PRÁCTICA Nº 13

MARCADORES MOLECULARES: ISOENZIMAS

I INTRODUCCIÓN
Las isoenzimas son distintas formas moleculares de una misma enzima que
presentan o muestran especificidad por el mismo sustrato. Ej. Las distintas formas
moleculares de alcohol deshidrogenasa (ADH) se diferencian en la carga eléctrica neta,
en el peso molecular o en ambas simultáneamente, pero todas ellas deshidrogenan el
alcohol (sustrato) convirtiéndolo en aldehído. La principal característica de las
isoenzimas es que deben tener la misma especificidad de sustrato.

La técnica que habitualmente se emplea para estudiar las isoenzimas es la electroforesis,

que permite separar las moléculas por su diferente carga, tamaño o ambas bajo la acción
de un campo eléctrico. Las alteraciones en la carga eléctrica neta se producen por
sustitución de un aminoácido por otro de distinta polaridad, por ejemplo, cambio de un
aminoácido ácido por otro básico o neutro.

Algunos autores opinan que solamente deben considerarse como isoenzimas aquellas
formas moleculares que están presentes en el mismo órgano o tejido, que tienen un
origen genético similar y actividades catalíticas muy similares. Las peroxidasas, las
esterasas y las fosfatasas presentan distintas formas moleculares en el mismo órgano o
tejido, pero tienen una amplia especificidad de sustrato, de manera que pueden
transformar diferentes compuestos. Además, pueden tener diferentes orígenes y, por
tanto, no se las considera como verdaderas isoenzimas.

La estructura cuaternaria activa de las isoenzimas puede ser fundamentalmente de tres

tipos:
1. Monómeros: isoenzimas que poseen una sola cadena polipeptídica como
estructura cuaternaria activa.
2. Dímeros: isoenzimas cuya estructura cuaternaria activa consiste en la unión de
dos polipéptidos.
3. Tetrámeros: la estructura cuaternaria activa de estas isoenzimas consta de
cuatro polipéptidos.
Las isoenzimas diméricas y tetraméricas pueden estar formadas por subunidades o
polipéptidos iguales o diferentes.
a) Homodímeros: isoenzima formada por dos polipéptidos idénticos.
b) Homotetrámero: isoenzima constituida por cuatro cadenas polipeptídicas
iguales.
c) Homopolímeros: isoenzimas formadas por múltiples cadenas polipeptídicas
idénticas.
d) Heterodímero: isoenzima constituida por dos polipéptidos diferentes.
e) Heterotetrámero: tetrámero constituido por la unión de cuatro polipéptidos
diferentes, pudiendo ser los cuatro distintos gdba, ser tres diferentes aadb, o
tener dos tipos distintos aabb.
Un término que se emplea con bastante frecuencia es el de Patrón Isoenzimático o
Zimograma, conjunto de bandas pertenecientes al mismo sistema enzimático que se
observan en el mismo individuo. Cabe destacar que he utilizado la palabra banda en vez
de la de isoenzima para indicar que una banda que se observa en un gel, después de
llevar a cabo una electroforesis, puede ser una sola isoenzima o la superposición de
varias isoenzimas diferentes con igual migración electroforética.

Otro término usado con mucha frecuencia es el de Alozimas o Alelozimas, empleado

para referirse a las distintas formas moleculares de una misma enzima producidas por
distintos alelos del mismo locus. Naturalmente, el vocablo isoenzima es más amplio, ya
que se incluye tanto a las diferentes formas moleculares de una misma enzima
producidas por alelos de mismo locus, como a las producidas por alelos de distintos
loci.

Localización Subcelular: Distintas isoenzimas muestran diferente localización

subcelular, de forma que unas se encuentran en el citoplasma, otras en las mitocondrias,
algunas en cloroplastos, otras en los glioxisomas, en peroxisomas, etc. Se debe hacer
mención al tejido u órgano en el que se detectan las isoenzimas, también es necesario
tener en cuenta su localización subcelular.

Variabilidad: Con las isoenzimas es posible al menos estudiar tres tipos de variabilidad
genética:

1. Variabilidad tisular: distintos tejidos u órganos de un mismo individuo muestran

diferentes formas moleculares o distintas cantidades relativas de las mismas
isoenzimas.
Por ejemplo, en ratón es posible observar cinco isoenzimas diferentes en órganos
tales como riñón, corazón, hígado y músculo esquelético. Dichas isoenzimas se
denominan LDH1, LDH2, LDH3, LDH4 y LDH5 de mayor a menor migración
electroforética. Sin embargo, las cantidades relativas de estas cinco formas
moleculares son distintas en cada órgano o tejido. La más abundante en hígado es
LDH5, mientras que en riñón existe mayor cantidad de LDH1.
2. Variabilidad ontogénica: un mismo tejido u órgano en distintos momentos del
desarrollo muestra diferentes formar moleculares o distintas cantidades relativas de
las mismas isoenzimas.
3. Variabilidad poblacional: distintos individuos en el mismo tejido u órgano y en el
mismo estado de desarrollo presentan diferentes isoenzimas.
Naturalmente, cuando se desea estudiar un tipo de variabilidad es necesario fijar las
otras dos fuentes de variación.

Variabilidad Ontogénica

Un mismo tejido u órgano en distintos momentos del desarrollo puede presentar

diferentes isoenzimas o distintas cantidades relativas de las mismas isoenzimas.

De nuevo, las isoenzimas de Láctico deshidrogenasa (LDH) son un ejemplo de

variabilidad durante el desarrollo en especies animales. En riñón de ratón es posible
observar cinco isoenzimas de LDH que de mayor a menor migración electroforética se
denominan LDH1, LDH2, LDH3, LDH4 y LDH5. Sin embargo, 5 días antes del
nacimiento la isoenzima más abundante en riñón es LDH5, mientras que en el individuo
adulto las isoenzimas más abundantes son LDH1 y LDH2. En este caso se trata de
diferencias en las cantidades relativas de las mismas isoenzimas.

También existen ejemplos en los que un mismo tejido muestra diferentes isoenzimas en
distintos momentos del desarrollo. Por ejemplo, las Peroxidasas de coleoptilo en las
primeras horas de germinación de la semilla de trigo cambian de forma dramática.

Tanto la Variabilidad Tisular como la Variabilidad Ontogénica son consecuencia de una

regulación diferencial, de manera que en todos los organismos diferentes tejidos tienen
diferentes baterías de genes expresándose y, en un mismo tejido en distintos momentos
del desarrollo se expresan diferentes grupos de genes.

Es frecuente hablar de sistemas enzimáticos Constitutivos y de sistemas enzimáticos

Variables. Los Constitutivos son aquellos que se expresan de manera constante a lo
largo del desarrollo y en todos los tejidos, mientras que sistemas Variables son aquellos
cuya expresión cambia a lo largo del desarrollo y de un tejido a otro.

Control Genético de Isoenzimas: Conocer el control genético de las isoenzimas

consiste en averiguar el número de loci que codifican para el sistema enzimático
analizado, el número de alelos de cada locus y las relaciones de dominancia o
codominancia que existen entre los diferentes alelos que dan lugar a las isoenzimas
estudiadas. Igualmente, para descubrir el control genético de las isoenzimas analizadas
es importante conocer su estructura cuaternaria, es decir, el número de cadenas
polipeptídicas del enzima activo. Como ya hemos indicado anteriormente existen
fundamentalmente tres posibles tipos de estructuras cuaternarias activas: monómero (un
polipéptido), dímero (dos polipéptidos) y tetrámero (cuatro polipéptidos)

Naturalmente, la forma más correcta de averiguar la estructura cuaternaria activa de un

enzima es llevar a cabo experimentos bioquímicos de disociación y reasociación de
subunidades "in vitro". Sin embargo, también es posible deducir el comportamiento
monomérico, dimérico o tetramérico de las isoenzimas mediante análisis genético
clásico. Por tanto, siguiendo la misma metodología de Mendel se puede averiguar la
estructura cuaternaria de una isoenzima, y además su control genético. Además del
método utilizado por Mendel, también es posible emplear otras opciones para averiguar
la estructura cuaternaria y el control genético de las isoenzimas, por ejemplo, estudiar
los patrones isoenzimáticos de los diferentes individuos de una población, analizar los
zimogramas de los diferentes tejidos de un mismo individuo y también estudiar los
patrones isoenzimáticos de individuos con diferentes constituciones cromosómicas.

Resumen del método utilizado por Mendel (cruzamientos en los que segrega un
locus).

Obtención de la primera generación filial (F 1 con genotipo Aa) entre dos líneas puras
homocigóticas (P1 con genotipo AA y P2 con genotipo aa). Autofecundación o
cruzamiento de dos individuos de la F1 para conseguir la segunda generación filial (F2).

Observando la apariencia externa (fenotipo) de los individuos de la F 1 (Aa) es posible

deducir las relaciones de dominancia o codominancia de los alelos (A y a) que controlan
el carácter estudiado. Si el fenotipo (patrón isoenzimático) de la F1 es uniforme e igual
al de uno de los parentales (P1 o P2) se trata de un caso de dominancia, si el alelo A
domina sobre a (A>a) la F1 tiene el mismo aspecto que el parental P 1. Los siete
caracteres estudiados por Mendel en guisante mostraban dominancia completa (Primera
Ley de Mendel o Principio de la Uniformidad).

Si en los individuos de la F1 se expresan al mismo tiempo los dos alelos A y a, se dice

que existe codominancia (A=a) y su fenotipo (patrón isoenzimático) es diferente al de
los dos parentales (P1 y P2).

En la segunda generación filial (F2) se observan individuos de tres genotipos distintos en

las siguientes proporciones: 1/4 AA, 1/2 Aa y 1/4 aa. Cuando existe dominancia
completa (A>a) en la F2 se observan dos fenotipos diferentes con las siguientes
proporciones: 3/4 A y 1/4 a. En este caso no es posible distinguir a los homocigotos
dominantes (AA) de los heterocigotos (Aa) ya que ambos muestran la misma apariencia
externa (Segunda Ley de Mendel o Principio de la Segregación).

Sin embargo, si entre los alelos A y a existe una relación de codominancia (A=a), en la
F2 encontraremos tres fenotipos distintos (patrones isoenzimáticos) con las siguientes
proporciones: 1/4 AA, 1/2 Aa y 1/4 aa. En este último caso, a cada genotipo le
corresponde una apariencia externa distinta. Los resultados obtenidos en la F 2 nos
permiten deducir en ambos casos (dominancia completa A>a o codominancia A=a) que
el carácter estudiado (sistema enzimático) está controlado por un solo locus con dos
alelos (A y a).

Hipótesis utilizada para el análisis de los patrones isoenzimáticos.

En todos los casos, de control genético que vamos a estudiar supondremos:
1. Que el análisis se lleva a cabo en un tejido diploide (con dos juegos de
cromosomas).
2. Que todos los loci estudiados se encuentran en autosomas.
3. Que como consecuencia de lo dicho anteriormente, todos los genes se encuentran en
dos dosis.
4. Que los dos alelos de un mismo locus son igualmente activos, de manera que en un
individuo heterocigoto (Aa) en el que existe una dosis de alelo A que produce
cadena polipeptídica a y otra dosis de alelo a que codifica cadena b, hay igual
cantidad de ambas cadenas polipeptídicas (1/2 a : 1/2 b)
5. Que los díferentes monómeros, dímeros o tetrámeros (según el caso) son igualmente
activos y muestran la misma especificidad de sustrato.
6. Que en el caso de los dímeros y tetrámeros, las cadenas polipeptídicas se asocian al
azar para formar dímeros activos o tetrámeros activos, según el caso.
Para comprender mejor como es posible deducir la estructura cuaternaria y el
control genético de las isoenzimas empleando la metodología de Mendel, se va ha
presentar los diferentes casos de estructura cuaternaria, comenzando por la situación
más sencilla de control genético, un locus con dos alelos, y estructura cuaternaria
monomérica.

1.- Un locus con dos alelos con dominancia completa (A>a) y estructura
cuaternaria monomérica.

Supongamos que el alelo activo A lleva información para el polipéptido a y que el alelo
a es un nulo. Un alelo nulo puede ser un alelo amorfo que llevaría información para un
polipéptido no funcional, o podría tratase de una delección o pérdida del gen o alelo que
codifica para el polipéptido correspondiente. Los. individuos homocigotos AA (P1)
producen cadena polipeptídica a y presentan una sola isoenzima (monómero a) los
homocigotos aa (P2) carecen de polipéptido activo y no presentan ninguna isoenzima, y
los heterocigotos Aa (F1) también sintetizan el monómero a y tienen, por tanto, una
isoenzima idéntica a la de los homocigotos AA. Los heterocigotos Aa (F1) tienen el
mismo patrón isoenzimático que los homocigotos dominantes AA. El cruzamiento de
dos heterocigotos (Aa x Aa) produce una F2 con dos clases individuos, los que tienen
una sola isoenzima (monómera) y los que carecen de isoenzima en proporciones 3/4 y
1/4, respectivamente. Esta segregación de la F 2 coincide con la esperada para un locus
con dos alelos y dominancia completa.
Aunque lo más habitual es que exista codominancia entre los alelos que codifican para
isoenzimas, sin embargo, hay ejemplos de dominancia completa, como son las
Peroxidasas, Fosfatasas alcalinas y Esterasas. Estas isoenzimas además tienen en
muchas especies vegetales estructura monomérica.

2.- Un locus con dos alelos codominantes (A=a) y estructura monomérica.

En este caso, ambos alelos (A y a) dan lugar a polipéptidos activos, el alelo A lleva
información para la cadena polipeptídica a y el alelo a para la b. Los individuos
homocigóticos AA (P1) presentan un solo monómero activo (a) y los homocigóticos aa
(P2) muestran otro monómero activo (b) con distinta migración electroforética. El
cruzamiento de ambos homocigotos produce una F1 heterocigótica (Aa) que tiene
simultáneamente las dos isoenzimas (monómeros a y b) observados por separado en los
parentales. Por tanto, en los individuos de la F1 se expresan simultáneamente los dos
alelos, existiendo codominancia.

