Microbiologia Manual

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INSTITUTO TECNOLGICO DE ORIZABA

Laboratorio de Ingeniera Ambiental
MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO MICROBIOLOGA AMBIENTAL
Miguel ngel Rendn Sagardi Ingeniera Qumica
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL
MANUAL DE PRCTICAS ELABORADO Y REVISADO POR:
M.C. GUSTAVO ADOLFO MIRANDA ROSAS M.C. RAL PREZ VILA
PERTENECIENTES AL DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA Y BIOQUMICA DEL INSTITUTO TECNOLGICO DE ORIZABA
DATOS GENERALES
NOMBRE DE LA MATERIA: MICROBIOLOGA AMBIENTAL
SEMESTRE: SEXTO
NOMBRE DEL MAESTRO TITULAR: M.C. RAL RREZ VILA
NOMBRE DEL ALUMNO: MIGUEL NGEL RENDN SAGARDI
NO. DE CONTROL: 07010179
EQUIPO: 2
CALIFICACIN FINAL:
_____________________________________
NDICE DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL
1. CONTINGENCIA AMBIETAL 2. MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO 3. MORFOLOGA COLONIAL Y TINCIN DE GRAM 4. MEDIOS DE CULTIVO 5. CULTIVO DE BACTERIAS Y DILUCIONES 6. MTODOS DE ESTERILIZACIN 7. DETERMINACIN DE LA CALIDAD DEL AGUA USANDO EL MTODO DEL NMERO MS PROBABLE
8. AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS POR MTODOS DIRECTOS
9. CINTICA DE FERMENTACIN
10. FLUCTUACIN DE MICROORGANISMOS EN LA ATMSFERA
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INSTITUTO TECNOLGICO DE ORIZABA REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE INGENIERA AMBIENTAL
ASISTENCIA AL LABORATORIO
La asistencia al laboratorio ser de acuerdo al horario y calendario de prcticas programadas. Se considerar retardo si el alumno se presenta a realizar su prctica de 10 a 15 minutos despus de la hora establecida. Pasado ese tiempo no se admitir a ningn alumno dndose por vista la prctica. No se podr abandonar el laboratorio sin la autorizacin del maestro, mientras dure la prctica. Es obligatorio el uso de bata blanca en el laboratorio y los implementos necesarios de proteccin personal. Cuando por mala fe, negligencia o descuido, desperdicien sustancias, destruyan o maltraten material, instrumentos, equipo o instalaciones; los responsables debern pagar por el dao ocasionado o reponer los aparatos o equipo daado.
REPORTE DE PRCTICAS
Cada alumno debe tener una libreta (engrapada o cosida, no de espiral) tamao esquela (de 10 por 15 cm.) en donde har sus anotaciones personales de recorrido de campo y dentro del laboratorio. El recorrido de campo lo avalar el profesor que hizo el recorrido anotando fecha y firma. El alumno una vez concluidos los anlisis de cada prctica anotar en la hoja del formato oficial, nicamente resultados y observaciones personales. Si el trabajo fue en equipo (o personal en equipo) se reportarn los resultados del equipo y cada uno anotar los resultados obtenidos personalmente.
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Al final del periodo el alumno entregar su libreta y sus hojas de reporte para evaluar su desempeo y acreditar la calificacin del laboratorio que ser reportada al maestro de teora. La calificacin del laboratorio se acreditar cuando el alumno no tenga adeudos de material, libros, revistas, tesis, reportes (de equipo y personales) Mantener limpia y ordenada El rea de trabajo permanentemente. No arrojar residuos slidos a los lavabos, tarjas o sumideros. Estrictamente prohibido ingerir alimentos dentro del laboratorio. No se permiten bromas, peleas o juegos, as como vocabulario soez dentro del laboratorio. Al o los alumnos que se les sorprenda realizando lo anterior se les retirar de la prctica y cuando el caso lo amerite podr cancelarse su derecho de asistencia al laboratorio. Al terminar el experimento limpie muy bien el material del equipo y mesa de trabajo. Entregue al maestro las sustancias sobrantes, no las tire. Toda el agua que se genere al realizar la prctica ser depositada en un lugar especial (cubeta de residuos) para su tratamiento y disposicin final, as como los medios de cultivo. El alumno se enterar de los dispositivos de seguridad del laboratorio y en caso de contingencia dar la voz de aviso inmediatamente. En caso de siniestro siga las instrucciones del encargado del laboratorio, guarde la calma. Ayude a sus compaeros de ser necesario y siga la ruta de evacuacin.
LABORATORIO DE INGENIERA AMBIENTAL ENERO 1998
PRLOGO
Integrar en un solo manual de prcticas de laboratorio los conocimientos bsicos de la microbiologa general y de la microbiologa ambiental supone ser muy ambicioso, sin embargo, se ha querido dar al estudiante en ste manual de prcticas un compendio de instrucciones claras y precisas que le permitan introducirse en los aspectos completamente bsicos de la microbiologa, hasta la microbiologa aplicada, con la finalidad de entender algunos procesos ambientales como las relaciones de los microorganismos con el ambiente en el que se desarrollan o la biodegradacin de contaminantes. En particular, se pretende que quien termina este curso con xito (tericoprctico), tenga los elementos necesarios de los procedimientos y habilidades que les permitan manipular los materiales y microorganismos con rapidez, seguridad, precisin y limpieza. Todo esto, con objeto de poderlos encontrar, observar, describir, distinguir y caracterizar en su ambiente, con lo cual se estar en condiciones de controlarlos, estudiarlos y, hasta cierto punto, utilizarlos para un proceso de inters. Es importante tener en cuenta que dada la amplitud de actividades que se abarcan en algunas prcticas, no todos los ejercicios aqu planteados se pueden realizar dentro del tiempo normalmente disponible por sesin, es decir, algunos de los ejercicios requieren de ms tiempo que el asignado en cada sesin. Por lo anterior, algunas experiencias se realizarn en tiempos extras y no necesariamente cuando lo indique el calendario. El orden en que se presentan las prcticas no necesariamente ser el que se siga durante el desarrollo del curso. Los cultivos microbianos sealados en cada prctica pueden ser sustituidos segn el criterio del profesor y la disponibilidad de las cepas que en algunos casos no es posible conservar y se deben obtener directamente del suelo, agua, clnicas u hospitales, instituciones de investigacin, etc. De tal manera que muchos de los experimentos que se creen que se obtendrn resultados aparentemente obvios no necesariamente correspondern con el resultado deseado. Se puede concluir de lo anterior que el trabajar con seres vivos, es trabajar con entidades variables. Al final se incluye un apndice con algunas tcnicas, frmulas de algunos medios de cultivos, reactivos y colorantes empleados en las prcticas.
10 REGLAMENTO DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE INGENIERA AMBIENTAL
Tomando en consideracin que se trabaja bsicamente con microorganismos y estos pueden ser patgenos reconocidos o potenciales, se debern seguir estrictamente las indicaciones de este reglamento. No se debe menospreciar el riesgo a la salud que representan muchas de las sustancias que se emplean ni las preocupaciones en el uso de mecheros de gas debiendo dar aviso de inmediato en el caso de fugas o derrames. 1. La hora de entrada debe cumplirse puntualmente. No se permitir el acceso al laboratorio a quien llegue con retraso. 2. Entrar al laboratorio con la bata puesta y abotonada. Solo podr quitrsela al salir de ste. 3. No se permitir la entrada a personas ajenas al laboratorio. 4. Recogerse el cabello antes de entrar al laboratorio. 5. La puerta del laboratorio deber mantenerse en lo posible siempre cerrada. 6. Limpiar la mesa de trabajo con una solucin germicida antes de empezar y al terminar el trabajo. 7. Colocar todos los objetos personales en los lugares asignados para ello. Dejar fuera solamente el material que se va a utilizar. 8. Abstenerse de comer, fumar, beber, aplicarse maquillaje e introducirse objetos a la boca. 9. No se debe pasear entre las mesas de laboratorio. Si fuera posible, el trabajo debe realizarse sentado. 10. Hablar solo lo necesario. 11. Leer cuidadosamente el instructivo antes de empezar la prctica y seguir las instrucciones del profesor. Si no entiende, pregunte. 12. Informar al profesor sobre cualquier accidente que ocurra. 13. Depositar en los botes de basura todo el material de desecho no contaminado, como papel, algodn, cerillos, etc. 14. No debe lavarse material de ningn tipo durante la sesin prctica. 15. Al finalizar cada sesin, colocar el material debidamente separado en los lugares asignados para ello: material contaminado para esterilizar, sin etiquetas; material sucio para lavar; material para incubar; y reactivos debidamente cerrados y ordenados. 16. El material para incubar debe llevar la siguiente identificacin: grupo, equipo, nombre del alumno, fecha y nombre del microorganismo o experimento. 17. Lavarse meticulosamente las manos antes de salir del laboratorio. 18. En caso de emergencia, inmediatamente cerrar la llave de gas ya apagar cualquier aparato con el que se est trabajando. De manera ordenada y rpida salir del laboratorio. RECUERDE: NO CORRO, NO GRITO, NO EMPUJO.
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OBJETIVOS GENERALES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL
1. Aprender el vocabulario y los conceptos tericos y experimentales que permitan conocer la naturaleza y diversidad de los microorganismos y el lugar que ocupan entre los seres vivos. 2. Reconocer las interrelaciones que se presentan entre los microorganismos y el ambiente. 3. Reconocer la importancia de los microorganismos como modelos de investigacin cientfica. 4. Utilizar adecuadamente las tcnicas microbiolgicas que permitan manipular los microorganismos para su aislamiento, estudio de las caractersticas fisiolgicas de cultivo, identificacin y clasificacin, seleccin, modificacin, propagacin, utilizacin y control. 5. Integrar las funciones generales de los microorganismos en los diferentes ecosistemas.
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Practica No. 1 Miguel ngel Rendn Sagardi M.C. Ral Prez vila
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CONTINGENCIA AMBIETAL PRCTICA No. 1 OBJETIVO: Contribuir a la instrumentacin de una tarea eficiente y segura en el mbito del Laboratorio de Microbiologa Ambiental, mediante procedimientos que prevengan, protejan y/o eliminen los riesgos fsicos, qumicos y biolgicos. FUNDAMENTOS TERICOS: RIESGOS QUIMICOS Todo producto qumico es un contaminante txico potencial que puede comportar riesgos por s mismo o producir reacciones ms peligrosas en contacto con otros. Todos los docentes involucrados en el dictado de los trabajos prcticos de materias que utilicen productos qumicos deben conocer sus propiedades fsico-qumicas, los efectos que producen sobre la salud y la forma de disminuir su incidencia nociva. FECHA DE REALIZACIN: 01 de septiembre de 2009
Envases Los reactivos debern estar contenidos en recipientes de tamao adecuado para facilitar su uso, evitar el trasvase y traslado de un lugar al otro del laboratorio. El envase deber ser acorde al producto a contener y a las cantidades que se deben dispensar. Deber tenerse en cuenta el posible efecto corrosivo que las sustancias qumicas y agentes fsicos (temperatura, radiacin solar) puedan tener sobre el material del envase. Los envases plsticos deben ser revisados con frecuencia. Los recipientes de pequea capacidad que contengan sustancias corrosivas (cidos y lcalis) debern ubicarse separados entre s y sobre bandejas de polietileno de alta densidad o policarbonato segn su compatibilidad para retener derrames (rotura, volcado). Los recipientes de vidrio se utilizarn slo para guardar pequeas cantidades de productos. Los envases de vidrio deben transportarse protegidos (ver transporte) y las botellas de dos litros deben disponer de un asa que facilite su manejo.
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Cada reactivo debe estar identificado correctamente mediante etiquetas normalizadas. Las sustancias qumicas se catalogarn y reconocern por medio de colores de acuerdo a su peligrosidad.
Desechos generados En el laboratorio debe existir un contenedor especial para vidrios rotos, material para adsorber derrames (tierra de diatomeas, arena, etc.) e implementos de limpieza para recolectar desperdicios en caso de rotura de material. Los residuos debern ser separados y envasados en recipientes adecuados de vidrio, plstico o bolsas plsticas, perfectamente identificados y rotulados.
RIESGOS BIOLOGICOS Los agentes biolgicos son todos aquellos microorganismos, con inclusin de los genticamente modificados, cultivos celulares y endoparsitos humanos, susceptibles de originar algn tipo de infeccin, alergia o intoxicacin, con lo cual todo material de origen biolgico es un contaminante txico potencial que puede comportar riesgos por s mismo. El laboratorio de Microbiologa Ambiental se encuentra ligado a estos riesgos, y es por esto que: Todo el personal docente debe conocer el nivel de riesgo que implica la manipulacin de microorganismos, vectores, hongos, parsitos, animales, sangre, suero, plasma, antisueros, etc. o cualquier agente modificado genticamente o proveniente de seres vivos, as como las posibles rutas de penetracin, infeccin o transmisin. El docente a cargo de los turnos de trabajos prcticos debe restringir el ingreso al laboratorio slo a aquellas personas cuyas tareas lo justifiquen, quienes debern estar informadas y capacitadas convenientemente. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de la zona de trabajo que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes.
TRABAJOS PRCTICOS CON MATERIALES BIOLGICOS En la entrada de todos los laboratorios debe existir informacin sobre el nivel de seguridad con el que se trabaja. Nivel de Seguridad I: Agente no patgeno. Utilizable para prcticas microbiolgicas estndar. Slo este nivel de riesgo est permitido para los laboratorios de enseanza de grado.
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Nivel de Seguridad II: Agente patgeno que puede provocar enfermedades en humanos o animales pero tiene pocas probabilidades de producir riesgo grave para el personal o su entorno. Riesgo individual moderado y comunitario limitado. Nivel de Seguridad III: Agente patgeno que suele ocasionar enfermedades humanas graves pero no se propaga de una persona a otra. Riesgo individual elevado o comunitario escaso (por ejemplo, aerosoles o transmisin por aire). Nivel de Seguridad IV: Riesgo individual y comunitario elevados. Agentes patgenos que suelen ocasionar enfermedades graves o mortales y que puede propagarse fcilmente (epidemias).
En aquellos laboratorios en que se desarrollen actividades con microorganismos que no pertenezcan al Grupo I, se debe exponer en la puerta el smbolo de Riesgo Biolgico durante el tiempo en que se realicen las tareas, informar la especie con la que se trabaja, el nombre y forma de ubicar al profesional responsable en caso de accidente y los requerimientos que deben cumplir las personas que ingresen al laboratorio. Las siguientes medidas de contencin primaria son necesarias para prevenir el escape de agentes infecciosos en el ambiente del laboratorio y proteger a las personas. Barrera 1: est dispuesta alrededor del microorganismo e incluye las buenas prcticas microbiolgicas, as como cualquier equipo diseado para prevenir la diseminacin de los agentes infectivos por aerosol o aire. Por ejemplo, para el Nivel de Seguridad I puede alcanzar con un mechero; para los otros niveles es necesario una cabina. Barrera 2: est dispuesta alrededor del trabajador e incluye ropa protectora (delantales, guantes, barbijos, zapatos cerrados, etc.) as como medidas de higiene y supervisin mdica. El uso de mscaras protectoras para ojos, nariz o boca est recomendado para el manejo de microorganismos peligrosos o manipulaciones de otros agentes biolgicos que puedan conducir a la formacin de aerosoles y especialmente en caso de trabajar con hongos. El derrame o cada de muestras contaminadas, diluciones y medios sembrados o inoculados ser informada al docente de inmediato. Se proceder a tratar el rea afectada con solucin desinfectante que corresponda, la cual se dejar actuar y se recoger con papel absorbente que ser luego autoclavado. Se tomarn las precauciones debidas para cada desinfectante. Una vez limpia, la zona ser tratada nuevamente con desinfectante.
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En caso de rotura del recipiente de vidrio que contiene microorganismos, proceder de igual forma pero no tocar los residuos antes de que el desinfectante hubiera actuado. El almacenamiento de recipientes con cualquier material biolgico debe efectuarse en cuartos, heladeras, congeladoras, etc., perfectamente identificados y etiquetados y bajo la responsabilidad del docente a cargo del laboratorio. Los docentes debern estar entrenados en el manejo correcto de cada instrumento: fuentes de poder, autoclaves, centrfugas refrigeradas, espectrofotmetros, estufas, microscopios, baos termostatizados, termocicladores, hornos de hibridacin, etc. El rea de trabajo debe estar limpia, ordenada sin libros, abrigos o bolsas sobre las mesadas trabajo. a) Siempre desinfectar y ordenar la zona de trabajo antes de comenzar, al terminar o si se hace un intervalo. Lavarse las manos meticulosamente cada vez que deje de trabajar y secarse con papel descartable. Los jefes de trabajos prcticos y coordinadores debern implementar que las manipulaciones ms riesgosas, como el trasvasamiento de cultivos, sean realizados por los docentes en zonas aptas para esa tarea.
Tratamiento y disposicin de los desechos generados Todos los cultivos se autoclavarn antes de su disposicin final y los residuos generados se tratarn como residuos domiciliarios. Se tomarn los recaudos necesarios para que los recipientes individuales estn contenidos en otros de mayor capacidad para prevenir la diseminacin de material orgnico dentro del autoclave en situaciones de dao o derrame. En caso de trabajar con hongos toxicognicos, los cultivos se inactivarn y se proceder como en el punto anterior. Las pipetas usadas, portaobjetos y otros elementos abiertos debern colocarse en un recipiente con solucin desinfectante para su posterior descontaminacin y lavado o descarte. Est terminantemente prohibido verter muestras o cultivos en las piletas. Todos los elementos corto punzantes utilizados sern desechados en descartadores apropiados (recipientes rgidos que no permitan su apertura).
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No est permitido encapuchar las agujas antes de ser desechadas. Los restos recipientes de vidrio rotos, una vez desinfectados, debern ser envueltos en papel grueso, cudruplo y colocado en caja de cartn, asegurndose de que no queden bordes y aristas potencialmente cortantes. En el laboratorio debe existir un contenedor especial para vidrios rotos, material para recoger derrames (tierra de diatomeas, arena, etc.) e implementos de limpieza para recolectar desperdicios en caso de rotura de material.
BUENAS PRCTICAS Las buenas prcticas incluyen reglas, recomendaciones o prohibiciones relacionadas con el conocimiento, el sentido comn y la solidaridad en el ambiente de trabajo. No se permitir comer, beber, fumar o maquillarse en el laboratorio. Se deber usar vestimenta adecuada (guardapolvos que cubran la ropa de calle, preferentemente de algodn y mangas largas que no ser utilizado fuera del laboratorio, zapatos cerrados). No est permitido pipetear con la boca.
CONTINGENCIA O EMERGENCIAS Los planes de contingencia que permitan contener derrames o fugas, sismos, incendios, accidentes, deben ser conocidos por todo el personal docente, comunicados a los alumnos al inicio del ciclo lectivo y cumplido estrictamente. Los alumnos y docentes deben estar familiarizados con los elementos de seguridad disponibles, salidas, extintores, duchas, lavaojos; adems de contar el equipo de proteccin personal.
El rea de trabajo debe estar limpia y ordenada. No deben colocarse libros, abrigos o bolsas sobre las mesadas de trabajo. Toda herida o abrasin, an los pequeos cortes que puedan producirse durante el trabajo prctico deben ser informados obligatoriamente al docente.
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MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO PRCTICA No. 2 OBJETIVO: El alumno conocer las partes del microscopio de campo luminoso, su funcionamiento y cuidados para conservarlo en las mejores condiciones de trabajo y as lograr buenas observaciones utilizando los diferentes objetivos. FUNDAMENTOS TERICOS: Una de las herramientas ms tiles e importantes en microbiologa es el microscopio. Todas las formas vivientes con las que se experimentan en Microbiologa son prcticamente invisibles a simple vista y es esencial estar plenamente familiarizado con el Microscopio al empezar cualquier curso de Microbiologa. Desde el punto de vista ptico, se reconocen dos tipos de microscopios: el que solamente usa una lente, tambin llamada lupa, que es el microscopio simple y el que se usa por lo menos dos lentes, microscopio compuesto, en el cual la imagen producida por la primera lente o sistema de lentes (objetivo) es ampliada por la segunda lente o sistema de lente (ocular)
AUMENTO MAXIMO UTIL (x) 1500 1500 2500 LIMITE DE RESOLUCIO N (nm) 100-200 100-200 100
FECHA DE REALIZACIN: 08 de septiembre de 2009
TIPO DE MICROSCOPIO
APLICACIN EN MICROBIOLOGA
Campo luminoso Campo oscuro Ultravioleta LUZ Fluorescencia Contraste de fases Con focal Barrido ELECTRONICO Transmisin EFECTO TUNEL
Muy usado con objetos teidos. Para microorganismos vivos o difciles de teir. Para obtener mayor aumento y resolucin que en campo luminoso. Para objetos con fluorescencia natural o por tincin; muy til en identificacin. Para ver estructuras de microorganismos vicos, sin teir. Permite estructuras superficiales con una imagen tridimensional. Permite ver imgenes en dos y tres dimensiones. Para observar organelos y ultra estructuras de microorganismos. Observacin de macromolculas o tomos.
1500 1500 1500 15000-100000 6000-400000 1000000100000000
100-200 100-200 100-200 1 a 10 1 <0.1 a 1
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Partes de un microscopio compuesto de campo brillante: Sistema Funcin Fuente de luz Selecciona la longitud de onda de la luz. Recoge la luz de la lmpara y la concentra en Condensador el objeto. Regula la cantidad de luz que sale de la Diafragma de campo lmpara. Regula la luz del condensador y permite Diafragma de condensador contrastar el objeto. Sistema de lentes de aumento. Pueden ser Objetivos secos o de inmersin en aceite. Conjunto de lentes de aumento que Ocular colectan, enfocan y envan la luz al ojo donde se forma la imagen virtual. Tornillos micromtricos Acerca o aleja rpidamente o lentamente el objeto y el sistema ptico. y macromtricos Revolver Sostiene y permite el cambio de los objetivos. Platina Sostiene la preparacin o portaobjetos. Pie y brazo Sostiene la parte ptica. Parte Lmpara Filtro
