
mol) ( N + 6 15.999 ) ( g
mol
O+ 32.065 )g
mol
S=3

M=
g
PM . L (
→ g=M . PM . L=( 1 mM ) 307.33 )g
mol
( 10 mL )=3.0733 mg

 Etanol-8% cloroformo: Mezclar 46 mL de etanol al 95% con 4 mL de cloroformo

en una campana extractora
50 ml x
50 ml corresponden al100 % ∴ = →
100 % 8 %
( 50 ml ) ( 0.08 )
x= =4 ml de cloroformo y aforar con etanol a los 50 mL
1
 Etanol 87% y cloroformo 1%:
o Mezclar 43,5 mL de etanol 95% con 0,5 mL de cloroformo y 6 mL de agua SQ.
50 ml x ( 50 ml ) ( 0.87 )
50 ml corresponden al100 % ∴ = → x= =43.5 ml de etanol
100 % 87 % 1
50 ml x ( 50 ml ) ( 0.01 )
= → x= =0.5 ml de etanol cloroformo
100 % 1 % 1
Aforar a 6 ml con agua DI: 43.5+0.5= 44ml  50ml-44ml=6 ml de agua DI

 Solución de NaCl-EDTA:
o Disolver 1.46 g de NaCl (0.25 M) y 0.18 g EDTA (5mM) en 10 mL de agua.
g g g
PM ( NaCl)=22.99 ( Na ) +35.45 Cl=58.44
mol mol mol
M=
g
PM . L
→ g=M . PM . L=( 0.25 M ) 58.44
g
mol ( )
( 50 mL )=7.3 g
 (
PM ( EDTA)=10 12.011
g
mol )
( C )+14 1.00784
g
mol (
( H )+ 2 14.0067 ) g
mol ( ) (
( N ) +2 22.989769
g
mol ) (
( Na ) +8 15

M=
g
PM . L
→ g=M . PM . L=( 5 mM ) 372.24
g
mol ( )
( 50 mL )=0.931 g

 Solución de ARN:
o Disolver 50 mg de ARN total en 50 mL de NaCl-EDTA prediluido 1/5 (20%) con agua
SQ. La muestra puede calentarse a 6070 C para para facilitar la disolución.
50 ml x ( 50 ml ) ( 0.2 )
50 ml corresponden al100 % ∴ = → x= =10 ml de NaCl−EDTA
100 % 20 % 1
y aforar a 50 ml con 40 ml de agua SQ

 Solución de HCl:
o Pipetear en campana de humos con guantes 5 mL de HCl concentrado en 10 mL de
agua SQ (concentración final 6 N).
Normalidad del HCl concentrado (37-38% de peso):
Por cada 37g de HCl hay 100 g de agua
PM=1 g/mol H + 35.5 g/mol Cl=36.5 g/mol
Densidad al 36-37%= 1.19 g/ml
Considerar 1000 ml para la molaridad

1000 ml ( 1.19ml g )( 10037 gg HCl )( 1 mol

Agua 36.5 g
HCl)=12.06 mol HCl=M

moles masa masa

M= , moles= → M=
V PM PM .V
°
n eq ° masa PM
N= ; n eq= ; eq= +¿
V eq H H +¿
¿ H +¿ → n°eq =masa∗¿ → N =masa∗¿ ¿¿ ¿
PM PM∗V
+¿=1entonces M =N ;
Si H N=M =12 mol=12 N
¿

C 1 V 1 (6 N ) ( 10 x 10−3 L )
V 2= = =5 mL HCl
C2 12 N

 Solución HCL 0.1 molar: en 50 ml:

moles masa masa
M=, moles= → M=
V PM V ∗PM
g g
masa=M∗V∗PM =0.1 ∗50 ml∗36.5 =0.1825 g
mol mol
m m ( 0.1825 )
ρ= → V = = =0.15336 ml al37 %
V ρ 1.19 g
ml
 x 0.15336 ml
= → x=0.4145 ml=415 µL
100 % 37 %