El cruzamiento de dos heterocigotos (Aa x Aa) produce una F2 con tres clases
individuos, 1/4 AA con una sola isoenzima (monómero a), 1/2 Aa con dos isoenzimas
(monómeros a y b) y 1/4 aa con otra isoenzima de menor migración (monómero b). En
este caso, los dos homocigotos presentan apariencias externas diferentes a las de los
heterocigotos. La segregación obtenida en la F 2 se corresponde con la de un locus con
dos alelos codominantes.

3.- Un locus con dos alelos codominantes (A=a) y estructura cuaternaria dimérica.

El alelo A lleva información para el polipéptido a y el alelo a para la cadena

polipeptídica b. Supondremos que dos cadenas polipeptídicas se asocian al azar para
formar dímeros activos. Los homocigotos AA (parental P1) tienen solamente cadena a y
forman dímeros aa, tienen una isoenzima de migración rápida. Los homocigotos aa
(parental P2) poseen sólo cadena b y producen dímeros bb, poseen una isoenzima de
migración lenta. Hemos supuesto que los dímeros aa y bb muestran diferente
migración electroforética. El cruzamiento de ambos parentales origina una F 1
heterocigótica (Aa) que tiene simultáneamente cadena a y cadena b, por tanto, la
asociación al azar de ambos polipéptidos producirá tres clases de dímeros: aa, ba y bb.
Si suponemos que a y b se producen en igual cantidad (a:b relación 1:1), el
heterodímero (ba+ab) es el doble de probable que los homodímeros aa o los bb.
Por consiguiente, los individuos de la F1 presentan tres isoenzimas (dímeros) diferentes,
dos de ellas tienen la misma migración que las que muestran los parentales por separado
(los homodímeros) y, la otra muestra una migración intermedia entre ambas,
correspondiendo al heterodímero. Las intensidades relativas de las tres isoenzimas
presentes en los heterocigotos son 1:2:1 de mayor a menor migración electroforética,
respectivamente.

Los alelos A y a se están expresando simultáneamente en los heterocigotos (Aa)

existiendo, por tanto, codominancia. Si comparamos los patrones isoenzimáticos de los
individuos de la F1 cuando la estructura cuaternaria es monomérica y dimérica,
llegaremos a la conclusión de que en el primer caso (monómeros), los heterocigotos
(Aa) de la F1 no muestran bandas nuevas de migración intermedia entre las de los
parentales, mientras que en el segundo (dímeros), se observa una banda nueva de
migración intermedia entre las de los parentales.
El cruzamiento de dos heterocigotos (Aa x Aa) produce una F2 con tres clases
individuos, 1/4 AA con una sola isoenzima (dímero aa), 1/2 Aa con tres isoenzimas
(dímeros aa, bay bb) y 1/4 aa con otra isoenzima de menor migración (dímero bb).
Los homocigotos (AA y aa) tienen apariencias externas distintas a la de los
heterocigotos (Aa). La segregación observada en la F 2 corresponde a la de un locus con
dos alelos codominantes.

4.- Un locus con dos alelos codominantes (A=a) y estructura cuaternaria

tetramérica.

El alelo A lleva información para el polipéptido a y el alelo a para la cadena

polipeptídica b. Supondremos que cuatro cadenas polipeptídicas se asocian al azar para
formar tetrámeros activos. Los homocigotos AA (parental P1) tienen solamente cadena a
y forman tetrámeros aaa, tienen una isoenzima de migración rápida. Los homocigotos
aa (parental P2) poseen sólo cadena b y producen tetrámeros bbbb, poseen una
isoenzima de migración lenta. Hemos supuesto que los tetrámeros aaaa y bbbb
muestran diferente migración electroforética.
El cruzamiento de ambos parentales origina una F 1 heterocigótica (Aa) que tiene
simultáneamente cadena a y cadena b, por tanto, la asociación al azar de ambos
polipéptidos producirá cinco clases de tetrámeros: aaaa, aaab , aabb, babb y bbbb.
Si suponemos que a y b se producen en igual cantidad (a:b relación 1:1), los
heterotetrámeros aaab y babb son cuatro veces más probables que los
homotetrámeros aaaa o los bbbb ya que existen cuatro posibles heterotetrámeros del
tipo aaab (aaab+aaab+abaa+abaa) y otros cuatro del tipo babb
(babb+babb+bbba+bbba). De igual forma, el heterotetrámero que posee dos cadenas
a y dos b (aabb) es seis veces más probable que los homotetrámeros ya que existen
seis posibles heterotetrámeros con dos cadenas de tipo a y dos de tipo b
(aabb+baba+baba+abab+abab+bbaa).
Por consiguiente, los individuos de la F1 presentan cinco isoenzimas (tetrámeros)
diferentes, dos de ellas tienen la misma migración que las que muestran los parentales
por separado (los homotetrámeros) y, las otras tres muestran una migración intermedia
entre ambas, correspondiendo a los heterotetrámeros. Las intensidades relativas de las
cinco isoenzimas presentes en los heterocigotos son 1:4:6:4:1 de mayor a menor
migración electroforética, respectivamente.

Los alelos A y a se están expresando simultáneamente en los heterocigotos (Aa)

existiendo, por tanto, codominancia. Si comparamos los patrones isoenzimáticos de los
individuos de la F1 cuando la estructura cuaternaria es monomérica, dimérica y
tetramérica, llegaremos a la conclusión de que en el primer caso (monómeros), los
heterocigotos (Aa) de la F1 no muestran bandas nuevas de migración intermedia entre
las de los parentales, en el segundo (dímeros), se observa una banda nueva de
migración intermedia entre las de los parentales, y en el tercer caso (los tetrámeros) los
heterocigotos muestran tres bandas nuevas de migración intermedia entre las de los
parentales.
El cruzamiento de dos heterocigotos (Aa x Aa) produce una F2 con tres clases
individuos, 1/4 AA con una sola isoenzima (tetrámero aaaa), 1/2 Aa con cinco
isoenzimas (tetrámeros aaaa, aaab , aabb, babb y) y 1/4 aa con otra isoenzima de
menor migración (tetrámeros bbbb). Los homocigotos (AA y aa) tienen apariencias
externas distintas a la de los heterocigotos (Aa). La segregación observada en la F2
corresponde a la de un locus con dos alelos codominantes.
Hasta el momento, hemos considerado que las isoenzimas analizadas se ajustaban a
situaciones sencillas de control genético. En todos los casos, hemos supuesto la
existencia de un solo locus. A partir de ahora, vamos a complicar un poco nuestro
estudio y vamos a tener en cuenta que las isoenzimas analizadas pueden estar
controladas por dos loci independientes, es decir, por dos loci situados en cromosomas
distintos o en el mismo cromosoma pero muy lejos. En cualquier caso, supondremos
que ambos loci (A, a y B, b) se combinan de forma independiente según la Tercera Ley
de Mendel.

Resumen del método utilizado por Mendel (cruzamientos en los que segregan dos
loci).