Iluminacin
ptica
Ajuste Soporte
CUIDADOS DEL MICROSCOPIO: 1. Transportar el microscopio en forma vertical, tomndolo del brazo con la mano y de la base con la otra. 2. Colocar cuidadosamente microscopio en la mesa. Es conveniente asegurar que no exista vibraciones o aparatos que la provoquen (vrtex, agitadoras, etc.) en la mesa donde se coloquen. 3. Limpiar el soporte metlico del microscopio con una tela que no deje pelusa y la parte exterior del sistema ptico con papel seda. Si las lentes se encuentran demasiado sucias pueden limpiarse con un hisopo de algodn impregnado con agua. En caso extremo acudir a un experto. JAMAS LIMPIAR LAS LENTES CON SOLVENTES ORGNICOS. 4. Evitar arrastrar, golpear o inclinar el microscopio. 5. NUNCA DEBE LIMPIARSE CON EL DEDO EL ACEITE DEL OBJETO DE INMERSIN.
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MANEJO DEL MICROSCOPIO: 1. Iluminacin del campo visual: Conectar y prender la lmpara. Acercar el objeto a la preparacin. Subir el condensador hasta el tope. Abrir o cerrar el diafragma del condensador hasta tener un campo adecuadamente iluminado y con el mayor contraste posible. Recuerde que los campos excesivamente iluminados disminuye el contraste de la estructura del objeto que se observa y que los campos poco iluminados no permiten distinguir los colores.
2. Colocar la preparacin en la platina y sujetarla con las pinzas. 3. Enfoque la preparacin. Cuando sea necesario, colocar el cubre objetos en la preparacin. Enfocar la preparacin con el objeto seco dbil (10x) usando primero el tomillo macromtrico y despus el tornillo micromtrico hasta obtener una imagen clara. Sin mover los tornillos, cambiar el objeto seco fuerte (40x) y mover el tornillos micromtrico hasta enfocar de nuevo. Para observar con el objeto de inmersin ponga el cubre objetos sobre la muestra. Dejar caer una pequea gota de aceite de inmersin sobre la preparacin, con cuidado cambiar el objeto de inmersin e intentar enfocar la preparacin en el tornillo micromtrico. Cuando se est enfocando una preparacin que se desea observar con el objeto de inmersin nunca se debe mover el tornillo macromtrico. Es importante tener cuidado al estar buscando el enfoque correcto ya que a veces por descuidado se presiona demasiado el porta objeto hasta que se rompe. Al terminar de hacer las observaciones, limpiar el microscopio como se indico anteriormente y entregarlo: a) Con la lmpara apagada, el cable enrollado y sujeto con una liga. b) Con la platina hasta el tope inferior. c) Con el revlver colocado en el objeto de menor aumento a donde no lo tiene. Colocar en el lugar asignado y cubrirlo con la funda. Avise a los profesores de cualquier irregularidad que note en el microscopio.
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ACTIVIDADES MATERIAL: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Microscopio de campo brillante. Pipetas Pasteur o asa bacteriolgica. Tela suave. Hisopos de algodn. Portaobjetos y cubreobjetos. Azul de metileno.
MATERIAL BIOLGICO: 1. Epidermis de cebolla. 2. Cultivo mixto de protozoarios (agua estancada) TCNICA: Preparacin hmeda (montaje hmedo): a) Limpie perfectamente los portaobjetos y coloque con cuidado una pequea gota del cultivo protista o cualquier otra muestra. Aydese con una pipeta Pasteur o con varias asadas. b) Con cuidado cubra la gota con un cubreobjetos perfectamente limpio. c) Para observarse, siga los pasos que se indican en el manejo del microscopio hasta tener una imagen ntida. Preparacin seca (frotis): a) Si la muestra es lquida, en zona estril y siguiendo la tcnica asptica tome una muestra con la pipeta Pasteur o con el asa, y extindala sobre el portaobjetos, deje secar al aire. b) Si la muestra es cultivo slido, coloque una gota pequea de agua destilada sobre el portaobjetos y mzclela con una muestra del slido que le interese, para que pueda ser disuelto en el agua. Deje secar al aire. REPORTE DE LA PRCTICA: 1. Resumir en un cuadro sinptico las principales partes del microscopio compuesto. 2. Presente imgenes ante los diferentes objetivos: seco (10x), seco fuerte (40x), e inmersin (100x).
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ESQUEMAS Y OBSERVACIONES: Realizamos un frotis hmedo con el agua estancada y observamos con diferentes objetivos:
Seco (10x)
Seco fuerte (40x)
Colocamos una porcin de epidermis en el portaobjetos y observamos con diferentes objetivos: Seco (10x) Seco fuerte (40x)
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Agregamos colorante a la muestra, retiramos el exceso y montamos la preparacin para proceder a observar:
No realizamos observaciones con el objetivo de inmersin (100x), pues las muestras que tenamos eran hmedas, y el contacto del cubreobjetos con el lente podra haberlo daado.
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Partes del microscopio:
Mapa conceptual de las partes del microscopio:
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Esquemas de las observaciones del agua estancada, observada con los diferentes objetivos:
Seco (10x) El panorama con el objetivo seco, no permite observar a detalle, aunque nos proporciona un gran campo visual.
Seco fuerte (40x) Con este objetivo se logra apreciar el agua con ms detalle, aunque el campo visual se reduce.
CUESTIONARIO: Cules son las diferencias bajo el microscopio ms obvias entre los microorganismos observados? R= La forma, pues pudimos apreciar diferentes morfologas; en el caso de la cebolla logramos apreciar la forma de las clulas en su epidermis. Qu partes de la ultraestructura de una bacteria solamente se puede observar por microscopa electrnica? R= Gracias al microscopio electrnico se hizo posible observar con detalle la estructura interna de las bacterias. Todava se trabaja en el perfeccionamiento de estas tcnicas, por lo cual, la anatoma est en una fase de desarrollo acelerado. CONCLUSION: Durante esta prctica, conocimos las partes del microscopio compuesto y pudimos apreciar diferentes morfologas mediante su uso.
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MORFOLOGA COLONIAL Y TINCIN DE GRAM PRCTICA No. 3 OBJETIVO: El alumno describir y reconocer la morfologa colonial as como la realizacin de la tcnica de coloracin de Gram con especies bacterianas conocidas. FECHA DE REALIZACIN: 11 de septiembre de 2009
FUNDAMENTOS TERICOS: Morfologa colonial: Cuando se examinan los microorganismos asociados o presentes en un animal, planta, suelo, agua o alimento, se encuentra una gran variedad. Slo raramente se encontrar un solo tipo de microorganismo. Si se quiere trabajar con un cultivo puro, se deben obtener colonias separadas o aisladas. La observacin cuidadosa de las colonias muestra que stas varan en apariencias. Una colonia microbiana est constituida por individuos de la misma especie provenientes de una clula o de un grupo de ellas. Por definicin un buen aislamiento en placas es aquel que nos da colonias aisladas, con una distancia que permita distinguir y describir la morfologa colonial que incluye: a) Tamao: se describe en milmetros y puede variar desde colonias extremadamente pequeas que miden apenas una fraccin de milmetro hasta aquellas que llegan a medir 10mm o ms. Algunas especies bacterianas pueden extenderse en toda la superficie de la caja. b) Color: las colonias pueden tener varios colores, debido a pigmentos propios a absorcin de algunas sustancias del medio. c) Forma: pueden ser puntiformes, circulares o irregulares. Las colonias puntiformes son tan pequeas que no se pueden distinguir el resto de sus caractersticas. d) Bordes: pueden ser enteros o mostrar irregularidades como lbulos, filamentos, proyecciones como dientes de sierra enrollados. e) Elevacin: la colonia puede ser plana o elevada, esta ltima a su vez puede ser convexa, pulvinada, embonada, crateriforme o umbilicada. f) Superficie: puede ser lisa, rugosa o granular g) Aspecto: puede ser hmedo o seco h) Luz reflejada: puede ser brillante o mate.
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Luz transmitida: puede ser transparente, translcida u opaca. Produccin de pigmentos: algunas bacterias producen pigmentos solubles en agua, que puede difundir al medio ambiente. k) Consistencia: dura o suave, esta ltima puede ser butirosa, o friable. Esta caracterstica se determina tocando la colonia con el asa y por lo tanto puede ser la ltima en describirse. l) Otras: en ciertos medios de cultivos el crecimiento bacteriano ocasiona cambios visibles alrededor de la colonia, como la hemolisis en gelosa sangre, acidificacin que de manifiesta con un indicador pH incorporado al medio de cultivo, y otros efectos similares. Con la experiencia en la observacin de cultivos, las caractersticas de morfologa colonial viene a constituir una gua muy til en el reconocimiento de los principales grupos de microorganismos, y tambin permite en muchos casos corroborar la pureza de un cultivo o alertar sobre una posible contaminacin. La certeza de tener un cultivo puro as como el reconocimiento de un cultivo mixto o impuro permite la caracterizacin correcta de un microorganismo. Tincin de Gram: La observacin microscpica de las bacterias es ms fcil cuando se tie. Sin embargo, es fcil confundir un punto o bastn sobre un fondo de un mismo color con algn artefacto. Este problema apareci cuando las muestras de tejidos infectados se tifien con azul de metileno buscando a las bacterias incluidas. El primer intento para resolver el problema fue decolorar los cortes despus de la coloracin. En los tejidos que tenan bacilos tuberculosos, esto fue efectivo pero en otras bacterias se decoloraba igual que los tejidos y no se ganaba nada. El problema fue resuelto por Hans Christian Gram, patlogo dans que en 1884 introdujo un colorante de contraste despus de la decoloracin. En esta tincin diferencial las bacterias se tean de color prpura oscuro usando la llamada solucin Ehrlich, violeta de genciana con anilina y los tejidos circulantes con caf de Bismark o vesubiano. Originalmente la coloracin de Gram. se desarrollo para visualizar las bacterias en los tejidos animales pero pronto se advirti que era til para la diferenciacin de bacterias. Las bacterias teidas por esta coloracin se dividen en dos grupos: las que retienen el violeta de genciana o cristal violeta o Gram positiva y las que se decoloran con el decolorante y se tien con el colorante de contraste (generalmente de color rojo como la safranina o la fucsina bsica aunque puede usarse verde de malaquita para los observadores daltnicos) o Gram negativas. La afinidad tintorial seguramente se debe a numerosas diferencias en la estructura y composicin qumica de muchos componentes celulares entre los
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que destaca la pared celular. Las bacterias Gram positivas tienen una pared compuesta principalmente de una capa de peptidoglicana relativamente gruesa (20-80nm). En cambio, las Gram negativas tienen una capa de peptidoglicana delgada (5-10nm) adems de una membrana externa constituida de fosfolpidos y lipolisacridos. En general, las bacterias Gram positivas son susceptibles a la penicilina y varios agentes qumicos y son ms resistentes a la desintegracin por tratamiento mecnico que las Gram negativas, que como grupo, son ms susceptibles a otros antibiticos como la estreptomicina. Las diferencias bsicas en la estructura superficial de las bacterias Gram positivas y negativas contribuyen a aclarar la diferencia en la respuesta a la coloracin Gram. Durante la tincin de Gram, ambos grupos de bacterias se tien con el colorante primario (cristal violeta) y mordente (yodo). El complejo colorante-mordente, es decir atrapado dentro de la clula Gram positiva por la deshidratacin y la porosidad reducida de la gruesa pared celular que ocurre durante de la etapa del lavado diferencial con etanol al 95%. En cambio, las Gram negativas la delgada capa de peptidoglicana no impide la extraccin del complejo colorante-mordente en la decoloracin. El colorante secundario o de contraste tifie fcilmente a las clulas decoloradas. Gram negativas. El rompimiento mecnico o disgregacin enzimtica de la pared celular de los Gram positivos los hace teirse como Gram negativos.
GRAM POSITIVO Fijacin Cristal violeta Lugol
GRAM NEGATIVO
Decoloracin Alcohol-cetona Safranina
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ACTIVIDADES MORFOLOGA COLONIAL: MATERIAL BIOLGICO: Cultivos de 24-48 hrs. de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus megaterium. MATERIAL: 1. 2. 3. 4. 5. Asa bacteriolgica Puente de tincin Portaobjetos Cubreobjetos Mechero
EQUIPO: 1. Microscopio REACTIVOS: 1. Safranina 2. Cristal violeta 3. Azul de metileno PROCEDIMIENTO: PREPARACIN DE UN FROTIS Y TINCIN Primer caso 1. Si se tiene un cultivo lquido, tome una muestra con el asa y extendindola sobre un portaobjetos perfectamente limpio y deje secar al aire. 2. Despus aada cuidadosamente un colorante y djelo por espacio de un minuto. 3. Suavemente lave el frotis con agua, deje secar al aire. 4. Observe cada uno de los objetos. 5. Anote las observaciones. Segundo caso
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1. Si se tiene una placa con cultivo, primero coloque una pequea gota de agua destilada sobre un portaobjetos perfectamente limpio. 2. Flamee el asa con el mechero y deje enfriar al aire cerca de la llama. 3. Tome con el asa una pequea colonia de la palca y haga una pequea suspensin bacteriana con la gota que est en el portaobjetos. 4. Extienda sta suspensin hasta hacer un frotis. Continu con el proceso descrito anteriormente. PRECAUCIONES: Al realizar esta tcnica se puede cometer errores que son comunes y que entorpecen una buena interpretacin al hacer la observacin, por lo que se debe considerar las siguientes recomendaciones. 1. AI ocupar los portaobjetos debern estar limpios de cualquier material extrao 2. Evitar los frotis que se vean espesos, de otra manera no podr apreciar con exactitud al microscopio 3. Evitar que el colorante actu por tiempos muy prolongados o muy cortos. 4. Sujetar por los lados al portaobjetos. Evitar hacerlo por donde estn los frotis, puede arriesgar a contaminarse con el microorganismo. 5. Secar cerca del mechero puede deshidratar o quemar los frotis. TINCIN DE GRAML: MATERIAL BIOLGICO: Cultivos de 24-48 hrs. de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus megaterium, Proteus sp., Enterobacter aerogenes, Saccharomyces cerevisiae. MATERIAL: 6. Asa bacteriolgica 7. Puente de tincin 8. Portaobjetos 9. Cubreobjetos 10. Mechero EQUIPO:
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2. Microscopio
REACTIVOS: 4. 5. 6. 7. 8. 9. Safranina Cristal violeta Bicarbonato de sodio al 5% Lugol Alcohol cetona Aceite de inmersin
PROCEDIMIENTO: 1. Hacer frotis con una de las bacterias y fijarla con calor. 2. Cubrir los frotis con cristal violeta y dejarlo actuar durante un minuto. Escurrir el colorante y lavar con un chorro suave de agua. 3. Cubrir los frotis con solucin de Lugol y dejarlo actuar durante un minuto. Escurrir el reactivo y lavar con un chorro suave de agua. 4. Colocar el frotis en forma vertical y usando un fondo blanco, decolorar aadiendo gota a gota al alcohol-cetona durante 5 a 15 segundos. El momento exacto para terminar la coloracin con agua es cuando dejan de fluir "hilos colorantes" por el frotis. Este es el paso crtico de la tincin. Lavar inmediatamente con un chorro de agua suave. 5. Cubrir los frotis con safranina y dejar actuar durante un minuto. Escurrir el colorante y lavar con un chorro suave de agua. Dejar secar al aire. PRECAUCIONES: La tincin de Gram en general es muy sencilla de hacer, sin embargo, se pueden cometer errores que hacen variar el resultado y consecuentemente la interpretacin. Los errores detectados frecuentemente son: 1. Un frotis mal fijado al portaobjetos puede ocasionar durante los lavados arrastre a las bacterias. 2. Lavar vigorosamente y con exceso de agua, elimina el frotis, colorante o complejo frotis-colorante del portaobjetos. 3. Dejar actuar por ms tiempo el decolorante arrojar resultados falsamente negativos. 4. Un cultivo viejo influye en los resultados obtenidos durante la tincin de Gram.
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ESQUEMAS Y OBSERVACIONES:
Morfologa colonial: Tomamos el asa bacteriolgica y la pusimos a la flama del mechero Bunsen hasta que se pusiera al rojo vivo, con el fin de esterilizar y posteriormente dejamos enfriar:
Colocamos la bacteria E. coli sobre el portaobjetos esparcindola levemente y posteriormente pasndola por la flama del mechero una tres veces procurando que no se quemara:
Colocamos el portaobjetos en el puente y aplicamos safranina y dejamos reposar de 1 minuto a minuto y medio y posteriormente lavamos con agua destilada:
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Colocamos el portaobjetos de nuevo en el puente y dejamos secar hasta que el agua sobrante se evapore y no se vea rastro alguno. Posteriormente llevamos al microscopio pero sin colocar el cubreobjetos:
En las siguientes fotos se muestra la bacteria Escherichia coli aglomeradas como cadenas. En el seco dbil 10x pudimos distinguir la bacteria pero en forma de pequesimos crculos.
En el seco fuerte 40x no se tomo fotografa. En el de Inmersin 100x ya se observa con mucho ms nitidez las cadenas aglomeradas de la bacteria la macha naranja es el tinte rojo, hay que recordar la bacteria es un bacillo en forma de bastn.
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Tincin Gram: En cuatro portaobjetos identificados con un plumn permanente (del 1 al 4) colocamos, con la ayuda del asa, una muestra de E. coli:
Hicimos el frotis seco la bacteria en cada portaobjetos y fijamos con calor. (Recordad que no hay que poner directamente el frotis en la llama y hacerlo por lapsos de tiempo):
Una vez seco el frotis, colocamos una pequea cantidad de colorante cristal violeta a cada uno de los frotis y dejamos reposar de medio minuto a 1 minuto y posteriormente escurrimos el colorante y lavamos con la piseta:
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Posteriormente cubrimos los frotis con una pequea cantidad de solucin de Lugol (NOTA: omitimos el portaobjetos numero 1, y lo hicimos del 2 al 4). Dejamos actuar de medio minuto a 1 minuto y posteriormente escurrir el reactivo y lavamos con un chorro suave de agua.
Luego colocamos el frotis en forma vertical y usando un fondo blanco, decoloramos aadiendo gota a gota alcohol-cetona (NOTA: omitimos el portaobjetos nmero 1 y 2, y lo hicimos con el 3 y 4). Dejamos actuar durante 15 segundos. El momento exacto para terminar la coloracin con agua es cuando deja de fluir hilos colorantes por el frotis. Este es el paso crtico de la tincin. Lavamos inmediatamente con un chorro suave de agua.
Posteriormente colocamos en pequea gota de colorante de safranina nicamente al portaobjetos 4, y dejamos actuar durante medio minuto a 1 minuto y posteriormente escurrimos el reactivo y lavamos con un chorro suave de agua. Dejamos secar y observamos cada portaobjetos, del 1 al 4:
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Esquemas de las fotos obtenidas en cada porta objetos Forma Forma de Identificacin En el Paso 1 Agrupacin Escherichia coli, bacteria con forma de bastn (bacilo), que pertenece a la familia de las Enterobactericeas; Todas las clulas se tien a est considerada como azul violeta el material biolgico En el ms utilizado en Paso 2 experimentacin. Esta bacteria se encuentra en el tracto intestinal de los mamferos. La especie comprende Todas las clulas siguen varios grupos que se del mismo color azul establecen segn su violeta actividad. Las especies En el de Escherichia coli Paso 3 oportunistas producen infecciones slo si abandonan el colon. La Escherichia coli es un organismo adecuado Las clulas Gram Positivas para la investigacin por siguen de color azulvioleta mientras que las de su crecimiento rpido y Gram negativa se porque su cultivo es decoloran sencillo. En el En las fotografas se Paso 3 puede notar como los G bacillos en forma de bastones se aglomeran como si estuvieran G formando cadenas o tiras, y de cmo se va Las clulas Gram Positivas siguiendo cada paso en (G+) se ven azul-violeta y las Gram Negativas (G-) la tincin de Gram hasta concluir en Gram rosas o rojas Negativa
Frotis con Cristal Violeta
Frotis con Cristal Violeta y Lugol
Frotis con Cristal Violeta, Lugol y Alcohol-Cetona
Frotis con Cristal Violeta, Lugol y Alcohol-Cetona y Safranina
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LA BACTERIA E. COLI ES GRAM NEGATIVA Cada uno de los integrantes del equipo llevo acabo el mismo procedimiento en un solo portaobjetos y llegamos a la misma conclusin. CUESTIONARIO 1. Qu importancia tiene la tcnica de coloracin de Gram en la identificacin de las bacterias? R=Por medio de esta tincin se puede diferenciar las bacterias y se pueden dividir en dos grupo: las que retienen el violeta de genciana o cristal-violeta que son las Gram Positivas, y las que se decoloran con el alcohol-cetona y se tie por contraste de rosa o rojo. 2. Cul es el paso crtico en la tcnica de la coloracin de Gram? R= Es cuando se le agrega el alcohol-cetona pues cuando dejan de fluir hilos colorantes por el frotis 3. Diga el nombre de tres bacterias (gnero y especie) Gram positivas y tres Gram negativas diferente citadas en la prctica. R= Gram Negativas: Escherichia coli , S. dysenteriae y H. influenzae. Gram Positivas: Saccharomyces , C. diphtheriae y M. tuberculosis. BIBLIOGRAFIA Brock Biologa de los Microorganismos, 10ma. Edicin, Editorial PEARSON Prentice Hall, Autores: Michael T. Madigan, John M. Martinko y Jack Parker. CONCLUSIN Durante esta prctica, reconocimos la morfologa colonial y aprendimos la tcnica de tincin diferencial de Gram con especies bacterianas conocidas.
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MEDIOS DE CULTIVO PRCTICA No. 4 OBJETIVO: El alumno preparar diversos medios de cultivo utilizando agar y fuentes fuente de carbono y sales minerales. FUNDAMENTOS TERICOS: Para disear un medio de cultivo se debe tener en cuenta no slo los nutrientes requeridos por el microorganismo que se desea estudiar, sino tambin las condiciones fsicas que le permitan crecer, los cuales son: Nutrientes: La cantidad y naturaleza de los nutrientes en un medio de cultivo viene determinada por el rendimiento de un producto determinado, adems de los requerimientos nutricionales del microorganismo. pH: Un microorganismo puede alterarse o alterar el pH del medio de cultivo como resultado de las sustancias producidas por el propio microorganismo. Estos cambios pueden llegar a inhibir el crecimiento del microorganismo. Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante sistemas tampn, el ms utilizado en microbiologa es la combinacin de KH2PO4 y K2HPO4. Necesidades de gases: los principales gases que afectan al desarrollo microbiano son el O2 y CO2. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al O2 libre clasificndose en 4 grupos:

FECHA DE REALIZACIN: 22 de septiembre de 2009
Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de O2 libre. Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de O2 libre. Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan en presencia o ausencia de O2 libre. Micro-aerobias: bacterias que crecen en presencia de pequeas cantidades de O2 libre.
Suministro de luz: Los organismos fotosintticos debern ser expuestos a una fuente de iluminacin, la cual no debe plantear problemas de variacin de
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temperatura, por lo que suelen usarse lmparas fluorescentes con un desprendimiento mnimo de calor.
Control de temperatura: El desarrollo de las bacterias depende de reacciones qumicas y la velocidad con que se efectan, las cuales estn influidas por la temperatura, por lo cual la temperatura puede, en parte, determinar el crecimiento de los microorganismos en estudio. Cada especie microbiana posee una temperatura ptima de crecimiento clasificndose segn esto en:

Psicrfilas (psicroflicas): capaces de desarrollarse a 0 C o menos. Su temperatura ptima es alrededor de los 15 C. Mesfilas (mesoflica): crecen mejor entre 25 y 40 C. Termfilas (termoflicas): crecen mejor entre 45 y 60 C.
Grado de humedad Presin osmtica: generalmente se trabaja en condiciones de isotona (300 miliosmoles), aunque existen bacterias que pueden crecer en concentraciones hipotnicas e hipertnicas. Esterilidad Proteccin: El medio de cultivo debe estar protegido de la contaminacin microbiana ambiental.
Agar El agar (llamado antiguamente agar-agar) es un gel coloidal formado por hidratos de carbono, de extendido uso comercial, y que proviene de las paredes celulares de varias especies de algas rojas, en concreto de miembros orientales del gnero Gelidium. Es un excelente medio de cultivo de bacterias, ya que no se disuelve por el efecto de las sales, ni se consume por la accin de la mayora de los microorganismos. Qumicamente, el agar es una mezcla compleja de sales de polisacridos, fundamentalmente, galactsidos. Las grandes molculas que lo constituyen determinan sus cualidades sobresalientes, como coloides y espesantes, que lo han hecho hasta ahora insustituible. Adems de los polisacridos, el agar contiene numerosos cationes asociados, tales como sodio, potasio, calcio, magnesio, etc. De los cuales no
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est, claramente, establecida su influencia sobre las propiedades de este producto. Referente a las propiedades y contenidos del agar, bsicamente, dependen de la materia prima empleada, procedencia geogrfica, poca de cosecha y madurez del alga. A continuacin, se caracterizarn los tipos de medios de cultivo segn su estado y composicin. Estado: 1. Medios slidos: Su proporcin de agar es siempre por encima del 15%. 2. Medios semislidos: Son medios intermedios entre los medios lquidos y slidos, su proporcin de agar suele ser suele ser inferior al 5%, pero siempre suele presentar cierta cantidad que le proporcione una consistencia semislida. 3. Medios lquidos o caldos: No contiene agar y su composicin (adems de agua) suele contener al menos una fuente de carbono, sales minerales, y a veces segn las caractersticas de medio, factores de crecimiento, vitaminas, peptonas, aminocidos, entre otros. Composicin: 1. Medios sintticos o qumicamente definidos: Llevan fuentes de carbono, nitrgeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca, etc.), otros elementos como estimuladores de crecimiento pero siempre a concentraciones conocidas. 2. Medios complejos o de composicin indefinida: Estos medios llevan ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusin de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composicin cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes. 3. Medios de enriquecimiento: Son medios complejos, normalmente, con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente hetertrofos exigentes). Tales como: adiccin de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas. 4. Medios selectivos: Son aquellos que favorecen por su diseo el crecimiento especfico de un microorganismo particular o grupo de microorganismos. Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una poblacin microbiana mixta. Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para auttrofos, adicionando cristal violeta se inhibe el
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crecimiento de los Gram Positivos (G+), utilizando maltosa como nica fuente de carbono slo crecern los que usen maltosa. 5. Medios diferenciales: Son aquellos destinados a facilitar la discriminacin de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolticos de no hemolticos; 6. McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-). 7. Medios de mantenimiento: Suelen ser distintos a los de crecimiento ptimo ya que el crecimiento rpido y prolfico suele ocasionar la muerte rpida de las clulas. Por ejemplo: al aadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen cidos, acidificndose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento. Medio de cultivo de uso comn: Agar Nutriente: Medio para fines generales que promueve el crecimiento de la mayora de los microorganismos poco exigentes. Agar Papa Dextrosa: Medio para el cultivo y enumeracin de levaduras y mohos a partir de alimentos y otros materiales. Los hidratos de carbono y la infusin de papa favorecen el crecimiento de levaduras y hongos, en tanto que por el bajo rango de pH, la flora acompaante se reduce significativamente. Agar Salmonella-Shigella: Medio para el aislamiento de salmonelas y de Shigella de heces, de comestibles y de otros materiales. Agar Sabouraud: Medio para la deteccin y aislamiento de hongos en muestras mediante tcnica de filtracin por membrana. Para que ocurra el crecimiento selectivo de hongos sobre bacterias en la muestra depende tan solo de la reaccin cida (pH 5.6). Caldo Nutritivo: Medio de uso general, utilizado para el crecimiento de microorganismos exigentes as como para los no exigentes. Clostridios y anaerobios pueden crecer tambin cuando se incuban bajo condiciones de anaerobiosis. Agar McConkey: Medio diferencial para la deteccin, aislamiento y enumeracin de bacterias coniformes y patgenas intestinales en aguas, productos lcteos y muestras biolgicas. Su accin diferencial est basada en que los microorganismos capaces de fermentar lactosa producen una cada de pH, junto con una absorcin del colorante, apareciendo en la colonia el color rojo, las colonias de microorganismos que no fermentan la lactosa permanecen incoloras.
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Agar Levine: Medio para el aislamiento y la diferenciacin de los Escherichia coli y enterobacterias, fermentadores de lactosa y no fermentadores de lactosa y para la identificacin rpida de los albicans. Agar Chapman: Medio para la deteccin de Staphylococcus patgenos en muestras de alimentos y otros materiales mediante la tcnica de filtracin por membrana. Cuadro de Crecimiento:
Agar nutriente Staphylococcus aureus Escherichia coli NO SI Agar McConkey NO SI Agar Levine NO SI Agar Chapman SI NO Agar Papa dextrosa NO NO Agar SalmonellaShigella NO NO Agar Sabouraud SI SI Agar Sangre NO SI Caldo Nutritivo SI SI
MATERIAL: a. b. c. d. e. f. g. EQUIPO: a) Balanza granataria b) Olla exprs REACTIVOS: a) Agares g) Caldo Nutritivo PROCEDIMIENTO: Cada equipo prepar dos medios de cultivo diferentes, en nuestro caso, al ser el equipo nmero dos nos toc preparar: Algodn Matraces elenmeyer Cajas de Petri Esptula Mechero Mortero con Pistilo Tubos de ensayo
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Caldo nutritivo: Medio de uso general, utilizado para el crecimiento de microorganismos exigentes as como para los no exigentes. Clostridios y anaerobios pueden crecer tambin cuando se incuban bajo condiciones de anaerobiosis. Frmula para 1000ml de agua destilada: Peptona de gelatina Extracto de carne de res pH final Disolver 8 gramos en un litro de agua destilada. Agar Czapek-dox: Medio de cultivo para hongos saprfitos, bacterias del suelo y otros microorganismos. En este medio la nica fuente de carbono es la sacarosa y el nitrato aporta nitrgeno. Se recomienda para el aislamiento de Aspergillus y Penicillium. De la flora bacteriana del suelo solo pueden desarrollar las bacterias no exigentes. Frmula para 1000ml de agua destilada: Sacarosa Nitrato de sodio Sulfato de magnesio Fosfato dipotsico Cloruro de potasio Sulfato ferroso Agar pH final Disolver 5 gramos en un litro de agua destilada. 1. Utilizando la balanza granataria, pese la porcin correspondiente de polvo para preparar el medio de cultivo. 2. Deposite en el matraz y llena afora con agua destilada y posteriormente homogeniza dando crculos en la punta de la llama del mechero de bunsen. 3. Posteriormente poner algodn y tapar con papel aluminio la boca (caso agar).
5.0 g. 3.0 g. 6.90.2
30.0 g. 3.0 g. 0 .5 g. 1.0 g. 0.5 g. 0.01 g. 0.01 g. 7.30.2
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4. Depositar en tubos de ensayo (caso caldo) 5. Llevar a la olla exprs con poca agua y colocar los matraces. 6. Llevar a la estufa hasta que llegue a los 300 C; mantener 15min y luego esperar a que baje la temperatura. 7. Posteriormente llevar al refrigerador y dejar reposar durante 24 hrs. 8. Despus sacar y meter al microondas para que cambie a estado liquido. 9. Colocar el agar en las cajas Petri cerca de la flama del mechero de bunsen y esperar a que se solidifiquen. 10. Posteriormente sellar con un pedazo de masking-tape y un sello de identificacin de agar. 11. Meter al refrigerador para conservar. PRECAUCIONES: El procedimiento para la preparacin de cualquier medio de cultivo debe realizarse rigurosamente para no contaminar el medio. Los medios de cultivo en ocasiones vienen muy duros (como piedra) as que hay que utilizar una esptula para picar y una mortero con pistilo para pulverizar.
ESQUEMAS Y OBSERVACIONES:
Para preparar el caldo nutritivo, basta disolver 8 gramos del polvo en un litro de agua; y ya que deseamos preparar 160 ml, se tiene:
1000ml. 8.0g. 160ml. x x = 1.28g.
Se pes.
Se midi el volumen de agua.
Se disolvi.
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Se llenaron los tubos de ensayo para introducir en la olla exprs.
Para preparar el agar Czapek-dox, basta disolver 5 gramos del polvo en un litro de agua; y ya que deseamos preparar 210 ml, se tiene:
1000ml. 5.0g. 210ml. x x = 1.05g.
Se pes.
Se midi el volumen de agua.
Se disolvi.
Se le coloc el sello de algodn y papel aluminio; y se introdujo a la olla exprs.
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Se saca de la olla y se llenan las cajas de Petri. BIBLIOGRAFIA Collins C.H, Lyne Patricia, Mtodos Microbiolgicos Edicin Acribia, S.A, Zaragoza, Espaa, quinta edicin. CONCLUSIN Durante esta prctica, aprendimos a preparar los medios de cultivos, los cuales permiten el crecimiento y desarrollo de microorganismos gracias a que proporcionan sustancias nutritivas.
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CULTIVO DE BACTERIAS Y DILUCIONES PRCTICA No. 5 OBJETIVOS: El alumno inocular diversas bacterias con el fin de observar las caractersticas de las mismas. El alumno realizar diluciones con el fin de observar la proliferacin de bacterias en un medio determinado. FUNDAMENTOS TERICOS: El cultivo es un mtodo para la multiplicacin de clulas o microorganismos, o para el crecimiento de tejidos en el que se prepara un medio ptimo para favorecer el proceso deseado; es empleado como un mtodo fundamental para el estudio de las bacterias. Esto se lleva a cabo al cultivarlas en un medio lquido o en la superficie de un medio slido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo slido donde las clulas que se multiplican no cambian de localizacin; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisin binaria una colonia macroscpica compuesta por decenas de millones de clulas similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecer como cultivo puro de un solo tipo de bacteria. Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfolgicamente que es imposible diferenciarlas slo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus caractersticas bioqumicas sembrndolas en medios de cultivo especiales. As, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayora de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos averiguar si est presente. Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azcares especiales que slo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se aaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos cidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentacin, generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado. FECHA DE REALIZACIN: 29 de septiembre de 2009
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Los diferentes medios y tcnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiologa, pues sirven para identificar las bacterias causantes de enfermedades infecciosas y los antibiticos a los que son sensibles esas bacterias. MATERIAL: Olla exprs Asa bacteriolgica Mechero Crayn Balanza granataria 6 Tubos de ensayo 6 Cajas de Petri 1 matraz
REACTIVOS: 2 medios de Czapek-dox 2 medios de Agar Nutritivo 2 medios de Agar dextrosa y papa 2 medio de Agar azul de metileno y eosina Agua destilada Agar nutritivo Bacterias (indicadas en la tcnica)
PROCEDIMIENTO: Cultivo Se utilizarn los siguientes medios, preparados en la prctica anterior: 2 medios de Czapek-dox (elaborado por nuestro equipo) 2 medios de Agar Nutritivo (elaborado por el equipo 5) 2 medios de Agar dextrosa y papa (elaborado por el equipo 4) 2 medio de Agar azul de metileno y eosina (elaborado por el equipo 3)
Cultivo en tres zonas: 1. Tomar las cajas de los medios con Agar Czapek-dox, dextrosa-papa y azul de metileno-eosina ya esterilizados; y con una crayola dividir en tres partes por la parte inferior de la caja. 2. Enumerar para saber que bacteria se sembrar en cada zona.
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Zona 1 sembrar Staphylococcus aureus. Zona 2 sembrar E. coli. Zona 3 ser el blanco. 3. La tcnica de siembra (inoculacin) ser la siguiente: Con el asa esterilizada tomamos una muestra de la bacteria. La pasamos por la zona correspondiente en el medio haciendo una estra. 4. Lo anterior se repetir en dos cajas de los 3 medios seleccionados. 5. Posteriormente llevar a incubacin para su crecimiento. Cultivo en siete zonas: 1. Se utilizarn dos cajas con agar nutritivo. 2. Dividir la caja en siete partes por la parte inferior utilizando el crayn. 3. En cada zona se sembrar lo siguiente: Zona 1: Muestra de cabello. Zona 2: Saliva. Zona 3: Piel. Zona 4: Muestra de piso. Zona 5: Muestra de agua de llave. Zona 6: Muestra tomada de suela de zapato. Zona 7: Blanco. 4. La tcnica de siembra (inolulacin) ser la siguiente: Con el asa esterilizada tomamos la muestra correspondiente. La pasamos por la zona correspondiente en el medio haciendo una estra. 5. Posteriormente llevar a incubacin para su crecimiento. Diluciones 1. Preparar medio de agar nutritivo siguiendo la metodologa vista en la prctica anterior. 2. Esterilizar con la olla exprs en 6 tubos de ensayo. 3. Sacar los tubos de ensayo de la olla y templar sin llegar a la solidificacin del medio; pues se llevarn a cabo las diluciones. 4. En una serie de tres tubos realizar la dilucin de la bacteria Bacilo subtilis y en otra serie de tres tubos la de la bacteria Proteus vulgaris. PRECAUCIONES: El procedimiento para la preparacin del medio de cultivo debe realizarse rigurosamente para no contaminar el medio. La temperatura del agar donde se realizar la dilucin ser tal que al contacto con el brazo sea tolerable sin llegar a la solidificacin del medio.
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Al finalizar la prctica las cajas se desecharn colocndolas en una bolsa y sometindolas a esterilizacin.
ESQUEMAS Y OBSERVACIONES: Cultivo en tres zonas: En cada una de las 6 cajas de cultivo: 2 de Agar Czapek-dox 2 de Agar dextrosa y papa 2 de Agar azul de metileno y eosina Se realiz lo siguiente
Divisin en 3 zonas
Esterilizacin de asa
Toma de muestra bacteriana Zona 1: Staphylococcus aureus. Zona 2: Escherechia coli. Zona 3: Blanco. Staphylococcus aureus:
Siembra
Es una especie bacteriana integrada por formas cocaceas, que se dividen en ms de un plano, por lo que se agrupan regularmente en racimos. Son inmviles y carecen de esporas. Son grampositivas.
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Agente patgeno que acta como un microorganismo saprfito, se encuentra en la piel del individuo sano pero en ocasiones en que las defensas de la piel caen puede causar enfermedad.
Escherichia coli: Es quizs el organismo procarionte ms estudiado por el ser humano, se trata de una bacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales y por ende en las aguas negras. sta y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto del proceso digestivo. Son gramnegativo. Anaerbico facultativo, mvil por flagelos peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa.
Medio de azul de metileno-eosina:
En caja que se aprecia en la fotografa a la izquierda se puede apreciar de mejor manera el crecimiento de las bacterias. La bacteria Staphylococcus aureus, presenta un color morado-grisceo mientras que la E. coli presenta un color negruzco. Medio de dextrosa-papa:
No se aprecia crecimiento aparente, solo un pequeo brillo en un lugar donde se coloc la estra.
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Medio de Czapek-dox:
No se aprecia crecimiento aparente, solo un pequeo brillo en un lugar donde se coloc la estra.
Observaciones hechas despus de 48 hr. de incubacin.
Cultivo en siete zonas: En las dos cajas de agar nutritivo se realiz lo siguiente:
Divisin en 7 zonas
Esterilizacin de asa
Toma de muestras Zona 1: Muestra de cabello. Zona 2: Saliva. Zona 3: Piel. Zona 4: Muestra de piso. Zona 5: Muestra de agua de llave. Zona 6: Muestra tomada de suela de zapato. Zona 7: Blanco.
Siembra
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Solo en la caja de la imagen izquierda no se mezclaron los crecimientos de las zonas, pues como se puede apreciar en la caja de la derecha, todo se mezcl. De la caja de la imagen izquierda se ve que:
Zona 1: Muestra de cabello: No hubo crecimiento de microorganismos, nicamente se aprecia el brillo donde se realizo la estra. Zona 2: Saliva: Se aprecia crecimiento de microorganismos en una colonia esfrica. Zona 3: Piel: No hubo crecimiento de microorganismos.
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Zona 4: Muestra de piso: Se poco crecimiento en una mancha amarillenta. Zona 5: Muestra de agua de llave: Se aprecia crecimiento en una mancha opaca. Zona 6: Muestra tomada de suela de zapato: Se aprecia crecimiento en una mancha grande. Zona 7: Blanco.
Observaciones hechas despus de 48 hr. de incubacin.
Diluciones: Preparacin de agar nutritivo:
Tomamos 6 tubos de ensaye con Agar Nutritivo ya esterilizados y en estado lquido (dado que la prctica la continuamos el da jueves 1 de octubre, se realiz bao mara para disolver)
Posteriormente en la primera serie de tres tubos se coloc una muestra de Bacilo subtilis y en la segunda serie Proteus vulgaris.
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En cada caso: Del tubo de ensaye (1) se toma una muestra y se coloca en otro tubo de ensaye (2); posteriormente se toma la muestra del tubo de ensaye (2) y se coloca en el tubo de ensaye (3) Se coloc en tres cajas de Petri el contenido de los 3 tubos de ensaye (1), (2) y (3) por separado y se etiquetaron para su identificacin.
Se llev a incubacin al refrigerador, durante parte del jueves, viernes, sbado, domingo y parte del lunes; pues debido a limpieza de la escuela por contingencia sanitaria no pudo colocarse en la estufa.
Se observa que en cada caja de Petri el crecimiento de las bacterias fue de forma proporcional ya que en el tubo de ensaye (1) haba ms poblacin y en el tubo de ensaye (2) disminua, y por ultimo en el tubo de ensaye (3) disminua an ms. Es decir no hubo crecimiento proporcional. Bacillus subtilis: Es una bacteria grampositiva, Catalasa-positiva, aerobio facultativo1 comnmente encontrada en el suelo. Tiene la habilidad para formar una resistente endospora protectora, permitendo al organismo tolerar condiciones ambientalmente extremas.
Proteus vulgaris: Es una bacteria gramnegativa, facultativamente anaerbico en forma de bacilo que habita en el tracto intestinal del hombre y varios animales. Puede tambin ser aislado de la tierra, agua y materia fecal. Se agrupa con las enterobacteriaceae
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y es un patgeno oportunista en humanos, causando infecciones urinarias, de heridas y en abscesos hepticos. Desecho de cajas de Petri:
Se esterilizaron en la olla exprs, se colocaron en una bolsa negra y se depositaron en el bote correspondiente. BIBLIOGRAFIA Cultivo (microbiologa), Wikipedia, Enciclopedia en Lnea http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_(microbiolog%C3%ADa) CONCLUSIN Durante esta prctica, comprobamos que cada bacteria tiene cierta afinidad por un medio de cultivo especfico, el cual le brinda los nutrientes necesarios para su crecimiento. Tambin observacin los crecimientos proporcionales de acuerdo a la cantidad de muestra.
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MTODOS DE ESTERILIZACIN PRCTICA No. 6 OBJETIVOS: Preparar para esterilizar el material de vidrio ms usado en el laboratorio de microbiologa. Conocer el material y equipo ms comn para la esterilizacin y el trabajo en condiciones de esterilidad. FUNDAMENTOS TERICOS: La esterilizacin es un proceso mediante el cual se elimina por remocin o muerte todos los organismos viables de un objeto, superficie o medio. Un objeto libre de cualquier forma de vida se dice que est estril. El concepto de esterilizacin absoluto, es decir no existe un material casi, ms o menos, o 99% estril. En el trabajo de un laboratorio de microbiologa es necesario que todo el material como pipetas, tubos de ensaye, cajas de Petri de vidrio o de plstico, medios de cultivo y soluciones estn estriles. Debe cuidarse que el material esterilizado se conserve estril. As, antes de esterilizarse, a los matraces, tubos y dems recipientes se les pone un tapn de algodn que evitar el acceso de microorganismos del ambiente al interior. Tambin es necesario proteger este tapn con papel para tratar que no se humedezca con agua de condensacin despus de esterilizar con calor hmedo. Algunos laboratorios utilizan tapones de plstico o metlicos en lugar de algodn con la misma finalidad. Existen varios mtodos fsicos y qumicos de esterilizacin, la seleccin de uno o de otro depende de la naturaleza del material que se piensa esterilizar. Por ejemplo, la esterilizacin con calor hmedo, generalmente se realiza en un autoclave a 121C durante 15 minutos, la temperatura se alcanza utilizando vapor de agua a una presin de 15 psi (2 atm). Estas condiciones de esterilizacin con calor hmedo pueden variar de acuerdo con el volumen, tipo de autoclave y naturaleza del material por esterilizar. LOS RECIPIENTES QUE SE ESTERILIZAN EN AUTOCLAVE NO DEBEN ESTAR HERMTICAMENTE CERRADOS. FECHA DE REALIZACIN: 6 de octubre de 2009
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La muerte de los organismos contaminantes ocurre principalmente por desnaturalizacin de las macromolculas (protenas, RNA y DNA) y coagulacin de protenas. La esterilizacin con calor seco se usa principalmente para material de vidrio y materiales slidos estables al calor, la cual requiere de mayor duracin e intensidad porque la conduccin del calor es menos rpida que un ambiente hmedo. La temperatura que se utiliza es generalmente entre 160 y 180C durante 1.5 horas. Las cajas de Petri de vidrio y las pipetas se colocan en cilindros de de metal con aberturas que permiten el paso del aire caliente. La inactivacin de los contaminantes ocurre por prdida de agua y oxidacin de todos sus componentes esenciales. La filtracin a travs de membranas se usa para esterilizar soluciones de sustancias termolbiles en donde los microorganismos son detenidos en el filtro. El filtrado estril debe recibirse en un recipiente tambin estril. Los virus y algunos tipos de bacterias muy pequeas como Bdellovidrio, rickettsias, clamidias y algunas espiroquetas atraviesan esos filtros de membrana. VAPOR A PRESIN (AUTOCLAVE) AIRE CALIENTE (HORNO) FLAMEADO INCINERACIN DISCO DE MEMBRANAS RAYOS UV RAYOS IR RAYOS X RAYOS (COBALTO-60) OXIDO DE ETILENO FORMALDEHDO BETA-PROPIOLACTONA
HUMEDO CALOR SECO MTODOS FSICOS FILTRACIN NO IONIZANTE RADIACIONES IONIZANTE GASES METODOS QUMICOS LQUIDOS
En las campanas de flujo laminar que se usan como reas estriles en el trabajo microbiolgico, el aire se esteriliza por filtracin a travs de mallas de fibras de diversos materiales (filtros absolutos). Para el control de la contaminacin proveniente del aire en especies limitadas, se ha usado la esterilizacin UV, pero su escaso poder de penetracin solo se le ha usado para esterilizacin de superficies y lminas muy delgadas de agua transparente, incolora y sin exceso de sales de fierro. El gas de xido de etileno y las radiaciones ionizantes son utilizados para esterilizar material de plstico sensible al calor, porque este gas
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difunde fcilmente a travs de polietileno, papel y cartn. Por esta razn se han usado radiaciones ionizantes como las del cobalto-60 para esterilizar artculos de plstico ya envueltos, como las jeringas hipodrmicas. Estos agentes no se recomiendan para esterilizar soluciones o medios de cultivo. Para determinar la eficiencia del proceso de esterilizacin se emplean los indicadores biolgicos de esterilizacin. Especficamente, cuando se esteriliza con calor hmedo se utilizan, junto al material que se esteriliza, ampolletas que contienen esporas viables de Bacillus stearothermophilus que son inactivadas a 121C durante 12 minutos. Despus de la esterilizacin se incuban las esporas y se analizan si stas sobrevivieron o no al proceso de esterilizacin. Tambin existen cintas que con el cambio de un indicador qumico muestran si se alcanzaron las condiciones de la esterilizacin por calor o por xido de etileno. MATERIAL Pipetas para esterilizar. Pipeta de 10 ml. 18 tubos de ensayo. 18 campanas. Algodn Papel aluminio. PROCEDIMIENTO Preparacin de tubos de vidrio para esterilizar en olla exprs (sustituyendo autoclave) 1. Prepara Caldo lactosado como medio de cultivo. 2. Colocar con una pipeta de 10ml de capacidad, 5ml del caldo en los 18 tubos, cada uno de los cuales debe contener una campana. 3. Colocar los tubos en la rejilla e introducir en la olla exprs. 4. Cerrar la olla esperar que aumente la presin y con ello la temperatura, mantener por 15 min. la temperatura de 121C. 5. Anotar en los tubos su respectivo rtulo de identificacin. Preparacin de pipetas para esterilizar en autoclave. Colocar en la boca de la pipeta un filtro de algodn con la ayuda de un clip desdoblado. EL ALGODN NO DEBE QUEDAR NI MUY APRETADO NI MUY FLOJO, DEBE PERMITIR EL PASO DEL AIRE PERO SIN MOVERSE. Flamear con el mechero el algodn que sobresale de la boquilla de la pipeta.
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Envolver con papel aluminio cada pipeta siguiendo las instrucciones del profesor. Marcar en la envoltura el volumen, valor de las subdivisiones menores y si es terminal o no. ESQUEMAS Y OBSERVACIONES Preparacin de tubos de vidrio para esterilizar en olla exprs (sustituyendo autoclave) Preparacin del caldo lactosado:
Llenado de tubos, con su respectiva campana.
Llevados a la olla exprs, hasta alcanzar 121C, y manteniendo en esta temperatura por 15 minutos:
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Preparacin de pipetas para esterilizar en autoclave. Envoltura de pipetas en papel alumnio:
Llevadas a la estufa:
CUESTIONARIO 1. Cul es el mtodo ms apropiado para esterilizar en siguiente material? MATERIAL Solucin de vitaminas Cajas de Petri de plstico de desecho Aceite mineral Sangre para transfusin Ropa contaminada Cajas de Petri de plstico limpias Talco MTODO Radiacin Gases Qumico Qumico Calor Seco Calor Hmedo Radiacin
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Instrumental de ciruga Sangre de desecho Cadveres de animales de experimentacin de laboratorio Radiacin Filtracin Radiacin
2. Con qu finalidad se le pone a las pipetas un filtro de algodn? R= Para evitar el acceso de microorganismos del ambiente al interior. 3. Con qu deben obtenerse los lquidos biolgicos (por ejemplo sangre) para preparar un medio de cultivo? R= Por medio de radiaciones inicas como las del cobalto-60 para esterilizar artculos de plstico ya envueltas, como jeringas hipodrmicas. 4. Cul es el dimetros del poro en los filtros de esteres de celulosa utilizados para esterilizar por filtracin? R= Son delgadas pelculas que derivados de celulsicos plsticas o aun metal con orificios uniformemente situados del mismo dimetro. 5. Cunto mide una bacteria de las pequeas que se conocen? R= Las bacterias miden de 0.2 a 1.5 micrmetros de dimetro. CONCLUSION Durante esta prctica aprendimos que la esterilizacin es muy importante en la microbiologa, ya que el material con el que se trabaja debe estar libre de cualquier forma de vida. Conocimos mtodos tanto fsicos como qumicos de esterilizacin, aunque solo utilizamos en esta prctica mtodos fsicos de esterilizacin seca y hmeda. BIBLIOGRAFIA Brock Biologa de los Microorganismos, 10ma. Edicin, Editorial PEARSON Prentice Hall, Autores: Michael T. Madigan, John M. Martinko y Jack Parker.
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Prctica No. 7 Miguel ngel Rendn Sagardi M.C. Ral Prez vila
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DETERMINACIN DE LA CALIDAD DEL AGUA USANDO EL MTODO DEL NMERO MS PROBABLE PRCTICA No. 7 OBJETIVO: Determinar la calidad de una muestra de agua, mediante la determinacin de coliformes, empleando el mtodo del nmero ms probable. FUNDAMENTOS TERICOS: La presencia y extensin de contaminacin fecal es un factor importante en la determinacin de la calidad de un cuerpo de agua. Las heces contienen una variedad de microorganismos y formas de resistencia de los mismos, involucrando organismos patgenos, los cuales son un riesgo para la salud pblica al estar en contacto con el ser humano. El examen de muestras de agua para determinar la presencia de microorganismos del grupo coliforme que habitan normalmente en el intestino humano y de otros animales de sangre caliente, da una indicacin. Dada la limitada capacidad de algunos miembros del grupo de organismos coliformes para sobrevivir en agua; sus nmeros tambin pueden emplearse para estimar el grado de contaminacin fecal. Una de las Normas Mexicana establece un mtodo para la deteccin y enumeracin en agua de coliformes totales, coliformes fecales (termotolerantes) y Escherichia coli presuntiva mediante el cultivo en un medio liquido en tubos mltiples y l clculo de sus nmeros ms probables (NMP) en la muestra. Este mtodo es aplicable para todo tipo de agua, incluyendo aquellos que contienen una cantidad apreciable de materia en suspensin. La seleccin de las pruebas usadas en la deteccin y confirmacin del grupo de organismos coliformes, incluyendo E. coli, puede verse como parte de una secuencia continua. El grado de confirmacin con una muestra en particular depende parcialmente de la naturaleza del agua y parcialmente de las razones para realizar el examen. En la prctica, la deteccin de E. coli presuntiva da usualmente una indicacin satisfactoria de contaminacin fecal. FECHA DE REALIZACIN: 13 de octubre de 2009
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El mtodo NMP se basa en la inoculacin de alicuotas de la muestra, diluida o sin diluir, en una serie de tubos de un medio de cultivo lquido conteniendo lactosa. Los tubos se examinan a las 24 y 48 horas de incubacin ya sea a 308 o 310K (35 o 37C). Mediante tablas estadsticas se lleva acabo l clculo del numero ms probable (NMP) de organismos coliformes, organismos coliformes termotolerantes y E. coli que pueda estar presente en 100 ml. de muestra, a partir de los nmeros de los tubos que dan resultados confirmativos positivos.
CALIDAD
NO. DE TUBOS CON REACCIONES POSITIVAS 3 TUBOS CON 10ml. 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 TUBOS CON 1ml. 0 0 1 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 3 TUBOS CON 0.1ml. 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3
INDICE DEL NMP POR 100ml. <3 3 3 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 23 39 64 43 75 120 93 150 210 240 460 1100 >2400
LMITE CONFIABLE DE 95% INFERIOR SUPERIOR
CRITERIO DE ACEPTACIN
EXCELENTE
<0.5 <0.5 <0.5 1 1 3 3 1 3 3 7 4 10 4 7 15 7 14 30 15 30 35 36 71 150
9 13 20 21 23 36 36 36 37 44 89 47 150 120 130 280 210 230 380 380 440 470 1300 2400 4800 NO ACEPTABLE DUDOSA ACEPTABLE RECOMENDABLE
MUY BUENA
BUENA
REGULAR
MALA
3 3 3 3
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En la anterior tabla se muestra el ndice del NMP y lmite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan tres tubos con porciones de 10 ml., tres tubos con porciones de 1 ml. y tres con porciones de 0.1 ml. Resultados positivos indican que existe presencia de: Organismos coliformes: son aquellos capaces de crecer de manera aerbico ya sea 3081K (351C) o 3101K (371C) en un medio de cultivo lquido lactosado con produccin de cido y gas dentro de un periodo de 48 horas. Organismos coliformes fecales (termotolerantes): son en primer trmino organismos coliformes que tienen las mismas propiedades fermentativas a 3170.5K (440.5C).
MATERIAL 1. Pipetas estriles 2. 18 tubos de ensayo con caldo lactosado y tubos Durham (preparados la prctica anterior) 3. Muestras de agua 4. Purpura de bromocresol 5. Perilla PROCEDIMIENTO Se utilizaran los 18 tubos preparados con caldo lactosado en la prctica anterior. 9 tubos servirn para determinar la calidad de una muestra de agua del grifo. 9 tubos servirn para determinar la calidad de una muestra de agua de marca comercial (purificada) 1. Toma tres tubos de la primera serie y, con ayuda de una pipeta y perilla, coloca 10 ml. de la muestra de agua en cada uno. 2. Toma otros tres tubos de la primera serie y coloca 1 ml. de la muestra de agua en cada uno. 3. Toma los ltimos tres tubos de la primera serie y coloca 0.1 ml. de la muestra de agua en cada uno. 4. Repite este procedimiento con la segunda serie y la segunda muestra. 5. Coloca los 18 tubos en la estufa con el fin de incubar por 24 hr.
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6. Cumplido el plazo, saca los tubos de la estufa y coloca 2 o 3 gotas de prpura de bromocresol a cada tubo. 7. Registra los resultados que muestra el vire o no vire del indicador. ESQUEMAS Y OBSERVACIONES Nota: Debido a que agregamos las gotas de prpura de bromocresol antes de la siembra e incubacin, tuvimos que esterilizar los tubos en la olla exprs. Imgenes despus de la incubacin: Serie 1: Agua de grifo. 3 tubos con 10ml. de muestra 3 tubos con 1ml. de muestra
3 tubos con 0.1ml. de muestra
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Serie 2: Agua purificada marca Santorini. 3 tubos con 10ml. de muestra 3 tubos con 1ml. de muestra
En todos los tubos de la primera serie hubo presencia de microorganismos, ya que se pudo apreciar sedimentacin. Tambin se not la presencia de gas dentro de los tubos Durham en 5 de los 9 tubos de la primera serie, lo que indica la generacin de CO2, y con ello la presencia de coliformes (E. coli) Diferente al caso de la serie 2, donde los tubos no presentaron cambios de color, ni presencia de sedimentos o gas:
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Tablas de resultados: PRIMERA SERIE = MUESTRA DE AGUA DE GRIFO NUMERO DE TUBO 1 2 3 NUMERO DE POSITIVOS 10ml. 2 1ml. 2 0.1ml. 1
SEGUNDA SERIE = MUESTRA DE AGUA MARCA SANTORINI NUMERO DE TUBO 1 2 3 NUMERO DE POSITIVOS 10ml. 0 1ml. 0 0.1ml. 0
Produccin de gas Produccin de acidez (verificado por el vire de azul a amarillo) Presencia de precipitado (crecimiento de microorganismos) Ningn cambio. La muestra de agua de grifo, segn el NMP, presenta 28 NMP por cada 100ml. Calidad: Buena Criterio de aceptacin: Aceptable La muestra de agua purificada Santorini, segn el NMP, presenta menos de 3 NMP por cada 100ml. Calidad: Excelente Criterio de aceptacin: Recomendable
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CONCLUSIN Mediante la realizacin de esta prctica de conoci el mtodo para calcular la presencia de microorganismos presentes en una muestra de agua, utilizando el mtodo del nmero ms probable. BIBLIOGRAFA NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-127-SSA1-1994 Salud ambiental, agua para uso y consumo humano-lmites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilizacin.
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AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS POR MTODOS DIRECTOS
PRCTICA No. 8
FECHA DE REALIZACIN: 20 de octubre de 2009
OBJETIVO: Aprender y practicar las tcnicas de aislamiento por medio de la estra cruzada y el mtodo de las diluciones. Aplicar tcnicas de cuantificacin por observacin microscpica directa para determinar la abundancia relativa de microorganismos en muestras de suelo y agua. FUNDAMENTOS TERICOS: Aislamiento de microorganismos Los microorganismos generalmente se encuentran en la naturaleza como poblaciones mixtas y para poder caracterizar e identificar un tipo particular de microorganismos, este debe ser aislado y conservado como un cultivo puro o axnico, que significa que esta formado por microorganismos de la misma especie. Para el aislamiento de microorganismos se cuentan con varios mtodos, los ms usados son: el mtodo de la estra cruzada y el mtodo de las diluciones. El mtodo de la estra cruzada consiste en depositar en un rea de la placa de medio de cultivo slido una asada de la muestra o cultivo mixto que sirve de inculo, se extiende el inculo con el asa haciendo varios trazos en forma de secante cada vez mayor de la orilla hacia el centro, pero solamente a una distancia de 1 a 2 centmetros de la orilla. Se esteriliza el asa, se deja enfriar o se introduce en el medio en un lugar que no interfiera con las siguientes estras. Se gira la caja de Petri 1/5 de la vuelta y con el asa esterilizada se hace una nueva serie de estras que deben extender una pequea porcin de la pequea serie en forma similar con trazos que vayan de la orilla hacia el centro. La operacin se repite dos veces ms y en la quinta se hace una serie de estras abiertas que termine en o cerca de centro, cuidando que no se toque las estras anteriores. El mtodo de las diluciones consiste en hacer una serie de diluciones, generalmente decimales, de las cuales se toman alcuotas que se siembran en medios de cultivos slidos ya sea depositando la alcuota en la superficie y
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dispersndola uniformemente con una varilla de vidrio; o bien mezclando la alcuota con un medio de cultivo fundido en un tubo y enfriado a 450 C y vaciando inmediatamente en una caja de Petri estril. Las colonias aisladas presentan caractersticas morfolgicas diferentes debido a que cada grupo filogentico de microorganismos tienen, caractersticas peculiares que se ven influidas por las condiciones del medio. Una colonia se desarrolla en un medio slido y procede de una sola bacteria, espora o agrupacin de microorganismos de la misma especie, a los que se les denomina unidades formadoras de colonias (UFC). Para determinar el nmero de UFC en una muestra procesada por el mtodo de las diluciones se cuenta el nmero de colonias formadas en las placas, de preferencia aquellas que tengan entre 30 y 300. Se calcula el nmero de UFC contenidas en un mililitro de la dilucin usada para inocular cada placa y se multiplica por la inversa de la dilucin correspondiente. No todas las bacterias viables presentes en una muestra pueden cultivarse in Vitro; dependiendo de la muestra, se estima que solamente crecen en los diferentes medios de cultivo entre un 20 y 50% de las especies presentes. Esto es debido a que algunas de ellas viven en simbiosis obligada, o son inhibidas por otros microorganismos presentes, o en los medios usados crecen muy lentamente, o son inhibidas por los componentes de los medios de cultivo, o tienen requerimientos nutricionales que el medio de cultivo no les proporciona, etc. Tambin para el xito del aislamiento de microorganismos a partir de muestras de ambientes naturales se pueden requerir de medios de transporte especiales o de tcnicas de enriquecimiento previas, y cultivo en medios ricos, selectivos o diferenciales. El oxgeno puede ser esencial para algunos microorganismos, pero txico para otros. La capacidad de los microorganismos para crecer en presencia o ausencia de oxgeno, est directamente relacionada con su metabolismo y con la presencia o ausencia de enzimas que los protegen del efecto txico de los productos del oxgeno (por ejemplo, superxido dismutasa y catalasa). Con base en los requerimientos de oxigeno, los microorganismos se han agrupado en: aerobios estrictos, anaerobios facultativos, anaerobios estrictos, anaerobios aerotolerantes y microaeroflicos. Los microorganismos aerobios estrictos respiran usando el oxgeno como aceptor final de electrones en su cadena respiratoria; los anaerobios facultativos pueden obtener su energa tanto por procesos respiratorios como fermentativos, es decir, tener como aceptores finales de electrones al oxgeno o compuestos
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orgnicos. Los microorganismos microaeroflicos requieren oxgeno pero a tensiones menores de 15%. Cuantificacin de microorganismos La estimacin de la poblacin microbiana por mtodos directos, se ha empleado en forma usual por diferentes investigadores. Los mtodos que se han descrito se pueden adaptar a diversos tipos de hbitat. Por otro lado, la observacin directa de microorganismo en muestras de suelo y agua, permiten conocer el tipo, la forma y las posibles agrupaciones de los diferentes microorganismos de la comunidad. Las cuantificaciones de microorganismos realizadas por mtodos directos, en general permiten obtener valores ms elevados con respectos a las determinaciones de cuenta viable, Esto es debido a que se incluyen clulas no viables y an aquellas que no pueden crecer en los medios de cultivos usuales empleados en le laboratorio. Los mtodos directos para cuenta de microorganismos empleados en estudios preliminares resultan complementarios a los mtodos indirectos, logrndose as obtener resultados de mayor confiabilidad. REINO PROTISTA Dinoflagelados: Los dinoflagelados son el segundo grupo ms importante del fitoplancton, que es el responsable de la produccin de energa en la cadena trfica ocenica. Tienen una estructura semejante a un ltigo llamada flagelo, que acta como rgano de locomocin y muestran caractersticas tanto de vegetales como de animales. Los dinoflagelados pueden reproducirse con rapidez, produciendo grandes poblaciones de forma inmediata; ciertas especies, mediante este tipo de crecimiento, forman las mareas rojas txicas que matan a los peces y contaminan los mariscos.
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Ciliados: Los protozoos ciliados son organismos unicelulares que se impulsan mediante unas diminutas proyecciones, a modo de pelos, llamadas cilios. Adems de servir para la locomocin, los cilios tambin tienen la funcin de crear corrientes que ayudan a arrastrar pequeas partculas alimenticias hacia el interior de una depresin pequea de la superficie del cuerpo, a travs de la cual se ingiere el alimento. Los protozoos ciliados viven en el agua o el suelo, o establecen relaciones como parsitos o simbiontes de otros organismos, En los suelos, los ciliados actan en la descomposicin de los organismos, disgregando la materia orgnica en sustancias que pueden ser utilizadas por otros seres vivos.
Ameba engullendo a un paramecio: Aqu se muestra a una ameba o amiba, un organismo unicelular carente de rganos internos, que atrapa a un paramecio y comienza a engullirlo, rodendolo con dos grandes proyecciones de su citoplasma, llamadas seudpodos. Cuando el paramecio es engullido por completo, se forma alrededor de l una primitiva cavidad digestiva, llamada vacuola. En sta, los cidos descomponen el paramecio en nutrientes, que pueden difundirse por el citoplasma de la ameba.
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Anatoma de un protozoo (Paramecio):
Estructura de la membrana
Vacuola llenndose de agua
Vacuola pulstil llena de agua, la cual se abre y la libera al exterior.
MATERIAL Biolgico: a) Muestras de suelo b) Muestras de agua Medios de cultivo, soluciones y reactivos: a) b) c) d) e) 18 tubos con caldo lactosado. 5 tubos con caldo nutrido y una correspondiente azcar. Tubos para realizar pruebas IMViC (Pruebas bioqumicas) Prpura de bromocresol. Agua estril.
Vidriera y diversos: a) Pipetas estriles. b) Campanas de fermentacin. c) Asa bacteriolgica.

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d) e) f) g) Matraz volumtrico de 100ml. Mecheros. Balanza granataria. Estufa.
PROCEDIMIENTO Primera parte: Cuantificacin de microorganismos por mtodos directos: 1. Con las muestras de suelo se realiza una dilucin de 1 gramo en un matraz volumtrico de 100 ml. 2. Con una pipeta estril, depositar en la primera serie de 9 tubos con caldo nutritivo, 10ml de la suspensin en tres tubos, 1ml en otros tres y 0.1ml en los ltimos tres. 3. Repetir el paso anterior con la segunda muestra de suelo. 4. Incubar por 48 horas y aplicar dos gotas de prpura de bromocresol para observar el cambio. Pruebas bioqumica y de azucares: 1. Utilizando una muestra de agua, que haya dado positivo en la prctica anterior, se realizarn las pruebas IMViC. 2. Se realizarn las pruebas de azucares. ESQUEMAS Y OBSERVACIONES Dilucin de tierra:
Se disolvi un gramo de cada muestra de tierra en un volumen de mezcla total de 100 ml.
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Imgenes despus de la incubacin: Serie 1: Tierra de tomada de rea verde en la escuela. 3 tubos con 10ml. de muestra 3 tubos con 1ml. de muestra
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Serie 2: Arena. 3 tubos con 10ml. de muestra 3 tubos con 1ml. de muestra
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Tablas de resultados: PRIMERA SERIE = TIERRA NUMERO DE TUBO 1 2 3 NUMERO DE POSITIVOS 10ml. 2 1ml. 2 0.1ml. 1
SEGUNDA SERIE = ARENA NUMERO DE TUBO 1 2 3 NUMERO DE POSITIVOS 10ml. 0 1ml. 0 0.1ml. 0
Produccin de gas Produccin de acidez (verificado por el vire de azul a amarillo) Presencia de precipitado (crecimiento de microorganismos) Ningn cambio. La muestra de tierra de la primera serie, segn el NMP, presenta ms de 2,400 NMP por cada 100ml. de solucin formada con agua estril. Calidad: Mala Criterio de aceptacin: No aceptable La muestra de arena en la segunda serie, segn el NMP, presenta igualmente ms de 2,400 NMP por cada 100ml. de solucin formada con agua estril. Calidad: Mala Criterio de aceptacin: No aceptable
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Pruebas bioqumicas: Trabajamos con uno de los tubos que dieron positivo (produccin de gas) en la prctica anterior (muestra de agua del grifo): Prueba IMViC: Indol MV Agar Citrato
Positivo Se cometi un error al aplicar el indicador, pues en la prueba de indol, rojo de metilo y Voges-Proskauer se aplico purpura de bromocresol y no los correctos reactivos: Indol: Reactivo de Erhlich-ter Rojo de metilo: Rojo de metilo Voges-Proskauer: Hidrxido de potasio-naftol Pruebas de azucares: Casena Dextrosa Fructuosa Sacarosa
Negativo
cido y gas
cido y gas
cido y gas
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Se realizo tincin de Gram y se obtuvo positivo. Entonces la bacteria es: Gram: + Citratos: + Dextrosa: cido y gas Fructuosa: cido y gas Sacarosa: cido y gas Casena: CONCLUSION Mediante la realizacin de esta prctica realizamos diluciones de suelo en agua y determinamos la cantidad de organismos por el mtodo de nmero ms probable; adems aplicamos tcnicas que en prcticas posteriores realizaremos de manera ms exacta. BIBLIOGRAFA Multimedia de diferencias bioqumicas http://nhscience.lonestar.edu/biol/wellmeyer/media/media.htm
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CINTICA DE FERMENTACIN
PRCTICA No. 9
FECHA DE REALIZACIN: 10 de noviembre de 2009
OBJETIVO: Llevar a cabo una fermentacin alcohlica utilizando levadura (Saccharomyces cerevisae), con el fin de determinar la cintica de la reaccin al cuantificar el sustrato y la poblacin microbiana en la cmara de Neubauer. FUNDAMENTOS TERICOS: La fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico realizado por las levaduras y algunas clases de bacterias. Estos microorganismos transforman el azcar en alcohol etlico y dixido de carbono. La fermentacin alcohlica, comienza despus de que la glucosa entra en la clula. La glucosa se degrada en un cido pirvico. Este cido se convierte luego en dixido de carbono y etanol. La levadura ms comn para llevar a cabo la fermentacin es la Saccharomyces cerevisae. La reaccin que se lleva a cabo es:
HEXOSA + CELULAS MAS CELULAS + ETANOL + DIOXIDO DE CARBONO SUSTRATO + CELULAS MAS CELULAS + PRODUCTO
O de una manera ms correcta:
SUSTRATO
CELULAS
CELULAS
PRODUCTO
En un medio de azucarado el desarrollo de un microorganismo viene acompaado de la degradacin o consumo de nutrientes y de la formacin de productos. El estudio de los cambios de concentracin con respecto al tiempo, en estos tres tipos de elementos (clulas, sustrato y producto) se les denomina cintica de fermentacin. Si se dispone de una tcnica efectiva de evaluacin
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cualitativa y cuantitativa de la concentracin de una poblacin microbiana y tcnicas analticas para determinar sustrato y producto, es posible seguir y estudiar la cintica de una fermentacin, el estudio consiste en seguir en funcin del tiempo (t) la concentracin celular (CC), del nutriente limitante (sustrato) (S) y del producto formado (P). Las consideraciones de ingeniera son tan importantes como los factores qumicos y biolgicos involucrados. La cintica del proceso necesita ser exactamente determinada y modelada:
rg = CC
Donde:
g rg = velocidad de crecimient o celular , 3 . dm h g C C = concentrac in de clulas , . 3 dm = velocidad de crecimient o especfico , h 1 .
[ ]
De acuerdo al modelo de Monod:
dCc CC = rg = max S C dt K S + CS
En reactores intermitentes donde ha se lleva a cabo fermentacin alcohlica con Saccharomyces cerevisae, se ha determinado para este modelo:
max = 0.3284383h1 K S = 1.694347

MATERIAL 1. Levadura 2. Jugo de fruta o solucin azucarada. 3. 1 recipiente de cristal con un volumen efectivo de 1L=1dm3 con tapn horadado. 4. Tubo de ensaye.
g dm3
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5. 6. 7. 8. 9. Manguera de hule. Microscopio. Cmara de Neubauer. Oxigenador. Brixmetro.
PROCEDIMIENTO 1. Vierte el jugo de frutas o la solucin azucarada en el recipiente de vidrio (previamente esterilizado en seco) 2. Normaliza para iniciar la fermentacin a 25 grados Brix (para fines de esta prctica la sacarosa ser equivalente a la hexosa sustrato-) 3. Pesa un gramo de levadura y aade al reactor. 4. Oxigena la mezcla y cuantifica la cantidad de UFC con la cmara de Neubauer. Esta determinacin es importante para conocer los gramos subsecuentes por regla de tres. 5. Coloca el tapn horadado y la manguera de hule; el extremo opuesto de esta deber ser introducido en el tubo de ensaye con agua (permitir observar la produccin de dixido de carbono que no se cuantificar) 6. Determina las UFC y los grados Brix cada 24 horas (hasta completar 72) 7. Elabora una tabla de la cintica y modela el sistema.
REACTOR INTERMITENTE
Solucin Azucarada + Levadura Etanol

oo
CO2
ESQUEMAS Y OBSERVACIONES
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Preparamos una solucin azucarada de panela; a los 20C deteminamos los grados Brix, y diluimos con agua destilada y esterilizada hasta obtener 25Brix.
(1Brix=10g de sacarosa/ml de solucin) Recordemos que para fines prcticos la concentracin de sacarosa ser igual a la de la glucosa. Por lo tanto al tiempo cero, la concentracin del sustrato es de 250 g/dm3. Tabla de observaciones: t (h) 0 24 48 72 Brix 25 24 20 18
CS g 3 dm
250 240 200 180
Oxigenamos la mezcla y determinamos las UFC al inicio (t=0)
107
Observacin en Cmara de Neubauer 36 40 74 92
t (h)
UFC/dm3
CC g 3 dm
1 1.11 2.05 2.55
0 24 48 72
4.5x1010 5x1010 9.25x1010 1.15x1011
La CC se obtiene al deducir que en el tiempo inicial se agreg 1 g en un litro de solucin, y ese gramo represent 4.5x1010 UFC/dm3, por lo tanto las UFC/dm3 calculadas en los siguientes tiempos sirven para determinar la concentracin en esos tiempos.
TABLA CINTICA:
t (h) 0 24 48 72
CC g 3 dm
1 1.11 2.05 2.55
CS g 3 dm
250 240 200 180
La velocidad promedio de crecimiento de la levadura, tomando el modelo de Monod, fue de:
rg = 0.3
g dm 3 h
CONCLUSION En esta prctica pudimos aplicar las tcnicas de conteo en la cmara de Neubauer y la cuantificacin de azucares con el brixmetro, observamos el proceso de la fermentacin y determinamos la velocidad con que crece la levadura.
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BIBLIOGRAFA Welch, C.A., Fishleder, J., Ciencias biolgicas de las molculas al hombre, CECSA,1979. Fogler, H.S., Elementos de ingeniera de las reacciones qumicas, PesarsonPrentice Hall, 2008.
109
110
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FLUCTUACIN DE MICROORGANISMOS EN LA ATMSFERA
PRCTICA No. 9
FECHA DE REALIZACIN: 17 de noviembre de 2009
OBJETIVO: Identificar la manera en que influyen los factores ambientales y geogrficos, en relacin al crecimiento microbiano, en un rea geogrfica determinada. FUNDAMENTOS TERICOS: Se entiende por crecimiento microbiano al incremento en forma ordenada de los componentes moleculares y el consecuente incremento del nmero de individuos. El crecimiento de los microorganismos en los medios de cultivo slido se evidencia por la formacin de colonias (conjunto de individuos originados a partir de un solo individuo), o por la formacin de turbidez, pelcula o sedimento en los medios lquidos. Como todo ser vivo, los microorganismos necesitan de nutrientes y determinadas condiciones para poder crecer y desarrollar sus diversas funciones vitales. Factores ambientales Temperatura: Dependiendo de su procedencia requerir una temperatura ptima determinada para su crecimiento. Existen tres grupos; psicrfilo (15 a 20 C), mesfilo (25 a 40 C) o termfilo (45 a 60 C). Oxgeno: El microorganismos ser aerobio si requiere de oxgeno para su crecimiento; anaerobio si requiere de un ambiente carente de oxgeno pues este elemento le es txico; microaeroflico, si la atmsfera en la que tiene que crecer no excede el 5% de oxgeno; o anaerobio facultativo, si puede crecer indistintamente en presencia o ausencia de oxgeno. pH: Un medio ligeramente neutro es el adecuado para la gran mayora de los microorganismos. Sin embargo, existen microorganismos con capacidad de crecer en ambientes tan cidos como los Thiobacillus ihioxidans que crece en medios con pH de hasta 1.0 (ptimo 2.0 a 2.8),
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pues esta bacteria es capaz de producir cido sulfrico. Otras en cambio pueden crecer en ambientes alcalinos como las Nitrosomonas que crecen en medios muy alcalinos con pH 10 (ptimo 8.0 a 8.8). Humedad y actividad del agua: Los microorganismos requieren de agua para su crecimiento y reproduccin. La disponibilidad de agua en el ambiente es muy variable; por ejemplo en suelos desrticos el agua es un factor que limita el crecimiento microbiano, mientras que en los lagos el agua no es un factor que limite la actividad microbiana. Presin: En el nivel del mar la presin atmosfrica es una atmsfera (1 atm = 760 mm Hg). En los cuerpos de agua, por cada 10 m de profundidad se incrementa aproximadamente 1 atm ms. Las Spirillum son bacterias capaces de crecer 15 veces ms rpido en presiones entre 300 a 600 atm que a 1 atm. Las presiones hidrostticas elevadas parecen inhibir la sntesis de ADN, ARN y protenas; el transporte a travs de la membrana celular; y la actividad de muchas enzimas por la modificacin de su estructura terciana. Radiacin: La entrada constante de la luz a los ambientes, permite la formacin de un espectro variado de longitudes de onda de los rayos UV, visibles, infra-rojos, rayos X, gamma, etc. Estas radiaciones se hacen ionizantes cuando interactan con la materia produciendo iones inestables y radicales libres que pueden provocar destruccin, mutacin o muerte de los microorganismos al incidir sobre ellos. La misma radiacin ultravioleta puede ser germicida a longitudes de onda de 260 nm que coincide con la mxima absorcin del ADN, lo que sugiere que el dao del ADN es el principal mecanismo del efecto germicida. Movimiento: El movimiento del aire y del agua favorece la dispersin pasiva de los microorganismos. De manera similar el movimiento es importante en la introduccin y distribucin de los nutrientes en el medio para el crecimiento microbiano, adems de la remocin de los productos metablicos que ocasionalmente puedan ser txicos. La introduccin de materiales y el movimiento de estos dentro del ecosistema estn controlados por diversos factores tales como la solubilidad, difusin, viscosidad, gravedad especfica, porosidad y las caractersticas del ecosistema. Espacio: En condiciones de laboratorio, un espacio determinado, como un caldo de cultivo, puede no ser un factor importante para el crecimiento inicial de los microorganismos; sin embargo cuando se incrementa la
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densidad poblacional, se reduce la disponibilidad de nutrientes y oxgeno y se incrementan los productos de desecho que puede limitar el crecimiento. En la naturaleza no es as porque el microorganismo restringe su crecimiento a superficies o medios favorables. En ecosistemas terrestres, la textura del suelo se usa como un ndice del rea disponible para los microorganismos MATERIAL 1. Cajas de Petri con agar nutritivo. 2. Termmetro 3. Reloj. PROCEDIMIENTO 1. Acudir al cerro del borrego situado en la ciudad de Orizaba Veracruz. 2. Los equipos se dividirn para posicionarse en diferentes alturas del cerro del borrego para abrir las cajas. 3. Sincronizar relojes con el resto del grupo a fin de que la toma de la muestra se realice al mismo tiempo sin importar la distancia recorrida. 4. Una vez situados, abrir las cajas de Petri durante 15 minutos; tomar la temperatura y anotar cuantas personas o animales pasan alrededor de la caja. 5. Llevar a incubacin durante 24 horas. ESQUEMAS Y OBSERVACIONES A m me toc subir hasta la cima del cerro. Pasaron 36 personas y 3 perros. La temperatura inicial fue de 20C y disminuyo a los 15 minutos hasta 19C.
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Caja de Petri
Observaciones
En la fotografa se muestra la muestra tomada en el cerro del borrego ya cultivada.
Frotis Hmedo
Fotografa tomada con el objetivo 10X
Fotografa tomada con el objetivo 40X
En el frotis hmedo se puede observar la presencia de muchos microorganismos y su las morfologas que predomina son cocos.
CONCLUSION Con esta prctica nos fue posible apreciar la rapidez con que las esporas de microorganismos pueden viajar en la atmsfera y desarrollarse en el momento en que encuentran las condiciones ptimas. Pudimos hacer una comparacin con las cajas de los dems compaeros y notar las diferencias de acuerdo a la zona de muestreo.