Procedimiento
 Los tejidos se homogeneizan con un aparato triturador de tejidos con mortero de teflón
en 23 volúmenes de solución salina de 140 mM NaCl tamponada con 10 mM Tris-
acetato, pH 7,5, conteniendo 0,55 mM DTT o 110 mM β-mercaptoetanol y 1 μg/mL
apoproteína o 1 mM PMSF como inhibidor de la proteasa. A continuación, se
centrifuga el homogeneizado a 15 000 x g durante 30 min a 24°C y se recoge el
sobrenadante (S15).
 Se toman 200 µL de muestra S15 y se coloca en tubos eppendorf, se añaden 50 µL de
fosfina 50 mM, se deja en el vórtex 1 min. Tomar 15 min de espera. Añadir 250 µL de
etanol-cloroformo (92:8), pasar por el vórtex 1 min y centrifugar a 6000 rpm por 10 min
a 4°C
 De lo anterior se toman 400 µL del sobrenadante y se colocan en otro tubo eppendorf,
se añade 50 µL de ARN (el ARN se añade como portador para coprecipitar con la MT)
y 10 µL de HCl 6N (la adición de HCl disminuye el pH para liberar los metales de la
MT), se pasa al vórtex 1 min, se añade 1 mL de etanol-cloroformo 87:1 se coloca en el
vórtex por 1 min. Se centrifuga de nuevo a 6000 rpm por 10 min a 4°C
 El sobrenadante se desecha con ayuda de una micropipeta y se lava el sedimento
(pellet) con 500 µL de etanol cloroformo 87:1, se pasa al vórtex 1 min para desprender
el pellet. Y se vuelve a centrifugar a 6000 rpm por 10 min a 4°C. El sobrenadante de
esto se desecha.
 El precipitado se resuspende en 150 μL de NaCl 0,25 M y 4 mM de EDTA (pasando
por vórtex 1 min y centrifugando a las mismas condiciones)
 El día siguiente para continuar la práctica se pasaron las muestras por el vórtex 1 min.
Se colocaron 70 μL de muestra en la microplaca por duplicado, se agregaron 70 μL de
NaCl-EDTA y 70 μL de estándar GSH, dejando un blanco por triplicado con NaCl-
EDTA y el estándar GSH también por triplicado.
 Finalmente se colocaron 30 μL de HCl 0.1 M se mete al equipo “Synergy” y se
programa de forma tal que agita por 40 s, espera 5 min y sale la microplaca para
añadir 30 μL de la solución de Tris-acetato-NaCl, se vuelve a introducir la placa al
equipo, agita por otros 40 s y espera otros 5 min. Y finalmente cuando vuelve a
expulsar la microplaca se añaden 200 μL del reactivo de Ellman a cada pocillo, vuelve
a agitar por 40 s y comienza la lectura de una sola medición a 412 nm.
 Se mide la absorbancia frente a una concentración estándar de glutatión reducido (10
nmol/mL o 20 nmol/mL) a 412 nm. El blanco contiene sólo 130 μL de solución
compuesta de NaCl 0,25 M-4 mM EDTA, HCl y tampón Tris-acetato como se ha
descrito anteriormente.
Cálculo de resultados
  Contenido de tiol reducido nmol/L= [Muestra A-Blanco A]*[Concentración de GSH
(nmol / mL) / Estándar A-blanco]*factor de dilución.
 El factor de dilución es calculado como sigue: (500/200 μL S15) * (400 μL / 150 μL) *
(330 μL / 70 μL) = 31.4.
 La cantidad relativa de MT podría ser calculada si el número de moléculas de cisteína
fuera conocido para las especies de prueba dadas. La secuencia de amino para MTs
podría ser encontrado a través de PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?
cmd5search&db5PubMed). Por ejemplo MT en ratas contiene 19 cisteínas por MT: MT
nmol/mL= contenido de tiol reducido/19.
 Los datos se expresan generalmente como nmol de tiol/mL cuando esta razón es
desconocida para las especies de prueba dadas. Sin embargo, en la metodlogia
original, alrededor del 70% de tiol reducido reacciona con el reactivo de Ellman,
mientras el 30% de tiol restante no fue detectado por esta metodología. Además, los
valores de MT podrían estar subestimados por un factor del 30% con este ensayo.
 La cantidad de glutatión reducido equivalente es entonces normalizada contra el total
de proteínas en el S15 (mg/mL) o el peso del tejido (g/mL) para dar nmol de tioles/mg
de proteínas o nmol de tioles/g de tejido

Resultados y conclusiones
El orden en la microplaca de las muestras quedo como se muestra a continuación:

Tabla 1. Orden de muestras en la microplaca

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A BLANCO BLANCO BLANCO STD STD STD J136 J136 J47 J47 P02 P02
B P028 P028 F142 F142 F50 F50 GC2 GC2 GC1 GC1 K149 K149
C K108 K108
D
E
F
G
H

Se utilizó la siguiente ecuación para la cuantificación de tiol reducido:

( )
nmol
concentracion de GSH
nmol mL
Contenido de tiol reducido =( muestra−blanco ) ( FD)
L estandar−blanco

(
Donde FD es el factor de dilución calculado como :
500 μL
)( )(
400 μL 330 μL
200 μL S 15 150 μL 70 μL )
=31.4
Y la concentración de GSH = 20 nmol/mL

Tabla 2. Tabla de resultados: cantidad de tiol reducido en las muestras S15

MUESTRA ABS CONTENIDO DE

TIOL REDUCIDO
 (nmol/mL)
BLANCO 0.165 0
ESTANDAR GSH 1.508 628.571429
J136 0.222 26.678013
J47 0.235 32.7624721
P02 0.261 44.9313903
P028 0.329 76.7577917
F142 0.254 41.6551431
F50 0.244 36.9747899
GC2 0.287 57.1003085
GC1 0.287 57.1003085
K149 0.283 55.2281672
K108 0.254 41.6551431

Con este ensayo se puede observar que la muestra S15 está expuesta a metales ya que el
contenido de tiol reducido indica que, a través de este grupo, las metalotioneínas están
uniéndose a metales pesados ocasionando estrés. La muestra P028 presenta el mayor
contenido de tiol r. lo que indica que es la que más exposición a metales tiene o las
vulnerable a estos. La muestra J136 presenta la menor cantidad de tiol r. indicando que es la
que sufre de menor estrés por metales. Sería conveniente realizar el mismo estudio en un
grupo control para inferir efectivamente que el lugar de donde proviene esta muestra se
encuentra contaminado por metales pesados.

Bibliografía

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