Obtención de la primera generación filial (F 1 con genotipo AaBb) entre dos líneas puras
homocigóticas (P1 con genotipo AABB y P2 con genotipo aabb). Autofecundación o
cruzamiento de dos individuos de la F1 para conseguir la segunda generación filial (F2).
Observando la apariencia externa (fenotipo) de los individuos de la F 1 (AaBb) es posible
deducir las relaciones de dominancia o codominancia de los alelos A y a y los alelos B y
b que controlan los caracteres estudiados. Si el fenotipo (patrón isoenzimático) de la F1
es uniforme e igual al de uno de los parentales (P 1 o P2) se trata de un caso de
dominancia, si el alelo A domina sobre a (A>a) y el B sobre el b (B>b) la F1 tiene el
mismo aspecto que el parental P1(Primera Ley de Mendel o Principio de la
Uniformidad).
Si en los individuos de la F1 se expresan al mismo tiempo los alelos A y a y los alelos B
y b, se dice que existe codominancia en ambos loci (A=a, B=b) y su fenotipo (patrón
isoenzimático) es diferente al de los dos parentales (P1 y P2).
En la segunda generación filial (F2) se observan individuos de nueve genotipos distintos
en las siguientes proporciones: 1/16 AABB + 2/16 AABb + 1/16 Aabb + 2/16 AaBB +
4/16 AaBb + 2/16 Aabb + 1/16 aaBB + 2/16 aaBb + 1/16 aabb. Estas proporciones se
obtienen de la combinación independiente de lo que le sucede a cada locus por separado
(1/4 AA + 1/2 Aa + 1/4 aa) X (1/4 BB + 1/2 Bb + 1/4 bb). Cuando existe dominancia
completa en ambos loci (A>a, B>b) en la F2 se observan cuatro fenotipos diferentes con
las siguientes proporciones: 9/16 AB, 3/16 Ab, 3/16 aB y 1/16 ab. En este caso no es
posible distinguir a los homocigotos dominantes de los heterocigotos en cada locus.
Esta segregación fenotípica también procede de la combinación independiente de lo que
le sucede a cada locus por separado, (3/4 A + 1/4 a) X (3/4 B + 1/4 b). (Tercera Ley de
Mendel o Principio de la Combinación Independiente).
Sin embargo, si entre los alelos A y a existe una relación de codominancia (A=a), y
entre los alelos B y b también (B=b), en la F2 encontraremos nueve fenotipos distintos
(patrones isoenzimáticos), tantos como genotipos diferentes y con las mismas
proporciones: 1/16 AABB + 2/16 AABb + 1/16 Aabb + 2/16 AaBB + 4/16 AaBb + 2/16
Aabb + 1/16 aaBB + 2/16 aaBb + 1/16 aabb . En este último caso, a cada genotipo le
corresponde una apariencia externa distinta.

5.- Dos loci independientes con dos alelos con dominancia completa en cada locus
(A>a) (B>b) y estructura cuaternaria monomérica.

Supondremos que el alelo A lleva información para el polipéptido a mientras que el

alelo a es un nulo que no lleva información para cadena polipeptídica alguna. De igual
forma, aceptaremos que el alelo B lleva información para el polipéptido b mientras que
el alelo b es un alelo nulo que no codifica para cadena polipeptídica alguna. La
migración del polipéptido a es más rápida que la del polipéptido b, de forma que los
homocigotos AAbb muestran una isoenzima o monómero correspondiente al polipétido
a. Sin embargo, los homocigotos aaBB presentan una isoenzima de menor migración
correspondiente al monómero b. El cruzamiento de los homocigotos AAbb por aaBB da
lugar a una F1 heterocigótica (AaBb) que presenta al mismo tiempo los monómeros a y
b. Es decir, los individuos de la F 1 muestran al mismo tiempo los monómeros a y b
observados por separado en los parentales homocigóticos, tratándose, por lo tanto, de
dominancia completa en ambos loci (A>a y B>b).

El cruzamiento de dos diheterocigotos AaBb x AaBb origina una F2 formada por cuatro
clases de descendientes. Se observan individuos con dos isoenzimas o monómeros
(monómero a y monómero b) de igual aspecto que los individuos de la F 1 (AaBb),
dichos individuos tienen al menos un alelo A y otro B, siendo, por tanto, su genotipo A-
B-. También, se obtienen en esta F 2 individuos que poseen solamente el monómero a y
que tienen al menos un alelo A (genotipo A-bb) e individuos que solamente poseen una
isoenzima (el monómero b) teniendo al menos un alelo B (genotipo aaB-). Por ultimo,
en esta F2 se obtienen también individuos que no presentan ninguna isoenzima o
monómero, dichos individuos son homocigotos para los dos alelos nulos (aabb). Si
tenemos en cuenta que los loci A, a y B, b son independientes, es decir, que se
encuentran en cromosomas diferentes o en el mismo cromosoma, pero muy alejados
entre si, las proporciones con las que se observan estos cuatro tipos de descendientes en
la F2 es la siguiente: 9/16 A-B-, 3/16 A-bb, 3/16 aaB- y 1/16 aabb. Se cumple la
segregación correspondiente a la 3ª ley de Mendel o Principio de la Combinación
Independiente 9 AB: 3 Ab: 3 aB: 1 ab.
Es importante hacer notar que los patrones isoenzimáticos observados en este caso son
idénticos a los descritos para el caso de un locus con dos alelos codominantes (A=a) y
estructura cuaternaria monomérica. La única diferencia es que cuando se trata de dos
loci (A,a y B,b) con dominancia completa (A>a y B>b), en la F2 aparecen individuos que
carecen simultáneamente de las dos isoenzimas o monómeros a y b. Por consiguiente,
para decidir si se trata de un locus con dos alelos codominantes y estructura cuaternaria
monomérica o si se trata de dos loci con dominancia completa y estructura también
monomérica, es necesario observar en la F 2 individuos que carezcan simultáneamente
de ambos monómeros, es decir, individuos sin isoenzimas. Cuando los loci analizados
son independientes, es relativamente fácil encontrar en la F 2 individuos sin los dos
monómeros, ya que la proporción esperada es 1/16. Sin embargo, si ambos loci están
situados sobre el mismo cromosoma y muy cerca (están estrechamente ligados), la
probabilidad de obtener en la F2 individuos que carezcan de ambas isoenzimas o
monómeros es muy baja. De manera que para una distancia genética de 10 Morgan
(Fracción de recombinación r=0,1) y un total de 200 descendientes (N=200), solamente
1/4 p2 N carecerán de ambos monómeros, es decir, ni si quiera se espera un individuo
del tipo aabb, ya que 1/4 x (0,1) 2 x 200 = 0,5. En tal situación (cuando no observamos
individuos aabb), interpretaríamos que las isoenzimas estudiadas son monómeros
controlados por un solo locus con dos alelos activos y codominantes.

6.- Dos loci independientes con dos alelos codominantes cada locus (A=a y B=>b) y
estructura cuaternaria monomérica.

