Práctica 7: Preparación tampón SSC.

Alejandra Vázquez Ortiz

1ºLABCB
Biología Molecular y citogenética.
14/02/2024

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1. Fundamento

El tampón salino de citrato sódico o citrato de sodio salino (SSC) es una solución clásica para
procedimientos de hibridación en biología molecular. Se utiliza para la desnaturalización y
limpieza en varios ensayos de hibridación, como en los protocolos de transferencia con
técnicas Southern o técnica FISH.

Los componentes principales son el cloruro de sodio y el citrato de sodio. El citrato de sodio
actúa como tampón, y los iones salinos pueden unirse al ácido nucleico cargado
negativamente para hacerlo eléctricamente neutro, lo que favorece la unión de la sonda a la
secuencia diana.

La solución SSC también puede utilizarse en la preparación del gel de separación para
electroforesis SDS-PAGE en la hibridación de ácidos nucleicos. Las concentraciones más
utilizadas son 2X y 0,5X. La concentración 2X SSC se utiliza para lavados donde retirar las
sondas de unión no específica. La concentración de 0,5X SSC se utiliza para aumentar la
estabilidad de la cadena de ácido nucleico y la repulsión entre ARN/ADN.

2. Material y reactivos
Materiales.
- Vaso de precipitados.
- Matraz aforado 100 mL, 250 mL y 500 mL.
- Balanza.
- Pipeta pasteur.
- Agitador magnético calefactor.
- Embudo.
- Vidrio de reloj.
- Espátula.
- Pipeta 10 mL.
- Auxiliar de pipeta.
- Varilla agitadora.
- Frasco lavador.
- Probeta.
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- Tiras reactivas de pH.
- Papel de filtro.
Reactivos.
- Citrato sódico 2-hidratado 0,3 M.
- Citrato sódico 1/5-hidratado 0,3 M.
(Se elegía una de las dos especies).
- Cloruro sódico 3 M.
- Agua destilada.

3. Procedimiento

a) Se prepararán 100 mL disolución de SSC 20X formado por:

- Cloruro sódico (NaCl) 3 M
- Citrato sódico 0,3 M
- pH 7.0

b) A partir de la disolución anterior, preparar 500 mL SSC 2X y 250 mL SSC 0,5X

c) Comprueba que el pH con una tira reactiva.

4. Cálculos.
• Para el Cloruro sódico.
Se prepara cloruro sódico 3 M en 100 mL de agua destilada.
Para ello se realizan los siguientes cálculos.
M= n/V (L).
M= g/Pm x V
G NaCl= M x Pm x V= 3 mol/l x 58,5 g/mol x 0,1 L.
G NaCl= 17,55 g
• Para el Citrato Sódico 2H2O.
Se prepara Citrato sódico 2H2O en 100 mL de agua destilada.
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 Para ello se realizan los siguientes cálculos.
M= n/V (L).
M= g/Pm x V
G Citrato Sódico= M x Pm x V= 0,3 mol/l x 264,10 g/mol x 0,1 L
G Citrato Sódico= 7,92 g.

• Para preparar la dilucion del tampón en 250 mL.

Se hará una dilución del tampón preparado anteriormente en 250 mL a 2X.
Para ello:
C1 X V1= C2 x V2.
20X x V1= 2X x 100 mL
V1= 50 mL.
Se sacarán 50 mL del tampón y se enrasará en el matraz de 250 mL.
• Para la dilución en 500 mL.
Se preparará una dilución del tampón anteriormente preparado en 500 mL a 0,5X.
Para ello:
C1 X V1= C2 x V2.
20X x V1= 0,5X x 500 mL.
V1= 6,25 ml.
Se sacarán 6,25 mL de tampón y se enrasará con agua a 500 mL en el matraz aforado.

5. Resultados e interpretación.
Se preparó el tampón siguiendo el protocolo. Para ello, se diluyó en un vaso de precipitados
agua destilada con los gramos necesarios de cloruro sódico y citrato sódico para

posteriormente trasvasarlo a un matraz aforado de 100 mL.

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Continuadamente, después de homogeneizar la disolución se midió el pH con una tira reactiva.
Se observó que el resultado fue un pH 8 (alcalino) al comparar el color de reacción de la tira
con su guía (la tira viró a color verdoso tirando a tonos azulados oscuros).
El pH debía de ser un pH más bien neutro (7). Sin embargo, se comprobaron las etiquetas de
los reactivos y efectivamente el reactivo utilizado, en este caso el citrato sódico dihidratado,
tiene un pH entre 8,6-9,2, por lo que el tampón también debía indicar un pH de entre 8 y 9.
En cambio en otras disoluciones se usó un citrato ½ hidratado. En este caso, las tiras relevaron
un pH ácido (4), que comparándolo con la información del producto es el pH correcto ya que
para este citrato sódico ½ hidratado el pH debía ser de entre 4 y 5, un tono más amarillo
anaranjado.

Una vez medidor el pH de las disoluciones, se prepararon dos diluciones, una a concentración
2X en 250 mL y otra a concentración 0,5 X en 500 mL. Para ello, se sacaron los volúmenes
correspondientes de la disolución madre y se añadieron a los dos matraces aforados para
posteriormente enrasar con agua destilada. En este caso no se midieron los pH.
6. Observaciones.
Al ser tanta cantidad de NaCl la que había que añadir para poder producir un tampón a
concentración 20X, fue realmente difícil poder disolver tal cantidad (17,55 g) en agua, ya que
al ocupar un volumen, la cantidad de agua que se podía añadir para disolverlo en un vaso de
precipitados no debía excederse demasiado para no sobrepasar la línea de enrase a la hora
de trasvasar la sustancia. Primero se probó a disolverlo con una varilla, pero al ver que no fue
posible, se pasó a utilizar el agitador magnético calefactor. De esta forma tampoco fue posible
disolverlo por completo, quedando restos de la sal flotando en el agua en el matraz.

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7. Gestión de residuos.
En cuanto al Citrato de sodio, debe almacenarse cerrado herméticamente, conservándose
únicamente en el bote de origen en un lugar fresco y ventilado. Se almacenará alejado de
agentes oxidantes fuertes o productos que promuevan reacción exotérmica. Las cantidades
significativas del producto deben eliminarse según la legislación, no desechándolo por el
desagüe y almacenándolo en un recipiente de residuos para que una empresa se haga
responsable de su eliminación.
Sus pictogramas son los siguientes:

En cuanto al cloruro de sodio (NaCl), se debe almacenar en un lugar seco y bien cerrado. Para
su eliminación, se debe de seguir la legislación pero no iré requisitos específicos, ya que al ser
catalogado como residuo cotidiano tiene el carácter de residuos especiales, es decir, no se
desechará como residuo doméstico pero no seguirá un desecho específico.
Sus pictogramas son: