GUÍA DE EJERCICIOS

UNIDAD 2 TME 145

1. Determine el orden relativo de avance (ascenso por la placa) de los siguientes lípidos en una
cromatografía en capa fina en una placa de gel de sílice, empleando como fase móvil una mezcla
de hexano, éter etílico y ácido acético 59:39:1 V/V. (
a) Oleato de colesterol:

b) Colesterol:

c) 1-estereatoilglicerol:

NOTA: Orden de hidrofobicidad (apolaridad): Hexano > éter etílico > ácido ácetico

2. Indique cuál de los siguientes tipos de cromatografía en columna será la más adecuada para
separar los compuestos A y B que se indican como pares en las siguientes muestras numeradas:

Componentes de las muestras:

A B

1) histona H1 (19,8 kDa, pI=10,6) pepsina (35 kDa, pI=3,9)

2) lactato deshidrogenasa (228 kDa, pI=7,3) malato deshidrogenasa (140 kDa, pI=4,8)

3) seroalbúmina (69 kDa, pI=4,8) inmunoglobulina G (153 kDa, pI=6,5)

4) seroalbúmina (Mr=69000, pI=4,8) glutatión (Mr=333, pI=2,25)

cierta proteína integral de membrana

5) hexoquinasa (53 kDa, pI=10,0)
(245 kDa, pI=9,5)

Cromatografías:

a. En capa fina de celulosa con cloroformo/metanol/acético (1:1:0,1) como fase móvil.

b. En columna de Sephadex G-50 con tampón fosfato pH=7 como fase móvil.
c. En columna de DEAE-Sepharosa con un gradiente de NaCl como fase móvil.
d. En papel con tampón fosfato pH=4 como fase móvil.
e. En columna de proteína A-Sepharosa con un gradiente de pH 7,5 a 1,5 como fase móvil.
f. En columna de octil-Sepharosa con tampón fosfato pH=7,0 como fase móvil.
g. En columna de piruvato ligado a BioGel-P20 con un gradiente de NaCl como fase móvil.
h. En columna de gel de sílice con hexano/éter/acético (60:40:1) como fase móvil.
 3. La casa GE Lifesciences vende, para cromatografía de filtración en gel, el producto Sephadex G-
100 Superfine, con las siguientes características:

Material: Dextrano entrecruzado con epiclorohidrina.

Tamaño de partícula: 10-40 μm (seco).
Volumen de lecho: 15-20 ml/g (en agua).
Límite de exclusión para proteínas globulares: 100 kDa.
Intervalo de fraccionamiento para proteínas globulares: 4-100 kDa.

Una muestra contiene las proteínas indicadas a continuación. Razonar cuál(es) de los componentes se
podrá(n) separar en una columna rellena con Sephadex G-100.

Lactoferrina: 77 kDa, pI=8,8

Proteína ligante de retinol (RBP): 21 kDa, pI=4,6
Lisozima: 15 kDa, pI=10,5
Ceruloplasmina: 134 kDa, pI=4,4
Glutatión: 333 Da, pI=2,25

a) Dibuje el cromatograma que se espera de esta cromatografía de filtración.

b) Indique cuáles proteínas quedan adsorbidas en una columna de DEAE celulosa (intercambio
aniónico) y cuáles eluyen en el frente de la columna a pH 7,4

4. Las siguientes son velocidades de una enzima X obtenidas en las siguientes condiciones: Vo1 sin
inhibidor alguno; Vo2, con el inhibidor A; Vo3, con el inhibidor B

De acuerdo a un análisis gráfico de dobles recíprocos prediga qué tipo de inhibidores son A y B para esta
enzima X.

Tiempo (s) Vo1 Vo2 Vo3

1 2.5 1.17 0.77
2 4 2.1 1.25
5 6.3 4 2
10 7.6 5.7 2.5
20 9 7.2 2.86

5. Una enzima que cataliza la reacción X→Y se aisló de dos especies bacterianas diferentes. Ambas
enzimas tienen la misma Vmax pero diferentes valores de Km para el sustrato. La enzima A
tiene una Km de 2.0 µM, mientras que la enzima B tiene una Km de 0.5 µM. El gráfico representa
las cinéticas de reacción llevadas a cabo con la misma concentración de cada enzima y con [X]=
1 µM. ¿Qué curva representa a la enzima A y cuál a la enzima B?
6. Las prostaglandinas son una clase de eicosanoides, derivados de ácidos grasos con una gran
variedad de acciones extremadamente potentes en los tejidos de vertebrados. Son
responsablesde la producción de fiebre, inflamación y dolor. Las prostaglandinas se derivan del
ácido araquidónico a través de una reacción catalizada por la enzima prostaglandina
endoperóxido sintasa. Esta enzima, una cicloxigenasa, utiliza oxígeno para convertir el ácido
araquidónico en PGG2, el precursor inmediato de muchas prostaglandinas.

a) Determina Vmax y Km de la prostaglandina endoperóxido sintasa.

b) El ibuprofeno es un inhibidor de la prostaglandina endoperóxido sintasa. Mediante la inhibición
de esta enzima, el ibuprofeno es capaz de reducir la inflamación y el dolor. Determina el tipo de
inhibición que ejerce el ibuprofeno sobre la prostaglandina endoperóxido sintasa.

7. Se determinó la representación de dobles recíprocos para una reacción de un solo sustrato

catalizada por la enzima Succinato deshidrogenasa a tres diferentes concentraciones de
enzima.
¿Cuál de las siguientes familias de curvas se podría esperar? Explíquelo.