En este caso, los alelos A y a dan lugar a polipéptidos activos, el alelo A lleva
información para la cadena polipeptídica a y el alelo a para la b. Los alelos B y b llevan
información para los polipéptidos activos d y g, respectivamente. Supondremos, para
facilitar la comprensión, que todos los monómeros presentan distinta migración, y que
los monómeros a y b muestran una mayor migración electroforética que los d y g. Los
homocigotos AABB tienen las isoenzimas o monómeros a y d, mientras que los
homocigotos aabb poseen los monómeros b y g. El cruzamiento de ambos homocigotos
(AABB x aabb) origina una F1 diheterocigótica que presenta simultáneamente las cuatro
isoenzimas o monómeros (a, b, d y g). Por tanto, en ambos loci los alelos son
codominantes (A=a y B=b), ya que en el heterocigoto se expresan simultáneamente
ambos alelos. Una de las características de la codominancia es que a cada genotipo le
corresponde un fenotipo o apariencia externa distinta, de manera que los homocigotos
son distintos de los heterocigotos.
El cruzamiento de dos diheterocigotos (AaBb x AaBb) da lugar a una F2 constituida por
nueve clases de individuos diferentes, tantas como genotipos distintos. Los nueve
genotipos diferentes de esta F2 se obtienen combinando de forma independiente lo que
le sucede a cada locus por separado, de manera, que en el locus A,a se observan tres
clases de individuos en las proporciones 1/4 AA + 1/2 Aa + 1/4 aa; en el locus B,b se
obtienen también tres clases de individuos en las proporciones 1/4 BB + 1/2 Bb + 1/4
bb. La combinación independiente de ambos loci (1/4 AA + 1/2 Aa + 1/4 aa) X (1/4 BB
+ 1/2 Bb + 1/4 bb) da como resultado la siguiente segregación en la F 2: 1/16 AABB +
2/16 AABb + 1/16 Aabb + 2/16 AaBB + 4/16 AaBb + 2/16 Aabb + 1/16 aaBB + 2/16
aaBb + 1/16 aabb. En esta F2, como se puede observar, existen nueve fenotipos
diferentes correspondientes a los nueve genotipos anteriormente mencionados. Además,
los individuos de la F2 muestran dos, tres o cuatro monómeros. Los homocigotos para
ambos loci presentan dos isoenzimas: a y d (AABB), a y g (AAbb), b y d (aaBB) o b y g
(aabb). Los diheterocigotos tienen cuatro isoenzimas o monómeros, como los
individuos de la F1: a, b, d y g. Los homocigotos para un locus y heterocigotos para el
otro locus presentan tres monómeros: AABb (a, d y g), aaBb (b, d y g), AaBB (a, b y d)
y Aabb (a, b y g).

La segregación obtenida en la F 2 corresponde a la esperada cuando los loci

analizados son independientes, es decir, cuando se encuentran situados en cromosomas
distintos o en el mismo cromosoma, pero muy lejos. En el caso de que se comporten
como estrechamente ligados (están en el mismo cromosoma y muy juntos) las
proporciones relativas de los diferentes individuos son distintas a las obtenidas en
independencia.
7.- Dos loci independientes con dos alelos codominantes cada locus (A=a y B=>b) y
estructura cuaternaria dimérica.

Supondremos que los alelos codominantes A y a llevan información para los

polipéptidos a y b, mientras que los alelos codominantes B y b codifican para los
polipéptidos d y g. Igualmente, imaginaremos que los cuatro homodímeros posibles
(aa, bb, dd y gg) presentan distinta migración sobre los geles, los homodímeros aa y
bb mayor migración que los homodímeros dd y gg. También supondremos que ambos
loci A,a y B,b codifican para isoenzimas con la misma localización subcelular, por
consiguiente, pueden aparecer heterodímeros entre los polipéptidos codificados por
alelos de distinto locus, es decir, heterodímeros da o ga o db o gb. En tal situación, los
homocigotos AABB muestran los dímeros aa, da y dd; y los homocigotos aabb tienen
los dímeros bb, gb y gg. El cruzamiento de ambos homocigotos (AABB x aabb) da lugar
a una F1 diheterocigótica que presenta nueve bandas distintas, las mismas que se
observan en los parentales por separado y tres nuevas de migración intermedia.
Cada una de las bandas de la F 1 corresponde a un dímero diferente, excepto la banda
central que se debe a la superposición de dos heterodímeros con igual migración
(db+ga).
Debido a que existe codominancia entre los alelos de los loci A,a y B,b y a que se
producen heterodímeros entre las cadenas polipeptídicas codificadas por alelos de
diferentes loci, en los diheterocigotos se producen 10 dímeros distintos que de mayor a
menor migración originan nueve bandas aa, ,ba bb, ,da (db+ga), ,ga dd, gd y gg. Las
intensidades relativas de estas nueve bandas se obtienen recordando que los
heterodímeros tienen doble probabilidad que los homodímeros y que la banda central es
la superposición de dos heterodímeros, por tanto, las intensidades relativas de las nueve
bandas aa, ,ba bb, ,da (db+ga), ,ga dd, gd y gg son 1:2:1:2:4:2:1:2:1, respectivamente.
El cruzamiento de dos diheterocigotos (AaBb x AaBb) origina una F2 constituida por
nueve tipos de descendientes. Los nueve genotipos diferentes de esta F 2 se obtienen
combinando de forma independiente lo que le sucede a cada locus por separado, de
manera, que en el locus A,a se observan tres clases de individuos en las proporciones
1/4 AA + 1/2 Aa + 1/4 aa; en el locus B,b se obtienen también tres clases de individuos
en las proporciones 1/4 BB + 1/2 Bb + 1/4 bb. La combinación independiente de ambos
loci (1/4 AA + 1/2 Aa + 1/4 aa) X (1/4 BB + 1/2 Bb + 1/4 bb) da como resultado la
siguiente segregación en la F2: 1/16 AABB + 2/16 AABb + 1/16 Aabb + 2/16 AaBB +
4/16 AaBb + 2/16 Aabb + 1/16 aaBB + 2/16 aaBb + 1/16 aabb. Los homocigotos para
ambos loci muestran tres dímeros AABB (aa, da y dd), aabb (bb, gb y gg), AAbb (aa,
ga y gg) y aaBB (bb, db y dd). Los diheterocigotos (AaBb) muestran el mismo patrón
isoenzimático que los individuos de la F1, nueve isoenzimas. Los homocigotos para un
locus y heterocigotos en el otro tienen seis dímeros con las intensidades relativas
indicadas en cada caso: 1aa:2ba:1bb:4da:4db:4dd en los individuos AaBB,
1aa:2ba:1bb:4ga:4gb:4gg para los Aabb, 4aa:4da:4ga:1dd:2gd:1gg en AABb y
4bb:4db:4gb:1dd:2gd:1gg en los individuos aaBb.
La segregación obtenida en la F2 corresponde a la esperada en caso de independencia, es
decir, cuando los loci se encuentran situados en cromosomas distintos o en el mismo
cromosoma, pero muy lejos. En el caso de ligamiento estrecho (ubicados en el mismo
cromosoma y muy juntos), las proporciones relativas de los diferentes individuos son
distintas a las obtenidas en independencia.
En el supuesto de que los loci analizados codificaran para isoenzimas con diferente
localización subcelular, por ejemplo, el locus A,a para isoenzimas situadas en la
mitocondria y el locus B,b para isoenzimas ubicadas en el citoplasma, los patrones
isoenzimáticos serian más sencillos, ya que no se observarían heterodímeros entre los
alelos correspondientes a polipéptidos con diferente localización subcelular. Los
homocigotos para ambos loci solamente mostrarían dos homodímeros y los
diheterocigotos (AaBb) tendrían solamente seis dímeros o bandas distintas en vez de las
nueve bandas y 10 dímeros descritos en el caso anterior. Los homocigotos en un locus y
heterocigotos en el otro presentarían cuatro isoenzimas en vez de las seis observadas en
el ejemplo anterior.