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Miguel ngel Rendn Sagardi Ingeniera Qumica

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MANUAL DE PRCTICAS ELABORADO Y REVISADO POR:

M.C. GUSTAVO ADOLFO MIRANDA ROSAS M.C. RAL PREZ VILA

PERTENECIENTES AL DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA Y BIOQUMICA DEL INSTITUTO TECNOLGICO DE ORIZABA

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NOMBRE DE LA MATERIA: MICROBIOLOGA AMBIENTAL

NOMBRE DEL MAESTRO TITULAR: M.C. RAL RREZ VILA

NOMBRE DEL ALUMNO: MIGUEL NGEL RENDN SAGARDI

NO. DE CONTROL: 07010179

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NDICE DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL

8. AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS POR MTODOS DIRECTOS

10. FLUCTUACIN DE MICROORGANISMOS EN LA ATMSFERA

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LABORATORIO DE INGENIERA AMBIENTAL ENERO 1998

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10 REGLAMENTO DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE INGENIERA AMBIENTAL

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OBJETIVOS GENERALES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL

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FECHA DE REALIZACIN: 08 de septiembre de 2009

1500 1500 1500 15000-100000 6000-400000 1000000100000000

100-200 100-200 100-200 1 a 10 1 <0.1 a 1

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Seco fuerte (40x)

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Mapa conceptual de las partes del microscopio:

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GRAM POSITIVO Fijacin Cristal violeta Lugol

Decoloracin Alcohol-cetona Safranina

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Frotis con Cristal Violeta

Frotis con Cristal Violeta y Lugol

Frotis con Cristal Violeta, Lugol y Alcohol-Cetona