8.- Series alélicas y cruzamientos entre individuos heterocigotos para distintos

alelos de un mismo locus.

Hasta el momento, hemos considerado que en cada uno de los loci analizados existían
solamente dos alternativas o alelos. Sin embargo, cuando se llevan a cabo análisis
isoenzimáticos en poblaciones es frecuente encontrar que en un locus existen más de
dos alelos o formas alternativas. Una serie alélica tiene lugar siempre que existen más
de dos alelos en un mismo locus, el ejemplo típico de serie alélica es el sistema ABO de
grupos sanguíneos en la especie humana.

El número total de genotipos diferentes que se pueden encontrar en una población para
n alelos es:
un locus en el que existe
CR = Combinaciones con repetición
CR = n(n+1)

El número total de genotipos homocigóticos distintos es n (tantos como alelos

diferentes), y el número de genotipos heterocigóticos es:
(n-1)/2; C = Combinaciones
C=n
Si nos imaginamos un locus con cuatro alelos codominantes (A 1, A2, A3 y A4),
tendremos un total de 10 genotipos distintos, de los cuales cuatro son homocigotos
(A1A1, A2A2, A3A3 y A4A4) y seis son heterocigotos (A1A2, A1A3, A1A4, A2A3, A2A4, y
A3A4). El número de fenotipos distintos es igual que el de genotipos ya que existe
codominancia.
Hasta ahora, para averiguar el control genético de las isoenzimas estudiadas, siempre
hemos supuesto que la F2 se obtenía mediante el cruzamiento de dos heterocigotos
idénticos (Aa x Aa). Sin embargo, cuando en el locus analizado existen más de dos
alelos, en muchos casos se pueden realizar cruzamientos entre individuos
heterocigóticos para distintos alelos. Por ejemplo, A1A2 x A1A3 o A1A2 x A3A4.
Para comprender mejor lo que sucede en este tipo de cruzamientos, vamos a suponer en
todos los casos que se trata de un locus en el que existen cuatro alelos distintos y
codominantes (A1, A2, A3 y A4) que codifican para cuatro cadenas polipeptídicas con
diferente migración electroforética (a, b, d y g, respectivamente). Igualmente, para
comenzar supondremos que la estructura cuaternaria activa de nuestra enzima es
monomérica.
En la descendencia de un cruzamiento entre individuos heterocigóticos para alelos
diferentes (A1A2 x A3A4) nos encontraremos cuatro clases de descendientes en igual
proporción. A este resultado se llega pensando que uno de los heterocigotos parentales
(A1A2) produce dos clases de gametos en igual proporción, 1/2 A 1 + 1/2 A2; y el otro
heterocigoto origina también otros dos tipos de gametos en igual cantidad 1/2 A 3 +1/2
A4.
Por tanto, la descendencia se obtiene combinando de forma independiente los gametos
producidos por cada parental (1/2 A1 + 1/2 A2) X (1/2 A3 +1/2 A4) = 1/4 A1A3 + 1/4
A1A4 + 1/4 A2A3 + 1/4 A2A4. Como se puede observar, a pesar de tratarse de la
segregación de un solo locus, aparecen cuatro clases de descendientes, y además todos
son heterocigóticos con dos bandas y con un patrón isoenzimático diferente al de sus
padres.
También es posible realizar cruzamientos entre heterocigotos que tienen un alelo común
(por ejemplo, A1), siendo los otros diferentes (A1A2 X A1A3). La descendencia que se
obtiene también está formada por cuatro clases de individuos en igual proporción, (1/2
A1 + 1/2 A2) X (1/2 A1 +1/2 A3) = 1/4 A1A1 + 1/4 A1A3 + 1/4 A2A1 + 1/4 A2A3), aunque
entre ellos hay homocigotos.

Si las isoenzimas que estamos analizando tienen estructura cuaternaria dimérica o

tetramérica, y seguimos suponiendo que están controladas por un solo locus con cuatro
alelos que codifican para cadenas polipeptídicas con distintas migraciones
electroforéticas, los resultados serian semejantes a los anteriores, cambiando
simplemente el patrón isoenzimático presentado por los descendientes.
En la descendencia de un cruzamiento entre individuos heterocigóticos para alelos
diferentes (A1A2 x A3A4) que codifican para cadenas polipeptídicas (a, b, d y g ) que
dan lugar a isoenzimas diméricas, nos encontraremos cuatro clases de descendientes en
igual proporción, (1/2 A1 + 1/2 A2) X (1/2 A3 +1/2 A4) = 1/4 A1A3 + 1/4 A1A4 + 1/4
A2A3 + 1/4 A2A4. Estos descendientes son todos heterocigóticos y muestran tres bandas
(dos homodímeros en los extremos y un heterodímero de migración intermedia entre
ambos homodímeros).
En la descendencia de un cruzamiento entre individuos heterocigóticos para alelos
diferentes (A1A2 x A3A4) que codifican para cadenas polipeptídicas (a, b, d y g ) que
dan lugar a isoenzimas tetraméricas, nos encontraremos cuatro clases de descendientes
en igual proporción, (1/2 A1 + 1/2 A2) X (1/2 A3 +1/2 A4) = 1/4 A1A3 + 1/4 A1A4 + 1/4
A2A3 + 1/4 A2A4. Estos descendientes son todos heterocigóticos y muestran cinco
bandas (dos homotetrámeros en los extremos y tres heterotetrámeros de migración
intermedia entre ambos homotetrámeros).

II
OBJETIVOS
Aplicar los conocimientos de las leyes de Mendel en la interpretación de los
marcadores moleculares isoenzímaticos.

III MATERIAL Y MÉTODOS

3.1 Problemas propuestos
1 ADH
Para averiguar la posible estructura cuaternaria de las isoenzimas de alcohol
deshidrogenasa (ADH) en centeno, se han cruzado dos plantas (P 1 x P2)
homocigóticas con isoenzimas de ADH de diferente migración electroforética.
Las plantas de la F1fueron uniformes y mostraron el patrón isoenzimático de la
derecha.
Indique las relaciones de dominancia o codominancia entre los alelos de
ADH. Indique la estructura cuaternaria. P1 F1 P2
2 CAT
Para averiguar la posible estructura cuaternaria de las isoenzimas de catalasa
(CAT) en centeno, se han cruzado dos plantas homocigóticas (P1 x P2) que
presentaban isoenzimas de CAT de diferente migración electroforética. Las
plantas de la F1 fueron uniformes y mostraron el patrón isoenzimático de la
derecha.
Indique las relaciones de dominancia o codominancia entre los alelos de P1 F1 P2
CAT. Indique la estructura cuaternaria.

3 ADH PGM
Para averiguar las relaciones de dominancia o codominancia entre los alelos
de los cuatro loci que codifican para cuatro isoenzimas diferentes, Alcohol
deshidrogenasa (ADH), Fosfoglucosa mutasa (PGM), Catalasa (CAT) y
Peroxidasa (PER) en centeno, se han cruzado dos plantas homocigóticas (P1
x P2) que presentaban isoenzimas distintas. Las plantas de la F1 fueron
uniformes y mostraron los patrones isoenzimáticos indicados a la derecha.
Indique las relaciones de dominancia o codominancia entre los alelos de
ADH, PGM, CAT Y PER. P1 F1 P2 P1 F1 P2
Indique la estructura cuaternaria.
CAT PER

P1 F1 P2 P1 F1 P2

4. A C O 50 Plantas de la F2
El cruzamiento de dos
plantas homocigóticas
(P1 x P2) para Aconitasa
(ACO) ha dado lugar a
una F1 uniforme. La
autofecundación de la F1
ha originado una F2 P1
Gel Nº 1: 25 primeras plantas de la F2
compuesta por 50 F1 P2
plantas. Averigüe:
Las interacciones entre
alelos, el nº de loci y la
estructura cuaternaria
para aconitasa.
La segregación TGel Nº 2: 25 últimas plantas de la F2
observada y esperada.
Comprobación
mediante c2.

5. CAT
El cruzamiento de dos
plantas homocigóticas (P1 x
P2) para Catalasa (CAT)
originó una F1 uniforme. La
autofecundación de la F1 dio
lugar a una F2 formada por P1 F1 P2 Gel Nº1: 25 plantas de la F2
25 plantas. Averigüe:
El nº de loci, interacciones
entre alelos y estructura
cuaternaria.
La segregación observada
y esperada.
Comprobación mediante
c2.

6 ADH
El cruzamiento
de dos plantas
Gel Nº1: Plantas de la 1 a la 25
homocigóticas
(P1 x P2) para
Alcohol
deshidrogenasa
(ADH) ha dado P1 F1 P2
lugar a una F1 Gel Nº2: Plantas de la 26 a la 50
uniforme. La
autofecundació
n de la F1 ha
originado una
F2 compuesta
por 50 plantas.
Averigüe:
El nº de loci,
interacciones
entre alelos y
estructura
cuaternaria.
La segregación
observada y
esperada.
Comprobación
mediante c2.

7 PGD 50 Plantas de la F2
El cruzamiento de
dos plantas
homocigóticas (P1 x
P2) para 6-
Fosfogluconato
deshidrogenasa
(PGD) ha dado lugar
a una F1 uniforme. La Gel Nº 1: 25 primeras plantas de la F2
autofecundación de la
F1 ha originado una
F2 compuesta por 50
plantas. Averigüe:
El nº de loci,
interacciones entre
alelos y estructura
cuaternaria. Gel Nº 2: 25 últimas plantas de la F2
Segregación
observada y
esperada.
Comprobación
mediante c2.
8 PER 100 Plantas de la F2
El cruzamiento de
dos plantas
homocigóticas (P1 x
P2) para Peroxidasa
(PER) originó una P1 P2 Gel Nº 1: Plantas de la 1 a la 25
F1 uniforme. La F1
autofecundación de
la F1 dio lugar a una Gel Nº 2: Plantas de la 26 a la 50
F2 formada por 100
plantas. Averigüe:
El nº de loci, las
Gel Nº 3: Plantas de la 27 a la 75
interacciones entre
alelos y la
estructura
cuaternaria de las Gel Nº 4: Plantas de la 76 a la 100
isoenzimas.
La segregación
observada y
esperada.
Comprobación
mediante c2.

9 ACO
La autofecundación
de una F1
heterocigótica para
Aconitasa (ACO),
procedente del P1 F1 P2 Gel Nº 1: Plantas de la 1 a la 25
cruzamiento de dos
plantas
homocigóticas (P1 X
P2) dio 100
descendientes.
Averigüe:
El nº de loci, las Gel Nº 2: Plantas de la 26 a la 50
interacciones entre
alelos, la estructura
cuaternaria de las
isoenzimas de
Aconitasa, y si
existe o no
Gel Nº 3: Plantas de la 27 a la 75
ligamiento.
La segregación
observada y
esperada para cada
locus por separado
y en conjunto.
Comprobación Gel Nº 4: Plantas de la 76 a la 100
mediante c2.
 PRACTICA Nº 14

MARCADORES MOLECULARES DE ADN.

I. INTRODUCCIÓN

Generalmente, no se conoce exactamente cuál es el gen responsable de un fenotipo

(característica física distintiva o enfermedad), pero sí podemos analizar múltiples
regiones del genoma y asociar la presencia o ausencia de ciertas variaciones en su
secuencia a la incidencia de esta condición fenotípica. Existen distintos tipos de
variaciones que nos sirven de marcador: desde cambios en un único nucleótido en
muchas regiones del genoma (SNPs: Single Nucleotide Polymorphism), hasta
secuencias de varios nucleótidos que se caracterizan por estar repetidas más o menos
veces. En este último grupo se encuentran los VNTRs, también llamados minisatélites.
Son repeticiones de secuencias de 9 a 100 pares de bases que se repiten en tándem, es
decir, unas a continuación de las otras, en número variable pero inferior a 50. Cada
individuo tiene miles de VNTRs en su genoma, cada uno de los cuáles está repetido un
número de veces concreto y específico para ese individuo. A veces, al explorar el patrón
de repeticiones de diversos VNTRs, podemos observar que la presencia de un número
concreto de repeticiones para un VNTR específico se asocia a un fenotipo. Así,
podemos, sin necesidad de conocer el gen responsable del fenotipo, predecir el fenotipo
a partir del número de repeticiones que posea el individuo en el VNTR, que será, pues,
un marcador molecular útil para investigar la condición fenotípica en cuestión.

Mapas de restricción: Un mapa de restricción representa una secuencia lineal de los

sitios en los que diferentes enzimas de restricción poseen dianas en una molécula de
ADN particular. Consiste en la ordenación de una serie de dianas para enzimas de
restricción en una molécula de ADN concreta. En el mapa se representan las distancias
entre dichas dianas, distancias que se miden en pares de bases (o en kilobases).
Cuando una molécula de ADN es cortada con una enzima de restricción y los
fragmentos generados se separan por electroforesis en un gel de agarosa, se puede
determinar el número de sitios de restricción y la distancia entre ellos a partir del
número y la posición de las bandas en el gel. Cabe distinguir entre moléculas de ADN
lineal y ADN circular: ADN lineal: hay que tener en cuenta que el número de
fragmentos que se generan tras una digestión, es el número de dianas presentes en su
secuencia para esa enzima más uno. La suma del tamaño de los fragmentos debe de
coincidir con el tamaño total del ADN digerido. Pero hay que tener en cuenta que el
número de fragmentos no es siempre coincidente con el número de bandas que aparecen
en un gel de agarosa, ya que puede haber fragmentos de igual tamaño que migran
juntos.

ADN circular: el número de fragmentos que se generan tras una digestión, es el mismo
que el número de dianas presentes en su secuencia para esa enzima. Cuando una enzima
corta una vez sólo, nos revela el tamaño del ADN circular. La suma del tamaño de los
fragmentos debe de coincidir con el tamaño total del ADN digerido. Como antes, hay
que tener en cuenta que el número de fragmentos no es siempre coincidente con el
número de bandas que aparecen en un gel de agarosa, ya que puede haber fragmentos de
igual tamaño que migran juntos. En cualquier caso, la información obtenida mediante
electroforesis no nos revela el orden ni la localización de las dianas de restricción. Para
poder realizar un mapa, se ha de cortar una muestra del ADN a mapear con una enzima
de restricción, una segunda muestra del mismo ADN con otra enzima diferente y una
tercera muestra de dicho ADN con las dos enzimas simultáneamente (digestión doble).
Esta tercera digestión nos da la clave para determinar el orden de las dianas para ambas
enzimas de restricción.

Marcadores moleculares: Es importante asignar los genotipos a los individuos del

pedigrí para intentar ver la coincidencia entre sus alelos y los patrones de bandas. Hay
que tener en cuenta la distancia entre dianas, que nos dará el tamaño de las bandas
observables, pero, además, hay que prestar especial atención a la región con la que
hibrida la sonda, pues aquellos fragmentos con los que no hibride, no podrán ser
detectados tras el revelado. En el caso de los microsatélites, los diferentes tamaños
amplificados para un locus pueden considerarse como alelos. Los microsatélites
presentan herencia mendeliana simple y son codominantes. Para un locus microsatélite,
cada uno de los alelos presentes en el genotipo de un individuo (tamaño de amplificado)
procede uno del padre y otro de la madre.
II. OBJETIVOS
 Analizar resultados experimentales para construir mapas genéticos de
restricción, basados en marcadores moleculares de ADN y resolver problemas
de aplicación.

III. METODOLOGÍA
Para resolver los problemas de aplicación, es necesario recurrir al conocimiento
teórico para poder dar una solución concreta a los problemas genético-reales
recopilados.

El DNA cortado (o digerido) se separa en un gel de agarosa y se determinan los tamaños

de los fragmentos mediante comparación con los tamaños de moléculas conocidas (los
"patrones") situadas en otra calle del gel (marcadores de peso)
Los fragmentos se organizan en forma de mapa comparando los tamaños de fragmentos
en las calles donde se cortó con una sola enzima (digestiones simples) con los de las
calles donde se cortó con dos enzimas (digestiones dobles).

IV. PROBELMAS PROPUESTOS

Problemas modelo: Un gen clonado muestra el siguiente mapa de restricción para las
enzimas EcoRI y HindIII:

a) Dibujar los patrones de los fragmentos de ADN esperados con cada enzima al
separar los fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa. Hacer lo mismo
para el caso de la digestión doble.

Para EcoRI el gen tiene dos dianas, por lo que será cortado en tres fragmentos de
tamaños 4Kb+3Kb+1Kb. Para HindIII también tiene dos dianas, pero en diferentes
posiciones, por lo que generará tres fragmentos pero de tamaños 4.5Kb+2Kb+1.5Kb.
Cuando utilizamos las dos enzimas para digerir el gen, obtendremos 5 fragmentos
diferentes (existen 4 puntos de corte, generando fragmentos de diana a diana de
ambas enzimas), aunque dos de ellos presentan el mismo tamaño (1Kb), por lo que
los observaremos como una única banda en el gel de agarosa. Los tamaños serán, por
tanto, de 3.5Kb+2Kb+1(x2) Kb+0.5Kb (ver figura).
a) Dibujar el patrón esperado para una copia mutante del gen que ha perdido el
primero de los cortes de EcoRI
Si la copia mutante del gen pierde una diana para EcoRI, al cortar con esta enzima,
obtendremos solo dos fragmentos, siendo uno de ellos, la suma de los dos entre los
cuales se encontraba la diana perdida para EcoRI, 7Kb+1Kb. Para el corte con
HindIII el patrón de bandas no se vería afectado, pero sí nuevamente para la
digestión doble, ya que hay un corte menos, 4,5Kb+2Kb+1Kb+0,5Kb (ver figura).

b) Dibujar el patrón esperado para una copia mutante del gen en la que ha aparecido
una nueva diana para HindIII en el centro del fragmento de 2Kb.

IV.1. Se ha cortado con PstI un plásmido bacteriano circular que contiene un gen de
resistencia a la ampicilina. Tras la electroforesis se observa una banda de 20 Kb.
¿Qué deducirías de los resultados que se plantean a continuación?
a) Con EcoRI, el plásmido se corta en dos fragmentos: uno de 11.5 Kb y otro de 8.5
Kb
b) La digestión PstI+EcoRI genera tres fragmentos de: 6 Kb, 5.5 Kb y 8.5 Kb
c) El ADN del plásmido cortado con PstI se ha mezclado y ligado con fragmentos de
ADN cortados con PstI. Todos los clones recombinantes son resistentes a la
ampicilina.
d) Tras cortar uno de los clones recombinantes con PstI se obtienen dos fragmentos:
20Kb y 6 Kb.
e) El clon anterior se corta con EcoRI y se obtienen 10 Kb, 8.5 Kb y 7.5 Kb.

IV.2. Se conoce un gen autosómico con tres alelos La, Lb y l que se diferencian en una
diana para la enzima de restricción PstI (↓ sitio de corte):
 Diseñar un experimento para diferenciar los genotipos de los diferentes individuos
que pudieren existir en una población si utilizamos como sonda el fragmento
homólogo de ADN señalado en el esquema.
4.3 En una población de centeno se ha aislado un gen de secuencia única. Se extrae el
ADN genómico de 10 plantas diferentes de la población, se digiere con Eco RI; los
segmentos producidos se separan mediante electroforesis en gel de agarosa y se
transfiere mediante Southern. Posteriormente, se hibrida esta membrana usando
como sonda radioactiva el gen de secuencia única de centeno clonado en un vector
bacteriano. Por último se realiza una autoradiografía y se revela

4.4. El siguiente pedigrí representa a una familia con alguno de sus miembros afectado por
una enfermedad autosómica dominante. El ADN de todos los individuos fue digerido con
la enzima PstI y sometido a electroforesis en gel de agarosa. Se analiza este ADN mediante
hibridación tipo Southern con una sonda que corresponde a un fragmento de ADN
humano clonado en un plásmido bacteriano. Los resultados del revelado de la hibridación
se muestran junto al pedigrí.

a) Explica el protocolo seguido y los resultados obtenidos en los distintos individuos

b) ¿Podemos usar la sonda con fines diagnósticos para esta enfermedad?
4.5. En un análisis con 4 marcadores de microsatélites se obtuvieron los siguientes
resultados para 5 individuos (los números indican tamaños de fragmentos
amplificados en pb):
a) ¿Qué diferencia existe entre los diferentes alelos de un mismo locus de
microsatélite?
b) ¿Cuántos alelos tienen los diferentes loci de microsatélites analizados en este
estudio?
c) ¿Se puede saber el número de repeticiones para cada uno de ellos? ¿Y el motivo de
repetición?
d) Si el individuo 1 es la madre del individuo 2, ¿cuáles de los otros tres individuos
pueden descartarse como posibles padres?

4.6 Dos hombres se disputan la paternidad de un niño. Los forences deciden utilizar el
método de la huella de ADN (VNTR) para resolver el caso, analizando el ADN de
la madre (M), del hijo (H) y de los posibles padres (P1 y P2). Los resultados
obtenidos en el esquema a) ¿Quién es el padre? b) Atribuya el mayor número
posible de bandas al padre y a la madre. c)¿Existe alguna banda que no sea posible
atribuida al padre o a la madre? Explique este tipo de bandas.